PapilloCheck - Greiner Bio-One

Transcrição

4°
8°
IVD
Fabricado na Áustria
HPV DNA-Chip
PapilloCheck®
Instruções de Uso
Kit diagnóstico para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33,
35, 3, 40, 42,43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais.
Xn
REF 465 060
Para uso em diagnóstico in vitro
Apenas por pessoal profissional de laboratório
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Alemanha
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
[email protected] • www.gbo.com
Revisão: BQ-013-07
Agosto 2011
GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS
en
Store in
the dark
Use by
Consult
Instructions For
Use
Catalog
Number
Manufacturer
In Vitro
Dianostic
Medical
Device
Temperature
limitation
Contents
sufficient
for <n>
tests
D Ncode
A - CImportant
hip
Irritant H P VBatch
Note
de
Im
Dunkeln
lagern
Mindestens
haltbar bis
Vor
Gebrauch
Anweisung lesen
Katalognummer
Hersteller
InVitro- Diagnostika
Medizinprodukt
Temperaturbegrenzung
Inhalt ausreichend
für <n>
Tests
Reizend
Chargenbezeichnung
Wichtiger
Hinweis
fr
À stocker à
l‘abri de la
lumière
Date limite
de conservation
jusqu’au
Lire les instructions
avant
utilisation
Numéro
de référence
Fabricant
Produit
médical de
diagnostic
in-vitro
Limite de
température
Contenu
suffisant
pour <n>
tests
irritant
No de lot
Note importante
es
Conservar en
un lugar
oscuro
A utilizar
preferiblemente
antes de
Antes
de usar,
lea las
instrucciones
Número
de catálogo
Fabricante
Producto
medicinal
de
diagnóstico in vitro
Limitación
de
temperatura
Contenido
suficiente
para <n>
ensayos
Irritante
Código de
lote
Nota importante
it
Conservare al buio
Da
utilizzare
entro e
non oltre
Leggere le
istruzioni
prima
dell’uso
Numero
catalogo
Produttore
Dispositivo
medicodiagnostico in-vitro
Limitazione temperatura
Contenuto
sufficiente
per test
<n>
Irritante
Codice del
lotto
Nota importante
pt
Conservar
num local
escuro
A utilizar
de preferência
antes de
Antes de
usar, leia
as instruções
Número
de catálogo
Fabricante
Dispositivo
médico
de diagnóstico in
vitro
Limitação
de temperatura
Conteúdo
suficiente
para <n>
ensaios
Irritante
Código do
lote
Aviso importante
nl
Donker
bewaren
Tenminste
houdbaar
tot
Gebruiksaanwijzing lezen
Catalogusnummer
PapilloCheck
Fabrikant
In vitro
diagnostisch
medisch
product
Temperatuurbeperking
Voldoende
inhoud
voor <n>
tests
Irriterend
Lot
nummer
Belangrijke opmerking
da
Instruções de Uso
Anvendes
senest
Læsbrugsanvisningen
Katalognummer
Producent
In vitro
meskdicin
doagnoseapparat
Temperaturbegraensær
Indeholder
nok til <n>
test
Lokalirriterende
Lotnummer
Vigtig
henvisning
sv
Förvaras
mörkt.
Sista förbrukningsdag
Läs bruksanvisningen före
användning
Katalognummer
Tillverkare
In vitromedicinsk
doagnostisk
apparatur
Temperatur-begränsning
Innehållet
räcker till
<n> tester
irriterande
Lot
nummer
Viktigt
meddelande
pl
Przechowywa ć w
ciemności
Termin
zydatności
Oppbeva-
holdbar til
Kit diagnóstico
35, 3, 40, 42,43,
no
Xn
®
Opbevares
mørkt
4°
8°
IVD
!
el
res mørkt
REF
465 060
Przed
Numer
Producent Diagnosty- Ogranicze- Zawartość drażniący Kod partii Ważne
użyciem
kataloka
nie
wystarcza
przeczytać gowy
in vitro
temperana <n>
para
a genotipagem de papillomavirus
humano
instrukcję
Produkt
tury
testów tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33,
44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58,yw59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais.
Les bruksanvisning
før bruk
katalognummer
produsent
Αποθηκεύεται por
το λιγότερο
πριν την
Παραγωγός
In vitro
Apenas
pessoal
profiΑριθμός
ssional de
laboratório
στα σκοτεινά διατηρείται
χρήση
Καταλόγου
διαγνωστικά
διαβάστε τις
οδηγίες
tr
in vitro-diagnostisk
medisinsk
utstyr
Karanlık
yerde
saklayınız
Son
kullanma
tarihi:
Kullanma- Katalog
Üretici
dan önce
numarası
firma
talimatı
Greinerokuyun
Bio-One GmbH
ιατρικά
προϊόντα
In vitro
diagnostik
tıbbi tanı
ürünü
temperaturbegrensning
Innhold
tilstrekkelig for <n>
tester
irriterende
batch nr.
Viktig
merknad
περιoριoμός
θερμοκραο
ίας
Περιεχόμενο
αροκετό για
<n> τεοτ
ερεθιστικό
κωδικός
παρτίδας
Σημαντική
υπόδειξη
Sıcaklık
sınırlaması
İçeriği <n>
test için
yeterlidir
Tahrişedici
Parti kodu
Önemli
Not
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
PapilloCheck® - Instruções de Uso
Revisão: BQ-013-07/Agosto 2011
2
TABLE OF CONTENTS
1. CONTEÚDO DO KIT ...................................................................................................... 5
H P V D N A - C h i p6
2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E HARDWARE NECESSÁRIO................................
3. TRANSPORTE E ESTOCAGEM ................................................................................... 8
4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA .................................................................................. 8
5. DESCARTE DE DEJETOS ............................................................................................ 9
6. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 10
6.1 Finalidade do teste......................................................................................................................... 10
6.2 Tipos de HPV detectáveis com PapilloCheck® ............................................................................ 10
6.3 Princípio do ensaio ........................................................................................................................ 11
4°
8°
IVD
6.4 Design do chip de DNA PapilloCheck® ........................................................................................ 13
6.4.1 Layout do chip PapilloCheck® ............................................................................................. 13
6.4.2 Controles na microplaca (On-chip) ..................................................................................... 14
7. INSTRUÇÕES DE USO PARA O FLUXO DE TRABALHO PAPILLOCHECK® ......... 15
7.1 Instruções gerais ........................................................................................................................... 15
7.2 Separação de salas ........................................................................................................................ 15
7.3 Cuidados e precauções ................................................................................................................. 16
®
7.3.1 Prevenção de contaminação ............................................................................................... 16
7.3.2 Instruções para manipular os chips DNA............................................................................. 16
7.3.3 Precauções gerais ............................................................................................................... 16
7.3.4 Segurança no trabalho......................................................................................................... 17
PapilloCheck
Instruções de Uso
8. PROCEDIMENTO PAPILLOCHECK® ......................................................................... 18
8.1 Coleta de amostras e extração do DNA ....................................................................................... 18
8.1.1 Coleta de amostras .............................................................................................................. 18
8.1.2 Extração do DNA ................................................................................................................. 20
Xn
8.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ..................................................................................... 21
8.2.1 Preparação do termociclador ............................................................................................... 21
Uracil-N-Glicosilase
(UNG)
35,8.2.2
3, 40, Tratamento
42,43, 44/55,
45, 51, 52, 53, 56,
58, ...............................................................................
59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais.22
8.2.3 Preparação da reação PCR ................................................................................................. 23
REF
465 060 e lavagem ................................................................................................................. 25
8.3
Hibridização
8.3.1 Preparação and disposição ................................................................................................. 25
8.3.2 Hibridização ......................................................................................................................... 27
8.3.3 Lavagem e secagem............................................................................................................ 29
8.4 Escaneamento e avaliação do chip PapilloCheck® .................................................................... 31
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
3
9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS................................................................................. 32
10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA............................................................................................. 33
11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK® ............................. 34
HPV DNA-Chip
11.1 Desempenho analítico do PapilloCheck® ....................................................................................
