diagnóstico da neosporose bovina

XIII Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária & I Simpósio Latino-Americano de Ricketisioses, Ouro Preto, MG, 2004.
DIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE BOVINA
Andréa Caetano da Silva1
1
Departamento de Parasitologia- IPTSP – Universidade Federal de Goiás
Caixa Postal 131 – 74001-970 – Goiânia, Goiás - e-mail: [email protected]
A neosporose bovina é causada por Neospora caninum,
que é um parasito coccídio, formador de cistos, que foi descrito e
caracterizado pela primeira vez em cães, nos EUA (Dubey et al,
1988 a, b). Desde sua descrição, a infecção por N. caninum tem sido
diagnosticada em ruminantes domésticos e silvestres, com distribuição cosmopolita. O ciclo biológico de N. caninum foi descrito por
McAllister et al. (1998), sendo o cão o hospedeiro definitivo, que
elimina oocistos do parasito nas fezes os quais , após esporulação,
são ingeridos por um hospedeiro intermediário, onde formará cistos
teciduais Entretanto, este tipo de transmissão (horizontal) não é
freqüente, sendo a maioria das infecções por Neospora em bovinos
através da transmissão vertical. A neosporose tem sido considerada
como uma das maiores causas de aborto em bovinos de todo o mundo (Dubey & Lindsay, 1996).
O diagnóstico definitivo da neosporose bovina é feito através da demonstração do parasito nos tecidos, por exemplo, no
caso de fetos abortados; entretanto, este tipo de diagnóstico, na maioria dos casos de aborto, quase sempre é impossível. Portanto, é
essencial a realização do diagnóstico da neosporose através da detecção de anticorpos específicos para Neospora caninum (Chahan et
al., 2003). Vários métodos sorológicos, como imunofluorescência
indireta (IFI), ensaios imunoenzimáticos (ELISA), Imunoblotting
(IB) e aglutinação direta, usando taquizoítos intactos ou antígenos de
taquizoítos, têm sido desenvolvidos para a detecção de anticorpos
anti-Neospora caninum em bovinos (Jenkins et al., 2002).
DIAGNÓSTICO CLÍNICO
A história clínica do animal ou rebanho pode facilitar a
realização de um diagnóstico acertado. Nos rebanhos infectados por
N. caninum, os abortos podem ocorrer tanto em novilhas quanto em
vacas e podem apresentar-se de forma esporádica, endêmica ou
epidêmica, em qualquer época do ano. A existência de antecedentes
de aborto em algum dos ascendentes ou descendentes dos animais
afetados é importante (Álvarez-Garcia, 2003). Se a infecção intrauterina ocorre no início da gestação, a morte e reabsorção embrionária podem passar despercebidas, mas se a infecção ocorre mais tardiamente, pode ocorrer o aborto como único sinal clínico da infecção
ou pode ainda haver a mumificação fetal. Nas fêmeas que abortaram
não são observados sinais clínicos posteriores e o cio ocorre normalmente. Entretanto, o aborto ou o nascimento de animais infectados, com ou sem sintomas, pode repetir em futuras gestações (Dubey, 1999).
Os bezerros infectados por Neospora podem nascer com
peso reduzido, ter dificuldade de se levantar e apresentar manifestações nervosas. Os membros, mais freqüentemente os posteriores,
podem estar flexionados ou hiperextendidos e o exame neurológico
pode revelar ataxia, diminuição do reflexo patelar e perda da consciência. Também podem apresentar exoftalmia e aparência assimétrica
dos olhos. Deve ser destacado que a maioria dos bezerros infectados
congenitamente nasce clinicamente normal (Ferre et al., 2003).
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Nos fetos abortados realiza-se o diagnóstico nos tecidos e
nos líquidos fetais. Este diagnóstico é feito através da utilização de
técnicas que permitam a detecção de lesões, o isolamento e
identificação do parasito, a detecção de ácidos nucléicos em tecidos
e a demonstração de anticorpos anti-Neospora em fluidos fetais. As
lesões mais características produzidas nos fetos abortados se localizam preferentemente no cérebro, podendo ser detectados inclusive
em fetos mumificados ou autolisados.
