a expressão gênica dos rnas não codificadores hotair, malat1, hulc

Transcrição

Vanessa Regina Maciel Uzan
A EXPRESSÃO GÊNICA DOS RNAs NÃO CODIFICADORES HOTAIR, MALAT1, HULC E BCYRN1
EM OSTEOSSARCOMA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação da Fundação PIO XII –
Hospital de Câncer de Barretos para
obtenção do Título de Mestre em Ciências
da Saúde.
Área de concentração: Oncologia
Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes
Co-orientador: Dr. Daniel Onofre Vidal
Barretos, SP
2015
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada por Rafael de Paula Araújo CRB 8/9130
Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos
U99e
Uzan, Vanessa Regina Maciel
A expressão gênica dos RNAs não codificadores HOTAIR, MALAT1, HULC e
BCYRN1 em osteossarcoma / Vanessa Regina Maciel Uzan. - Barretos, SP 2015.
84 f. : il.
Orientador: Luiz Fernando Lopes.
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital
de Câncer de Barretos, 2015.
1. Osteossarcoma. 2. RNAs não codificadores longos. 3. Metástase.
4. Expressão Gênica. 5. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo
Real. 6. Biomarcadores. I. Autor. II. Lopes, Luiz Fernando
CDD 572.86
FOLHA DE APROVAÇÃO
Vanessa Regina Maciel Uzan
A expressão gênica dos RNAs não codificadores HOTAIR, MALAT1, HULC E BCYRN1 em
osteossarcoma
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de
Câncer de Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde - Área de
Concentração: Oncologia
Data da aprovação: 26/02/2015
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Antônio Sergio Petrilli
Instituição: Instituto de Oncologia Pediátrica - Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP
Prof. Dr. Rui Manuel Vieira Reis
Instituição: Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos
Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes
Orientador – Presidente da Banca
“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da PósGraduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento
do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de Apresentação de Dissertações
e Teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este
trabalho foi realizado em concordância com o Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),
não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou
falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas
neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão
da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos.”
“Embora o Núcleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha
realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia
estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade
dos pesquisadores envolvidos. Os pesquisadores declaram não ter qualquer conflito de
interesse relacionado a este estudo.
DEDICATÓRIA
A Deus, pelo dom da vida, de amar e me fortalecer a cada dia.
Aos meus pais, Sandra M. Maciel Uzan e José Roberto Uzan por serem a minha referência
como ser humano e como profissional e pelo incentivo insaciável para a minha formação.
Aos meus irmãos Valéria e Márcio e aos meus sobrinhos Giovanna e Arthur pelo amor e
apoio na realização dos meus sonhos.
Ao meu namorado Alberto, pela força nas horas mais difíceis, pelo amor sincero,
companheirismo e por participar ativamente da concretização deste trabalho com seu
conhecimento e acreditando em mim.
Dedico à vocês este trabalho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a Deus, pela saúde, força, e por estar comigo todos os
dias, em todos os momentos incondicionalmente.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes, por acreditar em mim como pessoa
e como profissional, pelas palavras de incentivo durante as “tempestades” que encontramos
neste caminho chamado mestrado e por contribuir para o meu crescimento profissional e
intelectual.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Daniel Onofre Vidal, por acrescentar palavras de
sabedoria nas linhas deste trabalho, pela exigência no meu aprendizado e na qualidade
deste trabalho.
Aos assessores das Bancas de Acompanhamento, Dr. Rui Reis e Dra. Ana Lucia
Ambujamra que a cada encontro acrescentavam seus conhecimentos e sugestões para o
aprimoramento deste trabalho.
Ao Dr. Carlos Alberto Scrideli, pela pronta colaboração com este projeto.
A Dra. Érica Boldrini, por me acompanhar na revisão dos prontuários e dividir seus
conhecimentos comigo.
A toda equipe do Núcleo de Apoio ao Pesquisador pelo suporte prestado,
especialmente aos estatísticos Cleyton, Marco e Anderson por todo o aprendizado, e pela
realização das análises metodológicas e estatísticas.
Aos professores, colegas e equipe de suporte da Pós Graduação do Hospital de Câncer
de Barretos que contribuíram para o meu aprendizado.
Ao Dr. Valter Penna, pela coleta de todas as amostras de osteossarcoma que
utilizamos neste projeto.
Aos funcionários do Biobanco, em especial ao Dr. Cristovam Scapulatempo por revisar
criteriosamente e pacientemente todas as lâminas do nosso estudo, e à minha amiga e
excelente profissional Jacqueline, por me auxiliar em todas as etapas no laboratório.
Ao Dr. Carlos Eduardo Bezerra, por avaliar os exames de imagem e redimensionar
pacientemente os tumores avaliados.
Ao André Van Helvoort Lengert, além do profissionalismo, agradeço imensamente
pela amizade, pelas palavras de força e por contribuir ativamente da conclusão deste
trabalho. Exemplo de humildade, simplicidade e inteligência.
A Direção da Fundação Pio XII, em especial ao Sr. Henrique Duarte Prata, pelo
incentivo aos estudos e permitindo que possamos nos ausentar em alguns (ou vários)
momentos para a realização desse sonho.
A minha Equipe de Farmacêuticos (34) e Auxiliares (63) da Farmácia da Fundação Pio
XII – Hospital de Câncer de Barretos, pela compreensão nos momentos em que precisei me
ausentar e pelas palavras de força nos momentos em que tudo parecia difícil.
A minha família por ter lutado e muitas vezes se sacrificado para me dar esse privilégio
de poder estar formada e realizar o sonho da Pós Graduação. Em especial, agradeço aos
meus pais José Roberto Uzan e Sandra M. Maciel Uzan, por me ensinarem o amor ao
próximo, a buscar os sonhos, a não desistir diante das dificuldades e pelo amor
incondicional. Com muito amor e gratidão dedico esse trabalho a vocês.
Ao meu médico particular, noivo e eterno namorado, Alberto Paiva de Moraes Filho,
que durante esse período tornou-se mestre no assunto junto comigo e por acrescentar seus
conhecimentos técnicos e científicos nesse trabalho. Meu companheiro de leituras de
prontuários, interpretação de laudos de tomografias, raio-x e ressonâncias. Agradeço
também por ser tão compreensivo, paciente, presente e incentivador. Obrigada pelas
palavras de força e de ânimo nas horas certas!
E por fim, aos pacientes, por nos conceder o uso de suas amostras para a realização
deste trabalho. O sorriso que vemos no rosto de vocês diariamente, apesar das lutas que
vocês enfrentam, é o que nos dá forças para continuar e não desistir.
“ Seja lá o que for que você faça, empregue toda tua energia e todo teu espírito nesta tarefa.
Ninguém conquista um sonho sem persegui-lo, ninguém anda uma milha sem dar o primeiro
passo. Se ao fim da estrada alguma sombra de arrependimento te atacar, ainda assim,
levante a cabeça, orgulhe-se por ter tentado, por ter buscado, por ter empregado todas as
tuas forças até o último instante. Tanto pior e sempre pior é arrepender-se daquilo que você
não fez” (Augusto Branco)
“Eu tudo posso, naquele que me fortalece”
Filipenses 4:13
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
1.1
Osteossarcoma
1
1.2
Alterações genéticas associadas ao osteossarcoma
3
1.3
Os RNAs não codificadores longos (lncRNAs)
5
1.4
Os lncRNAs associados aos processos de invasão e metástase em
tumores humanos
8
1.4.1
MALAT1 (Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1)
8
1.4.2
HOTAIR (HOX transcript antisense RNA)
9
1.4.3
HULC (Hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA)
10
1.4.4
BCYRN1 (Brain cytoplasmic RNA1)
11
2
JUSTIFICATIVA
13
3
OBJETIVOS
3.1
Objetivo Geral
14
3.2
Objetivos Específicos
14
4
MATERIAIS E MÉTODOS
4.1
Amostras e seleção dos pacientes
15
4.2
Critérios de inclusão
15
4.3
Critérios de exclusão
15
4.4
Aspectos éticos
16
4.5
Coleta de dados
16
4.6
Avaliação da representatividade tumoral
16
4.7
Extração de RNA
17
4.8
Avaliação da quantidade e da qualidade do RNA total
18
4.9
Análise de contaminação do RNA com DNA genômico
19
4.10
Tratamento com DNase
19
4.11
Síntese de cDNA
20
4.12
Análise de expressão dos RNAs não codificadores longos por
RT-qPCR
20
4.13
Análise estatística
5
RESULTADOS
5.1
Tamanho da amostra
23
5.2
25
5.3
Extração, quantificação e avaliação da qualidade do RNA total
25
5.4
Avaliação de contaminação com DNA genômico e tratamento das
amostras de RNA com DNAse
5.5
Análise da expressão dos normalizadores e requantificação das
amostras utilizando o Qubit
5.6
21
27
28
Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes
com osteossarcoma
30
5.7
Análise da expressão dos lncRNAs
31
5.8
Associação da expressão dos lncRNAs com os fatores clínicopatológicos dos pacientes
5.9
33
Associação do perfil de expressão dos lncRNAs com as
características clínico-patológicas dos pacientes
40
5.10
Análise de sobrevida global e sobrevida livre de eventos
47
6
DISCUSSÃO
53
6.1
Otimização do protocolo de extração e análise da qualidade do RNA
53
6.2
Caracterização das amostras
55
6.3
Expressão dos lncRNAs em osteossarcoma
58
6.3.1
Correlação da expressão do BCYRN1 com as características clínicopatológicas e sobrevida
6.3.2
Correlação da expressão do HOTAIR com as características clínicopatológicas e sobrevida
6.3.3
Correlação da expressão do HULC com as características clínicopatológicas e sobrevida
6.3.4
59
Correlação da expressão do MALAT1 com as características clínicopatológicas e sobrevida
60
62
63
6.4
Limitações do estudo
65
7
CONCLUSÕES
66
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
66
ANEXOS
Anexo A – Ficha de coleta de dados
78
Anexo B – Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de
Câncer de Barretos e do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo
81
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Funções celulares atribuídas aos diversos lncRNAs conhecidos
6
Figura 2 -
Organização genômica dos lncRNAs
7
Figura 3 -
Representação esquemática da estratégia desenvolvida neste
trabalho para a avaliação da expressão de lncRNAs em osteossarcoma
Figura 4 -
Representatividade tumoral nas amostras selecionadas para a
avaliação da expressão dos lncRNAs
Figura 5 -
27
Expressão normalizada dos lncRNAs em osteossarcoma avaliada por
RT-qPCR
Figura 9 -
27
Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas
amostras de RNA após tratamento com DNase
Figura 8 -
26
Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas
amostras de RNA
Figura 7 -
25
Comparação da integridade do RNA de amostras de osteossarcoma
após extração com dois protocolos diferentes
Figura 6 -
24
32
Análise de sobrevida global e sobrevida livre de eventos para os
pacientes metastáticos e não metastáticos ao diagnóstico tratados
pelo protocolo GLATO 2006 no Departamento de Pediatria do
Hospital de Câncer de Barretos no período de 2006 a 2013.
Figura 10 -
47
Análise de sobrevida global de acordo com o perfil de expressão dos
lncRNAs
51
Figura 11 -
Análise de sobrevida livre de eventos de acordo com o perfil de
expressão dos lncRNAs
52
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Condições de ciclagem para a PCR do gene KRAS
Tabela 2 -
Média e desvio-padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH,
19
obtidos após análise de expressão gênica a partir de RNA
quantificado por meio do Nanovue
Tabela 3 -
Comparação da quantificação de RNA realizado pelos dois métodos
utilizados neste trabalho
Tabela 4 -
28
29
Média e desvio padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH,
obtidos após análise de expressão gênica a partir de RNA
quantificado por meio do Qubit
Tabela 5 -
Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes
com ostessarcoma para a análise de expressão dos lncRNAs
Tabela 6 -
38
Comparação da média de expressão do MALAT1 com as
características clínico-patológicas dos pacientes avaliados
Tabela 10 -
37
Comparação da média de expressão do HULC com as características
clínico-patológicas dos pacientes avaliados
Tabela 9 -
36
Comparação da média de expressão do HOTAIR com as
Tabela 8 -
31
Comparação da média de expressão do BCYRN1 com as
Tabela 7 -
29
39
Área sob a curva, desvio padrão, p-valor e intervalo de confiança
determinados pela curva ROC.
40
Tabela 11 -
Ponto de corte, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo
(VPP), valor preditivo negativo (VPN) e acurácia, de acordo com a
curva ROC.
Tabela 12 -
Associação do perfil de expressão do BCYRN1 com as caracterísiticas
epidemiológicas e clínico-patológicas
Tabela 13 -
48
Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em
relação às características clínico-patológicas
Tabela 20
48
Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação às
características clínico-patológicas
Tabela 19 -
47
relação às características epidemiológicas
Tabela 18 -
46
Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação às
características epidemiológicas
Tabela 17 -
45
Associação do perfil de expressão do MALAT1 com as caracterísiticas
Tabela 16 -
44
Associação do perfil de expressão do HULC com as caracterísiticas
Tabela 15 -
43
Associação do perfil de expressão do HOTAIR com as caracterísiticas
Tabela 14 -
41
49
Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação à
expressão dos lncRNAs
49
Tabela 21
relação à expressão dos lncRNAs
50
LISTA DE ABREVIATURAS
ACTB
Actin beta
ARF
ADP-ribosylation factor
ASXL1
Additional sex combs like 1
ASXL2
Additional sex combs like 2
ATRX
Alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked
AUC
Área sob a curva
BAX
BCL2-associated X protein
BCYRN1
Brain cytoplasmic RNA 1
CASKI
Linhagem celular de carcinoma epidermóide de cervix, HPV 16
CDKN2A
Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
CDKN2B
Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B
cDNA
DNA complementar
CEP
Comitê de Ética em Pesquisa
CREB
cAMP-response element-binding protein
CREBBP
cAMP responsive element binding protein
Ct
Cycle threshold
CXCR4
C-X-C chemokine receptor type 4
DNA
Ácido desoxiribonucléico
DNase
Desoxirribonuclease
dNTP
Desoxirribonucleotídeos fosfatados
EUA
Estados Unidos da América
EZH2
Enhancer of zeste homolog 2
FGFR2
Fibroblast growth factor receptor 2
FMRP/USP
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São
Paulo
GAPDH
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GBTO
Grupo Brasileiro de Osteossarcoma
H3F3A
H3 histone, family 3ª
HCB
Hospital de Câncer Infantojuvenil de Barretos
HIC1
Hypermethylated in cancer 1
HOTAIR
HOX transcript antisense RNA
HOXD
Homeobox D
HULC
Hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA
IC
Intervalo de confiança
Kb
Quilo bases
KDM6A
Lysine (K)-specific demethylase 6A
KRAS
Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
lncRNAs
RNAs não codificadores longos
MALAT1
Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1
MAP2K4
Mitogen-activated protein kinase 4
MAPK7
Mitogen-activated protein kinase 7
MDM2
MDM2 proto-oncogene, E3 ubiquitin protein ligase
MgCl2
Cloreto de magnésio
miRNA
Micro ácido ribonucleico
MLL2
Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 2
MMP9
Matrix metallopeptidase 9
mRNA
Ácido ribonucléico mensageiro
MYC
Myelocytomatosis oncogene
ncRNAs
RNAs não codificadores
NSD2
Nuclear SET domain-containing protein 2
OMS
Organização Mundial de Saúde
OS
Osteossarcoma
OSX
Osterix
PB
Pares de bases
PHF6
PHD finger protein 6
Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase/thymoma viral
PI3K/AKT/MTOR
proto-oncogene/mechanism target of rapamycin
(serine/threonine kinase)
PRC2
Complexo repressivo polycomb 2
PRKACB
cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit beta
RANKL
Receptor activator of NF-kappa-B ligand
RB1
Retinoblastoma
RIN
RNA Integrity number
RNA
Ácido ribonucléico
RNA POL II
RNA polimerase II
RNase
Ribonuclease
ROC
Receiver Operating Characteristics
RT-qPCR
Reação em cadeia da polimerase quantitativa
SAME
Serviço de Arquivo Médico Especializado
SAOS2
Linhagem celular de osteossarcoma
SETD2
SET domain containing 2
SG
Sobrevida Global
SisOnco
Sistema Hospitalar Interno do Hospital de Câncer de Barretos
SLE
Sobrevida Livre de Eventos
SMARCA4
SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator
of chromatin, subfamily a, member 4
SMC1A
Structural maintenance of chromosomes 1A
SPSS 21
Statistical Package for Social Science
TC
Tomografia computadorizada
TCLE
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TP53
Tumor protein p53
TWIST
Twist transcriptor factor
USP7
Ubiquitin specific peptidase 7
ZMYM3
zinc finger, myocyte maintenance-type 3
LISTA DE SÍMBOLOS
%
Porcentagem
~
Aproximadamente
<
Menor ou igual a
>
Maior que
<
Menor que
µm
Micrômetro
mg
Miligrama
mL
Mililitro
rpm
Rotações por minuto
µL
Microlitro
G
Gravidade (unidade de rotação em centrífuga)
°C
Graus Celsius
nm
Nanômetro
ng
Nanograma
mM
Milimolar
µM
Micromolar
U
Unidades
µg
Micrograma
cm
Centímetros
>
Maior ou igual a
P
Valor de p
vs
versus
RESUMO
Uzan VRM. A Expressão gênica dos RNAs não codificadores HOTAIR, MALAT1, HULC E
BCYRN1 em osteossarcoma. Dissertação (Mestrado). Barretos: Hospital de Câncer de
Barretos; 2015.
JUSTIFICATIVA: Os tumores ósseos primários representam 5-6% de todos os tumores da
infância e adolescência (0-19 anos), sendo o osteossarcoma o câncer ósseo primário mais
comum nesta faixa etária. Cerca de 20% dos pacientes apresentam metástases ao
diagnóstico e, em torno de 40% evoluirão com metástase, resultando em uma baixa taxa de
sobrevida de 20% em cinco anos. Geneticamente, o osteossarcoma é um tumor
extremamente complexo e por isso, torna-se necessária a busca de marcadores moleculares
que possam indicar o prognóstico, ou mesmo a presença de metástases ao diagnóstico
visando o auxílio do tratamento desses pacientes. OBJETIVO: Os objetivos deste estudo
foram otimizar um protocolo de extração e avaliação da qualidade do RNA em
osteossarcoma, avaliar a expressão gênica de quatro RNAs não codificadores longos
(HOTAIR, MALAT1, HULC E BCYRN1) em amostras de osteossarcoma primário e avaliar o
potencial dessas moléculas como marcadores de prognóstico de pacientes com
osteossarcoma. MATERIAIS E MÉTODOS: Inicialmente, 175 pacientes portadores de
osteossarcoma foram identificados no banco de dados da nossa instituição. Após rigorosos
critérios de inclusão e exclusão, 36 amostras pré-quimioterapia, provenientes de pacientes
diagnosticados entre 2006 e 2013, foram incluídas no nosso estudo. Todas as amostras de
osteossarcoma foram revisadas por um patologista e àquelas que apresentaram pelo menos
50% de tecido tumoral foram submetidas a extração do RNA. Após a extração, as amostras
foram analisadas quanto a integridade do RNA, quantificadas e a expressão dos genes foi
avaliada por meio da RT-PCR em tempo real. RESULTADOS: No nosso trabalho a média de
idade dos pacientes foi de 15 anos, sendo a maioria (55,6%) do sexo feminino. A localização
mais frequente do tumor foi o fêmur (44,4%) e o subtipo histológico osteoblástico foi
predominante (77,8%). A maioria dos pacientes no estudo apresentou resposta parcial à
quimioterapia (72,2%) e 44,9% dos pacientes apresentaram metástases ao diagnóstico ou
durante o tratamento. Em relação a expressão dos lncRNAs, nossos resultados mostraram
que existe uma ampla variação na expressão dos quatro genes propostos entre as amostras
e que a média de expressão maior dos genes BCYRN1 e MALAT1 foi associada
significativamente a idade superior a 10 anos. Após categorização da expressão, observamos
que a maioria dos pacientes que apresentaram baixa expressão do gene BCYRN1 pertenciam
ao grupo do tipo histológico osteoblástico. Para o gene HOTAIR, a alta expressão foi
associada à pacientes com tumor menor que 12 cm ao diagnóstico, e para o MALAT1, a alta
expressão foi observada em pacientes com idade ao diagnóstico igual ou superior a 10 anos.
CONCLUSÕES: Nossos achados demostraram que a maior expressão de BCYRN1 e MALAT1
foi associada significativamente a pacientes com idade acima de 10 anos. Não encontramos
associação significativa entre a expressão dos genes e a sobrevida dos pacientes. Nossos
dados em conjunto sugerem que a expressão de BCYRN1 e HOTAIR merecem uma
investigação mais abrangente em OS.
PALAVRAS-CHAVE: Osteossarcoma; RNAs não codificadores longos; Metástase; Expressão
Gênica; PCR em Tempo Real; Biomarcadores.
ABSTRACT
Uzan VRM. The gene expression of non-coding RNAs HOTAIR, MALAT1, HULC and BCYRN1 in
osteosarcoma. Dissertation (Master’s degree). Barretos: Barretos Cancer Hospital, 2015.
BACKGROUND: The primary bone tumors represent 5-6% of all tumors of childhood and
adolescence (0-19 years), and osteosarcoma is the most common primary bone cancer in
this age group. About 20% of patients present metastases at diagnosis, and approximately
40% will develop metastatic disease, resulting in low survival rate of 20% in five years.
Genetically, the osteosarcoma is an extremely complex tumor, therefore it becomes
necessary to identify new molecular markers that may predict the prognosis or the presence
of metastasis at diagnosis in osteosarcoma patients. OBJECTIVES: Standardize a protocol for
RNA extraction and quality assessment, evaluate the expression of non-coding RNAs
(MALAT1, HOTAIR, HULC and BCYRNA1) in primary osteosarcoma samples and also to
evaluate the potential role of these molecules as prognostic markers in osteosarcoma.
MATERIAL AND METHODS: Initially, 175 patients with osteosarcoma were identified in the
database of our institution. After stringent criteria for inclusion and exclusion, 36 prechemotherapy samples, from patients diagnosed between 2006 and 2013 were included in
our study. The RNA extraction was performed using the TRIZOL method and, in some specific
cases, using commercial kit. After extraction, the samples were analyzed for their integrity,
quantified, and the gene expression was assessed by real time RT-PCR. RESULTS: The
average age of the patients was 15 years, being the majority (55,6%) female. The most
frequent tumor site was femur (44,4%) and the osteoblastic histologic subtype was
predominant (77,8%). The majority of the patients presented partial response to treatment
(72,2%) and almost half (44.9%) presented metastasis at diagnosis or during treatment.
Regarding the expression of lncRNAs, our results showed that there is a wide variation in the
expression of the proposed four genes between samples and the average higher expression
of BCYRN1 and MALAT1 genes was significantly associated with the age of 10 years. After
categorization of expression in high and low, we observed that most patients with low
expression of the gene BCYRN1 belonged to the osteoblastic histological type group. For
HOTAIR gene overexpression has been associated with patients with lower than 12 cm
tumor diagnosis, and for MALAT1, high expression was observed in patients with age at
diagnosis less than 10 years.
CONCLUSIONS: Our findings showed that the highest expression of BCYRN1 and MALAT1
was significantly associated with patients over the age of 10 years. We found no significant
association between gene expression and patient survival. Our data together suggested that
the expression of BCYRN1 and HOTAIR deserves a comprehensive analysis in OS.
KEYWORDS: Osteosarcoma; long non-coding RNAs; Metastasis; Gene Expression; Real-Time
Polymerase Chain Reaction; Biomarker.
1
1
INTRODUÇÃO
1.1
Osteossarcoma
Os tumores ósseos primários representam 5-6% de todos os tumores da infância e
adolescência (0-19 anos), sendo o osteossarcoma (OS) o câncer ósseo primário mais comum
nesta faixa etária. O OS apresenta uma distribuição bimodal de idade, sendo o primeiro pico
observado na segunda década de vida (14-19 anos) e o segundo pico a partir da sexta
década de vida (60 anos)1.
Em geral, a incidência na população é de 2-4 casos/milhão ao ano, entretanto na
adolescência (15-19 anos) a incidência pode chegar a 8-10 casos/milhão ao ano. O OS
representa de 10 a 15% dos tumores sólidos extracraniais nesta faixa etária 1, 2. Nos Estados
Unidos (EUA) são esperados aproximadamente 400 novos casos de OS por ano, em
indivíduos até 20 anos3. No Brasil, a maior incidência deste tipo de tumor está registrada no
estado de São Paulo4, no qual são descritos 648 casos (~ 54 casos/ano) de OS entre 2000 e