34
11.1.1 Sensibilidade analítica ......................................................................................................... 34
11.1.2 Especificidade analítica – Tipos de HPV ............................................................................. 35
11.1.3 Especificidade analítica – Organismos não HPV................................................................. 35
11.2 Repetibilidade................................................................................................................................. 36
11.3 Reprodutibilidade........................................................................................................................... 37
11.4 Robustez ......................................................................................................................................... 38
11.5 Desempenho clínico do PapilloCheck® ....................................................................................... 39
12. PAPILLOCHECK® PROTOCOLO CURTO ................................................................... 41
12.1 Sala 2: PCR - Setup da reação mix ............................................................................................... 41
4°
8°
IVD
12.2 Sala 2: PCR-adição template DNA / Reação de PCR .................................................................. 42
12.3 Sala 3: Preparação da hibridização/
Reação de hibridização ......................................................................................................................... 43
12.4 Sala 3: Lavagem & Secagem /
Scaneamento e Avaliação ..................................................................................................................... 44
PapilloCheck®
Instruções de Uso
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
4
1. CONTEÚDO DO KIT
1
2
4°
8°
IVD
3
PapilloCheck® Test Kit1
Conteúdo
Quantidade
PCR MasterMix
5 x PapilloCheck®
PCR MasterMix2
5 x 300 µl
Caixa de lâminas, 5 x 12 Arrays
1 x Caixa de lâminas PapilloCheck®
Com 5 chips3 PapilloCheck®
5 x 12 Arrays
Tampão de Hibridização
2 x PapilloCheck®
Tampão de Hibridação
2 x 1000 µl
Tampão A conc.
2 x PapilloCheck® Tampão A
concentrado
2 x 40 ml
Tampão B conc.
2 x PapilloCheck® Tampão B
Concentrado
2 x 15 ml
HPV DNA-Chip
Um kit PapilloCheck® é suficiente para a análise de 60 amostras.
Contém todos os componentes necessários para PCR exceto para a DNA Taq Polimerase e o Uracil-N-Glycosilase.
Um chip PapilloCheck® contém 12 PapilloCheck® “microarrays
PapilloCheck®
Instruções de Uso
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
5
2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E HARDWARE
NECESSÁRIO
Recomenda-se o uso do PapilloCheck® em combinação com os consumíveis listados, equipamentos
e hardware apenas por profissionais.
HPV DNA-Chip
Consumíveis
Greiner Bio-One N° Cat
Quantidade
PapilloCheck® Test Kit
465 060
Kit para 60 testes
PapilloCheck® Kit Coleta
465 070
10 amostras
oCheck® DNA Kit de extração / Preparação Coluna
Única
515 040
Kit para 50 preparações
oCheck® DNA Kit de extração / Preparação 8 Colunas
515 050
12 x 8 preparações
765 288
774 288
772 288
739 288
750 288
96/960
96/960
96/960
96/960
60/600
616 201
683 201
673 210
373 270
500/4000
500/1000
125/1250
125/1250
210 261
25/450
607 180 ou 607 160
760 180 ou 760 160
786 180 ou 768 160
1/200
1/200
1/200
Ponteiras filtro para micropipetas isentas de DNA,
estéreis1
0.5-10μl ponteiras filtro
0.5-20μl ponteiras filtro
10-100μl ponteiras filtro
Tubos de ensaio isentos de DNA
IVD
Tubo de ensaio 1.5 ml
Tubo de ensaio 0.2 ml2
8 x 0.2 ml para tiras PCR
Tampa para tiras 8 x 0.2 ml tiras PCR
PapilloCheck®
Tubo em polipropileno 50ml3
Pipetas plásticas para pipetador
Instruções de Uso
4°
8°
Pipeta de 10 ml
Pipeta de 25 ml
Pipeta de 50 ml
1
2
3
Algumas das medidas de ponteiras são opcionais dependendo das micropipetas disponíveis.
A princípio, recomenda-se utilizar tiras PCR para 8 tubos. Tubos para reação única (0.2ml) são opcionais se as tiras
não estiverem disponíveis.
Somente é necessário se uma centrífuga de lâminas não estiver disponível.
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
6
Equipamento
Greiner Bio-One N° Cat
Quantidade
CheckScannerTM
862 070
1
CheckReportTM Software Basic
862 080
1
CheckReportTM Software PapilloCheck® plugin
862 081
1
oCheck® Hibridização Chamber com porta-lâminas
447 070
Cabo para porta-lâminas
447 001
1
Caixa de lavagem oCheck®4
447 020
1
oCheck® VacSet5®
863 080
1
oCheck® VacPump5
863 070
1
H P V D1N A - C h i p
Enzimas necessárias
• Taq Polimerase: HotStarTaq® DNA Polymerase 5 U/μl (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209)
• Uracil-N-Glicosilase : Uracil-DNA Glicosilase 1 U/μl (Fermentas; #EN0361, #EN0362)
Consumíveis adicionais necessários
• Água para PCR (PCR-grade water)
• Água destilada ou deionizada
• Luvas de uso único
Equipamentos adicionais necessários
IVD
• Microcentrífuga para tubos de ensaio 1.5 e 2 ml
• Centrífuga para tubos de polipropileno 50ml (por exemplo, BeckmanCoulter - Centrífuga Allegra X-22, C0650 Rotor
ângulo fixo)
• ou centrífuga de laminas (por exemplo, Labnet - Slide Spinner; VWR International - Centrífuga Galaxy MiniArray)
• Microcentrífuga tubos de ensaio 0.2 ml (um tubo) ou 8-tubos tiras PCR (por exemplo, Labnet - Spectrafuge Mini
Centrífuga)
• Termociclador PCR
®
• Sistema GeneAmp® PCR 9700 (Applied Biosystems)
• ou Veriti™ Termociclador para 96-poços (Applied Biosystems)
• Banho-maria (50°C)
• Micropipetas (diversas capacidades entre 1 - 1000μl)
• Multipipeta 8-Canais multipipeta (faixa: 5 - 50μl), por exemplo, Brand Transferpette®-8 (Brand)
• Pipetador para pipetas de vidro ou plástico
• Agitador tipo vórtex
• Racks para tubos de ensaio de diversas dimensões
PapilloCheck
4°
8°
Instruções de Uso
Hardware adicional necessário
• Computador (para os requisitos do sistema, consultar as instruções de uso do CheckScannerTM e
CheckReportTM Software)
4
5
Para o procedimento de lavagem PapilloCheck®, três oCheck® Washboxes são necessárias.
Somente
necessário quando
emacombinação
com Cat.
515 050.
Kit diagnóstico
para
genotipagem
de No.
papillomavirus
humano tipos
6, 11, 16, 18, 31, 33,
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
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3. TRANSPORTE E ESTOCAGEM
O transporte do PapilloCheck® Test Kit é realizado a temperatura ambiente. No entanto, o kit deve
ser imediatamente estocado após o recebimento entre 4-8°C ao abrigo da luz. Quando estocado
corretamente o PapilloCheck® Test Kit e seus componentes podem ser utilizados até a data de
validade indicada. Além disso, sob estas condições o prazo de validade não se desvia da data de
HPV DNA-Chip
validade após a primeira abertura do kit e seus componentes
4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA
O PapilloCheck® Test Kit é exclusivamente de uso laboratorial, não é um medicamento, produto
doméstico ou para outras finalidades. Utilizar sempre um avental de laboratório, luvas descartáveis
e óculos de proteção. Seguir as instruções de segurança apresentadas nesta seção.
Os componentes a seguir do PapilloCheck® Test Kit contém produtos nocivos ou perigosos.
