Avaliação de atividades farmacológicas de diferentes espécies
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Avaliação de atividades farmacológicas de diferentes espécies
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE DIFERENTES ESPÉCIES DE LYCHNOPHORA UTILIZADAS PELA POPULAÇÃO Aluna: Luciana Souza Guzzo Orientadora: Profa. Dra. Andrea Grabe Guimarães Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação de Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração Bioquímica Estrutural e Fisiológica. Ouro Preto, maio de 2007 G993a Guzzo, Luciana Souza. Avaliação de atividades farmacológicas de diferentes espécies de Lychnopharas utilizadas pela população [manuscrito] / Luciana Souza Guzzo. - 2007. xviii, 99f.: il., color.; tabs., grafs. Orientadora: Profª. Andréa Grabe Gumarães. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Bioquímica estrutural e fisiológica. 1. Agentes antiinflamatórios - Teses. 2. Agentes cardiovasculares - Teses. 3. Farmacologia - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título. CDU: 615.01 Catalogação: [email protected] Trabalho desenvolvido no Laboratório de Farmacologia Experimental e Laboratório de Farmacognosia da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto. i Luciana Souza Guzzo Dedicatória Dedico esse trabalho: Aos meus pais, Luiz Carlos e Josélia, pelo apoio e incentivo constantes e incondicionais e pelo exemplo de vida. À DEUS, pelas dádivas recebidas e pela presença constante em minha vida. ii Luciana Souza Guzzo Agradecimentos AGRADECIMENTOS Agradeço a todos que colaboraram para a realização e concretização desse trabalho, em especial: À Prof. Andréa por ter me dado oportunidade de sua orientação, pela amizade, carinho e ensinamentos e pelo bom exemplo de pessoa e de competência e dedicação no trabalho. “Você que com simplicidade e paciência me ensinou a gostar da ciência, a ter ética na pesquisa e principalmente proporcionou-me um grande crescimento pessoal e profissional. Pelas palavras de otimismo e compreensão nos momentos necessários, pelo respeito e confiança a mim concedidos e pela ótima convivência durante todos estes anos minha eterna gratidão.” À Prof. Dênia Saúde Guimarães pela orientação de importante parcela desse trabalho, pela amizade, pelo convívio agradável e solidariedade. Ao Prof. Homero Nogueira Guimarães pelo desenvolvimento do sistema de aquisição e de análise de dados dos parâmetros cardiovasculares. À Prof. Vanessa Mosqueira pela ajuda na descoberta do solvente para o extratos, pelas colaborações importantes no desenvolvimento do trabalho e pela disponibilização dos aparelhos e equipamentos do Laboratório de Desenvolvimento Galênico e Nanotecnologia da Escola de Farmácia da UFOP. Às Prof. Carla Penido e Neila Barcellos pela ótima convivência e pelas valiosas contribuições em todos os momentos desse trabalho. Ao Prof. Luis Fernando por está sempre disposto a ajudar. À Prof. Vera Guarda por disponibilizar os aparelhos e equipamentos do Laboratório de Síntese de Produtos Naturais. iii Luciana Souza Guzzo Agradecimentos Ao Prof. Mauro Martins Teixeira e o doutorando Flávio Amaral pela grande receptividade no laboratório de Imunofarmacologia da UFMG e pela disponibilização do pletismômetro para validação da metodologia do teste de edema de pata. Ao Prof. Júlio Lombardi pela identificação das espécies de Lychnophora. Aos professores da Escola de Farmácia e ICEB, pela convivência, incentivo e apoio durante todos esses anos. Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da UFOP pelos ensinamentos dispensados. Ao Cláudio e à Cristina funcionários do Biotério Central por disponibilizarem os animais sempre com presteza e ao Wilson por trazer os animais do Biotério Central para a Escola de Farmácia e cuidar dos mesmos. Aos funcionários da Escola de Farmácia: Acássio, Cida, Conceição, Toninho, Carla..., pelo agradável relacionamento no dia-a-dia e pela presteza em ajudar. À Cida, secretária do NUPEB, pela competência no trabalho e pela disponibilidade em ajudar sempre que necessário. À PROPP pela bolsa de Iniciação Científica fundamental para o desenvolvimento inicial desse trabalho. À FAPEMIG, pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento desse projeto (Projeto 190/05). À CAPES pela bolsa de estudo de mestrado. Ao Cristiano Munhoz e Thiago Miranda alunos que passaram pelo laboratório pelo apoio no meu ingresso à Iniciação Científica. iv Luciana Souza Guzzo Agradecimentos À Marina aluna de Iniciação Científica pelas valiosas contribuições na realização de alguns experimentos e na extração das espécies de Lychnophora. Aos amigos do Laboratório de Farmacologia Experimental: Lorena, Alessandra, Priscila, Milton, Franciele, Aryane e Dani e aos amigos que passaram pelo laboratório: Suzana, Gabriella, Mariana, Paty, Max e Naira pela ótima convivência, amizade, companheirismo e pela colaboração em algum momento da realização desse trabalho. À Elaine, aluna de mestrado que passou pelo laboratório, pelas contribuições ao longo desse trabalho e pelos seus bons exemplos. Aos colegas de Pós-graduação pela amizade, aprendizado e pelos momentos legais vividos. Às irmãs da República Bem-te-Vi pelos momentos de alegria e pelo apoio, em especial à Maísa pela força no ingresso à pós-graduação e por compartilhar de muitos momentos durante o curso. Às amigas Jô e Fla pela grande amizade, apoio, incentivo e compreensão. Obrigada pelos momentos alegres vividos no dia-a-dia e por me tornarem muito mais feliz. Sentirei saudades... Aos amigos da República Kome Keto pelo companheirismo, acolhimento e pelos momentos felizes compartilhados. À minha família pelas lições de dignidade e simplicidade, pelo carinho e por sempre torcerem por mim. v Luciana Souza Guzzo Agradecimentos Aos meus pais Josélia e Luiz Carlos, pela dedicação e doação e por suas lições e sábios conselhos. Obrigada pelos exemplos de caráter, humildade, persistência e coragem e por jamais medirem esforços para esse momento acontecer. Vocês são minha fortaleza, meu esteio e fonte inesgotável de sabedoria. Ao meu irmão e amigo Alfredo pela força e alegria transmitidas nas horas certas. Ao Pablo pelos momentos maravilhosos que passamos juntos, pelo conforto nas horas difíceis, companheirismo, cumplicidade, carinho e motivação constantes. À UFOP pela oportunidade e conhecimentos adquiridos À Ouro Preto, minha escola de vida, pela acolhida, aprendizado, momentos inesquecíveis e grandes amigos aqui conquistados. “Que eu encontre luz aonde eu vá como encontrei por aqui, e nessas lembranças, coragem para seguir em frente”. À DEUS e à Nossa Senhora por guiarem meus passos e abençoar essa jornada e pelo grande presente que é a vida. vi Luciana Souza Guzzo RESUMO Luciana Souza Guzzo Resumo RESUMO As espécies do gênero Lychnophora são plantas nativas do Brasil, popularmente conhecidas como “arnica” e utilizadas na medicina popular como analgésico e antiinflamatório. Os extratos etanólicos de seis espécies de Lychnophora foram avaliados após a administração oral em camundongos quanto ao efeito antinociceptivo no método da placa quente e no método de contorções induzidas pelo ácido acético e quanto ao efeito antiinflamatório tópico no método de edema de pata induzido pela carragenina. No método da placa quente, os extratos etanólicos das espécies L. pinaster na dose 0,75 g/kg e L. ericoides na dose 1,50 g/kg aumentaram significativamente a variação do tempo de latência para lamber as patas. Os extratos de L. passerina, L. candelabrum e L. pinaster na dose 0,75 g/kg e de L. ericoides e L. trichocarpha em ambas doses avaliadas (0,75 e 1,50 g/kg) reduziram significativamente o número de contorções induzidas pelo ácido acético. A administração das pomadas de L. pinaster e L. trichocarpha em ambas concentrações avaliadas (5 e 10%) e de L. passerina e L. candelabrum 10% reduziram significativamente o edema de pata mensurado 3 h após a administração subplantar de carragenina 0,1%, evidenciando pela primeira vez a atividade antiinflamatória tópica de espécies de Lychnophora. O método de mensuração do edema de pata pelo paquímetro foi validado mostrando-se tão efetivo quanto o método de mensuração pelo pletismômetro. Com o objetivo de detectar reações adversas advindas da administração oral de extratos de L. ericoides e L. trichocarpha, os mesmos foram avaliados quanto à atividade sobre o sistema nervoso central, antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções, no método do campo aberto, que avalia a atividade locomotora e capacidade exploratória dos animais e nos métodos de haste girante e tração, os quais avaliam a coordenação motora e força muscular dos animais, respectivamente. No método do campo aberto, os extratos etanólicos de L. ericoides (1,50 g/kg) em 1 h, de L. trichocarpha na dose 0,75 g/kg em 2 h e na dose 1,50 g/kg nos tempos 1, 2 e 4 h causaram inibição significativa da atividade locomotora dos animais evidenciada pela redução do número de quadrados percorridos em 5 min. Os extratos etanólicos de L. ericoides (0,75 g/kg) em 24 h, de L. trichocarpha na dose 0,75 g/kg em 2 h e na dose 1,50 g/kg nos tempos 1, 2 e 4 h causaram redução da capacidade exploratória dos viii Luciana Souza Guzzo Resumo animais, evidenciada pela redução significativa do número de vezes que o animal levanta em 5 min. A redução da locomoção espontânea tal como da capacidade exploratória em relação ao grupo controle são indicativas de atividade sedativa desses extratos. Os extratos de L. ericoides e L. trichocarpha em ambas doses avaliadas (0,75 e 1,50 g/kg) e em todos os tempos avaliados não causaram alteração significativa da coordenação motora e tônus muscular dos animais. Além da avaliação da atividade sobre o SNC, no presente estudo para melhor estabelecer a segurança terapêutica do extrato de L. ericoides, a espécie mais utilizada pela população, a atividade cardiovascular foi avaliada de 90 a 120 min após sua administração por via oral. Os resultados demonstraram que o extrato de L. ericoides na dose 1,50 g/kg, causou aumento da pressão arterial sistólica e diastólica e da freqüência cardíaca dos animais. O presente trabalho demonstrou comparativamente as atividades antinociceptiva e antiinflamatória de seis espécies de Lychnophora, a atividade sedativa das espécies L. ericoides e L. trichocarpha e a atividade hipertensiva e cronotrópica positiva da espécie L. ericoides na maior dose avaliada fornecendo conhecimento científico para o uso racional e direcionado das espécies estudadas na medicina popular. ix Luciana Souza Guzzo ABSTRACT Luciana Souza Guzzo Abstract ABSTRACT The Lychnophora genus species are native plants from Brazil, popularly known as “arnica” and used in the folk medicine as analgesic and anti-inflammatory. The antinociceptive activity of the etanolic extracts of six species of Lychnophora were evaluated in the hot-plate test and in the acetic acid-induced writhing test and the antiinflammatory topical activity were evaluated in the carrageenan-induced paw oedema test. In the hot-plate test the etanolic extracts of L. pinaster (0.75 g/kg) and L. ericoides (1.50 g/kg), significantly increased the variation of the latency time for licking of the paws. The extracts of L. passerina, L. candelabrum and L. pinaster in the dose 0.75 g/kg and of L. ericoides and L. trichocarpha in both doses evaluated (0.75 and 1.50 g/kg) significantly decreased the number of writhes induced by acetic-acid. The topical administration of L. pinaster and L. trichocarpha in both concentrations evaluated (5 and 10%) and of L. passerina and L. candelabrum 10%, significantly reduced the paw oedema measured 3 h after the subplantar injection of carrageenan 0.1%, evidencing for the first time the anti-inflammatory activity of the topical administration of Lychnophora species. The method of measurement of the paw oedema using a pakimeter were validated and showed that the pakimeter is so effective how the plethysmometer to measure the paw oedema induced by carrageenan. The effects of the extracts of L. ericoides and L. trichocarpha were evaluated before, 1, 2, 4 and 24 h after the oral administration, in the open-field test, that evaluate the locomotor and exploratory activities and in the rota-rod and traction tests, wich evaluate the motor coordination and the muscular tone of the animals, respectively. In the open-field test, the extract of L. ericoides (1.50 g/kg) in 1 h and the extract of L. trichocarpha in the dose 0.75 g/kg in 2 h and in the dose 1.50 g/kg in the times 1, 2 and 4 h induced to significant inhibition of the spontaneous locomotor activity of the animals evidenced by the reduction of the number of squares crossed in 5 min. The extracts of L. ericoides (0.75 g/kg) in 24 h and of L. trichocarpha in the dose 0.75 g/kg in 2 h and in the dose 1.50 g/kg in the times 1, 2 and 4 h induced to the decrease of the exploratory behavior of the animals, evidenced by the significant decrease of the number of times that the animal raises in 5 min. The decrease of the spontaneous locomotion and the exploratory behavior induced by the administration of these extacts xi Luciana Souza Guzzo Abstract compared to the control group were indicative of sedative effect. The extracts of L. ericoides and L. trichocarpha in both doses (0.75 and 1.50 g/kg) and in all times evaluated did not induce significant modification of the motor coordination and the muscular tone of the animals. Beyond the evaluation of the activity on the SNC, in the present study to better establish the therapeutical security of the L. ericoides ethanolic extract, the specie most used by the population, its cardiovascular activity was evaluate from 90 to 120 min after its administration by oral route. The results demonstrated that the L. ericoides extract in the dose 1.50 g/kg increased the systolic and diastolic arterial pressure and the heart rate of the animals. The present work demonstred comparatively the antinociceptive and antiinflammatory activities of six species of Lychnophora, the sedative activity of L. ericoides and L. trichocarpha species and the hypertensive and cronotropic positive activities of L. ericoides in the higher dose evaluated, giving cientific knowledge for the rational and directed use of the species studied in the folk medicine. xii Luciana Souza Guzzo Lista de Figuras e Quadros LISTA DE FIGURAS Figura 1: Fotos das espécies L. ericoides (A), L. trichocarpha (B), L. pinaster (C) e L. passerina (D)............................................................................................................11 Figura 2: Extração vegetal: pulverização (A), extração por percolação (B) e evaporação com o uso de rotavapor (C)........................................................................24 Figura 3: Camundongo sobre a placa aquecida a 56 ± 1ºC.........................................29 Figura 4: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras sobre o tempo gasto para lamber as patas em camundongos.................................................................................33 Figura 5: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras sobre o número total de contorções induzidas pelo ácido acético em 30 min em camundongos........................33 Figura 6: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras (A-F) e de fármacos padrão (G) sobre o número total de contorções induzidas pelo ácido acético contadas em períodos de 5 min por 30 min em camundongos..........................................................36 Figura 7: Mensuração do edema de pata com pletismômetro em camundongos.........39 Figura 8: Variação percentual da espessura da pata medida com paquímetro em camundongos.................................................................................................................46 Figura 9: Variação percentual da espessura da pata medida com pletismômetro em camundongos.................................................................................................................46 Figura 10: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras na variação da espessura das patas medidas antes e 3 h após administração de carragenina 0,1% em camundongos.................................................................................................................48 Figura 11: Camundongo no campo aberto (A), haste girante (B) e aparelho de tração (C)..................................................................................................................................56 Figura 12: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre o número de quadrados percorridos pelos animais em 5 min analisado antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções...................................57 Figura 13: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre o número de vezes que o animal levanta em 5 min analisado antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções...................................................58 Figura 14: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre o tempo de permanência do animal na haste girante antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções.................................................................60 xiii Luciana Souza Guzzo Lista de Figuras e Quadros Figura 15: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre a força muscular dos animais avaliada no método de tração antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções...................................................61 Figura 16: Sistema de Aquisição de ECG e PA 1) Visão geral do sistema; 2) Visão de um animal