Vitamina D - Hermes Pardini

B oletim Técnico
Nesta edição:
Vitamina D - Considerações Laboratoriais
Proteína S livre - Avaliação diagnóstica das trombofilias hereditárias
ano 1 | número 6 | dezembro 2009
Vitamina D
Considerações Laboratoriais
A avaliação laboratorial da vitamina D é realizada através da dosagem sérica da
25(OH) vitamina D [25(OH)D]. Existem duas formas distintas de 25(OH)D:
25(OH)D3, formada a partir do colecalciferol (vitamina D3), e 25(OH)D2,
produzida a partir do ergocalciferol (vitamina D2). A vitamina D3 é sintetizada
naturalmente na pele exposta à radiação ultravioleta, sendo também
encontrada em alguns alimentos. A vitamina D2 é obtida através de
suplementação, sendo gerada a partir da ação da radiação ultravioleta sobre o
ergosterol (esterol vegetal) 1.
Baixos níveis de 25(OH)D têm sido associados a maior risco e progressão de
várias doenças, incluindo osteoporose, cânceres, esclerose múltipla e doença
1,2
cardiovascular . Níveis adequados de 25(OH)D são baseados em conjunto
com biomarcadores fisiológicos ou de doenças. Desses, os mais conhecidos e
utilizados referem-se à integridade do sistema esquelético (paratormônio –
PTH, densidade mineral óssea – DMO e absorção intestinal de cálcio) 3. No
entanto, valores de referência baseados somente nesse aspecto ainda
carecem de consenso, principalmente, levando-se em consideração as mais
3,4
recentes implicações clínicas para a dosagem de 25(OH)D .
H
HO
Molécula Vitamina D
A alta variabilidade dos testes de 25(OH)D, a ausência de reconhecimento
simultâneo para os dois metabólitos, 25(OH)D3 e 25(OH)D2, e a falta de um
método de referência torna a determinação laboratorial da 25(OH)D um desafio
para o laboratório e para o clínico5. A espectrometria de massa aliada à
cromatografia líquida tem sido considerada como método analítico de
referência. No entanto, sua utilização é limitada pelos custos operacionais,
ausência de padronização e desempenho ainda tímido em protocolos clínicos e
3
estudos epidemiológicos .
A dosagem de 25(OH)D por radioimunoensaio (DiaSorin®) foi o primeiro teste
(em 1993) aprovado nos Estados Unidos para utilização clínica pelo Food and
Drug Administration (FDA). Desde então, ele tem sido extensamente utilizado
em estudos clínicos e epidemiológicos, gerando valores de decisão médica
frequentemente referenciados e utilizados.
Em 2007, a DiaSorin® recebeu nova aprovação, também do FDA, para a
utilização do ensaio para dosagem da 25(OH)D por quimioluminescência. De
acordo com o fabricante, ambos os ensaios são capazes de detectar,
1,3
indistintamente, a 25(OH)D3 e a 25(OH)D2 . Estudos de proficiência e estudos
comparativos demonstram boa comparabilidade entre os métodos de
radioimunoensaio e quimioluminescência produzidos pela DiaSorin® para a
dosagem da 25(OH)D total1.
Até o momento, a definição de níveis ótimos de 25(OH)D não foi estabelecida. É
muito importante que esses valores sejam gerados baseados em estudos
clínicos e epidemiológicos e, claramente, são dependentes do método
utilizado2,4,5. Mesmo utilizando-se um único método, o de radioimunoensaio da
DiaSorin®, encontramos dificuldade em estabelecer tais valores de referência.
Entre os limites inferiores mais sugeridos, o valor de 30 ng/mL (ou muito
próximo a esse) parece consensual2,3. No entanto, grande variabilidade nesses
níveis é apresentada, mesmo utilizando-se o teste do mesmo fabricante4.
Estratificação desses níveis entre deficientes e insuficientes talvez seja
interessante para uma maior reflexão sobre essa variabilidade, deixando a
individualização do limite inferior de 25(OH)D a critério médico.