Componente
4°
8°
IVD
Tampão de
hibridização
Tampão B
Conteúdos
Perigosos
Símbolo
de Perigo
Tiocianato de guanidina
(25-60%)
<20% de dodecilsulfato de sódio
Frases de
Segurança
Frases de
Segurança
Frases de
Segurança
Nocivo*
R 20/21/22
R 32
R 52/53
S13
S61
S36/37
Perigoso*
R 21/22
R 36/37/38
S26
S36/37
PapilloCheck®
* Rotulagem de perigo não necessária para embalagens pequenas de até 125g ou ml (de acordo com a 67/548/EEC
Art.25, 1999/45/EC Art. 12 e German GefStoffV § 20(3) e TRGS 200 7.1). Para maiores informações consultar a Folha
de Dados de Segurança
Instruções de Uso
Frases de Risco
R 21/22
Perigoso se em contato com a pele e se ingerido.
R 20/21/22 Perigoso por inalação, em contato com a pele e se ingerido.
R 33
Em contato com ácidos libera gases muito tóxicos.
R 36/37/38 Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele.
R 52/53
Perigoso para organismos aquáticos, pode causar efeitos em longo prazo ao meio ambiente aquático.
Xn
Frases de Segurança
S13
Manter distante de alimentos, bebidas e rações animais.
S26
Em caso de contato com os olhos, enxaguar imediatamente com grandes volumes de água e procurar por
Kit diagnóstico
para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33,
auxílio médico imediatamente.
35,
3,
40,
42,43,
44/55,
45, 51,
52, 53, e56,
58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais.
S36/37
Utilizar roupas de proteção
adequadas
luvas.
S61
Evitar o descarte ao meio ambiente. Consultar as instruções especiais/folha de dados de segurança.
REF 465 060
A versão atual da Folha de Dados de Segurança para este produto pode ser baixada a partir do
Para
em Bio-One:
diagnóstico
in vitro
website
da uso
Greiner
www.gbo.com/bioscience/biochips_download
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
8
5. DESCARTE DE DEJETOS
4°
8°
IVD
Após lavar e secar o chip PapilloCheck®, as soluções de lavagem I, II e III podem ser descartadas
sem nenhum tipo de precaução especial. Descartar o chip usado PapilloCheck®, componentes não
utilizados do kit assim como uma mistura de hibridização não utilizada com o descarte químico do
laboratório. Cumpra todos os regulamentos nacionais, estatais e locais relativos à eliminação de
HPV DNA-Chip
resíduos.
PapilloCheck®
Instruções de Uso
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
9
6. INTRODUÇÃO
Uma infecção persistente com o papillomavirus carcinogênico humano (HPV) é encontrado
virtualmente em todos os casos de câncer cervical – o segundo câncer mais comum em nível
mundial entre as mulheres1. Até a presente data acima de 100 tipos de HPV foram identificados,
dos quais cerca de 40 tipos são sexualmente transmissíveis e infectam a mucosa cervical. Os tipos
HPV DNA-Chip
de HPV cervical são classificados tanto como alto risco (HPV alto risco, hrHPV) e grupo de baixo
risco (baixo risco HPV, lrHPV). Considerando que os tipos de HPV de alto risco estão associados
com um risco maior de desenvolvimento de câncer cervical, os tipos de PHV de baixo risco causam
sobretudo verrugas genitais benignas2. Contudo, mesmo dentro do grupo de alto risco, o risco
relativo para o desenvolvimento de cancro ou de lesões intraepiteliais cervicais (CIN) depende
do tipo do vírus3. Cerca de 70% de todos os casos de câncer cervical estão conectados a uma
infecção persistente tanto por HPV 16 como HPV 18. Os tipos de baixo risco mais prevalente são
os HPV 6 e HPV 11. Com base na ligação etiológica quase absoluta entre HPV carcinogênico e
o câncer cervical, os testes para hrHPV (alto risco) atualmente estão sendo considerados para o
rastreamento primário de câncer cervical4.
6.1
Finalidade do teste
4°
8°
IVD
PapilloCheck® é um kit para diagnóstico in vitro para a detecção qualitativa e genotipagem de 24
tipos do papillomavirus humano em preparações de DNA obtidas de esfregaços cervicais humanos.
O kit destina-se a ser utilizado apenas por pessoal profissionalmente qualificado.
PapilloCheck® preenche os requisitos da Norma Européia In Vitro Diagnostic Medical Device
Directive (98/79/EC) e portanto possui a marca de conformidade CE.
Qualquer resultado de diagnóstico obtido, utilizando o PapilloCheck®, deve ser interpretado em
conjunto com outras descobertas clínicas ou laboratoriais .
PapilloCheck®
6.2
Tipos de HPV detectáveis com PapilloCheck®
Instruções de Uso
PapilloCheck® permite a identificação de 18 tipos de HPV de alto risco
do papillomavirus humano (HPV). (Tabela 1)
risco
e 6 tipos de HPV de baixo
Tabela 1: Tipos de HPV detectáveis com PapilloCheck®
HPV 16
HPV 45
HPV 59
HPV 6
HPV 18
HPV 51
HPV 66
HPV 11
HPV
31
HPV
52a
Kit diagnóstico
para
HPV 68de papillomavirus
HPV 40
genotipagem
humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33,
35,
3,
40,
42,43,
44/55,
45,
51,
52,
53,
56,
58,
59,66,
68,
70,
73, 82 em amostras cervicais.
HPV 33
HPV 53
HPV 70
HPV 42
REF35465
HPV
Xn
HPV 39
060
HPV 56
HPV 73
HPV 43
HPV 58
HPV 82
HPV 44 / HPV 55*
Apenas® não
porpermite
pessoal
profissional
laboratório
a diferenciação
entrede
o HPV
44 e o HPV 55.
* PapilloCheck
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
10
6.3
Princípio do ensaio
PapilloCheck® é um teste baseado na tecnologia de “microarray” para a detecção e genotipagem de
um fragmento do gene E1 do genoma do papillomavirus humano (HPV). O procedimento de teste
está resumido na Figura 1.
4°
8°
IVD
HPV DNA-Chip
cervical.
Antes da análise do PapilloCheck®, o DNA deve ser extraído de uma amostra de esfregaço
A coleta da amostra e a extração por DNA não fazem parte do PapilloCheck® Test Kit. Os produtos
para coleta de amostras (PapilloCheck® Collection Kit) e extração do DNA (oCheck® DNA Extraction
Kit) também estão disponíveis na Greiner Bio-One e devem ser adquiridos em separado (consultar
as especificações para aquisição no Capítulo 2).
Após a extração do DNA genômico humano e viral de uma amostra cervical, o fragmento 350
bp do gene viral E1 é amplificado por uma reação em cadeia da polimerase na presença de um
conjunto de “primers” para HPV específicos. Na mesma reação, um fragmento do gene humano
ADAT1 de cópia simples (deaminase-1 adenosina tRNA-específica humana) é amplificada para
monitorar a presença do material da amostra humana na amostra cervical (amostra controle) e um
template-controle interno presente no PapilloCheck® PCR MasterMix é amplificado para monitorar o
desempenho do PCR (Controle PCR). Além disso, o PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP.
Assim, a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores (“carry-over”) pode ser
eliminada através da utilização do tratamento com Uracilo-N-Glicosilase (UNG) (ver capítulo 8.2.2).
Os produtos PCR são então hibridizados para sondas DNA específica e controles “on-chip” ligados
à superfície do chip PapilloCheck®. Cada “chip” contém 12 microarrays de DNA, permitindo a
análise simultânea de 12 amostras cervicais. Durante a hibridização, o DNA ligado é marcado por
fluorescência e o DNA não ligado é removido nas etapas de lavagem subsequentes. A eficiência da
hibridização é monitorada (controle de hibridização).
Finalmente, o “chip” PapilloCheck® é scaneado, analisado e avaliado automaticamente usando
o CheckScannerTM e CheckReportTM®Software, respectivamente (consultar as especificações para
aquisição no Capítulo 2). O CheckScannerTM é um scanner a laser bicolor (comprimento de onda
de excitação 532nm e 635nm) que possibilita a detecção do sinal de fluorescência gerado pela
presença do produto de amplificação específicos de HPV bem como os controles (ver Capítulo
6.4.2). O CheckReportTM Software possibilita a visualização, análise e avaliação dos resultados e
apresenta automaticamente os valores correspondentes tanto dos tipos de HPV detectados como
dos controles em um relatório detalhado.