com os eletrodos inseridos no tecido subcutâneo, indicados pela seta; 3) Registro de ECG e PA obtidos a partir do animal em experimentação........................65 Figura 17: Esquema do protocolo experimental de avaliação da atividade cardiovascular...............................................................................................................66 Figura 18: Traçado do ECG e PA de um rato Wistar apresentando os parâmetros analisados (RR, PAS e PAD)........................................................................................67 Figura 19: Efeito do extrato etanólico de L. ericoides sobre a PAS (A), PAD (B) e FC (C) dos animais..............................................................................................................70 LISTA DE QUADROS Quadro 1: Atividades farmacológicas e biológicas de espécies de Lychnophora e de seus constituintes...........................................................................................................12 xiv Luciana Souza Guzzo Lista de Tabelas LISTA DE TABELAS Tabela 1: Número de contorções induzidas pelo ácido acético em camundongos..37 Tabela 2: Variação percentual da espessura das patas dos animais.........................47 Tabela 3: Variação percentual do volume das patas dos animais............................47 Tabela 4: Variação da espessura das patas dos animais após injeção de carragenina ou introdução da agulha na pata (sham) e tratamento tópico....................................49 Tabela 5: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre o número de quadrados percorridos pelos animais em 5 min no método do campo aberto.........................................................................................................................59 Tabela 6: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre o número de vezes que o animal levanta em 5 min no método do campo aberto.........................................................................................................................59 Tabela 7: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre o tempo de permanência do animal na haste girante...................................................62 Tabela 8: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre a força muscular dos animais no método de tração.....................................................62 Tabela 9: Valores de pressão arterial e freqüência cardíaca avaliados, em intervalos de 5 min de 90 à 120 min após administração por via oral do extrato de L. ericoides em ratos Wistar.........................................................................................................71 xv Luciana Souza Guzzo Sumário SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS E QUADROS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS 1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 1 1.1. INTRODUÇÃO GERAL............................................................................. 2 1.2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................... 6 1.2.1. Lychnophoras..................................................................................... 6 1.2.2. Inflamação e dor................................................................................. 14 1.2.3. Toxicidade.......................................................................................... 17 1.2.3.1. Atividade sobre o Sistema Nervoso Central.................................... 17 1.2.3.2. Atividade Cardiovascular................................................................ 19 2. OBJETIVOS................................................................................................. 21 2.1. OBJETIVO GERAL.................................................................................... 22 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................... 22 3. METODOLOGIA GERAL.......................................................................... 23 3.1. MATERIAL VEGETAL............................................................................. 24 3.2. EXTRAÇÃO VEGETAL............................................................................ 24 3.3. PREPARO DAS SOLUÇÕES DOS EXTRATOS DE LYCHNOPHORAS 25 3.4. ANIMAIS EXPERIMENTAIS................................................................... 25 3.5. MATERIAIS................................................................................................ 26 3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................... 26 4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA.......................... 27 4.1. METODOLOGIA...................................................................................... 28 4.1.1. Método da placa quente.................................................................... 28 4.1.2. Método de contorções induzidas pelo ácido acético......................... 29 xvii Luciana Souza Guzzo Sumário 4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 29 5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA...................... 38 5.1. METODOLOGIA........................................................................................ 39 5.1.1. Validação da metodologia de mensuração do edema de pata............. 39 5.1.2. Preparo das pomadas de Lychnophoras.............................................. 40 5.1.3. Método de edema de pata induzido pela carragenina......................... 40 5.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 40 6. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL......................................................................................................... 50 6.1. METODOLOGIA........................................................................................ 51 6.1.1. Método do Campo Aberto.................................................................. 51 6.1.2. Método da Haste Girante.................................................................... 51 6.1.3. Método de Tração............................................................................... 52 6.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 52 7. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOVASCULAR.......................... 63 7.1. METODOLOGIA........................................................................................ 64 7.1.1. Confecção de cateteres para implantação intravascular..................... 64 7.1.2. Procedimentos cirúrgicos.................................................................... 64 7.1.3. Obtenção dos sinais de eletrocardiograma e pressão arterial............. 64 7.1.4. Protocolo Experimental...................................................................... 65 7.1.5. Análise dos Registros......................................................................... 66 7.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 67 8. DISCUSSÃO GERAL.................................................................................. 72 9. CONCLUSÕES............................................................................................. 76 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... 79 ANEXO.............................................................................................................. 99 4 xviii Luciana Souza Guzzo 1. INTRODUÇÃO Luciana Souza Guzzo Introdução 1.1. INTRODUÇÃO GERAL No presente estudo foram realizados estudos farmacológicos de plantas do gênero Lychnophora, tipicamente brasileiras, que são conhecidas popularmente como “arnica” e amplamente utilizadas na medicina popular como analgésico e antiinflamatório (CERQUEIRA et al., 1987). As plantas são fontes importantes de produtos biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para síntese de um grande número de fármacos. Pesquisadores da área de “produtos naturais” mostram-se impressionados pelo fato desses produtos encontrados na natureza revelarem uma gama quase que inacreditável de diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas (WALL & WANI, 1996). Acredita-se que os “produtos naturais” em geral e as plantas medicinais sejam importantes fontes de novas substâncias químicas biologicamente ativas com potencial aplicabilidade terapêutica (ELISABETSKY, 1986; FARNSWORTH, 1989; EISNER, 1990; ANDRADE et al., 2007) e há um interesse crescente em plantas como fonte de medicamentos (RATES, 2001). O estudo de constituintes bioativos de plantas se mostra promissor na descoberta de novas drogas. A investigação de plantas usadas como medicamentos na medicina tradicional pode ser uma ferramenta útil para identificar moléculas biologicamente ativas das mais de 250.000 espécies de plantas existentes (MBWAMBO et al., 1996). Apesar do aumento do número de estudos nessa área, os dados disponíveis revelam que apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal (SOEJARTO, 1996). Desde as civilizações antigas as pessoas confiam nas plantas como arsenal profilático ou terapêutico na recuperação e manutenção da saúde (ANDRADE et al., 2007). O uso de plantas medicinais na arte de curar é uma forma de tratamento de origem muito antiga, relacionada aos primórdios da medicina e fundamentada no acúmulo de informações por sucessivas gerações. Ao longo dos séculos, produtos de origem vegetal constituíram as bases para tratamento de diferentes doenças. Desde a Declaração de Alma-Ata, em 1978, a Organização Mundial de Saúde (OMS) tem expressado a sua posição a respeito da necessidade de valorizar a utilização de plantas medicinais no âmbito sanitário, tendo em conta que 80% da população mundial utilizam 2 Luciana Souza Guzzo Introdução essas plantas ou preparações destas no que se refere à atenção primária à saúde (FARNSWORTH et al., 1985; BRASIL, 2006a). Ao lado disso, destaca-se a participação dos países em desenvolvimento nesse processo, já que possuem 67% das espécies vegetais do mundo. O Brasil possui grande potencial para o desenvolvimento da terapêutica utilizando “produtos naturais”, com a maior diversidade vegetal do mundo, ampla sociodiversidade, uso de plantas medicinais vinculado ao conhecimento tradicional e tecnologia para validar cientificamente esse conhecimento (BRASIL, 2006a). O mercado mundial atual de fitofármacos e fitoterápicos é da ordem de 9 a 11 bilhões de dólares por ano, sendo que mais de 13.000 plantas são mundialmente usadas como fármacos ou fonte de fármacos (TYLER, 1994). Outras estimativas revelam que o mercado mundial de produtos farmacêuticos movimenta 320 bilhões de dólares por ano, dos quais 20 bilhões são originados de substâncias ativas derivadas de plantas (ROBBERS et al., 1996). A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal como sua complexidade, contando com mais de 55.000 espécies de plantas, aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo (DIAS, 1996). De acordo com estimativas, apenas 8% das espécies vegetais da flora brasileira foram estudadas na busca de novos compostos bioativos e 1.100 espécies tiveram suas propriedades medicinais avaliadas (GARCIA et al., 1996). Destas, 590 plantas foram registradas no Ministério da Saúde para comercialização (ORTEGA et al., 1989). No Brasil, o crescimento do mercado de fitoterápicos é de 15% ao ano, enquanto o crescimento anual do mercado de medicamentos sintéticos gira em torno de 3 a 4% (ABIFITO, 2001). O panorama brasileiro mostra que 84% de todos os fármacos são importados e que 78% da produção brasileira ocorre por multinacionais, revelando assim uma necessidade de buscar alternativas para superar a dependência externa, principalmente quando confrontamos com altos preços médios praticados no Brasil em comparação àqueles praticados nos países desenvolvidos (BERMUDEZ, 1995). É nesse contexto, que as plantas medicinais adquirem importância como agentes terapêuticos e, por isso, sua segurança e eficácia devem ser analisadas para que os mesmos sejam registrados no Ministério da Saúde para posterior comercialização. No Brasil, recentemente, foi criado o Decreto nº 5.813 de 22 de junho de 2006, que aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, com o objetivo de garantir à população brasileira o acesso 3 Luciana Souza Guzzo Introdução seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, através principalmente da promoção do uso sustentável da biodiversidade, do desenvolvimento da cadeia produtiva e do fortalecimento da indústria farmacêutica nacional, estimulando a produção de fitoterápicos em escala industrial e incrementando suas exportações (BRASIL, 2006b), o que pode ajudar a superar a dependência externa. O levantamento acurado do uso popular de uma planta pode servir de base para a busca sistemática de novos fármacos. Entretanto, o uso popular e tradicional de plantas não é suficiente para validar eticamente o seu uso como medicamentos eficazes e seguros (LAPA et al., 2004), sendo necessária a abordagem etnofarmacológica, como estratégia para investigação de plantas medicinais, que consiste em combinar informações adquiridas junto a comunidades que façam uso da flora local com estudos químicos/farmacológicos realizados em laboratórios especializados (ELISABETSKY, 1987). Estes estudos costumam ser divididos em etapas seqüenciais bem determinadas a saber, botânica, agronômica, fitoquímica, farmacêutica, farmacológica pré-clínica e clínica (OMS, 1975; HAYES, 1984; WHO, 1992; 1998; BRASIL, 1996; GARCIAGONZÁLES, 2000). A etapa botânica envolve a seleção e identificação do material a ser avaliado. A etapa fitoquímica compreende o isolamento, elucidação estrutural e a identificação dos constituintes mais importantes da planta. Este conhecimento, quando associado ao monitoramento da atividade biológica, permite a análise e a caracterização da fração ou substância dotada de atividade terapêutica e/ou tóxica. A etapa farmacológica pré-clínica engloba estudos farmacodinâmicos, farmacocinéticos e toxicológicos do extrato total da planta a ser estudada, realizados in vivo e/ou in vitro. Um dos passos iniciais destes estudos é a investigação dos efeitos farmacológicos do extrato total ou bruto de uma dada planta, em modelos experimentais relevantes e relacionados às ações farmacológicas sugeridas pela análise da informação popular (ELIZABETSKY & SOUZA, 2004). Ao mesmo tempo em que se está conduzindo esta pesquisa é possível analisar alguns aspectos farmacocinéticos. Posteriormente, esses estudos também são realizados com as frações do extrato bruto e com as substâncias isoladas deste extrato, determinando o mecanismo de ação e aplicabilidade terapêutica da planta e de suas frações e metabólitos ativos. Finalmente, a etapa farmacológica clínica dividida em quatro fases seqüenciais, é realizada com finalidade de comprovar o potencial terapêutico do medicamento na espécie humana. Os estudos seqüências das 4 Luciana Souza Guzzo Introdução plantas medicinais englobam os diferentes aspectos do cabedal de conhecimento necessário para que um novo medicamento fitoterápico possa ser registrado (LAPA et al., 2004). Dentro desse contexto, o presente estudo é de grande importância, pois teve por objetivo avaliar comparativamente as atividades antinociceptiva e antiinflamatória de seis espécies de Lychnophora usadas de forma indiscriminada na medicina popular. Dessa forma, pode ser determinado quais espécies são ativas, fornecendo assim conhecimento seguro para o uso racional e direcionado das Lychnophoras pela população, o que pode ainda ajudar a evitar a sua extinção. Esse estudo comparativo é muito importante, uma vez que, quatro das espécies estudadas, ou seja, L. ericoides, L. passerina, L. pinaster e L. trichocarpha são morfologicamente semelhantes, não sendo possível de serem diferenciadas pela população. Além disso, considerando que o uso das diferentes espécies de Lychnophora se dá na forma de extrato bruto, podendo ter assim metabólitos com ação desconhecida, o estudo de sua atividade sobre o sistema nervoso central (SNC) e atividade cardiovascular se faz necessário para avaliação da segurança terapêutica desses extratos. 