universidade de são paulo faculdade de medicina de ribeirão preto
Transcrição
universidade de são paulo faculdade de medicina de ribeirão preto
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DO INTERFERON-ALFA E DE INIBIDORES DA INOSINA MONOFOSFATO DESIDROGENASE SOBRE ORTHOBUNYAVIRUS BRASILEIROS MÁRCIA CRISTINA LIVONESI RIBEIRÃO PRETO – SP 2006 MÁRCIA CRISTINA LIVONESI ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DO INTERFERON-ALFA E DE INIBIDORES DA INOSINA MONOFOSFATO DESIDROGENASE SOBRE ORTHOBUNYAVIRUS BRASILEIROS Tese (Doutorado) apresentada ao curso de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor (a) em Ciências – Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo Ribeirão Preto – SP 2006 FICHA CATALOGRÁFICA Livonesi, Márcia Cristina Estudo da atividade antiviral do interferon-alfa e de inibidores da inosina monofosfato desidrogenase sobre Orthobunyavirus brasileiros. Ribeirão Preto, 2006. 172p.: il. ; 30cm Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Figueiredo, Luiz Tadeu Moraes. 1.Bunyaviridae 2.Ribavirina 3.Ácido Micofenólico 4.Interferon-alfa 5.Ensaio de placa 6.in vivo Trabalho realizado no Centro de Pesquisa em Virologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, com auxílio financeiro da CAPES e FAPESP (No 03/03682-3). EPÍGRAFE A Sabedoria brilha, não fenece; deixa-se ver facilmente pelos que a amam, deixa-se encontrar pelos que a procuram. Antecipa-se aos que a desejam, sendo a primeira a se dar a conhecer. Quem parte cedo à sua procura não se fadigará, pois a encontrará sentada à sua porta. Apaixonar-se por ela é a perfeição do discernimento, e quem velar por sua causa estará em breve sem inquietações. Pois ela deambula em busca dos que dela são dignos, aparece-lhes benevolamente nos caminhos e vai ao encontro deles em cada um de seus pensamentos. Sabedoria 6:12-16. DEDICATÓRIA À Santíssima Trindade e à Virgem Maria: “Celebrai o Senhor de todo o poder, porque Ele é bom e sua fidelidade é para sempre”. (Jeremias 33:11) Aos meus pais, Luiz e Orminda: imensurável amor que acolhe, aquece e reconforta... As minhas irmãs Denise e Liz: companheiras de viagem no trem da vida e cuja amizade facilita a transposição de qualquer obstáculo. A minha sobrinha Vitória: amor puro e sincero, cujo sorriso e alegria nos cerca de felicidade. Ao Ricardo: Sol que ilumina os meus dias, que aquece e preenche o meu coração de amor e felicidade. AMO TODOS VOCÊS AGRADECIMENTOS Aos meus pais (Luiz e Orminda), as minhas irmãs (Denise e Liz) e ao meu namorado (Ricardo) pelo carinho, apoio e ajuda em todos os momentos desta jornada. Ao Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo que me aceitou como aluna em seu laboratório, mesmo sem me conhecer; que me introduziu no mundo da virologia e que confiou a mim um trabalho nunca dantes realizado em seu laboratório e que me orgulhei muito de fazer. Obrigada pelos ensinamentos, confiança e amizade. Aos professores Francisco de Paula Pinheiro, Aramis Augusto Pinto, Yara Maria Lucisano Valim e Karla de Melo Lima por terem aceitado participar da minha banca, pela atenção com que me atenderam e pelas sugestões e correções referentes a esta tese. A todos os professores que passaram pela minha vida, cujos ensinamentos foram fundamentais para meu crescimento pessoal e profissional. A Ana Cristine S. Ferreira, pessoa exemplar que muito me ajudou tanto no mestrado como no doutorado. Mãe dedicada e amorosa que recebe e trata todos os alunos com muito carinho e atenção. Ana, agradeço de todo o coração o que você fez por mim, nunca vou esquecer... Obrigada. Aos funcionários da Faculdade de Medicina que sempre me receberam com um sorriso no rosto e que se tornaram pessoas preciosas para mim. Assim refiro-me a Rosângela, Ronaldo, Wander, Cristiane (Mila), “Gil”, “Pity”, Marli, Isa, Maria Helena, Lúcia(s), Maria Inês, Júlio, Ednelson, Sávio, Denise, Vânia e muitos, muitos outros. Aos funcionários da Secretaria de Pós-graduação, da Biblioteca Central, do Biotério Central e do Biotério do Anexo A pelos valiosos serviços prestados, pela atenção e paciência em nos atender. Aos funcionários e amigos do Centro de Pesquisa em Virologia que me ajudaram muito e que tornaram meus afazeres mais fáceis. Assim refirome a Soraya, Sueli, Paulo, Pavanelli, Regina, Andréa e Fernanda. Agradeço também a “Guina”, ao Thiago e a Estela que não trabalham mais neste departamento, mas que foram muito importantes para mim. Muito obrigada. Aos meus amigos e companheiros de jornada: Viviane, Marcos, Alessandra, Roberta, Veridiana, Juliana, Thalita, Mário, Neusa, Aline, Gelse, Laura, Nadiele, Aldo, Victor, Paula, Glauciane, Luzia, Raquel, Liz e Alberto. Agradeço a amizade, o carinho, as conversas descontraídas e algumas vezes sérias, a compreensão e apoio no dia-a-dia. “Eu teria muita coisa a te escrever, mas não quero fazê-lo com tinta e pena; pois espero rever-te em breve, e conversaremos pessoalmente” (Terceira Epístola de João). Aos colegas de cursos, de congressos e dos “corredores da vida” que me escolheram para fazer parte de suas vidas, mesmo que tenha sido por um pequeno instante. A todos que não citei, mas que de uma forma ou de outra contribuíram para a realização deste trabalho. A CAPES e a FAPESP pelo indispensável apoio financeiro. Aos animaizinhos cujo destino foi dado em prol da ciência... ABREVIAÇÕES E SIGLAS AIDS: síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) ATF: “activating transcription factor” Coronavirus-SARS: Coronavirus da síndrome respiratória aguda severa EMC: vírus da encefalomiocardite HCV: vírus da hepatite C HIV: vírus da imunodeficiência humana IRF: “interferon regulatory factor” ISGF3: “interferon-stimulated gene factor 3” JAK: Janus quinase MeM: meio mínimo essencial MHC: complexo de histocompatibilidade principal NFκB: fator nuclear κB PFU: unidade formadora de placa SBF: soro bovino fetal STAT: transdutores de sinal e ativadores de transcrição Th: linfócito T auxiliar (helper) TyK: tirosina quinase pertencente à família da JAK VSV: vírus da estomatite vesicular ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO 01 1.1. Gênero Orthobunyavirus 01 1.2. Drogas Antivirais 10 1.2.1. Inibidores de Inosina Monofosfato Desidrogenase 10 1.2.1.1. Ribavirina 12 1.2.1.2. Ácido Micofenólico 18 1.2.2. Interferon-alfa 22 2. OBJETIVOS 30 3. MATERIAL E MÉTODOS 31 3.1. Amostras virais 31 3.2. Estoque viral ou semente viral 31 3.3. Experimentos in vitro 32 3.3.1. Cultura de células 32 3.3.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vitro 33 3.3.3. Avaliação da toxicidade da RBV, do MPA e do IFN-α-2a sobre as células Vero E6 3.3.4. Otimização da metodologia do ensaio de placa 34 36 3.3.5. Avaliação da atividade antiviral da RBV, do MPA e do IFN-α-2a sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro 38 3.4. Experimentos in vivo 40 3.4.1. Animais 40 3.4.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vivo 40 3.4.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal 100 (DL100) pela via de inoculação intra-peritoneal 41 3.4.4. Determinação da concentração máxima tolerada dos medicamentos RBV e IFN-αA pelos camundongos suíços lactentes 41 3.4.5. Metodologia para determinar a atividade antiviral da RBV e do IFN-αA sobre animais infectados 3.5. Análise Estatística 4. RESULTADOS 4.1. Resultados referentes às padronizações 43 45 46 46 4.1.1. Concentração máxima não tóxica dos medicamentos RBV, MPA e IFN-α-2a para células Vero E6 46 4.1.2. Susceptibilidade de camundongos suíços à infecção intra-peritoneal pelos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM 51 4.1.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal 100 (DL100) para os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM em animais suíços através da via de inoculação intraperitoneal 54 4.1.4. Detecção e quantificação de vírus no sangue e no cérebro 56 4.1.5. Concentração máxima tolerada dos medicamentos RBV e IFN-αA pelos camundongos suíços lactentes 4.2. Resultados referentes à Ribavirina 60 64 4.2.1. Atividade antiviral da RBV sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro 64 4.2.2. Atividade antiviral da RBV sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM em experimentos in vivo 4.3. Resultados referentes ao Ácido Micofenólico 70 73 4.3.1. Avaliação da capacidade antiviral do MPA sobre OROV,CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro 73 4.3.2. Avaliação da capacidade antiviral da RBV e do MPA quando utilizados concomitantemente sobre os vírus ORO, CAR e GRO 4.4. Resultados referentes ao Interferon-alfa 79 83 4.4.1. Atividade antiviral do IFN-α sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM in vitro 83 4.4.2. Atividade antiviral do IFN-α sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV em experimentos in vivo 87 5. DISCUSSÃO 96 6. CONCLUSÕES 112 7. RESUMO 114 8. ABSTRACT 115 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 116 10. ANEXOS 136 10.1. Artigo referente aos resultados de Ribavirina 136 10.2. Artigo referente aos resultados do Ácido Micofenólico 155 10.3. Carta de aprovação Experimentação Animal da Comissão de Ética em 171 1 1. INTRODUÇÃO 1.1. Gênero Orthobunyavirus O gênero Orthobunyavirus pertence à família Bunyaviridae, a qual compreende outros quatro gêneros: Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus (CALISHER, 1996; ELLIOT, 2000). A grande maioria destes vírus é transmitida por mosquitos, flebótomos ou carrapatos, com exceção dos Hantavirus que infectam roedores e possuem mecanismo de transmissão relacionado à inalação de aerossóis proveniente das excretas destes animais (SCHMALJOHN & HJELLE, 1997). Os vírus da família Bunyaviridae são esféricos, envelopados, medindo cerca de 80 a 120 nm, possuindo na sua superfície projeções glicoprotéicas (Figura 1) (ELLIOT, 1997). Seu genoma é constituído por RNA de fita simples de polaridade negativa, tri-segmentado, denominado de grande (L), médio (M) e pequeno (S), sendo que este último pode atuar ainda de forma “ambisense” em processo replicativo (ELLIOT, 1997). O segmento L origina a RNA polimerase viral (ou proteína L), enquanto o segmento M produz uma poliproteína que é clivada formando as glicoproteínas G1 e G2. O segmento M também produz uma proteína não estrutural, denominada NSm, enquanto o segmento S é responsável por originar a proteína do nucleocapsídio (proteína N) e uma pequena proteína não estrutural denominada NSs (ELLIOT, 1997). 2 Figura 1: Estrutura esquemática dos vírus pertencentes à família Bunyaviridae. L, M e S são os RNAs do vírus, a esfera em cor verde é a polimerase viral. (Fonte: www.stanford.edu/group/virus/bunya). A infecção por vírus da família Bunyaviridae inicia-se pela adsorção do microrganismo à membrana celular tendo como ligantes a proteína G1 para células de vertebrados e a proteína G2 para células de artrópodes. Os vírus penetram na célula, provavelmente por endocitose e fundem seu envelope às membranas endossômicas o que permite ao nucleocapsídio viral atingir o citoplasma (Figura 2). Primeiramente, utilizando a polimerase viral, ocorre uma transcrição primária do RNA de polaridade negativa (-) do vírus para RNA mensageiro (+) e RNA complementar (+). Posteriormente, a polimerase viral inicia a transcrição do RNA complementar (+) para RNA (-) encapsidado, originando o genoma da progênie viral (SCHMALJOHN, 1996). Enquanto isso, ribossomos livres fazem a tradução dos segmentos L, M e S dos RNAs mensageiros. Por fim, a montagem viral ocorre após o acúmulo das glicoproteínas G1 e G2 junto ao aparelho de Golgi, do qual a partícula viral brota e a progênie viral é liberada por pinocitose reversa com fusão das membranas das vesículas 3 citoplasmáticas à membrana celular (SCHMALJOHN, 1996). A partícula viral proveniente do aparelho de Golgi pode também unir-se diretamente à membrana celular alcançando o meio exterior, como uma maneira alternativa de completar o processo replicativo (ELLIOT, 1997). Figura 2: Esquema do processo replicativo dos vírus pertencentes à família Bunyaviridae. (Fonte: SCHMALJOHN, 1996). Uma vez no organismo do hospedeiro, os vírus da família Bunyaviridae podem causar uma série de sinais e sintomas que variam de acordo com o agente viral, podendo muitas vezes causar desde encefalites até febres hemorrágicas, como ocorre, por exemplo, nas infecções causadas pelos vírus La Crosse, Hantaan, febre do Vale Rift, febre 4 hemorrágica do Crimean-Congo e hantavirus do Novo Mundo (MANGIAFICO et al., 1988; ELLIOT, 1997). No Brasil Orthobunyavirus, foram sendo o isoladas mais dezenas importante de do vírus ponto do de gênero vista epidemiológico, o vírus Oropouche, por causar extensas epidemias na região Amazônica (VASCONCELOS et al., 1992), sendo superado apenas pelo dengue em número de casos notificados (VASCONCELOS et al., 1992; DIXON et al., 1981; PINHEIRO et al., 1982). O vírus Oropouche foi isolado pela primeira vez em 1955, em Trinidad, a partir do sangue de um morador da localidade de Vega de Oropouche (ANDERSON et al., 1961). No Brasil, o vírus foi isolado pela primeira vez em 1960, do sangue de uma preguiça (Bradypus tridactylus) e de um “pool” de Aedes serratus capturados nas margens da rodovia Belém-Brasília. O vírus Oropouche mantém-se na natureza utilizando 2 ciclos, um urbano e outro silvestre. O ciclo silvestre, que mantém o vírus originalmente na natureza, envolve como reservatórios 95 espécies de animais que incluem diversas aves silvestres, macacos e preguiças. Suspeita-se que o mosquito Aedes serratus possa ser o vetor silvestre do vírus Oropouche. O ciclo urbano, provavelmente, ocorreu como uma adaptação rápida do vírus às localidades ribeirinhas amazônicas, o que levou à emergência de uma nova doença humana epidêmica, a febre do Oropouche. As epidemias costumam ocorrer nas estações chuvosas, quando o vírus seria trazido do meio silvestre às comunidades urbanas, sendo transmitido aos seres humanos pelo mosquito Culicoides paraensis (maruim) (PINHEIRO et al., 1981; ROBERTS et al., 1981). 5 As epidemias de febre do Oropouche são extensas e explosivas acometendo cidades e vilarejos tanto da região Amazônica como do Planalto Central (GONZALEZ-SCARANO & NATHANSON, 1996; KINNEY & CALISHER, 1981). Estima-se em mais de meio milhão o número de casos ocorridos no Brasil nos últimos 30 anos e, além do Brasil, há registros de ocorrências de infecção pelo vírus Oropouche no Panamá, Peru, Suriname e Trinidad (PINHEIRO et al., 2004). Evidências sorológicas demonstraram que o vírus pode circular eventualmente em outras regiões do Brasil, como no interior do Estado de São Paulo em que 2 indivíduos apresentaram anticorpos para o Oropouche (FIGUEIREDO et al., 1986). O vírus Oropouche apresenta grande capacidade de adaptação, existindo o risco de epidemias da febre do Oropouche em outras regiões brasileiras, uma vez que o mosquito transmissor, conhecido por maruim, é abundante nas regiões litorâneas (ANDERSON et al., 1961) e pelo fato do vírus ter sido recentemente isolado de um macaco do gênero Callithrix sp na região sudeste do Brasil (NUNES et al., 2005). A patogenia da infecção pelo arbovírus Oropouche é pouco conhecida. Sabe-se que a infecção é sistêmica e provavelmente, viscerotrópica, indicando que no quadro clínico agudo febril deve haver a participação de substâncias mediadoras de reação de fase aguda, incluindo as citocinas: TNF-α, IFNs e IL-1, além de quimiocinas. Contudo, as células que participam da replicação viral não são conhecidas (ARAÚJO et al., 1978). A febre do Oropouche tem período de incubação de 4 a 8 dias e se caracteriza por quadro abrupto de febre de 39 a 40oC, mal-estar, 6 cefaléia, anorexia, mialgias e artralgias generalizadas, tonturas, fotofobia, prostração e, em 5% dos casos, exantema máculo-papular em tórax, dorso, braços e pernas. Congestão conjuntival, dor retro-orbitária, tosse, coriza, náuseas e diarréia são ocasionalmente descritas. O quadro clínico perdura por 2 a 5 dias, mas as mialgias, a astenia e, em alguns casos a cefaléia, pode prolongar-se por até um mês. Também, recidiva dos sintomas acontece em até 60% dos pacientes entre 10 a 14 dias após cessar o quadro inicial (PINHEIRO et al., 1982). Meningite linfomonocitária é um achado freqüente nos surtos de febre do Oropouche e o vírus já foi, inclusive, isolado de líquor (PINHEIRO et al., 1982). Esta meningite ocorre comumente na 2a semana de doença, tendo evolução benigna. Viremia é achado praticamente universal nos dois primeiros dias de doença, mas declina rapidamente podendo o isolamento viral ocorrer até o 5o ou 6o dia de doença (PINHEIRO et al., 1981 e 1997). A febre do Oropouche na gestação, provavelmente, se associou a abortamento em 2 de 9 grávidas em que a virose ocorreu no segundo mês de gravidez (PINHEIRO et al., 1997). Embora não pareça causar mortalidade importante, a febre por Oropouche causa grande morbidade, com grande impacto econômico e social (VASCONCELOS et al., 1989 e 1992; PINHEIRO et al., 1981 e 1982), uma vez que os pacientes precisam ficar acamados e muitas vezes afluem em grande número aos hospitais, chegando a causar total congestionamento dos mesmos. Além do vírus Oropouche, no Brasil foram isolados outros Orthobunyavirus que causam doença febril na espécie humana, dentre 7 eles podemos citar: vírus Caraparu, vírus Guamá, vírus Guaroa e vírus Tacaiuma. O vírus Caraparu foi primeiramente isolado na região Amazônica (KARABATSOS, 1985) e posteriormente na Mata Atlântica do estado de São Paulo, principalmente na região do Vale do Ribeira, onde existe uma alta prevalência de pessoas soropositivas para este vírus (IVERSSON, 1994). A febre do Caraparu é uma doença de início súbito, apresentando como sintomas, febre alta, cefaléia, mialgias, dor retroocular e fotofobia, que pode ter duração de 4 a 5 dias com evolução para a cura (VASCONCELOS et al., 1998). Estudos demonstraram que o vírus Caraparu pode ter como hospedeiros, tanto roedores silvestres (Akodon, Nectomys, marsupiais Oryzomys, Oxymecterus (Didelphis marsupialis) e Coendou pelo fato milanurus), dos como mesmos terem apresentado anticorpos anti-Caraparu. Além disso, acredita-se que mosquitos Culicidae possam ser os vetores, pois o vírus foi isolado de mosquitos da espécie Culex sacchettae (VASCONCELOS et al., 1992). O vírus Guamá, primeiramente identificado em Trinidad (JONKERS et al., 1968), tem sido isolado de seres humanos na região Amazônica, apresentando como sintomas: febre moderada, calafrios intensos, mal-estar, tonturas, cefaléia holocraniana, mialgias, artralgias, anorexia, fotofobia e dor à movimentação dos olhos. A duração dos sintomas é de aproximadamente 5 dias e evolui para a cura (VASCONCELOS et al., 1992 e 1998; PINHEIRO et al., 1985). Acredita-se que o ciclo silvático deste vírus envolva Culex portesi como vetor e vários 8 roedores como reservatórios (Oryzomys e Zygodontomys) (JONKERS et al., 1968). O vírus Guaroa foi descrito pela primeira vez por GROOT e colaboradores, em 1959, sendo primeiramente isolado em habitantes da Colômbia. No Brasil, o vírus Guaroa foi isolado pela primeira vez a partir da biópsia de fígado de um paciente que apresentava hepatopatia, paralisia e queda de cabelos. Posteriormente, evidências sorológicas demonstraram a presença deste vírus tanto na região Amazônica, onde se encontrou uma alta prevalência de pessoas soropositivas (8 a 18%) (PINHEIRO, 1985; IVERSSON, 1994), quanto no interior do Estado de São Paulo (FIGUEIREDO et al., 1986). A febre do Guaroa tem início abrupto com febre elevada (39oC a 40oC), calafrios, cefaléia e mialgias, que podem durar por 3 a 5 dias, apresentando evolução benigna. Este vírus tem aves silvestres como reservatórios e mosquitos Anopheles como vetores (KARABATSOS, 1985; VASCONCELOS et al., 1992 e 1998; PINHEIRO et al., 1997). O vírus Tacaiuma foi encontrado em diversos países como Argentina, Guiana Francesa, Suriname e Brasil (Van TONGEREN, 1967; KARABATSOS, 1985; SABATTINI et al., 1965). No Brasil, anticorpos para o vírus Tacaiuma foram encontrados em seres humanos, cavalos, morcegos, roedores silvestres e pássaros, enquanto isolamento viral ocorreu a partir de amostras de sangue de pessoas febris residentes na região norte do país, de macacos Cebus apella e de mosquitos dos gêneros Haemagogos sp e Anopheles sp. (KARABATSOS, 1985; SABATTINI et al., 1965). Estes artrópodes são considerados os vetores do vírus Tacaiuma na 9 região Amazônica. Na década de 80, em um inquérito sorológico para arbovírus na região de Ribeirão Preto, estado de São Paulo, foi demonstrada a presença de anticorpos inibidores da hemaglutinação para o vírus Tacaiuma em um morador de zona rural (FIGUEIREDO et al., 1986). Posteriormente, foram encontrados anticorpos para o vírus Tacaiuma em cavalos da região do Pantanal Mato-grossense (IVERSSON et al., 1993), dando indício de que o vírus Tacaiuma possa estar circulando em todas as regiões brasileiras. Os sintomas da febre do Tacaiuma são além de febre, cefaléia, mialgias, calafrios, astenia e artralgia, apresentando evolução benigna (VASCONCELOS et al., 1998; PINHEIRO et al., 1997). A maioria das arboviroses descritas ocorre em pessoas que entram em contato com o meio silvestre ou rural. No entanto, existem arboviroses que afetam habitantes das áreas urbanas, como a febre do Oropouche, devido a uma adaptação do vírus tanto ao mosquito transmissor presente nestas áreas, quanto ao hospedeiro humano. Nestes casos as arboviroses são responsáveis por grandes epidemias, que geram, às cidades atingidas, grande impacto econômico e social, uma vez que estas doenças possuem uma natureza debilitante de duração razoavelmente longa, fazendo com que as pessoas atingidas afluam em grande número aos hospitais por necessitar de acompanhamento médico (VASCONCELOS et al., 1989 e 1992; PINHEIRO et al., 1981 e 1982), gerando, assim, um problema de saúde pública. Diante disso, uma alternativa para tentar conter as epidemias, bem como amenizar os sintomas dessas infecções virais, seria o 10 tratamento dos indivíduos infectados com drogas antivirais eficientes. No entanto, para todas as infecções virais supracitadas, ainda não existe tratamento antiviral, sendo que, nestes casos recomenda-se o uso de antitérmicos para o controle da febre e antiinflamatórios e antieméticos quando necessário (PINHEIRO et al., 1997). 1.2. Drogas Antivirais 1.2.1. Inibidores da Inosina Monofosfato Desidrogenase Inosina monofosfato desidrogenase (IMPDH) é uma enzima que catalisa o primeiro e único passo da síntese de novo de nucleotídeos de guanina (Figura 3). Inosina Monofosfato IMPDH Adenilsuccinato Xantosina Monofosfato GMP sintetase Adenosina Monofosfato Guanosina Monofosfato GDP, GTP, dGDP, dGTP Figura 3: Esquema da síntese de novo de nucleotídeos de guanina. Enzimas estão em itálico. (Fonte: Adaptado de GRACI & CAMERON, 2006). 11 IMPDH converte inosina monofosfato (IMP) para xantosina monofosfato (XMP), a qual recebe grupamento amina pela ação da enzima guanosina monofosfato sintetase (GMP sintetase) e origina guanosina monofosfato (GMP). GMP é então convertida em metabólitos de guanina como GTP e dGTP (Figura 3) (GRACI & CAMERON, 2006). Até o momento foram identificadas duas isoformas de IMPDH: a forma tipo I que é expressa em baixas concentrações em todos os tipos celulares e a forma tipo II que é altamente expressa em células em estado proliferativo ou em transformação. As duas isoformas apresentam 84% de identidade na sua seqüência de aminoácidos e ambas são cataliticamente ativas quando na forma de tetrâmeros contendo subunidades de 55kDa (JI et al., 2006). O sítio ativo da IMPDH localiza-se na interface monômeromonômero, sendo que seu substrato (IMP) e seu co-fator (NAD+) ligam-se numa fenda presente na região C-terminal de cada tetrâmero (COLBY et al., 1999). Os metabólitos de guanina como GTP e dGTP provenientes da via sintética de novo são precursores essenciais para a síntese de RNA e DNA, respectivamente. Como IMPDH é a enzima responsável por esta via, a mesma tem sido identificada como um importante regulador da proliferação celular. Além disso, GTP tem importantes funções no estoque de energia, na sinalização intracelular, na tradução realizada pelos ribossomos e na síntese de glicoproteínas (GRACI & CAMERON, 2006). Diante da importância da IMPDH, esta enzima pode ser alvo da ação de substâncias inibidoras, que já apresentam atividade antiviral 12 comprovada, como é o caso da ribavirina, ou que vem demonstrando ter ações antivirais, como é o caso do ácido micofenólico. 1.2.1.1. Ribavirina A Ribavirina (RBV) (1-β-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3- carboxamida), comercialmente conhecida como Virazole, é um nucleosídeo sintético, com estrutura semelhante à da guanosina (Figura 4). Figura 4: Estrutura química da ribavirina. (Fonte: GRACI & CAMERON, 2006). A RBV foi primeiramente sintetizada por SIDWELL e colaboradores em 1972, os quais também foram responsáveis por demonstrar pela primeira vez a atividade antiviral da RBV sobre muitos vírus de DNA e de RNA tanto in vitro como in vivo (WITKOWSKI et al., 1972; SIDWELL et al., 1972). Apesar disso, a RBV hoje, é somente utilizada no tratamento das infecções causadas pelo vírus da hepatite C (HCV) (em combinação com Interferon-α) (DAVIS et al., 1998; McHUTCHISON et al., 1998; MANGIA et al., 2005), pelo vírus sincicial respiratório (WYDE, 1998; 13 COOPER et al., 2003) e experimentalmente nas infecções causadas pelo vírus da febre de Lassa (McCORMICK et al., 1986). Passados mais de trinta anos após a sua descoberta, o mecanismo de ação antiviral da RBV ainda gera controvérsia. Existem até o momento, 5 mecanismos descritos que podem ser os responsáveis pela atividade antiviral da RBV, sendo que os mesmos podem ou não atuar conjuntamente, dependendo do tipo celular e da estirpe viral envolvidos. No interior da célula, a RBV sofre processo de fosforilação originando as formas mono-, di- e tri-fosfato (WILLIS et al., 1978; PAGE & CONNOR, 1990). A ribavirina monofosfato (RMP), por mimetizar o substrato IMP, é o inibidor competitivo da IMPDH (Figura 3), fazendo com que os níveis de GTP e outros metabólitos de guanina diminuam no meio intracelular (STREETER et al., 1973). A redução nos níveis de GPT e dGTP pode resultar em dois efeitos: um para as células, que com a diminuição da síntese de DNA, RNA e proteínas deixam de proliferar, tendo a RMP um efeito citostático sobre as mesmas (MULLER et al., 1977); e outro para os vírus, cuja redução de GTP e dGTP impede a progressão do ciclo replicativo viral, por prejudicar a tradução, a transcrição e a replicação do RNA ou DNA dos vírus (STREETER et al., 1973). Este mecanismo de ação antiviral é o principal responsável pela inibição da replicação de flavivírus e paramixovírus in vitro (LEYSSEN et al., 2005) e pode explicar a capacidade da RBV em inibir ambos vírus de RNA e de DNA. Contudo, alguns pesquisadores sugerem que a inibição da IMPDH por si só, não é suficiente para explicar a atividade antiviral da RBV. WRAY e colaboradores (1985) observaram que concentrações crescentes de RBV não são capazes de 14 reduzir completamente os níveis de GTP intracelular, contudo, a dose crescente do medicamento apresenta efeito antiviral sobre o vírus influenza mais e mais pronunciado. Além disso, nem todos os inibidores de IMPDH apresentam atividade antiviral (CROTTY et al., 2000; LANFORD et al., 2001), sugerindo, então, que a RBV tenha outros mecanismos de ação. A maioria dos RNAs celulares e alguns RNAs virais possuem na sua porção final 5’ uma estrutura essencial tanto para a estabilidade como para a tradução do RNA mensageiro, denominada estrutura de “cap 7metilguanosina” (GOSWAMI et al., 1979). A formação desta estrutura requer a ação consecutiva de três enzimas, das quais uma é responsável por catalisar a adição de guanosina monofosfato (GMP) na região 5’ do RNA, sendo denominada por isso de guanililtransferase (BISAILLON & LEMAY, 1997). A RBV, na sua forma trifosfatada (RTP), por ser um análogo da guanosina, foi vista formar com a guanililtransferase um complexo covalente enzima-RTP, inibindo a atividade enzimática da mesma e prejudicando o “capping” do RNAm do vírus vaccínia por exemplo, com conseqüente redução da síntese protéica desse vírus (GOSWAMI et al., 1979; BOUGIE & BISAILLON, 2004). Além disso, foi demonstrado através de experimentos bioquímicos que a guanililtransferase possui a capacidade de transferir RMP ao RNA, formando um “cap” contendo RBV em sua estrutura. O “cap” constituído por RBV não é reconhecido pela maquinaria do “capping” do vírus vaccínia e, portanto, não sofre adição do grupamento 7-metil, gerando um RNA com “cap” incompleto que não é reconhecido pelos ribossomos e conseqüentemente não sofre processo de tradução (BOUGIE & BISAILLON, 2004). Este mecanismo antiviral da RBV pode 15 funcionar para vírus que necessitam do “cap” durante sua replicação, mas é incapaz de explicar a atividade antiviral que a RBV possui sobre os vírus que não utilizam “cap” para gerar sua progênie. A RBV trifosfato (RTP), além de agir sobre a