PapilloCheck
Instruções de Uso
O relatório indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis
e os controles abrangentes no-chip tornam a análise altamente confiável.
.
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
11
1. Reação PCR:
HPV DNA-Chip
4°
8°
IVD
2. Hibridização
3. Lavagem e secagem
PapilloCheck®
ou
Instruções de Uso
4. Scaneamento e análise
Xn
REF 465 060
Figura 1: Procedimento do teste PapilloCheck®
1. Reação PCR: Após a detecção do DNA, um fragmento de 350 bp do gene viral E1 e dois fragmentos dos controles alvo
são amplificados por PCR. Os produtos de amplificação são então hibridizados para sondas DNA complementares no
“chip”.
2. Hibridização: Cada tipo de HPV é detectado por uma sonda DNA presente no chip em cinco replicatas. Durante a
hibridização uma marcação fluorescente é introduzida.
3. Lavagem e secagem: O DNA não ligado é removido nas etapas de lavagem subsequentes.
Greiner Bio-One
4. Scaneamento e análise:
O “chip” GmbH
PapilloCheck® é scaneado e avaliado utilizado o CheckScannerTM e o
Maybachstr.
2 • 72636
Frickenhausen
• Alemanhaa presença ou ausência de um ou mais tipos
Um relatório
é criado,
o qual indica claramente
CheckReportTM Software.
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
de HPV detectáveis.
12
6.4
Design do chip de DNA PapilloCheck®
6.4.1
Layout do chip PapilloCheck®
Cada “chip” PapilloCheck® contém 12 “microarrays” designados como poços A1-B6. Cada microarray
PapilloCheck® é composto por 28 sondas diferentes e está rodeado por uma borda elevada. Cada
HPV DNA-Chip
sonda é colorida em cinco réplicas.
A disposição do microarray na lamina do PapilloCheck® é ilustrada na Figura 2 e os controles ‘onchip” são explicados no Capítulo 6.4.2
canal vermelho (635 nm)
controlo da orientação
VPH 6
VPH 45
VPH 11
VPH 51
VPH 16
VPH 52
VPH 18
VPH 53
VPH 31
VPH 56
VPH 33
VPH 58
VPH 35
VPH 59
VPH 39
VPH 66
VPH 40
VPH 68
VPH 42
VPH 70
VPH 43
VPH 73
VPH 44/55
b)
controlo da hibridação
PapilloCheck
canal verde (532 nm)
4°
8°
IVD
a)
®
Instruções de Uso
c)
controlo da PCR
controlo da orientação
VPH 82
controlo da amostra
controlo da PCR
VPH 6
VPH 45
VPH 11
VPH 51
VPH 16
VPH 52
VPH 18
VPH 53
VPH 31
VPH 56
VPH 33
VPH 58
VPH 35
VPH 59
VPH 39
VPH 66
VPH 40
VPH 68
VPH 42
VPH 70
VPH 43
VPH 73
VPH 44/55
VPH 82
controlo da hibridação
controlo da amostra
Xn
REF 465 060
Figura 2: Design do “chip” PapilloCheck®
a) Esquema do “chip” PapilloCheck®. b) e c) Imagens apresentadas pelo CheckReportTM Sofware para os dois
comprimentos de excitação de onda utilizados para scanear (b) canal vermelho: 635nm; c) canal verde: 532nm) e esquemas
Apenas
por pessoal
profissional
de laboratório
®
da disposição
do microarray
PapilloCheck
. As sondas
HPV específicas e os controles “on-chip” estão indicados.
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
13
6.4.2
Controles na microplaca (On-chip)
O design do chip DNA PapilloCheck® inclui controles abrangentes “on-chip”. Diversos sistemas
de controle monitoram todas as etapas críticas tanto do ensaio como do processamento do “chip”,
incluindo a qualidade da amostra e extração do DNA (controle da amostra), qualidade da reação PCR
(controle PCR), a eficácia da hibridização (controle da hibridização), assim como a homogeneidade
P V D N A - CAlém
hip
das colorações e qualidade da impressão (controle da orientação e controle da Himpressão).
disso a presença ou ausência dos tipos HPV, o CheckReport™Software mostra automaticamente
os valores correspondentes tanto dos controles como dos tipos de HPV detectados em um relatório
detalhado. Para a leitura dos diferentes controles ambos os comprimentos de excitação de onda do
CheckScanner™ são utilizados. Para o controle do desempenho do teste (amostra e controle PCR),
o canal vermelho é usado (comprimento de excitação de onda de 635nm), enquanto a qualidade da
hibridização e o “chip” (hibridização, orientação e controle de impressão) é avaliado no canal verde
(comprimento de excitação de onda de 532nm).
4°
8°
IVD
Controle da amostra
PapilloCheck® monitora a qualidade da amostra e/ou extração do DNA amplificando um fragmento
do gene humano de cópia simples - ADAT1(adenosina deaminase-1 tRNA - específico de humano).
Se o DNA humano estiver presente em uma quantidade adequada no DNA extraído da amostra
cervical, um sinal fluorescente é gerado nas colorações de controle de amostra.
Se não houver uma amplificação ADAT1, ou se for insuficiente, o CheckReport™ Software irá relatar
a amostra controle como “failed” (falha) e deverá se repetir a análise devido à quantidade insuficiente
de células na amostra cervical e/ou um desempenho de extração insuficiente (ver Capítulo 9).
Controle PCR
PapilloCheck® também monitora a qualidade da reação PCR. A amplificação de um template de
controle interno presente no PapilloCheck® PCR MasterMix gera um sinal nas colorações de controle
de PCR no chip PapilloCheck®. A qualidade da reação de amplificação também é automaticamente
avaliada pelo CheckReport™ Software.
® Se o desempenho PCR estiver abaixo de um patamar prédefinido, o CheckReport™ Software irá indicar o controle PCR como “failed” e a análise deve ser
repetida (ver Capítulo 9).
Se o total de DNA do HPV na amostra for muito alto, o sinal de fluorescência das colorações de
controle de PCR pode ficar baixo ou até ausente, devido à competição durante a reação PCR.
Neste caso, o sinal fluorescente para, pelo menos, uma sonda de HPV específica, deve exceder um
patamar pré-definido para que o teste seja considerado válido.
PapilloCheck
Instruções de Uso
Xn
Controle de hibridização
PapilloCheck® monitora a eficácia da hibridização através do uso de uma sonda marcada para
fluorescência dentro do Tampão de Hibridização do PapilloCheck®, que hibridiza com sequências
específicas de DNA no “chip” do PapilloCheck®.Uma eficácia de hibridação adequada resulta em
sinais fluorescentes em cada coloração de array. Os resultados das cinco colorações de controle de
hibridização no “chip” PapilloCheck® são também avaliadas pelo CheckReportTM Software.
Orientação
e Controle
da Impressão
REF 465
060
As colorações de controlo da orientação do chip PapilloCheck® geram sinais de fluorescência
independentes
da efi
ciência do inprocesso
de hibridização. Estas colorações são usadas pelo
Para uso em
diagnóstico
vitro
Software
como
pontos
guia
encontrar uma coloração correta, o que é um préCheckReport
ApenasTMpor
pessoal
profi
ssional
depara
laboratório
requisito para a análise correta dos sinais. Além disso, a qualidade do processo de impressão é
monitorada pela presença do sinal de fluorescência verde em cada mancha do “chip” (controle da
impressão).
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
14
7.
7.1
INSTRUÇÕES DE USO PARA O FLUXO DE TRABALHO
PAPILLOCHECK®
Instruções gerais
H Pmolecular
V D N A - C hnum
ip
Quando se implantam as técnicas modernas, atualmente utilizadas, de biologia
laboratório, devem se ter em conta as instruções seguintes para garantir a máxima segurança da
equipe do laboratório e resultados de alta qualidade.
