TCC05 - Faculdade de Biomedicina

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
FELIPE TUJI DE CASTRO FRANCO
ANALISE BIOQUÍMICA DAS ENZIMAS β-GLICOSIDASE E
QUITOTRIOSIDASE EM SANGUE IMPREGNADO EM PAPEL
FILTRO EM DIFERENTES CONDIÇÕES CLÍNICAS.
BELÉM
2011
FELIPE TUJI DE CASTRO FRANCO
ANALISE BIOQUÍMICA DAS ENZIMAS β-GLICOSIDASE E
QUITOTRIOSIDASE EM SANGUE IMPREGNADO EM PAPEL
FILTRO EM DIFERENTES CONDIÇÕES CLÍNICAS.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva.
BELÉM
2011
2
FELIPE TUJI DE CASTRO FRANCO
ANALISE BIOQUÍMICA DAS ENZIMAS β-GLICOSIDASE E
QUITOTRIOSIDASE EM SANGUE IMPREGNADO EM PAPEL
FILTRO EM DIFERENTES CONDIÇÕES CLÍNICAS.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
a Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina,
aprovado com o conceito:
________________________________
Belém (PA), 15 de Dezembro de 2011
BANCA EXAMINADORA:
______________________________________
Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva
(ICB – UFPA/Orientador)
______________________________________
Prof. Msc. Erik Arthur Cortinhas
(UEPA – Membro)
______________________________________
Prof. Dr. José Ricardo dos Santos Vieira
(UFPA – Membro)
______________________________________
Profa. Msc. Isabel Cristina Souza Neves
(UFPA – Suplente)
3
"Lembre-se que as pessoas podem tirar tudo de você, menos o seu
conhecimento. É o seu bem mais precioso.
Explore, viaje, descubra, conheça."
Albert Einstein
4
Dedico este trabalho a:
A minha mãe, pessoa mais importante na minha vida, que sempre se esforçou
para realizar meus sonhos, estando sempre do meu lado, me apoiando em todas as
minhas decisões, com todo meu amor e carinho.
5
AGREDECIMENTOS
A Deus, porque sem Ele nada disso seria possível.
Aos meus pais, Selma Tuji e Hildener Franco, pelo amor e pelo
incondicional apoio, que sempre torceram pelo meu sucesso e pelo meu bem
estar.
Ao meu orientador Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva, por ter
acreditado no meu potencial, pelo apoio e incentivo, pelos ensinamentos e,
principalmente, pela amizade.
Aos amigos do Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo da UFPA pela
amizade, companheirismo, idéias e risadas compartilhadas durante todos
esses anos. Em especial a Vaneisse Monteiro, Brenda Oliveira e Francília
Silva, pois são amizades que certamente eu levarei comigo a minha vida toda.
Aos meus amigos da Biomedicina Ana Paula Castro, Bárbara Brasil e o
Geison Castro, não tenho palavras para expressar toda a nossa amizade
durante esses 4 anos de curso.
Aos meus amigos Laura Seiffert, Humberto Castro, Yuri Vidal, Alexandre
Nogueira, Felipe Hage, Rodrigo Pará e Thaís Silva por estarem comigo durante
esses anos da minha vida contribuindo de alguma forma para a minha
felicidade.
Aos meus amigos que conquistei durante todos esses anos durante o
curso pelo companheirismo e, em especial, aquele que colaboraram com a
coleta do grupo controle.
As médicas Drª Saide Trindade e Drª Isabel Neves pelo auxilio na busca
dos pacientes.
A equipe do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre por todo o conhecimento adquirido.
Aos pacientes e pais dos pacientes por terem aceitado participar do nosso
trabalho.
E a todos aqueles que de forma direta e indireta contribuíram para a
realização desse trabalho.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
6
LISTA DE ABREVIATURAS
EIM: Erros inatos do metabolismo
DLD: Doença lisossômica de depósito
GSI: Esfingolipídio
DG: Doença de Gaucher
IL-1α: Interleucina-1α
IL-6: Interleucina-6
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
TRE: Terapia de reposição enzimática
OLS: Oligossacarídios
SOLS: Sialoligossacarídios
QT: Quitotriosidase
β-Gal: Beta-galactosidase
SIPF: Sangue impregnado em papel filtro
7
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Tabela 1 – Atividade das enzimas β-glicosidase e β-galactosidase em
diferentes amostras......................................................................................25
Figura 01 – Via de degradação dos esfingolipídios nos lisossomos humanos:
enzimas
envolvidas
e
enzimas
relacionadas
às
doenças
de
depósito...............................................................................................................6
Figura
02
–
Degradação
de glicosilceramida
em glicose
e
ceramida..............................................................................................................7
Figura
03
–
Células
de
Gaucher
retiradas
da
medula
óssea...................................................................................................................7
Figura 04 – Diferença no gene do QUIT normal e mutante. A: gene normal da
QUIT; B: gene mutante da QUIT, com duplicação de 24 pb no exon
10.......................................................................................................................13
Figura 05 – Sangue impregnado em papel filtro usado nos ensaios
enzimáticos........................................................................................................16
Figura 06 – Comparação das atividades enzimáticas da β-glicosidase
(nmol/h/mL) em leucóctios de indivíduos normais e pacientes com
DG......................................................................................................................23
Figura 07 – : Comparação das atividades enzimáticas da β-glicosidase
(nmol/h/mL) em SIPF de indivíduos normais e pacientes com
DG......................................................................................................................24
Figura 08 – Atividade da QT em plasma de pacientes com DG e indivíduos
normais..............................................................................................................26
Figura 09 – Atividade de QT em SIPF de pacientes com DG e indivíduos
normais..............................................................................................................27
8
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................11
1.0.
INTRODUÇÃO........................................................................................13
1.1
Erros Inatos do metabolismo........................................................13
1.2
Doenças lisossômicas de depósito...............................................14
1.3
Esfingolipidoses............................................................................14
1.4
Doença de Gaucher......................................................................16
1.5
Aspectos fisiopatológicos.............................................................17
1.6
Aspectos genéticos.......................................................................18
1.7
Tratamento...................................................................................19
1.8
Diagnóstico...................................................................................20
1.9
Marcadores e monitoramento.......................................................22
1.10 Justificativa...................................................................................24
2.0.
3.0.
OBJETIVOS............................................................................................25
2.1
Objetivo geral................................................................................25
2.2
Objetivos específicos....................................................................25
MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................26
3.1
Caracterização de amostra...........................................................26
3.2
Aspectos éticos.............................................................................26
3.3
Coleta e armazenamento.............................................................27
3.4
Riscos e benefícios do estudo......................................................27
3.5
Separação de leucócitos..............................................................27
3.6
Dosagem de proteínas.................................................................28
3.7
Ensaios enzimáticos: Leucócitos..................................................29
3.7.1 β-Glicosidase................................................................................29
3.7.2 β-Galactosidase ...........................................................................29
3.8
Ensaios enzimáticos: Plasma.......................................................30
3.8.1 Quitotriosidase .............................................................................30
4.0.
3.9
Ensaio enzimáticos: SIPF.............................................................30
3.10
Análise estatística.........................................................................33
RESULTADOS........................................................................................34
4.1
Atividade enzimática de β-glicosidase (leucócitos e SIPF)..........34
4.2
Atividade da enzima Quitotriosidase............................................37
9
5.0.
DISCUSÃO.............................................................................................39
6.0.
CONCLUSÃO.........................................................................................43
7.0.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................44
8.0.