guanililtransferase, foi vista ter ação inibitória sobre polimerases virais. Estudos in vitro realizados por ERIKSSON e colaboradores (1977) mostraram que a RTP possui a capacidade de inibir a RNA polimerase do vírus influenza e que nem a RBV, nem a RMP apresentaram tal ação. Neste caso, a RTP agiu como um inibidor competitivo da RNA polimerase, competindo com ATP e GTP pelo sítio ativo da enzima. Inibição da polimerase viral por RBV também foi visto para os vírus da estomatite vesicular (FERNANDEZLARSSON et al., 1989; TOLTZIS et al., 1988) e HCV (MAAG et al., 2001; VO et al., 2003). CROTTY e colaboradores em 2000 observaram que a RNA polimerase do poliovírus poderia se ligar a RTP e não ter sua atividade inibida, pelo contrário, a polimerase conseguia adicionar moléculas de RTP ao RNA viral durante o processo replicativo numa razão baixa de incorporação, na ordem de 1 a 2 moléculas de RTP para cada 7500 nucleotídeos do RNA viral. Os pesquisadores observaram ainda que, a RTP por apresentar estrutura análoga ao do GTP e do ATP, era adicionada ao RNA viral no lugar destes nucleotídeos, causando mutações no genoma do poliovírus. Durante o processo replicativo do poliovírus ocorrem normalmente 1,5 mutações por genoma, mas na presença da RTP houve um aumento de 2 a 4 mutações por genoma, dependendo da concentração de RBV adicionada à cultura celular. Esse aumento no número de 16 mutações superou o limiar permitido de alterações genômicas para o poliovírus, causando no mesmo o fenômeno de mutação letal, onde excesso de mutações origina progênie não infecciosa, com conseqüente perda da viabilidade reprodutiva viral (CROTTY et al., 2000). Estes achados deram a RBV mais uma função dentre as já mencionadas: a de causar mutações de caráter letal no genoma viral. Posteriormente, essa capacidade da RBV em aumentar a freqüência de mutações com conseqüente diminuição da viabilidade viral foi também observada para: réplicons de HCV (LANFORD et al., 2003; ZHOU et al., 2003), vírus GBV-B (LANFORD et al., 2001), vírus Hantaan (SEVERSON et al., 2003) e vírus West Nile (DAY et al., 2005). Além dos mecanismos antivirais descritos acima, estudos têm demonstrado que a RBV possui a capacidade de modular a resposta imune direcionando-a para um padrão de resposta do tipo Th1 (NING et al., 1998; TAM et al., 1999; HULTGREN et al., 1998). Resposta do tipo Th1 associa-se com imunidade celular e presença da citocina interferon-γ; enquanto resposta do tipo Th2 promove imunidade humoral com presença de interleucina (IL)-4 e IL-5 (ABBAS & LICHTMAN, 2005). Resposta imune do tipo Th2 tem sido associada ao desenvolvimento de doença crônica nas infecções causadas pelo vírus HCV (TSAI et al., 1997) e estudos in vitro com células humanas têm demonstrado que baixos níveis de RBV (5-10µM) inibem a resposta Th2 das células e promovem uma resposta Th1 tanto em células CD4+ como CD8+ (TAM et al., 1999). Contudo, até o momento, estudos clínicos não conseguiram comprovar essa ação imunomoduladora da RBV em pacientes infectados por HCV, permanecendo uma dúvida 17 sobre se este fenômeno ocorre também in vivo. No entanto, permanece o fato de que pacientes infectados por HCV e que fazem uso da terapia antiviral com RBV e interferon-α apresentam carga viral menor que os pacientes que fazem uso de interferon-α somente, reafirmando o papel de droga antiviral para a RBV, sem, no entanto, demonstrar sua função imunomoduladora (PAWLOTSKY et al., 2004). Utilizando-se de seus mecanismos de ação antiviral, a RBV apresentou atividade antiviral in vitro e/ou in vivo sobre vários vírus de RNA pertencentes a diferentes famílias, como: Paramyxoviridae (HRUSKA et al., 1980; LEYSSEN et al., 2005), Flaviviridae (NEYTS et al., 1996; JORDAN et al., 2000; LEYSSEN et al., 2005), Picornaviridae (CROTTY et al., 2000), Orthomyxoviridae (DURR & LINDH, 1975), Arenaviridae (JAHRLING et al., 1980; ANDREI & DE CLERCQ, 1990) e Bunyaviridae (HUGGINS et al., 1986; SIDWELL et al., 1988 e 1994; CASSIDY & PATTERSON, 1989; CRANCE et al., 1997). Diante do fato da RBV apresentar atividade antiviral sobre diferentes gêneros da família Bunyaviridae (HUGGINS et al., 1986; SIDWELL et al., 1988 e 1994; CASSIDY & PATTERSON, 1989; CRANCE et al., 1997), e pelo fato dos vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma pertencerem à mesma, apresentando genoma de RNA e possuindo RNA polimerase, é possível que a RBV possa apresentar atividade antiviral sobre estes vírus, porém, até o momento, não há relatos na literatura sobre a ação deste medicamento sobre os vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma. 18 1.2.1.2. Ácido Micofenólico O ácido micofenólico (ácido (E)-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi7-metil-3-oxo-5-iso-benzofuranil)-4-metil-4- hexenóico) (Figura 5) é um produto de fermentação de várias espécies de Penicillium como: P. brevicompactum e P. stoloniferum (THE MERCK INDEX, 1996). Figura 5: Estrutura química do ácido micofenólico. (Fonte: LIPSKY, 1996). O ácido micofenólico (MPA) foi descrito pela primeira vez por FLOREY e colaboradores em 1946 onde os pesquisadores observaram que esta substância apresentava propriedades antifúngicas. Posteriormente, KORZYBSKI e colaboradores (1967) verificaram que essa substância também apresentava propriedades antibacterianas, mas foi em meados de 1969 que PLANTEROSE fez os primeiros relatos de atividade antiviral relacionada ao MPA. Neste estudo, o pesquisador observou que o MPA foi capaz de inibir a replicação em cultura de células, dos seguintes vírus: vaccínia, herpes simplex, Semliki Forest, vírus da encefalomiocardite, Coxsackie B1 e influenza (A-NWS). Entretanto, quando testes in vivo foram 19 realizados para vaccínia, Semliki Forest e vírus da encefalomiocardite, PLANTEROSE não observou qualquer ação antiviral do MPA. Posteriormente, a função antimicrobiana do MPA deixou de ser avaliada pela comunidade científica, quando este medicamento apresentou atividade antineoplásica (TRESSLER et al., 1994) e imunossupressora, podendo enfim, ser utilizado no tratamento de várias doenças, incluindo artrite reumatóide (GOLDBLUM, 1993), psoríase (EPINETTE et al., 1987) e na prevenção de rejeição de órgãos após transplante (LIPSKY, 1996). O ácido micofenólico, de maneira similar à RBV, é um inibidor da IMPDH, porém, o MPA não apresenta estrutura análoga de nucleosídeo, como a RBV e não necessita sofrer processos de fosforilação intracelular para ter ação inibitória sobre a IMPDH (ALLISON & EUGUI, 1996). O MPA possui a capacidade de interagir com a IMPDH de maneira a alterar sua estrutura conformacional, levando a formação de agregados anulares de proteína impedindo a atividade enzimática da IMPDH (Figura 6). Estes agregados não se associam a nenhuma organela intracelular e podem ser convertidos aos tetrâmeros em arranjos lineares e funcionais pela ação da GTP (Figura 6). Desta forma, observa-se que GTP age como um antagonista do MPA, por se ligar à enzima e reverter a alteração conformacional ocasionada pelo MPA (JI et al., 2006). 20 Figura 6: Esquema estrutural das alterações conformacionais ocorridas na IMPDH pela ação de MPA e nucleotídeos. (Fonte: JI et al., 2006). Com o advento da AIDS e com a descoberta de que o MPA poderia agir sobre a IMPDH diminuindo os níveis intracelulares de GTP e dGTP, ocasionando entre outros efeitos uma ação citostática sobre células proliferativas, diversos grupos de pesquisa começaram a investigar a possibilidade do MPA apresentar alguma ação anti-HIV. Foi assim que em 1995, ICHIMURA & LEVY demonstraram que o MPA, em concentrações clinicamente aceitáveis de 1 a 10µM conseguia suprimir in vitro a replicação do HIV. Posteriormente, MARGOLIS e colaboradores (1999) demonstraram que o MPA apresentava sinergismo com abacavir, um inibidor da transcriptase reversa, aumentando os efeitos anti-HIV. Neste mesmo ano, MARGOLIS e colaboradores propuseram o uso da combinação de micofenolato mofetil (MMF) (agente terapêutico proveniente 21 do MPA) com abacavir em pacientes portadores de linhagens de HIV resistentes às terapias antiretrovirais convencionais. A partir destes estudos ou concomitantemente a eles, outros grupos de pesquisa começaram a cogitar a possibilidade do MPA ser utilizado no tratamento de outras doenças virais. Assim, pesquisas demonstraram que o MPA ou seu derivado MMF apresentaram atividade antiviral in vitro e/ou in vivo sobre o vírus da febre amarela (NEYTS et al., 1996), herpes simplex (potencializando a ação do aciclovir, ganciclovir e penciclovir) (NEYTS & DE CLERCQ, 1998), vírus da hepatite B (HBV) (GONG et al., 1999), vírus do dengue (DIAMOND et al., 2002) e reovirus aviário (ROBERTSON et al., 2004). Além disso, o MMF foi capaz de inibir o processo de miocardite ocasionado pelo vírus Coxsackie B3 em um modelo experimental utilizando camundongos, sem, no entanto, inibir a replicação do vírus (PADALKO et al., 2003). Com relação aos vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, não há relatos na literatura descrevendo a ação do ácido micofenólico sobre a replicação destes vírus, sendo que o mesmo poderá apresentar ação antiviral sobre estes vírus, uma vez que a droga inibe a IMPDH e com isso reduz os níveis de GTP intracelular que são necessários para o processo de replicação dos vírus de RNA. 22 1.2.2. Interferon-alfa Interferon (IFN)-α é parte integrante de um conjunto de proteínas pertencentes ao grupo dos Interferons (IFNs) que foram primeiramente descritos como substâncias resistentes a pH ácido, produzidas por células incubadas com vírus influenza inativado pelo calor e que poderiam inibir (interferir com) a replicação do mesmo vírus ou vírus heterólogo quando adicionado à outra cultura celular (ISAACS & LINDENMANN, 1957). O IFN-α, também conhecido por IFN leucocitário pelo fato de ser secretado em abundância por fagócitos mononucleares, pertence ao grupo dos IFNs do tipo I que incluem ainda o IFN-β (interferon fibroblástico) e o IFN-ω (proveniente de células hematopoiéticas) (JOHNSON et al., 1994). Os seres humanos podem expressar mais de 10 subtipos de IFN-α (a partir do gene IFNA), mas expressam somente um tipo de IFN-β (IFNB) e um tipo de IFN-ω (IFNW), sendo que todos os genes estão presentes no cromossomo 9 (SAMUEL, 1991) (Tabela 1). De maneira semelhante, camundongos também expressam vários subtipos de IFN-α (>10), e somente um IFN-β, sendo que os genes estão contidos no cromossomo 4 destes animais (KELLEY et al., 1983 e 1985; DANDOY et al., 1985). Coletivamente, estes IFNs podem apresentar diversas funções biológicas, como atividade antiviral (ISAACS & LINDENMANN, 1957; GRESSER, 1990), atividade antiproliferativa (FLEISCHMANN & FLEISCHMANN, 1988) e atividade imunomoduladora (MOORE, 1983; 23 BELARDELLI, 1995 e 1996), dependendo das vias de transdução de sinal ativadas por eles nas células (DARNELL et al., 1994). Tabela 1: Os tipos e subtipos de IFN tipo I (Fonte: FOSTER & FINTER, 1998). Lócus gênico Símbolo da proteína Interferon-α α IFNA1 IFN-α1 IFNA2 IFN-α2 IFNA4 IFN-α4 IFNA5 IFNA6 IFN-α5 IFN-α6 IFNA7 IFN-α7 IFNA8 IFN-α8 IFNA10 IFN-α10 IFNA13 IFN-α13 IFNA14 IFN-α14 IFNA16 IFN-α16 IFNA17 IFN-α17 IFNA21 IFN-α21 Interferon-β β IFNB Interferon-ω ω IFNW1 IFN-β IFN-ω Variantes alélicas IFN-α1a IFN-α1b IFN-α2a IFN-α2b IFN-α2c IFN-α4a IFN-α4b IFN-α5 IFN-α6 IFN-α7a IFN-α7b IFN-α7c IFN-α8a IFN-α8b IFN-α8c IFN-α10a IFN-α10b IFN-α13 IFN-α14a IFN-α14b IFN-α14c IFN-α16 IFN-α17a IFN-α17b IFN-α17c IFN-α17d IFN-α21a IFN-α21b IFN-α24 24 Embora o IFN-α e o IFN-β sejam estruturalmente diferentes, eles reconhecem o mesmo receptor, denominado IFNAR, presente na superfície de todas as células eucarióticas. A ligação desses IFNs ao seu receptor resulta na ativação de duas proteínas, a JAK1 e a Tyk2, que fosforilam os fatores de transcrição STAT1 e STAT2, os quais formam um heterodímero que desloca-se para o núcleo da célula onde se associa com p48/IRF-9 para formar o complexo ISGF3. O complexo ISGF3 liga-se a regiões específicas do DNA e estimula a transcrição de vários genes. Atualmente sabe-se que 100 genes podem ser estimulados à transcrição pela ligação de IFN-α ao receptor, enquanto 300 genes podem ser transcritos pela ligação do IFN-β (DER et al., 1998). Dentre os produtos gênicos transcritos, destacam-se aqueles responsáveis pela atividade antiviral do IFN tipo I como: proteína quinase ativada por RNA de dupla fita (PKR), 2’,5’-oligoadenilato sintetase (2-5AS) e proteínas Mx (KHABAR et al., 2000). A PKR é uma enzima presente em células eucarióticas em quantidades muito pequenas, que aumenta consideravelmente na presença de IFN tipo I. Contudo, PKR, no interior das células, apresentase sob uma forma inativa, não exercendo sua função até que ocorra interação da mesma com RNA de dupla fita proveniente do processo replicativo dos vírus. Interação entre PKR e RNA de dupla fita causa na enzima uma mudança conformacional que resulta em autofosforilação e dimerização tornando-a enzimaticamente ativa. PKR na forma ativa fosforila e inibe um fator celular importante no processo de tradução de 25 proteínas, denominado eIF-2α prejudicando assim, a síntese protéica (Figura 7) (citado por GARCIA-SASTRE, 2001). De modo semelhante à PKR, no interior das células eucarióticas existe baixa quantidade da enzima 2’,5’-oligoadenilato sintetase (2-5AS), que aumenta após estímulo celular com IFN tipo I. A 2-5AS também apresenta-se na forma inativa no interior das células, sendo que sua ativação ocorre após interação com RNA de dupla fita. Assim, a 2-5AS enzimaticamente ativa pode exercer sua função na ativação de uma RNase latente (RNase L). A RNase ativada provoca a degradação dos RNAs presentes na célula incluindo os RNAs mensageiros e os RNAs ribossômicos, prejudicando desta forma a síntese protéica (Figura 7) (STARK et al., 1998). Dentre os produtos gênicos induzidos pelo IFN tipo I, as proteínas Mx são as que mais apresentam evidências experimentais de sua atividade antiviral. Em modelos experimentais utilizando-se animais foi demonstrado que as proteínas Mx, mesmo na ausência de qualquer outra proteína induzida pelos IFN-α/β, foram capazes de bloquear a replicação de diversos vírus (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998). As proteínas Mx são GTPases que fazem parte de uma grande família de GTPases semelhantes à dinamina, as quais estão envolvidas em processos de endocitose e transporte de vesículas (STAEHELI et al., 1986; Van der BLIEK, 1999). Para sua ação antiviral, as proteínas Mx formam oligômeros, sendo que sua atividade GTPase é fundamental nesta ação antiviral, assim como é importante também sua localização no meio intracelular (PTOSSI et al., 1993). O genoma humano produz dois tipos de 26 proteínas Mx, a MxA e a MxB, ambas induzidas por interferon, mas que divergem na sua capacidade antiviral (AEBI et al., 1989; HALLER et al., 1998; STAEHELI et al., 1993). A proteína MxA normalmente acumula-se no citoplasma da célula e apresenta atividade antiviral sobre membros da família Orthomyxoviridae (vírus influenza A e C e vírus Thogoto) (ARNHEITER et al., 1996; FRESE et al., 1995; HALLER et al., 1998; MARSCHALL et al., 2000; PAVLOVIC et al., 1992), Paramyxoviridae (vírus do sarampo e parainfluenza 3), Rhabdoviridae (VSV), Togaviridae (vírus Semliki Forest) e Bunyaviridae (Vírus La Crosse, Hantaan, vírus da febre do Vale Rift e vírus da febre de sandfly) (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998; PAVLOVIC et al., 1995; FRESE et al., 1996; citado por SAMUEL, 2001). Contudo, as proteínas MxA não apresentam qualquer atividade antiviral sobre os vírus Mengo e EMC, pertencentes à família Picornaviridae (citado por SAMUEL, 2001). Contrariamente ao observado para as proteínas MxA, as proteínas MxB não apresentam propriedades antivirais (Figura 7) (HALLER et al., 1998). Camundongos também codificam duas proteínas Mx, a Mx1 e a Mx2 (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998). A Mx1 acumula-se no núcleo (DREIDING et al., 1985) e é induzida pela ação de IFN tipo I, sendo capaz de inibir a replicação dos vírus influenza e Thogoto (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998; STAEHELI et al., 1993). Contrariamente a Mx1, o gene que pode originar a proteína Mx2 não é funcional nas linhagens de camundongos de laboratório (STAEHELI & SUTCLIFFE, 1988), sendo, portanto, inviável a utilização destes animais para demonstrar se a Mx2 apresenta ou não atividade antiviral. Contudo, 27 existem duas linhagens de camundongos, NJL e SPR, que apresentam o gene que codifica a Mx2 funcional. Nestes animais, a proteína Mx2 acumulou-se no citoplasma após estímulo com IFN tipo I e foi capaz de conferir resistência aos animais após inoculação de vírus da estomatite vesicular (VSV) (JIN et al., 1999), apresentando, portanto, ação antiviral. Figura 7: Mecanismos antivirais induzidos pela ação do IFN tipo I (Fonte: STARK et al., 1998). O IFN secretado por uma célula infectada pode agir tanto de modo autócrino como parácrino nas células. De maneira autócrina, o IFN tipo I estimula na célula infectada, os mecanismos antivirais anteriormente citados, tendo como conseqüência a inibição do processo replicativo viral. De modo parácrino, o IFN secretado age sobre as células vizinhas que ainda não foram infectadas ativando nas mesmas um estado 28 antiviral, ou seja, torna as células resistentes à infecção viral (ABBAS & LICHTMAN, 2005). Além dos mecanismos antivirais já mencionados, o IFN tipo I pode auxiliar o sistema imune no reconhecimento de células infectadas, causando a destruição das mesmas. Neste caso, o IFN tipo I estimula o aumento da expressão de moléculas MHC de classe I na superfície das células infectadas que, carreando peptídeos virais, são facilmente reconhecidas pelos linfócitos TCD8+ citotóxicos. Os linfócitos ao reconhecerem os antígenos virais via MHC de classe I provocam nas células infectadas a sua morte, estimulando a apoptose nas mesmas ou causando sua lise (ABBAS & LICHTMAN, 2005). O IFN tipo I pode agir sobre células NK (“natural killer”) e aumentar sua atividade citolítica podendo assim, eliminar com mais facilidade células infectadas que deixaram de expressar em sua superfície o MHC de classe I por uma intervenção viral (ABBAS & LICHTMAN, 2005). Assim, as principais atividades do IFN tipo I funcionam de comum acordo na tentativa de erradicar infecções virais. Por isso mesmo, muitas pesquisas foram e estão sendo realizadas com o intuito de utilizar o IFN tipo I como medicamento antiviral. Para tanto, preparações farmacêuticas contendo IFN-α ou IFN-β começaram a ser produzidas em diversos laboratórios e foram testadas in vitro ou in vivo sobre diversos grupos virais. Destas pesquisas, as preparações de IFN-α demonstraram ter efeito antiviral in vitro e/ou in vivo sobre o vírus da febre sandfly Siciliana (CRANCE et al., 1997), vírus da dengue (DIAMOND et al., 2000), Coronavirus SARS (TAN et al., 2004; STRÖHER et al., 2004), vírus da hepatite murina (FUCHIZAKI et al., 29 2003), vírus vaccínia (LIU et al., 2004), vírus Ebola (MAHANTY et al., 2003), rotavírus (PETERSEN et al., 1997) e vírus da febre do Vale Rift (MORRIL et al., 1989). Apesar de resultados promissores, as formulações de IFN-α são utilizadas somente no tratamento das infecções crônicas causadas pelos vírus da Hepatite B e C (DAVIS et al., 1998; McHUTCHISON et al., 1998) e no tratamento das infecções genitais causadas pelo papiloma vírus humano (citado por SEN, 2001). Como pudemos observar anteriormente, o IFN-α apresenta atividade antiviral sobre dois membros da família Bunyaviridae, o vírus da febre sandfly Siciliana e o vírus da febre do Vale Rift. Adicionalmente, há na literatura uma descrição referente à ação do IFN-α, IFN-β e IFN-γ sobre o vírus Caraparu (BRINTON et al., 1993). Neste estudo, fêmeas de camundongos B6C3F1, de 4 a 6 semanas de idade, foram inoculadas intra-peritonealmente com o vírus Caraparu e após o desenvolvimento de necrose hepática coagulativa sucumbiram à doença e morreram entre 4 a 6 dias após a infecção. Tratamento destes animais com preparações de IFN-α ou IFN-β não evitou a morte dos animais, não apresentando, portanto, atividade antiviral sobre o vírus Caraparu. Contudo, tratamento com IFN-γ aumentou de maneira significante o tempo de vida dos animais infectados/tratados em relação aos animais infectados/não tratados com IFN-γ (BRINTON et al., 1993). Apesar de haver este estudo, não há na literatura qualquer relato da ação antiviral do IFN-α sobre os vírus Oropouche, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, o qual deve, portanto, ser avaliado. 30 2. OBJETIVOS Baseado no exposto e na tentativa de estabelecer um tratamento eficaz para as arboviroses causadas pelos vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, os objetivos deste trabalho foram: 2.1. Avaliar a ação antiviral in vitro dos medicamentos Ribavirina, Ácido Micofenólico e Interferon-α-2a sobre os Orthobunyavirus: Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, utilizando para tanto, a metodologia de ensaio de placa com células Vero E6. 2.2. Avaliar a ação antiviral in vivo do medicamento Ribavirina e da citocina recombinante Interferon-αA de camundongo sobre os vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, camundongos suíços recém-nascidos como modelo experimental. utilizando 31 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Amostras Virais As amostras dos vírus Oropouche (BeAn19991), Guamá (BeAn277), Guaroa (BeH22063) e Tacaiuma (BeAn73) foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Pedro Vasconcelos, do Instituto Evandro Chagas Belém, Brasil e pela Profa. Dra. Amélia Travassos da Rosa, da Universidade do Texas - Texas, EUA. A amostra do vírus Caraparu (SPAn2049) foi doada pela Profa. Dra. Terezinha Lisieux Coimbra, do Instituto Adolfo Lutz - São Paulo, Brasil. A partir destas amostras virais foram obtidos os estoques virais ou sementes virais. 3.2. Estoque viral ou semente viral As sementes virais foram utilizadas tanto para infectar as células quanto os camundongos e foram preparadas como descrito a seguir. Amostras do vírus Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guamá (GUAV), Guaroa (GROV) e Tacaiuma (TCMV) foram diluídas 1/100 em solução de cloreto de sódio (NaCl) a 0,85% (salina) e foram inoculadas intracerebralmente em camundongos suíços recém-nascidos (1 dia de vida) na quantidade de 20µL/camundongo. Após o aparecimento dos sintomas de encefalite nos animais caracterizado por paralisia dos membros 32 posteriores, tremor, dificuldade em se alimentar, os mesmos foram sacrificados por hipotermia, para conservação dos vírus, e foram identificados e armazenados em freezer –70oC. Posteriormente, os cérebros destes animais foram retirados, macerados e misturados em salina tamponada em fosfato (PBS) pH 7,2 – 7,4, numa proporção de 1:10 p/v (1 cérebro para 0,9mL de PBS). A suspensão obtida foi centrifugada a 2000×g por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi aliquotado, identificado e armazenado à temperatura de –70oC até o uso. 3.3. Experimentos in vitro 3.3.1. Cultura de células Células de rim de macaco verde africano, também denominadas células Vero E6 (ATCC-CCL81) foram mantidas em meio mínimo essencial (MeM, Cultilab, Campinas-SP, Brasil) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), sob uma temperatura média de 36oC e na presença de 5% de CO2. Os repiques para manutenção celular foram realizados a cada 3 ou 4 dias, com a utilização de tripsina (Cultilab, Campinas-SP, Brasil) para o desprendimento celular. 33 3.3.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vitro • Ribavirina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO): diluída em solução de NaCl a 0,85% em água destilada e estocada a 4oC. • Ácido micofenólico (Sigma Chemical Co. St. Louis MO): diluído em solução etanólica a 30% e estocado a 4oC. • Interferon-alfa-2a ou Roferon-A (Hoffmann-La Roche, EUA): mantido a 4oC. • Guanosina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO): diluída em solução de etanol a 30% e estocada a 4oC. • Solução de “trypan blue” utilizada no ensaio de citotoxicidade: Para cada 10mL da solução estoque adicionou-se 100mg de “trypan blue” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 10mL de PBS. Esta solução foi armazenada no escuro à temperatura ambiente. • Solução de agarose 1% utilizada no ensaio de placa: Para cada 200mL de solução estoque adicionou-se 2g de agarose “low-meltingpoint” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 200mL de água destilada. A suspensão assim preparada foi esterilizada a 120oC e armazenada em geladeira. No momento do uso, o gel formado era liquefeito colocando-se a agarose em microondas por 2 minutos seguido de manutenção da solução em banho-maria a 37oC até o uso. • Meio MeM 2x utilizado no ensaio de placa: Para cada litro de meio adicionou-se 200mL de MeM 10x (suplementado com glutamina e antibiótico) (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), 100mL de SBF (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), 20mL de uma solução de aminoácidos não- 34 essenciais (0,2mM) (Gibco BRL, Life Technologies, Inc.), 2mL de uma solução de piruvato de sódio (2mM) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 38mL de uma solução de bicarbonato de sódio a 8,4% e 500mL de água destilada ou água deionizada em MILLI-Q. Todos os compostos foram misturados, com exceção do SBF e o pH da solução foi corrigido para pH 7,2 – 7,4 com soluções de bicarbonato de sódio ou carbonato de sódio. Posteriormente, foi adicionado à solução água destilada ou água deionizada em MILLI-Q em q.s.p. 900mL. O meio obtido foi esterilizado por processo de filtragem em membrana de poro de 0,22µm em um sistema fechado (Corning, NY, EUA). Após a filtração, o SBF foi adicionado ao meio e o mesmo foi aliquotado e armazenado em geladeira até o momento do uso. • Solução de “naphtol blue-black” utilizada no ensaio de placa: Para cada litro da solução estoque adicionou-se 1,0g de “naphtol blueblack” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 13,6g de acetato de sódio (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 60mL de ácido acético glacial (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e 940mL de água destilada. Esta solução foi armazenada no escuro à temperatura ambiente (MORENS et al., 1985). 3.3.3. Avaliação da toxicidade da RBV, do MPA e do IFN-α α-2a sobre células Vero E6 A avaliação da toxicidade dos medicamentos selecionados sobre as células Vero E6 foi realizada por meio da metodologia de exclusão por “trypan blue” (KINCHINGTON et al., 1995). Resumidamente, células Vero 35 E6 distribuídas em placas de 24 cavidades receberam somente meio ou este adicionado de diferentes concentrações de RBV, MPA ou IFN-α-2a (Tabela 2). A placa foi, então, incubada por 3 dias em estufa a 36oC e 5% de CO2. Decorrido o período de incubação, as células provenientes do sobrenadante e as células desprendidas das cavidades com auxílio de tripsina (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), foram centrifugadas a 2000×g por 10 minutos a 4oC e ressuspensas em uma solução (v/v) de PBS e de “trypan blue” (500µL de cada). Em seguida, realizou-se a contagem de células mortas (azuis) e vivas (não coradas) em câmara de Neubauer e a porcentagem de células viáveis foi calculada tanto para as células incubadas com meio, como para as células incubadas com as diferentes concentrações dos medicamentos. Determinada a concentração máxima não tóxica, diluições da droga abaixo deste valor e incluindo o mesmo foram utilizadas nos experimentos in vitro na presença dos vírus. Tabela 2: Concentração dos medicamentos adicionados à cultura de células Vero E6. Medicamento Concentrações utilizadas Ribavirina 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256 µg/mL Ácido micofenólico 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128 µg/mL Interferon-alfa-2a 1; 10; 100; 1.000; 10.000; 100.000 UI/mL 36 3.3.4. Otimização da metodologia de ensaio de placa O ensaio de placa utilizado para quantificação viral, foi padronizado por nós, baseado na metodologia preconizada por MORENS e colaboradores em 1985, com algumas modificações. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades e incubadas por 24 horas a 36°C e 5% CO2 tiveram o meio removido e no lugar deste foi adicionado 200µL de meio (controle negativo) ou 200µL das diferentes diluições virais (10-2 a 10-6 ou 10-3 a 10-7) provenientes da diluição de alíquotas da semente viral em meio MeM contendo 5% de SBF. As amostras foram distribuídas em quadruplicata conforme demonstrado na figura 8 e as células foram incubadas por 2 horas a 36oC e 5% de CO2, sofrendo agitação branda a cada 30 minutos. Após o período de incubação, tanto o meio como o inóculo viral foram removidos e em seguida, adicionou-se 1mL/cavidade de meio proveniente da mistura (v/v) de agarose 1% e de meio MeM 2x e as células foram incubadas em estufa por 3 dias para OROV e GUAV, 5 dias para CARV e GROV, e 9 dias para TCMV. A cada 3 dias o meio (500µL de MeM 2x/agarose) era substituído para manutenção da viabilidade celular. Decorrido o período de incubação, o meio foi removido por completo e no lugar deste adicionou-se 500µL da solução de “naphtol blue black” e as placas foram incubadas por 15 minutos no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, a solução de “naphtol blue black” foi removida e as placas formadas pela ação citolítica dos vírus foram contadas utilizando-se microscópio invertido. O título viral 37 obtido foi determinado como PFU (Unidade Formadora de Placa) por mililitro (mL), cujo cálculo está exemplificado na figura 8: Meio 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Exemplo de cálculo de PFU/mL baseado na figura anterior: • Diluição viral onde é possível a contagem individual das placas (em branco): 10-5 • Média do total da contagem das placas: 8 placas ÷ 4 (quadruplicata) =2 • Resultado A: 2 x 105 PFU/200µL do inóculo viral • Correção do valor obtido para 1mL: multiplica por 5 o resultado A • Resultado B (definitivo): 2 x 105 x 5 PFU/mL = 1,0 x 106 PFU/mL • Neste caso, o título viral é: 1,0 x 106 PFU/mL Figura 8: Esquema ilustrativo de uma placa de 24 cavidades após ser submetida à metodologia de ensaio de placa, bem como um exemplo de cálculo do título viral obtido pela leitura desta placa. 38 3.3.5. Avaliação da atividade antiviral da RBV, do MPA e do IFN-α α-2a sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro Uma vez determinadas as concentrações não tóxicas dos medicamentos para as células Vero E6 e uma vez padronizado o ensaio de placa para OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, fomos avaliar a atividade antiviral dos medicamentos sobre os vírus utilizando-se de 3 diferentes análises segundo a metodologia preconizada por DIAMOND e colaboradores (2002). Primeiramente analisamos o efeito antiviral dos medicamentos quando adicionados à cultura celular, na concentração máxima não tóxica, em um período antecedente à infecção viral. Para este fim, células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com a dose máxima não tóxica 24 horas antes do contato com o inóculo viral (item 3.3.4), junto do inóculo viral e posteriormente ao mesmo no momento da adição do meio MeM 2x/agarose (item 3.3.4). Como controle negativo, células Vero E6 receberam somente meio nestes mesmos períodos. Os medicamentos foram recolocados a cada três dias quando o meio das células Vero E6 era substituído por meio novo (item 3.3.4). Em uma segunda análise, fomos avaliar o efeito antiviral dos medicamentos quando adicionados em cultura celular num período posterior à infecção viral. Para tanto, células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com a dose máxima não tóxica dos medicamentos 2 horas após a adição do inóculo viral conjuntamente ao meio MeM 2x/agarose (item 3.3.4). Como controle negativo, células Vero 39 E6 receberam somente meio neste período. Além do período de 2 horas após a infecção viral, foi testado também a atividade antiviral dos compostos quando os mesmos eram adicionados 24, 48 e 72 horas após a infecção viral. Da mesma maneira, os medicamentos eram recolocados a cada três dias no momento da troca do meio de manutenção. A terceira análise foi realizada somente após o medicamento ter apresentado capacidade antiviral significante sobre os vírus, quando da aplicação da primeira e segunda análise anteriormente descrita. Assim, a terceira análise foi realizada com a finalidade de obter uma concentração do medicamento menor que a máxima concentração não tóxica e que fosse capaz de inibir de maneira significante a replicação viral em tratamentos iniciados 24 horas antes ou 2 horas após a infecção viral. Portanto, tal análise poderia sugerir uma dose com eficácia antiviral, mas que por estar em menor concentração causaria menor dano celular. A partir dos dados obtidos destas três análises, foi possível predizer a possibilidade dos medicamentos selecionados de apresentarem ou não atividade antiviral em experimentos in vivo, os quais foram realizados em seguida. 40 3.4. Experimentos in vivo 3.4.1. Animais Foram utilizados em todos os experimentos camundongos suíços recém-nascidos provenientes do biotério central da Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto-SP, Brasil. Os animais foram mantidos em caixas individuais num sistema isolado no biotério do Centro de Pesquisa em Virologia (USP), onde todos os experimentos foram realizados. Todos os protocolos experimentais utilizando animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (USP) através do número 006/2004 (Anexo 10.3). 3.4.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vivo • Ribavirina (Item 3.3.2) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). • Interferon-alfaA recombinante de camundongo expresso em E. coli (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO): diluído em uma solução de NaCl a 0,85% e de albumina bovina a 0,1% conforme instruções do fabricante, aliquotado e estocado a -70oC. No momento do uso, o IFN-αA foi diluído em solução fisiológica gelada e permaneceu em gelo no decorrer dos experimentos in vivo. 41 3.4.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal 100 (DL100) pela via de inoculação intra-peritoneal Para determinar a DL50, alíquotas da semente viral foram diluídas para 10-2 a 10-9 em solução salina e grupos de 6 camundongos com 3 dias de vida foram infectados pela via intra-peritoneal com 40µL de cada diluição. Nos dias subseqüentes, os animais foram observados tendo sua mortalidade anotada. Cálculos envolvendo a quantidade de animais sobreviventes e animais mortos foram feitos pelo método de Reed & Muench (REED & MUENCH, 1938), obtendo-se, então a dose letal 50 (DL50) para cada vírus. Após a determinação da DL50, grupos de 6 camundongos foram infectados intra-peritonealmente com 10, 100 ou 1000 vezes a DL50 a fim de se obter a dose capaz de causar a morte de 100% dos animais (DL100). A dose obtida foi utilizada na infecção dos animais em todos os experimentos in vivo. 3.4.4. Determinação da concentração máxima tolerada dos medicamentos RBV e IFN-α αA pelos camundongos suíços lactentes Antes de verificar a ação dos medicamentos sobre os animais infectados, foi determinada a concentração máxima de cada um dos compostos que poderia ser utilizada e que não causaria reações adversas ou morte nos mesmos (HUGGINS et al., 1986). Para tanto, diferentes 42 concentrações dos medicamentos (Tabela 3) foram inoculados pela via intra-peritoneal (30µL/camundongo) iniciando o tratamento no 2o dia de vida e prolongando-se por 10 dias (KOFF et al., 1983; KENDE et al., 1985; KENYON et al., 1986; SASAKI et al., 1986; FUCHIZAKI et al., 2003). No decorrer deste período, os animais foram observados e seus pesos foram anotados, bem como a ocorrência de morte. Como controle do experimento, grupos de animais receberam somente salina via intraperitoneal e o peso destes camundongos foi anotado e comparado com os dos animais tratados com os medicamentos. Através da comparação estatística entre os pesos dos animais tratados ou não com os medicamentos foi determinada a concentração máxima tolerada dos compostos, a qual foi utilizada em todos os experimentos in vivo. Tabela 3: Concentração dos medicamentos RBV e IFN-αA testadas em camundongos lactentes. Medicamentos Concentrações Ribavirina 35; 45 mg/Kg/dia Interferon-alfaA 103 UI/mL (30 UI); 104 UI/mL (300 UI); 105 UI/mL (3000 UI) 43 3.4.5. Metodologia para determinar a atividade antiviral da RBV e do IFN-α αA sobre os animais infectados A determinação da atividade antiviral da RBV e do IFN-αA sobre os animais infectados foi realizada segundo a metodologia preconizada por HUGGINS e colaboradores (1986) e por SASAKI e colaboradores (1986). Para tanto, dois tipos de análise foram utilizadas: uma profilática e outra terapêutica. Na análise profilática, os medicamentos e o placebo (salina) foram administrados pela via intra-peritoneal (30µL), na concentração máxima tolerada, 24 horas antes da infecção viral, no momento da infecção e diariamente por mais 5 dias, totalizando 7 dias de tratamento. As drogas foram administradas 1 vez ao dia. Na análise terapêutica, os medicamentos começaram a ser administrados 3 horas ou 24 horas após a infecção viral, seguido de uma dose de manutenção a cada 24 horas totalizando também 7 dias de tratamento. As drogas foram administradas 1 vez ao dia, num volume de 30µL/camundongo. Durante o período de tratamento e posteriormente a ele, a eficácia do medicamento foi avaliada a partir de 4 parâmetros: curva de sobrevivência, tempo médio de vida, viremia e quantidade de vírus no cérebro. A curva de sobrevivência revelou graficamente a quantidade de animais que sobreviveram à infecção por um determinado período de 44 tempo, comparando o grupo tratado com o medicamento com o grupo tratado com salina. Os resultados provenientes da curva de sobrevivência foram demonstrados em tabelas onde colocou-se o número total de animais sobreviventes ao final do experimento sobre o número total de animais inicialmente infectados (tratados ou não com medicamento). O tempo médio de vida (TMV) correspondeu ao valor médio obtido entre o 1o dia e o último dia em que houve o aparecimento de animais mortos no decorrer do experimento. A viremia e a quantificação de vírus no cérebro foram realizadas segundo XIAO e colaboradores (2001). Para tanto, grupos de 18 animais com 3 dias de vida foram infectados com a DL100 e foram tratados em dias pré-determinados com os medicamentos ou com o placebo. Nos dias 1, 2, 3, 5, 7 e 9 após a infecção viral, foram retirados de 2 animais de cada grupo 100µL de sangue e cérebro. Para determinação da viremia, o sangue foi diluído 1/10 em meio MeM 1x contendo 5% de SBF, foi centrifugado a 2000×g por 10 minutos a 4oC e o sobrenadante obtido foi aliquotado e armazenado a –70oC. Concomitantemente, os cérebros foram macerados e misturados com meio MeM, numa proporção de 1:10 (1 cérebro para 0,9mL de meio MeM), a suspensão cerebral foi centrifugada a 2000×g por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi aliquotado e armazenado à temperatura de –70oC. Posteriormente, o sobrenadante proveniente do sangue e do cérebro foram diluídos de 10-2 a 10-6 ou 10-3 a 10-7 em meio MeM (5% de SBF) e foram distribuídos em quadruplicata, em placas de 24 cavidades (200µL/cavidade) contendo monocamada de células Vero E6 e o 45 ensaio seguiu conforme item 3.3.4. Os valores obtidos foram demonstrados graficamente. A eficácia antiviral dos medicamentos foi então analisada pela sua capacidade de impedir a mortalidade, de aumentar o tempo de vida dos animais, de inibir ou diminuir o processo virêmico e inibir ou diminuir a replicação viral no cérebro. 3.5. Análise estatística Para analisar os experimentos in vitro foram utilizados a análise de variância (ANOVA) e o método de Tukey-Kramer. Para os experimentos in vivo foi utilizado o Teste de t (Student’s t-test). Um valor de P menor que 0,05 (P<0,05) foi considerado estatisticamente significante. A análise de variância, o método de Tukey-Kramer e o Teste de t (Student’s t-test) foram realizados através do programa estatístico INSTAT, Graph Pad, Califórnia, EUA. 46 4. RESULTADOS 4.1. Resultados referentes às padronizações 4.1.1. Concentração máxima não tóxica dos medicamentos RBV, MPA e IFN-α α-2a para células Vero E6 Utilizando-se das concentrações discriminadas na tabela 2 (item 3.3.3) podemos observar que a RBV apresenta elevado grau de toxicidade sobre as células Vero E6 em concentrações ≥ 128µg/mL, com declínio da viabilidade celular superior a 30% em relação às células cultivadas na presença de meio somente (Figura 9). Porém, concentrações ≤ 64µg/mL apresentaram uma viabilidade em torno de 80 a 90%, podendo, portanto, serem utilizadas em culturas de células Vero E6 (Figura 9). No entanto, DIAMOND e colaboradores (2002) observaram que o uso da RBV na concentração de 50µg/mL é capaz de inibir em 50% o crescimento das células Vero E6, mostrando um efeito citostático sobre as mesmas. Diante deste fato, concentrações ≤ 50µg/mL foram utilizadas para avaliar a atividade antiviral da RBV sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV em cultura de células Vero E6. Com relação ao MPA podemos observar pela figura 10 que a concentração de 32µg/mL foi muito tóxica para as células, causando uma diminuição da viabilidade celular em torno de 30% em relação às células cultivadas com meio somente. Entretanto, doses ≤ 16µg/mL apresentaram uma porcentagem de viabilidade em torno de 80 a 90%, não 47 apresentando, portanto toxicidade significante sobre as células Vero E6. Contudo, DIAMOND e colaboradores (2002) observaram que uma concentração de MPA ≥ 10µg/mL causa um efeito citostático sobre as células Vero E6, diminuindo em 50% seu processo replicativo. Assim sendo, nos experimentos in vitro utilizamos concentrações de MPA ≤ 10µg/mL. Segundo dados da literatura, concentração de 100.000 UI/mL de IFN-α-2a não apresenta qualquer efeito tóxico sobre células Vero E6 em cultura (TAN et al., 2004) e corroborando com este dado, a figura 11 mostra-nos que a concentração de 100.000 UI/mL apresenta uma porcentagem média de viabilidade de 95%. Dessa forma, doses ≤ 100.000 UI/mL foram utilizadas por nós nos experimentos in vitro. Porcentagem de células Vero E6 viáveis (%) 48 100 80 60 40 20 0 M 2 4 8 16 32 64 128 256 Concentração de RBV (µ µ g/mL) Figura 9: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na presença de diferentes concentrações de RBV. A contagem das células foi realizada em câmara de Neubauer após mantê-las incubadas em solução de “trypan blue”. O valor proveniente da contagem das células cultivadas com meio somente (M) representa o controle negativo. As barras representam a média ± desvio-padrão (SD) de valores obtidos de uma duplicata. Porcentagem de células Vero E6 viáveis (%) 49 100 80 60 40 20 0 M 2 4 8 16 32 64 128 Concentração de MPA (µ µ g/mL) Figura 10: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na presença de diferentes concentrações de MPA. A contagem das células foi realizada em câmara de Neubauer após incubá-las em solução de “trypan blue”. Os dados provenientes da contagem das células cultivadas com meio somente (M) representam o controle negativo. As barras representam a média ± SD de valores obtidos de uma duplicata. Porcentagem de células Vero E6 viáveis (%) 50 100 80 60 40 20 0 M 1 10 100 1000 10000 100000 Concentração de IFN-α α (UI/mL) Figura 11: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na presença de diferentes concentrações de IFN-α α-2a. A contagem das células foi realizada em câmara de Neubauer após incubá-las em solução de “trypan blue”. Os dados provenientes da contagem das células cultivadas com meio somente (M) representam o controle negativo. As barras representam a média ± SD de valores obtidos de uma duplicata. 51 4.1.2. Susceptibilidade de camundongos suíços à infecção intraperitoneal pelos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM Devido ao fato de algumas drogas a serem testadas não atravessarem a barreira hemato-encefálica (IFNs) (RANG & DALE, 1993) e outras não atingirem concentrações adequadas no cérebro (RBV) (KOFF et al., 1983), a opção de inocular os vírus pela via cerebral causando uma inflamação local e imediata, dificultaria a observação da ação dos medicamentos sobre os vírus. Diante disso, optou-se por inocular os vírus pela via intra-peritoneal (i.p.), que acarretaria primeiramente uma infecção sistêmica (GONZALEZ-SCARANO et al., 1996) nos animais, permitindo analisar de uma forma mais eficaz o efeito das drogas sobre os vírus. Assim sendo, foi necessário saber se os Orthobunyavirus selecionados eram capazes de provocar a morte dos animais quando inoculados pela via intra-peritoneal. Relatos na literatura demonstraram que o OROV (PINHEIRO et al., 1997) e GROV (MARCH & HETRICK, 1967; TURNER et al., 1970) são capazes de levar à morte camundongos lactentes inoculados pela via i.p. Contudo, até o momento, o mesmo não foi relatado para CARV, GUAV e TCMV. Diante disso, foram realizados testes com o intuito de verificar se as sementes virais produzidas para os cinco vírus escolhidos eram capazes de causar morte em animais suíços com três dias de vida quando os vírus eram inoculados pela via intra-peritoneal (40µL). A título de comparação e como um controle do experimento, outro grupo de animais recebeu pela via intracerebral (i.c.) 20µL da mesma suspensão viral. 52 Os resultados demonstraram que os 5 Orthobunyavirus selecionados possuem a capacidade de causar doença e provocar a morte em camundongos lactentes com 3 dias de vida, quando inoculados pela via i.p. (Figura 12). Contudo, a morte foi mais rápida quando os vírus foram inoculados pela via i.c., com exceção do GROV que provocou a morte de 100% dos animais até o 4o dia pós-infecção, independentemente da via do inóculo. Vale ressaltar que o volume injetado pela via i.p. foi o dobro daquele inoculado pela via i.c., uma vez que, em testes anteriores utilizando-se o volume de 20µL em ambas inoculações, não observamos 100% de mortalidade para OROV e CARV. Sabendo que os camundongos lactentes são susceptíveis aos vírus supracitados quando os mesmos são inoculados pela via i.p. restou determinar a DL50 e a DL100 para serem utilizadas em testes com as drogas antivirais. 53 Sobrevivência (%) OROV 100 80 IC 60 40 IP 20 0 0 2 4 6 8 10 Dias de infecção GUAV Sobrevivência (%) 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 60 40 20 0 0 2 4 6 8 Dias de infecção GROV TCMV 80 60 40 20 0 80 Dias de infecção 100 0 100 10 Sobrevivência (%) Sobrevivência (%) Sobrevivência (%) CARV 2 4 6 8 10 100 10 Dias de infecção 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 Dias de infecção Figura 12: Susceptibilidade de camundongos suíços à inoculação intra-peritoneal de OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV. Camundongos com 3 dias de vida foram inoculados com a semente viral na diluição de 1/20 pela via i.p. ou pela via i.c. Os resultados representam 1 de 2 experimentos realizados independentemente. 54 4.1.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal 100 (DL100) para os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM em animais suíços através da via de inoculação intra-peritoneal Os resultados da DL50 estão apresentados na tabela 4, a qual mostra a DL50 por volume de inóculo bem como por mL de suspensão viral. Para a determinação da DL50 via i.p. dos animais inoculados com OROV, a suspensão viral necessitou ser diluída de 10-1 a 10-6, pois em experimentos prévios utilizando-se as diluições de 10-2 a 10-9 a DL50 ficou abaixo de 102. Neste sentido, podemos inferir que os animais suíços com três dias de vida já mostram certa resistência à infecção causada pelo vírus ORO, os quais são totalmente resistentes à doença a partir do quarto dia de vida. O mesmo fenômeno não foi observado para os outros vírus estudados. Tabela 4: DL50, por volume de inóculo e por mL, dos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM pela administração intra-peritoneal em camundongos suíços com 3 dias de vida. DL50 Vírus Por 40µL Por mL OROV 10 1.3 10 2.7 CARV 10 5.2 10 6.6 GUAV 10 7.0 10 8.4 GROV 10 6.4 10 7.8 TCMV 10 6.4 10 7.8 55 Após a obtenção da DL50, realizamos experimentos para determinar a DL100. Para tanto, grupos de 6 camundongos foram inoculados intra-peritonealmente (40µL) com diferentes valores da DL50 (10 DL50; 100 DL50; 1.000 DL50) e os animais foram observados por um período de 10 dias tendo sua mortalidade anotada. Os resultados estão descritos na tabela 5. Tabela 5: Valor de DL50 capaz de causar 100% de mortalidade (DL100) em camundongos suíços com três dias de vida. Vírus DL100 OROV 10 DL50* CARV 1.000 DL50 GUAV 100 DL50 GROV 100 DL50 TCMV 1.000 DL50 *Volume do inóculo foi de 100µL para obter 100% de mortalidade para o vírus ORO, ao contrário dos outros vírus cujo inóculo foi de 40µL. As doses acima determinadas foram utilizadas nos experimentos in vivo para avaliação da eficácia antiviral dos medicamentos RBV e IFNαA. 56 4.1.4. Detecção e quantificação de vírus no sangue e no cérebro Para utilizarmos a viremia e a quantidade de vírus no cérebro como padrões de avaliação da eficácia antiviral dos medicamentos RBV e IFN-αA, foi necessário saber em quais momentos os vírus aparecem nestes dois tecidos e em quais títulos. Dessa forma, grupos de animais foram inoculados pela via intra-peritoneal com as doses letais e em determinados dias o sangue e o cérebro foram retirados e processados para quantificação viral. Como controle negativo, utilizou-se sangue e cérebro de animais não infectados. Através da figura 13 podemos observar que não foi possível detectar a presença de vírus no sangue dos animais infectados por OROV e CARV. Além disso, a quantidade de vírus encontrada no sangue dos camundongos infectados por GUAV, GROV e TCMV foi muito reduzida, muitas vezes não sendo confirmada em experimentos posteriores. Diante destes resultados a viremia não foi utilizada como padrão de avaliação da atividade antiviral dos medicamentos selecionados. Com relação à quantificação de vírus no cérebro, esta pôde ser realizada com sucesso e reprodutibilidade através da técnica de ensaio de placa (item 3.3.4). Observando a figura 14 notamos que OROV foi detectado no cérebro 72 horas após a inoculação do vírus. O mesmo foi observado para GROV. 57 Viremia (Log10 PFU/mL) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV 1 2 3 5 7 CARV 1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 2 3 5 7 9 GROV 1 2 3 5 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GUAV 1 2 3 5 7 TCMV 1 2 3 5 7 Dias após infecção Figura 13: Detecção e quantificação de vírus no sangue de camundongos infectados por OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV utilizando a metodologia de ensaio de placa. Grupos de animais foram infectados aos 3 dias de vida com a semente viral na DL100 e seu sangue foi retirado e processado para quantificação viral. As barras representam o valor médio ± SD de valores em duplicata. Os resultados representam 1 de 3 experimentos realizados independentemente. 58 O vírus CAR, de maneira similar ao TCMV, foi detectado em quantidades elevadas no 5o dia após a inoculação dos animais e os valorem mantiveram-se elevado até o final da doença (Figura 14). Contrariamente aos vírus anteriores, GUAV foi encontrado precocemente no cérebro, especificamente às 48 horas após o inóculo viral e sua quantidade foi aumentando com o decorrer do período alcançando valor máximo no 7o dia de infecção (Figura 14). Diante dos resultados obtidos, a quantificação viral no cérebro foi um dos parâmetros empregados para avaliar a atividade antiviral dos medicamentos RBV e IFN-αA em camundongos lactentes. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV 1 2 3 5 7 CARV 1 2 3 5 7 9 GROV ) Quantidade de vírus no cérebro (Log10 PFU/mL) 59 1 2 3 5 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GUAV 1 2 3 5 7 TCMV 1 2 3 5 7 Dias após infecção Figura 14: Detecção e quantificação de vírus no cérebro de animais infectados por OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV utilizando a metodologia de ensaio de placa. Grupos de animais foram infectados aos 3 dias de vida com a DL100 e seus cérebros foram retirados e processados para quantificação viral em dias determinados. As barras representam o valor médio ± SD de valores em duplicata. Os resultados representam 1 de 3 experimentos realizados independentemente. 60 4.1.5. Concentração máxima tolerada dos medicamentos RBV e IFNαA pelos camundongos suíços lactentes Normalmente, a RBV é um medicamento antiviral bem tolerado, contudo, ela freqüentemente causa anemia hemolítica em seus usuários (RANG & DALE; 1993; GRATTAGLIANO et al., 2005). Diante disso, foi procurado nos camundongos tratados com RBV sinal de uma possível anemia, através da medida diária do peso dos mesmos e comparando os valores obtidos com os pesos dos animais tratados com salina somente. Perda significante de peso perante administração de uma determinada dose foi interpretada como tóxica para os camundongos suíços lactentes. Os resultados para RBV estão dispostos na figura 15 (A e B), onde podemos observar que animais tratados com a concentração de 35mg/Kg/dia apresentaram aumento diário de peso semelhante aquele dos animais tratados com salina. Por outro lado, animais que receberam a dose de 45mg/Kg/dia mostraram dificuldade em adquirir massa corpórea, apresentando um ganho de peso sempre inferior ao dos camundongos controle (Figura 15B), sendo que a partir do 7o dia de tratamento a diminuição de peso tornou-se significante em relação aos animais tratados com salina (Figura 15A). Portanto, a concentração de 45mg de RBV/Kg de peso foi considerada tóxica para os camundongos suíços lactentes por provocar perda de peso significante (possível sinal de anemia) e foi por isso descartada. Então, a dose de escolha para ser utilizada durante o processo de avaliação antiviral da RBV in vivo foi a de 35mg de RBV/Kg de peso/dia. 61 Com relação ao IFN-α, dados da literatura mostram que o mesmo é bem tolerado independentemente por da diversas idade dos linhagens mesmos de (SASAKI camundongos et al., 1986; LUKASZEWSKI & BROOKS, 2000; BROOKS & PHILLPOTTS, 1999; FUCHIZAKI et al., 2003). Desta forma, até o presente momento não há relatos na literatura descrevendo reações adversas após administração de doses iguais a 105 UI/mL, a qual se aproxima da mais alta dose de IFN-α recombinante (30 milhões de unidades/dia) administrada em humanos para tratamento da hepatite B ou C (BROOKS & PHILLPOTTS, 1999). Assim, foram testadas doses ≤ 105 UI/mL em camundongos lactentes por um período de 10 dias. Os resultados mostram que todas as doses de IFN-α administradas intra-peritonealmente foram bem toleradas pelos animais durante todo o período experimental (Figura 16A). Contudo, houve pequena toxicidade durante a administração da concentração de 105 UI/mL, onde verificamos que os animais apresentaram certa dificuldade em ganhar peso quando comparado com os animais que receberam salina, mantendo um ganho de peso sempre inferior ao dos camundongos controle (Figura 16B). Entretanto, estas diferenças não foram significantes e assim sendo, a concentração de escolha experimentos in vivo foi a de 105 UI/mL de IFN-α. para realização dos Média do peso (gramas) 62 A Salina 35,0 mg/Kg 45,0 mg/Kg 15 * * * 10 ↓ 5 0 * 0 2 4 6 8 10 12 14 Média do ganho de peso (gramas) Dias de Vida 3 B 2 ↓ 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Dias de Vida Figura 15: Determinação da concentração máxima tolerada de RBV pelos camundongos suíços lactentes. O gráfico A representa a média do peso diário em gramas dos camundongos que receberam salina ou diferentes concentrações de RBV via intra-peritoneal, enquanto o gráfico B representa a média do ganho de peso medido diariamente dos animais tratados com salina ou diferentes concentrações de RBV. As setas representam o 1o dia de administração da RBV. O tratamento foi realizado por dez dias consecutivos. Resultados similares foram obtidos em um segundo experimento. *p<0.05, estatisticamente significante quando comparado com o grupo controle. Média do peso (gramas) 63 10 Salina A 8 103 UI/mL 6 105 UI/mL 104 UI/mL 4 ↓ 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Média do ganho de peso (gramas) Dias de vida 1.00 B 0.75 ↓ 0.50 0.25 0.00 0 2 4 6 8 10 12 14 Dias de Vida Figura 16: Determinação da concentração máxima tolerada de IFN-αA pelos camundongos suíços lactentes. O gráfico A representa a média do peso diário em gramas dos camundongos que receberam salina ou diferentes concentrações de IFN-αA via intra-peritoneal, enquanto o gráfico B representa a média do ganho de peso medido diariamente dos animais tratados com salina ou diferentes concentrações de IFN-αA. As setas representam o 1o dia de administração do IFN-αA. O tratamento foi realizado por dez dias consecutivos. Resultados similares foram obtidos em um segundo experimento. 64 4.2. Resultados referentes à Ribavirina 4.2.1. Atividade antiviral da RBV sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro Posteriormente à padronização do ensaio de placa e à determinação das doses não tóxicas de RBV sobre as células Vero E6, foram realizados experimentos para observar atividade antiviral da RBV sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM quando o medicamento era adicionado à cultura em períodos de 24 horas antes ou 2 horas após a infecção das células Vero E6. A tabela 6 mostra-nos que a RBV (50µg/mL) não foi capaz de inibir o ciclo replicativo dos vírus ORO, CAR ou GRO em nenhum dos tipos de tratamento. Contudo, houve uma porcentagem de inibição, não significante, sobre a formação de placas em cultura de células infectadas pelo vírus GUA (Redução de 7%), em tratamento iniciado 24 horas antes da infecção das células. Entretanto, a RBV foi capaz de inibir de maneira significante a formação de placas pelo TCMV em ambos períodos de tratamento, sendo que a inibição foi maior quando o tratamento das células foi realizado 24 horas antes da infecção, com uma redução de aproximadamente 85% (p<0.005) na formação de placas quando comparada à quantidade de placas formadas na cultura de células tratadas com meio somente (Tabela 6). A adição de RBV no período de 2 horas após a infecção das células com TCMV inibiu em 62% (p<0.01) a formação de placas (Tabela 6). 