Em adultos, o diagnóstico laboratorial é realizado através
da detecção de anticorpos específicos no soro ou no colostro e leite
de vacas infectadas, assim como em fluidos vaginais e saliva (Ooi et
al., 2000).
Técnicas histológicas
As técnicas histológicas são muito utilizadas no diagnóstico do aborto por N. caninum, e devem ser realizadas no exame do
feto abortado. Este deve ser remetido ao laboratório, juntamente com
a placenta e, se possível, com o soro sanguíneo da mãe. Os órgãos de
eleição para o diagnóstico são o cérebro, coração e fígado.
A identificação do parasito, através de técnicas de histopatologia, é difícil, pois as lesões macroscópicas são pouco freqüentes (Dubey e Lindsay, 1996, Anderson et al., 2000) e o número de
parasitos também é escasso, tornando difícil a sua visualização em
cortes histológicos corados pela hematoxilina-eosina. As lesões mais
significativas são caracterizadas por encefalite não supurativa e
miocardite (Corbellini et al., 2002)
As técnicas de imunohistoquímica (IHQ) permitem localizar e identificar o parasito nos cortes de tecido, utilizando soro
policlonal ou anticorpo monoclonal anti-Neospora (Lindsay e Dubey, 1989). Atualmente, os tecidos fetais, que apresentam lesões
compatíveis com Neospora nos exames histopatológicos convencionais, são analisados através da IHQ, baseada no uso do complexo
Avidina-Biotina-Peroxidase, com a finalidade de confirmar a presença de restos de antígeno, taquizoítos ou cistos com bradizoítos. A
sensibilidade das técnicas histológicas utilizadas para o diagnóstico
pode variar em função do número de cortes histológicos analisados e
do grau de autólise nos tecidos (Alvarez-Garcia, 2003).
Técnicas de PCR
Várias técnicas baseadas em PCR foram desenvolvidas nos últimos anos, tendo como seqüência alvo a região ITS1 do DNA
ribossômico e a seqüência Nc5 do DNA genômico de N. caninum,
com modificações, como nested ou semi-nested PCR, sempre para
aumentar a sensibilidade e especificidade da técnica (CollantesFernández et al., 2002). Estas técnicas têm sido amplamente utilizadas em pesquisa e diagnóstico de N. caninum (Tabela 1).
As técnicas de PCR são de grande utilidade no diagnóstico de Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA, mesmo em tecidos que estejam autolisados e têm uma
alta sensibilidade e especificidade. O desenvolvimento de técnicas
de PCR quantitativas (Collantes-Fernández et al., 2002; Muller et
al., 2002) permitiu não só a detecção, mas também a quantificação
do DNA do parasito em diferentes tecidos de animais infectados.
Além do diagnóstico de aborto realizado em tecidos fetais, recentemente a técnica de PCR foi utilizada para a detectar e
quantificar DNA de Neospora caninum em sêmen de bovinos
destinados à reprodução (Ortega-Mora et al., 2003, Caetano-da-Silva
et al., 2004)
Isolamento e inoculação em animais de laboratório
O diagnóstico de Neospora através do isolamento do parasito, a partir de amostras de tecidos com suspeita de infecção, pode
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zadas para a obtenção de cepas e estudos de patogenia do parasito do
ser realizado através da utilização de cultivos celulares (células Veque para o diagnóstico de infecção.