ANEXOS.................................................................................................51
10
RESUMO
Introdução: A doença de Gaucher (DG) é um erro inato do metabolismo de
molécula complexa pertencente ao grupo das esfingolipidoses resultando no
acúmulo lisossomal de glicosilceramida, este acúmulo se deve à ausência ou
deficiência da enzima β-glicosidase. A quitotriosidase é um glicosil hidrolase
sintetizada e excretada pro macrófagos ativados. Na década de 90, estudos
mostraram que pacientes com DG possuíam níveis elevados de quitotriosidase
no plasma. Objetivos: Implantar um protocolo laboratorial enzimático
fluorimétrico utilizando sangue impregnado em papel filtro (SIPF) para
mensurar a atividade enzimática da β-glicosidase e quitotriosidase. Material e
métodos: Foram coletados 10 mL de sangue com heparina de 8 pacientes
diagnosticados com DG, 6 heterozigotos obrigatórios e 30 indivíduos controle
normais. Para a análise das enzimas β-glicosidase e quitotriosidase foram
utilizados o método descrito por Civallero e colaboradores, 2006. Os resultados
forem expressos em média ± desvio padrão. Resultados: A atividade
enzimática da β-glicosidase em indivíduos normais foi de 7,84 ± 2,91 nmol de
substrato hidrolisado/h/mL, em heterozigotos foi de 4,82 ± 0,67 nmol de
substrato hidrolisado/h/mL e em pacientes com DG foi de 0,71 ± 0,80 nmol de
substrato hidrolisado/h/mL. A atividade enzimática da quitotriosidase em SIPF
nos pacientes com DG foi de 277,93 ± 540,32 nmol de substrato
hidrolisado/h/mL, nos heterozigotos foi de 3,33 ± 2,82 nmol de substrato
hidrolisado/h/mL, enquanto nos indivíduos normais foi de 11,37 ± 10,78 nmol
de substrato hidrolisado/h/mL. Conclusão: Indivíduos com DG apresentaram a
atividade enzimática da β-glicosidase significativamente menor que aquelas
encontradas nos controles e heterozigotos (p<0,001), e atividade enzimática da
quitotriosidase significativamente maior quando comparadas com controles e
heterozigotos (p<0,001). Não houve diferença significativa entre controles e
heterozigotos (p=0,004) nas amostras. É viável a utilização de amostras de
sangue em papel filtro para o rastreamento da DG no norte do país.
Palavras-chaves: Doença de Gaucher, β-glicosidase, sangue impregnado em
papel filtro.
11
ABSTRACT
Introduction: Gaucher disease (GD) is an inborn error of metabolism of
complex molecules and it belongs to sphingolipidosis group, resulting on
lysosomal storage of glucosylceramide. The storage occurs because of the
absence or deficiency of β-glucosidase enzyme. Chitotriosidase is a glucosyl
hydrolase synthetized and excreted by active macrophages. In the 90’s decade,
studies showed that GD patients had high levels of plasmatic chitotriosidase.
Objectives: To implant a laboratorial protocol of enzymatic and fluorimetric
assay using dried blood on filter paper (DBFP) to quantify the enzymatic activity
of β-glucosidase and chitotriosidase enzymes. Material and methods: 10 mL
of blood was collected with heparin of 8 patients diagnosed with GD, 6
obligatory heterozygotes and 30 healthy controls individual. To analyze the βglucosidase and chitotriosidase enzymes it was used the method described by
Civallero and colleagues, 2006. Results were expressed in median ± standard
deviation. Results: The enzymatic activity of β-glucosidase in normal individual
was 7,84 ± 2,91 nmol of hydrolised substrate/mL, in heterozygotes it was 4,82 ±
0,67 nmol of hydrolised substrate/mL and in GD patients it was 0,71 ± 0,80
nmol of hydrolised substrate/mL. The enzymatic activity of chitotriosidase in
DBFP of GD patients was 277,93 ± 540,32 nmol of hydrolised substrate/mL, in
heterozygotes it was 3,33 ± 2,82 nmol of hydrolised substrate/mL, while in
normal individual it was 11,37 ± 10,78 nmol of hydrolised substrate/mL.
Conclusion: GD individual presented β-glucosidase enzymatic activity
statistically smaller than controls and heterozygote individual (p<0,001), and
chitotriosidase enzymatic activity is statistically higher than controls and
heterozygotes (p<0,001). There was no statistical difference between controls
and heterozygotes (p=0,004). Blood samples in filter paper have shown to be
viable to keep track of GD patients in the northern Brazil.
Key words: Gaucher disease, β-glucosidase, dried blood on filter paper
12
1. INTRODUÇÂO
1.1 Erros Inatos do Metabolismo
Os erros inatos do metabolismo (EIM) são doenças metabólicas
hereditárias, causadas pela deficiência de uma ou mais enzimas ou do defeito
em uma proteína de transporte. Como conseqüência, podemos ter acúmulo de
substrato, normalmente encontrada em concentrações mínimas, a deficiência
de produtos intermediários críticos, a deficiência de produtos específicos ou
ainda excesso nocivo de produtos de vias metabólicas associadas.
Segundo Wajner e colaboradores (2001), os EIM são, na sua grande
maioria de herança autossômica recessiva, com risco de 25% a cada gestação
de pais heterozigotos. Alguns são ligados ao cromossomo X, sendo o risco de
recorrência de 50% a cada gestação para o gênero masculino e de 50% das
filhas serem portadoras. Ainda existem as heranças mitocondriais, onde o risco
de recorrência de praticamente 100% para filhos de ambos os sexos. A
incidência individual de cada EIM, de acordo com o autor, é relatada como rara,
entretanto quando analisados em conjunto é de 1:5000 recém nascidos vivos,
sendo assim, o diagnóstico precoce e tratamento adequado, podem reverter
sintomas agudos e prevenir danos crônicos.
Os EIM podem ser didaticamente divididos em dois grandes grupos: os
de pequenas moléculas (aminoacidúrias, acidemias orgânicas, intolerância a
açúcares, etc.) e os de moléculas complexas (doenças de depósito
lisossômico, distúrbios peroxissomais). Pacientes portadores de defeitos do
metabolismo de pequenas moléculas apresentam um quadro de intoxicação
devido
ao
acúmulo
de
moléculas
não
metabolizadas
corretamente,
apresentando sintomas relacionados como vômito, convulsão, atraso no
desenvolvimento psicomotor e físico, hipotonia, morte súbita na infância, entre
outros. Os pacientes portadores de defeitos do metabolismo de moléculas
complexas apresentam sintomas permanentes e progressivos, independente
da ocorrência de infecções, jejum, cirurgias ou outras situações com
13
catabolismo acelerado e por não estarem relacionados à alimentação (Wajner
et al., 2001).
1.2 Doenças lisossômicas de depósito
A importância fisiológica das vias degradativas é revelada pela
existência de no mínimo 50 EIM classificados como Doenças Lisossômicas de
Depósito (DLDs) (Neufeld, 1991; Wilcox, 2004; Aerts et al., 2003). Os autores
argumentam que a maioria destas doenças ocorre devido a vários fatores entre
eles a deficiência enzimática lisossomal, transporte insuficiente dos substratos
a serem hidrolisados ou dos produtos de hidrólise através da membrana
lisossomal, a ausência de cofatores essenciais ou o defeito de proteínas
ativadoras das enfingolipidoses.
As DLDs, de acordo com o substrato acumulado são agrupadas em
mucopolissacaridoses, esfingolipidoses, mucolipidoses, oligossacaridoses e
glicogenoses (Neufeld, 1991). As DLDs são individualmente raras na
população, com menos de 5 casos em cada 10.000 nascidos vivos, mas em
conjunto têm uma incidência de 1 para cada 800 nascidos vivos (Meikle et al.,
1999; Ballabio, 2009).
Para a maioria das DLDs, o processo anormal de depósito começa no
período fetal durante a gravidez e torna-se clinicamente evidente nos primeiros
dois anos de vida, mas existem várias situações de início tardio. As DLDs são
progressivas, graves e predominantemente incuráveis, para a maioria delas o
diagnóstico permite apenas medidas preventivas como o aconselhamento
genético, a detecção de heterozigotos e o diagnóstico pré-natal (Ballabio,
2009).
1.3 Esfingolipidoses
Os esfingolipídios (GSls) são componentes essenciais da membrana de
células eucarióticas, sintetizados no retículo endoplasmático e no complexo de
Golgi. Localizados principalmente na camada externa da membrana plasmática
14
são internalizados por endocitoses e são degradados dentro dos lisossomos
(Sillence e Platt, 2004).