65 Tabela 6: Efeito da adição de RBV (50µg/mL) sobre a replicação dos Orthobunyavirus em cultura de células Vero E6. Porcentagem de inibição sobre a formação de placas (%) Tratamento 24h antes da Tratamento 2h após a infecção infecção OROV 0 0 CARV 0 0 GUAV 7 0 GROV 0 0 TCMV 85 Vírus a b a 62 b p<0.005 p<0.01 Este resultado demonstra que a RBV não possui atividade antiviral in vitro sobre OROV, CARV, GUAV e GROV. Ao contrário, a RBV parece apresentar atividade antiviral sobre o TCMV in vitro e a partir desta informação fomos avaliar a capacidade deste medicamento em inibir o TCMV em outras condições. Para tanto, células Vero E6 foram tratadas com concentrações ≤ 50µg/mL nos mesmos períodos analisados anteriormente, a fim de observarmos se doses menores de RBV também apresentariam capacidade de inibir a replicação do TCMV. A figura 17 (A e B) mostra-nos que somente a concentração de 50µg/mL é capaz de inibir o ciclo replicativo do TCMV em ambos períodos de tratamento, como demonstrado na tabela 6, sugerindo que o processo inibitório da RBV sobre o TCMV é dependente da dose. 66 10 A 9 8 7 6 * 5 Log10 PFU/mL 4 3 2 M 10 20 30 40 50 10 B 9 8 7 6 * 5 4 3 2 M 10 20 30 40 50 Concentração de RBV (ug/mL) Figura 17: Observação do efeito de concentrações menores ou iguais a 50µg/mL de RBV sobre a replicação do TCMV. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou este adicionado de diferentes concentrações de RBV, 24 horas antes (A) ou 2 horas após (B) a infecção pelo TCMV. 9 dias depois, o meio foi removido, as células foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram contadas. A escala de barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de quadruplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo experimento. *p<0.05 em relação às células infectadas e tratadas com meio. 67 Posteriormente, fomos verificar se a dose de 50µg/mL de RBV teria efeito inibitório sobre o TCMV quando adicionado à cultura em períodos de 24 e 48 horas após a infecção viral. Pela análise da figura 18, podemos observar que a RBV não mais apresenta atividade inibitória sobre a replicação do TCMV quando adicionada à cultura em períodos de 24 e 48 horas após infecção, sugerindo que a RBV não consegue inibir o processo replicativo quando este já foi iniciado, tendo capacidade inibitória somente quando adicionada antes do processo replicativo ou concomitantemente ao seu início, demonstrando que a RBV apresenta uma atividade antiviral limitada sobre TCMV. Apesar disso, fomos investigar se a ação inibitória da RBV sobre TCMV foi causada por uma redução nos níveis de GTP intracelular. Para elucidar isto, guanosina exógena na concentração de 30µg/mL foi adicionada à cultura junto com a RBV no período de 24 horas antes da infecção das células Vero E6 pelo TCMV. A figura 19 mostra-nos que a RBV inibe a replicação do TCMV, mas a adição de guanosina consegue reverter esta inibição, sugerindo que a atividade antiviral da RBV sobre TCMV está relacionada à inibição da enzima IMPDH e como conseqüência, à uma diminuição dos níveis de GTP intracelular que parece ser necessário ao processo replicativo do TCMV. 68 10 Log10 PFU/mL 9 8 7 6 5 4 3 2 M 24 48 Horas após infecção Figura 18: Observação do efeito da RBV sobre a replicação do TCMV, quando a droga foi adicionada 24 ou 48 horas após a infecção viral. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou este adicionado de RBV (50µg/mL) 24 ou 48 horas após a infecção pelo TCMV. Depois de 9 dias, o meio foi removido, as células foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram contadas. A escala de barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de quadruplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo experimento. 69 10 Log10 PFU/mL 9 8 7 6 5 4 3 2 M M+G RBV RBV+G Tipo de tratamento Figura 19: Adição de guanosina à cultura reverte a ação inibitória da RBV sobre a replicação do TCMV. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M), ou meio adicionado de guanosina (30µg/mL), ou meio adicionado de RBV (50µg/mL), ou meio adicionado de RBV e guanosina 24 horas antes da infecção pelo TCMV. Após 9 dias, o meio foi removido, as células foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram contadas. A escala de barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de quadruplicata. 70 4.2.2. Atividade antiviral da RBV sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM em experimentos in vivo Primeiramente iniciamos com a análise profilática, onde os animais foram tratados com 35mg de RBV/Kg/dia 24 horas antes de serem inoculados com a semente viral diluída para a DL100. Como controle um grupo de animais recebeu somente salina antes de serem infectados. Os resultados estão expostos na tabela 7, onde podemos notar que a RBV não foi capaz de prevenir a morte dos animais infectados por OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, assim como não foi capaz de aumentar o tempo de vida dos camundongos infectados, gerando resultados similares aos dos animais infectados e tratados com salina (Tabela 7). Tabela 7: Efeito da administração de RBV sobre a vida de animais infectados com os Orthobunyavirus. TMVb ± SD TMV± SD (Dias) (Dias) Salina RBV 1/16 (6%) 11.0 ± 2.8 11.5 ± 3.5 1/16 (6%)c 2/16 (12%) 9.0 ± 2.8 14.0 ± 7.0 GUAV 0/16 0/16 7.0 ± 1.4 7.0 ± 1.4 GROV 0/16 0/16 5.5 ± 2.1 5.5 ± 2.1 TCMV 0/16 0/16 8.5 ± 2.1 8.0 ± 1.4 Vivos a/total Vivos/total Salina RBV OROV 0/16 CARV Vírus a Razão entre o número de animais que sobreviveram pelo número total de animais que participaram do experimento b Tempo médio de vida (TMV) c Razão de sobrevivência (x%) 71 Diante de tais resultados, fomos pesquisar a quantidade de vírus no cérebro dos animais infectados e tratados com salina, bem como dos animais infectados e tratados com a RBV a fim de observarmos se existia alguma diferença em relação ao título viral no cérebro de ambos grupos analisados. A figura 20 mostra que tratamento com RBV 24 horas antes da infecção não apresenta qualquer influência na migração dos vírus para o cérebro, uma vez que os vírus apareceram em tempos iguais, com exceção do GROV, onde observamos que animais tratados com salina apresentaram vírus no cérebro aos três dias de infecção, enquanto nos animais tratados com RBV nada foi detectado neste dia. Adicionalmente, tratamento com RBV foi incapaz de diminuir o título viral no cérebro dos animais, pois as quantidades encontradas foram similares em ambos grupos estudados, podendo explicar o motivo pelo qual o período de morte de ambos grupos foi similar. Diante dos resultados obtidos, a análise terapêutica deixou de ser realizada, uma vez que já foi possível observar que a RBV não possui atividade antiviral sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vivo, sugerindo que estes vírus são resistentes à ação antiviral da RBV. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV Salina RBV 1 2 3 5 7 Dias após infecção Quantidade de vírus no cérebro (PFU/mL) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 CARV 1 2 3 5 7 9 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GUAV 1 Dias de infecção 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GROV 1 2 2 3 5 7 Dias de infecção mL) Quantidade de vírus no cérebro (Log10 PFU/mL) 72 3 5 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 TCMV 1 2 3 5 7 Dias após infecção Figura 20: Influência da RBV sobre a quantidade de vírus encontrado no cérebro de animais infectados com OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV. Camundongos foram inoculados i.p. com os vírus e foram tratados com RBV (35mg/Kg/dia) ou salina nos dias –1 a 5 da infecção, sendo que em dias determinados, os cérebros dos animais foram removidos e devidamente processados para quantificação viral por método de ensaio de placa. As barras representam a média ± SD da quantidade de vírus encontrado num “pool” de cérebros proveniente de dois animais por experimento. Estes independentes. resultados representam 1 de 2 experimentos 73 4.3. Resultados referentes ao Ácido Micofenólico 4.3.1. Avaliação da capacidade antiviral do MPA sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro Uma vez que a dose de 10µg/mL de MPA não apresenta efeito tóxico sobre as células Vero E6 e uma vez que esta concentração equivale aos níveis clinicamente terapêuticos (LIPSKY, 1996), a mesma foi escolhida para investigar as propriedades antivirais do MPA sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM in vitro. Assim, MPA adicionado às células Vero E6 em períodos de 24 horas antes ou 2 horas após a infecção com TCMV foi capaz de inibir de maneira significante o processo replicativo deste vírus (p<0.005), chegando a inibir por completo a replicação quando o tratamento das células foi iniciado 24 horas antes da infecção (Tabela 8). Adicionalmente, o MPA foi capaz de inibir significantemente a replicação do GUAV em tratamento anterior à infecção viral (p<0.05), sem, no entanto, inibir sua replicação quando o tratamento foi iniciado 2 horas após a infecção. Com relação aos vírus ORO, CAR e GRO, os mesmos não tiveram seu processo replicativo inibido pelo tratamento celular com MPA, demonstrando que MPA não apresenta efeito antiviral sobre estes vírus in vitro (Tabela 8). 74 Tabela 8: Efeito da adição de MPA (10µg/mL) sobre a replicação dos Orthobunyavirus brasileiros em cultura de células Vero E6. Porcentagem de inibição sobre a formação de placas (%) Tratamento 24h antes da Tratamento 2h após a infecção infecção OROV 0 0 CARV 0 0 GUAV 79 GROV 0 TCMV 100 Vírus a b a 0 0 b 95 b p<0.05 p<0.005 Com o intuito de saber se a diminuição da capacidade replicativa dos vírus GUA e TCM foi ocasionada por uma redução dos níveis de GTP intracelular, nós adicionamos à cultura de células Vero E6, guanosina exógena na concentração de 30µg/mL, concomitantemente ao tratamento com MPA, no período de 24 horas antes da infecção pelo GUAV e TCMV. A figura 21 mostra que o MPA inibe parcialmente a replicação do vírus GUA e inibe por completo a replicação do vírus TCM, porém a adição de guanosina consegue eficientemente reverter a ação inibitória do MPA sobre estes vírus, sugerindo que a atividade antiviral do MPA, neste caso, está relacionada à inibição da enzima IMPDH que tem como conseqüência uma redução dos níveis de GTP intracelular que parece ser necessário à replicação dos vírus GUA e TCM. Log10 PFU/mL 75 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GUAV M M+G MPA MPA+G M+G MPA MPA+G TCMV M Tipo de tratamento Figura 21: Adição de guanosina à cultura reverte a ação inibitória do MPA sobre a replicação do GUAV e TCMV. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M), ou meio adicionado de guanosina (30µg/mL), ou meio adicionado de MPA (10µg/mL), ou meio adicionado de MPA e guanosina 24 horas antes da infecção pelo GUAV ou TCMV. Em dias determinados, o meio de cultura foi removido, as células foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram contadas. A escala em barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de quadruplicata. Resultados similares foram obtidos em um segundo experimento. 76 Devido ao fato do MPA não possuir capacidade de inibir o ciclo replicativo dos vírus ORO, CAR, e GRO, e diante do fato do MPA apresentar efeito inibitório sobre GUAV somente quando o medicamento é adicionado 24 horas antes da infecção, nós decidimos analisar somente a ação do MPA sobre o TCMV em outras condições. Assim, fomos avaliar qual seria o efeito de concentrações ≤ 10µg/mL de MPA sobre a replicação do TCMV. A figura 22 mostra-nos que somente a concentração de 10µg/mL é capaz de inibir o ciclo replicativo do TCMV em períodos de tratamento de 24 horas antes ou 2 horas após a infecção viral, conforme observado na tabela 8, sugerindo que o processo inibitório do MPA sobre TCMV depende da dose administrada. Adicionalmente, fomos verificar se a dose de 10µg/mL de MPA teria efeito inibitório sobre TCMV quando adicionado à cultura em períodos de 24 e 48 horas após a infecção viral. Pela análise da figura 23, podemos observar que MPA perde sua capacidade inibitória sobre TCMV quando adicionada à cultura em períodos ≥ 24 horas após infecção. Este resultado demonstra que o MPA não consegue inibir o processo replicativo quando o mesmo já foi iniciado, sugerindo, que este composto, assim como a RBV, apresenta uma atividade antiviral limitada sobre TCMV. Log10 PFU/mL 77 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 A 0 0.625 1.25 2.5 5 10 B * 0 0,625 1,25 2,5 5 10 Concentração de MPA (µ µg/mL) Figura 22: Observação do efeito de concentrações ≤ 10µg/mL de MPA sobre a replicação do TCMV. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou este adicionado de diferentes concentrações de MPA 24 horas antes (A) ou 2 horas após (B) a infecção pelo TCMV. Nove dias depois, o meio foi removido, as células foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram contadas. A escala em barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de quadruplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo experimento. *p<0.05 em relação às células infectadas/tratadas com meio. Log10 PFU/mL 78 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 M 24 48 Horas após infecção Figura 23: Observação do efeito do MPA sobre a replicação do TCMV, quando a droga foi adicionada 24 ou 48 horas após a infecção viral. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou este adicionado de MPA (10µg/mL) 24 ou 48 horas após a infecção pelo TCMV. Depois de 9 dias, o meio foi removido, as células foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram contadas. A escala em barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de quadruplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo experimento. 79 4.3.2. Avaliação da capacidade antiviral da RBV e do MPA quando utilizados concomitantemente sobre os vírus ORO, CAR e GRO Até o momento, observamos que tanto a RBV quanto o MPA não tiveram qualquer ação antiviral sobre os vírus ORO, CAR e GRO quando testados separadamente. Sabendo que a RBV é um análogo da guanosina e um inibidor competitivo da IMPDH, e que o MPA é um inibidor de IMPDH não competitivo, nós investigamos a possibilidade de uma combinação destes dois medicamentos ser capaz de inibir a replicação dos vírus ORO, CAR e GRO. Primeiramente, fomos determinar uma combinação das drogas que não fosse tóxica para as células Vero E6. Para tanto, células Vero foram incubadas por três dias na presença das combinações dos compostos descritas na Tabela 9 e sua viabilidade foi determinada pelo uso do método de exclusão por “trypan blue” conforme item 3.3.3. Tabela 9: Combinações dos medicamentos RBV e MPA a serem testadas sobre as células Vero E6. Concentrações utilizadas em µg/mL RBV MPA 50 0 0 10 50 10 25 10 50 5 5 25 80 O resultado da toxicidade da combinação dos compostos está representado na figura 24, onde podemos observar que os compostos quando utilizados sozinhos não são tóxicos para as células Vero E6 como previamente sugerido (item 4.1.1). Entretanto, quando adicionamos à cultura 50µg/mL de RBV com 10µg/mL de MPA a viabilidade celular diminuiu em mais de 50%, sendo uma combinação extremamente tóxica para as células Vero E6. Contudo, as combinações restantes (Tabela 9) foram bem toleradas pelas células, mas a mais bem tolerada, gerando uma viabilidade celular em torno de 90%, foi a combinação de 25µg/mL de RBV com 10µg/mL de MPA, sendo portanto, a combinação escolhida para ser testada sobre as células infectadas pelos vírus ORO, CAR e GRO. A figura 25 mostra-nos os resultados provenientes da ação da combinação dos compostos RBV e MPA sobre OROV, CARV e GROV, onde podemos observar que a combinação escolhida foi capaz de inibir fracamente a replicação do CARV, sem, no entanto ser estatisticamente significante (p=0.07). Contrariamente, o uso conjunto de RBV e MPA não foi capaz de inibir o ciclo replicativo do OROV e GROV, sugerindo que o processo replicativo destes vírus parece ser pouco dependente dos níveis de GTP intracelular disponíveis. Concentração de MPA e RBV (µ g/mL) 81 MPA5/RBV25 MPA5/RBV50 MPA10/RBV25 MPA10/RBV50 RBV50 MPA10 Meio 0 25 50 75 100 125 % células Vero E6 viáveis Figura 24: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na presença de diferentes combinações dos compostos RBV e MPA. A contagem das células Vero E6 viáveis foi realizada em câmara de Neubauer após mantê-las incubadas em solução de “trypan blue”. O valor proveniente da contagem das células cultivadas com meio somente representa o controle negativo. As barras representam a média ± desviopadrão (SD) dos valores obtidos em triplicata. 82 Log10 PFU/mL 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV Meio RBV 50µ µ g/mL MPA 10µ µ g/mL MPA10/RBV25µ µ g/mL M RBV MPA MPA/RBV CARV M RBV MPA MPA/RBV GROV M RBV MPA MPA/RBV Tipo de tratamento Figura 25: Observação do efeito da combinação de RBV e MPA sobre a replicação dos vírus ORO, CAR e GRO. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou este adicionado de diferentes combinações de RBV e MPA 24 horas antes da infecção viral. Em dias pré-determinados, o meio foi removido, as células foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram contadas. A escala em barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de duplicata. Similar resultado foi obtido em um segundo experimento. 83 4.4. Resultados referentes ao Interferon-alfa 4.4.1. Atividade antiviral do IFN-α sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM in vitro Posteriormente à padronização do ensaio de placa e à determinação das doses não tóxicas de IFN-α-2a sobre as células Vero E6, foram realizados experimentos para observar se o IFN-α-2a apresentaria ou não atividade antiviral sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV quando o medicamento era adicionado à cultura em períodos de 24 horas antes ou 2 horas após a infecção das células Vero E6. Os resultados obtidos estão expostos na tabela 10, onde podemos observar que o IFN-α-2a na concentração de 100.000 UI/mL foi capaz de inibir de maneira significante (p<0.0005) o ciclo replicativo de todos os vírus em estudo nos dois tipos de tratamento. Tabela 10: Efeito da adição de IFN-α-2a (100.000 UI/mL) sobre a replicação dos Orthobunyavirus em cultura de células Vero E6. Porcentagem de inibição sobre a formação de placas (%) Tratamento 24h antes da Tratamento 2h após a infecção infecção OROV 99a 99a CARV 100 100 GUAV 100 100 GROV 100 100 TCMV 100 99a Vírus a p<0.0005 84 Uma vez que o IFN-α-2a foi capaz de inibir o ciclo replicativo de todos os vírus em estudo, fomos verificar se doses < 100.000 UI/mL teriam capacidade de inibir a replicação viral quando adicionada à cultura em período de 2 horas após a infecção. A figura 26 mostra que a concentração de 10.000 UI/mL foi capaz de inibir por completo a replicação dos vírus CAR, GUA e GRO (p<0.01) e inibiu parcialmente, mas significantemente a replicação do vírus TCM (p<0.01). Contudo, 10.000 UI/mL não teve qualquer efeito inibitório sobre a replicação do vírus ORO. Adicionalmente, podemos notar que a concentração de 1.000 UI/mL foi capaz de inibir de maneira significante a replicação dos vírus CAR, GRO e TCM (p<0.01), sem no entanto, apresentar atividade antiviral sobre OROV e GUAV. Em seguida, fomos observar se a concentração de 100.000 UI/ml de IFN-α-2a seria capaz de inibir a replicação dos vírus em períodos iguais e posteriores a 24 horas após a infecção. A figura 27 nos mostra que tratamento com IFN-α-2a iniciado 1 dia depois da infecção viral foi capaz de inibir significantemente a replicação do GUAV (p<0.01) e TCMV (p<0.001), sem alterar a replicação do OROV, CARV e GROV. Adicionalmente, tratamento realizado 2 dias após a infecção viral foi capaz de inibir a replicação do TCMV (p<0.001). Os resultados obtidos sugerem que IFN-α-2a apresenta atividade antiviral in vitro sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, porém esta é limitada e dependente tanto da concentração do medicamento como do início do período de tratamento. 85 10 OROV 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 M 1 10 100 1000 10000 10 CARV 9 Log10 PFU/mL 8 10 8 7 7 6 6 * 5 5 4 4 3 3 2 2 1 0 * M 1 10 100 1000 10000 1 0 * M 1 10 100 1000 10000 10 10 GROV 9 8 7 7 6 6 5 5 4 3 2 2 1 * 1 10 100 * 4 * 3 M TCMV 9 8 0 GUAV 9 1000 10000 * 1 0 M 1 10 100 1000 10000 Concentração de IFN-α α-2a (UI/mL) Figura 26: Observação do efeito de concentrações menores que 100.000 UI/mL de IFN-α-2a sobre a replicação dos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 poços foram tratadas com meio (M) ou este adicionado de diferentes concentrações de IFN-α-2a, duas horas após a infecção pelos vírus supracitados. Em dias determinados, as placas foram reveladas e contadas. A escala de barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de duplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo experimento. *p<0.01 em relação às células tratadas com meio somente. 86 Log10 PFU/mL 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV M 1 2 CARV M 1 2 3 GROV M 1 2 3 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GUAV * M 1 2 TCMV ** ** M 1 2 3 4 5 Dias de tratamento com IFN-α α-2a Figura 27: Observação do efeito do IFN-α-2a sobre a replicação dos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM, quando a droga é adicionada em períodos ≥ 24 horas após a infecção viral. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou este adicionado de IFN-α-2a (100.000 UI/mL) em períodos ≥ 24 horas após a infecção pelo vírus supracitados. Em dias determinados, as placas foram reveladas e contadas. A escala em barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de duplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo experimento. *p<0.01 e **p<0.001 em relação às células tratadas com meio somente. 87 4.4.2. Atividade antiviral do IFN-α sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV em experimentos in vivo Os experimentos in vivo foram iniciados com a análise profilática, onde os animais foram tratados com 100.000 UI/mL de IFN-α, 24 horas antes de serem inoculados com a semente viral diluída para a DL100. Como controle, um grupo de animais recebeu somente salina antes de serem infectados. Os resultados estão expostos na tabela 11, onde podemos observar que o IFN-α foi capaz de impedir em 100% a morte dos animais infectados por OROV e GROV, contrastando com a ausência de sobreviventes no grupo controle. Em relação aos animais infectados com CARV, podemos observar que houve uma sobrevida de aproximadamente 40% nos animais tratados com IFN-α, um valor superior àquele observado no grupo controle, que apresentou uma sobrevida de aproximadamente 10%, sugerindo que este aumento no número de sobreviventes possa estar relacionado à uma ação antiviral do IFN-α. Diferente do observado para OROV, GROV e CARV, o IFN-α foi incapaz de prevenir a morte dos animais infectados por GUAV e TCMV, porém, o tratamento com IFN-α prolongou um pouco o tempo médio de vida dos camundongos (Tabela 11). Pela comparação da sobrevida dos animais, podemos inferir que a citocina IFN-α, quando administrada 24 horas antes da infecção, tem atividade antiviral in vivo sobre OROV e GROV, mostrando uma ação antiviral parcial sobre CARV e ausente atividade sobre GUAV e TCMV. 88 Tabela 11: Efeito da administração de IFN-α sobre a vida de animais infectados com os Orthobunyavirus. TMVb ± SD TMV± SD (Dias) (Dias) Salina IFN-α 16/16 (100%) 8.5 ± 3.5 >20 2/16 (12%)c 6/16 (37%) 8.0 ± 2.8 9.0 ± 2.8 GUAV 0/16 0/16 6.0 ± 0 9.5 ± 3.5 GROV 0/16 16/16 (100%) 6.0 ± 0 >20 TCMV 0/16 0/16 6.5 ± 3.5 10.0 ± 2.8 Vivos a/total Vivos/total Salina IFN-α OROV 0/16 CARV Vírus a Razão entre o número de animais que sobreviveram pelo número total de animais que participaram do experimento b Tempo médio de vida (TMV) c Razão de sobrevivência (x%) Além dos efeitos observados na sobrevida dos animais, fomos verificar se o IFN-α era capaz de diminuir de maneira significativa a quantidade de vírus no cérebro. Os resultados estão apresentados na figura 28, onde podemos observar que animais infectados por OROV e GROV/tratados com IFN-α, 24 horas antes da infecção, não apresentaram em seu tecido cerebral qualquer vestígio de vírus, diferentemente dos animais controle, que apresentaram alta carga viral no tecido cerebral. Estes resultados indicam que o IFN-α foi capaz de inibir a replicação viral, bem como a migração de vírus para o sistema nervoso central, explicando a ausência de morte observada nos camundongos tratados com IFN-α. Animais infectados com CARV e tratados com IFN-α ou salina apresentam semelhantes quantidades de vírus no cérebro, sugerindo que 89 tratamento com IFN-α não impediu a migração e a replicação deste vírus no cérebro (Figura 28). Em relação aos animais infectados por GUAV e TCMV, podemos observar que tratamento com IFN-α não teve influência sobre a quantidade de vírus encontrada no tecido cerebral em relação aos grupos controles; assim como não influenciou no desenvolvimento do processo infeccioso, uma vez que os vírus apareceram no cérebro no mesmo período para ambos grupos (Figura 28). Estes resultados sugerem que IFN-α não tem ação antiviral in vivo sobre os vírus CAR, GUA e TCM, mas contrariamente apresenta atividade antiviral sobre os vírus ORO e GRO em tratamento iniciado 24 horas antes da infecção viral. Quantidade de vírus no cérebro (Log10 PFU/mL) 90 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV Salina IFN-α α 1 2 3 5 7 CARV 1 2 3 5 7 9 GROV 1 2 3 5 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GUAV 1 2 3 5 7 9 TCMV 1 2 3 5 7 9 11 Dias após infecção Figura 28: Influência do IFN-α sobre a quantidade de vírus encontrada no cérebro de animais infectados por OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV. Camundongos suíços com três dias de vida foram inoculados i.p. com os vírus e foram tratados com IFN-α (105 UI/mL) ou salina nos dias – 1 a 5 da infecção, sendo que em dias determinados, os cérebros dos animais foram removidos e devidamente processados para quantificação viral por método de ensaio de placa. As barras representam a média ± SD da quantidade de vírus encontrado num “pool” de cérebros proveniente de dois animais por experimento. Estes resultados representam 1 de 2 experimentos independentes. 91 Uma vez que IFN-α mostrou ser eficaz no tratamento profilático para as infecções causadas por OROV e GROV, fomos verificar se a droga seria capaz de inibir a doença causada por estes vírus em um tratamento terapêutico. Desta forma, fomos testar primeiramente uma terapia iniciada 3 horas após a infecção viral. Os resultados estão descritos na tabela 12, onde podemos observar que animais infectados por OROV e tratados com IFN-α apresentaram uma sobrevida 33%, porém, esta diferença não foi significante em relação ao grupo controle e demonstrou que o composto IFN-α perde sua eficácia antiviral quando administrado em tempos posteriores à infecção por OROV. Em relação ao vírus GRO, tratamento dos animais com IFN-α num período de 3 horas após a infecção, resultou numa sobrevida de 88%, demonstrando que o composto preserva sua capacidade antiviral sobre este vírus em período posterior à infecção. Tabela 12: Efeito da administração de IFN-α, 3 horas após a infecção de camundongos com os vírus ORO e GRO. TMV± SD (Dias) (Dias) Salina IFN-α 3/9 (33%) 5.0 ± 2.8 6.5 ± 2.1 8/9 (88%) 6.5 ± 2.1 >20 Vivos/total Salina IFN-α OROV 1/9 (11%)c GROV 0/9 Vírus a TMVb ± SD Vivos a/total Razão entre o número de animais que sobreviveram pelo número total de animais que participaram do experimento b Tempo médio de vida (TMV) c Razão de sobrevivência (x%) 92 Paralelamente aos experimentos de sobrevida, fomos verificar se o IFN-α era capaz de reduzir a quantidade de vírus no cérebro. Os resultados estão apresentados na figura 29, onde podemos notar que IFNα não impediu a migração e a replicação do OROV no cérebro, embora o vírus fosse encontrado somente no 7o dia de infecção, diferentemente do observado em animais tratados com salina, que apresentaram OROV no cérebro desde o 3o dia de infecção. Em relação ao GROV, podemos notar que tratamento com IFN-α no período de três horas após a infecção viral foi capaz de inibir a migração e a replicação deste vírus no cérebro dos camundongos, diferentemente do encontrado no cérebro dos animais do grupo controle que apresentaram alta carga viral no 5o dia após a infecção (Figura 29). Quantidade de vírus no cérebro (Log10 PFU/mL) 93 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV Salina IFN-α 1 2 3 5 7 GROV 1 2 3 5 Dias após infecção Figura 29: Influência do IFN-α sobre a quantidade de vírus encontrada no cérebro de animais infectados com OROV e GROV. Camundongos suíços com três dias de vida foram inoculados i.p. com os vírus e foram tratados com IFN-α (105 UI/mL) ou salina 3 horas após a infecção até o dia 7 da infecção, sendo que em dias determinados, os cérebros dos animais foram removidos e devidamente processados para quantificação viral por método de ensaio de placa. As barras representam a média ± SD da quantidade de vírus encontrado num “pool” de cérebros proveniente de dois animais por experimento. Estes resultados representam 1 de 2 experimentos independentes. 