ro, Marc, monócitos bovinos) e/ou inoculação em animais sensíveis,
imunossuprimidos ou não. Entretanto, estas técnicas são mais utiliTabela 1. Principais técnicas de PCR empregadas no diagnóstico e pesquisa de Neospora caninum
Método
Seqüência alvo
RAPD-PCR
Nested PCR
ITS1
Aplicação (espécie)
Referência bibliográfica
Estudos de filogenia
Guo & Jonhson, 1995
Diagnóstico de infecção (ovelhas)
Buxton., 1998
Diagnóstico do aborto (bovinos)
PCR
ITS1
PCR
p-Nc5
Estudos de filogenia (camundongo)
Holmdahl & Mattsson, 1996
PCR
ITS1
Estudos de filogenia
Payne & Ellis, 1996
PCR
p-Nc5
Camundongos
Yamage et al., 1996
Kaufmann et al., 1996
Nested PCR
14-3-3
Camundongos
Lally et al., 1996ª
PCR + sonda captura
(nss-r)RNA
Bovinos e macaco
Ho et al., 1996, 1997 a,b
PCR+UDG+DIA
p-Nc5
Diagnóstico de aborto (bovinos)
Gottstein et al., 1998
Semi-nested PCR
p-Nc5
Diagnóstico de aborto (bovinos)
Baszler et al., 1999
Nested PCR + PCR MIMIC
ITS1
Diagnóstico de aborto (camundongo)
Ellis et al., 1999
PCR e PCR-QC
p-Nc5
(camundongos)
Lidell et al., 1999 a,b
PCR-RFLP
IGS+5S
Estudo de virulência
Fazaeli et al., 2000
PCR
p-Nc5
Detecção de oocistos
Hill et al., 2001
RAPD-PCR
Estudos de diferenciação de espécies
Spencer et al., 2000
PCR quantitativa
p-Nc5
(Camundongos e fetos bovinos)
Collantes-Fernandez et al., 2002
PCR quantitativa
p-Nc5
(Ratos)
Muller et al., 2002
PCR
ITS1
Estudo de variabilidade entre cepas
Gondim, et al., 2004
Nested-PCR
ITS
Sêmen (Bovino)
Ortega-Mora et al., 2003
PCR quantitativa
p-Nc51
Adaptada de Álvarz-García (2003)
Caetano-da-Silva, 2004
Testes sorológicos
Desde o isolamento de N. caninum de cães infectados
(Dubey et al., 1988b) vários testes sorológicos, com o propósito de
estudar a epidemiologia e realizar o diagnóstico de N. caninum, em
diferentes espécies animais, têm sido desenvolvidos. Os testes sorológicos mais utilizados no diagnóstico da neosporose bovina são a
reação de imunofluorescência indireta (IFI), ensaios imunoenzimáticos (ELISA), imunoblotting (IB) e testes de aglutinação (AT).
A IFI foi o primeiro teste sorológico utilizado para a demonstração de anticorpos anti-N. caninum (Dubey et al., 1988b) e
tem sido reconhecida como o teste de referência, com o qual outros
testes para detecção de anticorpos têm sido comparados e calibrados
(Björkman e Uggla, 1999, Atkinson et al., 2000). O resultado positivo da IFI é dado pela fluorescência de todo o taquizoíto, a qual
ocorre em soros com títulos moderados a elevados. Quando soros
com título baixo são testados, ocorre apenas uma fluorescência apical ou parcial do taquizoíto. Isto pode ocorrer também no caso de
reações cruzadas com Toxoplasma gondii portanto, os títulos baixos
devem ser interpretados com cautela (Atkinson et al., 2000). Na
sorologia fetal, os pontos de corte mais aceitos variam de 1:50
(Wouda et al., 1998) até 1:80 (Barr et al., 1995). Entretanto, González et al. (1999) sugeriram o emprego de diferentes pontos de corte,
de acordo com a idade gestacional do feto. Em bovinos adultos pontos de corte variando de 1:200 (Schares et al., 1998) a 1:640 (Conrad
et al., 1993). Entretanto, a sensibilidade aumenta quando um título de
1:50 de IFI é empregado em soros de animais cronicamente infectados
(Schares et al., 1998, Alvarez-García, 2003).
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Vários testes ELISA, com alta sensibilidade e especificidade, utilizando diferentes tipos de antígenos, têm sido desenvolvidos nos últimos anos, para a detecção de anticorpos específicos para
Neospora (Tabela 2). O ELISA é um teste simples e rápido de se
realizar e a possibilidade de automatização dos resultados e baixo
custo econômico são vantagens, quando um grande número de amostras é examinado.
O imunoblotting (IB) é importante na identificação de antígenos imunodominantes (IDAs) e tem sido mais usado como auxiliar, junto com outros testes, do que como um teste na rotina de
diagnóstico. Os IDAs podem ser evidenciados mesmo quando soros
com baixo título de anticorpos são testados, sugerindo que um ponto
de corte, através do reconhecimento de dois IDAs é apropriado (Atkinson, et al, 2000). Entre os IDAs destacam-se, por sua intensidade
e freqüência de reconhecimento os de 17, 29-30, 37 e 46 kDa.