A execução de técnicas de biologia molecular tais como extração do DNA, amplificação e detecção
dos produtos de amplificação necessita pessoas apropriadamente qualificadas. Além disso, um
fluxo de trabalho bem estruturado e limpo é necessário para impedir resultados errôneos, tais como
os que ocorrem devido à degradação do DNA ou contaminação por produtos de amplificação. Para
assegurar isto, é necessário separar as áreas de extração, amplificação e detecção, como descrito
no Capítulo 7.2.
Cada área deve estar equipada com equipamentos, consumíveis, aventais e luvas exclusivas.
Nunca transferir aventais de laboratório, luvas e equipamentos de uma sala para outra.
IVD
7.2
Separação de salas
A Figura 3 apresenta um exemplo de como um laboratório pode ser separado em três seções
distintas. Uma utilizada apenas para a extração do DNA, outra para a instalação e realização das
reações PCR e a última é para hibridização e análise. Cada sala é usada exclusivamente para a
aplicação ou técnica indicada para impedir a contaminação das amostras. O uso de códigos de
cores pode ser vantajoso para evitar a troa acidental de equipamentos e consumíveis entre as
áreas.
PapilloCheck®
Sala 1
8°
Instruções de Uso
4°
Xn
Sala 2
Sala 3
Figura Kit
3: Separação
das salas
diagnóstico
para a genotipagem de papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33,
Sala 1: Todo o procedimento de extração do DNA deve ser realizado nesta sala.
35,
3,
40,
42,43,
44/55,
53, é56,
58, 59,66,
68, 70,(de
73,modo
82 em
amostras
cervicais.
Sala 2: Dentro desta sala, a reação45,
mix51,
para52,
o PCR
realizada
e aliquotada
ótimo
sob uma capela
PCR). A
adição de amostras de DNA extraídas na sala 1 deve ser realizada em um espaço separado dentro da sala 2.
465
Sala 3:REF
Dentro
da 060
Terceira sala do laboratório ocorre a reação de hibridização, etapas de lavagem e secagem do chip.
Adicionalmente, o CheckScannerTM em conjunto com o CheckReportTM Software são utilizados para a análise final do teste
PapilloCheck
.
Para ®uso
em diagnóstico in vitro
!
Não se deve trocar nem equipamento nem consumíveis entre as diferentes salas e espaços do laboratório.
Portanto, as duplicações de equipamento e consumíveis são uma necessidade e devem ser
consideradas ao equipar o laboratório
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
15
7.3
Cuidados e precauções
7.3.1
Prevenção de contaminação
• Devem ser utilizados aventais de laboratório durante todo o procedimento e conjuntos diferentes
de aventais são necessários para cada sala do laboratório.
HPV DNA-Chip
• As luvas devem ser utilizadas durante cada etapa da análise e devem ser trocadas com frequência
especialmente durante a extração de DNA
• O local de trabalho devem ser descontaminados com uma solução de limpeza apropriada.
• Não tocar nunca a parte interna da tampa do tubo de ensaio. Para evitar a contaminação cruzada,
abrir um tubo de cada vez.
• Ponteiras de micropipetas com filtro e barreira de aerosol adequadas devem ser utilizadas
(isentas de DNAse, RNAse, DNA humano). As ponteiras das pipetas sempre devem ser trocadas
entre as transferências de líquidos.
7.3.2
Instruções para manipular os chips DNA
• Os “chips” devem ser utilizados em um ambiente isento de poeira. A deposição de poeira e outras
partículas na superfície do chip deve ser evitada.
• Não tocar a zona de hibridização na superfície do “chip”.
IVD
• Apenas o lado marcado do “chip” desgina-se à hibridização.
• Não utilizar quaisquer canetas marcadoras para a identificação dos “chips” de DNA, pois causam
fluorescência inespecífica no “chip”.
• Os “arrays” DNA são para uso único. Os “chips” hibridizados não podem ser reutilizados.
• Estocar os “chips” não utilizados na embalagem original dentro da embalagem com zíper
contendo o dessecante.
®
PapilloCheck
4°
8°
7.3.3
Precauções gerais
Instruções de Uso
• Este kit é de uso exclusivo para diagnóstico in vitro e só pode ser utilizado por pessoal treinado
na prática de laboratório de diagnóstico in vitro.
• Desde o recebimento, verificar os componentes do kit em relação a danos. Se um dos
componentes estiver danificado (por exemplo, os frascos dos tampões), contatar o seu distribuidor
da Greiner Bio-One. Não utilizar componentes do kit danificados, pois o seu uso pode causar um
desempenho deficiente.
Xn
• Não utilizar o PapilloCheck® Test Kit após a data de validade.
• Não
utilizar
vencidos.
35,
3, 40,reagentes
42,43, 44/55,
45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais.
• Não misturar reagentes de lotes diferentes.
REF 465 060
• Utilizar reagentes/equipamentos fornecidos com o kit e os recomendados pelo fabricante.
• Deve
se uso
efectuar
a calibração/manutenção
regular das micropipetas, do banho-maria e do bloco
Para
em diagnóstico
in vitro
de Apenas
aquecimento.
por pessoal profissional de laboratório
• A pipetagem de pequenos volumes de líquido na faixa de microlitros é um desafio. Portanto,
tomar cuidado para pipetar da forma mais precisa possível.
• Para evitar a contaminação microbiana dos reagentes, tomar cuidado ao remover alíquotas dos
tubos de reagentes.
• Todas as etapas
de centrifugação
devem ser realizadas a temperatura ambiente (18-25 °C).
Greiner
Bio-One GmbH
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
16
7.3.4
Segurança no trabalho
• Tomar cuidado quando manipular amostras biológicas contendo materiais humanos
potencialmente infecciosos. Para minimizar o risco de infecção de materiais potencialmente
infecciosos, recomenda-se trabalhar sob uma cabine de segurança biológica até a lise da amostra
seja concluida. Manipular e descartar todos as amostras biológicas como se fossem capazes de
HPV DNA-Chip
transmitir agentes infecciosos.
• Nunca pipetar soluções com a boca.
• Não comer, beber, fumar ou aplicar produtos cosméticos nas áreas de trabalho.
• Evitar o contato direto com as amostras biológicas assim como respingar ou pulverizar as
amostras.
• Utilizar sempre um avental de laboratório, luvas e óculos de proteção ao manipular amostras de
origem humana.
4°
8°
IVD
• Lavar cuidadosamente as mãos após manipular amostras e reagentes.
PapilloCheck®
Instruções de Uso
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
17
8. PROCEDIMENTO P
APILLOCHECK®
O capítulo a seguir descreve detalhadamente as diferentes etapas de trabalho as quais finalmente
levam à realização de um relatório detalhado, indicando claramente a presença ou ausência de
um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis em cada amostra cervical analisada. A Figura 4
apresenta um resumo das diferentes etapas de trabalho necessárias. Também indica o sub-capítulo
correspondente que descreve a etapa específica do teste. As etapas de trabalho devem ser
realizadas na sequência descrita neste capítulo. Cada etapa específica que necessita de trabalho
manual está indicado com uma flecha .
!
Coleta de amostras, extração do DNA e análise com o CheckReportTM Software não são parte do
PapilloCheck® Test Kit. Desta forma, a descrição destas etapas de trabalho está abreviadas dentro deste
capítulo. Para informações mais detalhadas, favor consultar as instruções de uso correspondentes instruções
de uso, por exemplo, do PapilloCheck® Collection Kit, oCheck® DNA Extraction Kit e o CheckReportTM
Software.
8.1
Coleta de amostras e extração do DNA
8.1.1
Coleta de amostras
A coleta da amostras não faz parte do PapilloCheck® Test Kit. Uma coleta específica para amostras
cervicais (PapilloCheck® Collection Kit) também está disponível na Greiner Bio-One (consultar as
especificações para aquisição no Capítulo 2).
O PapilloCheck® foi validado utilizando DNA preparado com o oCheck® DNA Extraction Kit a partir
de esfregaços cervicais humanos coletados com um dos seguintes sistemas ou meios de coleta:
• PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha)
• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, EUA)
• Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA)
• STMTM (Qiagen, Hilden, Alemanha).