junho de 2012, em pacientes de 0 a 18 anos5. No Hospital de Câncer Infantojuvenil de
Barretos (HCB) há registro de 225 casos de OS entre os anos 2000 e 2013.
O OS é um tumor maligno definido pela presença de células mesenquimais alteradas
que produzem osteóide e/ou tecido ósseo imaturo6. Se origina mais frequentemente na
região metafisária dos ossos longos, no interior da cavidade medular e penetra no córtex
ósseo, envolvendo e invadindo os tecidos moles adjacentes7. Na classificação atual da
Organização Mundial de Saúde (OMS), o OS pode ser dividido em: convencional,
telangectásico, de pequenas células, central de baixo grau, secundário, parosteal, periosteal
e, por último, de superfície de alto grau. O diagnóstico histológico do tipo convencional
compreende a grande maioria deste tipo de tumor e é dividido em três subtipos:
osteoblástico, condroblástico e fibroblástico, dependendo do tipo predominante de matriz
presente no tumor6. O subtipo histológico não tem impacto sobre a resposta à
quimioterapia e os pacientes recebem o mesmo tratamento, independentemente do
subtipo histológico, sugerindo que estes vários padrões de diferenciação são reflexo de uma
única entidade clínica8.
Historicamente, o prognóstico de pacientes com OS tratados apenas com cirurgia e/ou
radioterapia era ruim, com sobrevida em torno de 20% em dois anos9. A maioria desses
pacientes iria ao óbito devido à evolução da doença e estabelecimento de metástases
2
pulmonares6. A introdução da quimioterapia sistêmica no tratamento do OS resultou em
uma melhora significativa no prognóstico dos pacientes, elevando a sobrevida livre de
eventos a 60 – 70%, em três anos, nos casos de OS localizados de extremidades10-12.
Aproximadamente, 15-20% dos pacientes com OS apresentam metástases ao
diagnóstico, detectadas por exames radiológicos, como a tomografia computadorizada (TC)
e, adicionalmente em torno de 40% evoluirão com metástase em fases posteriores durante
o tratamento12, 13. As metástases são muito frequentes nos pulmões (~80%), mas também
podem ocorrer em outros sítios ósseos, medula óssea e, raramente, em linfonodos. Os sítios
metastáticos da doença comumente apresentam resistência ao tratamento, resultando em
uma baixa taxa de sobrevida do paciente, em torno de 20% em cinco anos12, 14, 15.
O tratamento para o osteossarcoma preconiza a utilização combinada de
quimioterapia em altas doses, ressecção da lesão primária e de todos os sítios metastáticos
da doença, geralmente por toracotomia exploratória com apalpação de todo pulmão 16. Na
busca de novas alternativas para o sucesso no tratamento do osteossarcoma, o Grupo
Brasileiro para Tratamento de Osteossarcoma (GBTO)17, posteriormente Grupo Latino
americano de Oncologia Pediátrica (GALOP), vem publicando estudos propondo
modificações nos esquemas de tratamento quimioterápico a fim de melhorar a sobrevida
desses pacientes. Entretanto, os resultados encontrados mostraram que mesmo
intensificando o tratamento não houve melhora no grau de necrose ou na taxa de
sobrevivência17. Aproximadamente, 30% de todos os pacientes com metástase pulmonar ao
diagnóstico e, mais do que 40% daqueles que alcançarem uma remissão cirúrgica completa
podem apresentar bom prognóstico a longo prazo15. O tratamento para recidiva local ou nos
pulmões é inicialmente cirúrgico. A recorrência de metástase pulmonar é frequente e,
embora o prognóstico destes pacientes seja ruim, com uma sobrevida pós-recaída de 20%
em cinco anos, a retirada da lesão deve ser realizada quando viável18. Em contraste, quando
isso é possível em torno de 33% dos pacientes com múltiplas recorrências ressecáveis
sobrevivem cincos anos ou mais19.
Assim, a detecção da metástase ao diagnóstico ou mesmo o acompanhamento da
lesão metastática é essencial no tratamento do OS. Atualmente, a técnica padrão utilizada
na detecção e seguimento da metástase pulmonar é TC de tórax. Entretanto, tal técnica
tende a subestimar o número de metástases pulmonares e também pode falhar na
3
identificação de metástases ao diagnóstico, o que pode levar a um tratamento inadequado
destes pacientes19.
1.2
Alterações genéticas associadas ao osteossarcoma
Geneticamente, o OS é um tumor extremamente complexo, não havendo uma
alteração específica identificada neste tipo de sarcoma. Apesar dessa complexidade genética,
existem numerosos achados quanto às alterações genéticas que podem estar associadas à
patogênese do OS20. A descoberta de tais alterações foi originada de estudos que avaliaram
modelos animais (rato) de OS, síndromes de predisposição genética, fatores etiológicoambientais e a abordagem direta destes tipos de tumores21.
Diversos modelos animais que apresentam diferentes alterações genéticas
desenvolvem OS. Como exemplo, podemos citar os animais com alterações em Tp53, dos
quais cerca de 40-50% desenvolvem OS22, 23; em Bax e Arf, dos quais 44%24; em Hic1, dos
quais 40%25; entre outros. Entre as síndromes familiais que predispõe os indivíduos ao
desenvolvimento de OS pode-se destacar a síndrome de Li-Fraumeni e do Retinoblastoma,
apresentando alterações nos genes Tp53 e Rb1, respectivamente26,
27.
Em relação aos
fatores ambientais, agentes físicos, químicos e biológicos têm sido sugeridos como
carcinógenos para o OS. Entre eles, a ação da radiação ionizante já tem sido associada ao
maior risco de desenvolvimento de OS28. Uma variedade de genes também é descrita com
alterações nos OS que ocorrem de forma esporádica. Entre eles podemos citar: TWIST, MYC,
CDKN2A, CDKN2B, FGFR2, MDM2, MAPK7, MAP2K4, MMP9, entre muitos outros29. TesserGamba et al.30 estudaram a expressão de 10 genes localizados em regiões de rearranjo
cromossômico em OS. Dentre eles, encontravam-se os genes MAPK7 e MAP2K4 que
estavam altamente expressos na maioria das amostras analisadas e a expressão desses
genes foi significativamente associada com a presença de metástase ao diagnóstico, baixa
resposta à quimioterapia e pior sobrevida global.
Com o intuito de encontrar alvos moleculares para as terapias existentes ou em
desenvolvimento, um estudo realizado com pacientes após recaída de OS avançado,
encontrou comumente alterações na via PI3K/Akt/mTOR e sugeriu que existe uma elevada
diversidade molecular nesta doença e a necessidade de mais estudos para definir subgrupos
distintos de alterações genéticas31.
4
Um estudo que avaliou alterações em 633 genes reguladores epigenéticos em
amostras de 1000 tumores pediátricos diversos revelou que 72 genes estavam
recorrentemente mutados em todo o grupo de pacientes estudados. Os pacientes
portadores de OS apresentaram altas taxas de mutação nos genes reguladores epigenéticos,
tais como, H3F3A, PHF6, ATRX, KDM6A, SMARCA4, ASXL2, CREBBP, EZH2, MLL2, USP7, ASXL1,
NSD2, SETD2, SMC1A e ZMYM332.
Outro estudo teve como objetivo mostrar o comportamento metastático do OS
através da expressão dos genes e da análise citogenética e encontrou que os genes MDM2,
CXCR4, RANKL, RB1 e OSX possuem expressões modificadas de acordo com o momento do
surgimento da metástase (ao diagnóstico ou durante o tratamento), podendo haver perda
do RANKL ou ganho do CXCR4 em tumores de pacientes metastáticos ao diagnóstico.
Eventos como esses, facilitam a progressão da metástase concomitante com o
estabelecimento do tumor primário e apoiam o papel do receptor CXCR4 em direcionar a
metástase para o pulmão. Por outro lado, acontecimentos tardios, como a perda do RB1 e
ganho de MDM2, que são genes reguladores fundamentais do ciclo celular, parece estar
relacionada com os mecanismos finais que contribuem para o estabelecimento da metástase
no OS33.
Alterações cromossômicas também são frequentes no OS. A utilização de técnicas
convencionais de citogenética tem demonstrado como as mais comuns o ganho do
cromossomo 1 e as perdas dos cromossomos 2, 6, 8, 9, 10, 13 e 17 34, 35. Ainda, rearranjos
cromossômicos foram descritos envolvendo os cromossomos 1, 4, 6, 7, 11, 12, 14, 15, 17, 19
e 2236, 37. Esses dados sugerem que a instabilidade genômica é frequente e importante para
o desenvolvimento do OS e envolve vias que normalmente mantém a integridade genômica.
Apesar de todo esse conhecimento sobre as alterações moleculares envolvidas na
patogênese do OS, a doença metastática ainda é um desafio, sendo o processo metastático
pouco compreendido na evolução do OS. Dessa forma, há uma necessidade crítica de
identificar marcadores que possam indicar com precisão ou predizer a existência de doença
metastática em pacientes com OS, uma vez que a maioria desses pacientes apresenta
doença micrometastática não detectável pelos exames de imagem ao diagnóstico. Além
disso, estratificar os pacientes de maneira correta pode auxiliar no correto manejo do
tratamento, principalmente nos pacientes não metastáticos, que podem ser beneficiados
com tratamentos menos tóxicos sem piora na resposta ou prognóstico.
5
1.3
Os RNAs não codificadores longos (lncRNAs)
Nos últimos anos, principalmente com o desenvolvimento de novas técnicas como o
sequenciamento em larga escala e os DNA tiling arrays, houve uma revolução na nossa visão
em relação à organização e conteúdo do genoma humano. Previamente ao que era
assumido, tais técnicas revelaram o achado inesperado de que a maior parte do genoma
humano é transcrito em RNA. Atualmente, estima-se que mais de 70% do genoma humano
seja transcrito, entretanto apenas 2% servem de modelo para a produção de proteínas 38, 39.
Assim, as moléculas de RNA que não possuem a capacidade de codificar proteínas são
denominadas como RNAs não codificadores (ncRNAs).
De acordo com o seu tamanho, os ncRNAs são divididos em duas classes principais: os
ncRNAs pequenos (< 200 nucleotídeos) e os ncRNAs longos (lncRNAs > 200 nucleotídeos).
Recentemente, os ncRNAs pequenos têm recebido mais atenção, especialmente os
microRNAs (miRNAs) que têm sido descritos com um papel crucial no desenvolvimento de
diversas doenças, incluindo o câncer40. Entretanto, torna-se cada vez mais claro o fato de
que o genoma de mamíferos também codifica vários lncRNAs, definidos como RNAs
endógenos com tamanho superior a 200 nucleotídeos que não apresentam uma significativa
fase aberta de leitura (menos de 100 aminoácidos), dessa forma não resultando em
proteína41. A maioria dos lncRNAs descritos até o momento é transcrito pela RNA polimerase
II (RNA pol II) e são poliadenilados42, entretanto em alguns casos, como o BCYRN1, apesar de
funcionais os lncRNAs não são poliadenilados43.
Assim, os lncRNAs constituem um grupo heterogêneo de moléculas de RNA e podem
atuar de diversas maneiras diferentes em funções biológicas e moleculares nas células.
Dentre suas diversas funções, em geral os lncRNAs podem regular a expressão gênica44,
influenciar a localização das proteínas45 e, ainda, são importantes para a formação de
subestruturas celulares ou complexos proteicos essenciais para as células46. A figura 1
demonstra as funções celulares de alguns dos lncRNAs já descritos.
6
Fonte: Gutschner & Diederichs47
Figura 1. Funções celulares atribuídas aos diversos lncRNAs conhecidos. A) lncRNAs podem ser processados
em ncRNAs pequenos que podem alvejar outros RNAs, o que subsequentemente leva a degradação do RNA
alvo; B) lncRNAs podem atuar como “esponjas” de miRNAs, assim inibindo sua função e influenciando na
expressão dos RNAs alvos do miRNA; C e H) lncRNAs são importantes na formação de estruturas subcelulares e
complexos de proteínas, nos quais desempenham uma função de arcabouço; D) lncRNAs podem interagir com
proteínas alterando sua função e localização celular; E) lncRNAs regulam a expressão gênica pelo recrutamento
de fatores de transcrição a região promotora dos seus genes alvos; F) lncRNAs podem regular o mecanismo de
splicing alternativo de pré-mRNAs; G) lncRNAs podem interagir com complexos de remodelamento de
cromatina e induzir alterações locais ou globais no “empacotamento” da cromatina.
Os lcnRNAs frequentemente se sobrepõem com ou estão intercalados a transcritos
codificantes e não codificantes42. Em termos de posição genômica, os lncRNAs podem ser
agrupados em cinco diferentes categorias: (1) senso ou (2) antisenso, quando sobrepõe um
ou mais exons de outro transcrito na mesma fita ou na fita oposta de DNA, respectivamente;
(3) bidirecional, quando sua expressão e a de um transcrito adjacente na fita oposta é
iniciada em regiões genômicas próximas; (4) intrônico, quando se origina de um intron de
um segundo transcrito e; (5) intergênico, quando ocorre como uma unidade independente
dentro do intervalo genômico entre dois genes (Figura 2).
7
Fonte: criado por Vidal DO, 2013.
Figura 2. Organização genômica dos lncRNAs. A linha preta representa a fita de DNA; As caixas pretas
representam os exons, a linha preta pontilhada representa a posição dos introns e as setas indicam a direção
de transcrição dos genes.
Muitos estudos vêm sendo desenvolvidos no intuito de identificar novos lncRNAs. Um
dos relatos mais recentes identificou 5.440 lncRNAs no genoma humano que quando
combinados com o resultado de outros quatro estudos resultou em aproximadamente 7.000
lncRNAs48. Estimativas recentes levam a crer que existam mais de 20.000 lncRNAs transcritos
no genoma humano, implicando que esta classe de lncRNAs representará um enorme, ainda
desconhecido, componente de redes celulares normais que pode estar alterado na biologia
da célula tumoral49.
8
De fato, os lncRNAs são frequentemente expressos de forma específica seja em uma
doença, tecido ou estágio de desenvolvimento, o que torna tais moléculas alvos atrativos a
novas terapias voltadas às funções específicas dos lncRNAs tanto no desenvolvimento
quanto em doenças50, 51. No entanto, nossos conhecimentos de como os lncRNAs podem
agir nas células e quais funções eles podem ter nas doenças, como o câncer, ainda é muito
limitado.
1.4
Os lncRNAs associados aos processos de invasão e metástase em tumores humanos
Uma das principais características do câncer é a sua habilidade de invadir tecidos
adjacentes e promover a formação de metástases à distância, é também um dos maiores
desafios no tratamento oncológico e implica na interação e regulação de complexos
mecanismos biológicos. Frequentemente, as células tumorais passam por alterações
morfológicas, hoje conhecidas como transição epitélio-mesênquima, modificando sua
interação célula-célula ou célula-matriz. Portanto, toda essa cascata de invasão e metástase
compreende múltiplas alterações biológicas que permitem as células invadirem tecidos
sadios, seguido da intravasão nos vasos sanguíneos e linfáticos. Durante este trânsito na
corrente sanguínea, as células escapam da vigilância do sistema imune e adquirem a
capacidade de crescimento independente de ancoragem, além de extravasarem nos tecidos
alvos e promover a instalação de micrometástases e posteriormente o crescimento de um
tumor52. Neste contexto, alguns lncRNAs têm sido descritos como tendo um papel
fundamental no processo metastático. Dentre eles podemos destacar o MALAT1, HOTAIR,
HULC e BCYRN1.
1.4.1 MALAT1 (Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1)
Um dos primeiros lncRNAs a ser descrito com tal papel foi o MALAT1, um transcrito de
8kb, localizado no cromossomo 11q13.1 que é um ponto de quebra frequente de
translocações cromossômicas associadas ao câncer53-55. MALAT1 fica retido no núcleo e está
localizado nos speckles nucleares, que são estruturas envolvidas no processamento do prémRNA56. Recentemente, MALAT1 foi demonstrado atuando na regulação do splicing
alternativo de pré-mRNAs pela modulação dos níveis de fatores de splicing. A supressão de
MALAT1 altera o processamento de um conjunto de pré-mRNAs, os quais desempenham um
9
papel importante na biologia do câncer. Esse gene também é altamente conservado entre
diversas espécies ressaltando sua importância funcional53.
Primeiramente, o MALAT1 foi descrito com um aumento de expressão no tumor
primário, como um marcador prognóstico de metástase e pior sobrevida de pacientes
acometidos pelo carcinoma de pulmão de células não pequenas. Essa associação com a
metástase se mostrou estágio e histologia específica, dessa forma servindo como fator
prognóstico independente na sobrevida do paciente em estágios iniciais do adenocarcinoma
de pulmão57. A expressão de MALAT1 foi observada em diversos tecidos normais, com os
maiores níveis de expressão em pâncreas e pulmão57, entretanto sua expressão está
aumentada em uma gama de outros tumores quando comparados aos tecidos normais
correspondentes como, por exemplo, no carcinoma hepatocelular58. MALAT1 pode estar
associado com parâmetros clínicos e pode controlar a proliferação celular, a apoptose, a
migração, invasão, ou a disseminação metastática nas células tumorais59.
Um estudo demonstrou que o MALAT1 promove a mobilidade celular em células
tumorais de pulmão, por meio da regulação transcricional ou pós-transcricional de genes
importantes para este mecanismo celular60. Adicionalmente, MALAT1 suporta a proliferação
e invasão de células de câncer cervical (CaSki), e sua inibição leva ao aumento de expressão
de proteínas pró-apoptóticas como caspase 3, 8 e Bax61.
A expressão de MALAT1 também foi avaliada em pacientes com mieloma e mostrou
estar superexpresso em pacientes recém diagnosticados em comparação com pacientes pós
tratamento. A expressão desse gene foi relacionada com o status da doença e a mudança da
expressão pós tratamento teve relevância prognóstica. Pacientes que sofreram progressão
precoce tiveram uma alteração significativamente menor na expressão de MALAT1 após
tratamento. Sendo assim, MALAT1 mostrou ter um papel fundamental na patogênese do
mieloma62.
Recentemente, MALAT1 foi associado com o processo de proliferação e metástase em
osteossarcoma, através da ativação da via PI3K/Akt. Esses resultados indicaram que MALAT1
pode ser considerado como alvo terapêutico no osteossarcoma humano63.
1.4.2 HOTAIR (HOX transcript antisense RNA)
O HOTAIR é um gene de 2.2 kb localizado no cromossomo 12q13.13. HOTAIR atua na
interação e recrutamento do complexo repressivo polycomb 2 (PRC2) no locus do gene
10
HOXD o que leva ao silenciamento transcricional de 40 kb a montante44. Devido a sua
importância na regulação epigenética da expressão gênica, não é surpreendente que a
expressão de HOTAIR esteja alterada em uma série de tumores.
Em um dos primeiros relatos, a expressão aumentada de HOTAIR foi associada a
tumores primários de mama em relação ao tecido normal. Ainda, o seu nível de expressão
nos tumores primários correlacionou-se positivamente com a ocorrência de metástases e
pior prognóstico nestes pacientes. A superexpressão de HOTAIR em células epiteliais
cancerosas levou ao aumento do potencial de invasão e formação de metástases destas
células. Em contrapartida, a supressão de HOTAIR levou a inibição de tais processos
biológicos64. Resultados semelhantes foram descritos em carcinoma hepatocelular, no qual a
expressão de HOTAIR também está aumentada em tumores primários e parece ser um
biomarcador potencial para ocorrência de metástases em linfonodos. Ainda, a expressão de
HOTAIR mostrou-se um fator independente de prognóstico associado à recorrência da
doença e sobrevida menor dos pacientes. A depleção de HOTAIR em células tumorais do
fígado reduz a capacidade de invasão e viabilidade dessas células65. Somado a isso, a
supressão de HOTAIR torna as células cancerígenas mais sensíveis à ação de quimioterápicos
como a cisplatina e doxorrubicina66.
A alta expressão do HOTAIR ainda está relacionada ao potencial invasivo e metastático
do adenocarcinoma gástrico67, do melanoma68, do carcinoma endometrial69 e do câncer de
colo de útero70, entre outros. Xue et al.71 identificaram variantes genéticas do HOTAIR que
se associam a um risco aumentado de câncer colorretal. Meta-análises recentes confirmam
a associação entre a expressão elevada de HOTAIR com prognóstico desfavorável e
sobrevida reduzida em um grande número de malignidades72, 73.
1.4.3 HULC (Hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA)
O HULC é um gene de 500kb localizado no cromossomo 6p24.3. HULC foi inicialmente
descrito como um ncRNA específico do fígado que é altamente expresso em tumores
primários do fígado74. Também apresenta expressão elevada em metástases hepáticas de
pacientes com carcinoma colorretal, entretanto não é expresso nestes tumores primários 75.
Recente relato demonstrou que HULC funciona como uma “esponja” de miRNAs, se ligando
e provocando a diminuição da expressão de uma série de miRNAs, incluindo o miR-372. A
redução na expressão deste miRNA leva ao aumento da expressão do seu alvo PRKACB, que
11
por sua vez induz a fosforilação de CREB. Isso resulta na alteração dos processos de
deacetilação e metilação de histonas, gerando um impacto no remodelamento da cromatina
alterando assim a expressão de uma série de genes76.
Um estudo comparou a expressão tecidual e plasmática do HULC entre pacientes com
hepatocarcinoma e um grupo controle. Além de serem constatados níveis significativamente
maiores de HULC no tecido/plasma de pacientes com hepatocarcinoma, houve relação
direta entre os valores de expressão do HULC e outras variáveis, como o grau de
diferenciação histológica. Estes resultados sugerem um potencial uso deste RNA como
biomarcador diagnóstico e/ou prognóstico77.
Um trabalho mostrou superexpressão do HULC em tecidos de câncer gástrico,
notando-se associação direta com estádios mais avançados e presença de metástases. O
mesmo trabalho estudou os efeitos da superexpressão e do “knockdown” da expressão do
HULC em células, determinando que o HULC desempenha papel importante na proliferação,
migração e invasão celular, bem como na inibição da apoptose78.
Outro estudo investigou a expressão do HULC em tecidos de câncer de pâncreas,
observando-se correlação significativa entre maior expressão do gene com tamanho
tumoral, invasão vascular e o estádio da doença79.
1.4.4 BCYRN1 (Brain cytoplasmic RNA 1)
O BCYRN1, também conhecido como BC200, é um gene de 200pb localizado no
cromossomo 2p21, que é especificamente expresso em tecidos do sistema nervoso. Sua
expressão já foi descrita em células germinativas, entretanto normalmente não é expresso
em tecidos somáticos de origem não neural. Uma análise em 19 tipos diferentes de tumor
revelou sua expressão nos carcinomas de mama, colo do útero, esôfago, pulmão e ovário,
mas não nos tecidos normais correspondentes80. Em outro trabalho, os autores
identificaram a expressão elevada de BCYRN1 em carcinoma invasivo de mama, mas não em
tecido normal. Uma análise de sensibilidade e especificidade confirmou o poder prognóstico
da expressão do BCYRN1 como um marcador molecular deste tipo de tumor. Além disso, em
carcinoma ductal in situ, a expressão de BCYRN1 foi relacionada com alto grau nuclear,
apontando que possa ser utilizado como marcador prognóstico de progressão tumoral 43.
Tais exemplos deixam evidente o importante papel funcional dos lncRNAs para a
ativação do mecanismo de invasão celular e formação de metástases. De fato, os lncRNAs
12
descritos podem regular uma gama de genes envolvidos nestes processos. Por fim, lncRNAs
especificamente expressos ou silenciados em tumores humanos podem desenvolver um
papel importante no estabelecimento do fenótipo tumoral e, portanto, representar um
grupo de potenciais novos alvos terapêuticos no combate ao câncer.
Visto isso, nós avaliamos a expressão dos lncRNAs MALAT1, HOTAIR, HULC e BCYRN1
em amostras primárias de osteossarcoma ao diagnóstico e o potencial papel destas
moléculas como marcadores prognósticos nesta doença.
13
2
JUSTIFICATIVA
Os lncRNAs estão associados a regulação da expressão gênica e podem atuar por
diferentes mecanismos. Os lncRNAs MALAT1, HOTAIR, HULC e BCYRN1 já foram associados a
diversos fatores prognóstico como presença de metástase, baixa resposta à quimioterapia e
o processo metastático em tumores humanos. Nossa hipótese é de que esses genes também
possam estar envolvidos com a progressão do tumor, resistência ao tratamento e o processo
metastático em osteossarcoma. Como estes tumores são muito agressivos e metade dos
pacientes apresenta metástase ao diagnóstico ou durante o tratamento, com um
prognóstico muito pobre, a avaliação dessas moléculas pode indicar novos marcadores
biológicos com potencial prognóstico para este tumor, bem como novos alvos para terapias
alternativas no osteossarcoma.
14
3
3.1
OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar a expressão gênica de MALAT1, HOTAIR, HULC e BCYRN1 em amostras de
osteossarcoma e avaliar o potencial papel destes genes como marcadores prognósticos
nesses pacientes.
3.2
Objetivos específicos