94 Uma vez que IFN-α teve um fraco efeito protetor sobre os animais infectados por OROV, em tratamento iniciado 3 horas após a infecção, fomos observar o efeito deste composto quando administrado no período de 24 horas após a infecção somente para o vírus GRO. A tabela 13 mostra que IFN-α administrado 24 horas após infecção pelo GROV perde seu efeito protetor, uma vez que a sobrevida dos camundongos foi de somente 22%, um valor não significante em relação ao grupo controle. Tabela 13: Efeito da administração de IFN-α, 24 horas após a infecção de camundongos com GROV. Vírus GROV a Vivos a/total Vivos/total Salina IFN-α 0/9 2/9 (22%)c TMVb ± SD TMV± SD (Dias) (Dias) Salina IFN-α 7.0 ± 2.8 7.0 ± 2.8 Razão entre o número de animais que sobreviveram pelo número total de animais que participaram do experimento b Tempo médio de vida (TMV) c Razão de sobrevivência (x%) Em seguida, fomos verificar a quantidade de vírus no cérebro dos animais infectados por GROV/tratados com IFN-α. A figura 30 mostra-nos que o composto IFN-α foi incapaz de impedir a replicação do vírus GRO no tecido cerebral dos camundongos tratados com a droga, mostrando carga viral similar àquela encontrada nos animais controle. Os resultados obtidos demonstram que o IFN-α apresenta atividade antiviral in vivo sobre os vírus ORO e GRO, porém esta atividade é limitada e dependente da precocidade do tratamento. Quantidade de vírus no cérebro (Log10 PFU/mL) 95 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GROV Salina IFN-α 1 2 3 5 7 Dias após infecção Figura 30: Influência do IFN-α sobre a quantidade de GROV encontrada no cérebro de animais infectados. Camundongos suíços com três dias de vida foram inoculados i.p. com GROV e foram tratados com IFN-α (105 UI/mL) ou salina 24 horas após a infecção até o dia 8 da infecção, sendo que em dias determinados, os cérebros dos animais foram removidos e devidamente processados para quantificação viral por método de ensaio de placa. As barras representam a média ± SD da quantidade de vírus encontrado num “pool” de cérebros proveniente de dois animais por experimento. Estes independentes. resultados representam 1 de 2 experimentos 96 5. DISCUSSÃO No presente estudo foram avaliadas drogas antivirais como a Ribavirina, o Ácido Micofenólico e o Interferon-alfa sobre os vírus Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guamá (GUAV), Guaroa (GROV) e Tacaiuma (TCMV), objetivando um tratamento eficaz para as doenças ocasionadas por estes vírus, que acometem pessoas em diversas regiões brasileiras e em diversos países centro/sul-americanos, sendo muitas vezes responsáveis por epidemias que geram um problema de saúde pública nas regiões afetadas, com grande impacto econômico e social. Assim sendo, fomos primeiramente buscar metodologias que pudessem avaliar de maneira adequada a atividade antiviral dos compostos Ribavirina (RBV), Ácido Micofenólico (MPA) e Interferon-alfa (IFN-α) sobre os Orthobunyavirus supracitados. Para tanto, o método de ensaio de placa, utilizado por muitos pesquisadores para titulação viral e neutralização (MORENS et al., 1985; DIAMOND, et al., 2000 e 2002; ROBERTSON et al., 2004), sofreu pequenas modificações para ser aplicado pela 1ª vez, na quantificação dos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM (Item 3.3.4 e Figuras 13 e 14). O ensaio de placa, padronizado para estes vírus, mostrou-se de fácil manuseio e reprodutibilidade podendo ser utilizado em experimentos in vitro com as drogas, bem como em experimentos in vivo para quantificação de vírus proveniente do tecido cerebral de camundongos infectados. Em seguida, foram padronizadas metodologias para serem utilizadas em experimentos in vivo, sendo que os resultados obtidos 97 mostraram pela 1ª vez a susceptibilidade de camundongos lactentes à infecção intra-peritoneal pelos vírus CAR, GUA e TCM (Figura 12 e Tabelas 4 e 5). Adicionalmente, foi observada migração e replicação viral no cérebro de animais infectados pela via intra-peritoneal e esta replicação mostrou-se associada à morte dos animais (Figura 14). Além disso, foram padronizadas as concentrações máximas dos medicamentos que poderiam ser utilizadas in vitro e in vivo, sem prejuízo para as células ou para os animais (Figuras 9 a 11, 15 e 16). A partir da padronização dos métodos in vitro e in vivo, foram testadas a ação antiviral dos medicamentos RBV, MPA e IFN-α sobre os Orthobunyavirus selecionados. Os resultados obtidos in vitro demonstraram que tanto a RBV quanto o MPA foram capazes de inibir a replicação do TCMV em tratamento iniciado 24 horas antes ou 2 horas após a infecção viral (Tabelas 6 e 8). Tal efeito inibitório foi revertido pela adição de guanosina exógena à cultura celular (Figuras 19 e 21), sugerindo que a atividade antiviral da RBV e do MPA sobre o TCMV ocorreu por inibição da enzima IMPDH, responsável pela diminuição nos níveis de GTP intracelular, dificultando a progressão do ciclo replicativo viral. Vários estudos demonstraram que a inibição da IMPDH, por ação ou da RBV ou do MPA, foi o principal mecanismo responsável por prejudicar a replicação in vitro de diversos vírus, dentre os quais podemos citar: vaccínia, herpes simplex, sarampo (CLINE et al., 1969), febre amarela vacinal 17D, vírus parainfluenza humana tipo 3 (hPIV3) (LEYSSEN et al., 2005), dengue (DIAMOND et al., 2002) e reovirus aviário (ROBERTSON et al., 2004). 98 Embora RBV e MPA tenham mostrado atividade antiviral sobre TCMV, esta foi abolida quando os medicamentos foram adicionados à cultura celular em concentrações menores que 50µg/mL para RBV (Figura 17) e 10µg/mL para MPA (Figura 22), sugerindo que a progressão do ciclo replicativo do TCMV necessita de uma quantidade determinada de GTP intracelular, que torna-se indisponível somente na presença de altas concentrações de RBV ou de MPA. Ademais, os compostos não apresentaram atividade antiviral sobre o TCMV quando colocados na cultura celular em períodos de 24 e 48 horas após a infecção viral (Figuras 18 e 23), sugerindo, também, que para inibir a replicação deste vírus fazse necessário diminuir os níveis de GTP intracelular antes que o processo replicativo se inicie ou logo após o seu início, caso contrário, uma vez estabelecido o ciclo replicativo, a quantidade intracelular de GTP parece não ter influência sobre o mesmo. Adicionalmente, a RBV e o MPA apresentaram efeito inibitório in vitro sobre a replicação do GUAV em tratamento iniciado 24 horas antes da infecção viral (Tabelas 6 e 8), porém, a atividade da RBV sobre o GUAV não foi significante, diferentemente da atividade do MPA que inibiu a formação de placas em 79% (p<0.05). Esta inibição produzida por MPA sobre GUAV foi também revertida pela adição de guanosina exógena à cultura celular (Figura 21), sugerindo que MPA diminui a replicação do vírus GUA por inibir a enzima IMPDH, ocasionando redução nos níveis de GTP intracelular. Entretanto, o vírus GUA parece ser menos susceptível à redução dos níveis de GTP intracelular que o vírus TCM, pois o MPA foi incapaz de inibir este vírus quando adicionado à cultura no tempo de 2 99 horas após a infecção viral (Tabela 8). Somado a isso, a replicação do TCMV foi inibida por RBV (Tabela 6), enquanto que a mesma droga, usada em igual concentração, não teve atividade antiviral sobre GUAV. Contrariamente ao observado para os vírus TCM e GUA, a RBV e o MPA, quando utilizadas sozinhas, não conseguiram inibir o ciclo replicativo dos vírus ORO, CAR e GRO, em nenhum dos períodos analisados (Tabelas 6 e 8). No entanto, quando os medicamentos foram adicionados conjuntamente à cultura celular em período antecedente à infecção (Figura 25), observou-se uma pequena inibição, somente no ciclo replicativo do CARV, porém esta não foi significante (p=0.07). Estes resultados sugerem que o processo replicativo destes vírus é pouco dependente das quantidades de GTP intracelular disponíveis, sendo, portanto, resistentes à ação antiviral da RBV e do MPA. SCHIEDEL e colaboradores (1987) produziram uma linhagem do vírus Sindbis (Família Togaviridae, gênero Alfavirus) resistente a RBV e ao MPA, pela passagem em série deste vírus em cultura de células de Aedes albopictus na presença de MPA. Nesta época, os autores sugeriram que o vírus Sindbis mutante conseguia replicar na presença de RBV e/ou MPA por apresentar uma guanililtransferase ou uma RNA polimerase (ou ambas) com maior afinidade pelo GTP intracelular. Entretanto, em estudos posteriores, SCHIEDEL e colaboradores (1991) revelaram que a resistência do vírus Sindbis mutante à RBV e ao MPA devia-se a uma alteração de sua guanililtransferase e não de sua RNA polimerase. A enzima guanililtransferase tem importante função na formação da estrutura de “cap 7-metilguanosina” (ou simplesmente “cap”) na porção 5’ 100 do RNA mensageiro celular e viral, sendo responsável por catalisar a adição de guanosina monofosfato (GMP) a esta estrutura (GOSWANI et al., 1979; BISAILLON & LEMAY, 1997). Contudo, os vírus pertencentes à família Bunyaviridae, não produzem as enzimas formadoras do “cap” do RNA mensageiro, pois possuem a capacidade de adquirir a porção “cap” do RNA mensageiro celular, utilizando-o para iniciar o processo de transcrição do seu RNA. Este mecanismo de aquisição do “cap” da célula do hospedeiro é conhecido como “cap-snatching” (JIN et al., 1993). Portanto, é pertinente sugerir que a resistência dos vírus ORO, CAR, GUA e GRO à ação antiviral da RBV e do MPA, bem como a susceptibilidade limitada do vírus TCM a estes compostos, pode estar relacionado a alguma particularidade da RNA polimerase destes vírus. Resistência ao MPA foi descrita somente para o vírus Sindbis (SCHIEDEL et al., 1987 e 1999), porém resistência à RBV foi relatada para o vírus HCV (YOUNG et al., 2003), Coronavirus SARS (TAN et al., 2004) e poliovírus (ARNOLD et al., 2005; PFEIFFER et al., 2003). Vírus HCV resistente à ação da RBV foi isolado de um grupo de pacientes apresentou que recebiam uma monoterapia mutação com caracterizada esta pela droga. Este substituição de HCV um aminoácido em sua RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). Interessantemente, quando o tratamento foi interrompido, alguns pacientes apresentaram vírus com reversão do aminoácido para o original, uma fenilalanina, e os mesmos mostraram ser susceptíveis à ação antiviral da RBV. A mutação ocorrida no HCV foi supostamente devida à 101 ação mutagênica da RBV. No entanto, nestes experimentos, não foi possível comprovar esta suposição (YOUNG et al., 2003). Poliovírus resistente à RBV foi isolado por dois grupos de pesquisadores, PFEIFFER e colaboradores (2003) e ARNOLD e colaboradores (2005), que observaram como causa da resistência, uma mutação em sua RdRp, por troca de um resíduo de glicina por um de serina. A possibilidade de mutagênese ter ocorrido foi descartada, uma vez que esta linhagem de caráter resistente foi detectada entre a população viral, sendo considerada como “quasispecie”, que apesar de ter resistência à RBV, foi vista ter fenótipo atenuado e restrito tropismo tecidual em camundongos susceptíveis à infecção pelo poliovírus (VIGNUZZI et al., 2006). Estes dados dão suporte à idéia de que a resistência à ação antiviral da RBV pelo OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV possa estar relacionada a alguma particularidade (mutação?) da RNA polimerase destes vírus. Entretanto, este dado não foi analisado no presente estudo. Os resultados obtidos in vivo em relação à RBV mostraram que este medicamento foi incapaz de prevenir a morte dos animais infectados por OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV (Tabela 7). Além disso, animais tratados com RBV ou tratados com salina apresentaram quantidades similares de vírus no cérebro (Figura 20). Sabe-se que a inoculação intraperitoneal de vírus produz primeiramente uma infecção sistêmica (GONZALEZ-SCARANO et al., 1996), que em nosso estudo (Figuras 12 e 14) foi seguida por migração e replicação dos vírus no cérebro dos camundongos lactentes (Figura 14), causando a morte dos mesmos 102 (Figura 12). Diante disso, podemos propor que a resistência observada in vivo do OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV à ação da RBV pode estar associada a alguma particularidade da RNA polimerase destes vírus que funciona normalmente, mesmo sofrendo interferências da RBV, o que permitiu multiplicação viral no organismo dos animais e migração destes vírus para o cérebro, causando encefalite e morte dos camundongos. Adicionalmente a isto, estudos mostraram que a RBV não é um medicamento eficaz no tratamento de infecções virais que utilizam a via intracerebral de inoculação em camundongos, a menos que o composto seja administrado diretamente no cérebro (ALLEN, 1980). Isto sugere que a RBV ou seus metabólitos ativos não alcancem concentrações adequadas no cérebro, provavelmente porque a RBV não atravessa eficientemente a barreira hemato-encefálica (KOFF et al., 1983). Desta forma, quando os vírus alcançam o cérebro após a infecção sistêmica, eles encontram um micro-ambiente favorável à sua replicação, sem interferência da RBV, aumentando a carga viral neste local e levando os animais à morte. Esta hipótese foi elegantemente demonstrada por KOFF e colaboradores (1983), que inocularam camundongos Balb/c intracerebralmente com vírus do dengue tipo 2 e trataram estes animais utilizando a via intra-peritoneal ou com RBV ou utilizando um derivado lipofílico da RBV, denominado 2’,3’,5’triacetato de ribavirina. Os autores observaram que animais tratados com o derivado lipofílico da RBV apresentaram tempo médio de vida e razão de sobrevivência significantemente superiores aos animais tratados com RBV somente. Isto teria ocorrido porque o derivado lipofílico consegue 103 atravessar mais eficientemente a barreira hemato-encefálica, o que não acontece com a RBV. Todos estes dados sugerem que, tanto a RBV como o MPA não apresentam atividade antiviral in vitro sobre os vírus ORO, CAR, GUA e GRO e mesmo que ambos compostos apresentem atividade antiviral sobre o vírus TCM nesta condição, esta é limitada e não comprovada in vivo, pelo menos no caso da RBV. Desta forma, tanto a RBV quanto o MPA devem ser desconsiderados como agentes terapêuticos para tratar as doenças causadas pelos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM. Resultados mais animadores foram observados em nosso estudo utilizando o IFN-α-2a, onde os resultados in vitro mostraram que o medicamento, na concentração de 100.000 UI/mL, foi capaz de inibir a replicação de todos os Orthobunyavirus selecionados, tanto em tratamento iniciado 24 horas antes como naquele realizado 2 horas após a infecção viral (Tabela 10). Adicionalmente, a concentração de 10.000 UI/mL de IFN-α-2a foi capaz de inibir em 100% a replicação de CARV, GUAV e GROV e inibiu significantemente a replicação do TCMV (p<0.01) em tratamento iniciado 2 horas após a infecção viral (Figura 26). Por fim, tratamento das células (100.000 UI/mL de IFN-α-2a) iniciado 24 horas após a infecção viral mostrou ação antiviral significante sobre GUAV e TCMV, mas não sobre OROV, CARV e GROV (Figura 27). Além disso, TCMV teve sua replicação significantemente inibida em tratamento iniciado 48 horas após a infecção viral (p<0.001) (Figura 27). Estes resultados sugerem que IFN-α-2a apresenta atividade antiviral in vitro sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, contudo, esta 104 é limitada e dependente tanto da concentração do medicamento como do momento de início do tratamento. As respostas provenientes do sistema interferon (Figura 7) representam o mais precoce mecanismo de defesa contra as infecções virais, e é um importante componente da imunidade inata (VILCEK & SEN, 1996). Sabe-se que RNAs de dupla fita (dsRNA) gerados durante a replicação viral são importantes indutores da resposta de IFN tipo I (JACOBS & LANGLAND, 1996). Os dsRNAs podem estimular a produção de IFN do tipo I por ativarem fatores de transcrição como IRF, NFκB e ATF (Citado por SEN et al., 2001) ou por ativar a via de sinalização do “Toll-like receptor 7” (TLR7) (Citado por BARTON & MEDZHITOV, 2003). Estes componentes celulares induzem produção de IFN-α/β e este, ao ligar-se a seu receptor IFNAR, ativa uma cascata de sinalização intracelular que culmina por ativar genes produtores de proteínas com atividade antiviral (Figura 7). Assim, células primadas com IFN tipo I possuem altos níveis das enzimas PKR e 2-5AS. Estas enzimas, ao interagirem com o dsRNA proveniente da replicação viral, ativarão vias que levarão à inibição da síntese protéica, clivagem de RNA e à apoptose da célula infectada (Figura 7) (STARK et al., 1998), evitando assim a replicação e a disseminação dos vírus pelo organismo do hospedeiro (Figura 7) (STARK et al., 1998). A resposta antiviral proveniente da estimulação celular por IFN tipo I é poderosa e imediata. Por isso, não surpreende que muitos vírus tenham desenvolvido no decorrer de sua evolução mecanismos inibidores destas respostas antivirais, que podem antagonizar desde a produção do IFN até as respostas provenientes de sua ativação (WEBER et al., 2002; 105 ALCAMI & KOSZINOWSKI, 2000; CEBULLA et al., 1999; GALE & KATZE, 1998; GOODBOURN et al., 2000; KALVAKOLANU, 1999; PLOEGH, 1998). Vírus de RNA de polaridade negativa que inclui os ortomixovírus, paramixovírus, filovírus, arenavírus e bunyavírus, produzem fatores com habilidade de inibir o sistema IFN (Citado por GARCIA-SASTRE, 2001). Como exemplo, podemos citar o vírus influenza A, um ortomixovírus, que produz uma proteína não estrutural denominada NS1, a qual funciona como antagonista tanto da produção de IFN como da resposta gerada pelo IFN, por se ligar aos dsRNAs, impedindo que estas moléculas ativem PKR e 2-5AS (Citado por GARCIA-SASTRE, 2001). Especificamente em relação aos bunyavírus, estudos têm demonstrado que a proteína não estrutural NSs produzida pelo vírus Bunyanwera (gênero Orthobunyavirus) é capaz de inibir a ativação dos fatores de transcrição IRF-3 e NFκB, impedindo assim, a produção de IFN do tipo I pela célula infectada (WEBER et al., 2002). De maneira semelhante, o vírus da febre do Vale Rift (gênero Phlebovirus) que também expressa a proteína NSs, foi visto bloquear a expressão do gene de IFN, porém, não por inibir os fatores IRF-3 ou NFκB, mas por inibir um fator de transcrição presente em um passo subseqüente (BOULOY et al,. 2001; BILLECOCQ et al., 2004). Contrariamente, membros pertencentes aos gêneros Hantavirus e Nairovirus não produzem a proteína NSs a partir do segmento S do seu genoma. Contudo, até o momento, nenhum membro do gênero Nairovirus foi visto induzir produção de IFN por células em cultura, enquanto que o vírus Hantaan, pertencente ao gênero Hantavirus, foi visto estimular produção de IFN-β por células endoteliais (PENSIERO et al., 106 1992), bem como, foi capaz de ativar os fatores de transcrição IRF-3 e NFκB (SUNDSTROM et al., 2001). Portanto, é possível que membros da família Bunyaviridae, que não expressem a proteína NSs, possam usar de outras estratégias para escapar da ação antiviral do IFN tipo I (WEBER et al., 2002). Estas informações explicam em parte os resultados obtidos in vitro neste trabalho (Tabela 10 e Figuras 26 e 27). Sabe-se que células Vero E6 são deficientes em genes que produzem IFN tipo I, sendo, por isso, incapazes de produzir IFN-α/β (MOSCA & PITHA, 1986). Contudo, as vias dependentes de IFN são funcionais e podem ser ativadas por IFN exógeno adicionado à cultura. Assim sendo, quando adicionamos IFN-α-2a em período de 24 horas antes da infecção por OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, as células Vero E6 já teriam sido primadas e assim adquiriram um estado antiviral, que as tornou resistentes à infecção, podendo isto ser responsável pela elevada inibição na formação de placas observada neste período (Tabela 10). Além disso, adição de IFN-α-2a em período de 2 horas após a infecção viral, teria ativado o sistema IFN no momento em que a replicação viral estava iniciando, inibindo-a de forma significante (Tabela 10). Porém, quando o medicamento foi adicionado em períodos ≥ a 24 horas após a infecção, quando a replicação viral já estava estabelecida, o IFN-α-2a inibiu apenas, de forma limitada, a replicação dos vírus GUA e TCM, sem atividade sobre OROV, CARV e GROV (Figura 27). Esta ausência de atividade antiviral sugere que, durante a replicação, estes vírus possam produzir algum fator que iniba a ação do sistema IFN sobre eles. Considerando que NSs tenha sido descrita apenas como inibidora 107 das vias de produção de IFN do tipo I, é possível que, em nossos experimentos, o mecanismo inibitório dos vírus sobre IFN tenha sido diferente pois o IFN-α-2a foi adicionado à cultura celular. Isto sugere que os Orthobunyavirus possuem outro mecanismo de escape das ações do IFN ainda não descrito. Contudo, os Orthobunyavirus possuem um genoma pequeno e é pouco provável que existam outros fatores virais além de NSs com atividade anti-IFN. Assim, é possível que esta proteína tenha funções anti-IFN ainda desconhecidas. Isto também poderia explicar como doses similares de IFN-α-2a não exibiram as mesmas capacidades inibitórias sobre os diferentes Orthobunyavirus estudados (Figura 26). Em relação aos resultados in vivo, podemos observar que a administração profilática de IFN-αA não foi capaz de evitar a morte de animais infectados pelos vírus CAR, GUA e TCM (Tabela 11), bem como não evitou a migração e a replicação viral no cérebro (Figura 28). Isto sugere que esta citocina, embora apresente atividade antiviral limitada in vitro sobre estes vírus, esta não ocorre in vivo. Este resultado está de acordo com o estudo realizado por BRINTON e colaboradores (1993), que observaram que camundongos infectados com CARV e tratados com IFN-α sucumbiam à infecção e morriam entre 4 a 6 dias como os animais tratados com salina, demonstrando que IFN-α não apresenta atividade antiviral sobre CARV, como observado por nós. Contrariamente, IFN-αA eficientemente evitou a morte dos camundongos infectados por OROV e GROV (Tabela 11) por inibir a migração e/ou replicação de vírus no cérebro destes animais (Figura 28), 108 em tratamento iniciado 24 horas antes da infecção, confirmando os resultados obtidos in vitro. Posteriormente, administração terapêutica da citocina em período de 3 horas após a infecção viral, preveniu a morte de mais de 80% dos animais infectados por GROV, assim como inibiu a migração e/ou replicação de vírus no tecido cerebral (Tabela 12 e Figura 29). Porém, quando a citocina foi administrada 24 horas após a infecção viral a sobrevida dos animais caiu para 22%, sendo que estes morreram por encefalite (Tabela 13 e Figura 30). Estes dados estão correlacionados com os obtidos nos experimentos in vitro (Tabela 10 e Figura 27), sugerindo que a citocina IFN-α, apresenta atividade antiviral sobre GROV. Porém, como observado in vitro, esta atividade é dependente da ministração precoce do IFN-α, até 3 horas após a infecção. Com relação ao OROV, a administração do IFN-α 3 horas após a infecção viral mostrou uma sobrevida de 33% (Tabela 12), sendo que os camundongos morreram devido à encefalite (Figura 29). Portanto, para o vírus ORO, a citocina IFN-α apresentou efeito antiviral somente em tratamento profilático e não em tratamento terapêutico. Os resultados obtidos in vivo com a citocina IFN-α sugerem que os vírus ORO e GRO, mas principalmente CARV, GUAV e TCMV apresentam algum mecanismo de escape das ações antivirais do sistema IFN, que pode ou não estar associado à proteína NSs produzida pelos mesmos, como previamente discutido. É válido ressaltar ainda, que as citocinas testadas in vitro e in vivo fazem parte de um grupo maior de citocinas de IFN-α existentes 109 (Tabela 1). Portanto, não se pode afirmar categoricamente se outras citocinas de IFN-α apresentariam propriedades antivirais similares às aqui observadas. TAN e colaboradores (2004) testaram in vitro 4 tipos de citocinas IFN-α disponíveis no mercado, Roferon-A (IFN-α-2a), Intron A (IFN-α-2b), Wellferon (IFN-α-n1) e Alferon (IFN-α-n3), sobre o Coronavirus SARS (SARS-CoV) e observaram que somente 2 delas, o Wellferon e o Alferon, conseguiram inibir o efeito citopático ocasionado pelo vírus em cultura de células Vero E6. O mecanismo relacionado a estas diferenças de atividade não é conhecido, sendo que a diferença primária entre estes IFNs está relacionado à sua origem, onde algumas preparações são derivadas de células linfoblastóides humanas ou leucócitos humanos derivados do sangue periférico estimulados com vírus Sendai, enquanto outras preparações foram produzidas por E. coli ou por células de mamíferos transfectadas (FOSTER & FINTER, 1998). O IFN-α usado em nossos experimentos foi o Roferon-A e o IFN-αA ambos produzidos por E. coli, sendo que o RoferonA não apresentou qualquer atividade antiviral sobre SARS-CoV, no trabalho realizado por TAN e colaboradores. De qualquer forma, os resultados obtidos para IFN-α sugerem que este medicamento apresenta atividade antiviral in vitro sobre os vírus CAR, GUA e TCM, porém esta ação é limitada e não foi comprovada in vivo. Portanto, o mesmo não deve ser considerado como agente terapêutico para tratar as doenças causadas por estes vírus. No entanto, o IFN-α apresentou atividade antiviral profilática in vitro e in vivo sobre OROV e GROV e também mostrou ação antiviral terapêutica para GROV. Este 110 medicamento, se confirmada uma ação similar em seres humanos, poderia ser utilizado profilaticamente durante epidemias ocasionadas por estes dois vírus e poderia ser utilizado terapeuticamente para GROV em caso de acidentes laboratoriais, sendo que neste caso o tratamento deve ser iniciado dentro de até 3 horas após a inoculação acidental. O vírus GRO pertence ao sorogrupo da encefalite da Califórnia, cujos vírus são responsáveis por causar epidemias em várias regiões norte-americanas (PAVLOVIC et al., 2000), para os quais ainda não existe tratamento antiviral. A susceptibilidade do GROV à atividade antiviral do IFN-α poderia ser utilizado como estímulo ao início de pesquisas da ação deste composto sobre o vírus da encefalite da Califórnia, objetivando amenizar as doenças ocasionadas por este vírus. Em suma, a metodologia utilizada nos experimentos in vitro e in vivo, viabilizou-nos pesquisar a ação antiviral de 3 diferentes compostos sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM pertencentes ao gênero Orthobunyavirus. Mesmo obtendo resultados favoráveis somente para os vírus ORO e GRO com o medicamento IFN-α, esta metodologia poderá ser utilizada ainda para selecionar outros compostos com atividade antiviral, conhecidos ou não, para tratar as doenças ocasionadas pelos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM que tanto transtorno causam às pessoas atingidas. Consideramos importante para o país, desenvolver tecnologias que permitam descobrir a viabilidade antiviral de compostos e, nesse sentido, a metodologia utilizada no presente trabalho, realizando testes in 111 vitro e in vivo, se mostrou ferramenta simples e confiável que pode continuar a ser utilizada na avaliação preliminar da capacidade antiviral de um número ilimitado de compostos, sobre vírus que tenham interesse em saúde pública. 