Para maiores informações a respeito de meios de transporte adequados ou sistemas de
extração de DNA, favor contatar o seu distribuidor da Greiner Bio-One ou consultar o website
18
Capítulo 8.1.2 Extracção de ADN
Capítulo 8.2 PCR
Capítulo 8.3.2 Hibridação
Capítulo 8.3.3 Lavagem e secagem
ou
Capítulo 8.4. Varrimento e avaliação
Figura 4: Resumo das diferentes etapas de trabalho do PapilloCheck®
19
8.1.2
Extração do DNA
A extração do DNA não faz parte do PapilloCheck® Test Kit. A extração do DNA antes da análise
pelo PapilloCheck® deve ser realizada usando o oCheck® DNA Extraction Kit, também fornecido
pela Greiner Bio-One (consultar as especificações para aquisição no Capítulo 2). Favor consultar as
Instruções de Uso cuidadosamente quando utilizar oCheck® DNA Extraction Kit.
Para a extração do DNA com o oCheck® DNA Extraction Kit, é necessário o uso de 250μl de
solução de amostra.
As amostras cervicais humanas que forem coletadas com:
• PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One, cód. 465 070)
• PreservCyt® Collection Medium (Hologic, Bedford, MA, USA)
podem ser processadas diretamente.
• SurepathTM Collection Medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) devem ser lavadas antes do uso:
centrifugar 250μl da amostra durante 5 minutos a 11,000 g e resuspender o “pellet” em 250μl
de água destilada. Subsequentemente, os 250μl podem ser processados com oCheck® DNA
Extraction Kit.
• STMTM Collection Medium (Qiagen, Hilden, Germany) devem ser diluídas: usar 100μl da amostra e
adicionar 150μl de água destilada. O volume 250μl da amostra diluída pode ser processada com
o oCheck®DNA Extraction Kit.
Em geral, se a amostra de esfregaço cervical parecer muito concentrada e já agregada. A amostra
deve ser diluída e homogeneizada antes de iniciar a extração do DNA!
Os esfregaços de amostras cervicais que estão muito diluídas e sem células visíveis devem
ser concentradas de modo a atingir um rendimento mais alto de células para a extração do
DNA: centrifugar até 1000μl da amostra durante 5 minutos a 11,000g e resuspender o “pellet”
em 250μl de água destilada. Subsequentemente os 250μl podem ser processados com o
oCheck® DNA Extraction Kit
!
Esta etapa de concentração é apenas apropriada para amostras cervicais que são coletadas com o
PapilloCheck® Collection Kit, em PreservCyt® Collection Medium ou em SurepathTM Collection Medium.
Se o STMTM Collection Medium tiver sido utilizado, uma concentração por centrifugação não será possível.
20
8.2
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
PCR é um método muito sensível que pode detectar quantidades extremamente pequenas de
DNA. Deve se tomar precauções especiais para evitar contaminação da reação (ver capítulo 7). As
enzimas HotStarTaq®Polymerase e Uracil-N-Glicosilase são necessárias mas não são fornecidas
com o PapilloCheck® Test Kit e devem ser adquiridas em separado. (Ver Capítulo 2).
!
O PapilloCheck® Test Kit foi validado usando HotStarTaq® Polymerase da Qiagen e Uracil-N-Glicosilase da
Fermentas (consultar as especificações para aquisição no Capítulo 2). O uso destas enzimas é mandatório
de modo a atingir o desempenho estabelecido.
8.2.1
•
•
•
Preparação do termociclador
O PapilloCheck® Test Kit foi validado com os seguintes termocicladores:
GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems)
Veriti™ 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems).
!
É imprescindível usar um dos dois termocicladores mencionados acima de modo a alcançar o desempenho
estabelecido.
O programa do termociclador do PapilloCheck® está resumido na Tabela 2.
Tabela 2: Programa do termociclador do PapilloCheck® PCR
Tempo
Temp. °C
N.º de ciclos
20 minutos
37 °C
1
15 minutos
95 °C
1
30 segundos
25 segundos
45 segundos
95 °C
55 °C
72 °C
40
30 segundos
45 segundos
95 °C
72 °C
15
Manter
10 °C
Além disso, os parâmetros devem ser configurados para cada termociclador. Para uma descrição
de como configurar estes parâmetros, consultar as Instruções de Uso do respectivo termociclador.
GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems)
Ajustar o volume da reação para 26μl, a velocidade “ramp” para “9600” e fixar a temperatura da
tampa para 103°C.
Veriti™ 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems)
Utilize a ferramenta Método de Conversão (Convert Method) do Termociclador Veriti™ de 96 Poços
para entrar no programa PCR PapilloCheck® e seleccione “9600 Emulation Mode”. Ajustar volume
da reação para 26μl e fixar a temperatura da tampa para 103°C.
21
8.2.2
Tratamento Uracil-N-Glicosilase (UNG)1
O PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP que é incorporada nos produtos de amplificação
durante a fase PapilloCheck® PCR, tornando os produtos PCR passíveis de degradação pela UNG.
A UNG cliva os produtos PCR em locais onde o resíduo desoxiuridilato tenha sido incorporado.
Os produtos PCR clivados não serão amplificados em uma reação subsequente. Por isso, um
tratamento UNG pode se utilizado para eliminar uma contaminação cruzada (carry-over) de reações
prévias PCR.2
¯¯ Diluir a Uracil-N-Glicosilase 1:200 em água de grau PCR. Usar uma diluição fresca de UNG
para cada conjunto de reações de PCR PapilloCheck® (ver capítulo 8.2.3). Não reutilizar a UNG
diluída.
¯¯ Misturar a diluição UNG cuidadosamente com agitador vórtex durante dois segundos e e depois
reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes.
A concentração original da Uracil-N-Glicosilase é 1U/μl. Consequentemente a concentração da
diluição é de 0.005 U/μl.
!
VO kit PapilloCheck® foi validado usando a Uracil-N-Glicosilase da Fermentas (ver capítulo 2). A utilização
desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido.
¯¯ Adicionar 1μl desta diluição a cada reação de PCR PapilloCheck® (ver capítulo 8.2.3, Tabela 3).
Este total é suficiente para eliminar a contaminação cruzada (“carry-over”) do PCR. Tenha cuidado
para não utilizar uma solução de UNG com concentração mais elevada, pois pode causar um efeito
adverso no desempenho do PCR, resultando numa sensibilidade reduzida do PapilloCheck®.
Em geral, para o tratamento da UNG, o MIX da reação de PCR é incubada durante 20 minutos
a 37°C. Posteriormente, a UNG é inativada através de uma etapa de incubação adicional de 15
minutos a 95°C. Estas duas etapas já estão incorporadas no PCR PapilloCheck® e correspondem
às duas primeiras etapas do programa do termociclador (ver Tabela 2). Dentro da segunda etapa (15
minutos a 95°C) ocorre tanto a inativação da Uracil-N-Glicosilase como a ativação da HotStarTaq®
Polymerase.
!
O sistema UNG incorporado no kit PapilloCheck® eliminará apenas a contaminação cruzada (“carry-over”)
com produtos provenientes de reações de PCR prévias. Outra contaminação, por exemplo, que ocorra
durante a preparação da amostra, extração do DNA ou adição do template PCR, não podem ser eliminadas.
Portanto, é necessário seguir as instruções e precauções especiais para impedir a contaminação descrita
no Capítulo 7.
A aquisição de PapilloCheck® faz-se acompanhada de uma licença limitada com os Números de Patentes Norteamericanas 5 035 996, 5 683 896, 5 945 313, 6 287 823 e 6 518 026, e as patentes estrangeiras correspondentes.
2
Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions,
Gene, 93, 125-128, 1990.
1
22
8.2.3
Preparação da reação PCR
Com exceção da HotStarTaq® Polymerase e da Uracil-N-Glicosilase , o PapilloCheck®
PCR MasterMix já contém todos os componentes necessários para a realização da reação PCR
(Tampão PCR, MgCl2, dNTPs, sondas, template do controle PCR).