Referências Bibliográficas
1. Wagner D, Hanwell HEC, Vieth R. An evaluation of automated methods for measurement of serum 25hydroxyvitamin D. Clin Biochem 2009;42:1549-1556.
2. Bischoff-Ferrari HA, Giovannucci E, Willett WC, et al. Estimation of optimal serum concentrations of 25hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Am J Clin Nutr 2006;84:18-28.
3. Hollis BW. Assessment of vitamin D status and definiton of a normal circulating range of 25-hydroxyvitamin D.
Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 2008;15:489-494.
4. Pal BR, Marshall T, James C, et al. Distribution analysis of vitamin D highlights differences in population
subgroups: preliminary observations from a pilot study in UK adults. J Endocrinol 2003;179:119-129.
5. Roth HJ, Schmidt-Gayk H, Weber H, et al. Accuracy and clinical implications of seven 25-hydroxyvitamin D
methods compared with liquid chromatography-tandem mass spectrometry as a reference. Ann Clin Biochem
2008;45:153-159.
Assessoria Científica
Dr. William Pedrosa
Assessoria Científica | Endocrinologia
Proteína S livre
Avaliação diagnóstica das trombofilias hereditárias
A deficiência de proteína S (PS) é a trombofilia hereditária de diagnóstico mais
difícil. Devido à heterogeneidade dos defeitos moleculares em casos de
deficiência de PS, o seu diagnóstico é estabelecido pela determinação
plasmática da atividade e das concentrações do antígeno, usando métodos
funcionais e imunológicos, respectivamente.
No plasma, cerca de 60% da PS circula ligada à proteína do complemento
C4bBP. O restante, fração designada PS livre, é a forma predominantemente
ativa da proteína. O termo PS total se refere à quantificação das duas formas,
livre e complexada. Com base na determinação de seus níveis plasmáticos, a
deficiência de PS é classificada em tipo I (deficiência quantitativa com redução
de PS total e livre), tipo II (deficiência qualitativa, caracterizada por atividade
diminuída e níveis antigênicos normais de PS total e livre) e tipo III (níveis
normais de PS total e baixos níveis de PS livre).
As concentrações plasmáticas de PS são influenciadas por fatores como
idade (período neonatal), sexo (mulheres apresentam níveis mais baixos que
homens), status hormonal (mulheres na pós-menopausa apresentam níveis
mais elevados que na pré-menopausa) e genética, o que resulta em grande
variabilidade interindividual dos seus níveis. Várias condições adquiridas como
deficiência de vitamina K, doença hepática, gestação, infecção,
anticoncepcional oral, estrógenos, coagulação intravascular disseminada,
doença autoimune e anticoagulante oral, produzem uma diminuição dos níveis
de PS. Existe uma sobreposição dos valores de referência de proteína S entre
os indivíduos saudáveis e aqueles heterozigotos para deficiência de PS. Com
uma prevalência menor que 0,5%, a deficiência de PS é rara na população
geral.
Por todos esses motivos, a solicitação da dosagem e a interpretação dos
resultados da PS devem obedecer alguns critérios com o objetivo de minimizar
a ocorrência de resultados falsamente alterados:
A avaliação inicial pode ser feita com um teste funcional ou um imunoensaio
para PS livre;
Os testes funcionais podem detectar algumas formas de deficiência de PS
não-detectadas pelos imunoensaios (deficiência tipo II), porém podem sofrer
interferências de vários fatores e devem ser utilizados com cautela na
avaliação inicial dos níveis de PS;
Se o resultado do teste funcional para proteína S estiver alterado, confirmar
com um imunoensaio monoclonal para PS livre;
Se o resultado inicial da PS for baixo, independente do método usado,
confirmar com novo teste em outra amostra, após exclusão de causas
adquiridas de deficiência de PS. Estudos familiares também podem ser úteis;
Para mulheres, valores de referência específicos para pré e pós-menopausa
devem ser considerados. Considerar também o uso de anticoncepcional oral
e terapia de reposição hormonal, que podem reduzir os níveis de PS;
Não se recomenda a dosagem de PS durante qualquer evento agudo
(trombose, inflamação, cirurgia) ou durante a gestação. Entretanto, resultado
normal na vigência de um evento agudo exclui deficiência de PS;
A dosagem de PS deve ser realizada no mínimo 30 dias após a suspensão do
warfarin.