Otimizar um protocolo de extração e análise de qualidade de RNA em osteossarcoma;

Correlacionar a expressão dos genes com os dados clínico-patológicos dos pacientes;

Analisar a sobrevida global e sobrevida livre de eventos dos pacientes de acordo com a
expressão dos genes avaliados.
15
4
4.1
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostras e seleção dos pacientes
O levantamento dos pacientes diagnosticados com OS entre os anos de 2006 e 2013
foi realizado por meio do SisOnco, um sistema informatizado, o qual contém a base de
dados da patologia do Hospital de Câncer de Barretos (HCB). Nesse período, foram
identificados 175 pacientes com OS. Ainda, por meio de uma colaboração estabelecida com
o Dr. Carlos Alberto Scrideli, 32 amostras de RNAs de OS provenientes do Banco de Tumores
do Laboratório de Pediatria da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de
São Paulo (FMRP/USP) foram incluídas em nossas análises.
Além das amostras de osteossarcoma, também avaliamos expressão dos genes de
interesse em uma linhagem celular não tumorigênica de osteossarcoma (SAOS).
Para a avaliação dos critérios de elegibilidade, foi utilizada uma ficha de coleta de
dados (Anexo A), contendo 62 parâmetros. Através dos dados obtidos em prontuário, a ficha
foi preenchida e criou-se um banco de dados no programa SPSS 21.
4.2
Critérios de inclusão
Os participantes deste estudo atenderam aos seguintes critérios de inclusão:

Qualquer idade ao diagnóstico;

Diagnóstico definido de osteossarcoma (ósseo), de qualquer localização anatômica e
histologia;

Tratamento realizado pela equipe de Pediatria;

Com metástase ou não ao diagnóstico;

Amostras criopreservadas disponíveis para a extração de RNA.
4.3
Critérios de exclusão
Os critérios de exclusão deste estudo foram:

Pacientes cujo início do tratamento quimioterápico ocorreu anteriormente a coleta do
material biológico;

Amostras que não possuíam representatividade de tumor maior que 50%;

Amostras cuja integridade do RNA estava comprometida (RIN < 4.0);