!
O PapilloCheck® Test Kit foi validado utilizando HotStarTaq® Polymerase da Qiagen (ver capítulo 2). A
utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido.
A melhor forma de preparar o mix de reação é realizada num ambiente protegido, por exemplo, com
uma proteção para PCR, para evitar a contaminação da reação.
¯¯ Preparae o Mix da reação (que consiste em PapilloCheck® PCR MasterMix, HotStarTaq®
Polymerase e Uracil-N-Glicosilase ) na quantidade necessária para as reações PCR como
descrito na Tabela 3.
Para analisar múltiplas amostras, o Mix da reação deve ser preparado em um lote (na quantidade
necessária para todas as análises). Para ajustar as variações de volume durante a pipetagem,
recomenda-se aumentar (n) por 1 para cada chip (=n+1), por exemplo, preparar um volume de mix
de reação para 13 reações de amplificação se 12 amostras devem ser testadas (ver Tabela 3).
Sempre utilizar um frasco de MasterMix para as reações de um chip.
!
Recomenda-se incluir um controle negativo para cada lote de PapilloCheck® PCR MasterMix preparado.
Pode ser utilizado o tampão de eluição DNA do kit de extração DNA apropriado como controle negativo ou
água grau PCR.
¯¯ Misture o Mix da reação cuidadosamente com o agitador vórtex durante 2 segundos e depois
reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes
¯¯ Aliquotar o mix de reação pipetando 21μl da reação mix para cada reação de PCR em um tubo
de reação para PCR de paredes finas de 0.2 ml
Efetue a adição do DNA template em um sala separada da de preparação do Mix de reação (ver
capítulo 7.2)
¯¯ Adicionar 5μl do extrato DNA para cada reação PCR e misture com o agitador vortex durante 2
segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. O volume total
de uma reacção de PCR é 26μl.
¯¯ Coloque os tubos de reação no termociclador e inicie a reação de PCR utilizando o programa do
termociclador descrito no capítulo 8.2.1 (Tabela 2).
!
Após a conclusão da PCR, os produtos de amplificação devem ser utilizados imediatamente para
hibridização ou estocados ao abrigo da luz a -20°C durante uma semana.
23
Tabela 3: Preparação da reação de PCR PapilloCheck®
1 reação
13 reações
(1 “chip”)
26 reações
(2 “chips”)
39 reações
(3 “chips”)
52 reações
(4 “chips”)
PapilloCheck®
PCR MasterMix
19,8 µl
257,4 µl
514,8 µl
772,2 µl
1029,6 µl
HotStarTaq® Polimerase
(5 U/µl)
0,2 µl
2,6 µl
5,2 µl
7,8 µl
10,4 µl
Uracil-N-Glycosilase
(Diluição de 1:200,
0.005 U/μl)
1 µl
13 µl
26 µl
39 µl
52 µl
Volume total antes da adição da amostra DNA
21 µl
273 µl
546 µl
819 µl
1092 µl
Extrato DNA de amostra
cervival (DNA template)
5 µl
Volume total da reação
26 µl
24
8.3
Hibridização e lavagem
8.3.1
Preparação and disposição
A hibridização deve ser realizada a temperatura ambiente (20-25°C). Iniciar com as preparações
necessárias para as etapas de hibridização e lavagem pelo menos 30 minutos antes do início do
procedimento de hibridização.
¯¯ Para dissolver os potenciais precipitados nos tampões de hibridização e de lavagem, deixar os
mesmos à temperatura ambiente (20-25°C) durante 30 minutos e misture bem antes do uso.
A estocagem do PapilloCheck® Test Kit entre 4-8°C pode resultar na precipitação do SDS no Tampão
de Hibridização e no Tampão B. Deixe as soluções atinjam a temperatura ambiente e a seguir agitar
no vórtex o tubo ou agitar o frasco até que qualquer precipitado se dissolva.
¯¯ Prepare a Câmara de Hibridização (oCheck® Hibridização Chamber): coloque um papel toalha
novo e úmido dentro da Câmara de Hibridização oCheck® e fechee a tampa para criar uma
atmosfera saturada de umidade.
Para evitar a evaporação do pequeno volume de mix de hibridização usado no “chip”, é necessário
realizar a hibridização em uma atmosfera saturada em umidade. Uma Câmara de Hibridização
exclusiva para a análise do PapilloCheck® está à disposição na Greiner-Bio-One (ver Capítulo 2).
¯¯ Incube a quantidade necessária de “chips” PapilloCheck® na Câmara de Hibridização a
temperatura ambiente (20-25°C) durante, pelo menos, 10 minutos.
!
O suporte magnético de Lâminas da Câmara de Hibridização contém um ímã em apenas uma das duas
extremidades. Se menos que quatro “chips” de PapilloCheck® devem ser hibridizados em paralelo, tomar o
cuidado de preencher o suporte de lâminas com os “chips” de PapilloCheck® do lado oposto do ímã. Senão,
os “chips” de PapilloCheck® não serão recobertos com o líquido durante o procedimento de lavagem.
¯¯ Prepare as soluções de lavagem I, II e III de acordo com as instruções a seguir.
Preparação das soluções de lavagem I, II e III:
¯¯ Prepare o mix para as soluções de lavagem I, II e III adequada ao número de “chips” de
PapilloCheck® a serem analisados, como demonstrado na Tabela 4.
¯¯ Aliquotar três volumes iguais de mix de solução de lavagem em três oCheck® WashBoxes e
etiquetar as mesmas como solução de lavagem I, II e III. Cada oCheck® WashBox contém uma
escala gravada indicando o volume correto de solução necessária para até 4 “chips”. Utilize esta
escala para verificar a quantidade de tampão.
¯¯ Pré-aquecer a solução de lavagem II a 50°C em um banho-maria com temperatura controlada
pelo menos 20 minutos antes do uso.Certifique-se de que o nível do banho-maria seja igual ao
nível da solução de lavagem II.
25
Tabela 4: Preparação do mix de solução de lavagem
Os volumes apresentados nesta tabela são suficientes para todas as três etapas de lavagem (soluções de lavagem I, II e
III) para o número indicado de “chips” de PapilloCheck®.
Número de “chips” PapilloCheck®
Componentes
1
2
3
4
Água destilada ou deionizada
140 ml
280 ml
420 ml
560 ml
PapilloCheck® Tampão A
14 ml
28 ml
42 ml
56 ml
PapilloCheck® Tampão B
1,75 ml
3,5 ml
5,25 ml
7 ml
155,75 ml
311,50 ml
467,25 ml
623 ml
Volume total
!
Nunca reutilizae as soluções de lavagem, pois isto pode originarum acúmulo de produtos PCR lavados que
possivelmente interferem com os resultados PapilloCheck®. Utilize soluções de lavagem novas para cada
ensaio.
O mix de solução de lavagem pode ser estocado até uma semana à temperatura ambiente. Verificar se
ocorre precipitação de SDS. Se isto ocorrer, aquecer o mix de solução de lavagem até que o precipitado
se dissolva e se equilibre novamente à temperatura ambiente. Em seguida, prepare a nova reação de
hibridização.
26
8.3.2
Hibridização
A hibridização deve ser realizada à temperatura ambiente (20-25°C). As principais etapas de
trabalho para a hibridização dos produtos de reação PCR para o PapilloCheck® dentro do chip
PapilloCheck® são apresentadas na Figura 5.
¯¯ Misture os produtos de PCR antes do uso. Centrifugue brevemente.
Se os produtos de PCR foram estocados a -20°C até a hibridização, primeiro descongele os produtos
de PCR antes de misturar e a seguir proceder conforme está descrito.
¯¯ Agitar com o vórtex o tampão de hibridização antes do uso. Centrifugue brevemente.
¯¯ Misture 30μl do tampão de hibridização PapilloCheck® em um tubo de reação limpo ou em uma
tira 8x de PCR com 5µl do produto de PCR por agitação no vórtex ou pipetando para cima e
para baixo diversas vezes.