112 6. CONCLUSÕES 6.1. A metodologia in vitro e in vivo utilizada neste estudo mostrou-se adequada para a seleção de compostos com atividade antiviral sobre os vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma; 6.2. A Ribavirina apresenta atividade antiviral in vitro somente sobre o vírus Tacaiuma, sendo que esta atividade é dependente da concentração e do período de administração do medicamento; 6.3. A atividade antiviral in vitro da Ribavirina sobre o vírus Tacaiuma, está associada à redução dos níveis intracelulares de GTP; 6.4. O Ácido Micofenólico apresenta atividade antiviral sobre os vírus Guamá e Tacaiuma em experimentos in vitro, sendo que esta atividade depende da concentração do medicamento e do período de administração do composto; 6.5. A atividade antiviral do Ácido Micofenólico sobre os vírus Guamá e Tacaiuma está relacionada à redução nos níveis de GTP intracelular; 6.6. O medicamento Interferon-alfa apresenta atividade antiviral in vitro sobre todos os Orthobunyavirus selecionados, sendo que esta 113 atividade é dependente da concentração do medicamento e do período de administração do composto; 6.7. Interferon-alfa apresenta atividade antiviral in vivo sobre os vírus Oropouche e Guaroa, em período precoce da infecção, sendo, portanto, potencialmente utilizável doenças ocasionadas por estes vírus. para tratar preventivamente as 114 7. RESUMO Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guamá (GUAV), Guaroa (GROV) e Tacaiuma (TCMV) são vírus de RNA que pertencem ao gênero Orthobunyavirus, família Bunyaviridae. Estes vírus são transmitidos por mosquitos e causam doença febril e encefalite em seres humanos, tendo importância em saúde pública no Brasil. Objetivando tratar ou amenizar os sintomas destas doenças, testou-se in vitro e/ou in vivo os compostos ribavirina (RBV), ácido micofenólico (MPA) e interferon-alfa (IFN-α) sobre os vírus supracitados. Os resultados mostraram que a RBV (50µg/mL) possui atividade antiviral in vitro sobre TCMV quando o tratamento é realizado precocemente e esta atividade, relacionou-se à redução nos níveis de GTP intracelular. MPA (10µg/mL) mostrou atividade antiviral in vitro sobre os vírus GUA e TCM, quando adicionado precocemente à cultura celular. Esta atividade também, se relacionou com redução nos níveis de GTP intracelular. IFN-α (105UI/mL) mostrou atividade antiviral in vitro sobre todos os Orthobunyavirus em estudo, quando adicionado à cultura celular antes da infecção viral. A atividade antiviral observada in vitro pela ação do IFN foi confirmada in vivo sobre os vírus ORO e GRO em tratamento realizado antes da infecção viral. Além disso, IFN-α (105UI/mL) mostrou atividade antiviral sobre GROV em tratamento iniciado 3 horas após a infecção dos camundongos lactentes. Portanto, os resultados sugerem que o IFN-α é um medicamento potencialmente utilizável na prevenção e/ou tratamento das doenças ocasionadas pelo OROV e GROV. 115 8. ABSTRACT Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guama (GUAV), Guaroa (GROV), and Tacaiuma (TCMV) are RNA viruses that belong to the Orthobunyavirus genus, Bunyaviridae family. These viruses are transmitted by mosquitoes, and cause human febrile illness and encephalitis, having importance in public health in Brazil. Aiming to treat or reduce the symptoms of these diseases, ribavirin (RBV), mycophenolic acid (MPA) and interferon-alpha (IFN-α) coumponds were tested in vitro and/or in vivo on the above-mentioned viruses. The results indicated that RBV (50µg/mL) showed in vitro antiviral activity on TCMV when the treatment was early performed. This activity was associated with reduction of intracellular GTP levels. MPA (10µg/mL) exhibited in vitro antiviral activity on GUAV and TCMV when early added to the cell cultures. This activity was also associated with reduction on intracellular GTP levels. IFN-α (105 IU/mL) demonstrated in vitro antiviral activity on all Orthobunyavirus studied when added to cell cultures just before viral infection. The in vitro antiviral activity observed for IFN-α was confirmed in vivo on ORO and GRO viruses when treatment was carried out before viral infection. Moreover, IFN-α (105 IU/mL) showed antiviral activity on GROV when treatment was initiated 3 hours after infection of suckling mice. Thus, the results suggest that IFN-α may be a potentially useful drug for the prevention and/or treatment of diseases caused by OROV and GROV. 116 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. Citocinas, p.:268-269. In A.K. Abbas and A.H. Lichtman (eds). Imunologia Celular e Molecular 5o edição. Elsevier Editora Ltda, Rio de Janeiro, Brasil. 2005. ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. Mecanismos efetores da imunidade mediada por células, p.:307-326. In A.K. Abbas and A.H. Lichtman (eds). Imunologia Celular e Molecular 5o edição. Elsevier Editora Ltda, Rio de Janeiro, Brasil. 2005. AEBI, M.; FÄH, J.; HURT, N.; SAMUEL, C.E.; THOMIS, D.; BAZZIGHER, L.; PAVLOVIC, J.; HALLER, O.; STAEHELI, P. cDNA strutures and regulation of two interferon-induced human Mx proteins. Mol. Cell. Biol., 9: 5062-5072, 1989. ALCAMI, A.; KOSZINOWSKI, U.H. Viral mechanisms of immune evasion. Immunol. Today, 21: 447-455, 2000. ALLEN, L.B. Review of in vivo efficacy of ribavirin, p.:43-58. In: R.A. Smith and W. Kirkpatrick (eds). Ribavirin: a broad spectrum antiviral agent. Academic Press Inc., New York, USA. 1980. ALLISON, A.C.; EUGUI, E.M. Purine metabolism and immunosuppressive effects of mycophenolate mofetil (MMF). Clin Transplant, 10: 77– 84, 1996. ANDERSON, C.R.; SPENCE, L.; DOWNS, W.G.; AITKEN, T.H.G. Oropouche virus: a new human disease agent from Trinidad, West Indies. Am. J. Trop. Med. Hyg., 10: 574-578, 1961. ANDREI, G.; De CLERCQ, E. Inhibitory effect of selected antiviral compounds on arenavirus replication in vitro. Antiviral Res., 14(4–5): 287-299, 1990. ARAÚJO, R.; DIAS, L.B.; ARAÚJO, M.T.F.; PINHEIRO, F.; OLIVA, O.F.P. Alterações ultraestruturais no fígado de hamster após inoculação experimental com arbovírus Oropouche (Tipo BeAn 19991). Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 20: 45-54, 1978. 117 ARNHEITER, H.; FRESE, M.; KAMADUR, R.; MEIER, E.; HALLER, O. Mx transgenic mice-animal models of health. Curr. Top. Microbiol., 206: 119-147, 1996. ARNOLD, J.J.; VIGNUZZI, M.; STONE, J.K.; ANDINI, R.; CAMERON, C.E. Remote site control of na active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase. J. Biol. Chem., 280(27): 2570625716, 2005. BARTON, G.M.; MEDZHITOV, R. Linking Toll-like receptors to IFN-α/β expression. Nature Immunol., 4(5): 432-433, 2003. BELARDELLI, F. Role of interferons and other cytokines in the regulation of the immune response. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand., 103: 161-179, 1995. BELARDELLI, F.; GRESSER, I. The neglected role of type I interferon in the T-cell response: implications for its clinical use. Immunol. Today., 17: 369-372, 1996. BILLECOCQ, A.; SPIEGEL, M.; VIALAT, P.; KOHL, A.; WEBER, F.; BOULOY, M.; HALLER, O. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virology, 78(18): 9798-9806, 2004. BISAILLON, M.; LEMAY, G. Viral and cellular enzymes involved in synthesis of mRNA cap structure. Virology, 236(1): 1–7, 1997. BOUGIE, I.; BISAILLON, M. The broad spectrum antiviral nucleoside ribavirin as a substrate for a viral RNA capping enzyme. J. Biol. Chem., 279(21): 22124–22130, 2004. BOULOY, M.; JANZEN, C.; VIALAT, P.; KHUN, H.; PAVLOVIC, J.; HUERRE, M.; HALLER, O. Genetic evidence for an interferon- antagonistic function of Rift Valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virology, 75(3): 1371-1377, 2001. BRINTON, M.A.; GAVIN, E.I.; LO, W.K.; PINTO, A.J.; MORAHAN, P.S. Characterization of murine Caraparu Bunyavirus liver infection and immunomodulator-mediated antiviral protection. Antiviral Res., 20(2): 155-171, 1993. 118 BROOKS, T.J.G.; PHILLPOTTS, R.J. Interferon-alpha protects mice against lethal infection with St Louis encephalitis virus delivered by the aerosol and subcutaneous routes. Antiviral Res., 41: 5764, 1999. CALISHER, C.H. History, classification, and taxonomy of viruses in the family Bunyaviridae, p. 1-17. In RM Elliot (ed.), The Bunyaviridae. Plenum Press, Inc., New York, NY. 1996. CASSIDY, L.F.; PATTERSON, J.L. Mechanism of La Crosse virus inhibition by ribavirin. Antimicrob. Agents Chemother., 33: 2009-2011, 1989. CEBULLA, C.M.; MILLER, D.M.; SEDMAK, D.D. Viral inhibition of interferon signal transduction. Intervirology, 42: 325-330, 1999. CLINE, J.C.; NELSON, J.D.; GERZON, K.; WILLIAMS, R.H.; DELONG, D.C. In vitro antiviral activity of mycophenolic acid and its reversal by guanine-type compounds. Applied Microbiology, 18(1): 14-20, 1969. COLBY, T.D.; VANDERVEEN, K.; STRICKLER, M.D.; MARKHAM, G.D.; GOLDSTEIN, B.M. Crystal structure of human type II inosine monophosphate dehydrogenase: implications for ligand binding and drug design. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96: 3531-3536, 1999. COOPER, A.C.; BANASIAK, N.C.; ALLEN, P.J. Management and prevention strategies for respiratory syncytial virus (RSV) bronchiolitis in infants and young children: a review of evidence-based practice interventions. Pediatr. Nurs., 29(6): 452–456, 2003. CRANCE, J.M., GRATIER, D.; GUIMET, J.; JOUAN, A. Inhibition of sandfly fever Sicilian virus (Phlebovirus) replication in vitro by antiviral compounds. Res. Virol., 148: 353-365, 1997. CROTTY, S.; MAAG, D.; ARNOLD, J.J.; ZHONG, W.; LAU, J.Y.; HONG, Z.; ANDINO, R.; CAMERON, C.E. The broad-spectrum antiviral ribonucleoside ribavirin is an RNA virus mutagen. Nat. Med., 6: 1375-1379, 2000. 119 DANDOY, F.; De MAEYER, E.; BONHOMME, F.; GUENET, J.L.; De MAEYER-GUIGNARD, J. Segregation of restriction fragment length polymorphism in an interspecies cross of laboratory and wild mice indicates tight linkage of the murine interferon-b gene to the murine interferon-a genes. J. Virology, 56: 216-220, 1985. DARNELL, J.E.;. KERR Jr, I.M.; STARK, G.R. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science, 264: 1415-1421, 1994. DAVIS, G.L.; ESTEBAN-MUR, R.; RUSTGI, V.; HOEFS, J.; GORDON, S.C.; TREPO, C.; SHIFFMAN, M.L.; ZEUZEM, S.; CRAXI, A.; LING, M.H.; ALBRECHT, J. Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin for the treatment of relapse of chronic hepatitis C. International Hepatitis Interventional Therapy Group. N. Engl. J. Med. 339: 1493-1499, 1998. DAY, C.W.; SMEE, D.F.; JULANDER, J.G.; YAMSHCHIKOK, V.F.; SIDWELL, R.W.; MORREY, J.D. Error-prone replication of West Nile virus caused by ribavirin. Antiviral Res., 67(1): 38-45, 2005. DER, S.D.; ZHOU, A.; WILLIAMS, B.R.; SILVERMAN, R.H. Identification of genes differentially regulatedby by interferon alpha, beta, or gamma using oligonucleotide arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 15623-15628, 1998. DIAMOND, M.S.; ROBERTS, T.G.; EDGIL, D.; LU, B.; ERNST, J.; HARRIS, E. Modulation of dengue virus infection in human cells by alpha, beta, and gamma interferons. J. Virology, 74: 4957-4966, 2000. DIAMOND, M.S.; ZACHARIAH, M.; HARRIS, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology, 304: 211-221, 2002. DIXON, K.E.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; TRAVASSOS DA ROSA, J.F.; LLEWELLYN, C.H. Oropouche virus. II. Epidemiological observations during an epidemie in Santarém, Pará, Brazil in 1975. Am. J. Trop. Med. Hyg., 30: 161-164, 1981. 120 DREIDING, P.; STAEHELI, P.; HALLER, O. Interferon-induced protein Mx accumulates in nuclei of mouse cells expressing resistance to influenza viruses. Virology, 140: 192-196. 1985. DURR, F.E.; LINDH, H.F. Efficacy of ribavirin against influenza virus in tissue culture and in mice. Ann. N. Y. Acad. Sci., 255: 366-371, 1975. ELLIOT, R.M.; CALISHER, C.H.; GOLDBACH, R.; MOYER, J.T.; NICHOL, S.T.; PETTERSSON, R.; PLYUSNIN, A.; SCHMALJOHN, C.S. Bunyaviridae, p. 599-621. In C.M. Fauquet, M.H.V. van Regenmortel, D.H.L. Bishop, E.B. Carstens, M.K. Estes, S.M. Lemon, J. Maniloff, M.A. Mayo, D.H. McGooch, C.R. Pringle, and R.B. Wickner (ed.), Virus taxonomy. Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 2000. ELLIOTT, R.M. Emerging viruses: the Bunyaviridae. Mol. Med., 9: 572577, 1997. EPINETTE, W.W.; PARKER, C.M.; JONES, E.L.; GREIST, M.C. Mycophenolic acid for psoriasis. J. Am. Acad. Dermatol., 17: 962– 971, 1987. ERIKSSON, B.; HELGSTRAND, E.; JOHANNSON, N.; LARSSON, A.; MISIONNY, A.; NOREN, J.O.; PHILIPSON, L.; STENBERG, K.; STENING, G.; STRIDH, S.; OBERG, B. Inhibition of influenza virus ribonucleic acid polymerase by ribavirin triphosphate. Antimicrob. Agents Chemother., 11: 946-951, 1977. FERNANDEZ-LARSSON, R.; O’CONNELL, K.; KOUMANS, E.; PATTERSON, J.L. Molecular analysis of the inhibitory effect of phosphorylated ribavirin on the vesicular stomatitis virus in vitro polymerase reaction. Antimicrob. Agents Chemother., 33(10): 1668–1673, 1989. FIGUEIREDO, L.T.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; FIORILLO, A.M. Níveis de anticorpos para arbovírus em indivíduos da região de Ribeirão Preto, SP (Brasil). Rev. de Saúde Pública São Paulo, 20: 204-211, 1986. 121 FLEISCHMANN, C.M.; FLEISCHMANN, W.R. Jr. Differential antiproliferative activities of IFNs a, b and g: kinetics of establishment of their antiproliferative effects and the rapid development of resistance to IFNs a and b. J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 2: 173-185, 1988. FLOREY, H.W.; GILLIVER, K.; JENNINGS, M.A.; SANDERS, A.G. Mycophenolic acid: an antibiotic from Penicillium brevicompactum Dierckx. Lancet, i: 46–49, 1946. FOSTER, G.R.; FINTER, N.B. Are all Tipe I human interferons equivalent? J. Viral Hepatitis, 5: 143-152, 1998. FRESE, M.; KOCHS, G.; FELDMANN, H.; HERTKORN, C.; HALLER, O. Inhibition of Bunyaviruses, Phleboviruses, and Hantaviruses by human MxA protein. J. Virology, 70: 915-923, 1996. FRESE, M.; KOCHS, G.; MEIER-DIETER, U.; SIEBLER, J.; HALLER, O. Human MxA protein inhibits tick-borne Thogoto virus but not Dhori virus. J. Virology, 69: 3904-3909, 1995. FUCHIZAKI, U.; KANEKO, S.; NAKAMOTO, Y.; SUGIYAMA, Y.; IMAGAWA, K.; KIKUCHI, M.; KOBAYASHI, K. Synergistic antiviral effect of a combination of mouse interferon-alpha and interferon-gamma on mouse hepatitis virus. J. Med. Virol., 69(2): 188-194, 2003. GALE, M.I.; KATZE, M.G. Molecular mechanisms of interferon resistance mediated by viral-directed inhibition of PKR, the the interferon induced protein kinase. Pharmacol. Ther., 78: 29-46, 1998. GARCIA-SASTRE, A. Inhibition of interferon-madiated antiviral responses by influenza A viruses and other negative-strand RNA viruses. Virology, 279: 375-384, 2001. GOLDBLUM, R. Therapy of rheumatoid arthritis with mycophenolate mofetil. Clin. Exp. Rheumatol., 11: S117–119, 1993. GONG, Z.J.; De MEYER, S.; CLARYSSE, C.; VERSLYPE, C.; NEYTS, J.; De CLERCQ, E.; YAP, S.H. Mycophenolic acid, an immunosuppressive agent, inhibits HBV replication in vitro. J. Viral Hepat., 6: 229-236, 1999. 122 GONZALEZ-SCARANO, F.; NATHANSON, N. Bunyaviruses, p. 1473-1504. In: B.N. Fields; D.M. Knipe (ed). Fields Virology, LippincottRaven, Philadelphia, USA. 1996. GOODBOURN, S.; DIDCOCK, L.; RANDALL, R.E. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures. J. Gen. Virol., 81: 2341-2364, 2000. GOSWAMI, B.B.; BOREK, E.; SHALMA, D.K.; FUJITAKI, J.; SMITH, R.A. The broad spectrum antiviral agent ribavirin inhibits capping of mRNA. Biochem. Biophis. Res. Commun., 89: 830-836, 1979. GRACI, J.D.; CAMERON, C.E. Mechanisms of action of ribavirin against distinct viruses. Rev. Med. Virol., 16(1): 37-48, 2006. GRATTAGLIANO, I.; RUSSMANN, S.; PALMIERI, V.O.; PORTINCASA, P.; PALASCIANO, G.; LAUTERBURG, B.H. Glutathione peroxidase, thioredoxin, and membrane protein changes in erythrcytes predict ribavirin-induced anemia. Clin. Pharmacol. Ther., 78: 422-432, 2005. GRESSER, I. Biologic effects of interferons. J. Invest. Dermatol., 95(6 Suppl): 66S-71S, 1990. GROOT, H.; OYA, A.; BERNAL, C.; BARRETO-REYES, P. Guaroa virus, a new agent isolated in Colombia, South America. Am. J. Trop. Med. Hyg., 8: 604-609, 1959. HALLER, O.; FRESE, M.; KOCHS, G. Mx proteins: mediators of innate resistance to RNA viruses. Rev. Sci. Technol. Off. Int. Epizootol., 17: 220-230, 1998. HRUSKA, J.F.; BERNSTEIN, J.M.; DOUGLAS, R.G. Jr; HALL, C.B. Effects of ribavirin on respiratory syncytial virus in vitro. Antimicrob. Agents Chemother., 17: 770-775, 1980. HUGGINS, J.W.; KIM, G.R.; BRAND, O.M.; McKEE Jr, K.T. Ribavirin therapy for Hantaan virus infection in suckling mice. J. Infect. Dis., 153(3): 489-497, 1986. HULTGREN, C.; MILICH, D.R.; WEILAND, O.; SALLBERG, M. The antiviral compound ribavirin modulates the T helper (Th) 1/Th2 subset 123 balance in hepatitis B and C virus-specific immune responses. J. Gen. Virol., 79(Pt10): 2381-2391, 1998. ICHIMURA, H.; LEVY, J.A. Polymerase substrate depletion: a novel strategy for inhibiting the replication of the human immunodeficiency virus. Virology, 211: 554-560, 1995. ISAACS, A.; LINDENMANN, J. Virus interference I. The interferon. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 147(927): 258-267, 1957. IVERSSON, L.B. Current status of the eco-epidemiological knowledge on arboviruses pathogenic to humans in the Atlantic Forest region of the State of São Paulo. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 36: 343-353, 1994. IVERSSON, L.B.; SILVA, R.A.M.S.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; BARROS, V.L.R.S. Circulation of Eastern Equine Encephalitis, Western Equine Encephalitis, Ilhéus, Maguari, and Tacaiuma viruses in equines of the Brazilian Pantanal, South America. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 35: 355-359, 1993. JACOBS, B.L.; LANGLAND, I.O. When two strands are better than one: The mediators and modulators of the cellular responses to double-strand RNA. Virology, 219: 339-349, 1996. JAHRLING, P.B.; HESSE, R.A.; EDDY, G.A.; JOHNSON, K.M.; CALLIS, R.T.; STEPHEN, E.L. Lassa virus infection of rhesus monkeys: pathogenesis and treatment with ribavirin. J. Infect. Dis., 141: 580-589, 1980. JI, Y.; GU, J.; MAKHOV, A.M.; GRIFFITH, J.D.; MITCHELL, B.S. Regulation of the interation of inosine monophosphate dehydrogenase with mycophenolic acid by GTP. J. Biol. Chem., 281(1): 206-212, 2006. JIN, H.; ELLIOT, R.M. Non-viral sequences at the 5’ ends of Dugbe nairovirus S mRNAs. J. Gen. Virol., 74: 2293-2297, 1993. JIN, H.K.; TAKADA, A.; KON, Y.; HALLER, O.; WATANABE, T. Identication of the murine Mx2 gene: interferon-induced expression of the Mx2 protein from the feral mouse gene confers resistance to vesicular stomatitis virus. J. Virology, 73: 4925-4930, 1999. 124 JOHNSON, H.M.; BAZER, F.W.; SZENTE, B.E.; JARPE, M.A. How interferons fight disease. Sci. Am., 270(50): 68-75, 1994. JONKERS, A.H.; Spence, L.; Olivier, O. Laboratory studies with wild rodents and viruses native to Trinidad. III. Studies with three Guama-group viruses. Am. J. Trop. Med. Hyg., 17: 299-307, 1968. JORDAN, I.; BRIESE, T.; FISCHER, N.; LAU, J.Y.; LIPKIN, W.I. Ribavirin inhibits West Nile virus replication and cytopathic effect in neural cells. J. Infect. Dis., 82: 1214-1217, 2000. KALVAKOLANU, D.V. Virus interception of cytokine regulated pathwyas. Trends Microbiol., 7: 166-171, 1999. KARABATSOS, N. International catalogue of arbovirus including certain other viruses of vertebrates. Am. Soc. Trop. Med. Hyg., San Antonio, Tex. 1985. KELLEY, K.A.; KOZAK, C.A.; DANDOY, F.; SOR, F.; SKUP, D.; WINDASS, J.D.; De MAEYER-GUIGNARD, J.; PITHA, P.M.; DeMAEYER E. Mapping of murine interferon-a genes to chromosome 4. Gene, 26(2-3): 181-188,1983. KELLEY, K.A.; PITHA, P.M. Characterization of a mouse interferon gene locus. I. Isolation of a cluster of four alpha-interferon genes. Nucleic Acids Res.,13: 805-823, 1985. KENDE, H.; ALVING, C.R.; RILL, W.L.; SWARTZ Jr., G.M.; CANONICO, P.G. Enhanced efficacy of liposome-encapsulated ribavirin against Rift Valley fever virus infection in mice. Antimicrob. Agents Chemother., 27(6): 903-907, 1985. KENYON, R.H.; CANONICO, P.G.; GREEN, D.E.; PETERS, C.J. Effect of ribavirin and tributylribavirin on argentine hemorrhagic fever (Junin virus) in guinea pigs. Antimicrob. Agents Chemother., 29(3): 521-523, 1986. KHABAR, K.S.; DHALLA, M.; SIDDIQUI, Y.; ZHOU, A.; AL-AHDAL, M.N.; DER, S.D.; SILVERMAN, R.H.; WILLIAMS, B.R. Effect of deficiency of the double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, on antiviral resistance in the presence or absense of 125 ribonuclease L: HSV-1 replication is particularly sensitive to deficiency of the major IFN-mediated enzymes. J. Interferon Cytokine Res., 20: 653-659, 2000. KINCHINGTON, D.; KANGRO, H.; JEFFRIES, D.J. Design and testing of antiviral compounds p.:154-155. In: Medical Virology – A practical approach. U Desselberger ed. Oxford University Press New York, USA, 1995. KINNEY, R.M.; CALISHER, C.H. Antigenic relationships among Simbu serogroup (Bunyaviridae) viruses. Am. J. Trop. Med. Hyg., 30: 1307-1318, 1981. KOFF, W.C.; PRATT, HALSTEAD, R.D.; S.B. ELM Jr, Treatment J.L.; of VENKATESHAN, intracranial dengue C.N.; virus infections in mice with a lipophilic derivative of ribavirin. Antimicrob. Agents Chem., 24: 134-136, 1983. KORZYBSKI, T.; KOWSZYK-GINDIFER, Z.; KURYLOWICZ, W. In: Antibiotics, Origin, Nature and properties, vol. 2, p.:1203. Translated by E. Paryski. Pergamon Press, London and New York, USA, 1967. LANFORD, R.E.; CHAVEZ, D.; GUERRA, B.; LAU, J.Y.; HONG, Z.; BRASKY, K.M.; BEAMES, B. Ribavirin induces error-prone replication of GB virus B in primary tamarin hepatocytes. J. Virolology, 75(17): 8074–8081, 2001. LANFORD, R.E.; GUERRA, B.; LEE, H.; AVERETT, D.R.; PFEIFFER, B.; CHAVEZ, D.; NOTVALL, L.; BIGGER, C. Antiviral effect and virus-host interations in response to alpha interferon, gamma interferon, poly(i)-poly(c), tumor necrosis factor alpha, and ribavirin in hepatitis C virus subgenomic replicons. J. Virology, 77(2): 1092-1104, 2003. LEYSSEN, P.; BALZARINI, J.; De CLERCQ, E.; NEYTS, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramixoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J. Virology, 79(3): 1943-1947, 2005. 126 LIPSKY, J.J. Mycophenolate mofetil. Lancet, 348: 1357-1359, 1996. LIU, G.; ZHAI, Q.; SCHAFFNER, D.J.; WU, A.; YOHANNES, A.; ROBINSON, T.M.; MALAND, M.; WELLS, J.; VOSS, T.; BAILEY, C.; ALIBEK, K. Prevention of letal respiratory vaccinia infections in mice with interferon-α and interferon-γ. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 40: 201-206, 2004. LUKASZEWSKI, R.A.; BROOKS, T.J.G. Pegylated alpha interferon is an effective treatment for virulent venezuelan equine encephalitis virus and has profound effects on the host immune response to infection. J. Virology, 74(11): 5006-5015, 2000. MAAG, D.; CASTRO, C.; HONG, Z.; CAMERON, C.E. Hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) as a mediator of the antiviral activity of ribavirin. J. Biol. Chem., 276(49): 46094– 46098, 2001. MAHANTY, S.; GUPTA, M.; PARAGAS, J.; BRAY, M.; AHMED, R.; ROLLIN, P.E. Protection from lethal infection is determined by innate immune responses in a mouse model of Ebola virus infection. Virology, 312: 415-424, 2003. MANGIA, A.; SANTORO, R.; MINERVA, N.; RICCI, G.L.; CARRETA, V.; PERSICO, M.; VINELLI, F.; SCOTTO, G.; BACCA, D.; ANNESE, M.; ROMANO, M.; ZECHINI, F.; SOGARI, F.; SPIRITO, F.; ANDRUILLI, A. Peginterferon alfa-2b and ribavirin for 12 vs. 24 weeks in HCV genotype 2 or 3. N. Engl. J. Med., 352(25): 2609– 2617, 2005. MANGIAFICO, J.A.; SANCHEZ, J.L., FIGUEIREDO, L.T.; LeDUC, J.W.; PETERS, C.J. Isolation of a newly recognized Bunyamwera serogroup virus from a febrile human in Panama. Am. J. Trop. Med. Hyg., 39: 593-596, 1988. MARCH, R.W.; HETRICK, F.M. Studies on Guaroa virus. II. Observations in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg., 16(2): 196-199, 1967. MARGOLIS, D.; HEREDIA, A.; GAYWEE, J.; OLDACH, D.; DRUSANO, G.; REDFIELD, R. Abacavir and mycophenolic acid, an inhibitor of inosine monophosphate dehydrogenase, have profound and 127 synergistic anti-HIV activity. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr., 21(5): 362-370, 1999. MARSCHALL, M.; ZACH, A.; HECHTFISCHER, A.; FOERST, G.; MEIEREWERT, H.; HALLER, O. Inhibition of influenza C viruses by human MxA protein. Virus Res., 67: 179-188, 2000. McCORMICK, J.B.; KING, I.J.; WEBB, P.A.; SCRIBNER, C.L.; CRAVEN, R.B.; JOHNSON, K.M.; ELLIOTT, L.H.; BELMONT-WILLIAMS, R. Lassa fever. Effective therapy with ribavirin. N. Engl. J. Med., 314: 20-26, 1986. McHUTCHISON, J.G.; GORDON, S.C.; SCHIFF, E.R.; SHIFFMAN, M.L.; LEE, W.M.; RUSTGI, V.K.; GOODMAN, Z.D.; LING, M.H.; CORT, S.; ALBRECHT, J.K. Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. Hepatitis Interventional Therapy Group. N. Engl. J. Med. 339: 1485-1492, 1998. MOORE, M. Interferon and the immune system. II. Effect of interferon on the immune system, p. 181. In Interferon: From Molecular Biology to Clinical Application. Thirty-fifth Symposium of the Society for General Microbiology. D.C. Burke and A.G. Morris, eds. Cambridge University Press, Cambridge, 1983. MORENS, D.M.; HALSTEAD, S.B.; REPIK, P.M.; PUTVATANA, R.; RAYBOURNE, N. Simplified plaque reduction neutralization assay for dengue viruses by semimicro methods in BHK-21 cells: comparison of the BHK suspension test with standard plaque reduction neutralization. J. Clin. Microbiol., 22(2): 250-254, 1985. MORRIL, J.C.; JENNINGS, G.B.; COSGRIFF, T.M.; GIBBS, P.H.; PETERS, C.J. Prevention of Rift Valley fever in Rhesus monkeys with interferon-α. Rev. Infect. Dis., 11(4 Suppl): S815-S825, 1989. MOSCA, J.D.; PITHA, P.M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol., 6: 22792283, 1986. 128 MULLER, W.E.; MAIDHOF, A.; TASCHNER, H.; ZAHN, R.K. Virazole (1beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide: a cytostatic agent. Biochem. Pharmacol., 26(11): 1071–1075, 1977. NEYTS, J.; De CLERCQ, E. Mycophenolate mofetil strongly potentiates the anti-herpesvirus activity of acyclovir. Antiviral Res., 40: 53-56, 1998. NEYTS, J.; MEERBACH, A.; McKENNA, P.; De CLERCQ, E. Use of the yellow fever virus vaccine strain 17D for the study of strategies for the treatment of yellow fever virus infections. Antiviral Res., 30: 125-132, 1996. NING, Q.; BROWN, D.; PARODO, J.; CATTRAL, M.; GORCZYNSKI, R.; COLE, E.; FUNG, L.; DING, J.W.; LIU, M.F.; ROTSTEIN, O.; PHILLIPS, M.J.; LEVY, G. Ribavirin inhibits viral-induced macrophage production of TNF, IL-1, the procoagulant fgl2 prothrombinase, and preserves TH1 cytokine production but inhibits TH2 cytokine response. J. Immunol., 160: 3487-3493, 1998. NUNES, M.R.T.; MARTINS, L.C.; RODRIGUES, S.G.; CHIANG, J.O.; AZEVEDO, R.S.S.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; VASCONCELOS, P.F.C. Oropouche virus isolation, Southeast Brazil. Emerg. Infect. Dis., 11: 1610-1613, 2005. PADALKO, E.; VERBEKEN, E.; MATTHYS P.; AERTS, J.L.; De CLERCQ, E.; NEYTS, J. Mycophenolate mofetil inhibits the development of Coxsackie B3-virus-induced myocarditis in mice. BMC Microbiol., 3: 25-33, 2003. PAGE, T.; CONNOR, J.D. The metabolism of ribavirin in erythrocytes and nucleated cells. Int. J. Biochem., 22(4): 379–383, 1990. PAVLOVIC, J.; ARZET, H.A.; HEFTI, H.P.; FRESE, M.; ROST, D.; ERNST, B.; KOLB, E.; STAEHELI, P.; HALLER, O. Enhanced virus resistance of transgenic mice expressing the human MxA protein. J. Virology, 69: 4506-4510, 1995. 129 PAVLOVIC, J.; HALLER, O.; STAEHELI, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J. Virology, 66: 2564-2569, 1992. PAVLOVIC, J.; SCHULTZ, J.; HEFTI, H.P.; SCHUH, T.; MOLLING, K. DNA vaccination against La Crosse virus. Intervirology, 43(4-6): 312321, 2000. PAWLOTSKY, J.M.; DAHARI, H.; NEUMANN, A.U.; HEZODE, C.; GERMANIDIS, G.; LONJON, I.; CASTERA, L.; DHUMEAUX, D. Antiviral action of ribavirin in chronic hepatitis C. Gastroenterology, 126(3): 703-714, 2004. PENSIERO, M.N.; SHAREFKIN, J.B.; DIEFFENBACH, C.W.; HAY, J. Hantaan virus infection of human endothelial cells. J. Virology, 66: 5929-5936, 1992. PETERSEN, C.; BRUNS, E.; KUSKE, M.; Von WUSSOW, P. Treatment of extrahepatic biliary atresia with interferon-α in a murine infectious model. Pediatric Res., 42(5): 623-628, 1997. PFEIFFER, J.K.; KIRKEGAARD, K. A single mutation in poliovirus RNAdependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(12): 7289-7294, 2003. PINHEIRO, F.P. Situação das arboviroses na região Amazônica. Anais do simpósio internacional sobre arbovírus dos trópicos e febres hemorrágicas, p. 27-48. Academia Brasileira de Ciências, Belém, Brazil, 1985. PINHEIRO, F.P.; ROCHA, A.G.; FREITAS, R.B.; OHANA, B.A.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; ROGÉRIO, J.S.; LINHARES, A.C. Meningite associada às infecções por vírus Oropouche. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 24: 246-251, 1982. PINHEIRO, F.P.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; TRAVASSOS DA ROSA, J.F.S.; ISHAK, R.; FREITAS, R.B.; GOMES, M.L.; LeDUC, J.W.; OLIVA, O.F.P. Oropouche virus. I. A review of clinical, epidemiological and ecological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg., 30: 149-160, 1981. 130 PINHEIRO, F.P.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; VASCONCELOS, P.F.C. Doenças Infecciosas e Parasitárias, Enfoque Amazônico, p. 285298. In: R.N.Q. Leão (ed). CEJUP, Belém, Brasil, 1997. PINHEIRO, F.P.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; VASCONCELOS, P.F.C. Oropouche fever, p 2418-2423. In: R.D. Feigin (ed). Textbook of pediatric infectioius diseases. W.B. Saunders Co., Philadelphia, 2004. PLANTEROSE, D.N. Antiviral and cytotoxic effects of mycophenolic acid. J. Gen. Virol., 4: 629-630, 1969. PLOEGH, H.L. Viral strategies of immune evasion. Science, 280: 248-253, 1998. PTOSSI, F.; BLANK, A.; SCHRÖDER, A.; SCHWARZ, A.; HÜSSI, P.; SCHWEMMLE, M.; PAVLOVIC, J.; STAEHELI, P. A functional GTP-binding motif is necessary for antiviral activity of Mx proteins. J. Virology, 67: 6726-6732, 1993. RANG, H.P.; DALE, M.M. Drogas antivirais, p.509-515. In: Farmacologia, 2a edição. H.P. Rang e M.M. Dale eds. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. 