Diagnóstico de osteossarcoma como 2º tumor primário.
16
4.4
Aspectos éticos
O projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) da Fundação Pio XII –
HCB (aprovado em abril de 2013 – número de referência 251.134) e do Hospital das Clínicas
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP)
(aprovado em setembro de 2014), de modo a atender as exigências da Resolução nº
466/2012 do Conselho Nacional de Saúde/Ministério da Saúde (Anexo B).
A dispensa do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) foi concedida pelo
CEP por se tratar de um estudo com uso de amostras retrospectivas e de risco mínimo para
os participantes da pesquisa, sendo este risco inerente a quebra acidental do sigilo de
informações. Os pesquisadores envolvidos se comprometeram a garantir o sigilo de todos os
pacientes, não divulgando publicamente o nome ou qualquer outra informação que possa
identificar os pacientes envolvidos neste estudo.
4.5
Coleta dos dados
A coleta dos dados clínicos-patológicos foi realizada no SAME (Serviço de Arquivo
Médico Especializado) na Fundação Pio XII – HCB e no mesmo departamento da Fundação
Pio XII - Hospital de Câncer Infantojuvenil de Barretos. Os dados clínico-patológicos das
amostras provenientes de Ribeirão Preto foram encaminhados pelo Dr. Carlos Alberto
Scrideli.
4.6
Para as amostras do HCB, um fragmento de tecido congelado de cada amostra
selecionada para o estudo foi descalcificado, incluído em parafina e corado com
hematoxilina/eosina, seguindo os protocolos padronizados no departamento de patologia
do HCB. Em seguida, confeccionou-se lâminas de cada amostra e estas foram avaliadas pelo
patologista Dr. Cristovam Scapulatempo Neto, para determinar a porcentagem de tumor
presente no fragmento estocado e disponível no biobanco da instituição.
As amostras provenientes da FMRP/USP foram submetidas a macrodissecção manual
no laboratório de patologia da instituição, com o intuito de proporcionar o enriquecimento
das amostras para células tumorais. A microdissecção das amostras foi realizada em
criostato refrigerado e utilizando o composto Tissue Tek O.C.T (Sakura). Dois cortes de 810µm foram utilizados na macrodissecção, após a marcação da área tumoral pelo
17
patologista. A macrodissecção das amostras permite o enriquecimento maior do que 80%
para células tumorais.
4.7
Extração de RNA
A extração do RNA total de todas as amostras foi realizada a partir de um fragmento
do tumor congelado, utilizando-se inicialmente o TRIZOL (Life Technologies), de acordo com
as recomendações do fabricante. Brevemente, aproximadamente 30mg de tecido tumoral
foram separadas em um tubo contendo 1mL de TRIZOL e esferas de cerâmica (CK28) para
maceração. Os tecidos foram macerados utilizando o equipamento precellys 24 (Bertin
Technologies) sendo submetidos a pelo menos 2 ciclos de maceração de 6500 rpm durante
10 segundos. Durante o intervalo de 5 minutos entre os ciclos, as amostras eram
armazenadas no gelo.
Após esse passo, todo o conteúdo foi transferido para um tubo de 1,5mL e
acrescentou-se 200L de solução salina 0,9%. As amostras foram incubadas à temperatura
ambiente por 5 minutos e adicionou-se 200L de clorofórmio. Em seguida, as amostras
foram homogeneizadas com auxílio de vórtex por 15 segundos e centrifugadas a 12.000G
por 15 minutos a 4°C. Após centrifugação, foi recolhido o sobrenadante (fase aquosa)
contendo o RNA. O RNA foi precipitado acrescentando-se 500L de isopropanol gelado. Os
tubos foram homogeneizados por inversão e armazenados no freezer a -20°C overnight.
No dia seguinte, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 12.000G na
temperatura de 4°C. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e realizaram-se duas
lavagens do RNA com 1mL de etanol 75%, sendo os tubos centrifugados a 7.500G por 5
minutos na temperatura de 4°C. Ao final, descartou-se o sobrenadante, e o pellet de RNA
resultante ficou à temperatura ambiente pelo tempo necessário para sua completa
secagem. O RNA obtido foi ressuspendido com 20 µL de água milli-Q RNase-free.
Para algumas amostras, que apresentaram baixa qualidade do RNA (RIN<6) a extração
do RNA foi realizada novamente. Assim, o RNA foi extraído novamente utilizando-se o
miRNeasy micro kit (Qiagen), de acordo com as recomendações do fabricante. Brevemente,
30mg de tecido tumoral foram adicionadas a 700µL de Qiazol nos tubos com esferas de
cerâmica (CK28) para maceração. Os tecidos foram macerados da mesma maneira como
descrito anteriormente, seguiram a extração pelo protocolo do kit e foram eluídas em 20 µL
de água milli-Q RNase-free.
18
Após a extração, todas as amostras foram quantificadas e submetidas a análise de
qualidade/integridade do RNA e permaneceram estocadas a -80°C até a sua utilização.
4.8
Avaliação da quantidade e da qualidade do RNA total
A quantificação das amostras de RNA total foi realizada inicialmente no
espectrofotômetro NanoVue® (GE Healthcare Life Sciences) por análise da absorbância a
260nm. A pureza do RNA extraído foi avaliada através do cálculo das razões A260/A280 e
A260/A230, que indicam possíveis contaminações da amostra por proteínas e compostos
fenólicos. Posteriormente, para garantir uma quantificação mais precisa das amostras,
utilizamos uma metodologia de fluorescência com o equipamento Qubit (Life Technologies),
usando um kit que possui sondas moleculares específicas de RNA e portanto, se houver
proteína, DNA, ácidos nucleicos degradados presentes na amostra, estes não irão interferir
na quantificação.
A análise da qualidade do RNA total foi realizada por meio de eletroforese microfluida
no equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies), utilizando o RNA Nano Chip kit
(Agilent Technologies), de acordo com as recomendações do fabricante. Brevemente, após a
preparação do chip foram adicionados 9µL de Small RNA conditioning solution na posição
marcada como CS, 1µL de marcador na posição indicada como ladder e 5µL de RNA small
marker em cada posição do chip reservada para as amostras, bem como na posição do
marcador. As amostras foram desnaturadas por dois minutos a 70°C, para evitar a formação
de estruturas secundárias do RNA, e foi adicionado 1µL (100ng) de cada amostra nas
posições do chip marcadas de 1 a 12. O chip foi agitado no vórtex IKA MS3 (Manca),
horizontalmente por um minuto a 2.200rpm e, em seguida, foi colocado no aparelho para
leitura.
Com o auxílio do Agilent 2100 Expert Software obteve-se o resultado (eletroferograma
e densitometria dos géis) referente à qualidade das amostras que são representados pelo
RNA Integrity Number (RIN). As amostras apresentando RIN entre 1 e 3 foram consideradas
totalmente degradadas; entre 4-7 foram consideradas parcialmente degradadas; entre 8 e
10, amostras íntegras.
19
4.9. Análise de contaminação do RNA com DNA genômico
Dos quatro genes escolhidos nesse estudo, dois (HOTAIR e BCYRN1) são formados por
apenas um exon, sendo assim os ensaios (iniciadores e sonda) para RT-qPCR (PCR em tempo
real) poderiam amplificar o DNA genômico, dessa forma prejudicando a análise de expressão
destes genes. Assim, com o intuito de avaliar a presença de contaminação por DNA nas
amostras de RNA previamente extraídas, nós realizamos uma PCR com iniciadores intrônicos
para o gene KRAS em todas as amostras. A reação foi desenvolvida utilizando-se
aproximadamente 100ng de RNA total, 1x Tampão GoTaq Flexi Buffer, 0,2mM de dNTPs,
2mM de MgCl2, 0,3µM dos iniciadores, 0,5U da enzima Go-Taq Hot Start Polymerase
(Promega), em um volume final de 15µL. Os iniciadores utilizados foram: Direto - 5’
ATGTTCTAATATAGTCACATTTTC 3’ e Reverso - 5’ GTCCTGCACCAGTAATATGC 3’. As amostras
foram incubadas no termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems), de acordo
com as condições descritas na tabela 1.
Tabela 1 - Condições de ciclagem para PCR do gene KRAS
Estágio
Temperatura
Tempo
Desnaturação inicial
96°C
10 minutos
Desnaturação
96°C
45 segundos
Anelamento
56,5°C
45 segundos
Extensão
72°C
45 segundos
Extensão final
72°C
10 minutos
Final
4°C
∞
Ciclos
40 X
A avaliação da amplificação do gene KRAS em todas as amostras foi realizada por
eletroforese em gel de agarose 2% (Life Technologies), corado com corante Ez-vision in gel
10.000x (Amresco,USA).
4.10 Tratamento com DNase
O tratamento com DNase (Sigma-Aldrich) foi realizado seguindo as orientações do
fabricante. Brevemente, a partir de 1µg de RNA o tratamento foi realizado com 1x do
20
tampão da enzima, 1U de DNase I, em um volume final de 10µL. As amostras foram
incubadas a 37°C por 20 minutos. Posteriormente, para inativação da enzima adicionou-se
1µL de Stop Solution (50mM EDTA) e as amostras foram incubadas a 70°C por 10 minutos,
sendo em seguida colocadas no gelo.
Para confirmar a eficiência do tratamento, após tratamento com DNase, a PCR do gene
KRAS foi realizada novamente como descrito anteriormente (tópico 4.9).
4.11 Síntese de cDNA
A síntese do cDNA foi realizada a partir de 1µg de RNA total tratado com DNAse
utilizando o High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies), de acordo com
as recomendações do fabricante. Brevemente, 1µg de RNA total tratado foi adicionado a 1x
RT buffer, 4mM de dNTPs, 1x RT Random primers, 50U de MultiScribe Reverse Transcriptase
e 20U de RNAse Inhibitor, em um volume final de 20µL. As amostras foram incubadas a 25°C,
por 10 minutos, 37°C por 120 minutos, 85°C por 5 minutos. A reação foi realizada no Veriti
Thermal Cycler (Applied Biosystems).
4.12 Análise de expressão dos RNAs não codificadores longos por RT-qPCR .
A análise de expressão dos quatro lncRNAs foi realizada por RT-qPCR utilizando-se os
ensaios PrimeTime qPCR assay (Integrated DNA Technologies). Estes ensaios contêm sondas
e iniciadores específicos que permitem a amplificação e avaliação da expressão do gene de
interesse.
Após a síntese, 1µL do cDNA foi utilizado como molde nas reações de RT-qPCR que
foram realizadas com 1x Kapa Probe Fast Master Mix (Kapa Biosystems), 1x PrimeTime qPCR
assay (50X) específico para o gene em análise, em um volume final de 20µL. Essa reação foi
desenvolvida a 95°C por 10 minutos; seguida de 40 ciclos a 95°C por 15 segundos e 60°C por
1 minuto.
Além dos genes de interesse, foi realizada a avaliação dos genes endógenos ACTB e
GAPDH que serviram para a normalização dos dados de expressão dos genes de interesse
avaliados.A expressão normalizada de cada gene de interesse do estudo foi calculada por
meio do modelo matemático 2-∆Ct, no qual o ∆Ct corresponde ao Ct do gene de interesse
subtraído pelo Ct do gene normalizador81. A análise de expressão foi realizada no 7900 HT
21
Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems) e todas as reações foram realizadas em
duplicata.
4.13 Análise estatística
Os dados obtidos dos prontuários foram digitados e arquivados em um banco de
dados com auxílio do programa Statistical Package for Social Science (SPSS) versão 21.0. A
análise estatística foi realizada utilizando-se o mesmo programa.
Para este estudo, foram consideradas as variáveis epidemiológicas: sexo e idade ao
diagnóstico e variáveis clínico-patológicas: tipo histológico, grau de Huvos, localização do
tumor, tamanho do tumor, presença ou ausência de metástase e momento do diagnóstico
da metástase.
Para a análise estatística, algumas variáveis foram categorizadas da seguinte forma:

Sexo: masculino ou feminino;

Idade: menor/igual ou superior a 10 anos;

Tipo histológico: osteoblástico ou condroblástico/fibroblástico/telangectásico;

Grau de Huvos: grau 1/2 ou grau 3/4;

Local do tumor: fêmur ou fíbula/tíbia/úmero;

Tamanho do tumor: menor/igual ou superior a 12cm; a medida foi realizada por um
radiologista através de exames de imagem ao diagnóstico (Raio X /Ressonância/Tomografia
computadorizada;

Presença de metástase: Ausente ou Presente;

Momento do diagnóstico da metástase: não metastático ou metástase ao diagnóstico
ou metástase após diagnóstico;
As variáveis contínuas foram apresentadas como média, desvio padrão, mediana,
valores mínimo e máximo. As variáveis categóricas foram apresentadas pelas frequências e
porcentagens.
Inicialmente, a expressão gênica foi considerada como uma variável numérica e a
correlação da média de expressão dos genes com os fatores clínico-patológicos considerados
no estudo foi realizada utilizando-se o teste de Mann-Whitney. A avaliação da diferença da
qualidade do RNA medida pelo RIN, entre os métodos de extração utilizados (kit ou TRIZOL),
também foi realizada pelo teste de Mann-Whitney.
22
Posteriormente, para categorizar a expressão dos genes foi determinado um ponto de
corte utilizando a curva ROC e considerado o melhor ponto aquele que apresentou a melhor
sensibilidade e especificidade na comparação entre pacientes não metastáticos e
metastáticos. Para a avaliação desse ponto, foram analisados a área sob a curva (AUC), a
sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia e
seus respectivos intervalos de confiança de 95%.
Após essa análise, a expressão dos genes foi correlacionada com as características
clínicas por meio do teste de qui-quadrado ou teste exato de Fisher, quando os pressupostos
no teste do qui-quadrado não foram satisfeitos. Como a variável metástase foi divida em
três categorias (não metastático, metástase ao diagnóstico ou metástase após o
diagnóstico), utilizou-se o teste Kruskal-Wallis para avaliar a correlação com a expressão dos
genes.
A sobrevida global (SG) foi definida como o período da admissão (diagnóstico) até a
avaliação mais recente de acompanhamento ou óbito. Para a análise da sobrevida livre de
eventos (SLE), foi considerado como evento a recaída, a progressão de doença ou óbito (o
que ocorreu primeiro). O tempo até o evento foi estimado entre a data do diagnóstico até a
data do evento.
Para estimar os tempos de sobrevida global e os tempos de sobrevida livre de evento
utilizou-se o método de Kaplan-Meier. Para a comparação das curvas de sobrevida em
relação a cada categoria dentro de uma determinada variável utilizou-se o teste nãoparamétrico de LogRank.
Para todas as análises foi considerado um nível de significância de 5%.
23
5.
5.1
RESULTADOS
Tamanho da Amostra
Nos registros do HCB, das 175 amostras identificadas inicialmente, 76 permaneceram
elegíveis para análise após avaliação dos prontuários.
As demais foram excluídas pelos seguintes critérios:

68 amostras foram coletadas após início de quimioterapia;

12 amostras de pacientes que não receberam tratamento no Departamento de
Pediatria do HCB;

05 amostras possuíam classificação incorreta pelo SisOnco;

03 amostras eram de recidiva;

02 amostras com radioterapia prévia;

03 amostras de metástase;

03 amostras com laudo inconclusivo;

02 amostras não estavam armazenadas no Biobanco;