Os GSLs têm a função, entre outras, de colaborar nas propriedades
físico-químicas da membrana celular. Eles apresentam cerca de 300 estruturas
diferentes entre si e são compostos de pelo menos um resíduo de
monossacarídeo glicosidicamente ligado a um aminoálcool ceramida –
esfingosina ligada a um ácido graxo (Degroote et al., 2004; Wenneks et al.,
2009).
Como todos os constituintes celulares, os GSLs são continuamente
sintetizados e degradados. Tanto a via de síntese como a via de degradação,
contém uma série de enzimas, sendo o produto de uma reação o substrato
para a próxima reação enzimática. Se uma das enzimas faltar ou sua atividade
estiver comprometida, o produto não é sintetizado ou é inadequadamente
sintetizado, fazendo com que essa molécula não seja degradada, gerando
desordens metabólicas. Algumas dessas desordens metabólicas hereditárias
são conhecidas por resultarem de defeitos nas enzimas lisossomais
envolvendo a degradação dos GSLs (Kolter e Sandhoff, 2006).
A degradação dos esfingolipídios ocorre, predominantemente, em
endossomos e lisossomos. Huwiler e colaboradores (2000) e Walkley e Vanier
(2009) sustentam que alterações nas múltiplas vias de síntese, degradação e
reciclagem dos esfingolipídios podem gerar a produção e acúmulo secundário
desses metabólitos, os quais podem contribuir diretamente para a patogênese
de muitas doenças de depósito (Figura 1).
15
Figura 01. Via de degradação dos esfingolipídios nos lisossomos humanos: enzimas
envolvidas e enzimas relacionadas às doenças de depósito. Fonte: Kolter e Sandhoff, 2006.
1.4 Doença de Gaucher
A doença de Gaucher (DG) é um erro inato do metabolismo de molécula
complexa pertencente ao grupo das esfingolipidoses resultando no acúmulo
lisossomal de um material degradado incompletamente denominado de
glicocerebrosídio dentro das células da linhagem monócito-macrófago. Este
acúmulo se deve à ausência ou deficiência da enzima lisossomal β-glicosidase
ácida (β-glico,D-glicosil-N-acilesfingosina glicohidrolase, EC 3.2.1.45). Em
decorrência da deficiência da atividade da β-glicosidase, fica prejudicada a
clivagem do glicocerebrosídio. Como resultado tem-se o acúmulo desse
substrato
no
sistema
mononuclear
fagocitário
(monócitos/macrófagos),
originando células neste sistema denominadas de células de Gaucher
(Grabowski e Horowitz, 1997) (figuras 2 e 3).
16
Figura 02.Degradação do glicosilceramida em glicose e ceramida. Fonte: Kolter e
Sandhoff, 2006.
Figura 03.Células de Gaucher retiradas da medula óssea. Fonte: Sobreira e Bruniera,
2008.
1.5 Aspectos fisiopatológicos
As manifestações clínicas da DG são variadas e, às vezes até
assintomáticas, as mais comuns são a hepatosplenomegalia, trombocitopenia,
anemia, infecções recorrentes, alterações ósseas incluindo fraturas e
osteoporose. Os pacientes com DG são, geralmente, divididos em três
fenótipos de acordo com os sinais e sintomas clínicos apresentados: (Futerman
et al., 2004).
17
DG
tipo
1
ou
forma
não
neuropática:
caracterizada
por
hepatoesplenomegalia, anemia, plaquetopenia e degeneração óssea. A
expressão clínica da doença pode variar desde os primeiros meses de vida até
a oitava década de vida. O sistema nervoso não está envolvido nesse tipo. É a
forma mais comum da doença correspondendo até a 99% dos casos e é,
particularmente, prevalente entre os judeus Ashkenazi com uma incidência de
cerda de 1:450 e de 1:40.000 em comparação com a população em geral.
DG tipo 2 ou neuropática: os pacientes têm anormalidades nervocraniais e
no
tronco
cerebral, hipertonia, retardo
mental, apnéia e
hepatoesplenomegalia. Idade de aparecimentos dos sintomas é em torno dos
primeiros meses de vida.
DG tipo 3 ou neuropática: pacientes têm sintomas similares ao tipo 1,
mas os sinais neuropáticos (retardo mental, apraxia motora ocular) aparecem
durante a adolescência.
Na DG tipo 1, a glicosilceramida acumulada, principalmente nas células
do sistema mononuclear fagocitário, é responsável pelo aumento e pela
liberação mediada por macrófagos, muitas vezes acentuada, de citocinas pró e
antiinflamatórias. Estas incluem entre outras citocinas a interleucina-1α (IL-1α),
a interleucina-6 (IL-6), o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a quemoquina
CCL18/PARC. Tais mediadores podem contribuir para a patogênese da doença
(Jmoundiak e Futerman 2005; Walkley e Vanier 2009).
1.6 Aspectos Genéticos
A DG tem herança autossômica recessiva sendo caracterizada a
presença de dois alelos mutantes para o gene da β-glico (GBA1), localizado na
região q21 do cromossomo 1. Atualmente, são conhecidas mais de 200
mutações no gene GBA1 o que acarreta expressiva heterogeneidade nas
manifestações fenotípicas da doença.
18
As mutações mais freqüentes são as denominadas N370S e L444P. A
primeira é causada por uma troca de adenina por guanina no éxon 9 do gene,
que determina a substituição do aminoácido asparagina por uma serina no
resíduo 370 da proteína. A mutação L444P deve-se a troca de uma timina por
uma citosina no éxon 10, o que leva a uma substituição do aminoácido leucina
por prolina no resíduo 444 da proteína (Wennedes et al., 2009).
De acordo com Charrow e colaboradores (2000) entre os judeus
Ashkenazi, quatro mutações são responsáveis por 90% dos casos, N370S,
84GG, L444P e IVS2+1. Na população não judia, a doença apresenta baixa
prevalência, e as mutações mais identificadas são as L444P, N370S, D409H,
R463C e IVS2+119. No Brasil, as mutações mais freqüentes coincidem com as
mais comuns referidas na literatura internacional: N370S e L444P (Pires e
Sobreira, 2004).
1.7 Tratamento
As opções terapêuticas para DLDs são relativamente limitadas e
restringem na sua maioria a cuidados paliativos. Este fato decorre da
dificuldade dos agentes terapêuticos desenvolvidos agirem no sistema nervoso
central, local de manifestação na maioria das DLDs. Grupos de pesquisa
concentram em desenvolver estratégias principalmente no transplante de
medula óssea, terapia de reposição enzimática (TRE), terapia de redução de
substrato e terapia gênica (Platt & Butters, 2000; Ozkara, 2002).
O marco no processo no tratamento de DLDs foi feito há poucas
décadas atrás, onde com o uso de técnicas de DNA recombinante, permitiu a
produção de enzimas lisossomais in vitro. As enzimas recombinantes são
conduzidas ao interior das células somáticas pelo receptor de manose, onde
são transferidas para o lúmen dos lisossomos. Uma vez no lisossomo, estas
enzimas degradam o substrato acumulado, repercutindo em uma melhora dos
sintomas de várias DLD. Estudos demonstram o uso da TRE na melhora da
qualidade de vida de pacientes com doença de Fabry, Mucopolissacaridoses
do tipo I, II e VI, doença de Pompe e DG (Nakamura et al., 2011).
19
O uso da TRE é limitado, pois a enzima recombinante não melhora
efetivamente todos os sintomas. Estudos clínicos mostram que alguns
sintomas são irreversíveis em casos avançados, mesmo com o tratamento em
longo prazo, portanto o diagnóstico precoce e tratamento são extremamente
importantes. Além de que essas enzimas recombinantes não atravessam a
barreira hematocefálica, mostrando que a TRE tem pouca ou nenhuma
eficiência, em relação às manifestações no sistema nervoso central (Nakamura
et al., 2011).