1993. REED, L.J.; MUENCH, H. A simple method of estimating fifty percent end points. Am. J. Hyg., 27: 493-497, 1938. ROBERTS, D.R.; HOCH, A.L.; DIXON, K.E.; LLEWELLYN, C.H. Oropouche virus. III. Entomological observations from three epidemics in Pará, Brazil, 1975. Am. J. Trop. Med. Hyg., 30: 165-171, 1981. ROBERTSON, C.M.; HERMANN, L.L.; COOMBS, K.M. Mycophenolic acid inhibits avian reovirus replication. Antiviral Res., 64: 55-61, 2004. SABATTINI, M.S.; SHOPE, R.E.; VANELLA, J.M. Serological survey for arboviruses in Cordoba Province, Argentina. Am. J. Trop. Med. Hyg., 14: 1073-1078, 1965. SAMUEL, C.E. Antiviral actions of interferon: interferon-regulated cellular proteins and their surprisingly selective antiviral activities. Virology, 183: 1-11, 1991. 131 SAMUEL, C.E. Antiviral actions of interferons. Clin. Microbiol. Rev., 14(4): 778-809, 2001. SASAKI, O.; KARAKI, T.; IMANISHI, J. Protective effect of interferon on infections with hand, foot, and mouth disease virus in newborn mice. J. Infec. Dis., 153(3): 498-502, 1986. SCHEIDEL, L.M.; DURBIN, R.K.; STOLLAR, V. Sindbis virus mutants resistant to Mycophenolic Acid and Ribavirin. Virology, 158: 1-7, 1987. SCHEIDEL, L.M.; STOLLAR, V. Mutations that confer resistance to mycophenolic acid and ribavirin on Sindbis virus map to the nonstructural protein nsP1. Virology, 181: 490-499, 1991. SCHMALJOHN, C.S. Fundamental Virology, p. 649-673. In: B. Fields, D.M. Knipe, and Howley (ed). Lipincott-Raven, Inc., Philadelphia, 1996. SCHMALJOHN, C.S.; HJELLE, B. Hantaviruses: a global disease problem. Emerg. Infect. Dis., 3: 95-104, 1997. SEN, G.C. Viruses and interferons. Annu. Rev. Microbiol., 55: 255-281, 2001. SEVERSON, W.E.; SCHMALJOHN, C.S.; JAVADIAN, A.; JONSSON, C.B. Ribavirin causes error catastrophe during Hantaan virus replication. J. Virology, 77(1): 481-488, 2003. SIDWELL, R.W.; HUFFMAN, J.H.; BARNARD, D.L.; SMEE, D.F.; WARREN, R.P.; CHIRIGOS, M.A.; KENDE, M.; HUGGINS, J. Antiviral and immunomodulating inhibitors of experimentally-induced Punta Toro virus infections. Antiviral Res., 25: 105-122, 1994. SIDWELL, R.W.; HUFFMAN, J.H.; BARNETT, B.B.; PIFAT, D.Y. In vitro and in vivo Phlebovirus inhibition by ribavirin. Antimicrob. Agents Chemother., 32: 331-336, 1988. SIDWELL, R.W.; HUFFMAN, WITKOWSKI, activity of J.T.; J.H.; ROBINS, Virazole: KHARE, R.K. G.P.; ALLEN, Broad-spectrum L.B.; antiviral 1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3- carboxamide. Science, 177(50): 705–706, 1972. 132 STAEHELI, P.; HALLER, O.; BOLL, W.; LINDENMANN, J.; WEISSMANN, C. Mx protein: constitutive expression in 3T3 cells transformed with cloned Mx cDNA confers selective resistance to influenza virus. Cell, 44: 147-158, 1986. STAEHELI, P.; PITOSSI, F.; PAVLOVIC, J. Mx proteins: GTPases with antiviral activity. Trends Cell Biol., 3: 268-272, 1993. STAEHELI, P.; SUTCLIFFE, J.G. Identification of a second interferonregulated murine Mx gene. Mol. Cell Biol., 8: 4524-4528, 1988. STARK, G.R.; KERR, I.M.; WILLIAMS, B.R.; SILVERMAN, R.H.; SCHREIBER, R.D. How cells respond to interferons. Annu. Rev. Biochem., 67: 227-264, 1998. STREETER, D.G.; WITKOWSKI, J.T.; KHARE, G.P.; SIDWELL, R.W.; BAUER, R.J.; ROBINS, R.K.; SIMON, L.N. Mechanism of action of 1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide (Virazole), a new broad-spectrum antiviral agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 70: 1174-1178, 1973. STRÖHER, U.; DiCARO, A.; LI, Y.; STRONG, J.E.; AOKI, F.; PLUMMER, F.; JONES, S.M.; FELDMANN, H. Severe acute respiratory syndrome-related Coronavirus is inhibit by interferon-α. J. Infect. Dis., 189: 1164-1167, 2004. SUNDSTROM, J.B.; McMULLAN, L.K.; SPIROPOULOU, C.F.; HOPPER, W.C.; ANSARI, A.A.; PETERS, C.J.; ROLLIN, P.E. Hantavirus infection induces the expression of RANTES and IP-10 without causing increased permeability in human lung microvascular endothelial cells. J. Virology, 75:6076-6085, 2001. TAM, R.C.; PAI, B.; BARD, J.; LIM, C.; AVERETT, D.R.; PHAN, U.T.; MILOVANOVIC, T. Ribavirin polarizes human T cell responses towards a Type 1 cytokine profile. J. Hepatol., 30(3): 376-382, 1999. TAN, E.L.C.; OOI, E.E.; LIN, C.; TAN, H.C.; LING, A.E.; LIM, B.; STANTON, L.W. Inhibition of SARS coronavirus infection in vitro with clinically approved antiviral drugs. Emerg. Infec. Dis., 10(4): 581586, 2004. 133 THE MERK INDEX. Published by Merck Research Laboratories Division of Merck & Co.; Inc. Whitehouse Station, NJ. USA. 1996. TOLTZIS, P.; O’CONNELL, K.; PATTERSON, J.L. Effect of phosphorylated ribavirin on vesicular stomatitis virus transcription. Antimicrob. Agents Chemother., 32(4): 492–497, 1988. TRESSLER, R.J.; GARVIN, L.J.; SLATE, D.L. Anti-tumor activity of mycophenolate mofetil against human and mouse tumors in vivo. Int. J. Cancer, 57: 568–573, 1994. TSAI, S.L.; LIAW, Y.F.; CHEN, M.H.; HUANG, C.Y.; KUO, G.C. Detection of type 2-like T-helper cells in hepatitis C virus infection: implications for hepatitis C virus chronicity. Hepatology, 25(2): 449-458, 1997. TURNER, W.; GIBSON, W.; CHIRIGOS, M.A. Enhancement of murine sarcoma virus (Moloney) infection in mice by Guaroa virus. Cancer Res., 30: 2645-2651, 1970. Van der BLIEK, A.M. Functional diversity in the dynamin family. Trends Cell Biol., 3: 96-102, 1999. Van TONGEREN, H.A. Occurence of arboviruses belonging to the C-, Bunyamwera and Guama groups, and of Oropouche, Junin, Tacaiuma and Kwatta viruses in man in the province of Brokopondo, Surinam: a serological survey. Trop. Geogr. Med., 19: 309-325, 1967. VASCONCELOS, P.F.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; DÉGALLIER, N.; TRAVASSOS DA ROSA, J.F.S.; PINHEIRO, F.P. Ciência e Cultura, 44: 117-124, 1992. VASCONCELOS, P.F.C.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; PINHEIRO, F.P.; SHOPE, R.E.; TRAVASSOS DA ROSA, J.F.; RODRIGUES, S.G.; DEGALLIER, N.; TRAVASSOS DA ROSA, E.S. Arboviruses pathogenic for man in Brazil, p. 72-99. In: A.P.A. Travassos da Rosa, P.F.C. Vasconcelos, J.F.S. Travassos da Rosa (ed). An overview of arbovirology in Brazil and neighbouring countries. Instituto Evandro Chagas, Belém, Brazil, 1998. 134 VIGNUZZI, M.; STONE, J.K.; ARNOLD, J.J.; CAMERON, C.E.; ANDINO, R. Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature, 439(7074): 344-348, 2006. VILCEK, J.; SEN, G.C. Interferons and others cytokines, p.: 375-399. In: Fields Virology. B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, R.M. Chanock, J.L. Melnick, T.P. Monath, B. Roizman, S.E. Straus (eds). Lippincott-Raven, Philadelphia, USA. 1996. VO, N.V.; YOUNG, K.C.; L.A.I., M.M. Mutagenic and inhibitory effects of ribavirin on hepatitis C virus RNA polymerase. Biochemistry, 42(35): 10462–10471, 2003. WEBER, F.; BRIDGEN, A.; FAZAKERLEY, J.K.; STREITENFELD, H.; KESSLER, N.; RANDALL, R.E.; ELLIOTT, R.M. Bunyamwera bunyavirus nonstrutural protein NSs counteracts the induction of alpha/beta interferon. J. Virology, 76(16): 7949-7955, 2002. WILLIS, RC; CARSON, DA; SEEGMILLER, JE. Adenosine kinase initiates the major route of ribavirin activation in a cultured human cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75(7): 3042–3044, 1978. WITKOWSKI, J.T.; ROBINS, R.K.; SIDWELL, R.W.; SIMON, L.N. Design, synthesis, and broad spectrum antiviral activity of 1-beta-Dribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide and related nucleosides. J. Med. Chem., 15(11): 1150–1154, 1972. WRAY, S.K.; GILBERT, B.E.; NOALL, M.W.; KNIGHT, V. Mode of action of ribavirin: effect of nucleotide pool alterations on influenza virus ribonucleoprotein synthesis. Antiviral Res., 5(1): 29–37, 1985. WYDE, P.R. Respiratory syncytial virus (RSV) disease and prospects for its control. Antiviral Res., 39: 63-79,1998. XIAO, S.; GUZMAN, H.; ZHANG, H.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; TESH, R.B. West Nile virus infection in the golden hamster (Mesocricetus auratus): a model for West Nile encephalitis. Emerg. Infect. Dis., 7(4): 714-721, 2001. YOUNG, K.C.; LINDSAY, K.L.; LEE, K.J.; LIU, W.C.; HE, J.W.; MILSTEIN, S.L.; LAI, M.M. Indetification of a ribavirin-resistant NS5B 135 mutation of hepatitis C vírus during ribavirin monotherapy. Hepatology, 38(4): 869-878, 2003. ZHOU, S.; LIU, R.; BAROUDY, B.M.; MALCOLM, B.A.; REYES, G.R. The effect of ribavirin and IMPDH inhibitors on hepatitis C virus subgenomic replicon RNA. Virology, 310(2): 333-342, 2003. 136 10. ANEXOS 10.1. Artigo referente aos resultados de Ribavirina Manuscrito submetido para publicação na “American Journal of Tropical Medicine and Hygiene”. 137 LRH: LIVONESI AND OTHERS RRH: RIBAVIRIN ACTION ON BRAZILIAN ORTHOBUNYAVIRUS IN VITRO AND IN VIVO STUDIES OF THE RIBAVIRIN ACTION ON BRAZILIAN ORTHOBUNYAVIRUS MÁRCIA C. LIVONESI, RICARDO L. MORO DE SOUSA, SORAYA J. BADRA, AND LUIZ T. M. FIGUEIREDO Center for Research in Virology, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil. 138 Abstract Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa and Tacaiuma are viruses (Orthobunyavirus genus) that cause human febrile illnesses and encephalitis. The goal of this study was to evaluate the antiviral action of Ribavirin on these Orthobunyavirus to achieve a therapeutical agent to treat the diseases caused by these viruses. Results in vitro showed that the ribavirin (50 µg/mL) have antiviral activity only on the Tacaiuma virus. Addition of guanosine in the culture reverted the antiviral effect of ribavirin on Tacaiuma virus, suggesting that ribavirin inhibited this virus by reducing intracellular guanosine pool. Moreover, ribavirin was not an effective drug in vivo, because it was unable to inhibit the death of the mice, and the virus replication in the brain. The results suggest that ribavirin does not have antiviral activity on the Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa and Tacaiuma viruses and consequently the ribavirin would not be a good therapeutical agent to treat these arboviruses. 139 1. Introduction The Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guama (GUAV), Guaroa (GROV) and Tacaiuma (TCMV) viruses belong to distinct antigenic serogroups of the Orthobunyavirus genus, in the Bunyaviridae family. These viruses are enveloped with trisegmented single-stranded RNA genome of negative or ambisense polarity, replicate in the cytoplasm and bud into the Golgi apparatus or upon the plasma membrane.1, 2 The OROV (Simbu group) is transmitted mainly by the biting midge (Culicoides paraensis) and has been associated with dengue-like acute febrile illness. The OROV fever has emerged over the past 40 years as a serious public health problem in tropical and subtropical areas of Central and South America, having caused least 30 reported outbreaks, involving more than half a million people.3 Clinical features of the OROV fever include abrupt onset of fever, chills, severe headache, dizziness, myalgia, arthralgia, nausea, and vomiting. Occasionally, neurologic involvement has been reported. All ages and both sexes appear to be equally susceptible to infection.4 Similar to OROV, CARV (C group), GUAV (Guama group), GROV (Bunyamwera group) and TCMV (Anopheles A group) have also been associated with febrile illness, as well as encephalitis in humans. They are transmitted by mosquitoes, and cause disease mainly in residents of the Amazon region of Brazil.5--8 Due to the high attack rates of OROV epidemics and to the debilitating nature and duration of symptoms of the clinical syndromes caused by this and other Brazilian Orthobunyavirus, an antiviral therapy, if available, would become a very helpful intervention. Ribavirin, the nucleoside analog 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3- carboxamide, exhibits antiviral activity against a variety of RNA viruses in cell culture 9, 10 including viruses from the Paramyxoviridae,11,12 Flaviviridae,12--14 Picornaviridae,15 Orthomyxoviridae,16 Arenaviridae 17, 18 and Bunyaviridae 19, 20 families. In humans, RBV is used clinically to treat infections by hepatitis C virus (in combination with interferon-α),21, 22 respiratory syncytial virus23 and Lassa fever virus.24 Ribavirin is phosphorylated by cellular enzymes, and has been proposed to exert antiviral effects through several mechanisms:25 (A) reduction in cellular guanosine triphosphate (GTP) pools via inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) inhibition,26 (B) inhibition of the viral RNA guanylyltransferase and, consequently, reduction of the capping of viral mRNA,27 (C) inhibition of the viral RNA polymerase,28 (D) incorporation of the compound either as a GTP or an ATP analogue, causing lethal mutagenesis of the viral RNA genomes,15 and (E) enhancement of the Th1 antiviral immune response.29 Ribavirin monophosphate is the 140 derivative responsible for the first mechanism, and RBV triphosphate is linked to the second, third and fourth of these mechanisms.30 In an effort to characterize antiviral agents that could attenuate infection caused by OROV, CARV, GUAV, GROV and TCMV, we tested the action of RBV, an antiviral of broad-spectrum, on these viruses both in vitro and in vivo. 2. Materials and methods 2.1. Viruses The ORO (BeAn19991), GUA (BeAn277), GRO (BeH22063), and TCM (BeAn73) viruses were kindly supplied by Dr. Pedro Vasconcelos and Dr. Amélia Travassos da Rosa, (Evandro Chagas Institute, Brazilian Ministry of Health, Belém, Brazil and University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, USA). The CARV (SPAn2049) was kindly supplied by Dr. Terezinha Lisieux Coimbra (Adolpho Lutz Institute, São Paulo, Brazil). Viral stocks were obtained from the brains of intracerebrally infected suckling mice. Brains were mixed with PBS (dilution 1:10 w/v), macerated and centrifuged at 2000×g for 10 minutes at 4°C. The supernatants were harvested and stored at -70oC until use. 2.2. Cell culture African green monkey kidney (Vero E6) cells (ATCC-CCL81) were grown in minimum essential medium (MEM, Cultilab, Brazil) supplemented with 10% inactivated, Mycoplasma free, fetal bovine serum (FBS, Cultilab, Brazil), 1% L-glutamine and 0.3% sodium bicarbonate. 2.3. Compounds Ribavirin and guanosine were purchased commercially (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Ribavirin was diluted in 0.85% NaCl solution and guanosine (G) was diluted in 30o ethanol, and they were stored at 4oC until use. 2.4. Animals Swiss newborn mice were obtained from the laboratory animal facility of the University of São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil. The mice were maintained in microisolator cages in the animal housing facility of the Center for Research in Virology, University of 141 São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil. The experiments were approved by the ethical committe on vertebrate animal experiments of the University of São Paulo (No 006/2004). 2.5. In vitro antiviral evaluation In vitro antiviral evaluation was done by using plaque assay. Vero E6 cells were seeded in 24-well plates in MEM with 10% FBS, for 24hr at 37°C and 5% CO2. Medium was removed and serial 10-fold dilutions of viral stocks diluted in MEM with 5% FBS were added (0.2 mL/well) in quadruplicates, and the cells were incubated for 2h at 37°C. Subsequently, the viral inoculum was removed and 1.0 mL of a combination (v/v) of 1% low-melting-point agarose plus 2X MEM (10% FBS) was added to each well, and the plates were incubated at 37°C for 3 days for OROV and GUAV, 5 days for CARV and GROV, and 9 days for TCMV. The plaques were visualized by staining with a naphtol blue black solution (15 minutes) after the removal of the agarose plug.31 The plaques were counted under an inverted microscope and the virus titer was determined as Log10 PFU per milliliter. Ribavirin and guanosine were diluted in the medium and added to cells on the day before, or 2 hr after viral infection. A comparison between the virus titers obtained in the presence or absence of RBV were done and the results were plotted as percentage of inhibition on plaque formation. Concentration of RBV added to the cell cultures was ≤50 µg/mL, because this concentration had a mild cytostatic effect, as they inhibited Vero E6 cell growth by 50%.32 Moreover, clinically therapeutic levels of RBV are 25 µg/mL (or 100 µM).33 Exogenous guanosina was added to the cell cultures, at the concentration of 30 µg/mL. 2.6. Determination in vivo of RBV toxicity Ribavirin toxicity was evaluated by significant weight loss, which is a sign of RBV-induced anemia. Applied RBV doses were 45 and 35 mg/kg/day. The mice were treated intraperitoneally (IP) daily for 10 days. The animal weights were determined prior to the first treatment and daily for 10 days. 2.7. Intraperitoneal challenge with viruses and administration with RBV Three-day-old Swiss mice were infected IP with OROV (10 DL50), CARV (1,000 DL50), GUAV(100 DL50), GROV(100 DL50), or TCMV (1,000 DL50) in a volume 142 of 40 µL per mouse. The mice were treated intraperitoneally with RBV or placebo in a volume of 30 µL per mouse. The treatment was initiated 24 hr before infection and maintained each every day. The animals were daily monitored for mortality. 2.8. Determination of brain virus titers The brains of mice (two mice per group) were taken aseptically on days 1, 2, 3, 5, 7, and 9 after infection. Brains were mixed with PBS (dilution 1:10 w/v), macerated and centrifuged at 2000×g for 10 minutes at 4°C. The supernatants were harvested and stored at -70oC before plaque assay on Vero E6 cells. The viruses titer in brain were expressed as Log10 PFU/mL. 2.9. Statistical Analysis Analysis of variance, followed by the parametric Tukey-Kramer test was used in the in vitro experiments. Student’s t-test was used to determine if there was a significant difference in the body weight of the mouse treated with different doses of RBV or placebo and virus titers between the treated and the placebo groups. A P value less than 0.05 was considered to indicate statistical significance. 3. Results 3.1. In vitro antiviral effect of Ribavirin Ribavirin (50 µg/mL) presented significant inhibitory effect on the TCMV replication, either 24hr before (inhibition 85%; p<0.005) or 2hr after (inhibition 62%; p<0.01) infection in Vero E6 cells. Moreover, RBV showed a weak inhibitory effect on the GUAV replication, when the treatment was initiated 24hr prior infection. On the other hand, RBV was unable to inhibit the replication of other viruses tested (Table 1). To know whether fewer doses than 50 µg/mL are able to inhibit TCMV replication, cells were treated one day before (Fig.1A) or 2hr after (Fig.1B) infection with doses ≤ 50 µg/mL. Figure 1 shows that only the concentration of 50 µg/mL is able to significantly inhibit TCMV replication. Moreover, the concentration of 50 µg/mL have antiviral effect only when the treatment is initiated early, because treatment 24hr and 48hr after infection do not have inhibitory effect on TCMV replication (Fig.1C). To investigate whether the inhibition of TCMV replication by RBV was caused by depletion of the GTP pool, exogenous guanosine was added to the culture medium at 143 concentration of 30 µg/mL. Figure 1D shows that addition of guanosine efficiently reversed the inhibitory effect of RBV on the TCMV replication in Vero E6 cells, suggesting that the antiviral activity of RBV on TCMV is indeed related to reduction in GTP intracellular levels. 3.2. In vivo antiviral effect of Ribavirin To determine the maximum dose to cause no toxicity, suckling mice were treated with placebo, either 35 mg/kg, or 45 mg/kg of a RBV single daily dose for 10 days. Figure 2 shows that the dose of 35 mg/kg/day was well tolerated by mice because they presented an increase of weight similar to the placebo-treated mice. On the other hand, mice treated with the dose of 45 mg/kg/day had significant weight loss beginning on day 7 of treatment (p<0.05), when compared to placebo-treated mice, demonstrating that this dose is toxic to suckling mice. Then, 35 mg/kg/day of RBV was the dose chosen to treat the mice infected by viruses ORO, CAR, GUA, GRO, and TCM. Ribavirin treatment consisting of a single daily dose was initiated 1 day before the viral infection, until the death of placebo-treated mice. Intraperitoneal administration of RBV did not prevent the death of mice infected by studied Orthobunyaviruses (Table 2), although RBV-treated mice infected by OROV or CARV presented survival rates of 6 and 12%, respectively, which was not significant (Table 2). Likewise, RBV treatment did not result in a significant increase in the mean time to death of infected mice (Table 2), demonstrating that RBV do not have antiviral action in vivo on the OROV, CARV, GUAV, GROV, and TCMV. Next, we studied the effect of RBV treatment on virus migration and replication in brain tissue. Figure 3 shows that RBV treatment was unable to prevent neither migration nor replication of the studied Orthobunyaviruses because the viruses appeared in the brains of the two groups in the same period, and the virus titer in the brain was equivalent between RBV-treated and placebo-treated groups. This data can explain the ineffectiveness of RBV to prevent the death of virus-infected mice and to confirm that the RBV does not have antiviral activity in vivo on the studied viruses. 4. Discussion In this study, RBV was evaluated for its antiviral action on the OROV, CARV, GUAV, GROV and TCMV in vitro and in vivo. RBV had significant antiviral effect in vitro, only on the TCMV, either before or after viral infection (Table 1). However, this 144 antiviral effect was abolished when the treatment starting 24 hr after infection (Fig.1C), or when we used concentrations lower than 50 µg/mL (Figs.1A and 1B), suggesting that to use therapeutic level of RBV, which is 25 µg/mL, could be ineffective to treat illness caused by TCMV. This supposition is confirmed by experiments in vivo, where the RBV did not show any antiviral effect on the OROV, CARV, GUAV, GROV and TCMV. Thus, the RBV was unable to prevent the death of infected mice, it did not prolong the mean time to death (Table 2), and neither prevented the virus migration and replication in the brain tissue (Fig.3). The inhibitory effect of RBV on TCMV in vitro was reversed by the addition of guanosine (Fig.1D), suggesting that the mechanism of these antiviral action, in this model, was mediated through depletion of GTP intracellular, what could hypothetically reduce the efficiency of the viral polymerase activity. However, RBV did not have any inhibitory effect on OROV, CARV, GUAV, or GROV replication (Table 1), suggesting that the replicative cycle of these viruses is less dependent on GTP intracellular levels. Schiedel et al., 1987,30 produced RBV-resistant Sindbis virus (family Togaviridae, genus Alphavirus) by performing serial passages of the virus in A. Albopictus cells in the presence of MPA (Mycophenolic Acid). The authors suggested that Sindbis virus mutants were able to replicate in the presence of RBV and MPA because they generated a guanylyltranferase and/or RNA polymerase with an increased GTP affinity. Subsequently, Schiedel et al., 1991,34 showed that the MPA resistent Sindbis virus had an alteration on the RNA guanylyltransferase. Guanylyltransferase is an important protein for the 5’cap structure formation of cellular and viral mRNAs. However, viruses of the Bunyaviridae family do not encode enzymes for making 5’cap of mRNAs because they have a mechanism known as cap-snatching where they use host-derived primers to initiate the mRNA transcription process.35 Thus, the resistance to RBV observed in vitro by OROV, CARV, GUAV, GROV, and TCMV (when doses lower than 50 µg/mL were used, and treatment starting 24 hr post-infection) is not associated with guanylyltransferase protein, but it could be related to some particularity of the RNA polymerase of these viruses. A similar result was reported on abscense action of RBV on SARS-CoV (Severe acute respiratory syndromecoronavirus). However, the RBV resistance mechanism has not been explained by the authors.36 Intraperitoneal inoculation of virus produces first a sistemic disease and later the viruses migrate to the brain, where they replicate and cause the death of suckling mice 145 (data not showed). Then, we can propose that the RBV resistance in vivo by the OROV, CARV, GUAV, GROV, and TCMV can be associated with 2 factors: First to some particularity of the RNA polymerase of these viruses, which was not inhibited by RBV action, permiting the virus replication with consequent increase viral burden, which consequently got to the brain of mice, causing illness and death; second, RBV was seen not to be effective against intracerebral virus infections of mice, unless it is administered directly into the brain,37 suggesting that RBV or its active metabolites do not reach the brain in adequate concentrations, probably because the RBV does not cross the blood-brain barrier.38 Then, when the viruses reach the brain, they can replicate in an environment without the antiviral action of RBV, causing disease and death in the infected animals. This second factor was described in mice infected with dengue virus, which treatment with RBV was ineffective, but treatment with a lipophilic analog of RBV was effective, because this one crossed the blood-brain barrier.38 In conclusion, our results indicate that the compound RBV does not present antiviral action on OROV, CARV, GUAV, GROV, and TCMV, and consequently the RBV will not be a good therapeutical agent to treat these arboviruses. Future studies will be necessary to characterize other antiviral agents to attenuate the infection caused by these viruses. Acknowledgments We thank Dr. Pedro Vasconcelos, Dr. Amélia Travassos da Rosa, and Dr. Terezinha Lisieux Coimbra for kindly supplying viruses used in this study, and Dr. Eurico de Arruda Neto for his critical review of the manuscript. Financial Support This work was supported by FAPESP grant to L.T.M. Figueiredo (No 03/03682-3) and by fellowship from CAPES to M.C. Livonesi. Address Márcia C. Livonesi; Ricardo L. M. de Sousa, Soraya J. Badra, and Luiz T. M. Figueiredo Centro de Pesquisa em Virologia, Universidade de São Paulo (USP) Av. Bandeirantes, 3900, 14049-900, Ribeirão Preto, SP, Brasil. Phone/Fax: +55-16-602-3376. 146 Adress for reprint Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo Centro de Pesquisa em Virologia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo (USP). Av. Bandeirantes, 3900. CEP: 14049-900 - Ribeirão Preto, SP, Brasil. References 1. Elliot RM, 1996. The Bunyaviridae. Plenum Press, New York, N.Y. 2. Goldsmith CS, Elliot LH, Peters CJ, Zaki SR, 1995. Ultrastrutural characteristics of Sin Nombre virus, causative agent of hantavirus pulmonary syndrome. Arch. Virol. 140: 2107-2122. 3. Pinheiro FP, Travassos da Rosa APA, Vasconcelos PFC, 2004. Oropouche fever. Feigin RD, ed. Textbook of pediatric infectious diseases. WB Saunders Co 2418--2423. 4. LeDuc JW, Pinheiro FP, 1988. Oropouche fever. Monath TP, ed. The Arboviruses: Epidemiology and Ecology. Volume IV. Boca Raton FI: CRC Press, 1--15. 5. Brinton MA, Gavin EI, Lo WK, Pinto AJ, Morahan PS, 1993. Characterization of murine Caraparu Bunyavirus liver infection and immunomodulator-mediated antiviral protection. Antiviral Res. 20: 155--171. 6. Jonkers AH, Spence L, Olivier O, 1968. Laboratory studies with rodents and native to Trinidad. Am. J. Trop. Med. Hyg. 17: 299--307. 7. March RW, Hetrick FM, 1967. Studies on Guaroa virus. Am. J. Trop. Med. Hyg. 16: 191--195. 8. Travassos da Rosa APA, Travassos da Rosa JFS, Pinheiro FP, Vasconcelos PFC, 1997. Leão RNQ, ed. Doenças Infecciosas e Parasitárias – Enfoque Amazônico. Belém, CEJUP, 207--241. 9. De Clercq E, 1993. Antiviral agents: characteristic activity spectrum depending on the molecular target with which they interact. Adv. Virus Res. 42: 1--55. 10. Crotty S, Cameron CE, Andini R, 2001. RNA virus error catastrophe: direct molecular test by using Ribavirin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 6895--6900. 11. Hruska JF, Bernstein JM, Douglas RG Jr, Hall CB, 1980. Effects of ribavirin on respiratory syncytial virus in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 17: 770--775. 12. Leyssen P, Balzarini J, De Clercq E, Neyts J, 2005. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramixoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virology 79: 1943--1947. 147 13. Neyts J, Meerbach A, McKenna P, De Clercq E, 1996. Use of the yellow fever virus vaccine strain 17D for the study of strategies for the treatment of yellow fever virus infections. Antiviral Res. 30: 125--132. 14. Jordan I, Briese T, Fischer N, Lau JY, Lipkin WI, 2000. Ribavirin inhibits West Nile virus replication and cytopathic effect in neural cells. J. Infect. Dis. 82: 1214--1217. 15. Crotty S, Maag D, Arnold JJ, Zhong W, Lau JY, Hong Z, Andino R, Cameron CE, 2000. The broad-spectrum antiviral ribonucleoside ribavirin is an RNA virus mutagen. Nat. Med. 6: 1375--1379. 16. Durr FE, Lindh HF, 1975. Efficacy of ribavirin against influenza virus in tissue culture and in mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 255: 366--371. 