5 Luciana Souza Guzzo Introdução 1.2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.2.1. LYCHNOPHORAS As espécies do gênero Lychnophora pertencem à família Asteraceae, uma das maiores famílias de plantas existentes, possuindo cerca de 2.000 gêneros e mais de 20.000 espécies cujos estudos conduziram a mais de 4.000 novos compostos (BRUNETON, 1995). Esse gênero compreende trinta e quatro espécies restritas ao cerrado brasileiro (ROBINSON, 1999). As Lychnophoras são plantas nativas do Brasil com ocorrência nos estados de Minas Gerais, Goiás e Bahia (CUNHA et al., 1995) e são popularmente conhecidas como “arnica”, “falsa arnica” ou “arnica da serra” devido ao odor semelhante à espécie européia Arnica montana L. (CERQUEIRA et al., 1987). Muitas espécies de Lychnophora são utilizadas na medicina popular brasileira imersas em água, etanol ou cachaça, como analgésico e antiinflamatório, no tratamento de contusões, reumatismo, feridas, coceira e picada de insetos (CERQUEIRA et al., 1987; SAÚDE et al., 1998; LOPES, 2001). A coleta indiscriminada das espécies de Lychnophora tem causado o declínio de suas populações, as quais já foram incluídas pela Sociedade Brasileira de Botânica na lista de plantas em perigo de extinção (IBAMA, 2005). Muitas espécies de Lychnophora já foram objeto de estudo fitoquímico (SAÚDE, 1994), fornecendo terpenóides, esteróides e flavonóides como constituintes principais (BORELLA et al., 1992). Constituintes como poliacetilenos e lignanas que apresentam várias atividades biológicas (MACRAE & TOWERS, 1984), também foram relatados para algumas espécies deste gênero (BORSATO et al., 2000). As lactonas sesquiterpênicas presentes nas Lychnophoras são das classes furanoeliangolídeo, goiazensolídeo, eremantolídeo, guaianolídeo e eudesmanolídeo (BORELLA et al., 1992; ARAGÃO, 2003). A família Asteraceae é a maior fonte de lactonas sesquiterpênicas, constituintes esses que também apresentam várias atividades biológicas já descritas (PICMAN, 1986; RODRIGUEZ et al., 1986). As espécies de Lychnophora e seus metabólitos têm sido alvos de muitos estudos acerca de suas atividades biológicas e farmacológicas. Atividades tais como antioxidante (CHICARO et al., 2004; KANASHIRO et al., 2004), antitumoral (LÊ QUESNE et al., 1976; 1982; SAÚDE, 1994), citotóxica (HERZ & GOEDKEN, 1982; 6 Luciana Souza Guzzo Introdução CANALLE et al., 2001), antimicrobiana (MIGUEL et al., 1996; SAÚDE et al., 1998; MACIEL, 2002), tripanossomicida (CHIARI et al., 1991; 1996; OLIVEIRA et al., 1996; JORDÃO et al., 1997; GRAEL et al., 2000; TAKEARA et al., 2003; JORDÃO et al., 2004; ALCÂNTARA et al., 2005; SILVEIRA et al., 2005b), antinociceptiva (CERQUEIRA et al., 1987; BORSATO et al., 2000; SANTOS et al., 2005) e antiinflamatória (AZEVEDO, 2004; FERRAZ FILHA et al., 2006) foram avaliadas (Quadro 1). As Lychnophoras são típicas do cerrado e regiões áridas localizadas na parte central do Brasil, onde alta incidência de luz e raios UV bem como longos períodos de estiagem são característicos da região. Em geral, para adaptação em tais ambientes e para proteção, as plantas acumulam flavonóides que podem absorver luz UVB (TEVINI et al., 1991; KOOTSTRA, 1994). Estudo fitoquímico do extrato etanólico da espécie L. passerina (Mart. ex. DC) Gardn., levou ao isolamento das lactonas sesquiterpênicas 15-deoxigoiazensolídeo e goiazensolídeo e de cinco flavonóides. Estudo da atividade antioxidante desses flavonóides demonstraram que quercetina, kaempferol e tiliroside são eficientes antioxidantes e por isso protetores contra raios UV (CHICARO et al., 2004). KANASHIRO et al. (2004) demonstraram que oito flavonóides das espécies L. granmongolense (Duarte) D.J.N. Hind, L. salicifolia Mart. e L. ericoides Mart. foram capazes de inibir a formação de espécies de oxigênio reativos por neutrófilos, estimulado por dois tipos de imunocomplexos em coelhos e que essa ação foi altamente dependente da estrutura dos flavonóides. Os furanoeliangolídeos licnofolídeo e eremantolídeo C extraídos do extrato etanólico das partes aéreas de L. trichocarpha Spreng. (SAÚDE et al., 1998) e seus derivados foram avaliados contra as bactérias Enterococus faecalis S48, Bacillus subtilis CECT 397, Staphylococus aureus ATCC 8, Salmonella thyphymurium LT2, Escherichia coli U9 e Proteus sp. As lactonas sesquiterpênicas licnofolídeo, seu derivado1β-hidroxi-2,3-dihidrolicnofolídeo e os derivados do eremantolídeo C, 1βhidroxi-2,3-dihidroeremantolídeo C e 3’hidroxieremantolídeo C apresentaram atividade antibacteriana (SAÚDE et al., 2002). MIGUEL et al. (1996) demonstraram a atividade antimicrobiana do ácido acetil licnofólico isolado do extrato etanólico das folhas e tronco de L. salicifolia e MACIEL (2002) demonstrou a atividade antibacteriana do extrato de L. ericoides contra espécies gram-positivas. 7 Luciana Souza Guzzo Introdução Lactonas sesquiterpênicas citotóxicas foram isoladas durante a busca por agentes antitumorais de origem natural. Neste processo, foi observado que a ocorrência de atividade citotóxica era muito comum e a atividade antitumoral ocorria em menor extensão (KUPCHAN et al., 1971). As lactonas sesquiterpênicas licnoforolídeos A e B isoladas de L. affinis Gardn. apresentaram atividades citotóxica e antitumoral (LÊ QUESNE et al., 1982) e as lactonas licnofolídeo e eremantolídeo C isoladas de L. trichocarpha também demonstraram atividade antitumoral contra trinta e três e dezoito linhagens de células tumorais, respectivamente (SAÚDE, 1994). Flavonóides isolados do extrato etanólico das folhas e tronco de L. affinis também apresentaram atividade antitumoral em cultura de células de carcinoma nasofaríngeo humano (LÊ QUESNE et al., 1976). HERZ & GOEDKEN (1982) demonstraram a atividade citotóxica do goiazensolídeo isolado de L. passerina e CANALLE et al. (2001) do licnofolídeo, lactona sesquiterpênica já isolada de L. ericoides (SAKAMOTO et al., 2003) e L. trichocarpha (OLIVEIRA et al., 1996). Na busca de novos agentes profiláticos para doença de Chagas, foi feita uma triagem de trinta “produtos naturais” in vivo e in vitro contra as formas tripomastigotas de Trypanossoma cruzi e dentre eles o extrato etanólico das partes aéreas de L. villosissima Mart. e a lactona sesquiterpênica 15-deoxigoiasenzolídeo isolada desse extrato apresentaram atividade (CHIARI et al., 1991). Esse foi o primeiro relato de atividade tripanossomicida de lactona sesquiterpênica, o que estimulou a triagem de espécies da família Asteraceae. Várias espécies de plantas dessa família foram então avaliadas e dentre elas as espécies L. pinaster Mart., L. passerina e L. trichocarpha, na forma de extrato etanólico, lisaram 100% das formas tripomastigotas in vitro e in vivo (CHIARI et al., 1996). O fracionamento dos extratos brutos dessas três espécies de Lychnophora levou ao isolamento de quatro substâncias com atividade tripanossomicida: o ácido licnofóico e as lactonas goiazensolídeo, erematolídeo C e licnofolídeo (OLIVEIRA et al., 1996). O ácido licnofóico e seus derivados ésteres e álcoois (ALCÂNTARA et al., 2005) e os extratos acetato de etila das partes aéreas de L. salicifolia (JORDÃO et al., 1997) e de L. granmongolense (GRAEL et al., 2000; JORDÃO et al., 2004) também exibiram atividade contra as formas tripomastigotas de T. cruzi. A atividade da espécie L. granmongolense foi atribuída à presença do flavonóide quercetina-7,3’,4’- trimetil éter, do ácido licnofólico (JORDÃO et al., 2004) 8 Luciana Souza Guzzo Introdução e das lactonas sesquiterpênicas centraterina e goiazensolídeo (GRAEL et al., 2000). Centraterina e goiazensolídeo causaram lise total dos parasitas e, apesar do goiazensolídeo ter sido ativo em menor concentração, apresentou atividade hemolítica (GRAEL et al., 2000). O extrato metanólico das folhas de L. staavioides Mart. mostrou atividade com 98,8% de lise das formas tripomastigotas na concentração de 4 mg/ml. Esse extrato foi fracionado fornecendo flavonóides dos quais o mais ativo foi a quercetina 3-metil éter (TAKEARA et al., 2003). Do extrato hexânico e diclorometânico das partes aéreas de L. pinaster foram isolados misturas de hidrocarbonetos homólogos (DUARTE, 1999), triterpenos, ácidos graxos, ácido licnofóico, quercetina e 15-deoxigoiazensolídeo (SILVEIRA et al., 2005a) e do extrato aquoso foram isolados os seguintes compostos: ácido cafeico, ácido isoclorogênico, vitexina, isovitexina e quercetina (SILVEIRA et al., 2005b). A despeito do extrato bruto de L. pinaster ter lisado 100% das formas tripomastigotas de T. cruzi (SILVEIRA et al., 2005b), nessa concentração causou lise das células sanguíneas provavelmente devido à presença de saponinas, já detectadas nas partes aéreas de L. pinaster (DUARTE, 1993). Os extratos etanólicos de L. pinaster e L. pseudovillosissima Semir & Leitão, não demonstraram atividade contra moluscos da espécie Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário do Schistosoma mansoni, em uma triagem que foi realizada de sessenta e seis espécies da família Asteraceae (MENDES et al., 1999). Entretanto, o goiazensolídeo isolado de L. passerina já foi relatado como um agente moluscicida (VICHNEWSK, 1976). Recentemente, FERRAZ FILHA et al. (2006) revelaram que os extratos brutos das espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha possuem alta atividade inibitória da enzima xantina oxidase, provavelmente por conter substâncias bioativas úteis no tratamento da gota e outras doenças induzidas pela atividade da xantina oxidase, justificando assim o uso popular dessas espécies no tratamento do reumatismo. AZEVEDO (2004) demonstrou que o extrato bruto hidroalcoólico de L. pinaster administrado por via oral em camundongos apresenta efeito antinociceptivo dose-dependente detectável na segunda fase do teste de formalina (fase inflamatória) e potencial antiedematogênico em baixas doses, evidenciado pela redução do edema de pata induzido pela carragenina. Atividade antiinflamatória também foi observada na peritonite induzida pela carragenina. Por 9 Luciana Souza Guzzo Introdução outro lado, o extrato aquoso da mesma espécie não demonstrou inibição significativa da enzima 5-lipooxigenase (LOX) (SILVEIRA et al., 2005b), talvez devido à baixa lipoficidade dos constituintes presentes nesse extrato (PANTHONG et al., 1994). Entre as espécies de Lychnophora, a espécie L. ericoides é a mais utilizada pela população. Investigação fitoquímica do extrato apolar de suas folhas apresentou como constituintes as lactonas sesquiterpênicas, centraterina, 15-desoxigoiazensolídeo e licnofolídeo, (SAKAMOTO et al., 2003) e flavonóides (BORELLA et al., 1998) e das raízes foram extraídas as lignanas (BORSATO et al., 2000). O extrato diclorometânico das raízes de L. ericoides, do qual foram extraídas 10 lignanas, apresentou atividade antinociceptiva significativa demonstrada no método de contorções induzidas pelo ácido acético. Entre as lignanas isoladas, a metilcubebina e a cubebina foram as mais ativas (BORSATO et al., 2000). SANTOS et al. (2005) demonstraram que a fração nbutanólica do extrato das raízes de L. ericoides e os ácidos 3,5- e 4,5-di-O-[E]cafeoilquínicos isolados dessa fração também apresentaram atividade antinociceptiva demonstrada no método de contorções. Além dos extratos das raízes, os extratos aquosos das folhas e tronco de L. ericoides também apresentaram atividade antinociceptiva demonstrada no método da placa quente (CERQUEIRA et al., 1987). A investigação fitoquímica do extrato polar de L. ericoides apresentou como constituintes o 6,8-di-C- β-glucosilapigenina e o novo composto 6,8-di-C-β-glucosilcrisina. Para o primeiro foi demonstrada atividade antiedematogênica no método de edema de pata induzido pela carragenina em ratos (GOBBO-NETO et al., 2005). Do extrato de folhas secas de Lychnophoriopsis candelabrum (Schultz-Bip.) H. Robinson foram isolados três triterpenos e cinco flavonóides (SANTOS et al., 2004), entretanto essas substâncias ainda não tiveram as atividades farmacológicas estudadas. Essa espécie era conhecida como Lychnophora candelabrum Sch. Bip. e foi reclassificada por ROBINSON (1992) como sendo do gênero Lychnophoriopsis. Entretanto como essa espécie, típica da Serra do Espinhaço do estado de Minas Gerais, era classificada dentro do gênero Lychnophora, foi incluída no presente estudo como tal. Como pôde ser observado, embora as diferentes espécies de Lychnophora sejam utilizadas popularmente como analgésico e antiinflamatório, muitas outras atividades 10 Luciana Souza Guzzo Introdução farmacológicas para essas espécies e seus constituintes químicos já foram descritas na literatura. Além disso, embora tenham sido realizados estudos de atividade antinociceptiva e antiinflamatória de espécies do gênero Lychnophora nenhum deles avaliou tais atividades comparativamente in vivo, ressaltando assim mais uma vez a importância do presente estudo. A B A C D Figura 1: Fotos das espécies L. ericoides (A), L. trichocarpha (B), L. pinaster (C) e L. passerina (D). 11 Luciana Souza Guzzo Introdução Quadro 1: Atividades farmacológicas e biológicas de espécies de Lychnophora e de seus constituintes Espécies Constituintes Atividade Referência L. passerina quercetina, kaempferol e tiliroside antioxidante Chicaro et al., 2004 L. granmongolense, L. salicifolia e L. ericoides oito flavonóides antioxidante Kanashiro et al., 2004 L. trichocarpha licnofolídeo, 1β-hidroxi-2,3antibacteriana dihidrolicnofolídeo, 1β-hidroxi2,3-dihidroeremantolídeo C e 3’hidroxieremantolídeo C Saúde et al., 2002 L. salicifolia ácido acetil licnofólico antimicrobiana Miguel et al., 1996 L. ericoides extrato antibacteriana Maciel, 2002 L. affinis licnoforolídeos A e B Lê Quesne et al., 1982 L. trichocarpha licnofolídeo e eremantolídeo citotóxica e antitumoral antitumoral L. affinis flavonóides antitumoral Lê Quesne et al.,1976 L. passerina goiazensolídeo citotóxica Herz & Goedken, 1982 L. villosissima extrato e 15deoxigoiasenzolídeo isolado desse extrato tripanossomicida Chiari et al., 1991 L. pinaster, L. passerina e extrato L. trichocarpha tripanossomicida Chiari et al., 1996 L. pinaster, L. passerina e ácido licnofóico, L. trichocarpha goiazensolídeo, erematolídeo C e licnofolídeo tripanossomicida Oliveira et al., 1996 Saúde, 1994 L. salicifolia extrato tripanossomicida Jordão et al., 1997 L. granmongolense extrato, quercetina-7,3’,4’trimetil éter, ácido licnofólico tripanossomicida Jordão et al., 2004 L. granmongolense extrato, centraterina e goiazensolídeo tripanossomicida Grael et al., 2000 L. staavioides extrato e quercetina 3-metil éter tripanossomicida Takeara et al., 2003 L. pinaster extrato tripanossomicida Silveira et al., 2005b L. passerina goiazensolídeo moluscicida Vichnewsk, 1976 12 Luciana Souza Guzzo Introdução L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha extrato antireumática L. pinaster extrato antinociceptiva, Azevedo, 2004 antiedematogênica e antiinflamatória L. ericoides extrato, metilcubebina e a cubebina antinociceptiva L. ericoides extrato e ácidos 3,5- e 4,5-di-O- antinociceptiva [E]- cafeoilquínicos L. ericoides 6,8-di-C-β glucosilapigenina 13 Ferraz Filha et al., 2006 Borsato et al., 2000 Santos et al., 2005 antiedematogênica Gobbo-Neto et al., 2005 Luciana Souza Guzzo Introdução 1.2.2. INFLAMAÇÃO E DOR Muitas plantas medicinais têm sido investigadas como o objetivo da descoberta de novas drogas ou como modelos para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e dentre essas muitas são conhecidas popularmente por suas propriedades antiinflamatória e analgésica (BOHLIN, 1995). A busca de novos compostos analgésicos (MATTISON et al., 1988) e antiinflamatórios (VERPOORTE, 1999) tem sido prioridade das indústrias farmacêuticas há algum tempo. Dois principais fatores são determinantes nesse interesse: primeiramente compostos analgésicos ou antiinflamatórios, tais como os opióides, antiinflamatórios esteroidais (AIEs) e não esteroidais (AINEs), ainda apresentam uma variedade de efeitos colaterais abrindo espaço para novos e mais seguros compostos (MILLER et al., 1978; AHMADIANI et al., 1998; VELPOORTE, 1999); e em segundo lugar, o mercado internacional desses medicamentos é estimado em vários bilhões de dólares (FLOWER et al., 1985). Inflamação é a resposta de um tecido vascularizado a um agente agressor. A reação inflamatória é caracterizada pela presença de rubor (eritema), calor (aumento de temperatura na região inflamada), tumor (edema), dor e perda da função do tecido afetado (PEREIRA, 2004). As respostas vascular e celular da inflamação são mediadas por fatores químicos provenientes do plasma ou de células e desencadeados pelo estímulo inflamatório. A resposta inflamatória aguda é caracterizada por dois eventos vasculares principais: 1) vasodilatação levando ao aumento do fluxo sanguíneo, que é causa do calor e eritema; 2) aumento da permeabilidade vascular resultando na exsudação de líquido rico em macromoléculas plasmáticas para o espaço intersticial, o que possibilita o acesso de alguns dos mediadores do processo inflamatório tais como proteínas e leucócitos ao local da inflamação. O extravasamento de proteínas leva ao aumento da pressão oncótica intersticial fazendo com que o extravasamento do exsudato seja acompanhado de saída de água dos vasos, levando assim ao aumento final do líquido extravascular, ou seja, a formação do edema. A perda de líquidos resulta na concentração de hemácias nos pequenos vasos e aumento da viscosidade sangüínea, um distúrbio denominado estase sanguínea. Quando a estase se desenvolve ocorre a migração leucocitária. Os leucócitos aderem ao endotélio e migram através da parede 14 Luciana Souza Guzzo Introdução vascular para o local da inflamação quimiotaxicamente (JOHNSTON & BUTCHER, 2002). Os neutrófilos polimorfonucleares são o tipo celular predominante nos estágios iniciais da resposta (inflamação aguda). Caso o processo inflamatório persista, aumenta a migração de células mononucleares (monócitos e linfócitos) para o local, modificando o padrão do tipo celular prevalente. O principal objetivo dos efeitos vasculares citados acima é facilitar o acesso de células e outros constituintes plasmáticos ao tecido lesado, onde são necessários para enclausurar, neutralizar, destruir e eliminar o agente agressor. O desenvolvimento da resposta inflamatória aguda é mediado por citocinas, aminas vasoativas (histamina e serotonina), produtos de clivagem dos sistemas enzimáticos presentes no plasma (sistemas do complemento, da coagulação, das cininas e fibrinolítico), por mediadores lipídicos como prostaglandinas (PG), tromboxanos (TX), leucotrienos (LT) e fator de ativação plaquetário (PAF) e pelo óxido nítrico (NO) (FERREIRA, 2002). Os principais mediadores responsáveis pela vasodilatação durante a inflamação são histamina, serotonina, bradicinina, NO e PGE2, PGI2 e PGD2. A interação de substâncias como as aminas vasoativas, a bradicinina e o PAF acarretam aumento da permeabilidade vascular (ver COLLINS, 2000; RANG et al., 2003). A necessidade de interferência clinica e/ou farmacológica no processo inflamatório justifica-se principalmente quando a inflamação deixa de ter papel protetor passando a atuar impropriamente contra substâncias inócuas ou contra os tecidos do próprio corpo, de modo que as próprias respostas podem produzir lesão e passar a constituir parte do processo patológico, como na cirrose hepática e anafilaxia, ou quando suas manifestações são exacerbadas a ponto de se tornarem incomodas ao indivíduo, o que caracteriza a dor inflamatória (RANG et al., 2003). A dor inflamatória é causada pela liberação de mediadores que desencadeiam a sensibilização e ativação dos nociceptores presentes nas terminações periféricas de fibras nervosas aferentes primárias (fibras C e Aδ). Os mediadores envolvidos na dor inflamatória são principalmente bradicinina (DRAY & PERKINS, 1993), citocinas (CUNHA et al., 1991; 2005), fator de crescimento neuronal (NGF) (MCMAHON, 1996), fator de necrose tumoral (TNF-α) (CUNHA et al., 1992), os prostanóides (SMITH et al., 1998), leucotrienos, trifosfato de adenosina (ATP), histamina e serotonina (ver DRAY, 1995). 