1.8 Diagnóstico
O protocolo inicial de investigação das DLD inclui o teste do azul de
toluidina (para investigação das Mucopolissacaridoses), bem como as
cromatografias de oligossacarídios (OLS) e sialoligossacarídios (SOLS) e a
medida das atividades das enzimas plasmáticas β-glicuronidase e das
hexosaminidases totais.
As cromatografias de OLS e SOLS realizadas em camada delgada
detectam bandas correspondentes a oligossacarídeos que são o produto da
degradação incompleta de cadeias laterais de glicoproteínas e glicolipídeos
complexos. Na presença de bandas anormais e padrões sugestivos de uma ou
outra doença, haverá a necessidade de confirmação da DLD através da
medida da atividade enzimática, utilizando geralmente um substrato artificial
com um radical fluorescente, em plasma, leucócitos ou cultura de fibroblastos
e, atualmente, em sangue impregnado em papel filtro (Wajner et al., 2001;
Civallero et al, 2006).
Algumas dessas doenças não são detectadas por esses protocolos, é o
caso, por exemplo, da DG (foco deste estudo), necessitando de uma suspeita
clínica e posterior solicitação de ensaios enzimáticos específicos, sem
necessidade de passar pelos protocolos já citados (Wajner et al., 2001).
Antes da identificação da deficiência enzimática, o diagnóstico da DG
era realizado através de exame histopatológico de biópsia de medula óssea ou,
20
em alguns casos, do fígado ou do baço. Entretanto, a presença de células
semelhantes às de Gaucher (chamadas de pseudocélulas de Gaucher) em
outras doenças, tais como leucemina mielóide crônica, mieloma múltiplo,
talassemia e doença de Hodgkin, poderia muitas vezes levar a diagnóstico
incorreto (Beutler, 2006).
Atualmente, o diagnóstico laboratorial da DG é feito através da medida
da atividade enzimática em leucócitos e/ou cultura de fibroblastos, obtidos a
partir de sangue periférico e a partir de biópsia de pele, respectivamente
(Michelin et al., 2004).
No grupo dos EIM, na qual a maioria das doenças é de herança
autossômica recessivas, a possibilidade de ter um novo filho afetado é de 25%.
No momento em que é feito o diagnóstico de uma criança com EIM, é
recomendado realizar o aconselhamento genético com a finalidade de informar
à família sobre os riscos de recorrência, o prognóstico, a gravidade da doença
em estudo e a possibilidade de realização do diagnóstico pré-natal.
O diagnóstico pré-natal é possível para a doença de Gaucher. Podem-se
realizar em diferentes tipos de amostras tais como:
a) Vilosidades coriônicas, coletadas usualmente entre a 10ª e 11ª
semana de gestação, e que permite a análise direta do material num período
mais precoce da gestação;
b) Líquido amniótico, que é geralmente coletado entre a 14ª e 16ª
semana de gestação, e cuja análise requer o cultivo prévio das células, o qual
leva em torno de 2 semanas;
c) Sangue fetal, que é coletado do cordão umbilical a partir da 20ª
semana de gestação.
O diagnóstico pré-natal é geralmente realizado pelo ensaio enzimático
especifico para a doença de Gaucher, mas também pode ser realizado pela
pesquisa da mutação por diagnóstico molecular, quando esta já é conhecida na
família (Sanseverino et al., 2001).
21
1.9 Marcadores e monitoramento
Estudos sugerem que a análises de anormalidades secundárias, tais
como a elevação nos níveis plasmáticos de determinadas proteínas, poderiam
intervir no entendimento da fisiopatologia da DG, além de fornecer marcadores
que possam auxiliar no momento do diagnóstico, bem como servir de
parâmetro da efetividade das terapias utilizadas, o que conseqüentemente
poderá auxiliar na otimização da dose para cada paciente, levando-se em
conto o alto custo dos tratamentos (Aerts et al., 2003; Parrenti, 2009).
A quitotriosidase (QT), também conhecida como quitinase humana (EC
3.2.1.14) é um glicosil hidrolase sintetizada e excretada pro macrófagos
ativados e está, usualmente, presente no fígado, rins, baço, pulmão e medula
óssea (Hollak et al., 1994; Aerts et al., 2008). Esta enzima é análoga a
quitinases de não vertebrados. Na década de 90, estudos mostraram que
pacientes com DG possuíam níveis elevados de QT no plasma (cerca de 100 a
500 vezes) e que após a introdução da TRE estes níveis diminuíam (Hollak et
al., 1994; Pastores e Barnett, 2005).
Acredita-se que, por ser sintetizada por macrófagos, a QT reflete
processos inflamatórios (Van Eijk et al., 2005), o que está de acordo com
achados prévios, demonstrando uma elevada atividade da QT em neonatos
com infecções fúngicas e em outras patologias como a malária (Labadaridis et
al., 2005; Muzzarelli, 2010). Estes mesmos autores destacam que apesar dos
vários estudos já realizados, não se conhece ainda as funções da QT em seres
humanos e, também, são desconhecidos os mecanismos exatos pelos quais a
QT é produzida em altas quantidades na DG e em outras esfingolipidoses
(Wajner et al., 2007).
Alguns estudos relatam o aumento da atividade da quitotriosidase em
algumas doenças lisossomais, este aumento é decorrente da ativação de
macrófagos devido ao acúmulo de esfingolipídios que contem, no seu interior,
ceramida, que é considerada imunogência (Wajner et al., Muzzarelli, 2010).
22
A quitotriosidase tem capacidade de clivar polímeros de quitina em
oligossacarídeos de tamanhos variados e liberando monossacarídeos de
glicosamina, a partir do final de uma molécula de quitina. A QT é mais ativa em
pH entre de 4,0-5,0. A capacidade destas enzimas para degradar quitina é
rotineiramente medida em ensaios que utiliza quitina fluorescente etiquetado
como um substrato, em plasma ou soro (Ober e Chupp, 2009).
Apesar da potencialidade da enzima QT como biomarcador para DG,
Moyses (2003) evidenciou que a elevada atividade enzimática não constitui
condição específica para esta patologia. Vários estudos indicam que a
presença de polimorfismos no gene QUIT1 pode levar à deficiência da enzima
QT no plasma, mesmo que não haja ainda nenhuma comprovação de que essa
deficiência tenha alguma repercussão para saúde. O mais conhecido e
freqüente destes polimorfismos é uma duplicação de 24 pb no éxon 10 do gene
QUIT1 (Figura 04). Apesar de 6% de a população ser homozigota para o alelo
mutante, a freqüência deste polimorfismo tem sido encontrada de forma
heterogênea em várias populações. A freqüência alélica da duplicação é
elevada em ameríndios da Amazônia Brasileira (61,0%) e Asiáticos (56,0%) e
menores em Europeus (17,0%) e Africanos (7,0%) (Lee et al., 2007; Silva,
2010).
Figura 04: Diferença no gene da QUIT normal e mutante. A: gene normal da QUIT; B: gene
mutante da QUIT, com duplicação de 24 pb no exon 10. Fonte: Lee et al., 2007..
23
1.10. Justificativa
Neste trabalho, será validada a metodologia de diagnóstico em SIPF
para a investigação bioquímica da DG na região norte do país. Amostras em
papel filtro apresentam um menor volume de sangue coletado e uma maior
facilidade quanto ao transporte e acondicionamento. Este tipo de material é de
fundamental importância quando se considera as grandes dimensões do Brasil
e os custos envolvidos no transporte e materiais de coleta. Dessa forma, a
determinação de atividade enzimática em amostras de SIPF poderia facilitar a
detecção de pacientes afetados, pois a coleta e seu transporte envolvem um
baixo custo.
24
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
 Implantar um protocolo laboratorial enzimático fluorimétrico em
SIPF para a determinação da atividade das enzimas β-glicosidase e
Quitotriosidase.