17. Jahrling PB, Hesse RA, Eddy GA, Johnson KM, Callis RT, Stephen EL, 1980. Lassa virus infection of rhesus monkeys: pathogenesis and treatment with ribavirin. J. Infect. Dis. 141: 580--589. 18. Andrei G, De Clercq E, 1990. Inhibitory effect of selected antiviral compounds on arenavirus replication in vitro. Antiviral Res. 14:287--299. 19. Sidwell RW, Huffman JH, Barnett BB, Pifat DY, 1988. In vitro and in vivo Phlebovirus inhibition by ribavirin. Antimicrob. Agents Chemother. 32: 331--336. 20. Cassidy LF, Patterson JL, 1989. Mechanism of La Crosse virus inhibition by ribavirin. Antimicrob. Agents Chemother. 33: 2009--2011. 21. Davis GL, Esteban-Mur R, Rustgi V, Hoefs J, Gordon SC, Trepo C, Shiffman ML, Zeuzem S, Craxi A, Ling MH, Albrecht J, 1998. Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin for the treatment of relapse of chronic hepatitis C. International Hepatitis Interventional Therapy Group. N. Engl. J. Med. 339: 1493--1499. 22. McHutchison JG, Gordon SC, Schiff ER, Shiffman ML, Lee WM, Rustgi VK, Goodman ZD, Ling MH, Cort S, Albrecht JK, 1998. Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. Hepatitis Interventional Therapy Group. N. Engl. J. Med. 339: 1485--1492. 23. Wyde PR, 1998. Respiratory syncytial virus (RSV) disease and prospects for its control. Antiviral Res. 39: 63--79. 24. McCormick JB, King IJ, Webb PA, Scribner CL, Craven RB, Johnson KM, Elliott LH, Belmont-Williams R, 1986. Lassa fever. Effective therapy with ribavirin. N. Engl. J. Med. 314: 20--26. 25. Graci JD, Cameron CE, 2006. Mechanisms of action of ribavirin against distinct viruses. Rev. Med. Virol. 16:37--48. 148 26. Streeter DG, Witkowski JT, Khare GP, Sidwell RW, Bauer RJ, Robins RK, Simon LN, 1973. Mechanism of action of 1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide (Virazole), a new broad-spectrum antiviral agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70: 1174-1178. 27. Goswami BB, Borek E, Shalma DK, Fujitaki J, Smith RA, 1979. The broad spectrum antiviral agent ribavirin inhibits capping of mRNA. Biochem. Biophis. Res. Commun. 89: 830--836. 28. Eriksson B, Helgstrand E, Johannson N, Larsson A, Misionny, A, Noren JO, Philipson L, Stenberg K, Stening G, Stridh S, Oberg B, 1977. Inhibition of influenza virus ribonucleic acid polymerase by ribavirin triphosphate. Antimicrob. Agents Chemother. 11: 946--951. 29. Ning Q, Brown D, Parodo J, Cattral M, Gorczynski R, Cole E, Fung L, Ding JW, Liu MF, Rotstein O, Phillips MJ, Levy G, 1998. Ribavirin inhibits viral-induced macrophage production of TNF, IL-1, the procoagulant fgl2 prothrombinase, and preserves TH1 cytokine production but inhibits TH2 cytokine response. J. Immunol. 160: 3487--3493. 30. Scheidel LM, Durbin RK, Stollar V, 1987. Sindbis Virus mutants resistant to Mycophenolic Acid and Ribavirin. Virology 158: 1--7. 31. Morens DM, Halstead SB, Repik PM, Putvatana R, Raybourne N, 1985. Simplified plaque reduction neutralization assay for dengue viruses by semimicro methods in BHK-21 cells: comparison of the BHK suspension test with standard plaque reduction neutralization. J Clin Microbiol; 22: 250--254. 32. Diamond MS, Zachariah M, Harris E, 2002. Mycophenolic Acid inhibits Dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology 304: 211--221. 33. Lipsky JJ, 1996. Mycophenolate mofetil. Lancet 348: 1357--1359. 34. Scheidel LM, Stollar V, 1991. Mutations that confer resistance to mycophenolic acid and ribavirin on Sindbis virus map to the nonstructural protein nsP1. Virology 181: 490-499. 35. Jin H, Elliot RM, 1993. Non-viral sequences at the 5’ends of Dugbe nairovirus S mRNAs. J. Gen. Virol. 74: 2293--2297. 36. Tan ELC, Ooi EE, Lin C, Tan HC, Ling AE, Lim B, Stanton LW, 2004. Inhibition of SARS coronavirus infection in vitro with clinically approved antiviral drugs. Emerg. Infec. Dis. 10: 581--586. 37. Allen LB, 1980. Review of in vivo efficacy of ribavirin. Smith RA, Kirkpatrick W, eds, Ribavirin: a broad spectrum antiviral agent. Academic Press, Inc., New York, 43--58. 149 38. Koff WC, Pratt RD, Elm Jr, JL, Venkateshan CN, Halstead SB, 1983. Treatment of intracranial dengue virus infections in mice with a lipophilic derivative of ribavirin. Antimicrob. Agents Chemother. 24:134--136. Figure legends Figure 1: RBV presents antiviral effect on the TCMV only in dose of 50 µg/mL, which it is abolished by addition of guanosine. A-B: Vero E6 cells cultured in 24-well plates were treates only with medium (M) or it added to different concentrations RBV (≤ 50 µg/mL) 24hr before (A) or 2hr after (B) infection by TCMV. C: Vero E6 cells were treated only with medium (M) or medium added to RBV (50 µg/mL) 24 or 48hr after infection by TCMV. D: Vero E6 cells cultured in 24-well plates were treated only with medium (M) or medium added to Guanosine (G), or medium added to RBV, or medium plus RBV and Guanosine 24hr before infection by TCMV. A-D: 9-days after infection the overlay was removed, the cells were stained with naphtol blue black, and the plaques forming units (PFU) were counted. The scale bars represent the mean ± SD of Log10 PFU/mL obtained from quadruplicate cultures. Similar results were obtained in a second experiment. * p<0.05 compared with medium-treated infected cells. Figure 2: The dose of RBV of 35 mg/kg/day does not present toxic effect in suckling mice. Groups of Swiss mice were treated daily with placebo, or doses of 45 or 35 mg/kg of RBV for 10 consecutive days. The treatment was initiated on 2-day-old mice (black arrow) and was maintained for 10 days. The animals were weighed before of treatment and daily for 10 days. Values represent the mean of mouse weights of each group. * p<0.05 compared with placebo-treated mice. Similar results were obtained in a second experiment. Figure 3: RBV-treated and placebo-treated mice present similar virus titer in the brain. Groups of 16 three-day-old Swiss mice were infected intraperitoneally with OROV, CARV, GUAV, GROV, or TCMV and they were treated intraperitoneally with RBV (35 mg/kg/day) or placebo. The treatment was initiated 24hr before infection and maintained each every day. The mice brain (two mice per group) were taken on days 1, 2, 3, 5, 7, and 9 after infection. The virus titer in the brain was measured by plaque assay. The scale bars represent the mean ± SD of PFU/mL. Similar results were obtained in a second experiment. 150 Table 1: Livonesi et al., Table 1: Effect of RBV on Brazilian Orthobunyavirus replication in Vero E6 cells Percentage of inhibition on plaque formation a (%) a Viruses Treatment 24h before infection Treatment 2h after infection OROV 0 0 CARV 0 0 GUAV 7 0 GROV 0 0 TCMV 85 b 62 c Percentage of inhibition on plaque formation by virus in Vero cells treated with 50 µg/mL of RBV b p< 0.005 c p< 0.01 151 Figure 1: Livonesi et al., 10 A 9 8 7 6 * 5 4 3 2 B 9 Log10 PFU/mL Log10 PFU/mL 10 8 7 6 * 5 4 3 M 10 20 30 40 2 50 M RBV (ug/mL) 30 40 50 10 C 8 7 6 5 4 3 D 9 Log10 PFU/mL 9 Log10 PFU/mL 20 RBV (ug/mL) 10 2 10 8 7 6 5 4 3 M 24 Hours after infection 48 2 M M+G RBV RBV+G 152 Mean of animal weight (gms) Figure 2: Livonesi et al., 15 Placebo 35,0 mg/Kg 45,0 mg/Kg 10 * ↓ 5 0 * * * 0 2 4 6 8 Days 10 12 14 153 Table 2: Livonesi et al., Table 2: Effect of RBV on mice infected i.p. with Brazilian Orthobunyavirus Viruses Survived/total Placebo Survived/total RBV MTD a ± S.D. (days) Placebo MTD ± S.D. (days) RBV OROV 0/16 1/16 (6%)b 11.0 ± 2.8 11.5 ± 3.5 CARV 1/16 (6%)b 2/16 (12%)b 9.0 ± 2.8 14.0 ± 7.0 GUAV 0/16 0/16 7.0 ± 1.4 7.0 ± 1.4 GROV 0/16 0/16 5.5 ± 2.1 5.5 ± 2.1 TCMV 0/16 0/16 8.5 ± 2.1 8.0 ± 1.4 a Mean b time to death (x %) = Survival rates 154 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV Placebo RBV 1 2 3 5 7 CARV Q Viral titer in the brain (Log10 PFU/mL) Figure 3: Livonesi et al., 1 2 3 5 7 9 GROV 1 2 3 Days after infection 5 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GUAV 1 2 3 5 7 2 3 5 7 TCMV 1 Days after infection 155 10.2. Artigo referente aos resultados do Ácido Micofenólico Manuscrito submetido para publicação na “Intervirology”. 156 CATEGORY: Original Article TITLE: In vitro study of antiviral activity of Mycophenolic Acid on Brazilian Orthobunyavirus. RUNNING TITLE: Mycophenolic Acid action on Brazilian Orthobunyavirus AUTHORS’ NAMES: Márcia Cristina Livonesi a, Ricardo Luiz Moro de Sousa b, and Luiz Tadeu Moraes Figueiredo a. a Centre of Research in Virology, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo-USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil. b Department of Veterinary Pathology, School of Veterinary and Agrarian Sciences, São Paulo State University – UNESP, Jaboticabal, SP, Brazil. CORRESPONDING AUTHOR: Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo (USP). Av. Bandeirantes, 3900. CEP: 14049-900 - Ribeirão Preto, SP, Brasil. Phone/Fax: +55-16-602-3376. E-mail: [email protected] 157 Abstract Objective: Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa and Tacaiuma are ssRNA viruses that belong to Orthobunyavirus genus and have been associated with human febrile illnesses and encephalitis. In this study, we evaluated the antiviral action of Mycophenolic Acid (MPA) on these Orthobunyavirus to achieve a therapeutical agent to treat the diseases caused by these viruses. Methods: The in vitro antiviral evaluation to MPA was done by using plaque assay, in differents periods of treatment and concentrations of the compound. Results: Results showed that MPA in the concentration of 10µg/mL has significant antiviral activity on Tacaiuma virus when treatment was initiated either prior or after viral infection. Moreover, MPA presents inhibitory effect on Guama virus replication, but only when treatment was initiated before cell infection. Addition of guanosine in the culture reverted the inhibitory effect of MPA on Tacaiuma and Guama viruses, suggesting that the antiviral activity of this substance was via depleting intracellular guanosine pool. However, doses lower than 10µg/mL and treatment starting 24 hours after infection did not show any antiviral activity on Tacaiuma virus, suggesting that the compound MPA presents limited antiviral activity on Tacaiuma virus. Conclusion: Our results suggest that MPA would not be a good therapeutical agent to treat the diseases caused by Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa, and Tacaiuma viruses. Keywords: Mycophenolic Acid, Oropouche virus, Caraparu virus, Guama virus, Guaroa virus, Tacaiuma virus, Orthobunyavirus, IMPDH, antivirals. 158 Introduction The Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa and Tacaiuma viruses belong to the Orthobunyavirus genus, in the Bunyaviridae family. These viruses are enveloped, with trisegmented single-stranded RNA genome of negative or ambisense polarity, replicate in the cytoplasm and bud into the Golgi apparatus [1] or upon the plasma membrane [2]. Oropouche virus is transmitted mainly by the biting midge (Culicoides paraensis) and has been associated with dengue-like acute febrile illness. The Oropouche fever has emerged over the past 40 years as a serious public health problem in tropical and subtropical areas of South America, having caused at least 30 reported outbreaks, involving more than half a million people [3]. Similar to Oropouche virus, Caraparu, Guama, Guaroa, and Tacaiuma viruses have been associated with febrile illness, as well as encephalitis in humans. These viruses are transmitted by mosquitoes, and cause disease mainly in residents of the Amazon region of Brazil [4-7]. Due to the high attack rates of Oropouche fever epidemics and to the debilitating nature and duration of symptoms of the clinical syndromes caused by this and other Brazilian Orthobunyavirus, an antiviral therapy, if available, would become a very helpful intervention. Mycophenolic acid (MPA), a fermentation product of several Penicillium species, is a potent, selective, reversible, and noncompetitive inhibitor of the enzyme inosine monophosphate dehydrogenase IMPDH [8]. IMPDH is an enzyme that facilitates the conversion of IMP to xanthosine monophosphate. Inhibition of IMPDH depletes the intracellular guanosine pool, blocking RNA and DNA synthesis [9]. MPA is used clinically in the prevention of rejection of transplanted organs [10]. However, MPA can inhibit to varying degrees the infection of cells in vitro with several viruses: vaccinia, Semliki Forest, influenza A [11], yellow fever [12], dengue [13], and avian reovirus [14]. Thus, in an effort to characterize antiviral agents that could attenuate infection caused by Brazilian Orthobunyavirus, we tested the inhibitory effect of MPA on the replication of Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa, and Tacaiuma viruses in Vero E6 cell cultures by using plaque assay. 159 Materials and methods Viruses Oropouche (OROV) (BeAn19991), Guama (GUAV) (BeAn277), Guaroa (GROV) (BeH22063), and Tacaiuma (TCMV) (BeAn73) viruses were kindly supplied by Dr. Pedro Vasconcelos and Dr. Amélia Travassos da Rosa, (Evandro Chagas Institute, Brazilian Ministry of Health, Belém, Brazil and University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, USA). The Caraparu virus (CARV) (SPAn2049) was kindly supplied by Dr. Terezinha Lisieux Coimbra (Adolpho Lutz Institute, São Paulo, Brazil). Viral stocks were obtained from the brains of intracerebrally infected suckling mice. Brains were mixed with PBS (dilution 1:10 w/v), macerated and centrifuged at 2000×g for 10 minutes at 4°C. The supernatants were harvested and stored at -70oC until use. Cell culture African green monkey kidney cells (Vero E6) were grown in minimum essential medium (MEM, Cultilab, Brazil) supplemented with 10% inactivated, Mycoplasma free, fetal bovine serum (FBS, Cultilab, Brazil), 1% L-glutamine and 0.3% sodium bicarbonate. Compounds Mycophenolic acid (MPA) and guanosine were purchased commercially (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). These compounds were diluted in 30o ethanol, and they were stored at 4oC until use. In vitro antiviral evaluation In vitro antiviral evaluation was done by using plaque assay. Vero E6 cells were seeded in 24-well plates in MEM with 10% FBS, for 24hr at 37°C and 5% CO2. Medium was removed and serial 10-fold dilutions of viral stocks diluted in MEM with 5% FBS were added (0.2mL/well) in quadruplicates, and the cells were incubated for 2hr at 37°C. Subsequently, the viral inoculum was removed and 1.0mL of a combination (v/v) of 1% low-melting-point agarose plus 2X MEM (7% FBS) was added to each well, and the plates were incubated at 37°C for 3 days for OROV and GUAV, 5 days for CARV and GROV, and 9 days for TCMV. The plaques were visualized by staining with a naphtol blue black solution (15 minutes) after the removal of the agarose plug [15]. The plaques were counted under an inverted microscope and the virus titer was determined as PFU per milliliter. 160 MPA and guanosine were diluted in the medium and added to cells on the day before, or 2 hours after viral infection. Determination in vitro of MPA toxicity MPA toxicity on Vero E6 cells was evaluated by trypan blue exclusion assay. MPA doses ≤ 128µg/mL were added on Vero E6 cell cultures by three days.Then the percentage of viable cells was obtained. Statistical Analysis Analysis of variance, followed by the parametric Tukey-Kramer test was used (INSTAT software, GraphPad, San Diego, CA). A P value less than 0.05 was considered to indicate statistical significance. Results MPA inhibits replication of GUAV and TCMV Mycophenolic acid concentration lower than 16µg/mL resulted in a percentage of viable cells of approximately 90% (Fig.1). However, concentration of MPA of 10µg/mL has presented a mild cytostatic effect on Vero E6 cells, because this dose inhibits cell growth by 50% [13]. Additionaly, clinically therapeutic levels of MPA are 10µg/mL (or 30µM) [10]. Then, the dose of 10µg/mL MPA was chosen used to evaluated antiviral activity this compound on Brazilian Orthobunyavirus. Vero E6 cells were treated with MPA 24hr before or 2hr after infection by OROV, CARV, GUAV, GROV and TCMV. The Figure 2 shows that MPA was able to inhibit the replication of TCMV either 24hr before as 2hr after infection (p<0.005). Moreover, MPA presented inhibitory activity on replication of GUAV (p<0.05) when treatment was initiated 24hr before infection. On the other hand, MPA was unable to inhibit the replication of OROV, CARV, and GROV. Addition of exogenous guanosine rescue viral growth of GUAV and TCMV To verify whether the inhibiton of GUAV and TCMV replication by MPA was caused by depletion of the intracellular pool of GTP, guanosine was added to the culture medium at a concentration of 30µg/mL. Figure 3 shows that addition of guanosine efficiently reversed the inhibitory effect of MPA on GUAV and TCMV replication, 161 suggesting that MPA antiviral effect is related to a depletion of the intracellular pool of GTP. Lower doses than 10µg/mL and treatment starting 24 hours after infection are unable to inhibit TCMV replication. To verify whether lower MPA doses than 10µg/mL have inhibitory effect on TCMV replication, cells were treated a day before (Fig.4A) or 2hr after (Fig.4B) viral infection with the following doses: 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, and 10µg/mL. The Figure 4 shows that only the concentration of 10µg/mL is able to inhibit TCMV replication. Furthermore, treatment with MPA starting 24 or 48 hr after TCMV infection was unable to inhibit viral replication (Fig.5), suggesting that antiviral effect of MPA on TCMV is limited and depend of determined conditions, as concentration and treatment period. Discussion In this study, we evaluate the antiviral action of MPA on OROV, CARV, GUAV, GROV and TCMV in vitro. The MPA had significant antiviral effect on the TCMV, either before or after viral infection (Fig.2). This inhibitory effect was reversed by the addition of guanosine in the cell culture (Fig.3), suggesting that the predominant mechanism of inhibitory effect of MPA on TCMV, in this model, is mediated through depletion of intracellular GTP pool. Additionally, MPA showed inhibitory effect on GUAV replication (Fig.2), which was reversed when guanosine was added into the cell culture (Fig.3), suggesting that the mechanism of action of MPA, also in this case, was mediated by the depletion of intracellular GTP pool. Otherwise, 10µg/mL of MPA did not produce any inhibitory effect on OROV, CARV, and GROV, despite this concentration to be sufficient to inhibit the replication of many virus, as follows: yellow fever [12], dengue [13], and avian reovirus [14], suggesting that the replicative cycle of these viruses is less dependent on intracellular GTP levels. Schiedel et al., 1987 [16], produced ribavirin (RBV)/MPA-resistant Sindbis virus (family Togaviridae, genus Alphavirus) by performing serial passages of the virus in A. Albopictus cells in the presence of MPA. The authors suggested that Sindbis virus mutants were able to replicate in the presence of MPA and RBV because they generated a guanylyltranferase and/or RNA polymerase with an increased GTP affinity. Subsequently, Schiedel et al., 1991 [17], showed that the MPA resistent Sindbis virus had an alteration on the RNA guanylyltransferase. 162 Guanylyltransferase is an important protein for the 5’cap structure formation of cellular and viral mRNAs. However, viruses of the Bunyaviridae family do not encode enzymes for making 5’cap of mRNAs because they have a mechanism known as cap-snatching, where they use host-derived primers to initiate the mRNA transcription process [18]. Thus, the resistance of OROV, CARV, and GROV, and the weak susceptibility of GUAV and TCMV to MPA action is not associated with guanylyltransferase protein, but it could be related to some particularity (mutation?) of the RNA polymerase of these viruses. It is important to emphasize that this is the first an in vitro study describing the resistance of Brazilian Orthobunyavirus to MPA antiviral action. In conclusion, our results showed that MPA present antiviral activity on GUAV and TCMV, presenting as a possible mechanism of action to the inhibition of inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) enzyme. However, this antiviral action is limited, because it depends on either concentration of MPA, as the treatment period. Thus, MPA could not be a good therapeutical agent to treat diseases caused by Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa and Tacaiuma viruses. More studies will be necessary to characterize other antiviral agents to attenuate the infections caused by these viruses. Acknowledgments We thank Dr. Pedro Vasconcelos, Dr. Amélia Travassos da Rosa, and Dr. Terezinha Lisieux Coimbra for kindly supplying viruses used in this study, and Dr. Eurico de Arruda Neto for his critical review of the manuscript. This work was supported by FAPESP grant to L.T.M. Figueiredo (No 03/03682-3) and by fellowships from CAPES to M.C. Livonesi. References 1. Elliot RM. The Bunyaviridae. Plenum Press, New York. 1996. 2. Goldsmith CS, Elliot LH, Peters CJ, Zaki SR. Ultrastrutural characteristics of Sin Nombre virus, causative agent of hantavirus pulmonary syndrome. Arch Virol 1995; 140:2107-2122. 3. Pinheiro FP, Travassos da Rosa APA, Vasconcelos PFC. Oropouche fever. In: Feigin RD (ed): Textbook of pediatric infectious diseases. Philadelphia: W.B. Saunders Co., 2004, pp 2418–2423. 163 4. Brinton MA, Gavin EI, Lo WK, Pinto AJ, Morahan PS. Characterization of murine Caraparu Bunyavirus liver infection and immunomodulator-mediated antiviral protection. Antiviral Res 1993; 20(2):155-171. 5. Jonkers AH, Spence L, Olivier O. Laboratory studies with rodents and native to Trinidad. Am J Trop Med Hyg 1968; 17:299–307. 6. March RW, Hetrick FM. Studies on Guaroa virus. Am J Trop Med Hyg 1967; 16:191–195. 7. Travassos da Rosa APA, Travassos da Rosa JFS, Pinheiro FP, Vasconcelos PFC. Doenças Infecciosas e Parasitárias – Enfoque Amazônico. In: Leão RNQ (ed). Belém, CEJUP, 1997, pp 207-241. 8. Eugui EM, Almquist SJ, Muller CD, Allison AC. Lymphocyte-selective cytostatic and immunosuppressive effects of mycophenolic acid in vitro: role of deoxyguanosine nucleotide depletion. Scand J Immunol 1991; 33:161-173. 9. Catapano CV, Dayton JS, Mitchell BS, Fernandes DJ. GTP depletion induced by IMP dehydrogenase inhibitors blocks RNA-primed DNA synthesis. Mol Pharmacol 1995; 47:948-955. 10. Lipsky JJ. Mycophenolate mofetil. Lancet 1996; 348:1357-1359. 11. Planterose DN. Antiviral and cytotoxic effects of mycophenolic acid. J Gen Virol 1969; 4:629-630. 12. Neyts J, Meerbach A, McKenna P, De Clercq E. Use of the yellow fever virus vaccine strain 17D for the study of strategies for the treatment of yellow fever virus infections. Antiviral Res 1996; 30:125-132. 13. Diamond MS, Zachariah M, Harris E. Mycophenolic Acid inhibits Dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology 2002; 304:211-221. 14. Robertson CM, Hermann LL, Coombs KM. Mycophenolic acid inhibits avian reovirus replication. Antiviral Research 2004; 64:55-61. 15. Morens DM, Halstead SB, Repik PM, Putvatana R, Raybourne N. Simplified plaque reduction neutralization assay for dengue viruses by semimicro methods in BHK-21 cells: comparison of the BHK suspension test with standard plaque reduction neutralization. J Clin Microbiol 1985; 22(2):250-254. 16. Scheidel LM, Durbin RK, Stollar V. Sindbis Virus mutants resistant to Mycophenolic Acid and Ribavirin. Virology 1987; 158:1-7. 164 17. Scheidel LM, Stollar V. Mutations that confer resistance to mycophenolic acid and ribavirin on Sindbis virus map to the nonstructural protein nsP1. Virology 1991; 181:490-499. 18. Jin H, Elliot RM. Non-viral sequences at the 5’ends of Dugbe nairovirus S mRNAs. J Gen Virol 1993; 74:2293-2297. Figure legends Figure 1: Concentrations of MPA lower than 16 µg/mL are not toxic to Vero E6 cells. Vero E6 cells cultured in 24-well plates were treated with medium (M) or it was added to different concentrations of MPA. Three days after, the viable cells were counted by exclusion trypan blue assay, and the results were expressed as the mean ± SD of percentage of viable cells obtained of duplicate cultures. Figure 2: MPA presents antiviral activity on the GUAV and TCMV. Vero E6 cells were treated only with medium (M) or it was added to MPA (10µg/mL) 24hr before or 2hr after infection by OROV, CARV, GUAV, GROV, and TCMV. In determinated days after infection the overlay was removed, the cells were stained with naphtol blue black, and the plaques forming units (PFU) were counted. The scale bars represent the mean ± SD of Log10 PFU/mL obtained of quadruplicate cultures. ** p<0.005 and * p<0.05 compared with medium-treated infected cells. Similar results were obtained in a second experiment. Figure 3: Guanosine abolishes the antiviral effect of MPA on the GUAV and TCMV. Vero E6 cells cultured in 24-well plates were treated with medium (M) or this added to Guanosine (G), or medium added to MPA, or medium added to MPA and Guanosine 24hr before infection by GUAV and TCMV. Subsequently the overlay was removed, the cells were stained with naphtol blue black, and the plaques forming units (PFU) were counted. The scale bars represent the mean ± SD of Log10 PFU/mL obtained of quadruplicate cultures. Similar results were obtained in a second experiment. Figure 4: MPA presents inhibitory effect on the TCMV only at a concentration of 10µg/mL. Vero E6 cells cultured in 24-well plates were treated with medium (M) or this added to different concentrations MPA (≤ 10µg/mL) 24hr before (A) or 2hr after (B) 165 infection by TCMV. Nine days after infection the overlay was removed, the cells were stained with naphtol blue black, and the plaques forming units (PFU) were counted. The scale bars represent the mean ± SD of Log10 PFU/mL obtained of quadruplicate cultures. * p<0.05 compared with medium-treated infected cells. Similar results were obtained in a second experiment. Figure 5: TCMV replication is not inhibited when treatment of cells starting 24 hours after infection. Vero E6 cells were treated with medium (M) or medium added to MPA (10µg/mL) 24 or 48hr after infection by TCMV. Nine days after infection the plaques forming units (PFU) were counted. The scale bars represent the mean ± SD of Log10 PFU/mL obtained of quadruplicate cultures. Similar results were obtained in a second experiment. 166 Percentage of Vero E6 cells viable (%) Figure 1: Livonesi et al., 100 80 60 40 20 0 M 2 4 8 16 32 64 MPA concentration (µ g/mL) 128 167 Figure 2: Livonesi et al., Treatment 24hr before infection 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Log10 PFU/mL 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV M MPA CARV M MPA GUAV * M MPA GROV M MPA TCMV M MPA Treatment 2hr after infection 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OROV M MPA CARV M MPA GUAV M MPA GROV M MPA TCMV ** M MPA 168 Log10 PFU/mL Figure 3: Livonesi et al., 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GUAV M M+G MPA MPA+G M+G MPA MPA+G TCMV M Treatment 169 Log10 PFU/mL Figure 4: Livonesi et al., 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 A 0 0.625 1.25 2.5 5 10 B ** 0 0.625 1.25 2.5 5 10 MPA concentration (µ µg/mL) 170 Log10 PFU/mL Figure 5: Livonesi et al., 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 M 24 Hours post-infection 48 171 10.3. Carta de Aprovação da Comissão de Ética em Experimentação Animal O projeto intitulado “Ação de drogas antivirais e interferons sobre Orthobunyavirus brasileiros” foi aprovado de acordo com o Protocolo No 006/2004. 172 Livros Grátis ( http://www.livrosgratis.com.br ) Milhares de Livros para Download: Baixar livros de Administração Baixar livros de Agronomia Baixar livros de Arquitetura Baixar livros de Artes Baixar livros de Astronomia Baixar livros de Biologia Geral Baixar livros de Ciência da Computação Baixar livros de Ciência da Informação Baixar livros de Ciência Política Baixar livros de Ciências da Saúde Baixar livros de Comunicação Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE Baixar livros de Defesa civil Baixar livros de Direito Baixar livros de Direitos humanos Baixar livros de Economia Baixar livros de Economia Doméstica Baixar livros de Educação Baixar livros de Educação - Trânsito Baixar livros de Educação Física Baixar livros de Engenharia Aeroespacial Baixar livros de Farmácia Baixar livros de Filosofia Baixar livros de Física Baixar livros de Geociências Baixar livros de Geografia Baixar livros de História Baixar livros de Línguas Baixar livros de Literatura Baixar livros de Literatura de Cordel Baixar livros de Literatura Infantil Baixar livros de Matemática Baixar livros de Medicina Baixar livros de Medicina Veterinária Baixar livros de Meio Ambiente Baixar livros de Meteorologia Baixar Monografias e TCC Baixar livros Multidisciplinar Baixar livros de Música Baixar livros de Psicologia Baixar livros de Química Baixar livros de Saúde Coletiva Baixar livros de Serviço Social Baixar livros de Sociologia Baixar livros de Teologia Baixar livros de Trabalho Baixar livros de Turismo