01 amostra com fragmento pequeno, impossibilitando a avaliação pelo patologista.
As 32 amostras de Ribeirão Preto já haviam sido avaliadas em relação a todos os
critérios de inclusão e de exclusão com exceção da avaliação da integridade do RNA.
Abaixo, segue uma representação esquemática da estratégia utilizada para a avaliação
de expressão dos lncRNAs em osteossarcomas (figura 3). Cada etapa será descrita
detalhadamente nos tópicos a seguir.
24
Figura 3 – Representação esquemática da estratégia desenvolvida neste trabalho para a avaliação da
expressão de lncRNAs em osteossarcoma.
25
5.2
Inicialmente, as 76 amostras do HCB foram avaliadas para a confirmação da presença
de tumor, das quais 56 foram confirmadas com pelo menos 50% de tecido tumoral no
fragmento disponível. As 32 amostras provenientes da FMRP/USP já haviam passado por
essa avaliação anteriormente e, após microdissecção manual houve um enriquecimento
para 80% de tecido tumoral nestas amostras. Assim, foram consideradas para seguimento
no projeto 88 amostras, das quais 71% (77 amostras) apresentaram pelo menos 80% de
tecido tumoral viável. A figura 4 ilustra a quantidade de amostras analisadas e a
porcentagem tumoral presente em cada uma delas.
Figura 4. Representatividade tumoral nas amostras selecionadas para avaliação da expressão dos lncRNAs.
Para as amostras do HCB esta avaliação foi realizada pelo patologista em lâmina de fragmento corado com
hematoxilina e eosina. Para as amostra da FMRP/USP esta avaliação foi feita previamente e as amostras
macrodissecadas garantindo a presença de pelo menos 80% de tecido tumoral viável.
5.3
Extração, quantificação e avaliação da qualidade do RNA total
Inicialmente, a extração do RNA total foi realizada utilizando o método do TRIZOL.
Após a extração, a quantificação e a pureza do RNA extraído foi avaliada pela análise de
absorbância (260/280nm) utilizando o espectrofotômetro NanoVue.
A avaliação da qualidade/integridade do RNA foi realizada com auxílio do equipamento
Bioanalyzer 2100. Das 88 amostras avaliadas, três possuíam um fragmento tumoral muito
pequeno que resultou em baixa quantidade de RNA e não foi possível obter o valor de RIN, e
26
nem a realização de nova extração/análise. Das 85 amostras restantes, 56 apresentaram
degradação parcial do RNA (RIN < 6) e por isso, na tentativa de atingir melhores resultados,
para 25 amostras com tecido remanescente o RNA foi extraído novamente utilizando-se o
miRNeasy micro kit (Qiagen). A re-extração utilizando-se o kit não resultou em uma melhor
qualidade do RNA visto que a maioria das amostras não apresentou diferença relevante em
relação ao valor de RIN observado inicialmente. Neste processo de re-extração, apenas
quatro amostras que inicialmente apresentaram RIN<4, foram recuperadas com RIN>4 e
incorporadas na análise. A comparação dos valores do RIN entre os dois procedimentos de
extração de RNA utilizados estão descritos na figura 5.
Figura 5 - Comparação da integridade do RNA de amostras de osteossarcoma após extração com dois
protocolos diferentes. O gráfico apresenta as médias e desvios padrão dos RINs obtidos nas extrações. A
coluna da esquerda (em vermelho) representa as amostras extraídas com TRIZOL e a da direita (em azul),
extraídas por kit. Não houve diferença estatística significativa (p=01642). Teste de Mann-Whitney.
De acordo com o gráfico, podemos observar que não houve diferença significativa de
qualidade do RNA entre os dois métodos de extração utilizados em nosso trabalho
(p=0,1642).
Em nosso trabalho, amostras com RIN > 4 apresentaram uma qualidade satisfatória
para a análise, o que foi comprovado pela baixa variação dos Cts (1,27) observada na análise
de expressão gênica dos genes normalizadores (endógenos), que será apresentada na tabela
4. Portanto, independentemente do método utilizado para a extração, as 31 amostras que
obtiveram o RIN ≥ 4 foram selecionadas para o estudo. A mesma análise de qualidade foi
aplicada as 32 amostras de RNA provenientes da FMRP/USP. Dessas, 12 amostras
27
apresentaram RIN > 4 e foram incluídas nas análises subsequentes. Assim, totalizando 43
amostras aptas a análise de expressão dos genes alvos (Figura 3).
5.4
Avaliação de contaminação com DNA genômico e tratamento das amostras de RNA
com DNase
Após a extração de RNA, para as amostras do HCB pôde-se observar que todas
amplificaram o gene KRAS, o que confirma a contaminação por DNA nessas amostras (Figura
6).
Figura 6 - Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas amostras de RNA. M: Ladder
(1Kb plus - Life Technologies); C+: controle positivo (DNA genômico); C-: controle negativo (sem amostra). O
tamanho esperado para o fragmento amplificado é de 202 pares de bases.
Após o tratamento com DNAse, as amostras foram novamente submetidas a
amplificação do gene KRAS, para a avaliação da eficiência do tratamento. O tratamento foi
eficiente para eliminar a contaminação das amostras de RNA com DNA genômico, pois não
observamos a amplificação do fragmento esperado deste gene, exceto para a amostra nº 70
(Figura 6). Como não havia mais RNA disponível dessa amostra, optamos por excluí-la das
análises. Estes resultados foram obtidos após a quantificação do RNA com o aparelho Qubit,
para os quais os motivos serão apresentados no tópico a seguir.
Figura 7 - Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas amostras de RNA após
tratamento com DNase. M: Ladder (1Kb plus - Life Technologies); L: linhagem celular de ostessarcoma SAOS;
C+: controle positivo (DNA genômico); C- : controle negativo (sem amostra). O tamanho esperado para o
fragmento amplificado é de 202 pares de bases.
28
5.5
Análise da expressão dos normalizadores e requantificação das amostras utilizando o
Qubit
Para a avaliação da expressão gênica dos alvos selecionados, utilizou-se a técnica de
RT-qPCR. Inicialmente foi avaliada a expressão gênica dos dois genes endógenos (ACTB e
GAPDH) com o intuito de selecionar o melhor gene normalizador, ou seja, aquele que
apresentou menor variação de Cts dentre todas as amostras de osteossarcoma avaliadas.
Sendo assim, a partir da quantificação obtida pelo Nanovue, 1µg de RNA foi tratado
com DNase e após confirmação da eficiência do tratamento, as amostras foram submetidas
a síntese de cDNA e avaliação da expressão dos genes endógenos. Essa análise revelou um
alto desvio padrão na análise de expressão dos genes endógenos quando consideradas todas
as amostras do estudo, o que não é satisfatório para genes que servirão de normalizadores
para a análise de expressão gênica dos genes alvo (tabela 2).
Tabela 2 – Média e desvio padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH, obtidos após análise de
expressão gênica a partir de RNA quantificado por meio do Nanovue.
Gene
Média Ct
Desvio Padrão
ACTB
24,48
2,66
GAPDH
22,84
2,08
Devido à degradação parcial observada nas amostras de RNA (RIN entre 4 e 7), optouse por realizar a quantificação com o Qubit, já que esse método utiliza sondas moleculares
específicas para a quantificação de RNA íntegro e portanto, proporciona uma análise mais
fidedigna da quantidade de RNA nas amostras em estudo.
Diante dos resultados de quantificação descritos na tabela 3, observa-se a grande
variação apresentada entre a quantificação realizada pelo NanoVue e pelo Qubit, o que
mostrou a necessidade de requantificar todas as amostras utilizando-se essa nova
abordagem mais precisa.
29
Tabela 3 – Comparação da quantificação de RNA realizada pelos dois métodos utilizados neste trabalho
Nº Amostra
NanoVue (ng/µL)
Qubit (ng/µL)
13
2292
17,4
48
1338
556
49
1325
794
63
305
119
64
4276
1350
Assim, após a requantificação das amostras utilizando-se o Qubit, duas foram excluídas
devido à baixa quantidade de RNA disponível e impossibilidade de re-extração do RNA a
partir do fragmento de tecido. Portanto, baseado na quantificação das amostras pelo Qubit,
1µg das 41 amostras de RNA remanescentes foi novamente tratado com DNase e após
confirmação da eficiência do tratamento, houve a necessidade de exclusão de mais uma
amostra. Dessa forma, o RNA de 40 amostras foi submetido a síntese de cDNA e avaliação da
expressão dos genes endógenos.
Ainda, na análise de expressão dos genes endógenos, quatro amostras apresentaram
níveis muito baixos de expressão para estes genes (alto Ct) quando comparados a média
geral das amostras. Mesmo sendo aprovadas em todos os parâmetros determinados em
nosso trabalho, optamos por excluir essas amostras, pois isso poderia gerar um viés nas
análises de expressão dos lncRNAs para estas amostras. Assim, as análises de expressão dos
genes alvos seguiram com 36 amostras de RNAs de osteossarcoma.
A análise de expressão dos genes endógenos (ACTB e GAPDH), nestas 36 amostras
revelou que o gene ACTB apresentou a menor variação de expressão entre todas amostras
avaliadas, sendo então escolhido para normalização dos dados de expressão gênica dos
genes alvos (Tabela 4).
Tabela 4 - Média e desvio padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH, obtidos após análise de
expressão gênica a partir de RNA quantificado por meio do Qubit.
Gene
Média Ct
Desvio Padrão
ACTB
19,50
1,27
GAPDH
19,00
2,06
30
5.6
Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes com osteossarcoma
A caracterização das amostras foi realizada para os 36 pacientes, para os quais a
análise de expressão dos genes foi realizada. A maioria eram do sexo feminino (55,6%), com
idade entre 4 e 29 anos. A média de idade ao diagnóstico foi de 15 anos.
Quanto às características clínicas, ao diagnóstico, a maioria dos pacientes (53,6%)
apresentaram tumores menos volumosos (<12cm). Dos 36 pacientes do estudo, foi possível
obter o tamanho do tumor de 20 pacientes, sendo que a medida de 9 pacientes foi obtida
através da radiografia convencional, 7 através de ressonância magnética e 4 por tomografia
computadorizada. A localização mais frequente do tumor foi o fêmur em 16 pacientes
(44,4%), sendo o subtipo histológico mais comum o osteoblástico, que foi confirmado em 28
casos (77,8%). Em relação ao grau de resposta à quimioterapia (grau de Huvos-Ayala), a
maioria dos pacientes apresentou resposta parcial com mais de 50% de necrose, grau 2 de
Huvos-Ayala que foi observado em 14 pacientes (41,17%), sendo que 12 pacientes (35,3%)
não responderam a quimioterapia (grau 1 de Huvos-Ayala), seis (17,64%) apresentaram mais
que 90% de necrose tumoral, com tumor viável presente, dois (5,88%) apresentaram grau 4,
sem tumor viável e, para dois pacientes o grau de Huvos não se aplicava pois os pacientes
não realizaram cirurgia após quimioterapia. Em relação à presença de metástases, 20
pacientes (55,6%) não apresentaram metástases, e nos 16 pacientes metastáticos (44,4%), a
metástase pulmonar foi a mais frequente. Todos esses dados podem ser visualizados na
tabela 5.
31
Tabela 5 – Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes com osteossarcoma para a análise
de expressão dos lncRNAs.
Variável
Sexo
Idade ao
diagnóstico
Local do tumor
Tipo histológico
Grau de Huvos*
Tamanho do
tumor*
Metástases*
Categoria
n (%)
feminino
20 (55,6)
masculino
16 (44,4)
<10 anos
7 (19,4)
>10 anos
29 (80,6)
Média 15 anos
Fêmur
16 (44,4)
Tíbia
11 (30,6)
Úmero
6 (16,7)
Fíbula
3 (8,3)
Osteoblástico
28 (77,8)
Condroblástico
5 (13,9)
Fibroblástico
2 (5,6)
Telangectásico
1 (2,8)
Grau 1
12 (35,3)
Grau 2
14 (41,17)
Grau 3
6 (17,64)
Grau 4
2 (5,88)
<12
15 (53,6)
>=12
13 (46,4)
Não metastático
20 (57,1)
Metástase ao
diagnóstico
7 (20,0)
Metástase após
diagnóstico
8 (22,9)
*nº de pacientes cuja variável foi possível obter os dados
5.7
Análise da expressão dos lncRNAs
O presente estudo avaliou a expressão dos lncRNAs nas 36 amostras tumorais de OS
por meio da RT-qPCR.
Os resultados obtidos e normalizados mostram uma ampla variação na expressão dos
quatro genes avaliados. Interessante notarmos que para algumas amostras, a expressão dos
32
genes não foi detectada demonstrando que os genes não eram expressos nestas amostras,
principalmente para os genes HOTAIR e BCYRN1. Neste experimento, foi utilizada uma
linhagem celular de osteossarcoma (SAOS2) a fim de verificar o perfil de expressão desses
genes nesta linhagem. Como podemos notar, estes genes apresentam uma baixa expressão
nessa linhagem celular de osteossarcoma.
Abaixo estão demonstrados os gráficos (Figura 8), referentes a expressão de cada um
dos lncRNAs nas 36 amostras de OS.
Figura 8 - Expressão normalizada dos lncRNAs em osteossarcoma avaliada por RT-qPCR. A: MALAT1; B: HULC;
C: HOTAIR; D: BCYRN1. No eixo x, cada número representa uma amostra. No eixo y está representado o valor
normalizado de expressão do lncRNA avaliado. A normalização foi realizada de acordo com o modelo
matemático 2- ΔCt, sendo o gene endógeno ACTB utilizado como normalizador.
33
Figura 8 (Continuação) - Expressão normalizada dos lncRNAs em osteossarcoma avaliada por RT-qPCR. A:
MALAT1; B: HULC; C: HOTAIR; D: BCYRN1. No eixo x, cada número representa uma amostra. No eixo y está
representado o valor normalizado de expressão do lncRNA avaliado. A normalização foi realizada de acordo
com o modelo matemático 2- ΔCt, sendo o gene endógeno ACTB utilizado como normalizador.
5.8
Associação da expressão dos lncRNAs com os fatores clínico-patológicos dos
pacientes
Tendo em vista o potencial papel dos lncRNAs na carcinogênese e sua influência no
prognóstico de pacientes com câncer, foi avaliada a correlação da expressão desses genes
com os fatores clínicos-patológicos considerados no estudo como tipo histológico, grau de
Huvos, sexo, idade ao diagnóstico, local do tumor, tamanho do tumor e presença de
metástase.
34
Considerando a expressão dos genes como uma variável numérica, podemos observar
que para o gene BCYRN1 sua maior expressão está associada significativamente com
pacientes que apresentam idade acima de 10 anos (p=0,036). Apesar de não significativos,
nós podemos destacar algumas observações como por exemplo o grupo de tumores com
grau histológico condroblástico, fibroblástico e telangectásico, apresenta em média pelo
menos quatro vezes maior expressão de BCYRN1 quando comparado aos tumores
osteoblásticos. Além disso, a maior expressão deste gene também pode ser observada nos
tumores menos responsivos a quimioterapia (grau Huvos 1/2) quando comparados aos que
respondem (Huvos 3/4). Em relação a presença de mestástases, tumores associados a
metástases apresentaram maior expressão de BCYRN1 (em média três vezes maior) em
comparação aos casos não metastáticos (Tabela 6).
Para o gene HOTAIR, apesar da associação da expressão gênica e as características
clínico-patológicas dos pacientes não serem significativas, podemos observar maior
expressão de HOTAIR no grupo de tumores com tipo histológico condroblástico, fibroblástico
e telangectásico, aproximadamente 13 vezes maior, quando comparado aos tumores
osteoblásticos. Podemos observar também uma maior expressão de HOTAIR nas amostras
de pacientes não metastáticos, ainda em tumores localizados na fíbula, tíbia ou úmero ou
que responderam pior à QT pré-operatória (Huvos 1/2) e que ao diagnóstico apresentaram
tamanho do tumor menor que 12cm (Tabela 7).
Para o gene HULC, a associação da expressão gênica e as características clínicopatológicas dos pacientes também não foram significativas, entretanto podemos observar
que a média de expressão foi maior em pacientes que apresentaram tumores do tipo
histológico osteoblástico, em tumores de pacientes com idade igual ou superior a 10 anos e
em tumores para os quais o paciente apresentou metástase após o diagnóstico (Tabela 8).
Em relação ao MALAT1, sua maior expressão foi associada significativamente a
pacientes com idade igual ou superior a 10 anos. Apesar de não encontrarmos associação
significativa às demais características clínico-patológicas, observamos a maior expressão de
MALAT1 em pacientes do sexo masculino, em tumores localizados na fíbula, tíbia ou úmero.
Ainda, quando consideramos a presença de metástase independente do momento,
observamos uma expressão um pouco aumentada de MALAT1 em pacientes não
metastáticos. Entretanto, quando os pacientes que tem metástase são estratificados em
35
dois grupos, observamos que a maior expressão do gene ocorre nos tumores de pacientes
que desenvolvem metástase ao longo do tratamento (Tabela 9).
Analisando os resultados obtidos, podemos notar que as amostras analisadas
mostraram uma ampla variação de expressão dos quatro genes analisados, como
demonstrado anteriormente (Figura 8). Os valores de média, desvio padrão, mediana e
percentis dos resultados obtidos para os genes analisados estão demonstrados nas tabelas
de 6 a 9.
36
Tabela 6 – Comparação da média de expressão do BCYRN1 com as características clínico-patológicas dos pacientes avaliados.
Contagem
Média
Desvio padrão
Mínimo
Osteoblástico
28
0,781883
0,828815
0,053557
0,209929
0,482505
1,111098
3,509397
Condroblástico/Fibroblástico
Telangectásico
8
3,389459
5,869342
0,081406
0,490397
1,275666
2,941804
17,618533
Grau 1 / 2
26
1,581165
3,385022
0,061554
0,252257
0,869527
1,426408
17,618533
Grau 3 / 4
8
0,509721
0,432008
0,053557
0,155135
0,408658
0,798371
1,299885
Feminino
20
1,865601
3,865963
0,053557
0,295323
0,815225
1,284110
17,618533
Masculino
16
0,731024
0,662778
0,081406
0,185287
0,428737
1,319098
2,160619
<10 anos
>=10 anos
7
29
0,675498
1,526894
1,347527
3,201655
0,053557
0,061554
0,081406
0,351490
0,190994
0,864022
0,302513
1,299885
3,722989
17,618533
Fêmur
16
1,036519
1,100962
0,061554
0,327002
0,679728
1,284110
3,722989
Fíbula, Tíbia e Úmero
20
1,621205
3,844194
0,053557
0,185287
0,640261
1,295311
17,618533
<12 cm
15
1,102877
1,078174
0,053557
0,106236
0,864022
1,465697
3,722989
>=12 cm
13
0,911535
0,944459
0,061554
0,302513
0,450207
1,299885
3,509397
Ausentes
20
0,687126
0,565351
0,053557
0,240560
0,553916
0,951154
2,160619
Presentes
16
2,204118
4,285407
0,061554
0,136692
0,999978
2,178777
17,618533
Não metastático
20
0,68742
0,56535
0,5356
0,24087
0,55397
0,95125
2,16062
Metástase ao diagnostico*
7
1,423940
1,56189
0,6155
0,10624
0,87504
3,51087
3,73304
Metástase após diagnostico*
8
p-valor < 0,05
2,999230
6,0173
0,8144
0,12866
0,78793
2,18982
17,69960
Tipo histológico
Grau de Huvos*
Percentil 25 Mediana Percentil 75
Máximo
Sexo
Idade ao diagnóstico
Local do tumor
Tamanho do tumor*
0,138
0,155
0,504
0,036
0,610
Metástase
Metástase*
p-valor
0,695
0,373
0,787
37
Tabela 7 - Comparação da média de expressão do HOTAIR com as características clínico-patológicas dos pacientes avaliados.
Tipo histológico
Grau de Huvos*
Sexo
Local do tumor
Contagem
Média
Desvio padrão
Mínimo
Percentil 25 Mediana Percentil 75
Máximo
Osteoblástico
28
0,004895
0,010908
0,000006
0,000200
0,000649
0,003271
0,049928
Telangectásico
8
0,053119
0,144645
0,000001
0,000248
0,002224
0,004468
0,411069
Grau 1 / 2
26
0,020308
0,080410
0,000001
0,000343
0,000981
0,004132
0,411069
Grau 3 / 4
8
0,003746
0,007745
0,000074
0,000118
0,000271
0,003271
0,022579
Feminino
20
0,004219
0,007400
0,000001
0,000292
0,000649
0,004029
0,025486
Masculino
16
0,029852
0,102391
0,000084
0,000184
0,000981
0,002734
0,411069
<10 anos
>=10 anos
7
29
0,001623
0,018988
0,001998
0,076161
0,000074
0,000001
0,000153
0,000299
0,000535
0,000857
0,003926
0,003902
0,004902
0,411069
Fêmur
16
0,006980
0,013925
0,000006
0,000321
0,000649
0,003914
0,049928
20
0,022517
0,091503
0,000001
0,000161
0,001088
0,003481
0,411069
<12 cm
15
0,029670
0,105558
0,000130
0,000385
0,001613
0,003926
0,411069
>=12 cm
13
0,004059
0,008893
0,000006
0,000167
0,000343
0,001106
0,025486
Ausentes
20
0,023479
0,091391
0,000074
0,000184
0,000785
0,004017
0,411069
Presentes
16
0,005777
0,013314
0,000001
0,000249
0,000936
0,002772
0,049928
Não metastático
20
0,023573
0,091767
0,000077
0,000185
0,000785
0,004040
0,412760
Metástase ao diagnostico
7
0,004605
0,009369
0,000028
0,000205
0,000555
0,003925
0,025625
Metástase após diagnostico
8
0,007505
0,017220
0,000001
0,000279
0,001455
0,003315
0,049940
0,543
Tamanho do tumor*
Metástase
Metástase*
p-valor
0,256
0,874
0,510
0,874
0,093
p-valor < 0,05
0,799
0,966
38
Tabela 8 - Comparação da média de expressão do HULC com as características clínico-patológicas dos pacientes avaliados.
Desvio
padrão
Contagem
Média
Osteoblástico
28
0,000038420
0,000036056 0,000000999 0,000009198 0,000026801 0,000062379 0,000126349
Tipo
histológico
Condroblástico/Fibroblástico/
Telangectásico
8
0,000021071
0,000037211 0,000000904 0,000001697 0,000006115 0,000020671 0,000110694
Grau de
Huvos*
Grau 1 / 2
26
0,000032895
0,000035429 0,000000904 0,000006021 0,000019150 0,000058980 0,000119445
Grau 3 / 4
8
0,000047261
0,000041736 0,000001921 0,000008204 0,000051891 0,000064813 0,000126349
Feminino
Masculino
<10 anos
20
16
7
0,000031637
0,000038224
0,000012347
0,000036392 0,000000999 0,000002119 0,000013231 0,000053670 0,000119445
0,000037522 0,000000904 0,000006996 0,000025021 0,000067190 0,000126349
0,000015860 0,000001921 0,000002102 0,000009950 0,000012230 0,000046800
>=10 anos
29
0,000039927
0,000038205 0,000000904 0,000007970 0,000025805 0,000064756 0,000126349
Fêmur
16
0,000032168
0,000034274 0,000000904 0,000003990 0,000017751 0,000057981 0,000119445
20
0,000036482 0,000038988
<12 cm
15
0,000028590
0,000030117 0,000000999 0,000001960 0,000017106 0,000056982 0,000087958
>=12 cm
Ausentes
13
20
0,000044040
0,000036495
0,000041784 0,000000904 0,000010426 0,000033252 0,000060002 0,000126349
0,000031211 0,000001018 0,000012193 0,000026801 0,000057981 0,000126349
Presentes
16
0,000032151
0,000043198 0,000000904 0,000001626 0,000007986 0,000069012 0,000119445
Não metastático
20
0,00003
0,00003
0,00000
0,00001
0,00003
0,00005
0,00013
7
0,00002
0,00004
0,00000
0,00000
0,00001
0,00002
0,00012
8
0,00005
0,00005
0,00000
0,00000
0,00003
0,00010
0,00012
Sexo
Idade ao
diagnóstico
Local do
tumor
Tamanho do
tumor*
Metástase
Metástase*
p-valor < 0,05
Mínimo
Percentil 25
Mediana
Percentil 75
Máximo
0,000000999 0,000005125 0,000020671 0,000067190 0,000126349
p-valor
0,119
0,394
0,484
0,105
0,702
0,369
0,171
0,378
39
Tabela 9 - Comparação da média de expressão do MALAT1 com as características clínico-patológicas dos pacientes avaliados.
Contagem
Média
28
4,49462
Osteoblástico
Tipo histológico
Grau de Huvos*
Sexo
Local do tumor
Tamanho do tumor*