15 Luciana Souza Guzzo Introdução Segundo a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IAPS) a dor é uma experiência desagradável, de natureza sensorial, cognitiva e emocional, associada ao dano tissular real ou potencial. A dor é uma experiência subjetiva incluindo um componente emocional, sendo que sua ocorrência só pode ser seguramente determinada quando ela é relatada. Apesar dos animais não apresentarem a capacidade de relatar a ocorrência de dor, eles exibem respostas comportamentais, através das quais podemos constatar a percepção do estímulo nociceptivo. O estímulo lesivo ativa as fibras aferentes primárias que compreendem as fibras C amielinizadas de condução lenta, as Aδ mielinizadas de velocidade de condução intermediária. As fibras C estão associadas tanto aos nociceptores polimodais quanto aos nociceptores específicos para estímulos químicos, térmicos e mecânicos. As fibras Aδ estão associadas a mecanoreceptores (MEYER et al., 1994). As fibras aferentes primárias fazem conexão com neurônios que transmitem o estímulo ao SNC. O estímulo passa primeiramente pelo corno dorsal da medula espinhal e centros supraespinhais até atingir os centros córtico-límbicos (ver BESSON & CHAOUCH, 1987). Com intuito de ampliar o arsenal terapêutico no tratamento da inflamação e da dor e validar seu amplo uso popular, no presente estudo as atividades antinociceptiva e antiinflamatória de seis espécies de Lychnophora foram avaliadas. Para avaliação da atividade antiinflamatória foi utilizado o método de edema de pata induzido pela carragenina (WINTER et al., 1962) e para avaliação da atividade antinociceptiva foram utilizados os métodos da placa quente (EDDY & LEIMBACK, 1953) e de contorções induzidas pelo ácido acético (KOSTER et al., 1959). 16 Luciana Souza Guzzo Introdução 1.2.3. TOXICIDADE As plantas medicinais utilizadas como medicamentos podem ser consideradas como xenobióticos, isto é, produtos estranhos ao organismo humano, nele introduzidos com finalidades terapêuticas. Como todo corpo estranho, os produtos de sua biotransformação são potencialmente tóxicos e assim devem ser considerados. Uma planta medicinal não pode ser considerada inócua, se do reino vegetal são obtidas substâncias extremamente tóxicas como, por exemplo, a estricnina, a digitoxina, os curares e os heterosídeos cianogênicos (LAPA et al., 2004). Nesse sentido, as plantas medicinais não se diferenciam de outros xenobióticos sintéticos e sua preconização, ou a autorização oficial do uso de plantas medicinais e registro de fitoterápicos deve ser fundamentada em evidências experimentais comprobatórias que demonstram que os riscos a que se expõem aqueles que as utilizam é suplantado pelos benefícios que possam advir (BRASIL, 1995). Diante disso, comprovada a eficácia de determinada planta medicinal, a mesma é submetida a estudos toxicológicos na etapa de estudos farmacológicos pré-clínicos, com intuito de avaliar sua segurança, ou seja, a relação risco/benefício. Com o objetivo de garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, o Decreto nº 5.813 de 22 de junho de 2006, que aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, tem como uma de suas diretrizes criar e apoiar centros de pesquisas especializados em toxicologia de plantas medicinais e fitoterápicos (BRASIL, 2006b). É nesse contexto, que o presente estudo, teve como objetivo além de determinar as atividades terapêuticas, a saber, atividade antinociceptiva e antiinflamatória de extratos etanólicos de seis espécies de Lychnophora, avaliar também a atividade sobre o SNC dos extratos de duas dessas espécies e a atividade cardiovascular de uma espécie. 1.2.3.1. ATIVIDADE SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL O sistema nervoso em mamíferos coordena o comportamento, a percepção e a resposta a estímulos externos e é responsável pela mediação da comunicação com o ambiente além de coordenar a atividade de todos os outros sistemas, exercendo também importante atividade na manutenção do equilíbrio metabólico do organismo (LANDRIGAN et al., 1992). Para que uma substância seja capaz de exercer atividade sobre o sistema nervoso, ela precisa atravessar a barreira hematoencefálica, o que ocorre 17 Luciana Souza Guzzo Introdução por meio de mecanismos de transporte específicos (PARDRIDGE, 1988). Substâncias tais como triterpenos, lactonas sesquiterpênicas, constituintes encontrados nos extratos de Lychnophoras por serem lipofílicas têm potencial para atravessar por difusão passiva a barreira hematoencefálica. De acordo com LANDRIGAN et al. (1992), o SNC tem como característica única entre outras, uma baixa capacidade regenerativa, ou seja, muitas de suas células não são capazes de multiplicar e uma vez danificadas essas células não podem ser substituídas. A toxicidade sobre o SNC merece então, grande atenção devido à sua irreversibilidade no que se refere à lesão celular. Neurotoxicidade pode ser definida como a capacidade de um agente químico, biológico ou físico em causar uma reação adversa ou variação funcional ou estrutural no SNC. A avaliação de atividades sobre o SNC ou neurocomportamentais in vivo podem ser realizadas principalmente ao nível de atividades motora, cognitiva e sensorial, e constituem ferramentas relevantes, que em conjunto podem indicar a toxicidade de uma substância ou conjunto de substâncias sobre o SNC. A atividade sobre o SNC in vivo de várias plantas já foi demonstrada tais como a do extrato de Cecropia obtusifolia (PÉREZ-GUERRERO et al., 2000), Clerodendrum phlomidis (MURUGESAN et al., 2001) e Nelumbo nucifera (MUKHERJEE et al., 1996) que causaram perda da coordenação motora e do tônus muscular de animais experimentais. A depressão da atividade motora de animais também já foi relatada como conseqüência da administração do extrato de Casimiroa edulis (MORA et al., 2005). Poucos estudos de atividade sobre o SNC foram realizados com espécies de Lychnophora. CERQUEIRA et al. (1987) relatou a redução da locomoção espontânea provocada pela administração oral do extrato hidroalcoólico de L. ericoides e AZEVEDO (2004) em estudos realizados com L. pinaster não constatou atividade relaxante muscular do extrato hidroalcoólico dessa espécie. Neste contexto, no presente estudo, com o objetivo de detectar reações adversas advindas da administração oral de extratos de duas espécies de Lychnophora, os mesmos foram avaliados quanto à atividade sobre o SNC, nos métodos de campo aberto (open-field) (TURNER, 1972), que avalia a locomoção espontânea e capacidade exploratória dos animais e nos métodos de haste girante (rota-rod) (DUNHAM & MIYA, 1977) e tração (RUDZIK et al., 1973), os quais avaliam a coordenação motora e 18 Luciana Souza Guzzo Introdução força muscular dos animais, respectivamente. O uso de vários métodos é importante, pois nenhum método é capaz de examinar todos os aspectos do sistema nervoso, sendo necessário o uso de vários métodos para indicar a neurotoxicidade de uma substância (LANDRIGAN et al., 1992). 1.2.3.2. ATIVIDADE CARDIOVASCULAR Além da avaliação da atividade sobre o SNC, no presente estudo foi avaliada a atividade cardiovascular, mais especificamente a pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) e freqüência cardíaca (FC) do extrato de L. ericoides, a mais utilizada na medicina popular, com o objetivo de determinar possíveis efeitos adversos dessa planta, para que assim seja estabelecida a sua segurança. A pressão arterial (PA) é definida como aquela exercida no interior das artérias sobre as suas paredes e pode ser calculada pelo produto da resistência vascular periférica total versus o débito cardíaco. Assim, devido a esta proporcionalidade, todos os fatores que alteram estas duas variáveis podem alterar a PA. Dentre os fatores que modificam o débito cardíaco, estão as alterações da volemia, da contratilidade do miocárdio e da FC. Já a regulação da resistência vascular periférica depende de um complexo mecanismo de regulação, no qual atuam de modo interrelacionado: os barorreceptores e quimioreceptores que atuam no controle da PA a curto prazo; o balanço de eletrólitos, especialmente de sódio, potássio e cálcio; o sistema reninaangiotensina-aldosterona; substâncias vasoativas tais como PG, TX, NO e endotelinas, neurotransmissores como adrenalina e noradrenalina e hormônios tais como peptídeo natriurético atrial, vasopressina, cortisol e sistema calicreína-cinina (ver AIRES, 1999; BERNE et al., 2004). Em situações em que há alterações nesse complexo mecanismo controlador da pressão arterial, poderá ocorrer o desenvolvimento de uma situação em que a pressão arterial se manterá em níveis elevados, caracterizando a hipertensão arterial (IRIGOYEN et al., 2003). As doenças cardiovasculares são responsáveis por um terço das mortes no mundo, além de contribuírem para o desenvolvimento e aumento das principais doenças que afetam a população mundial (WHO, 2002). No Brasil, as doenças cardiovasculares estão entre as principais causas de mortes, sendo responsáveis por 32% do total de mortes e por 11% do total de internações hospitalares pelo Sistema Único de Saúde 19 Luciana Souza Guzzo Introdução (SUS), correspondendo à terceira causa de internações hospitalares (DATASUS, 2003). O Framinghham Heart Study, permitiu quantificar os riscos das doenças cardiovasculares em relação aos níveis pressóricos, verificando que a hipertensão arterial é o fator de risco mais prevalente e que mais contribui para o desenvolvimento dessas doenças (KANNEL, 1996). Diante disso, atenção especial deve ser dada ao uso de “produtos naturais” em relação aos seus possíveis efeitos cardiovasculares. Pouco existe na literatura descrevendo ações cardiovasculares tóxicas de “produtos naturais” que apresentam ações terapêuticas em outro sistema e não há nenhuma informação em relação às Lychnophoras. A avaliação da atividade cardiovascular de L. ericoides, juntamente com a avaliação de sua atividade sobre o SNC fornecerá conhecimento científico para o uso seguro dessa espécie na medicina popular. 20 Luciana Souza Guzzo 2. OBJETIVOS Luciana Souza Guzzo Objetivos 2.1. OBJETIVO GERAL Este trabalho tem como objetivo avaliar atividades farmacológicas in vivo de seis espécies de Lychnophora utilizadas pela população. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Em âmbito mais específico este trabalho tem como objetivos principais: Avaliar comparativamente a atividade antinociceptiva dos extratos etanólicos das espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha, administrados por via oral, utilizando os métodos da placa quente e de contorções induzidas pelo ácido acético em camundongos. Validar o método de mensuração do edema de pata induzido pela carragenina por paquímetro utilizando o pletismômetro. Avaliar comparativamente a atividade antiinflamatória dos extratos etanólicos das espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha, administrados por via tópica, utilizando o método de edema de pata induzido pela carragenina em camundongos. Avaliar as atividades sobre o SNC dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides e L. trichocarpha, administrados por via oral, utilizando os métodos do campo aberto, da haste girante e de tração em camundongos. Avaliar a atividade cardiovascular do extrato etanólico da espécie L. ericoides, administrada por via oral, em ratos Wistar normotensos. 22 Luciana Souza Guzzo 3. METODOLOGIA GERAL Luciana Souza Guzzo Metodologia Geral 3.1. MATERIAL VEGETAL As partes aéreas das espécies Lychnophora passerina (Mart. ex. DC.) Gardn., Lychnophoriopsis candelabrum (Schultz-Bip.) H. Robinson, Lychnophora ericoides (Mart.) e Lychnophora staavioides Mart. coletadas em Setembro de 2000 e Lychnophora pinaster Mart. coletada em Março de 2003, foram depositadas no Herbarium do Instituto de Ciências Biológicas (ICB), UFMG, Belo Horizonte, Brasil. Lychnophora trichocarpha Spreng foi coletada em Outubro de 2003 e depositada no Herbarium do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas (ICEB), UFOP, Ouro Preto, MG, Brasil. Todas as espécies foram coletadas no estado de Minas Gerais, Brasil. 3.2. EXTRAÇÃO VEGETAL As partes aéreas das espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha foram secadas em estufa a 40oC por sete dias. Após a secagem, foram pulverizadas e a partir de 800 g de cada espécie foi realizada a extração com etanol, à temperatura ambiente, até o esgotamento do material vegetal. O etanol foi, então, evaporado à pressão reduzida até a obtenção do resíduo bruto. A A B C Figura 2: Extração vegetal: pulverização (A), extração por percolação (B) e evaporação com o uso de rotavapor (C). 24 Luciana Souza Guzzo Metodologia Geral 3.3. PREPARO DAS SOLUÇÕES DOS EXTRATOS DE LYCHNOPHORAS Para avaliação das atividades antinociceptiva e antiinflamatória os extratos etanólicos brutos das espécies de Lychnophora foram solubilizados em Tween 80, dimetilsulfóxido (DMSO) e água destilada 1:1:8 (veículo) para preparo das soluções nas concentrações 75 mg/ml e 150 mg/ml. Para avaliar a atividade cardiovascular e sobre o SNC das Lychnophoras, cada extrato etanólico bruto foi solubilizado em Capryol: água destilada (6,5:3,5) e suspenso em 0,5% de carboximetilcelulose (CMC) para preparo das soluções nas concentrações 50 mg/ml e 100 mg/ml. 3.4. ANIMAIS EXPERIMENTAIS Os animais utilizados foram provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto e mantidos no Biotério da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto até a realização dos experimentos. Os animais foram mantidos em caixas em grupos de cinco, no ciclo 12 horas claro e 12 horas escuro, com acesso livre à comida e água. Para os experimentos em que a administração das soluções foi realizada por via oral, os animais foram mantidos em jejum num período de oito a doze horas antes dos experimentos com acesso livre somente à água. Os estudos das atividades antinociceptiva e antiinflamatória foram realizados em camundongos albinos Swiss (30 ± 5 g) de ambos os sexos e os métodos de avaliação da atividade sobre o SNC foram realizados em camundongos machos. Os estudos da atividade cardiovascular foram realizados em ratos Wistar machos normotensos (250 ± 30 g). 3.5. MATERIAIS No presente trabalho, foram utilizados os seguintes fármacos e reagentes: Tween 80 (Synth, Brasil), CMC, DMSO (Synth, Brasil), Capryol (Gattefossé, França), carragenina (Sigma-Aldrich, USA), dipirona sódica (Teuto, Brasil), cloridrato de morfina, indometacina (Sigma-Aldrich, USA), diazepam (Sigma-Aldrich, USA), 25 Luciana Souza Guzzo Metodologia Geral diclofenaco sódico emulgel (Novartis, Brasil), cloreto de sódio e pentobarbital sódico (Cristália, Brasil). Todos os solventes utilizados foram de grau analítico e a água foi purificada por destilação. 3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (e.p.m.) com n ≥ 6 para cada grupo experimental. Os resultados foram submetidos à análise de variância (One-way ANOVA) seguida de teste Dunnet para análise dos grupos teste em relação ao grupo controle e foram submetidos à análise de variância (One-way ANOVA) seguida de teste Bonferroni para análise entre os grupos. Apenas para o método de tração os resultados foram expressos em porcentagem de animais que não obtiveram êxito no teste e a significância estatística foi avaliada pelo teste Fisher. Para todas as análises foi adotado intervalo de confiança de 95%, sendo que as diferenças foram consideradas significativas quando o valor de P foi menor ou igual a 0,05 (P ≤ 0,05). Para a análise estatística foi usado o Software Graf Pad Prisma 4.0. 26 Luciana Souza Guzzo 4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antinociceptiva 4.1. METODOLOGIA Para avaliação da atividade antinociceptiva os camundongos receberam solução controle (veículo) ou extratos etanólicos das espécies L. candelabrum, L. ericoides, L. passerina, L. pinaster, L. staavioides e L. trichocarpha nas doses 0,75 g/kg ou 1,50 g/kg por via oral. Como fármacos padrão foram utilizados: morfina 10 mg/kg (1 mg/ml) por via intraperitoneal (i.p.) ou dipirona 200 mg/kg (25 mg/ml) por via oral, ambas dissolvidas em água destilada, utilizados nos dois métodos descritos abaixo ou a indometacina 10 mg/kg (1 mg/ml) por via oral solubilizada em água destilada e 0,5% de Tween 80 (ESTEVES et al., 2005) utilizada no método de contorções. Avaliação da atividade antinociceptiva foi realizada utilizando o método da placa quente e o método de contorções induzidas pelo ácido acético. 