2.2 Objetivos Específicos
 Correlacionar os resultados obtidos na análise da β-glicosidase
em SIPF com resultados obtidos em leucócitos;
 Correlacionar os resultados obtidos na análise da Quitotriosidase
em SIPF com resultados obtidos em plasma;
25
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Caracterização da amostra
Para o presente estudo, foram coletadas amostras de sangue total para
a obtenção de SIPF, plasma e leucócitos. O grupo controle foi constituído de
amostras de 30 indivíduos saudáveis (18-50 anos), de ambos os sexos. O
grupo DG foi constituído de amostras de 8 pacientes previamente
diagnosticados com DG, sendo 5 do gênero feminino e 3 do gênero masculino.
A faixa etária dos pacientes variou de 11 a 43 anos. O grupo de heterozigotos
(familiares do pacientes) foi constituído de 6 indivíduos, que apresentavam
apenas um alelo mutante confirmado por análise molecular.
3.2 Aspectos Éticos
Este trabalho levou em consideração os princípios éticos básicos das
diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisa envolvendo seres humanos:
autonomia, beneficência, não maleficência e justiça, o que está de acordo com
a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde. Este projeto teve o
parecer favorável e aprovado pelo Comitê de ética em Pesquisa do Centro de
Hemoterapia e Hematologia do Pará – Fundação HEMOPA (anexo 01)
A explicação detalhada dos objetivos do estudo foi realizada pelo médico
envolvido no projeto ou pelo próprio pesquisador, através de um contato
pessoal, e/ou uma carta convite com esclarecimento de todas as dúvidas
levantadas pelo paciente ou seu responsável. Caso o convite para participação
neste estudo por parte do paciente fosse aceito, foi fornecido o termo de
consentimento livre e esclarecido (anexo 02), antes da coleta de qualquer
material biológico.
O material biológico coletado foi utilizado apenas neste estudo. Ele ficou
armazenado sob a responsabilidade do pesquisador responsável (coordenador
do estudo) no Laboratório de Erros Inatos da UFPA, sendo este também
26
responsável pela utilização do material. Após a assinatura do termo de
consentimento livre e esclarecido foi realizada a coleta de sangue.
3.3 Coleta e armazenamento das amostras
Para os ensaios enzimáticos nas amostras foram coletados 10 mL de
sangue venoso em seringa em tubo com heparina. Uma alíquota de 2 mL foi
separada pra separar o plasma e fazer a impregnação no papel filtro
Whatman 903 (Figura 05), sendo 8 mL destinados para a separação de
leucócitos. As amostras de plasma e leucócitos foram armazenadas a –20ºC e
o SIPF foi armazenado a 4°C até o momento dos ensaios enzimáticos.
Figura 05: Sangue impregnado em papel filtro usado nos ensaios enzimáticos.
3.4 Riscos e benefícios do estudo
A coleta da amostra biológica (punção venosa de sangue periférico)
representa um risco mínimo para o paciente, visto que é um procedimento
rotineiramente empregado em análises clínicas para medição de vários
metabólitos no sangue.
3.5 Separação de leucócitos
Os leucócitos foram isolados de sangue heparinizado de acordo com o
método descrito por Skoog e Beck (1956), que consiste em transferir 10 mL de
sangue total para um tubo de vidro grande e adição de 10 mL de uma solução
27
composta pela mistura dos seguintes reagentes: solução de ácido cítricocitrato-dextrose (ACD), dextran 6% e glicose 5%, diluídos em cloreto de sódio
0,9 %. Após misturar suavemente por inversão a amostra e s solução, essa
mistura foi deixada à temperatura ambiente, até completar sedimentação das
hemácias, por aproximadamente 1 hora. O sobrenadante foi transferido para
um tubo cônico de plástico e centrifugado a 2000 rpm por 10 min a 4ºC. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o precipitado, contendo os
leucócitos foi lavado com 0.8 mL de solução de NaCl 0,9%, homogeneizando
em agitador tipo vórtex. Foram adicionados 2,4 mL de água destilado gelada e
novamente homogeneizado. Depois de 90 segundos foi adicionado 0,8 mL de
NaCl 3,6%, misturado por inversão e centrifugado a 3000 rpm por 5 min a 4ºC.
O sobrenadante foi descartado e o pellet de leucócitos foi armazenado a -20 ºC
até o momento das análises enzimáticas.
3.6 Dosagem de proteínas
No momento da análise, o pellet de leucócitos foi diluído em água
destilada, em um volume que variou de 300 a 600 µL. Depois as amostras
foram sonicadas em Sonicador Ultrassônico, por 2 ciclos de 25 segundos,
intercalados por um período de descanso de 30 segundos, a fim de assegurar
o rompimento das membranas celulares e a conseqüente liberação do material
celular contido no interior dos lisossomos. Durante todo o procedimento, as
amostras foram mantidas em recipiente com gelo para manter a estabilidade da
atividade enzimática.
Para a dosagem de proteínas nas amostras, foi utilizado o método
descrito por Lowry, et al (1951). As amostras foram diluídas em água destilada
(20 µL de amostra e 480 de água destilada). Foram adicionados, sob agitação
em vórtex, 1,5 mL de reativo alcalino de cobre em todos os tubos, inclusive na
curva-padrão de albumina 0,02%. Após 10 minutos de repouso, foi adicionada,
sob agitação em vórtex, 150 µL de reativo de Folin-Ciocalteau em todos os
tubos, inclusive na curva e, após 30 minutos a cor desenvolveu-se, sendo
possível detectar a quantidade de proteína presente na amostra, através de um
espectrofotômetro Spectra Max M2 com comprimento de onda de 750 nm,
28
usando como padrão uma curva preparada com albumina bovina nas
concentrações 20, 40, 60, 80 e 100. O cálculo foi realizado a partir de curvapadrão de albumina e os resultados expressos em µg /100 µL.
3.7 Ensaios enzimáticos: Leucócitos
3.7.1 β-Glicosidase
A atividade enzimática da β-glicosidase foi determinada de acordo com
Peters e colaboradores (1976), utilizando-se uma mistura de 10 mmol/L de 4metilumbeliferil-β-D-glicosídio como substrato e 50 mmol/L de tauracolato de
sódio como detergente. Para o ensaio foram utilizados 20 µL de leucócitos, 100
µL de substrato e 50 µL de tampão citrato-fosfato 0.54 mol/L pH 5,5. Os
leucócitos foram incubados por 1 hora a 37ºC. A reação foi interrompida pela
adição de 1500 µL de tampão glicina-NaOH 0,5 mol/L pH 10,3, e a
fluorescência foi medida em um espectrofluorímetro Spectra Max M2 usando
filtros de emissão e excitação de comprimentos de onda 450 nm e 365 nm,
respectivamente. As leituras foram comparadas a uma curva de calibração 4metilumbeliferona.
As atividades enzimáticas foram calculadas em nanomol de substrato
hidrolisados por hora por miligrama de proteína (nmol/h/mg de proteína)
3.7.2. β-Galactosidase (Enzima de referência)
Para o ensaio enzimático da β-galactosidase (β-gal) em leucócitos
(enzima de referência) foi utilizado o método descrito por Suzuki, K. (1977), as
amostras foram diluídas em cloreto de sódio 0,9% para uma concentração de
proteína da amostras de 15 a 30 μg. O substrato 4-metilumberiferil-β-Dgalactosídeo foi diluído em tampão citrato-fosfato pH 4, numa proporção de 1
mg / 1,5 mL, que foi dissolvido através de aquecimento. No ensaio, foi utilizado
um volume de 100 μL de amostra diluída e 200 μL de substrato, em tubos de
vidro que foram incubados por 1 hora, a 37 ºC, com agitação suave. Após este
período, a reação foi interrompida pela adição de 3 mL de tampão glicina29
NaOH pH 10,3. A fluorescência (excitação, 365nm; emissão, 450 nm) foi
medida no espectrofluorímetro Spectra Max M2. A atividade enzimática foi
expressa em nmol/h/mg de proteína.