Metástase
Metástase*
Desvio padrão Mínimo Percentil 25 Mediana Percentil 75 Máximo p-valor
2,59922
0,31235
2,67482
3,83030
5,87172
10,31942
0,879
Telangectásico
8
7,11100
7,97581
1,11040
1,62371
3,56961
12,57206
20,24685
Grau 1 / 2
26
5,26356
4,90580
0,31235
2,53629
3,83030
5,83639
20,24685
Grau 3 / 4
8
4,92796
2,93913
1,82188
2,51630
4,12311
7,00178
10,31942
Feminino
20
4,47554
4,14551
0,31235
2,45454
3,33675
4,66701
19,30773
Masculino
16
5,82666
4,67299
1,42553
3,25912
3,88384
7,59785
20,24685
<10 anos
7
3,36515
2,95060
1,11040
1,82188
2,53752
2,87323
9,90586
>=10 anos
29
5,48901
4,60057
0,31235
2,93827
3,98345
6,67541
20,24685
Fêmur
16
3,97204
2,60823
0,31235
2,22625
3,29498
5,43569
9,78187
20
5,95924
5,29724
1,11040
2,87120
3,94474
6,62821
20,24685
<12 cm
15
3,80605
2,55096
0,31235
2,41400
2,93827
5,06803
10,31942
>=12 cm
13
4,27727
2,33912
1,42553
2,93028
3,79895
4,05027
9,78187
Ausentes
20
5,67148
4,29679
1,95742
3,20004
3,94474
7,00178
20,24685
Presentes
16
4,33174
4,49858
0,31235
1,82685
2,93428
4,66701
19,30773
Não metastático
20
5,68325
4,30610
1,95837
3,20250
3,95382
7,02332
20,28665
7
2,60455
1,23704
0,31453
1,83184
2,87658
3,65196
4,03885
8
6,21568
5,81494
1,11045
2,37683
4,67390
7,59983
19,31390
p-valor < 0,05
0,685
0,252
0,048
0,214
0,534
0,126
0,100
40
5.9
Associação do perfil de expressão dos lncRNAs com as características clínico-
patológicas dos pacientes
Com o intuito de categorizar a expressão dos genes (maior e menor expressão) nós
utilizamos a análise da curva ROC. Uma vez que esses genes são marcadores de metástase
em outros tumores, o ponto determinado na curva ROC para cada gene foi aquele que
apresentou a melhor especificidade e sensibilidade para discriminar entre pacientes
metastáticos e não metastáticos.
Assim, considerando os resultados de expressão obtidos para cada gene, podemos
observar que a análise da curva ROC não revelou nenhum ponto de corte com significância
estatística que permitisse a discriminação das amostras entre metastáticas e não
metastáticas (tabela 10 e 11)
Sendo assim, utilizamos para cada gene o ponto da curva ROC que apresentava a
maior sensibilidade e especificidade para determinação desses grupos. Portanto, para as
amostras cujos resultados de expressão encontravam-se acima deste ponto foram
consideradas com alta expressão do gene, em contrapartida àquelas abaixo do ponto
determinado consideradas com baixa expressão do gene.
Tabela 10 – Área sob a curva, desvio padrão, p-valor e intervalo de confiança determinados pela curva ROC.
IC 95%
Gene
Área sob a curva
Desvio padrão
p-valor
Limite inferior
Limite superior
BCYRN1
0,588
0,105
0,373
0,382
0,793
HOTAIR
0,475
0,099
0,799
0,281
0,669
HULC
0,366
0,106
0,171
0,158
0,573
MALAT1
0,65
0,096
0,126
0,463
0,837
41
Tabela 11 – Ponto de corte, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo
negativo (VPN) e acurácia, de acordo com a curva ROC.
Gene
Ponto de corte Sensibilidade % Especificidade %
VPP
VPN
Acurácia
BCYRN1
0,86952666
40
(19,17-63,93)
35,71
(18,67-55,93)
30,77
(14,37-51,79)
45,45
(24,42-67,77)
37,5
(25,22-51,64)
HOTAIR
0,00056915
50
(27,23-72,77)
67,9
(47,65-84,09)
52,6
(28,9-75,51)
65,5
(45,67-82,04)
60,4
(46,31-72,98)
0,0000107873
55
(31,55-76,9)
71,4
(51,33-86,74)
57,9
(33,53-79,7)
69
(49,17-84,68)
64,6
(50,44-76,57)
3,6699867
60
(36,07-80,83)
71,4
(51,33-86,74)
60
(36,07-80,83)
71,4
(51,33-86,74)
66,7
(52,54-78,32)
HULC
MALAT1
Assim, após a categorização da expressão dos genes nas amostras avaliadas, nós
realizamos as análises de associação do padrão de expressão dos genes com as
características clínico-patológicas dos pacientes.
Para o gene BCYRN1, nossos resultados mostraram que 90,5% dos pacientes que
apresentaram baixa expressão do gene pertenciam ao tipo histológico osteoblástico
(p=0,046). Apesar de não ter significância estatística, podemos observar que dos pacientes
que apresentaram alta expressão do gene 93,3% tinham idade ao diagnóstico maior ou igual
a 10 anos e 93% apresentaram baixa resposta ao tratamento (Grau Huvos 1/2). Ainda,
daqueles pacientes cuja expressão foi alta, 60,0% apresentavam metástase em algum
momento (Tabela 12).
Em relação ao HOTAIR, 75% dos pacientes com alta expressão do gene apresentaram
tamanho do tumor < 12cm (p=0,049) e, apesar de não significativo, considerando a baixa
expressão, 60% não eram metastáticos (Tabela 13).
Para o gene HULC não houve associação estatística significativa entre a o perfil de
expressão do gene e as características clínico-patológicas avaliadas. Entretanto, podemos
destacar algumas observações, como por exemplo 88,9% dos pacientes que apresentaram
alta expressão do gene pertencia ao tipo histológico osteoblástico e, 94,4% apresentavam
idade ao diagnóstico igual ou superior a 10 anos (p-valor = 0,088) (Tabela 14).
Em relação a expressão do MALAT1, 95,5% dos pacientes que apresentaram alta
expressão tinham 10 anos ou mais ao diagnóstico (p=0,008). Apesar dos outros resultados
encontrados não terem sido estatisticamente significativos, podemos destacar que a maioria
42
dos pacientes (68,2%) com alta expressão do gene não eram metastáticos e a baixa
expressão do gene foi vista no grupo de pacientes do sexo feminino (71,4%) e que
apresentavam tamanho do tumor ao diagnóstico menor do que 12 cm (66,7%). (Tabela 15).
43
Tabela 12 – Associação do perfil de expressão do BCYRN1 com as características epidemiológicas e clínicopatológicas.
Baixa expressão
Osteoblástico
Tipo histológico
Grau de Huvos*
Sexo
Local do tumor
Tamanho do tumor*
Metástase
Metástase*
Alta expressão
p-valor
n
%
n
%
19
90,5
9
60,0
0,046
Telangectásico
2
9,5
6
40,0
Grau 1 / 2
13
65,0
13
92,9
Grau 3 / 4
7
35,0
1
7,1
Feminino
11
52,4
9
60,0
Masculino
10
47,6
6
40,0
Fêmur
9
42,8
7
46,7
12
57,2
8
53,3
<10 anos
6
28,6
1
6,7
>=10 anos
15
71,4
14
93,3
<12 cm
8
50,0
7
58,3
>=12 cm
8
50,0
5
41,7
Ausentes
14
66,7
6
40,0
Presentes
7
33,3
9
60,0
Não metastático
14
66,7
6
42,9
Metástase ao diagnóstico
3
14,3
4
28,6
Metástase após diagnóstico
4
19
4
28,6
0,102
0,650
0,821
0,200
0,662
0,112
0,410
44
Tabela 13 – Associação do perfil de expressão do HOTAIR com as características epidemiológicas e clínicopatológicas
Baixa expressão Alta expressão
Tipo histológico
Grau de Huvos*
Sexo
Local do tumor
Tamanho do tumor*
Metástase
Metástase*
n
%
n
%
Osteoblástico
17
85,0
11
68,8
Telangectásico
3
15,0
5
31,3
Grau 1 / 2
14
73,7
12
80,0
Grau 3 / 4
5
26,3
3
20,0
feminino
11
55,0
9
56,3
masculino
9
45,0
7
43,8
Fêmur
10
50,0
6
37,5
10
50,0
10
62,5
<10 anos
4
20,0
3
18,8
>=10 anos
16
80,0
13
81,3
<12 cm
6
37,5
9
75,0
>=12 cm
10
62,5
3
25,0
Ausentes
12
60,0
8
50,0
Presentes
8
40,0
8
50,0
Não metastático
12
63,2
8
50,0
4
21,1
3
18,8
3
15,8
5
31,3
p-valor
0,422
0,999
0,940
0,453
0,999
0,049
0,549
0,585
45
Tabela 14 – Associação do perfil de expressão do HULC com as características epidemiológicas e clínicopatológicas
HULC
Baixa expressão
Tipo histológico
Grau de Huvos*
Sexo
Local do tumor
Tamanho do tumor*
Metástase
Metástase*
Alta expressão
n
%
n
%
Osteoblástico
12
66,7
16
88,9
Telangectásico
6
33,3
2
11,1
Grau 1 / 2
13
81,3
13
72,2
Grau 3 / 4
3
18,8
5
27,8
Feminino
11
61,1
9
50,0
Masculino
7
38,9
9
50,0
Fêmur
8
44,4
8
44,4
10
55,6
10
55,6
<10 anos
6
33,3
1
5,6
>=10 anos
12
66,7
17
94,4
<12 cm
8
61,5
7
46,7
>=12 cm
5
38,5
8
53,3
Ausentes
8
44,4
12
66,7
Presentes
10
55,6
6
33,3
Não metastático
8
47,1
12
66,7
5
29,4
2
11,1
4
23,5
4
22,2
p-valor
0,228
0,693
0,502
0,999
0,088
0,431
0,18
0,384
46
Tabela 15 – Associação do perfil de expressão do MALAT1 com as características epidemiológicas e clínicopatológicas
Tipo histológico
Grau de Huvos*
Sexo
Local do tumor
Baixa
expressão
n
%
Alta
expressão
n
%
Osteoblástico
10
71,4
18
81,8
Condroblástico / Fibroblástico /
Telangectásico
4
28,6
4
18,2
Grau 1 / 2
10
76,9
16
76,2
Grau 3 / 4
3
23,1
5
23,8
Feminino
10
71,4
10
45,5
Masculino
4
28,6
12
54,5
Fêmur
8
57,1
8
36,4
6
42,9
14
63,6
Idade ao
diagnóstico
<10 anos
6
42,9
1
4,5
>=10 anos
8
57,1
21
95,5
Tamanho do
tumor*
<12 cm
8
66,7
7
43,8
>=12 cm
4
33,3
9
56,3
Ausentes
5
35,7
15
68,2
Presentes
9
64,3
7
31,8
Não metastático
5
38,5
15
68,2
5
38,5
2
9,1
3
23,1
5
22,7
Metástase
Metástase*
p-valor
0,683
0,999
0,126
0,221
0,008
0,229
0,056
0,101
47
5.10
Análise de sobrevida global e sobrevida livre de eventos
A população avaliada em nosso estudo sem metástase ao diagnóstico e com metástase
ao diagnóstico apresenta sobrevida global em 5 anos de 62,7% e 28,6%, respectivamente e
sobrevida livre de eventos de 59,6 e 28,6%, respectivamente (figura 9).
Figura 9 - Análise de sobrevida global e sobrevida livre de eventos para os pacientes metastáticos e não
metastáticos ao diagnóstico tratados pelo protocolo GLATO 2006 no Departamento de Pediatria do Hospital
de Câncer de Barretos no período de 2006 a 2013.
Em relação às características epidemiológicas, os resultados encontrados não foram
estatisticamente significativos para a análise de sobrevida, no entanto, podemos observar
que tanto a sobrevida global como a sobrevida livre de eventos em 5 anos é maior em
pacientes do sexo masculino (Tabela 16 e 17).
Tabela 16 - Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação as características epidemiológicas.
Variável
Sexo
Idade
Categoria
Feminino
SG
1 ano
73,7
3 anos
43,6
5 anos
43,6
Masculino
< 10 anos
> 10 anos
93,3
85,7
81,5
79
57,1
60,9
64,6
57,1
51,5
p-valor
0,101
0,885
48
Tabela 17 - Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação as características
epidemiológicas.
SLE
Variável
Categoria
1 ano
3 anos
5 anos
p-valor
Sexo
Idade
Feminino
60
42,0
42,0
Masculino
< 10 anos
> 10 anos
93,3
71,4
75,0
66,7
57,1
51,6
66,7
57,1
51,6
0,136
0,912
Quanto às características clínico-patológicas, não encontramos significância estatística
em nenhuma das variáveis analisadas em relação a análise de sobrevida, mas podemos
observar que tanto a SG como a SLE em 5 anos é maior para os pacientes com tipo
histológico osteoblástico, que responderam melhor à quimioterapia (Grau de Huvos 3/4),
nos tumores de localização tíbia/fíbula/úmero (Tabela 18 e 19).
Tabela 18 - Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação as características clínico-patológicas.
Variável
SG
Categoria
Osteoblástico
1 ano 3 anos 5 anos p-valor
82,1
66,2
57
Tipo histológico
0,225
83,3
Telangectásico
Grau de Huvos
Local do Tumor
Tamanho do tumor
33,3
33,3
Grau 1/2
83,3
56,7
46,4
Grau 3/4
87,5
72,9
72,9
Fêmur
60
52,5
39,4
Tíbia /Fíbula / Úmero
94,7
68,4
63,2
< 12 cm
86,7
47,7
47,7
> 12 cm
66,7
66,7
55,6
0,287
0,063
0,785
49
Tabela 19 - Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação as características clínicopatológicas.
Variável
SLE
Categoria
Osteoblástico
78,6
59,2
59,2
Tipo histológico
0,1
57,1
Telangectásico
Grau de Huvos
Local do tumor
Tamanho do tumor
28,6
28,6
Grau 1/2
72
46,9
46,9
Grau 3/4
87,5
72,9
72,9
Fêmur
53,3
44,4
44,4
Tíbia /Fíbula / Úmero
90
60
60
< 12 cm
73,3
49,5
49,5
> 12 cm
66,7
58,3
58,3
0,273
0,150
0,759
Em relação a expressão dos genes, também não observamos um impacto significativo
na sobrevida global e sobrevida livre de eventos. Entretanto, podemos observar que os
pacientes que apresentaram maior expressão dos genes BCYRN1 e HOTAIR, apresentaram
uma menor sobrevida global e sobrevida livre de eventos em 5 anos (tabela 20 e 21; figura
10 e 11).
Tabela 20 - Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação a expressão dos lncRNAs.
Variável
Categoria
SG
Baixa expressão
81
70,8
59,4
Alta expressão
84,6
40,4
40,4
Baixa expressão 83,3
64,8
64,8
Alta expressão
81,3
54,2
40,6
60,9
60,9
BCYRN1
0,295
HOTAIR
0,242
HULC
0,525
Alta expressão
83,3
58,9
44,9
59,8
49,9
Alta expressão
59,,9
54,5
MALAT1
0,778
81
50
Tabela 21 - Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação a expressão dos lncRNAs.
Variável
Categoria
SLE
61,0
61,0
Alta expressão
71,4
40,2
40,2
62,3
62,3
Alta expressão
68,8
41,3
41,3
57,8
57,8
BCYRN1
0,313
HOTAIR
0,224
HULC
0,557
Alta expressão
72,2
48,1
48,1
53,8
53,8
Alta expressão
53,1
53,1
MALAT1
0,753
77,3
51
Figura 10 - Análise de sobrevida global de acordo com o perfil de expressão dos lncRNAs. (A) BCYRN1; (B)
HOTAIR; (C) HULC; (D) MALAT1.
52
Figura 11 - Análise de sobrevida livre de eventos de acordo com o perfil de expressão dos lncRNAs. (A)
BCYRN1; (B) HOTAIR; (C) HULC; (D) MALAT1.
53
6
6.1
DISCUSSÃO
Otimização do protocolo de extração e análise da qualidade do RNA
Na otimização do protocolo de extração e análise da qualidade do RNA, observamos
aspectos importantes durante esses passos que muitas vezes não são descritos na literatura,
ou simplesmente não realizados com o rigor necessário.
A avaliação do patologista para garantir uma boa representatividade tumoral foi uma
etapa crucial, pois a contaminação das amostras tumorais com células normais pode levar a
uma interpretação errônea das análises de expressão dos genes. Após essa análise para
confirmação da representatividade tumoral das nossas amostras, 20 foram excluídas do
estudo por possuírem quantidade menor que 50% de tumor, o que ainda é uma quantidade
razoável de células tumorais. Em uma análise de correlação entre a pureza do tecido
tumoral e a expressão gênica foi demonstrado que amostras com menos do que 50% de
tecido tumoral apresentam um viés na expressão gênica, o que leva a interpretação errada
dos resultados, uma vez que a expressão deste gene pode se apresentar de forma diferente
no tecido normal. Conforme a representatividade tumoral (acima de 60-70%) aumenta, a
análise atinge qualidade suficiente para a avaliação da expressão gênica e obtenção de
dados fidedignos e reais de expressão82, 83. A fim de evitar interferência em nossa análise,
atribuída a presença de tecido tumoral, optamos por incluir amostras com
representatividade de tecido tumoral acima de 50%. De fato, podemos avaliar que a maioria
das nossas amostras (71%) foram classificadas com mais de 80% de tecido tumoral. Dessa
forma, podemos inferir que os dados de expressão dos genes avaliados em nosso estudo são
reais e refletem o comportamento destes genes nos tumores, não tendo uma interferência
significativa proveniente de células normais.
Para a extração do RNA, utilizamos o método do TRIZOL de acordo com as orientações
do fabricante em todas as etapas, conforme descrito na metodologia. O TRIZOL é um dos
produtos comerciais mais utilizados para esse fim. Ele consiste de uma solução monofásica
de fenol e guanidina isotiocianato que atua provocando a lise das células mantendo a
integridade do RNA. A vantagem da utilização deste método é o maior rendimento em
relação a quantidade de RNA resgatado. A principal desvantagem é a possibilidade de
contaminação do RNA com DNA genômico, uma vez que a separação do RNA é realizada
manualmente, independente do uso de coluna. Diversos trabalhos na literatura, utilizam o
54
TRIZOL para a extração de RNA de amostras tumorais para avaliar a expressão de genes por
RT-qPCR, inclusive em osteossarcoma30, 33, 84-86.
Ao avaliarmos a qualidade do RNA extraído por TRIZOL, nos deparamos com a maior
parte das amostras apresentando o RNA de parcialmente a totalmente degradado. Com o
intuito de obter um RNA de melhor qualidade, optamos por re-extrair algumas amostras por
meio de um kit comercial de extração de RNA. O kit de extração é um método rápido de
isolamento e purificação do RNA baseado no processo de colunas cromatográficas utilizando
uma resina como matriz de separação. A vantagem deste método é que o RNA purificado
apresenta alta pureza, mas a principal desvantagem é o menor rendimento em termos de
quantidade de RNA. Mesmo com a utilização do kit de extração, nossos resultados
mostraram que não houve melhora significativa na qualidade do RNA extraído (p=0,164).
A integridade do RNA extraído, comumente é avaliada por meio de gel de agarose,
porém, essa técnica é subjetiva e pouco reprodutível87. De maneira crescente na literatura, o
padrão ouro para avaliar a integridade do RNA tem sido a utilização do Bioanalyzer, um
equipamento capaz de separar pequenas quantidades de RNA de acordo com o seu peso
molecular em canais presentes em um chip, para então serem analisadas por fluorescência.
O resultado é dado através de uma curva de eletroesferograma e um algoritmo denominado
RIN (RNA Integrity Number) que indica a qualidade do RNA87, 88.
Para muitas técnicas utilizadas nos estudos de expressão gênica o RNA intacto é
essencial, mas de acordo com alguns autores, recomenda-se um valor de RIN superior a 5
como requisito mínimo para uma quantificação por RT-qPCR de sucesso e de confiança87-89.
Além disso, a utilização de iniciadores e sondas para a amplificação de fragmentos menores
do que 100pb associados a análise de PCR em tempo real, no nosso caso, permitiu a
utilização de amostras com RIN> 4, com resultados satisfatórios para as análises de
expressão dos genes como demonstrado em nossos resultados.
Uma vez que as amostras apresentam um certo grau de degradação, outro ponto
importante é a quantificação do RNA, a qual inicialmente foi realizada por
espectrofotômetro (NanoVue). Ao avaliarmos a expressão dos normalizadores, detectamos
uma variação na expressão desses genes, com um desvio padrão muito alto. Isso nos levou a
realizar a quantificação do RNA pelo método de fluorescência (Qubit), já que o
espectrofotômetro é menos específico uma vez que qualquer partícula na solução poderá
influenciar na leitura e fornecer concentrações superestimadas.
55
A partir dessa nova quantificação, notamos que a concentração de RNA fornecida pelo
Qubit era menor do que a indicada pelo espectrofotômetro, explicando em parte, o alto
desvio padrão encontrado na avaliação da expressão dos normalizadores. Sendo assim,
concluímos ser a melhor opção a quantificação obtida pelo Qubit e dessa forma, observamos
uma menor variação para um dos normalizadores (ACTB). Com essa estratégia podemos
afirmar que a variação de expressão dos genes avaliados entre as amostras é real e não foi
gerada a partir de artefatos (diferença na quantidade de RNA) devido a degradação das
amostras.
6.2
Caracterização das amostras
Nos últimos 25 anos, notou-se uma melhora significativa no prognóstico de pacientes
com OS, principalmente naqueles com doença localizada. Com a associação da
quimioterapia a cirurgia e com regimes de quimioterapia utilizando multidrogas, e doses
mais elevadas, a sobrevida em 5 anos desses pacientes aumentou de forma progressiva até
a década de 80. No entanto, estudos publicados após essa década, mostraram que não
houve melhoras significativas na sobrevivência de pacientes com OS e destacam a
importância de uma nova estratégia na gestão sistêmica dessa condição ainda muito letal90,
91.
Pelo amplo espectro de apresentação e prognósticos distintos observados no
tratamento do OS, diversos fatores epidemiológicos, clínico-patológicos e marcadores
biológicos têm sido buscados para melhor predizer a evolução dos pacientes e estimar sua
sobrevida10, 92-94.
Entre os fatores reconhecidos com importância prognóstica destacam-se: tamanho
do tumor94, localização e resposta à quimioterapia neodajuvante17,
95.
Outros fatores
prognósticos desfavoráveis já foram descritos em alguns estudos e incluem: presença de
doença metastática ao diagnóstico17, 34, 94, 96, tumores volumosos97, idade inferior a 10 anos e
sexo masculino10, 12, 93.
O perfil dos pacientes descritos no nosso trabalho quanto aos fatores prognósticos,
não difere dos padrões observados em outros estudos publicados, com exceção do sexo,
pois na maioria dos estudos, o sexo masculino costuma ser o mais frequentemente
afetado17,
98.
Assim, dos 36 pacientes incluídos no estudo, a maior frequência do
osteossarcoma foi no sexo feminino (55,6%), e segundo Mirabello et al.1 que avaliou a
56
incidência e a sobrevida dos pacientes com OS de 1973 a 2004, também encontrou a maior
frequência no sexo feminino. Apesar de alguns autores considerarem o sexo masculino
como um prognóstico desfavorável10, 12, 93, a sobrevida global e a sobrevida livre de eventos
em 5 anos foi maior para o sexo masculino, mas nossa análise não demonstrou resultado
significativo que nos permitisse corroborar estes achados.
Em relação à idade ao diagnóstico, 29 (80,6%) possuíam idade igual ou superior a 10
anos. A média de idade foi de 15 anos, o que condiz com os dados da literatura. Apesar da
média de idade ao diagnóstico ser muito variável na maioria dos estudos17, 95, 99, 100, os dados
reafirmam que o maior pico de incidência desta doença é na segunda década de vida1, 101, 102.
A idade como fator prognóstico na literatura é muito controversa. Pacientes com menos de
14 anos e mais de 40 anos, segundo dois grandes estudos retrospectivos, apresentaram
sobrevidas inferiores12, 103. Entretanto, em um estudo retrospectivo, multicêntrico, com 2680
pacientes de 10 centros de pesquisa do mundo, demonstrou que a idade não foi um
marcador prognóstico93. No Brasil, em um estudo com 225 pacientes, a idade não mostrou
ser um fator prognóstico17. No nosso estudo, a idade não impactou a sobrevida dos
pacientes.
O osteossarcoma pode acometer qualquer osso do esqueleto axial ou apendicular do
corpo humano, mas preferencialmente acomete as metáfises dos ossos longos, como fêmur
distal, tíbia e úmero proximais. Neste trabalho, a grande maioria 91,7% (33/36) apresentou
comprometimento de ossos longos, principalmente fêmur e tíbia, seguido do úmero, além
do predomínio da histologia clássica, corroborando os dados da literatura17, 90, 95. De acordo
com a literatura, tumores axiais possuem um pior prognóstico quando comparados com os
de extremidades, principalmente pela dificuldade de ressecção total do tumor axial.
Osteossarcoma de pelve, coluna e tórax tem uma sobrevida de apenas 20-40% quando
comparado com o de extremidades (60-70%)12,
104, 105.
Em nosso trabalho, não temos
tumores localizados em região do esqueleto axial, não sendo possível realizar essa
associação com a sobrevida dos pacientes. Entretanto, nossos dados sugerem que mesmo
considerando apenas o esqueleto apendicular, a presença de tumor em região femural
apresenta SG e SLE aproximadamente 30% menor em 5 anos, comparados aos tumores
localizados em tíbia, fíbula e úmero.
Historicamente,
acreditava-se
que
os
subtipos
histológicos
clássicos
de
osteossarcoma (osteoblástico, fibroblástico e condroblástico) apresentavam mesmo