4.1.1. MÉTODO DA PLACA QUENTE Para avaliação da atividade antinociceptiva foi utilizado o método da placa quente descrito por EDDY & LEIMBACK (1953), com modificações. Cada camundongo foi colocado individualmente sobre a placa aquecida a 56 ± 1ºC e o tempo para que os animais apresentassem o reflexo de lamber as patas (tempo de latência para a resposta nociceptiva) foi registrado antes e 30 minutos (min) após administração das soluções dos extratos das seis espécies de Lychnophora (0,75 ou 1,50 g/kg), das soluções padrão (morfina, dipirona ou indometacina) ou da solução controle. O tempo de reação do animal foi registrado com auxílio de um cronômetro e o tempo máximo de permanência do animal sobre a placa foi 60 segundos (s) para evitar danos ao animal. Efeito antinociceptivo, definido como aumento do tempo de reação, foi calculado como uma variação (∆) dos resultados obtidos antes e após administração das soluções. 28 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antinociceptiva Figura 3: Camundongo sobre a placa aquecida a 56 ± 1ºC 4.1.2. MÉTODO DE CONTORÇÕES INDUZIDAS PELO ÁCIDO ACÉTICO Para avaliação da atividade antinociceptiva foi utilizado o método de contorções descrito por KOSTER et al. (1959). A resposta induzida pela administração i.p. de ácido acético consiste na contração do músculo abdominal junto ao estiramento das patas posteriores do animal. As soluções dos extratos etanólicos das seis espécies de Lychnophora estudadas nas duas doses avaliadas (0,75 ou 1,50 g/kg, via oral), as soluções de morfina, dipirona ou indometacina ou a solução controle foram administradas 30 min antes da injeção de ácido acético 0,8% v/v. As contorções foram contadas por 30 min, em períodos de 5 min, iniciando logo após a administração do ácido acético. A redução significativa do número de contorções comparado ao grupo controle foi considerada resposta antinociceptiva positiva. 4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO O presente estudo avaliou comparativamente pela primeira vez o efeito antinociceptivo de seis espécies de Lychnophora nativas do Brasil. Para isso, foram usados os métodos da placa quente e de contorções induzidas pelo ácido acético, os quais são descritos na literatura como métodos para avaliação da atividade antinociceptiva central e periférica, respectivamente (VERMA et al., 2005). A Figura 4 mostra o efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras sobre o tempo de latência para o camundongo lamber as patas, quando submetido à estimulação térmica no método da placa quente. Os extratos de L. pinaster na menor dose e L. ericoides na maior dose avaliada apresentaram atividade antinociceptiva evidenciada 29 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antinociceptiva pelo aumento no tempo de reação do animal, sendo 25 ± 7,3 s e 18 ± 4,8 s, respectivamente. Este efeito foi semelhante ao observado após administração de dipirona (17 ± 2,6 s) e morfina (29 ± 4,1 s) e diferente do grupo controle (3 ± 0,8 s). No método da placa quente o calor induz a ação termoceptiva cutânea. A integração do estímulo ocorre devido à estimulação de fibras C de condução lenta, que apresenta terminais não capsulados de receptores termais e mecânicos e fibras do tipo Aδ de condução rápida que induz ao reflexo de retirada da pata pela ativação de termorreceptores (HENDRY et al., 1999) e a latência do reflexo de retirada da pata ocorre por integração medular com influência supraespinhal (LE BARS et al., 2001). Como já relatado por SANTOS et al. (1998), a indometacina, um AINE, não apresenta atividade no método da placa quente (Figura 4). Este método é considerado seletivo para compostos com atividade sobre o SNC (JANSSEN et al., 1963; LE BARS et al., 2001), por isso a morfina, analgésico narcótico opióide, apresentou atividade no método da placa quente. A dipirona, não tem o mecanismo de ação pelo qual se evidencia seu efeito analgésico claramente elucidado, parecendo concorrer mecanismos periféricos e centrais e em diferentes níveis de processamento da informação dolorosa (ANDRADE, 2005). O fato da dipirona ter apresentado atividade antinociceptiva no método da placa quente reforça achados recentes de VAZQUEZ et al. (2005), que demonstraram que a administração intravenosa (i.v.) de dipirona em ratos leva à ativação de circuitos opioidérgicos endógenos na substância cinzenta periaquedutal e no núcleo magno da rafe, áreas que compõem o sistema descendente inibitório espinhal. A Figura 5 e a Tabela 1 mostram o número total de contorções durante 30 min de observação, iniciado imediatamente após a administração i.p. do ácido acético. Os resultados observados nesse método demonstraram o efeito de L. passerina, L. candelabrum e L. pinaster na dose 0,75 g/kg. O extrato etanólico de L. ericoides e L. trichocarpha em ambas doses avaliadas (0,75 e 1,50 g/kg) reduziram o número de contorções de maneira dose-dependente. Esta redução representa 52,7% e 88,1% para L. ericoides e 47,9% e 89,1% para L. trichocarpha para as doses 0,75 e 1,50 g/kg, respectivamente. Os extratos mais efetivos em produzir efeito antinociceptivo por este método foram então, aqueles obtidos de L. ericoides e L. trichocarpha. Na Figura 6G pode ser observado que os fármacos padrões dipirona e morfina induziram ao efeito antinociceptivo em todo tempo de análise (0-30 min) e o efeito 30 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antinociceptiva antinociceptivo da indometacina ocorreu entre 5 e 25 min. Como mostrado na Figura 6 e Tabela 1, a redução do número de contorções após a administração dos extratos de Lychnophoras foi observada 5 min após a injeção de ácido acético e não foi mais observada após 20 min exceto para os extratos de L. ericoides (Figura 6D e Tabela 1) e L. trichocarpha (Figura 6F e Tabela 1) na dose 1,50 g/kg, cujo efeito antinociceptivo foi observado até o final da análise (30 min). Os extratos de L. passerina (Figura 6A) no tempo 10-15 min e de L. staavioides no tempo 0-5 min (Figura 6E), ambos na dose 1,50 g/kg, induziram à hiperalgesia evidenciada pelo aumento significativo do número de contorções. O método de contorções induzidas pelo ácido acético é considerado inespecífico, sendo muito utilizado para triagem que permite a detecção de compostos com atividade antinociceptiva principalmente periférica. COLLIER et al. (1968) propuseram que o ácido acético age indiretamente pela liberação de mediadores endógenos que estimulam neurônios nociceptivos. DERAEDT et al. (1980) relataram que o método de contorções induzidas pelo ácido acético está relacionado ao aumento dos níveis de PGE2 e PGF2α e produtos da LOX, durante os primeiros 30 min após a administração de ácido acético. Adicionalmente, DUARTE et al. (1988) demonstraram que a administração i.p. de ácido acético induz também à liberação de mediadores do sistema nervoso simpático. Mais recentemente, RIBEIRO et al. (2000) propuseram que a atividade nociceptiva do ácido acético pode está relacionada à liberação de citocinas, tais como TNF-α, IL-1β e IL-8, à partir de macrófagos peritoniais e de mastócitos. Considerando o método de contorções como o modelo antinociceptivo de menor seletividade (TOMA et al., 2003), pode-se inferir no presente estudo, que por isso, um maior número de espécies e doses de extratos etanólicos de Lychnophoras mostrou atividade nesse método. Os resultados observados nos métodos da placa quente e de contorções induzidas por ácido acético confirmam a atividade antinociceptiva de L. pinaster (AZEVEDO, 2004) e de L. ericoides (CERQUEIRA et al., 1987; BORSATO et al., 2000; SANTOS et al., 2005). A ação antinociceptiva de L. ericoides foi relacionada à presença de flavonóides, triterpenos, lactonas sesquiterpênicas (BORELLA et al., 1998), ácidos cafeicos (SANTOS et al., 2005) e lignanas (BORSATO et al., 2000). OTUKI et al. (2005) demonstraram que a mistura dos triterpenos α e β-amirina apresentam atividade antinociceptiva no método de contorções induzidas pelo ácido acético, mas não no 31 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antinociceptiva método da placa quente. Esses triterpenos já foram isolados das espécies L. ericoides (SAKAMOTO et al., 2003), L. candelabrum.(SANTOS et al., 2004), L. pinaster (SILVEIRA et al., 2005a) e L. trichocarpha (SAÚDE et al., 1998). Além disso, sitosterol presente na espécie L. trichocarpha (SAÚDE et al., 1998) reduziu o número de contorções induzidas pelo ácido acético e aumentou o tempo de reação dos animais no método da placa quente (VILLASSENOR et al., 2002). Quercetina e vitexina, flavonóides já isolados de L. pinaster (SILVEIRA et al., 2005b), também apresentaram atividade antinociceptiva no método da placa quente (RYLSKI et al., 1979). KAUR et al. (2005) demonstraram que a quercetina induz ao efeito antinociceptivo que involve principalmente a modulação de vias adrenérgicas. Os extratos etanólicos de L. passerina e L. candelabrum no método de contorções e L. pinaster nos dois métodos utilizados apresentou atividade antinociceptiva significativa na menor mas não na maior dose avaliada. Este efeito foi provavelmente causado pela presença de substâncias que agem somente na maior dose causando hiperalgesia. Este efeito hiperalgésico parece mascarar a atividade antinociceptiva dos extratos de Lychnophoras agindo através da interação sinérgica entre bradicinina, serotonina e histamina (LAVICH et al., 2003). Este resultado pode ser explicado se for considerado que o extrato bruto de uma planta é uma mistura de inúmeras substâncias dotadas de atividades biológicas diversas, entre elas substâncias potencialmente irritantes para os tecidos, tais como sais diversos, hexoses, saponinas e a própria clorofila que, em altas concentrações, poderiam gerar ou potenciar uma resposta hiperalgésica. Desta forma, o aumento da dose dessas espécies de Lychnophora poderia levar à administração de quantidades maiores destas substâncias, cujo efeito seria antagônico ao efeito antinociceptivo em estudo. Embora existam muitos relatos da atividade analgésica das Lychnophoras, este foi o primeiro estudo que avaliou comparativamente o efeito antinociceptivo in vivo de seis espécies em dois modelos experimentais. Os resultados mostram que não são todas as espécies que apresentam atividade antinociceptiva, sendo importante, então, o conhecimento das características morfológicas e propriedades farmacológicas das espécies de Lychnophora para correta identificação e uso direcionado pela população. 32 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antinociceptiva 35 Controle Variação do tempo de latência para lamber a pata (s) * * 30 Dipirona 200 mg/kg Morfina 10 mg/kg 25 Indometacina 10 mg/kg L. passerina 0,75 g/kg * L. passerina 1,50 g/kg L. candelabrum 0,75 g/kg L. candelabrum 1,50 g/kg 20 15 L. pinaster 0,75 g/kg L. pinaster 1,50 g/kg * L. ericoides 0,75g/kg L. ericoides 1,50 g/kg 10 5 L. staavioides 0,75 g/kg L. staavioides 1,50 g/kg 0 L. trichocarpha 0,75 g/kg L. trichocharpha 1,50 g/kg Número total de contorções em 30 min Figura 4: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras sobre a variação do tempo gasto para lamber as patas em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). 45 Controle 40 Dipirona 200 mg/kg Morfina 10 mg/kg 35 Indometacina 10 mg/kg L. passerina 0,75 g/kg 30 L. passerina 1,50 g/kg L. candelabrum 0,75 g/kg 25 * 20 * * * * * 15 10 5 0 * * ** * L. candelabrum 1,50 g/kg L. pinaster 0,75 g/kg L. pinaster 1,50 g/kg L. ericoides 0,75g/kg L. ericoides 1,50 g/kg L. staavioides 0,75 g/kg L. staavioides 1,50 g/kg L. trichocarpha 0,75 g/kg L. trichocharpha 1,50 g/kg Figura 5: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras sobre o número total de contorções induzidas pelo ácido acético em 30 min em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). 33 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antinociceptiva A Número de contorções 15 + Controle L. passerina 0,75 g/kg L. passerina 1,50 g/kg 12 9 * 6 * 3 * 0 0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30 Tempo após administração de ácido acético (min) 10 Número de contorções B Controle L. candelabrum 0,75 g/kg L. candelabrum 1,50 g/kg 8 6 * 4 * 2 0 0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30 Tempo após administração de ácido acético (min) C Número de contorções 10 Controle L. pinaster 0,75 g/kg L. pinaster 1,50 g/kg 8 6 * 4 * 2 0 0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30 Tempo após administração de ácido acético (min) 34 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antinociceptiva D Número de contorções 10 Controle L. ericoides 0,75 g/kg L. ericoides 1,50 g/kg 8 6 * 4 * * * 2 * * 0 0-5 5 -10 * * * 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30 Tempo após administração de ácido acético (min) E Número de contorções 12 Controle L. staavioides 0,75 g/kg L. staavioides 1,50 g/kg 10 8 + 6 * 4 * * * 2 0 0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30 F Número de contorções Tempo após administração de ácido acético (min) 12 Controle L. trichocarpha 0,75 g/kg L. trichocarpha 1,50 g/kg 10 8 6 * 4 * 2 * 0 0-5 5 -10 * * * * * 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30 Tempo após administração de ácido acético (min) 35 Luciana Souza Guzzo G Número de contorções Avaliação da atividade antinociceptiva 10 Controle Dipirona 200 mg/kg Morfina 10 mg/kg Indometacina 10 mg/kg 8 6 * 4 * 2 0 ** ** 0-5 5-10 ** * * * * * * ** 10 -15 15-20 20-25 25-30 Tempo após administração de ácido acético (min) Figura 6: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras (A-F) e de fármacos padrão (G) sobre o número total de contorções induzidas pelo ácido acético contadas em períodos de 5 min por 30 min em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 redução do número de contorções comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). + P≤0,05 aumento do número de contorções comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). 36 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antinociceptiva Tabela 1: Número de contorções induzidas pelo ácido acético em camundongos Tempo após administração do ácido acético (min) Tratamento 0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 Total Controle 3 ± 0,6 7 ± 0,7 8 ± 0,7 9 ± 0,7 6 ± 0,6 3 ± 0,4 35 ± 2,7 Morfina 10mg/kg 0 ± 0,0* 0 ± 0,2* 0 ± 0,3* 0 ± 0,3* 0 ± 0,0* 0 ± 0,0* 1 ± 0,7* Dipirona 200 mg/kg 0 ± 0,0* 0,0 ± 0,2* 1 ± 0,2* 1 ± 0,3* 1 ± 0,3* 0 ± 0,2* 3 ± 0,7* Indometacina 10 mg/kg 1 ± 0,4 3 ± 0,6* 4 ± 0,7* 3 ± 0,5* 3 ± 0,4* 2 ± 0,4 16 ± 2,1* L. passerina 0,75 g/kg 3 ± 0,5 3 ± 0,6* 3 ± 0,6* 5 ± 1,6* 3 ± 1,5 1 ± 0,6 18 ± 4,7* L. passerina 1,50 g/kg 1 ± 0,2 7 ± 08 13 ± 1,1+ 11 ± 0,9 7 ± 0,9 1 ± 0,4 38 ± 3,1 L. candelabrum 0,75 g/kg 1 ± 0,4 2 ± 0,6* 4 ± 0,7* 6 ± 1,1 6 ± 1,4 2 ± 0,6 21 ± 3,5* L. candelabrum 1,50 g/kg 3 ± 1,5 7 ± 1,4 5 ± 1,4 7 ± 2,0 4 ± 1,1 1 ± 0,4 26 ± 5,6 L. pinaster 0,75 g/kg 3 ± 1,4 4 ± 1,2 4 ± 1,0* 4 ± 1,0* 3 ± 0,9 2 ± 0,9 19 ± 5,4* L. pinaster 1,50 g/kg 2 ± 1,2 7 ± 1,2 7 ± 1,3 6 ± 1,2 5 ± 0,9 4 ± 1,0 31 ± 3,9 L. ericoides 0,75 g/kg 1 ±0,9 3 ± 1,2* 3 ± 1,1* 4 ± 1,1* 3 ± 0,7* 3 ± 0,9 16 ± 5,1* L. ericoides 1,50 g/kg 2 ± 0,8 1 ± 0,5* 1 ± 0,3* 0 ± 0,2* 0 ± 0,2* 0 ± 0,2* 4 ± 2,2* L. staavioides 0,75 g/kg 4 ± 1,2 5 ± 1,2 4 ± 0,8* 5 ± 1,3* 4 ± 0,9 3 ± 0,8 26 ± 4,8 L. staavioides 1,50 g/kg 7 ± 2,2+ 8 ± 2,4 5 ± 1,8 3 ± 1,0* 3 ± 0,9* 2 ± 0,7 29 ± 8,3 L. trichocarpha 0,75 g/kg 5 ± 1,9 5 ± 1,6 4 ± 1,5* 2 ± 0,6* 1 ± 0,6* 1 ± 0,6 18 ± 5,7* L. trichocarpha 1,50 g/kg 1 ± 0,6 2 ± 1,1* 1 ± 0,4* 0 ± 0,3* 0 ± 0,1* 0 ± 0,3* 4 ± 2,0* Os valores representam a média + erro padrão da média. *P≤0,05 redução do número de contorções comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). + P≤0,05 aumento do número de contorções comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). 37 Luciana Souza Guzzo 5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória 5.1. METODOLOGIA 5.1.1. VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE MENSURAÇÃO DO EDEMA DE PATA O método de mensuração do edema de pata pelo paquímetro utilizado no presente estudo foi validado utilizando o pletismômetro (FERREIRA et al., 1979), que consiste na imersão da pata do animal na cuba do aparelho até a articulação tibiotársica, registrando-se o volume deslocado. Foi administrado por via subcutânea na pata direita o volume de 0,02 ml de carragenina 0,1% ou 1% em solução salina e na pata esquerda 0,02 ml de solução salina. Foram mensurados o volume da pata do animal utilizando-se o pletismômetro (modelo 7140, UGO BASILE, Itália) e a espessura entre as faces dorsal e ventral da mesma pata foi obtida com o uso de um paquímetro (Vonder, China) posicionando-o na porção central da pata, sem pressionar. As mensurações foram feitas antes, 1 e 3 h após administração da solução de carragenina ou solução salina. A variação da espessura em mm foi comparada à variação do volume em mililitros (ml). Figura 7: Mensuração do edema de pata com pletismômetro em camundongos. 39 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória 5.1.2. PREPARO DAS POMADAS DE LYCHNOPHORAS Os extratos etanólicos das espécies de L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha na concentração 150 mg/ml foram incorporados em pomada base (lanilina/vaselina 3:7) e obtidos as concentrações de 5 e 10%. 