O teste de aglutinação direta para a detecção de anticorpos anti-Neospora caninum (NAT) foi primeiramente utilizado por
Romand et al. (1998). Recentemente, Canada et al. (2004) determinaram o título de 1:40 como ponto de corte ideal para a utilização do
NAT para o diagnóstico sorológico de Neospora em bovinos. A
técnica baseia-se no princípio da aglutinação de taquizoítos, na
presença de anticorpos específicos e tem como vantagem não necessitar de um anticorpo secundário, espécie-específico, tornando portanto, a técnica mais simples e com capacidade de ser utilizada para
diferentes espécies de hospedeiros.
Nos últimos anos, trabalhos têm sido realizados (Schares
et al., 1999; Von Blumröeder et al., 2004), na tentativa de minimizar
as discrepâncias existentes e comparação de resultados obtidos,
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através de diferentes técnicas sorológicas, em bovinos de categorias
etárias ou reprodutivas distintas.
Tabela 2. Testes ELISA desenvolvidos para o diagnóstico de Neospora caninum
Tipo de Elisa (Antígeno)
Indireto
Ponto de corte
Características diagnósticas
Sens.
Espec.
DO = 0,45
S/P = 0,45
DO = 0,17
DO = 0,40
97,7
88,6
89
97
95,6
96,5
100
100
S/P = 0,7
88
98
97
92
IRPC = 5
Sanduíche
Competição
Aplicação diagnóstica
Infecção em adultos
Infecção em adultos
Infecção em fetos
Infecção em adultos
Infecção em adultos:
-Animais que abortaram
-Rebanhos endêmicos ou normais
Infecção em adultos
Infecção em adultos
Aborto epidêmico e endêmico
Infecção em adultos
Técnica de
referência
Referência bibliográfica
IFI
IFI
IFI
Björkman et al, 1994
Paré et al, 1995
Osawa et al, 1998
IHQ
Wouda et al, 1998
IFI
Rebordosa et al, 2000
DO = 0,034
PI = 58%
94,2
94,2
IFI e WB
WB
Schares et al., 1999
Baszler et al., 1996
PI = 10%
PI = 15%
PI = 20%
PI = 30%
98
98
98
97,6
96,4
89
96
96
98,6
96,8
Infecção em adultos
Mastazyme
Williams et al., 2000
Infecção em adultos
IFI e IHQ
IFI
Baszler et al., 2000
DO=0,15-0,20
100
96
Infecção em adultos e leite
IFI
Björkman et al, 1997
DO =0,77
PP= 20
PP = 20
PP = 10
95
97
85
83
96
95
90
75
Infecção em adultos
Animais que abortaram
Rebanhos endêmicos
Rebanhos normais
IFI
Williams et al., 1997
IFI
Williams et al., 1999
Infecção em adultos
IFI
Lally et al., 1996b
Jenkins et al., 1997
Infecção em adultos
IHQ
Louie et al., 1997
Infecção em adultos
Infecção em adultos
IFI e WB
WB
Nishikawa et al., 2001
Howe et al.,2002
IFI e WB
Chahan et al., 2003
IFI
Schares et al., 2000
ELISA
ELISA
Schares et al., 2002
Schares et al., 2004
Indireto (partículas Iscoms)
Indireto (taquizoítos)
Indireto (antígeno recombinante) NcDG1 e NcDG2
N54
N57
SRS2
SAG1
(Nc-p29)
DO = 1,0
DO = 0,04
DO = 0,03
DO = 0,189
(+) DO > 1,2
(-) DO < 0,5
95
82
96
93
Infecção em cães, camundongos, e bovinos
SAG1t
Indireto (antígeno purificado por afinidade) p38
p38 (avidez)
ELISA comercial (HerdChek®)
DO = 0,1
DO = 0,153
DO = 0,149
DO = 0,208
AI = 55%
DO = 0,261
83
78
85
92
90
83
78
85
92
90
Infecção em adultos
Aborto epidêmico
Aborto endêmico
Aborto epidêmico-endêmico
Detecção de anticorpos no leite
Adaptada de Alvarez-Garcia (2003)
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