3.8 Ensaios enzimáticos: Plasma
3.8.1. Quitotriosidase
A atividade enzimática da quitotriosidase foi determinada segundo Hollak
e colaboradores (1994), utilizando-se o substrato artificial 4-metilumbeliferil-βD-N-N'-N”-triacetilquitotriosísio 0,02 mmol/L. O material destinado ao ensaio
continha 5 μL de plasma acidificado (50 μL de plasma adicionado de 5 μL de
ácido cítrico 0,2 mol/L) e 100 μL de substrato, dissolvido em tampão citrato
10mmol/L-fosfato 200 mmol/L pH 5,2 em um volume total de 105 μL. Este
material foi incubado por 15 minutos a 37ºC. A reação foi interrompida com
1000 μL de tampão glicina-NaOH 0,5 mmol/L pH 10,3, e a fluorescência foi lida
com um espectrofluorímetro Spectra Max M2 com filtros de emissão e
excitação de 450nm e 365nm, respectivamente.
As leituras foram corrigidas com valores dos brancos comparadas a uma
curva de calibração de 4-metilumbeliferona. Nas amostras em que atividade foi
muito elevada (pacientes com DG), procedeu-se uma diluição prévia (1:50) da
amostra em albumina 1% em água destilada para assegurar as condições de
saturação do substrato.
As atividades enzimáticas foram calculadas em nanomol de substrato
hidrolisados por hora por mililitro de sangue (nmol/h/mL).
3.9. Ensaios enzimáticos: SIPF
As amostras de SIPF foram obtidas de sangue total, utilizando-se papel
Whatman nº 903, secas à temperatura ambiente, por um período de 4 horas,
em superfície plana. Depois de secas, as mesmas foram acondicionadas em
sacos plásticos e armazenadas a 4 ºC até o momento da análise.
30
3.9.1 β-Glicosidase
Para este ensaio, foi utilizado o método descrito por Civallero et al. 2006.
No ensaio foram utilizados discos de 3,0 mm de diâmetro, contendo SIPF (~
3,6 µL de sangue total), em tubo eppendorf de 2,0 mL. Utilizou-se uma mistura
de 10 mmol/L de 4-metilumbeliferil-β-D-glicosídio como substrato e 50 mmol/L
de taurodeoxicolato de sódio como detergente. Para o ensaio foram utilizados
100 µL de substrato e 50 µL de tampão citrato-fosfato 0,54 mol/L pH 5,5 e
incubados a 37 ºC por 5 horas, com agitação suave. Antes da adição do
substrato, foram adicionados 1,5 mL de tampão glicina-NaOH 0,5M pH 10,3
aos tubos brancos.
Após o período de incubação, a reação foi interrompida pela adição de
1,5 mL de tampão glicina-NaOH 0,5M pH 10,3 aos tubos testes. As amostras
foram centrifugadas a 3000 rpm, por 10 min a 4 ºC. A fluorescência foi lida com
um espectrofluorímetro Spectra Max M2 com filtros de emissão e excitação de
450nm e 365nm, respectivamente.
A atividade enzimática foi calculada em nmol/h/mL. Em todos os ensaios
enzimáticos as leituras foram corrigidas pelos brancos e comparadas com
calibradores de 4-metilumbeliferona.
3.9.2 β-Galactosidase
A medida da atividade da enzima β-galactosidase foi realizada para a
avaliação da integridade das amostras em SIPF.
Para este ensaio, foi utilizado o método descrito por Civallero et al. 2006.
No ensaio foram utilizados discos de 3,0 mm de diâmetro, contendo SIPF (~
3,6 µL de sangue total), em tubo eppendorf de 1,5 mL. Após a adição de 80 µL
de tampão citrato-fosfato pH 4,4 0,05 M (líquido de diluição), foram adicionados
40 µL de substrato 4-metilumbeliferil-β-D-galactosídio 0,8 M/L com diluição em
água destilada e aquecimento para completar a dissolução. Após a
homogeneização, as amostras foram incubadas a 37 ºC por 3 horas, com
31
agitação suave. Antes da adição do substrato, foram adicionados 600 µL de
tampão glicina-NaOH 0,085M pH 10,5 aos tubos brancos.
Após o período de incubação, a reação foi interrompida pela adição de
600 µL de tampão glicina-NaOH 0,085M pH 10,5 aos tubos testes. As amostras
foram centrifugadas a 3000 rpm, por 10 min a 4 ºC. A fluorescência foi lida com
um espectrofluorímetro Spectra Max M2 com filtros de emissão e excitação de
450nm e 365nm, respectivamente.
A atividade enzimática foi calculada em nmol/h/mL. Em todos os ensaios
enzimáticos as leituras foram corrigidas pelos brancos e comparadas com
calibradores de 4-metilumbeliferona.
3.9.3. Quitotriosidase
Para este ensaio, foi utilizado o método descrito por Civallero et al. 2006.
No ensaio foram utilizados discos de 3.0 mm de diâmetro, contendo SIPF (~
3,6 µL de sangue total), em tubo eppendorf de 1,5 mL. Após a adição de 40 µL
de tampão acetato de sódio 0,25 M/L pH 5,5, foram adicionados 40 µL de
substrato 4-metilumbeliferil-β-D-N-N'-N”-triacetilquitotriosísio
0,19 M/L com
diluição em água destilada e aquecimento para completar a dissolução. Após a
homogeneização, as amostras foram incubadas a 37 ºC por 30 minutos, com
agitação suave.
Após o período de incubação, a reação foi interrompida pela adição de
600 µL de Etilenodiamina 0,13M pH 11,3 aos tubos testes. As amostras foram
centrifugadas a 3000 rpm, por 10 min a 4 ºC. A fluorescência foi lida com um
espectrofluorímetro Spectra Max M2 com filtros de emissão e excitação de
450nm e 365nm, respectivamente.
A atividade enzimática foi calculada em nmol/h/mL. Em todos os ensaios
enzimáticos as leituras foram corrigidas pelos brancos e comparadas com
calibradores de 4-metilumbeliferona.
32
3.10. Análise Estatística
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. O teste
não-paramétrico de Mann-Whitney do software Bioestat 5.0 foi usado para
determinação da diferença entre controles e paciente. Foi considerado p <
0,001 como sendo significante (Ayres et al., 2003).
33
4. RESULTADOS
4.1. Atividade enzimática de β-glicosidase (leucócitos e SIPF):
Neste estudo foi realizada a medida da atividade enzimática da βglicosidase em leucócitos e em sangue impregnado em papel filtro em 8
indivíduos com DG (previamente diagnosticados), 6 indivíduos heterozigotos
para a DG e 30 indivíduos normais.
Como pode ser observado na Figura 06 a média das atividades da βglicosidase nos pacientes com DG foi de 1,06 ± 0,71 nmol de substrato
hidrolisado/h/mg de proteνna, nos heterozigotos foi de 11,83 ± 5,4 nmol de
substrato hidrolisado/h/mg de proteνna, enquanto nos indivνduos normais foi
de 11,42 ± 5,93 nmol de substrato hidrolisado/h/mg de proteνna em leucσcitos.
Figura 06: Comparação das atividades enzimáticas da β-glicosidase (nmol/h/mL) em
leucóctios de indivíduos normais e pacientes com DG. Valores de referência: 10–25 nmol/h/mL
34
A medida da atividade enzimática da β-glicosidase em SIPF nos
pacientes com DG foi de 0,71 ± 0.80 nmol de substrato hidrolisado/h/mL, nos
heterozigotos foi de 4,82 ± 0,67 nmol de substrato hidrolisado/h/mL, enquanto
nos indivíduos normais foi de 7,85 ± 2,91 nmol de substrato hidrolisado/h/mL,
conforme a Figura 07.
Figura 07: Comparação das atividades enzimáticas da β-glicosidase (nmol/h/mL) em SIPF de
indivíduos normais e pacientes com DG. Valores de referência: 3 – 18 nmol/h/mL.
Após análise estatística foi verificado que os indivíduos com DG
apresentaram uma atividade enzimática significativamente menor que aquelas
encontradas nos controles e heterozigotos (p<0,001). Não houve diferença
significativa entre controles e heterozigotos em leucócitos (p=0,3202) e em
SIPF (p=0,0048).