5.1.3. MÉTODO DE EDEMA DE PATA INDUZIDO PELA CARRAGENINA Para a avaliação da atividade antiinflamatória dos extratos de Lychnophoras foi utilizado o modelo de inflamação descrito por WINTER et al. (1962) com modificações. Um volume de 0,02 ml de carragenina 0,1% em solução foi injetado na região subplantar da pata direita posterior dos camundongos. A pata esquerda posterior foi submetida apenas à introdução da agulha (sham). As pomadas dos extratos de Lychnophoras nas concentrações 5 e 10% ou a pomada base foram administradas com auxílio de uma espátula logo após a injeção de carragenina ou apenas introdução da agulha na pata do animal. O grupo padrão recebeu diclofenaco gel após administração de carragenina na pata direita. Para permitir a permanência da pomada em contato com a pata do animal até o fim do experimento, foi utilizado gaze e esparadrapo, assegurando assim a absorção local da pomada. Os animais foram, então, colocados em gaiolas individuais e 3 h (horas) após a administração da carragenina as espessuras das patas foram novamente mensuradas. O edema de pata foi expresso em milímetros (mm) e calculado como a variação (∆) entre o tempo zero e 3 h após a administração de carragenina, momento em que ocorre pico de formação do edema (CARVALHO et al., 1999). 5.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO Com o objetivo de validar a mensuração do edema de pata, no presente estudo, as espessuras das patas dos camundongos mensuradas com o uso do paquímetro foi comparada às mensurações utilizando-se o pletismômetro. Os dados foram expressos como variação percentual da espessura (Figura 8 e Tabela 2) e volume (Figura 9 e 40 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória Tabela 3) da pata 1 e 3 h após administração da carragenina em relação ao tempo zero (antes da administração da carragenina). A Figura 8 mostra que o aumento da espessura das patas dos animais foi significativa 1 e 3 h após administração de carragenina 0,1 e 1%, comparado ao grupo controle. Entretanto, carragenina 1% foi mais efetiva em produzir o edema de pata em camundongos nos dois tempos analisados. Esses achados estão em acordo com os resultados obtidos com as medidas com o pletismômetro para as patas que receberam carragenina 1% (Figura 9). Entretanto, na mensuração com pletismômetro o aumento do volume das patas que receberam carragenina 0,1% na primeira hora foi maior que na terceira hora. Isto não era esperado, já que se sabe que o edema atinge seu maior volume 3 h após a administração de carragenina (CARVALHO et al., 1999) como foi demonstrado por CALVO (2006) usando o pletismômetro. Os resultados sugerem que o paquímetro é tão efetivo quanto o pletismômetro para mensuração do edema de pata induzido pela carragenina 1% em camundongos e se mostrou mais sensível na mensuração do edema de pata induzida por carragenina 0,1% na terceira hora de experimento. A Figura 10 e a Tabela 4 mostram os resultados obtidos pelo método de edema de pata induzido pela carragenina. A administração tópica das pomadas de L. pinaster e L. trichocarpha em ambas concentrações avaliadas (5 e 10%) e L. passerina e L. candelabrum 10% reduziram significantemente o edema de pata mensurado 3 h após a administração de carragenina, comparado aos grupos controle, sugerindo uma atividade antiinflamatória desses extratos. Somente as pomadas de L. pinaster e L. trichocarpha, em ambas concentrações avaliadas, mostraram atividade antiinflamatória similar ao diclofenaco gel e as demais pomadas de Lychnophoras que apresentaram atividade foram menos ativas que a droga padrão. O método usado para avaliar a atividade antiinflamatória induzida pela carragenina 0,1% em camundongos foi satisfatório, visto que foi observada uma diferença significativa entre as patas sham e controle que receberam injeção de carragenina 0,1% e foram tratadas com pomada base (Figura 10 e Tabela 4). Como demonstrado na Tabela 4, as patas sham que receberam pomada base como tratamento também desenvolveram algum edema, porém o edema desenvolvido foi significativamente menor ao observado no grupo tratado com carragenina e pomada base. As patas sham que receberam o tratamento com as pomadas 41 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória contendo extratos das espécies de Lychnophora também desenvolveram algum edema, porém de maneira similar ao desenvolvido no grupo sham tratado com pomada base, sem alterações induzidas pelo tratamento com os extratos. Tais observações indicam ausência de atividade pró-inflamatória dos extratos de Lychnophoras por via tópica e, avaliando a metodologia utilizada, foi observado que apenas a inserção da agulha na pata induz a um discreto processo inflamatório agudo. Os resultados obtidos estão em acordo com AZEVEDO (2004) que demonstrou a atividade antiedematogênica da solução hidroalcoólica do extrato de L. pinaster administrada por via oral em camundongos. Considerando que as espécies de Lychnophora são usadas em infusões, banhos ou macerados em etanol ou cachaça por via tópica como analgésico e antiinflamatório, o presente trabalho é relevante já que demonstra pela primeira vez a atividade antiinflamatória in vivo, mais especificamente atividade antiedematogênica, da administração tópica dos extratos das espécies de Lychnophora e indica quais espécies devem ser usadas para essa atividade. O edema de pata induzido pela carragenina é um modelo experimental de inflamação aguda que envolve diferentes fases (VINEGAR et al., 1969). Primeiramente a carragenina estimula a liberação de citocinas pró-inflamatórias que estimulam a liberação de serotonina e histamina nos primeiros 90 min, e de cininas numa fase intermediária (90-150 min) (RONALD & CHRISTOPHER, 1990; FERREIRA et al., 1993). A partir deste momento o edema é mantido principalmente pela produção de PGs (DI ROSA & SORRENTINO, 1968; DI ROSA et al., 1971; DI ROSA, 1972; DI ROSA & WILLOGHBY, 1971). Outros mediadores tal como os produtos do sistema de complemento (WILLOUGHBY et al., 1969), a somatostatina (TRAUB & BROZOSKI, 1996) e SP (GILLIGAM et al., 1994) também estão envolvidos na resposta inflamatória induzida pela carragenina. O NO outro importante mediador exerce um papel chave no desenvolvimento do edema e da nocicepção induzida pela carragenina (SALVEMINI et al., 1996). Em camundongos, pode ser observada uma resposta inflamatória de 24-72 h após a injeção de carragenina, evidenciada pelo acúmulo de macrófagos, eosinófilos e linfócitos e cuja mediação depende principalmente de citocinas (HENRIQUES et al., 1987). O edema inflamatório decorre da interação entre substâncias que promovem o aumento da permeabilidade vascular, com mediadores que causam vasodilatação. 42 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória Embora os vasodilatores sejam incapazes de induzir o edema, eles potenciam a atuação dos outros mediadores, por aumentarem o aporte sangüíneo na região inflamada (WILLIAMS, 1978; 1979). Desta forma, AINEs como o diclofenaco, usado como droga padrão no método de edema de pata no presente estudo, que inibem a ação da ciclooxigenase (COX) e conseqüentemente reduzem a produção de PGs, retiram a potenciação exercida pelo efeito vasodilatador destes mediadores lipídicos reduzindo assim, o edema inflamatório (TULUNAY, 2000). O mecanismo pelo qual os extratos de Lychnophoras produzem atividade antiinflamatória e os metabólitos responsáveis por tal atividade ainda não está claro. Já foi demonstrado por KIMURA et al. (1985) que ácidos cafeoilquínicos reduzem a liberação de histamina por mastócitos in vitro. Ácidos cafeicos já foram isolados de L. ericoides (SANTOS et al., 2005) e L. pinaster (SILVEIRA et al., 2005b). A atividade antiinflamatória da cubebina, lignana já isolada de L. ericoides (BORSATO et al., 2000) já foi demonstrada no método de edema de pata induzido pela carragenina (BASTOS et al., 2001). A atividade antiinflamatória de muitas plantas foi atribuída aos seus constituintes flavonóides (PARMAR & GOSH, 1978) e triterpenos (AHMAD et al., 1983), os quais já foram isolados de muitas espécies de Lychnophora. Em um sítio de inflamação há uma grande concentração de radicais livres e oxidantes, os quais desempenham um importante papel em diferentes processos da inflamação. Diante disso, compostos antioxidantes como os flavonóides isolados de L. passerina (CHICARO et al., 2004) e de L. ericoides (KANASHIRO et al., 2004) podem evitar esses processos (SALVEMINI et al., 1996). CALIXTO et al. (2000) revelaram a atividade analgésica e/ou antiinflamatória de vários flavonóides e essas atividades foram associadas a vários fatores. Estudos demonstraram que a quercetina, flavonóide já isolado das espécies L. passerina (CHICARO et al., 2004), L. ericoides (BORELLA et al., 1998) e L. pinaster (SILVEIRA et al., 2005b), inibe a produção de NO e a expressão de iNOS (óxido nítrico sintase induzível) in vitro (MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2005), o que também já foi confirmado em estudos in vivo (MORALES et al., 2006; SHEN et al., 2002). Além disso, o kaempferol, flavonóide também já isolado da espécie L. passerina (CHICARO et al., 2004), e a quercetina causaram uma redução dos níveis das proteínas COX-2, iNOS e proteína C reativa, via mecanismo que parece envolver o 43 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória bloqueio da ativação de NF-κB e conseqüentemente a inibição da expressão de genes pró-inflamatórios. Kaempferol também exibiu efeito inibitório da enzima xantina oxidase (ZHANG et al., 2006). Além da quercetina e do kaempferol, os flavonóides apigenina, luteolina e tirilosídeo também já foram isolados da espécie L. passerina (CHICARO et al., 2004). Em estudos in vitro a quercetina e o tirilosídeo inibiram significativamente a produção de NO e das citocinas TNF-α e IL-12 (RAO et al., 2005). Estudos feitos com apigenina in vitro demonstraram que esse flavonóide tem efeito inibitório sobre a expressão gênica de TNF-α (KOWALSKY et al., 2005), inibe a produção de NO (SOLIMAN et al., 1998) e ainda, tal como a luteolina, apresenta atividade inibitória das enzimas COX-2 e 5-LOX (KIM et al., 2006). A luteolina também inibiu TNF-α em estudos realizados in vivo e in vitro (UEDA et al., 2002) e recentemente inibiu eficientemente o edema de pata induzido pela carragenina e essa atividade foi atribuída à sua ação inibitória sobre a expressão gênica da enzima COX-2 (ZIYAN et al., 2007). A atividade antiinflamatória também é uma atividade comum de muitos triterpenos (SAFAIHY & SAILER, 1997) e vários mecanismos foram atribuídos a essa atividade incluindo: inibição da atividade da COX, LOX e elastase e do sistema de complemento (SINGH et al., 1992). A atividade antioxidante de vários triterpenos incluindo alguns presentes nas Lychnophoras já foi demonstrada (ANDRIKOPOULOS et al., 2003). Recentemente, FERRAZ FILHA et al. (2006) revelaram que as espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha possuem uma alta atividade inibitória da enzima xantina oxidase, a enzima que catalisa o metabolismo de xantina e hipoxantina em ácido úrico, o qual é responsável pela doença chamada gota causada pela deposição de ácido úrico nas articulações (CHIANG et al., 1994). Além disso, a xantina oxidase é uma importante fonte de radicais livres derivados do oxigênio que contribuem para os danos oxidativos dos tecidos envolvidos em muitos processos patológicos como, por exemplo, a inflamação. Diante disso, por inibir a xantina oxidase, as espécies de Lychnophora são úteis no tratamento da gota e outras doenças induzidas pela atividade dessa enzima, justificando assim o uso popular dessas espécies no tratamento do reumatismo (SWEENEY et al., 2001). Além disso, as lactonas sesquiterpênicas parecem modular muitos processos que influenciam reações 44 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória inflamatórias, por exemplo, fosforilação oxidativa, agregação plaquetária, liberação de histamina e serotonina (HALL et al., 1980; SCHRÖDER et al., 1990). Essas atividades são mediadas quimicamente por estruturas carbonílicas α,β-insaturadas, que reagem com nucleófilos, especialmente grupos cisteína sulfidrílicos (SCHMIDT, 1999; PICMAN et al., 1979; PICMAN, 1986). Centraterina, 15-deoxigoiazensolídeo e licnofolídeo, lactonas sesquiterpênicas isoladas de L. ericoides, apresentam um grupo αmetileno-γ-lactona e um grupo carbonil α,β,γ,δ-insaturado (SAKAMOTO et al., 2003). Além desses grupos, centraterina e goiazensolídeo também apresentam um grupo acil α,β,γ,δ-insaturado que é considerado o terceiro sítio de reação. Esses dois compostos são os mais potentes membros antiinflamatórios dos furanoheliangolídeos como demonstrado in vitro (RÜNGELER et al., 1999). A atividade antiinflamatória das lactonas sesquiterpênicas é principalmente atribuída à inibição do fator transcricional NF-κB (LYß et al., 1997), um dos reguladores chave dos genes envolvidos na resposta imune e inflamatória, pela alquilação seletiva de sua subunidade p65, provavelmente através da reação com resíduos de cisteína (RÜNGELER et al., 1999; LYß et al., 1998). Embora as lactonas sesquiterpênicas sejam conhecidas por suas atividades antiinflamatórias in vitro, ainda não há nenhuma evidência dessas atividades in vivo. Embora a espécie L. ericoides contenha lactonas sesquiterpênicas que apresentam atividade antiinflamatória in vitro (RÜNGELER et al., 1999), essa espécie não mostrou atividade no método de edema de pata induzido pela carragenina no presente trabalho. O presente trabalho demonstrou pela primeira vez que uma simples formula contendo extrato etanólico de algumas espécies de Lychnophora nativas do Brasil pode realmente produzir um efeito antiinflamatório. Entretanto, os resultados do método de edema de pata mostram que nem todas as espécies apresentam tal atividade, como também foi observado nos testes de antinocicepção. Salienta-se assim mais uma vez a importância da correta identificação e conhecimento das propriedades farmacológicas das espécies de Lychnophora para o uso racional das mesmas. 45 Luciana Souza Guzzo Variação da Espessura (%) Avaliação da atividade antiinflamatória 50 30 * * 40 * * Controle Sham 20 Carragenina 0,1% 10 Carragenina 1% 0 -10 1 3 Tempo após administração de carragenina (h) Variação do volume (%) Figura 8: Variação percentual da espessura da pata mensurada pelo paquímetro em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). 50 40 * * * * 30 Controle 20 Sham 10 Carragenina 0,1% Carragenina 1% 0 -10 1 3 Tempo após administração de carragenina (h) Figura 9: Variação percentual do volume da pata mensurada pelo pletismômetro em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). 46 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória Tabela 2: Variação percentual da espessura das patas dos animais Variação da espessura (%) Tratamento 1h 3h Controle 4 ± 1,2 6 ± 1,4 Sham -0,0 ± 1,3 4 ± 1,5 Carragenina 0,1% 27 ± 2,5* 32 ± 2,0* Carragenina 1 % 41 ± 3,6* 43 ± 2,7* Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett) Tabela 3: Variação percentual do volume das patas dos animais Variação do volume (%) Tratamento 1h 3h Controle -5 ± 3,3 -5 ± 4,2 Sham -2 ± 1,6 -6 ± 1,9 Carragenina 0,1% 38 ± 6,3* 31 ± 7,0* Carragenina 1 % 41 ± 4,9* 44 ± 3,3* Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett) 47 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória 8 Pomada Base Sham Variação da espessura das patas (10 -2 mm) 7 Diclofenaco L. passerina 5% 6 L. passerina 10% L. candelabrum 5% 5 * 4 3 * * * * * * L. candelabrum 10% L. pinaster 5% L. pinaster 10% L. ericoides 5% L. ericoides 10% 2 1 L. staavioides 5% * L. staavioides 10% L. trichocarpha 5% L. trichocarpha 10% 0 Figura 10: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras na variação da espessura das patas mensuradas antes e 3 após administração de carragenina 0,1% em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). 48 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade antiinflamatória Tabela 4: Variação da espessura das patas dos animais após injeção de carragenina ou introdução da agulha na pata (sham) e tratamento tópico Variação da espessura das patas (x 10-2 mm) Após injeção sham 2,6 ± 0,44 Após injeção de carragenina 5,9 ± 0,45** L. passerina 5% 1,5 ± 0,37 4,8 ± 0,47 L. passerina 10% 2,6 ± 0,90 3,7 ± 0,57* L. candelabrum 5% 1,6 ± 0,72 4,9 ± 1,01 L. candelabrum 10% 1,4 ± 0,44 3,9 ± 0,38* L. pinaster 5% 0,3 ± 0,17 2,3 ± 0,60* L. pinaster 10% 1,6 ± 0,64 3,4 ± 0,83* L. ericoides 5% 2,3 ± 1,76 4,6 ± 1,18 L. ericoides 10% 0,5 ± 0,13 6,1 ± 1,23 L. staavioides 5% 0,8 ± 0,25 6,3 ± 1,29 L. staavioides 10% 1,0 ± 0,29 5,6 ± 0,74 L. trichocarpha 5% 0,8 ± 0,38 2,9 ± 0,43* L. trichocarpha 10% 0,4 ± 0,15 3,7 ± 0,49* Tratamento tópico Pomada base Os valores representam a média + e.p.m. **P≤0,05 comparado ao grupo sham tratado com pomada base *P≤0,05 comparado ao grupo controle tratado com carragenina e pomada base (ANOVA seguido de teste Dunnett). 49 Luciana Souza Guzzo 6. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central 6.1. METODOLOGIA Para avaliação da atividade sobre o SNC foram utilizados camundongos albinos machos. Foram avaliadas as atividades dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocharpha nas doses 0,75 ou 1,50 g/kg. Foram utilizados dois grupos controle: 1) animais que receberam solução controle e 2) animais que receberam água destilada. Foi utilizada como droga padrão o diazepam na dose 10 mg/kg (1 mg/ml suspenso em 0,5% de CMC) (KITANO et al., 2005). Todas as soluções foram administradas por via oral utilizando uma cânula orogástrica. Foram utilizados três métodos de avaliação in vivo da atividade aguda sobre o SNC e os animais foram submetidos às avaliações nos tempos 0 (zero), 1, 2, 4 e 24 horas após a administração das soluções. 6.1.1. MÉTODO DO CAMPO ABERTO − OPEN-FIELD Foi utilizado o método proposto por TURNER (1972), com modificações, com o objetivo de avaliar a locomoção espontânea e atividade exploratória do animal. O campo aberto (Figura 11A) consiste em uma caixa quadrada de 3.600 cm2, demarcada por 16 quadriláteros de 225 cm2 com paredes laterais de 19,5 cm de altura. Os animais foram colocados individualmente em um dos quadrados em um dos cantos e por 5 min foram contados o número de quadrados invadidos e o número de vezes que o animal levantou apoiando-se nas patas posteriores, incluindo as vezes em que apoiou na parede lateral do campo aberto. 