57
comportamento. No entanto, há dados que sugerem que o osteossarcoma condroblástico
esta associado a pior resposta à quimioterapia em comparação com outros subtipos e,
portanto, está associado a um mau prognóstico106. Nossos resultados não encontraram
significância estatística, mas podemos notar que os pacientes que apresentaram uma pior
sobrevida global e livre de eventos estavam no grupo do condroblástico/fibroblástico/
telangectásico. Das oito amostras deste grupo, cinco são do subtipo condroblástico e desses
80% (4) tem resposta pobre a quimioterapia (grau de Huvos 1/2), o que parece corroborar
os dados da literatura. Para o paciente restante, esse critério não se aplicou pois não foi
submetido a cirurgia.
No tratamento do osteossarcoma, o grau de Huvos refere-se ao grau de necrose
tumoral em resposta à quimioterapia neo-adjuvante107. É considerado pela literatura como
um fator prognóstico muito importante na sobrevida dos pacientes com osteossarcoma92, 93,
97.
O grau de Huvos é avaliado em porcentagem na análise histopatológica da peça cirúrgica
do paciente, após o início do tratamento. É uma avaliação direta e objetiva da eficácia do
tratamento quimioterápico. No nosso estudo, em relação ao grau de resposta à
quimioterapia encontramos que dos 36 casos, apenas 2 não foram avaliados, pois os
pacientes não foram submetidos à cirurgia pós quimioterapia. Assim, para aqueles em que
esse parâmetro estava disponível, 35,3% (12/34) dos casos foram classificados como grau 1
e 41,17% (14/34) grau 2, ou seja, ~ 76,5% dos casos apresentou resposta pobre à
quimioterapia (índice de necrose tumoral menor ou igual a 90%). Do restante, 17,64%
(6/34) apresentaram grau 3 e 5,88% (2/34) grau 4 e foram classificados com boa resposta à
quimioterapia (necrose tumoral maior que 90%). Para análise estatística, o grau de Huvos foi
dividido em duas categorias: boa resposta à quimioterapia (grau 3 e 4) com somente 22,5 %
(8/34) dos casos e pobre resposta à quimioterapia (grau 1 e 2) com 76,4% (26/34) dos casos.
De acordo com a literatura, pacientes que alcançam pobre resposta ao tratamento,
apresentam uma pior sobrevida quando comparado aos pacientes com boa resposta17, 108.
No nosso estudo, o grau de Huvos não foi associado a sobrevida dos pacientes, mas
podemos observar que a sobrevida global e livre de eventos foi maior em pacientes que
responderam melhor ao tratamento (grau 3/4).
Em relação ao tamanho do tumor, alguns estudos demonstraram que ele pode se
correlacionar com o prognóstico: tumores maiores foram associados com estimativas
inferiores de sobrevida109, 110. Tumores maiores que 10 cm tem sido associados com resposta
58
pobre ao tratamento em alguns estudos111, 112. Outros associaram tamanhos maiores que
12cm17. Entretanto, existe uma dificuldade em se estabelecer um ponto de corte onde a
partir de um tamanho, essa variável se torne importante para indicar o prognóstico dos
pacientes. Isto se deve às diversas técnicas utilizadas na mensuração do tamanho do tumor
e somado a isso, o uso de diferentes modalidades de imagem como a radiografia
convencional, a tomografia computadorizada e a ressonância magnética 108. No nosso
estudo, o ponto de corte selecionado foi 12 cm, de acordo com o GBTO 17 e o método
utilizado para a mensuração do tamanho do tumor foi preferencialmente a ressonância
quando disponível, seguido pela tomografia e radiografia, neste caso quando apenas este
exame estava disponível. No nosso trabalho, o tamanho do tumor não foi um fator
prognóstico e podemos observar que pacientes com tumores maiores que 12 cm
apresentam uma melhor sobrevida global e livre de eventos. Apesar de ter sido avaliado
pelo mesmo radiologista, esse achado pode ser explicado pelo fato de utilizarmos diferentes
métodos/exames de imagem para determinar o tamanho de tumor ao diagnóstico. A
radiografia convencional proporciona ao radiologista uma menor precisão para a
mensuração do tamanho do tumor, o que pode ter subestimado o tamanho de tumor de
alguns pacientes (9/28). Ainda, para 8 dos 36 pacientes não havia disponível qualquer exame
de imagem para a determinação do tamanho do tumor, o que restringiu a nossa
amostragem para a análise deste aspecto.
A presença de doença metastática tem sido considerada como fator prognóstico, e
menos de 20% dos pacientes têm sobrevida livre de doença em 5 anos 12. Em relação à
sobrevida global e livre de eventos de pacientes metastáticos e não metastáticos ao
diagnóstico, nossos dados são comparáveis aos dados da literatura1,17 e podemos ver
claramente que a doença metastática ao diagnóstico confere ao paciente uma sobrevida
significativamente menor quando comparado ao não metastático.
6.3
Expressão dos lncRNAs em osteossarcoma
Devido a raridade da doença, a maioria dos trabalhos que tem por objetivo estudar
alterações moleculares em osteossarcoma tem à disposição casuísticas restritas em torno de
20 a 50 pacientes30, 33, 85, 99, 111, 112. Em nosso caso, apesar da disponibilidade de 175 amostras
de tecido tumoral congelado de osteossarcoma, optamos por ser estringentes nos critérios
de inclusão destas amostras no estudo, principalmente no que diz respeito à qualidade do
59
RNA. Dessa forma, minimizamos a introdução de viés nas análises de expressão gênica,
devido à baixa qualidade do RNA, garantindo que o resultado obtido é fidedigno e reflete a
real expressão destes genes nas amostras avaliadas. Diversos trabalhos que avaliam a
expressão gênica em OS não descrevem a utilização de tais critérios em suas análises63, 99, 113,
114.
6.3.1 Correlação da expressão do BCYRN1 com as características clínico-patológicas e
sobrevida
O BCYRN1 é um RNA não codificador seletivamente expresso no sistema nervoso
central de primatas e foi identificado em domínios somatodendríticos de um subconjunto de
neurônios80.
Na literatura, estudos avaliando a expressão de BCYRN1 em tumores humanos são
escassos. Um dos primeiros estudos apenas avaliou a expressão de BCYRN1 em 19 tipos
diferentes de tumor e revelou sua maior expressão nos carcinomas de mama, colo do útero,
esôfago, pulmão e ovário, mas não nos tecidos normais correspondentes80. Posteriormente,
outro grupo avaliou a expressão de BCYRN1 em tecido mamário normal em relação a
carcinomas ductais in situ de baixo grau, alto grau e carcinomas invasivos. Os resultados
mostraram que o BCYRN1 não é expresso em mama normal e não tem expressão
significativa em carcinomas ductais in situ de baixo grau, em contrapartida, está altamente
expresso em carcinomas ductais in situ de alto grau e em todos os carcinomas invasivos. A
alta expressão deste gene foi sugerida como marcador de invasividade, diagnóstico e
prognóstico no câncer de mama. A superexpressão do BCYRN1 nestes tumores pode ser
usada como indicador de progressão tumoral43. Portanto, apesar de poucos relatos, os
primeiros estudos avaliando a expressão deste gene demonstram evidências de que sua
maior expressão ocorre nos tecidos tumorais e, ainda que essa expressão está associada
com a agressividade do tumor, visto que sua maior expressão foi observada nos subtipos de
alto grau e invasivos.
Nós não encontramos na literatura estudos que avaliaram a expressão de BCYRN1 em
osteossarcoma. No nosso estudo, quando comparamos a média de expressão de BCYRN1
entre as características avaliadas apenas encontramos associação em relação a idade. Os
tumores de pacientes com > a 10 anos tem maior expressão do gene comparado ao grupo
menor do que 10 anos (p=0,036). Não houve associação estatisticamente significativa com
60
as outras características avaliadas (tabela 6). Em relação ao padrão de expressão do gene
(análise categórica) nossos resultados demonstraram que alta expressão está associada com
os subtipos condroblástico, fibroblástico ou telangectásico (p=0,046 – Tabela 12). Como já
descrito anteriormente, a literatura aponta o subtipo condroblástico associado a resposta
pobre ao tratamento e pior prognóstico. Apesar de não significativo, nossos dados apontam
que pacientes com este subtipo tumoral apresentam estimativas de SG e SLE 30% menores
quando comparados ao osteoblástico (SG: 33,3% vs 57,0% p=0,225 e SLE: 28,6 vs 59,2 p=0,1,
respectivamente). Nossos dados podem ser as primeiras evidências de que a expressão
deste gene pode estar associado a um pior prognóstico dos pacientes com OS.
Apesar de não significativos, outros achados reforçam esta hipótese. Por exemplo,
pacientes pouco responsivos ao tratamento (Huvos 1/2) apresentaram expressão em média
três vezes maior de BCYRN1 em relação aos que tem boa resposta (Huvos 3/4). Além disso,
pacientes metastáticos ao diagnóstico e com metástase durante o tratamento apresentaram
em média duas vezes e quatro vezes, respectivamente, maior expressão de BCYRN1 quando
comparados aos não metastáticos (Tabela 6). Os pacientes que apresentaram maior
expressão do gene tiveram estimativas de SG e SLE 20% menor em 5 anos em relação aos
que tiveram baixa expressão (SG: 40,4 vs 59,4 p=0,295 e SLE: 40,2 vs 61 p=0,313,
respectivamente).
Embora a maioria das análises não sejam significativas, esses dados em conjunto
apontam para uma possível associação entre a maior expressão do BCYRN1 como um
potencial marcador de pior prognóstico nos pacientes com osteossarcoma. Sendo assim, a
expressão e função deste gene merece uma investigação mais profunda em OS.
6.3.2 Correlação da expressão do HOTAIR com as características clínico-patológicas e
sobrevida
Relatos sugerem que o HOTAIR atua na regulação epigenética pelo recrutamento de
complexos remodeladores de cromatina (polycomb repressive complex 2) sobre sequências
alvo específicas que culmina na supressão de diversos genes44. Recentemente, foi
demonstrado que o aumento de expressão de HOTAIR, induzido por TGF-β1, regula a
ativação do processo de transição epitélio-mesenquima (TEM) em linhagens celulares de
carcinoma colorretal e de mama115. TEM é um importante processo que permite as células
epiteliais desativarem as ligações intercelulares e adquirir propriedades mesenquimais como
61
capacidade migratória aumentada e potencial metastático116. Também foi demostrado que a
ativação da via de sinalização de TGF-β promove a transição epitélio-mesenquima, aumento
de mobilidade celular e invasão na linhagem celular de osteossarcoma U2OS117 e que, a
inibição dessa via resulta no bloqueio do crescimento do tumor primário e o
desenvolvimento de metástases pulmonares em OS118. Apesar de sua função ainda não ter
sido explorado em OS, esses relatos podem indicar um potencial papel funcional do HOTAIR
em OS.
De fato, o aumento de expressão de HOTAIR tem sido associado a presença de
metástases e pior prognóstico em diversos tipos tumorais64, 119-121. Por exemplo, um dos
primeiros relatos a avaliar a expressão de HOTAIR em tumores humanos, demonstrou que a
superexpressão de HOTAIR em tumores primários de mama está associado ao
desenvolvimento de mestástase e menor sobrevida global64. Em tumores primários de
pulmão não pequenas células a alta expressão de HOTAIR foi relacionada com uma
sobrevida significativamente menor dos pacientes119. Em relação a sobrevida, o mesmo foi
observado para carcinoma escamoso de esôfago, além da maior expressão de HOTAIR
também estar associada a um maior tamanho do tumor, estadiamento clínico mais
avançado, presença de metástase linfonodal e menor grau de diferenciação histológica120.
Em tumores gástricos, também foi descrita associação entre alta expressão de HOTAIR com
presença de metástase linfonodal e estágio avançado da doença121.
Apesar de todos esses achados que evidenciam a expressão de HOTAIR como um
marcador de metástase e pior prognóstico, interessantemente, um estudo recente em
tumores de mama demonstrou que não houve correlação significativa entre a
superexpressão do HOTAIR com as características clínico-patológicas avaliadas. Ainda, de
forma surpreendente demonstrou na análise multivariada que pacientes com maior
expressão do HOTAIR tiveram menor risco de recidiva e morte, quando comparados àqueles
com baixa expressão. Sendo assim, os autores sugerem que a expressão do HOTAIR pode
não ser um marcador independente de prognóstico, sendo necessários estudos
independentes de validação em tumores de mama122.
Em relação aos sarcomas, um trabalho avaliou a expressão de HOTAIR em tumores
primários e em metástases. Os autores demonstraram que menores níveis do HOTAIR foram
associados com boa resposta ao tratamento. Neste mesmo estudo, a alta expressão do
62
HOTAIR foi relacionada a uma maior probabilidade de presença de metástases 123. Em
relação a avaliação da expressão deste gene em OS, nada foi encontrado.
No nosso estudo, quando a expressão do HOTAIR foi considerada como uma variável
numérica, não encontramos associação significativa entre a média de expressão de HOTAIR
e as características epidemiológicas e clínico-patológicas avaliadas. Apesar disso, vale a pena
destacar nesta análise que a expressão de HOTAIR foi em média 5,4 vezes maior em
pacientes com resposta pobre ao tratamento (Huvos 1/2) comparado aos bons
respondedores (Huvos 3/4) (p=0,256 – Tabela 7), o que parece estar em concordância com
os achados em relação a expressão deste gene em sarcomas123.
Em relação a análise categórica de expressão do HOTAIR, nossos dados demonstraram
que dos pacientes que apresentavam alta expressão do gene, 75% tinham tumores
inferiores a 12cm (p=0,049 – Tabela 13). Na literatura, esse dado é um pouco controverso,
uma vez que alguns estudos descrevem que não há associação significativa entre alta
expressão do HOTAIR e o tamanho do tumor64, 122, 123, enquanto outros estudos descrevem
essa associação120, 124, 125. De qualquer forma, esse achado deve ser avaliado de forma
cuidadosa, uma vez que para essa característica não foi possível resgatar a informação em
oito pacientes e, ainda, do restante há uma variação nos exames utilizados para a
determinação do tamanho tumoral, como descrito anteriormente. Em relação as análises de
sobrevida, ainda que não significativo, a SG e SLE nos pacientes que apresentaram alta
expressão do gene foi inferior quando comparado com aqueles que tiveram baixa expressão
(SG: 40,6% vs 64,8% p=0,242; SLE: 41,3% vs 62,3% p=0,224, respectivamente).
Mesmo que não significativos, nossos dados demonstraram que a maior expressão do
HOTAIR pode ser observada em pacientes que respondem pior ao tratamento e que
apresentam menores estimativas de sobrevida, também podendo ser um potencial
biomarcador de prognóstico em OS. Da mesma forma, a expressão e função deste gene
merece uma investigação mais abrangente em OS.
6.3.3 Correlação da expressão do HULC com as características clínico-patológicas e
sobrevida
Ao avaliarmos a expressão do HULC, não encontramos nenhuma associação
significativa com as variáveis clínico-patológicas estudadas. Podemos notar que mesmo não
obtendo resultados significativos, a maior média de expressão dos genes estava relacionada
63
com pacientes considerados bons respondedores (grau 3 e 4), com idade igual ou superior a
10 anos e com ausência de metástase ao diagnóstico. Quando avaliamos as mesmas
variáveis após categorização da expressão, notamos que a maioria dos pacientes que
apresentaram alta expressão do gene pertencia ao tipo histológico osteoblástico, com idade
igual ou superior a 10 anos (p=0,088) e com ausência de metástase ao diagnóstico (p=0,180).
De acordo com a literatura, no câncer pancreático a alta expressão do HULC foi
associada ao tamanho do tumor, metástase linfonodal e invasão vascular 79. No câncer
gástrico, a alta expressão deste gene também foi relacionada com a presença de metástase
linfonodal, metástase à distância e ao estadio mais avançado da doença. Foi observado os
efeitos da superexpressão e do “knockdown” da expressão do HULC e determinou-se que
este gene desempenha um papel importante na proliferação, migração, invasão e na
inibição da apoptose. Neste estudo não foi encontrada associação do gene com outros
fatores clínico-patológicos como idade, sexo, tamanho do tumor, localização e diferenciação
do tumor78.
No carcinoma hepatocelular, a expressão tecidual e plasmática de HULC estava
aumentada entre pacientes com hepatocarcinoma e um grupo controle. Além de serem
constatados níveis significativamente maiores de HULC no tecido/plasma de pacientes com
hepatocarcinoma, houve relação direta entre os valores de expressão do HULC e outras
variáveis, como o grau de diferenciação histológica. Estes resultados sugerem um potencial
uso deste RNA como biomarcador diagnóstico e/ou prognóstico. Além disso, sua expressão
foi maior quando comparada com tecidos normais do fígado e mostrou que a expressão
deste gene pode estar associada com a agressividade e a progressão do tumor77.
Na literatura, não encontramos relatos sobre a expressão do HULC em amostras de
osteossarcoma. No nosso trabalho, não encontramos nenhum correlação significativa entre
a expressão deste gene e um pior prognóstico, como sugere a literatura.
6.3.4 Correlação da expressão do MALAT1 com as características clínico-patológicas e
sobrevida
MALAT1 foi o primeiro lncRNA associado com um alto potencial metastático e pior
prognóstico em um estudo avaliando pacientes portadores de câncer de pulmão de não
pequenas células com ou sem metástase. MALAT1 mostrou estar superexpresso em muitos
64
tumores sólidos, dentre eles, mama, próstata, cólon, fígado, útero, hepatocarcinoma,
pâncreas e osteossarcoma57, 58, 126-128.
No nosso estudo, a maior expressão do MALAT1 foi associada significativamente a
pacientes com idade igual ou superior a 10 anos quando analisamos a média da expressão
(p=0,048), e após a categorização da expressão (p=0,008). Na literatura, não encontramos
associação significativa deste gene com a idade63, 129-132.
Apesar de não encontrarmos associação significativa com as demais características
clínico-patológicas, observamos uma maior expressão do MALAT1 em pacientes do sexo
masculino, em tumores localizados na fíbula, tíbia ou úmero. MALAT1 se mostrou com uma
expressão um pouco aumentada em pacientes não metastáticos quando avaliamos a
presença de metástase independente do momento diagnosticado. Entretanto, após a
estratificação dos pacientes metastáticos, pudemos observar que a maior expressão do gene
ocorre nos tumores de pacientes que desenvolvem metástase durante o tratamento. Além
disso, observamos também que a maioria dos pacientes com baixa expressão não obtiveram
boa resposta à quimioterapia (grau 1/2).
O mecanismo de ação molecular do MALAT1 é ainda muito discutido. Em linhagem de
células tumorais humanas, a inibição de MALAT1 suprimiu a migração e invasão57. Ao injetar
em camundongos, xenoenxertos de células tumorais de câncer de pulmão não pequenas
células, a formação e o crescimento dos tumores se mostraram prejudicada com a
diminuição da expressão do MALAT1130. Diversos estudos têm mostrado uma forte
associação da superexpressão do MALAT1 com a presença de metástase e um prognóstico
ruim57, 63, 99, 129-132.
Um estudo pioneiro com MALAT1 propôs identificar diferenças na expressão gênica
entre tumores de pulmão não pequenas células que metastatizaram ou não e encontrou
uma expressão maior (cerca de três vezes mais) nas amostras de pacientes que
desenvolveram metástases, além da drástica piora na sobrevida global57.
A superexpressão de MALAT1 foi avaliada em amostras de tumores como mieloma
múltiplo e revelou que este lncRNA possui um papel na patogênese da doença e que a
alteração na expressão desse gene depois do tratamento foi clinicamente significativa e
pode servir como um preditor molecular dos pacientes em risco de progressão precoce.
Além disso, este estudo revelou que pacientes com menor expressão do MALAT1 tinham
65
significativamente maior sobrevida livre de progressão em comparação com os pacientes
com uma menor alteração na expressão62.
Em osteossarcoma, um estudo que teve como objetivo demonstrar a associação entre
os níveis de expressão de MALAT1 e características clínico-patológicas encontrou que a
expressão do gene nos tecidos tumorais foi significativamente maior do que em tecidos
normais; a presença de metástases pulmonares e acometimento linfonodal foram
significativamente mais comuns no grupo de maior expressão; não houve associação entre a
expressão do gene e o sexo, tamanho do tumor e sobrevida em 5 anos, e em relação a
idade, o grupo com maior expressão do MALAT1 foi o mais jovem (em média, 16 anos)
(p=0,05). Neste estudo, o autor concluiu que o osteossarcoma apresenta expressão elevada
de MALAT1 e que o nível de expressão associa-se a uma maior probabilidade de desenvolver
metástases pulmonares e acometimento linfonodal63. Outro estudo em osteossarcoma
mostrou que a expressão do MALAT1 foi significativamente maior no grupo de maus
respondedores ao tratamento quimioterápico, mas não encontrou associação com a
sobrevida global e livre de eventos, assim como no nosso estudo99.
6.4
Limitações do estudo
Como podemos observar, para a maioria das análises desenvolvidas em nosso estudo
não foi possível encontrar associações significativas indicando o papel prognóstico destes
genes em OS. Entretanto, uma limitação do nosso projeto foi o pequeno número de
amostras (36) que pôde ser avaliado, uma vez que temos no biobanco da instituição
amostras tumorais congeladas provenientes de 175 pacientes (os motivos da exclusão
dessas amostras já foi descrito anteriormente). Uma parte considerável dessas amostras foi
excluído devido aos restringentes critérios de qualidade determinados para que as amostras
fossem utilizadas em nossas análises. Em contrapartida, esses critérios nos permitem afirmar
com segurança, que nossos dados refletem com fidelidade a expressão destes genes em OS.
Somado a essa pequena amostragem, temos o fato de que 35% dos pacientes
apresentam um tempo de seguimento menor do que dois anos, o que pode não ser tempo
suficiente para um paciente acometido por OS apresentar metástase ou óbito.
Reconhecemos tais limitações e sugerimos que o aumento da amostragem,
principalmente com a inclusão de pacientes com um tempo maior de seguimento pode nos
revelar o real papel prognóstico destes genes em OS.
66
7
CONCLUSÕES