Diferenças analíticas entre os métodos utilizados para determinação dos níveis
de PS também contribuem para a incerteza associada ao diagnóstico da
deficiência da proteína. A avaliação dos níveis de PS pode ser feita com o uso
de testes funcionais ou imunológicos. Entretanto, os ensaios funcionais
apresentam problemas de especificidade devido à interferência de vários
fatores. A presença de níveis elevados de fator VIII e de fator VII, resposta de
fase aguda e fator V de Leiden podem ser associados com níveis falsamente
diminuídos de PS e diagnóstico de deficiência de PS do tipo II, enquanto a
presença de anticoagulante lúpico pode resultar em níveis falsamente elevados
de PS.
Os testes funcionais também apresentam problemas de reprodutibilidade.
Segundo dados do ECAT, os testes de PS funcional e livre apresentam
coeficientes de variação interlaboratorial de 36,9% e 17,7%, respectivamente.
Por sua vez, apesar dos métodos imunológicos não sofrerem interferência dos
fatores mencionados acima, o seu desempenho pode ser afetado por algumas
variáveis analíticas como a temperatura da reação, diluição e tempo de
incubação da amostra, resultando em alguns casos em níveis elevados de PS e
ao não-diagnóstico de deficiência de PS.
A dosagem da PS livre é recomendada pela ISTH-WHO como o método
apropriado para o diagnóstico de deficiência de PS. Estudos utilizando
indivíduos com deficiência geneticamente confirmada de PS demonstraram
sensibilidade diagnóstica entre 97,7% a 100% e especificidade de 100% para
os testes de PS livre.
O melhor preditor do risco de tromboembolismo venoso em pacientes com
suspeita de deficiência de PS é o genótipo. Entre os vários métodos
laboratoriais disponíveis, a dosagem de PS livre é o que melhor se correlaciona
com o genótipo relacionado à deficiência de PS. Apesar da possibilidade de que
alguns indivíduos com deficiência do tipo II não sejam diagnosticados se o teste
para PS livre for utilizado na triagem de deficiência de PS, a deficiência do tipo II
é extremamente rara.
Seguindo recomendações da literatura, o Hermes Pardini realiza a dosagem de
PS por um método imunoturbidimétrico, que utiliza partículas de látex cobertas
com C4BP para captura da fração livre de PS da amostra e anticorpos
monoclonais anti-PS (IL TestTM Free PS). O IL Free PS não requer pré-diluição
da amostra e possui um tempo de incubação muito curto, o que o torna menos
suscetível a apresentar resultados falsamente elevados de PS. O intervalo de
referência da PS livre com o IL Free PS é diferente para homens e mulheres
(mulheres apresentam valores médios mais baixos que homens). Nenhum
efeito significativo da idade sobre os níveis de PS livre foi observado com o IL
Free PS, confirmando que a PS livre sofre menor influência do status hormonal
que a PS total.
Referências Bibliográficas
1. Castoldi E, Hackeng TM. Regulation of coagulation by protein S. Curr Opin Hematol 2008;15:529–36.
2. Goodwin AJ, Rosendaal FR, Kottke-Marchant K, et al. A review of the technical, diagnostic, and epidemiologic
considerations for protein S assays. Arch Pathol Lab Med 2002;126:1349–66.
3. Lane DA, Mannucci PM, Bauer KA. et al. Inherited thrombophilia: part 2. Thromb Haemost 1996;76:824–34.
4. Serra J, Sales M, Chitolie A, Domènech P, Rossi E, Borrell M, Dahlbäck B. Multicentre evaluation of IL Test
Free PS: a fully automated assay to quantify free protein S. Thromb Haemost 2002;88(6):975-83.
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