6.1.2. MÉTODO DA HASTE GIRANTE − ROTA-ROD O método da haste girante foi realizado utilizando o método descrito por DUNHAM & MIYA (1977) com o objetivo de avaliar a coordenação motora dos animais. A haste (Figura 11B) consiste em uma barra giratória horizontal de 2,8 cm de diâmetro colocada a 30 cm de altura, dividida em quatro seguimentos iguais por discos de 20 cm de diâmetro, acionada por um motor que confere uma rotação constante de aproximadamente 11 rpm. Os camundongos foram treinados no dia anterior ao experimento na haste em rotação, quando foram selecionados os animais capazes de 51 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central permanecer na haste por mais de 60 s por duas vezes. Foram mensurados o tempo de permanência do animal na haste e o número de quedas em 1 min. 6.1.3. MÉTODO DE TRAÇÃO O método de tração foi realizado de acordo com o método descrito por RUDZIK et al. (1973), com o objetivo de detectar atividade dos extratos de Lychnophoras sobre B o tônus muscular. O aparelho de tração (Figura 11C) consiste em um fio metálico horizontal estendido a 30 cm de altura, sustentado por duas barras laterais. Foi avaliado a porcentagem de animais com capacidade de se prender e sustentar no fio de metal com as patas anteriores e quando livre colocar uma das patas posteriores no fio em 5 s. 6.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO A análise dos efeitos das Lychnophoras sobre o SNC é importante, pois gera conhecimento científico para o uso seguro dessas espécies pela população, já que efeitos colaterais sobre o SNC não são desejáveis na maioria das condições. Com o objetivo de avaliar as atividades das espécies L. ericoides e L. trichocarpha sobre o SNC foram utilizados os métodos do campo aberto, da haste girante e de tração. No método do campo aberto, foi observado (Figura 12 e Tabela 5) que o extrato de L. ericoides na dose 1,50 g/kg induziu à redução significativa de 50,5% do número de quadrados percorridos pelos animais em 5 min em relação ao grupo controle 1 h após a administração do extrato, acompanhado de aumento progressivo da atividade locomotora dos animais que receberam esse extrato nos três tempos subseqüentes (tempos 2, 4 e 24 h). O extrato etanólico de L. trichocarpha (0,75 g/kg) no tempo 2 h (45,8%) e na dose 1,50 g/kg nos tempos 1 (68,6%), 2 (61,5%) e 4 h (53,1%), reduziu significativamente a locomoção espontânea dos animais sendo que as reduções provocadas em 2 h de análise para as duas doses foram similares à induzida pelo fármaco padrão. O diazepam, um fármaco benzodiazepínico agonista alostérico de receptores GABAA, foi utilizado como droga padrão por sua propriedade sedativa, causando redução significativa de 57,8% da locomoção dos animais 2 h após sua administração oral. FARKAS et al. (2005) em estudo da atividade do diazepam revelou que apesar do efeito sedativo desse fármaco em humanos ser bem conhecido, ele reduz 52 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central a atividade locomotora com potência relativamente menor em camundongos. Adicionalmente, como ainda observado na Tabela 5, todas as soluções utilizadas, causaram redução da locomoção dos animais em relação ao tempo controle (testes realizados antes da administração das soluções). A redução significativa do número de quadrados percorridos em relação ao tempo controle (0 h) foi observada após administração da solução controle em 2 h, e das soluções de L. ericoides e L. trichocarpha em ambas doses avaliadas nos tempos 1, 2 e 4 h após administração, sendo que este efeito para os animais que receberam L. ericoides (0,75 g/kg) e L. trichocarpha (1,50 g/kg) foi apresentado até o tempo de 24 h (Tabela 5). Essa redução da atividade locomotora para todos os grupos (incluindo o controle) se dá pois, em testes repetidos os animais são habituados ao campo aberto tendendo à redução da locomoção até atingir a estabilidade (CHOLERIS et al., 2001). Para demonstrar que essa redução não foi causada pela solução controle, foi realizado o mesmo experimento em animais que receberam água por via oral e o mesmo comportamento foi observado (Tabela 5). O extrato com maior capacidade em produzir esse efeito sedativo avaliado pelo método de campo aberto foi o da espécie L. trichocarpha. Os resultados para o extrato de L. ericoides estão em acordo com CERQUEIRA et al. (1987), que demonstraram redução do número de quadrados percorridos no método de campo aberto causada pela administração do extrato hidroalcoólico dessa espécie. O número de vezes que o animal levanta-se em 5 min também foi avaliado no campo aberto, o que reflete a capacidade exploratória dos animais. Os dados apresentados na Figura 13 e na Tabela 6 mostram que o extrato de L. trichocarpha na dose 0,75 g/kg no tempo 2 h (61,9%) e na dose 1,50 g/kg nos tempos 1 (87,5%), 2 (81,0%) e 4 h (67,9%) após administração, causaram inibição significativa da capacidade exploratória dos animais. A inibição ocorrida em decorrência da administração oral do extrato de L. trichocarpha (1,50 g/kg) foi similar à causada pelo diazepam, o qual para esse parâmetro avaliado, causou redução significativa em relação ao grupo controle em 1 (87,5%), 2 (95,2%) e 4 h (85,7%) após sua administração. A redução significativa do número de vezes que o animal levanta em relação ao tempo controle foi observada após administração das soluções dos extratos de L. ericoides (0,75 g/kg) e L. trichocarpha (1,50 g/kg) e do diazepam em todos os tempos avaliados. 53 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central A redução em relação ao tempo controle para os grupos que receberam os extratos de L. ericoides (1,50 g/kg) e L. trichocarpha (0,75 g/kg) foi significativa nos tempos 1 h e 1 e 2 h após a administração, respectivamente (Tabela 6). O método do campo aberto é utilizado por muitos autores para medir comportamento emocional (GRAY, 1979), tal como atividades exploratória e locomotora dos animais (ARCHER & BLACKMAN, 1971). A movimentação dos animais no campo aberto é sujeito a várias interpretações, sendo a principal a que reflete curiosidade ou alternativamente, uma tentativa de escape (ARCHER, 1973). Uma diminuição do número de quadrados percorridos e do número de vezes que o animal levanta revela um comportamento sedativo, que também é aceito como um parâmetro para avaliação das condições de ansiedade dos animais (RODRÍGUEZ et al., 1984). Segundo OZTURK et al. (1996) uma diminuição da locomoção espontânea é indicativa de excitabilidade reduzida com origem no SNC levando à sedação. Os extratos de L. ericoides e L. trichocarpha nas duas doses avaliadas e em todos os tempos de análise não causaram alteração significativa da coordenação motora e tônus muscular dos animais, avaliados nos métodos da haste girante (Figura 14 e Tabela 7) e tração (Figura 15 e Tabela 8), respectivamente. O diazepam também usado como droga padrão por sua propriedade miorrelaxante, induziu à redução da coordenação motora dos animais nos tempos 1 e 2 h e redução do tônus muscular nos tempos 1, 2, 4 e 24 h, evidenciado nos métodos de haste girante e de tração. O extrato de L. ericoides apresentou um efeito antinociceptivo ao estímulo químico (ácido acético) e térmico (placa quente). Esse efeito na presença desses dois estímulos é característico de analgésicos centrais tal como a morfina, que inibem a dor inflamatória e não-inflamatória (SILVESTRINI & PICCINELLI, 1969). Diante disso, supõe-se que o extrato de L. ericoides tenha propriedades morfinomiméticas, que pode explicar seu efeito depressor sobre o SNC observado nesse estudo. O mecanismo pelo qual os extratos de L. ericoides e L. trichocarpha exercem atividade sobre o SNC e os compostos presentes nessas espécies de Lychnophora responsáveis por essa atividade ainda é desconhecido. Sabe-se que a quercetina tal como outros flavonóides têm uma grande variedade de atividades biológicas (MIKSICEK et al., 1993; MIDDLETON & KANDASWAMI, 1994; HARBORNE & WILLIAMS, 2000) com ações neurofarmacológicas tais como analgesia, efeitos na 54 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central motilidade e sono (SPERONI & MINGHETTI, 1988; PICQ et al., 1991). Além disso, em estudos anteriores a quercetina apresentou atividade na modulação do metabolismo oxidativo neuronal (OYAMA et al., 1994) e efeitos proconvulsante, anticonvulsante, sedativo e ansiolítico (MARDER et al., 1995; MEDINA et al., 1998; GRIEBEL et al., 1999). A interação da quercetina com os canais iônicos do receptor de serotonina do tipo 3 (5-HT3), presente no sistema nervoso central e periférico já foi relatada (GOUTMAN et al., 2003; LEE et al., 2005). Os resultados da avaliação de atividades sobre o SNC sugerem a atividade sedativa dos extratos de L. ericoides e L. trichocarpha, embora não tenham causado perda de coordenação motora e redução do tônus muscular dos animais. Estudos farmacológicos e químicos devem ser realizados para caracterizar o mecanismo responsável por essa atividade sedativa e para identificar os princípios ativos responsáveis por tal atividade, seja para o seu uso terapêutico ou para fins de determinação da toxicidade. A análise da atividade sobre o SNC deve ser estendida para outras doses e espécies de Lychnophora para fornecer conhecimento seguro visando o uso racional dessas espécies pela população. 55 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central A B C Figura 11: Camundongo no campo aberto (A), haste girante (B) e aparelho de tração (C). 56 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central Número de quadrados percorridos em 5 min 150 Controle Diazepam 10 mg/kg L. ericoides 0,75 g/kg L. ericoides 1,50 g/kg 125 100 75 * 50 * 25 0 1 2 4 24 Tempo (h) Número de quadrados percorridos em 5 min 150 Controle Diazepam 10 mg/kg L. trichocarpha 0,75 g/kg L. trichocarpha 1,50 g/kg 125 100 75 50 * * ** * 1 2 4 25 0 24 Tempo (h) Figura 12: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre o número de quadrados percorridos pelos animais em 5 min analisado antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). 57 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central Número de vezes que o animal levanta 50 Controle Diazepam 10 mg/kg L. ericoides 0,75 g/kg L. ericoides 1,50 g/kg 40 30 20 10 * 0 1 * 2 * 4 24 Tempo (h) Número de vezes que o animal levanta 40 Controle Diazepam 10 mg/kg L. trichocarpha 0,75 g/kg L. trichocarpha 1,50 g/kg 30 20 ** * * * * * 1 2 4 10 0 24 Tempo (h) Figura 13: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre o número de vezes que o animal levanta em 5 min analisado antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett). 58 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central Tabela 5: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre o número de quadrados percorridos pelos animais em 5 min no método do campo aberto Tempo (h) Tratamento 0 1 2 4 24 Controle 123 ± 7,5 105 ± 10,3 83 ± 11,2+ 98 ± 11,4 105 ± 9,0 Água 110 ± 4,1 99 ± 12,4 90 ± 9,4 104 ± 16,8 100 ± 12,0 Diazepam 10 mg/kg 137 ± 7,8 91 ± 12,0 + 35 ± 8,7* + 65 ± 16,1 124 ± 12,1 L. ericoides 0,75 g/kg 122 ± 6,2 73 ± 12,8+ 59 ± 9,0+ 66 ± 9,2+ 71 ± 8,4+ L. ericoides 1,50 g/kg 129 ± 8,5 52 ± 14,7*+ 62 ± 14,6+ 71 ± 15,5+ 101 ± 13,0 L. trichocarpha 0,75 g/kg 121 ± 4,9 76 ± 15,9+ 45 ± 7,6*+ 68 ± 8,5+ 94 ± 9,2 107 ± 2,6 + + L. trichocarpha 1,50 g/kg 33 ± 6,6* + 32 ± 8,4* + 46 ± 7,6* 80 ± 8,5+ Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett) + P≤0,05 comparado ao tempo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett) Tabela 6: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre o número de vezes que o animal levanta em 5 min no método do campo aberto Tempo (h) Tratamento 0 1 2 4 24 Controle 31 ± 2,9 24 ± 3,8 21 ± 3,6 28 ± 4,3 33 ± 4,2 Água 22 ± 3,2 23 ± 4,7 21 ± 3,9 26 ± 5,7 26 ± 4,0 Diazepam 10 mg/kg 35 ± 4,4 + 3 ± 1,1* + 1 ± 0,6* + 4 ± 1,7* 21 ± 2,6+ L. ericoides 0,75 g/kg 33 ± 2,2 14 ± 3,5+ 10 ± 2,6+ 17 ± 2,7+ 18 ± 2,4+ L. ericoides 1,50 g/kg 35 ± 4,6 11 ± 5,8+ 16 ± 6,0 18 ± 6,0 33 ± 6,1 L. trichocarpha 0,75 g/kg 27 ± 3,7 + 13 ± 3,7 + 8 ± 2,3* 17 ± 3,9 24 ± 3,9 L. trichocarpha 1,50 g/kg 33 ± 3,5 3 ± 1,2*+ 4 ± 1,6*+ 9 ± 2,6*+ 24 ± 3,6+ Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett) + P≤0,05 comparado ao tempo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett) 59 Luciana Souza Guzzo Tempo de permanência do animal na haste girante (s) Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central 60 * 50 Controle Diazepam 10 mg/kg 40 * 30 L. ericoides 0,75 g/kg L. ericoides 1,50 g/kg 20 0 1 2 4 24 Tempo de permanência do animal na haste girante (s) Tempo (h) 60 * 50 Controle Diazepam 10 mg/kg L. trichocarpha 0,75 g/kg 40 * 30 L. trichocarpha 1,50 g/kg 20 0 1 2 4 24 Tempo (h) Figura 14: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre o tempo de permanência do animal na haste girante antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (teste Dunnet). 60 Luciana Souza Guzzo Porcentagem de animais que falharam no teste de tração Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central * 100 * Controle Diazepam 10 mg/kg L. ericoides 0,75 g/kg L. ericoides 1,50 g/kg * 75 50 * 25 0 0 1 2 4 24 Porcentagem de animais que falharam no teste de tração Tempo (h) * 100 * Controle Diazepam 10 mg/kg * 75 L. trichocarpha 0,75 g/kg L. trichocarpha 1,50 g/kg 50 * 25 0 0 1 2 4 24 Tempo (h) Figura 15: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre a força muscular dos animais avaliada no método de tração antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (teste Fisher). 61 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central Tabela 7: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre o tempo de permanência do animal na haste girante. Tempo (h) Tratamento 0 1 2 4 24 Controle 60 ± 0,0 60 ± 0,0 60 ± 0,0 58 ± 2,3 59 ± 0,5 Água 60 ± 0,0 60 ± 0,0 60 ± 0,0 60 ± 0,0 60 ± 0,0 Diazepam 10 mg/kg 60 ± 0,0 27 ± 5,5* 45 ±4,9* 56 ± 3,1 60 ± 0,0 L. ericoides 0,75 g/kg 60 ± 0,0 58 ± 1,8 59 ± 0,8 57 ± 2,1 59 ± 0,8 L. ericoides 1,50 g/kg 60 ±0,0 57 ±1,7 59 ± 1,2 60 ± 0,0 59 ± 1,3 L. trichocarpha 0,75 g/kg 60 ± 0,0 60 ± 0,5 60 ± 0,0 59 ± 0,8 58 ± 1,9 L. trichocarpha 1,50 g/kg 60 ± 0,0 60 ± 0,0 60 ± 0,4 59 ± 1,0 57 ± 2,7 Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett) Tabela 8: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre a força muscular dos animais no método de tração. Tempo (h) Tratamento 0 1 2 4 24 Controle 0 0 0 14,3 7,1 Água 0 0 0 0 10 Diazepam 10 mg/kg 0 100* 91,7* 83,3* 41,7 L. ericoides 0,75 g/kg 0 0 7,1 0 7,1 L. ericoides 1,50 g/kg 0 0 22,2 11,1 5,6 L. trichocarpha 0,75 g/kg 0 5,6 11,1 16,7 11,1 L. trichocarpha 1,50 g/kg 0 6,3 25 25 12,5 Dados apresentados como porcentagem de animais que falharam no teste. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (teste Fisher). 62 Luciana Souza Guzzo 7. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOVASCULAR Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade cardiovascular 7.1. METODOLOGIA 7.1.1. CONFECÇÃO DE CATETERES PARA IMPLANTAÇÃO INTRAVASCULAR Os cateteres foram preparados utilizando-se 15 cm de tubo de polietileno PE50 e 4,5 cm de tubo de polietileno PE10, soldados sob a ação do calor, utilizando-se um fio de aço para impedir a oclusão da luz. Os cateteres foram preenchidos com solução salina (NaCl 0,9%) heparinizada (10 U/ml) e ocluídos por pinos metálicos na extremidade PE50 antes de sua implantação. 7.1.2. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS Os animais foram anestesiados pelo pentobarbital sódico (70 mg/kg) por via i.p. Após a anestesia ter alcançado a profundidade adequada os animais foram traqueostomizados, utilizando-se uma cânula de polietileno, para permitir respiração espontânea adequada e em seguida, tiveram os cateteres intravenoso e intra-arterial implantados. A implantação dos cateteres intravasculares foi feita da seguinte forma: após tricotomia, assepsia e incisão na região inguinal, o feixe vásculo-nervoso foi, então, localizado, exposto e, em seguida, a artéria e a veia femorais foram isoladas por um fio duplo de algodão. Na parte proximal a artéria foi ocluída e após pequena incisão, a extremidade PE10 do cateter foi introduzida na artéria, ficando localizada na aorta abdominal, abaixo das artérias renais. O mesmo procedimento foi realizado para canulação da veia femoral, entretanto a oclusão não se fez necessária. Após introdução a extremidade da porção PE10 do cateter ficava localizada na veia cava inferior. 7.1.3. OBTENÇÃO DOS SINAIS DE ELETROCARDIOGRAMA E PRESSÃO ARTERIAL O sinal do eletrocardiograma (ECG) foi obtido utilizando agulhas hipodérmicas de aço inoxidável como sensores. As agulhas foram inseridas no tecido subcutâneo do membro superior direito e inferior esquerdo, com o objetivo de mensurar a diferença de potencial relativa à derivação DII. O registro da PA foi realizado utilizando um transdutor de pressão modelo P23XL (Spectramed, EUA). Esse transdutor foi conectado ao cateter introduzido na 64 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade cardiovascular artéria femoral do animal. Os sensores de ECG e o transdutor de pressão arterial foram, então, conectados a um sistema condicionador de sinais (desenvolvidos no Departamento de Engenharia Elétrica da Universidade Federal de Minas Gerais). Os sinais obtidos desse sistema foram amostrados em tempo real a uma freqüência de 1200 Hz por uma placa conversora analógico-digital Windaq Board (modelo DI 200 USA). 