Não houve diferença em termos de qualidade na extração do RNA entre o TRIZOL e
método comercial baseado em coluna;

A quantificação das amostras utilizando o Qubit é mais precisa e deve ser utilizada nas
análises de expressão gênica quando o RNA apresenta degradação parcial;

A maior expressão de BCYRN1 foi associada significativamente a pacientes com idade
acima de 10 anos e com o subtipo condroblástico/fibroblástico/telangectásico;

A expressão de HOTAIR não tem associação significativa com as características clínico-
patológicas avaliadas;

A expressão de HULC não tem associação significativa com as características clínico-
patológicas avaliadas;

A maior expressão de MALAT1 foi associada significativamente a pacientes com idade
acima de 10 anos;

As expressões de BCYRN1, HOTAIR, HULC e MALAT1 não foram significativamente
associadas a SG e SLE dos pacientes.
67
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78
Anexo A – Ficha de coleta de dados
O
Identificação
1
1
1
2
Nome
2
2
2
3
Registro
Hospitalar
3
3
3
4
Sexo
4
4
1- Feminino; 2- Masculino
4
DD/MM/AAAA
5
1- SUS; 2- Convênios; 3- Outros____________
6
1- Branco; 2- Negro; 3- Pardo; 4- Amarelo; 99- Ignorado
7
DESCREVER
8
DESCREVER
9
5
Data
de nascimento
5
5
6
Categoria
6
6
7
Raça
7
7
8
Naturalidade
– Cidade
8
8
9
Naturalidade
– UF
9
9
10
11
12
13
14
15
Estado Civil
1
1- Solteiro; 2- Casado / União estável; 3- Separado; 4- Viúvo; 99- Ignorado
1
Atividade
profissional
DESCREVER
1
Departamento
que o atende na nossa instituição
DESCREVER
1
Origem
do paciente
1- Clínica particular; 2- Rede pública; 3- Por conta própria; 99- Ignorado
1
Data
do primeiro atendimento em nosso serviço
DD/MM/AAAA
1
Data
do diagnóstico
DD/MM/AAAA
HEMOGRAMA HCB
1
HB
16
1
10
1
11
1
12
1
13
1
14
1
15
1
16
1
HT
1
17
17
1
Leucócitos
1
18
18
1
Neutrófilos
1
19
19
2
Plaquetas
2
20
20
TRATAMENTO HCB
2
Revisão
diagnóstica
21
2
0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
21
DESCREVER
22
23
24
DD/MM/AAAA
25
DESCREVER
26
2 Revisão
AP
22
2
2
Modificação
diagnóstica
23
2
2
Biópsia
24
2
2
Data
da biópsia
25
2
2
Local
do tumor
26
2
79
2
Data
em que recebeu o primeiro tratamento
27
2
DD/MM/AAAA
27
28
DESCREVER
29
Motivo da interrupção / Não seguimento no protocolo – Quimioterapia
neoadjuvante
3
1- Crescimento do tumor após indução; 2- Ulceração / Sangramento do
tumor;
3- Dor intratável; 4- Outros ____________
3Quimioterapia adjuvante
3Protocolo quimioterapia adjuvante
DESCREVER
3Mudança protocolo quimioterapia adjuvante
Motivo da interrupção / Não seguimento no protocolo – Quimioterapia
adjuvante
3
1- Crescimento do tumor após indução; 2- Ulceração / Sangramento do
tumor;
3- Dor intratável; 4- Outros ____________
3Radioterapia
3Cirurgia
3Data da cirurgia
DD/MM/AAAA
3Tipo de Cirurgia
1- Urgente; 2- Eletiva; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Tipo de ressecção
4
1- Com preservação do membro; 2- Sem preservação do membro
(amputação);
88- Não se aplica; 99- Ignorado
Se realizou cirurgia, qual resultado?
4
1- Completamente ressecado com margens livres;
2- Completamente ressecado com margens comprometidas; 3- Ressecção
incompleta
4Reconstrução
1- Biológica; 2- Mecânica; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
4Complicações cirúrgicas
0- Não; 1- Sim; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Infecção de ferida operatória
4
0- Não; 1- Sim, precoce (até 30 dias); 2- Sim, tardia; 88- Não se aplica; 99Ignorado
4Eventos tromboembólicos
0- Não; 1- TVP; 2- TEP
Deiscência de ferida operatória
4
0- Não; 1- Sim, sem necessidade de reabordagem; 2- Sim, com necessidade
de reabordagem; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
4Tipo histológico
DESCREVER
4Huvos (Aplicavel apenas para Osteossarcoma)
1- Grau 1; 2- Grau 2; 3- Grau 3; 4- Grau 4; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
30
2
Quimioterapia
neoadjuvante
28
2
2
Protocolo
quimioterapia neoadjuvante
29
2
3
Mudança
protocolo quimioterapia neoadjuvante
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
3
3
31
3
32
3
33
3
34
3
35
3
36
3
37
3
38
3
39
4
40
4
41
4
42
4
43
4
44
4
45
4
46
4
47
4
48
80
4Estadiamento utilizado
4
49
49
5Metástases
50
5
0- Ausentes; 1- Presentes
50
DD/MM/AAAA
51
52
53
54
55
56
57
DD/MM/AAAA
58
5Data da metástase
51
5
5Local da metástase - Pulmão
52
5
5Local da metástase - Ossos
53
5
5Local da metástase - Medula Óssea
54
5
5Local da metástase - SNC
55
5
5Local da metástase – Outro local
56
5
5Cirurgia de tórax
57
5
5Data da cirurgia de tórax
58
5
5DHL
5
59
59
6Data da última informação / óbito
60
6
DD/MM/AAAA
60
Status
6
61
62
OBS.:
1- Vivo sem doença; 2- Vivo com doença; 3- Óbito por câncer; 4Óbito por outra doença
6Perdeu seguimento (tempo do retorno x 2)
6
61
6
62
81
Anexo B – Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Câncer de
Barretos e do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/Universidade de São Paulo.
82
83
84

a expressão gênica dos rnas não codificadores hotair, malat1, hulc

Transcrição

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