Neste estudo foi realizada a medida da atividade enzimática de outra
enzima em leucócitos e em SIPF para validação do procedimento e do material
35
biológico. A média das atividades da β-galactosidase nos pacientes com DG foi
de 143,78 ± 62,83 nmol de substrato hidrolisado/h/mg de proteína, nos
heterozigotos foi de 150,23 ± 48,65 nmol de substrato hidrolisado/h/mg de
proteína, enquanto nos indivíduos normais foi de 214,09 ± 59,50 nmol de
substrato hidrolisado/h/mg de proteína em leucócitos.
A medida da atividade enzimática de β-galactosidase em SIPF nos
pacientes com DG foi de 32,14 ± 21,22 nmol de substrato hidrolisado/h/mL, nos
heterozigotos foi de 44,46 ± 13,40 nmol de substrato hidrolisado/h/mL,
enquanto nos indivíduos normais foi de 44,17 ± 21,70 nmol de substrato
hidrolisado/h/mL (Tabela 01).
Tabela 01: Atividade das enzimas β-glicosidase e β-galactosidase em diferentes amostras.
Método
n
Variação das atividades (média
± DP)
p
β-glicosidase
Leucócitos
Pacientes com DG
Controles normais
SIPF
Pacientes com DG
Controles normais
8
30
0,31 – 2 (1,06 ± 0,71)
5,35 – 28,5 (11,42 ± 5,93)
< 0,001
8
30
0 – 2,5 (0,71 ± 0.80)
3 - 15.1 (7.84 ± 2.91)
< 0,001
β-galactosidase
Leucócitos
Pacientes com DG
Controles normais
SIPF
Pacientes com DG
Controles normais
8
30
84,4 – 231,6 (143,78 ± 62,83)
101 - 336 (214,09 ± 59,50)
> 0,05
8
30
10,44 – 73,94 (32,14 ± 21,22)
29 – 117,1 (44,17 ± 21,70)
> 0,05
Após análise estatística foi verificado que os indivíduos com DG não
apresentaram atividade enzimática de β-galactosidase diferentes da observada
no grupo controle e heterozigotos (p>0,05). Não houve diferença significativa
entre controles e heterozigotos em leucócitos (p=0,3202) e em SIPF
(p=0,0048).
36
4.2. Atividade da enzima Quitotriosidase
Neste estudo foi realizada a medida da atividade enzimática da QT em
plasma e em SIPF em 8 indivíduos com DG, 6 indivíduos heterozigotos para a
DG e 30 indivíduos normais.
A média da atividade da QT nos 8 pacientes com DG foi de 13.977,80
± 15.551,66 nmol/h/mL de plasma; nos heterozigotos foi de 59,35 ± 19,33
nmol/h/mL de plasma; nos 30 indivíduos do grupo controles foi de 27,20 ±
25.97 nmol/h/mL de plasma. A Figura 08 mostra a atividade plasmática de QT
em indivíduos normais e pacientes com DG (dados representados em logaritmo
decimal).
Figura 08: Atividade da QT (nmol/h/mL) em plasma de pacientes com DG e indivíduos
normais. Valores de referência: 8,85 – 132 nmol/h/mL.
100000
Atividade (nmol/h/mL)
10000
1000
100
10
1
0
5
10
15
20
25
30
Indivíduos
37
A medida da atividade enzimática da QT em SIPF nos pacientes com
DG foi de 277,93 ± 540,32 nmol de substrato hidrolisado/h/mL, nos
heterozigotos foi de 3,33 ± 2,82 nmol de substrato hidrolisado/h/mL, enquanto
nos
indivíduos
normais
foi
de
11,37
±
10,78
nmol
de
substrato
hidrolisado/h/mL, conforme a Figura 09.
Figura 09: Atividade de QT (nmol/h/mL) em SIPF de pacientes com DG e indivíduos normais.
Valores de referência: 0 – 44 nmol/h/mL.
10000
Atividade (nmol/h/mL)
1000
100
10
1
0
5
10
15
20
25
30
35
Indivíduos
Após análise estatística, foi constatado que os indivíduos com DG
apresentaram uma atividade enzimática significativamente maior que aquelas
dos controles e dos heterozigotos (p<0,001). Não houve diferença significativa
entre controles e heterozigotos em leucócitos (p=0,0051) e em SIPF
(p=0,2291).
38
5. DISCUSSÃO
Este trabalho contou com amostras de sangue de pacientes com DG,
onde foi confirmado o diagnóstico através da determinação enzimática, em
leucócitos, da enzima β-glicosidase. Este diagnóstico foi realizado utilizando
tampão citrato-fosfato pH 5,5 e o substrato artificial 4-metilumbeliferil-β-Dglicosídio (Peters et al, 1976; Michelin et al. 2004).
Pacientes homozigotos para a DG tipo I são usualmente diagnosticados
pela determinação enzimática, resultando em uma atividade quase ou
totalmente deficiente da enzima β-glicosidase. No presente estudo, observouse que os indivíduos com DG tipo I apresentaram uma diminuição na atividade
da β-glicosidase em, aproximadamente, 95% em leucócitos em relação à
atividade média dos indivíduos normais (Figura 06), o que está de acordo com
Michelin e colaboradores (2004).
A deficiência relativa da atividade da β-glicosidase, utilizando-se para
essa medida substratos artificiais em leucócitos ou em fibroblastos cultivados,
não possui valor preditivo confiável para avaliar a gravidade clínica
(prognóstico) e tampouco distinguir os subtipos e variantes neurológicas e não
neurológicas da DG (Michelin et al., 2005).
Com ênfase ainda na caracterização das amostras do presente estudo
foi realizada a avaliação da atividade da enzima QT no plasma dos indivíduos
analisados. Neste estudo, foi realizado o diagnóstico de um paciente com DG e
deficiente da enzima QT, mostrando a importância da utilização de outro
biomarcador no diagnóstico e monitoramento da DG.
Pacientes com DG, homozigotos para duplicação dos 24 pb, não
apresentam atividade de QT no plasma. A fim de validar o uso da atividade da
QT como marcador de diagnóstico e monitoramento de terapias em pacientes
com DG, é indispensável determinar a freqüência alélica e genotípica da
duplicação de 24pb e de outros polimorfismos no gene QUIT1 nos grupos
étnicos e avaliar a possibilidade de usar outros marcadores (citocinas
39
estimuladoras
de
macrófagos,
enzima
conversora
de
angiotensina,
quemoquina CD163, CCL18, dentre outros) no monitoramento da DG.
Para validação da técnica, foram medidas as atividades da β-glicosidase
em amostras de leucócitos e SIPF e da QT em plasma e SIPF. Em todos os
pacientes com DG, foi possível confirmar a deficiência da β-glicosidase em
amostras de leucócitos e SIPF. Uma diferença estatisticamente significativa foi
observada na atividade da β-glicosidase entre o grupo controle e pacientes
com DG em ambas as amostras (SIPF e leucócitos) (Figura 06 e 07).
Em relação à atividade enzimática de QT, foi detectado um aumento na
atividade da enzima em amostras de plasma e SIPF. Esse aumento foi
estatisticamente significativo entre os indivíduos normais e pacientes com DG
em ambas as amostras (Figura 08 e 09).
Deve-se considerar que a medida da atividade enzimática em SIPF não
é sempre constante. Esta concentração depende principalmente dos
procedimentos de coleta da amostra (Civellero et al, 2006). Para minimizar esta
variação é recomendada a medida de uma enzima de referência em cada
amostra, neste trabalho foi utilizada a enzima β-galactosidase para esta
finalidade.
Uma correlação positiva pode ocorrer entre a contagem de leucócitos no
sangue e a diminuição da atividade enzimática medida em amostras de SIPF.
A diminuição na atividade enzimática relatada para baixas contagens de
leucócitos poderia ser facilmente identificada pelo ensaio simultâneo de outras
enzimas, com a observação de suas médias (Chamoles et al., 2001).