1 2 3 Figura 16: Sistema de Aquisição de ECG e PA 1) Visão geral do sistema; 2) Visão de um animal com os eletrodos inseridos no tecido subcutâneo, indicados pela seta; 3) Registro de ECG e PA obtidos a partir do animal em experimentação. 7.1.4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL Os animais foram previamente tratados com extrato etanólico de L. ericoides, nas doses 0,75 ou 1,50 g/kg ou veículo constituído de Capryol, água destilada e 0,5% de CMC. Todas as soluções foram administradas por via oral e após 30 min os animais foram anestesiados e submetidos ao procedimento cirúrgico. Os animais foram conectados ao sistema e deixados por 5 min para estabilização antes do início do experimento. Os parâmetros cardiovasculares foram registrados por 65 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade cardiovascular 30 min, de 90 a 120 min após administração das soluções. Foram obtidos registros de 30 s, a cada 5 min (Figura 17). Figura 17: Esquema do protocolo experimental de avaliação da cardiovascular. atividade 7.1.5. ANÁLISE DOS REGISTROS Os experimentos foram inicialmente analisados por inspeção visual do registro com auxílio do software Win/Daq, utilizando-se diversos fatores de compressão para os sinais. Posteriormente foram selecionados segmentos em janelas de 120 s a partir dos registros de 30 s feitos a cada 5 min permitindo a análise de um número variado de ciclos cardíacos completos, dependendo da FC do animal. Os registros armazenados foram analisados off-line e incluíram medidas do intervalo RR (intervalo entre duas ondas R) extraídos do traçado do ECG, PAS e PAD obtidas a partir do sinal de PA (Figura 18). 66 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade cardiovascular Figura 18: Traçado do ECG e PA de um rato Wistar apresentando os parâmetros analisados (RR, PAS e PAD). 7.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO Embora a cardiotoxicidade possa ser caracterizada pela presença de um ou mais fatores tais como hipertensão arterial, cardiomiopatia, bradiarritmia, além do prolongamento do intervalo QT do ECG (YOUSSEF & LINKS, 2005), no presente estudo foram avaliados apenas os níveis pressóricos e FC, uma vez que hipertensão arterial é o fator de risco mais prevalente e que mais contribui para o desenvolvimento das doenças cardiovasculares (KANNEL, 1996). A avaliação dos parâmetros cardiovasculares mostrou que o extrato de L. ericoides na dose 1,50 g/kg induziu à hipertensão em todo os tempos avaliados e apresentou efeito cronotrópico positivo de 95 a 120 min após a administração oral. Esses efeitos foram evidenciados pelo aumento da PAS, PAD e da FC (Figura 19 e 67 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade cardiovascular Tabela 9) dos animais, o que não ocorreu com os animais que receberam o extrato de L. ericoides na dose 0,75 g/kg e solução controle. A espécie L. ericoides contém flavonóides como constituintes (BORELLA et al., 1998), os quais apresentam efeitos antioxidante (RICE-EVANS & PACKER, 1998), antiagregante plaquetário (GRYGLEWSKI et al., 1987), vasodiltador (DUARTE et al., 1993a; b) e hipotensor (DUARTE et al., 2001), efeitos esses que indicam proteção cardiovascular. No entanto, tais efeitos contrapõem os efeitos observados após a administração oral do extrato de L. ericoides na maior dose avaliada, o que pressupõe que os flavonóides não estejam envolvidos em tal efeito. Pode ser sugerido que a espécie L. ericoides, a qual apresentou atividade analgésica no presente estudo e que já teve a atividade antiinflamatória de seus constituintes demonstrada (RÜNGELER et al., 1999) tenha atividade cardiovascular semelhante aos AINEs, os quais podem induzir à elevação da PA ou mesmo interferir na eficácia dos anti-hipertensivos (JOHNSON et al., 1994; ARMSTRONG & MALONE, 2003). O principal mecanismo atribuído a esse efeito dos AINEs é a inibição da síntese de PGs, o que leva à retenção de sódio, embora essa não seja a única explicação para tal interação (PLAVINIK, 2002). As PGs intensificam a vasodilatação e atenuam os efeitos vasoconstritores, portanto, alguns AINEs, podem interferir no tônus dependente das PGs nos leitos vasculares renal e extra-renal que medeiam a ação antihipertensiva de alguns fármacos (ARMSTRONG & MALONE, 2003; FORTES & NIGRO, 2005). O presente estudo é de grande relevância, pois demonstra pela primeira vez a atividade cardiovascular in vivo da administração oral do extrato de uma espécie de Lychnophora. Os resultados mostram claramente que o uso de extrato de L. ericoides em doses maiores pode contribuir para o desenvolvimento de um quadro de hipertensão arterial, agravar um quadro de hipertensão já instalado ou ainda pode se supor que o seu uso pode levar à ineficácia de um tratamento hipertensivo. Estudos posteriores devem ser realizados para avaliação de outros parâmetros cardiovasculares tal como a análise do ECG e estudos in vitro, sendo necessário também que esses estudos sejam realizados em outras doses e a longo prazo, para investigar outros possíveis efeitos cardiotóxicos e demonstrar os mecanismos 68 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade cardiovascular envolvidos na ação hipertensiva e cronotrópica positiva do extrato de L. ericoides. Estudos adicionais também são necessários para isolamento e caracterização dos constituintes químicos responsáveis por tais atividades. Além disso, considerando que outras espécies de Lychnophora também são usadas pela população é de grande importância a avaliação da atividade cardiovascular para outras espécies para fornecer conhecimento seguro visando o uso racional das Lychnophoras pela população. 69 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade cardiovascular A 170 PAS (mmHg) 160 150 * * 90 95 * * * * * 100 105 110 115 120 Controle L. ericoides 0,75 g/kg L. ericoides 1,50 g/kg 140 130 120 110 100 90 Tempo após a administração (min) B 110 PAD (mmHg) 100 * * 90 95 * * * * * 105 110 115 120 90 Controle L. ericoides 0,75 g/kg L. ericoides 1,50 g/kg 80 70 60 50 100 Tempo após a administração (min) C 425 FC (bpm) 400 * * * * * * 95 100 105 110 115 120 375 Controle L. ericoides 0,75 g/kg L. ericoides 1,50 g/kg 350 325 300 275 90 Tempo após a administração (min) Figura 19: Efeito do extrato etanólico de L. ericoides sobre a PAS (A), PAD (B) e FC (C) dos animais. Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett) 70 Luciana Souza Guzzo Avaliação da atividade cardiovascular Tabela 9: Valores de pressão arterial e freqüência cardíaca avaliados, em intervalos de 5 min de 90 à 120 min após administração por via oral do extrato de L. ericoides em ratos Wistar. Tratamento Parâmetros Tempo (min) Controle PAS (mmHg) 0 5 10 15 20 25 30 PAD (mmHg) 0 5 10 15 20 25 30 FC (bpm) 0 5 10 15 20 25 30 115 ± 6,8 112 ± 6,8 116 ± 7,8 117 ± 7,2 111 ± 7,4 112 ± 7,4 113 ± 8,1 L. ericoides 0,75 g/kg 113 ± 7,9 111 ± 6,3 114 ± 6,3 114 ± 6,5 111 ± 8,0 113 ± 9,3 113 ± 8,8 L. ericoides 1,50 g/kg 147 ± 4,8* 145 ± 4,4* 148 ± 6,1* 148 ± 4,2* 148 ± 4,7* 146 ± 3,6* 148 ± 3,3* 77 ± 4,9 78 ± 5,8 78 ± 6,3 77 ± 5,9 74 ± 5,2 74 ± 6,0 74 ± 6,4 71 ± 6,7 70 ± 5,5 72 ± 5,3 72 ± 6,1 69 ± 6,3 72 ± 7,9 72 ± 7,3 98 ± 4,7* 98 ± 4,5* 96 ± 4,3* 100 ± 3,9* 98 ± 4,7* 99 ± 3,5* 98 ± 3,2* 341 ± 11,3 341 ± 13,4 336 ± 10,8 334 ± 9,0 334 ± 9,8 331 ± 8,5 327 ± 8,8 328 ± 8,5 323 ± 9,1 323 ± 9,1 317 ± 10,3 318 ± 10,8 312 ± 10,8 320 ± 13,2 Os valores representam a média + e.p.m. *P≤0,05 comparado ao (ANOVA seguido de teste Dunnett) 71 380 ± 8,0 383 ±6,7* 382 ±6,9* 383 ± 7,2* 384 ± 7,0* 386 ± 6,6* 385 ± 6,9* grupo controle Luciana Souza Guzzo 8. DISCUSSÃO GERAL Luciana Souza Guzzo Discussão Geral DISCUSSÃO GERAL O presente trabalho demonstrou comparativamente a atividade antinociceptiva, por via oral, e antiinflamatória, por via tópica, de extratos etanólicos brutos de espécies de Lychnophora. As espécies cujas atividades foram demonstradas podem futuramente, após passarem por estudos adicionais preconizados pelo Ministério da Saúde (BRASIL, 2000), serem registradas como fitoterápicos, ampliando o arsenal terapêutico no tratamento da dor e inflamação. O objetivo primordial do uso de fitoterápicos na medicina humana não é substituir medicamentos comercializados e já registrados, mas sim aumentar a opção terapêutica dos profissionais de saúde, ofertando medicamentos equivalentes também registrados, talvez mais baratos, com espectros de ação mais adequados ou com indicações terapêuticas complementares às medicações já existentes, mas sempre em estrita obediência aos preceitos éticos que regem o emprego de xenobióticos na espécie humana. Objetivos secundários, mas não menos importantes, são a valorização das tradições populares e o fornecimento de substrato autóctone para o desenvolvimento da indústria farmacêutica local. A descoberta de fontes naturais que substituam compostos químicos usualmente importados, aliada ao desenvolvimento de fitoterápicos de fabricação nacional, pode ter conseqüências sócio-econômicas significativas, além de aumentar a autonomia regional para a criação e gerenciamento de políticas de saúde (LAPA et al., 2004). No presente trabalho, seguindo uma abordagem etnofarmacológica, a avaliação pré-clínica dos extratos brutos das espécies de Lychnophora foi baseada no uso popular dessas plantas como analgésico e antiinflamatório. Ainda dentro do estudo farmacológico pré-clínico de uma planta está a avaliação de seus efeitos adversos em ensaios toxicológicos in vivo. É nesse contexto, que o presente estudo, teve como objetivo, além de determinar as atividades terapêuticas, a saber, atividades antinociceptiva e antiinflamatória de extratos etanólicos de seis espécies de Lychnophora, avaliar a atividade sobre o SNC dos extratos de duas dessas espécies, L. ericoides escolhida por ser a mais utilizada pela população e L. trichocarpha por ter apresentado efeito antinociceptivo e antiinflamatório no presente estudo e a avaliação da atividade cardiovascular da espécie L. ericoides. 73 Luciana Souza Guzzo Discussão Geral A atividade sedativa das duas espécies avaliadas foi demonstrada no método do campo aberto e as atividades hipertensiva e cronotrópica positiva foi detectada para a maior dose de L. ericoides avaliada. Esses efeitos adversos agudos devem ser considerados e avaliados mais detalhadamente em outros métodos e in vitro, além de suas determinações a longo prazo (crônica), para que seja determinada a segurança terapêutica do extrato dessas espécies de Lychnophora, indicando assim o grau de confiança a ser depositado nelas. Estudos em outros modelos animais também devem ser realizados, uma vez que, segundo a Food and Drug Administration, a toxicidade aguda deve ser avaliada pelo menos em duas espécies de animais experimentais (FDA, 2007). Além disso, o efeito sedativo apresentado pelas espécies L. ericoides e L. trichocarpha deve ser considerado como também um possível efeito terapêutico dessas espécies. Embora o Tween 80 e o DMSO sejam amplamente utilizados na dissolução de substâncias hidrofóbicas em experimentos toxicológicos e farmacológicos, no presente estudo, esses solventes foram utilizados nos experimentos de avaliação das atividades antinociceptiva e antiinflamatória. Por seus efeitos cardiovasculares e sobre o SNC não foram utilizados nos demais experimentos. VARMA et al. (1985) demonstraram que o Tween 80 apresenta atividade depressora sobre o SNC em ratos e camundongos em doses superiores a 1 ml/kg e atividade hipotensora por via i.v. em cães. Atividade cardiovascular (BAZIL et al., 1993; KRAMER et al., 1995) e neurotoxicidade sistêmica (CAVALLETI et al., 2000) também foram descritas para o DMSO em experimentos in vivo. Embora essas atividades relatadas tenham sido conseqüências da administração crônica do DMSO ou da administração do Tween 80 por via oral ou i.p. em doses altas ou ainda por via i.v., condições essas diferentes das utilizadas no presente trabalho, foi utilizado o monoglicerídeo Capryol, ou seja, propilenoglicol monocaprilato, um excipiente inerte usado para solubilizar formulações líquidas. Outro aspecto importante foi observado durante a avaliação da atividade cardiovascular. Embora, a administração oral do extrato etanólico de L. ericoides em ratos tenha sido realizada com intuito de observar os parâmetros cardiovasculares, pôde ser observado que 40% animais que receberam L. ericoides (0,75 g/kg) e 83% dos animais que receberam L. ericoides (1,50 g/kg) apresentaram diarréia durante o experimento o que não foi observado para os animais que receberam solução controle. 74 Luciana Souza Guzzo Discussão Geral A avaliação desse efeito do extrato de L. ericoides tal como de seu efeito cardiovascular e de seu efeito sedativo apresentado também pela espécie L. trichocarpha deve ser posteriormente estendido às outras doses e espécies de Lychnophora para fornecer conhecimento seguro visando o uso racional dessas espécies pela população. O presente estudo é relevante, pois demonstrou pela primeira vez, as atividades antinociceptiva e antiinflamatória comparativa de seis espécies de Lychnophora nativas do Brasil, demonstrando que nem todas as espécies avaliadas apresentam tais atividades, sendo importante, então, o conhecimento das características morfológicas e propriedades farmacológicas dessas espécies para correta identificação e uso direcionado pela população, diminuindo assim, o seu uso indiscriminado o que pode ajudar a evitar a extinção dessas espécies. Para melhor esclarecimento das atividades antinociceptiva, antiinflamatória, sedativa e cardiovascular dos extratos de Lychnophoras, estudos farmacológicos e químicos devem ser realizados para caracterizar os mecanismos e identificar os princípios ativos responsáveis por tais atividades. Esses princípios ativos se identificados e tendo suas propriedades farmacológicas comprovadas podem, tal como o extrato bruto das espécies de Lychnophora, ampliar o arsenal terapêutico no tratamento da dor e inflamação. Esses conhecimentos são importantes para a promoção do uso racional das Lychnophoras pela população. 75 Luciana Souza Guzzo 9. CONCLUSÕES Luciana Souza Guzzo Conclusões CONCLUSÕES Os extratos etanólicos das espécies L. pinaster na dose 0,75 g/kg e de L. ericoides na dose 1,50 g/kg, administrados por via oral, apresentaram efeito antinociceptivo agudo no método da placa quente, evidenciado pelo aumento no tempo reação do animal para lamber as patas. Os extratos etanólicos das espécies L. passerina, L. candelabrum e L. pinaster na dose 0,75 g/kg e de L. ericoides e L. trichocarpha em ambas as doses avaliadas (0,75 e 1,50 g/kg) administrados por via oral, apresentaram efeito antinociceptivo agudo no método de contorções induzidas pelo ácido acético, evidenciado pela redução do número de contorções dos animais. O paquímetro mostrou-se tão efetivo quanto o pletismômetro na mensuração do edema de pata induzido pela carragenina 1% em camundongos A administração tópica das pomadas de L. pinaster e L. trichocarpha em ambas concentrações avaliadas (5 e 10%) e de L. passerina e L. candelabrum 10% reduziram significativamente o edema de pata mensurado 3 h após a administração de carragenina 0,1%, evidenciando atividade antiinflamatória desses extratos. Os extratos etanólicos de L. ericoides (1,50 g/kg) em 1 h, de L. trichocarpha na dose 0,75 g/kg em 2 h e na dose 1,50 g/kg nos tempos 1, 2 e 4 h após a administração oral, causaram inibição da atividade locomotora dos animais em relação ao grupo controle, evidenciada pela redução significativa do número de quadrados percorridos pelos animais em 5 min no método do campo aberto. Os extratos etanólicos de L. ericoides (0,75 g/kg) em 24 h, de L. trichocarpha na dose 0,75 g/kg em 2 h e na dose 1,50 g/kg nos tempos 1, 2 e 4 h após a administração oral, causaram redução da capacidade exploratória dos animais em relação ao grupo controle, evidenciada pela redução significativa do número de vezes que o animal levanta em 5 min no método do campo aberto. 77 Luciana Souza Guzzo Conclusões A redução da capacidade exploratória tal como da locomoção espontânea dos animais provocada pela administração oral dos extratos de L. ericoides e de L. trichocarpha são indicativas de atividade sedativa desses extratos. Os extratos de L. ericoides e L. trichocarpha em ambas doses avaliadas (0,75 e 1,50 g/kg) e em todos os tempos avaliados não causaram alteração significativa da coordenação motora e do tônus muscular dos animais, avaliados nos métodos da haste girante e tração, respectivamente. A avaliação dos parâmetros cardiovasculares revelaram que o extrato de L. ericoides na dose 1,50 g/kg, administrado por via oral, apresentou efeito hipertensivo e cronotrópico positivo agudo em ratos normotensos. 78 Luciana Souza Guzzo 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Luciana Souza Guzzo Referências Bibliográficas REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABIFITO – Associação Brasileira de Indústrias de Fitoterápicos, 2001. Perspectivas do setor de fitoterápicos. In: IBAMA/CENARGEN. Reunião Técnica sobre recursos genéticos de plantas medicinais e aromáticas – Estratégias para conservação e manejo sustentável, 1. Relatório (não publicado), Brasília. AHMAD, M.M., QURESHI, S., SHAH, A., QAZI, N.S., RAO, R.M., ALBAKIRI, M., 1983. Anti-inflammatory activity of Caralluma tuberculata alcoholic extract. Fitoterapia 46, 357–360. AHMADIANI, A., FEREIDONI, M., SEMNANIAN, S., KAMALINEJAD, M., SAREMI, S., 1998. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Sambucus ebulus rhizome extract in rats. 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