Nossos resultados encontrados para a dosagem da enzima βgalactosidase em SIPF se mostrou diferente daqueles encontrados por
Chamoles e colaboradores (2002) e Civallero e colaboradores (2006). Em
relação à β-glicosidase em SIPF, os valores também se encontraram diferentes
dos encontrados por Civallero e colaboradores (2006), mas não foi possível
comparar com os valores encontrados por Chamoles e colaboradores (2002),
40
uma vez que a metodologia utilizada foi diferente. Essa diferença pode ser
explicada pela diferença nos equipamentos utilizados, reagentes e/ou
diversidade étnica, uma vez que a população brasileira é conhecida devido à
variabilidade genética dos grupos étnicos que a formaram. Os valores
encontrados para a quitotriosidase não mostraram diferença estatística
(p>0,05) quando comparados com os outros autores.
Diversos estudos têm sido realizados para o melhor conhecimento do
SIPF como uma ferramenta no rastreamento e no diagnóstico das DLDs tanto
por fluorímetria como por espectrofotometria em Tandem (LC-MS/MS)
(Civallero et al., 2006; Olivova et al., 2009; De Jesus et al., 2009). Este
conhecimento torna o uso do papel filtro mais seguro e confiável, para a
investigação das DLDs e demonstra sua importância no rastreamento e
diagnóstico destas doenças na triagem neonatal.
Levando em conta o novo tipo de metodologia apresentado neste
trabalho, isso facilitaria a análise, diminuiria o custo e o tempo dos ensaios
enzimáticos, e possibilitaria a implantação de triagem para algumas DLDs em
populações de alto risco. Com a facilidade de coleta e transporte, o número de
casos poderá aumentar fazendo com que a real incidência dessas doenças na
população seja mais bem estimada, especialmente em países com grandes
dimensões geográficas como o Brasil, ou onde as condições de coleta e envio
de amostras de sangue heparinizado sejam limitadas.
Atualmente apenas 3 DLDs são triadas pelo programa de Triagem
Neonatal (PTN) de vários países. A doença de Pompe foi selecionada para
fazer parte do PTN tailandês devido à alta prevalência da doença, em
comparação com outras populações, 27,4% de todos os casos infantis da
doença de Pompe são diagnosticados lá (Kishnani et al., 2006). A doença de
Fabry foi escolhida em alguns países, como Itália e Tailândia, devido aos
benefícios do tratamento e, também, pela não urgência em tratar pacientes
diagnosticados na infância. Spada e colaboradores (2006) analisaram 37.104
neonatos do sexo
masculino
e foi diagnosticado 12 neonatos que
apresentaram deficiência na atividade enzimática da α-galactosidase A e,
41
posteriormente, confirmados por diagnóstico molecular, estimando a freqüência
da doença de Fabry na Itália em 1:3.100. Lin e colaboradores (2009) na
população tailandesas analisaram 100.027 neonatos para a investigação da
doença de Fabry e 45 neonatos foram diagnosticados para a doença,
estimando uma incidência de 1:1.600 casos de homens diagnosticados com a
doença. Outra doença selecionada foi à doença de Krabbe no estado de Nova
York no EUA, devido ao transplante de medula óssea realizado nos primeiros
meses de nascimento apresentar melhoras no quadro clínico da doença
(Escolar et al., 2005).
Burin e colaboradores (2010) realizaram o primeiro diagnóstico pré natal
no Brasil. No estudo, a gravidez foi considerada de risco para a
mucopolissacaridose tipo VI (MPS VI), pois já ocorrera o diagnóstico prévio de
duas crianças com MPS VI. Devidos aos problemas de distância, a equipe
médica decidiu enviar amostra de SIPF para o laboratório de referência para se
realizar o diagnóstico, onde foi possível fazer o diagnóstico corretamente,
relatando assim à importância da utilização de amostras de sangue
impregnado em papel filtro.
Este estudo indica que é viável a utilização de amostras de SIPF para o
rastreamento
da
DG no
Estado do Pará,
possibilitando
um rápido
estabelecimento do diagnóstico da DG, tratamento por TRE e outras
terapêuticas e seu posterior monitoramente via determinação da atividade de
QT naqueles casos de DG que este marcador pode ser considerado.
42
6. CONCLUSÃO
Neste trabalho foi possível a implantação de uma nova metodologia em
amostras de SIPF para a identificação de pacientes com doença de Gaucher,
como um método prático e seguro que poderia ser facilmente implantado em
laboratórios de referência, possibilitando a identificação mais fácil de pacientes
afetados, especialmente em áreas com dificuldades para a coleta e transporte
de amostras líquidas.
43
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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50
8. ANEXOS
51
Serviço Público Federal
Universidade Federal do Pará
Instituto de Ciências Biológicas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidado (a) a participar, como voluntário (a), da
pesquisa: “DIAGNÓSTICO LABORATORIAL E MONITORAMENTO
BIOQUÍMICO DA DOENÇA DE GAUCHER NA REGIÃO NORTE”, que é
desenvolvida pelo Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo (Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará). Para que você decida
participar ou não da pesquisa lhe serão prestadas as seguintes informações.
Este projeto tem como objetivo geral estabelecer mecanismos de
validação de procedimentos laboratoriais envolvidos na investigação da
Doença de Gaucher. A doença de Gaucher (DG) é uma esfingolipidose
(lipidose) com herança autossômica recessiva, caracterizada peço acúmulo de
substâncias no lisossoma (glicosilceramida) de vários órgãos como fígado,
baço, ossos e medula óssea. Esse acúmulo é causado pela deficiência da
enzima β-glicosidade ou glicocerebrosidase.
Riscos e desconfortos potenciais: No momento da coleta de sangue
poderá haver alguma dor decorrente da punção da pele. Complicações de
coleta de sangue rotineira são raras e geralmente de pequeno porte.
Benefícios esperados: Este estudo poderá no futuro beneficiar a
investigação e o monitoramento da Doença de Gaucher, através de
metodologias mais precisas.
Procedimentos alternativos: Eu entendo que tive o direito de recusar a
participar deste projeto, sem quaisquer prejuízos ou contrapartidas.
Pelo presente Consentimento, declaro que fui esclarecido, de forma
detalhada, livre de qualquer forma de constrangimento e coerção, dos
objetivos, da justificativa, dos procedimentos que serei submetido, dos riscos,
desconfortos e benefícios do presente projeto de pesquisa, assim como dos
procedimentos alternativos aos quais poderia ser submetido, todos acima
listados.
Fui igualmente informado:
1. da garantia de receber esclarecimento a qualquer dúvida acerca dos
procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados a
pesquisa;
2. da liberdade de retirar meu consentimento, a qualquer momento, e deixar
de participar do estudo, sem que isso traga quaisquer prejuízos;
3. da segurança de que não serei identificado e que se manterá o caráter
confidencial das informações relacionadas com a minha privacidade;
4. da natureza e objetivo do projeto de pesquisa;
5. que poderei não ter benefício direto por participar do estudo
6. que os possíveis riscos e/ou efeitos adversos, desconforto e
inconveniências foram explicadas a mim;
52
7. que não serei remunerado financeiramente por participar deste estudo.
8. que o material (sangue) coletado seja utilizado somente no projeto
supracitado
9. Autorizo o armazenamento das minhas amostras (sangue), obtidas nesse
estudo, para utilização futura. Nesse caro, porém, entendo que serei
recontactado para fornecer consentimento especifico.
Belém, _____ / _____ / _______
__________________________________
Assinatura do Participante
________________________________
Assinatura do Responsável
__________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsável
Nome: Luiz Carlos Santana da Silva
End.: Av. Pedro Miranda, 1807 / 203,
Bairro Pedreira, CEP. 66080-000
Fone 09132018030
Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do HEMOPA – Centro de Hemoterapia e
Hematologia do Pará – Trav. Padre Eutíquio, N° 2109, Bairro Batista Campos, CEP. 66033600, Belém / Pará.
Tele/Fax: 9132429100.
53