¯¯ Centrifugue Brevemente.
¯¯ Transferir 25μl do mix de hibridização em cada poço de “chips” utilizando seis canais de uma
pipeta multicanal. Evitar a formação de bolhas de ar!
Recomenda-se processar seis amostras em paralelo utilizando uma pipeta multicanal com 8
ponteiras e tiras PCR 8x (ver Figura 5). Isto aumenta a eficiência de manipulação, a velocidade e
desta forma reduz o risco de evaporação. Se for necessário processar mais de um chip por vez, o
uso de pipeta multicanal é obrigatório de modo a alcançar o tempo correto de hibridização.
Se for possível, hibridizar todos os 12 poços de um “chip”. No caso de processos inferiores a 12
amostras, deixar os poços não utilizados vazios. Os poços não utilizados de um “chip” processado
não podem ser utilizados para amostras futuras.
!
Manipular o “chip” cuidadosamente para evitar derramar o mix de hibridização. Os respingos ou derrames
podem causar contaminação cruzada das amostras e resultados falso positivos.
Incube o “chip” exatamente 15 minutos a temperatura ambiente (20-25°C) dentro da Câmara de
Hibridização, ao abrigo da luz, em atmosfera saturada de umidade. Tomar cuidado para não mover
a Câmara de Hibridização durante a hibridização.
!
Nunca altere o tempo ou a temperatura de incubação da reação de hibridação, pois isso pode ocasionar a
perda de intensidade do sinal fluorescente ou um aumento da fluorescência não específica.
Não exponha os “chips” hibridizados a ação da luz solar direta.
27
¯¯ Prepare a atmosfera saturada de umidade
na Câmara de Hibridização.
¯¯ Incube o total necessário de “chips”
PapilloCheck® a temperatura ambiente
(20-25°C) (ver capítulo 8.3.1).
¯¯ Misture 30μl tampão de hibridização
PapilloCheck® em um tubo de reação de
0,2ml de uma tira PCR com 5μl do produto
PCR. Misture cuidadosamente.
¯¯ Transfera 25μl do mix de hibridização em
cada um dos poços do “chip” PapilloCheck®
usando uma pipeta multicanal.
¯¯ Feche a câmara de incubação e incube
o “chip” por exatamente 15 minutos a
temperatura ambiente (20-25°C).
Figura 5: Etapas de trabalho do processo de hibridização
28
8.3.3
Lavagem e secagem
Os equipamentos específicos fornecidos pela Greiner Bio-One permitem a lavagem paralela de até
quatro “chips” de PapilloCheck® (ver Capítulo 2). Os equipamentos adicionais necessários para o
processamento do chip PapilloCheck® inclui três caixas de lavagem oCheck® (oCheck® WashBoxes)
e um cabo para o suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridização.
As várias etapas de trabalho são apresentadas na Figura 6.
¯¯ Retire cuidadosamente o suporte magnético de lâminas contendo as lâminas hibridizadas da
Câmara de Hibridização.
¯¯ Colocque o suporte de laminas contendo as lâminas diretamente na oCheck® WashBox contendo
a solução de lavagem I. Certificar-se que o lado magnético esteja voltado para cima.
¯¯ Fixe o oCheck® Handle (cabo) ao suporte de lâminas e inicie a primeira das três etapas de
lavagem.
¯¯ Lave o “chip” a temperatura ambiente (20-25°C) na solução de lavagem I movendo rapidamente
para cima e para baixo durante 10 segundos. Os “arrays” devem estar recobertos pela solução
de lavagem durante todo o tempo.
¯¯ Lave o “chip” durante 60 segundos na solução de lavagem II a 50°C movendo vigorosamente
o suporte para lâminas para cima e para baixo.
¯¯ Lave o “chip” a temperatura ambiente (20-25°C) na solução de lavagem III movendo o mesmo
rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos.
¯¯ Retire imediatamente qualquer líquido da superfície da microplaca através de centrifugação.
Se utilizar uma microcentrifugadora especial para microarrays, centrifugue durante 1 minuto.
Se utilizar uma microcentrifugadora aplicável aos tubos de 50 ml, coloque cada microplaca
PapilloCheck® lavada num tubo de 50 ml e centrifugue à temperatura ambiente durante
3 minutos a 500 g.
O “chip” PapilloCheck® agora está pronto para o scaneamento e deve ser scaneado imediatamente.
Para a limpeza das oCheck® WashBoxes, enxague várias vezes com água após cada etapa completa
de lavagem e de secagem.
29
Primeira etapa de lavagem
¯¯ Retire cuidadosamente o suporte magnético de
lâminas da Câmara de Hibridação.
¯¯ Coloque rapidamente o suporte de laminas
o oCheck® WashBox contendo a solução de
lavagem I.
¯¯ Conectar o oCheck® Handle (cabo).
¯¯ Lavar o “chip” PapilloCheck® na solução de
lavagem I à temperatura ambiente durante
10 segundos movendo rapidamente para cima
e para baixo.
Segunda etapa de lavagem
¯¯ Lavar o “chip” PapilloCheck®” durante 60
segundos na solução de lavagem II a 50°C
movendo vigorosamente o suporte para
lâminas para cima e para baixo.
Terceira etapa de lavagem
¯¯ Lavar o “chip” PapilloCheck® na solução
de lavagem III a temperatura ambiente,
movendo o suporte rapidamente para cima e
para baixo durante 10 segundos.
Secagem
ou
¯¯ Remova imediatamente qualquer resíduo
de líquido da superfície dos “chips”
PapilloCheck® por centrifugação
3 minutos
500 g
1 minuto
velocidade máx.
Figura 6: Etapas de trabalho do procedimento de lavagem
As várias etapas de lavagem e procedimento de secagem antes da análise do “chip” PapilloCheck® com o CheckScannerTM
e o CheckReportTM Software.
30
8.4
Escaneamento e avaliação do chip PapilloCheck®
Coloque o(s) “chip(s)” PapilloCheck® dentro do CheckScannerTM e inicie o scaneamento como
descrito em detalhes no Manual do Usuário do CheckReportTM Software.
Para informações mais detalhadas a respeito da instalação do CheckScannerTM e
oCheckReportTM Software, bem como os requisitos de sistema do computador, consulte as Instruções
de Utilização correspondentes do CheckScanner™ e do CheckReport™ Software.
Sempre que os dados forem analisados utilizando o CheckReport™ Software, certificarse que o CheckReport™ Software instalado em seu computador corresponde à versão
indicada no kit PapilloCheck® utilizado. Se as versões não forem correspondentes, atualizar o
CheckReport™ Software. A última versão pode ser baixada do website Greiner Bio-One:
31
9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS
Se ocorrer uma das mensagens de erro seguintes durante o varrimento do chip ou se a análise
PapilloCheck® falhar devido a controlos específicos no chip, continue conforme descrito abaixo.
Não hesite em contatar o seu distribuidor local Greiner Bio-One se tiver dúvidas ou dificuldades
durante a utilização do PapilloCheck®.
HPV DNA-Chip
PROBLEMA e causa
Comentários e sugestões
4°
8°
IVD
MENSAGEM DE ERRO "COULD
NOT READ BARCODE” (NÃO FOI
POSSÍVEL LER O CÓDIGO DE
BARRAS)
Código de barras danificado
Verificar o código de barras em relação a danos. Entrar manualmente com o
código de barras quando a janela apropriada se apresentar.
O “chip” não foi carregado de
modo correto
Verificar a orientação do “chip” e “scanear” na orientação correta.
MENSAGEM DE ERRO “MISSING
SPOTS”, PRINTING CONTROL
FAILED OR ORIENTATION
CONTROL FAILED
(COLORAÇÕES FALTANDO,
IMPRESSÃO DO CONTROLE
FALHOU OU ORIENTAÇÃO DO
CONTROLE FALHOU)
Poeira no “chip”
Repetir a hibridização do produto(s) PCR em outro “chip(s)” .
Formação de bolhas de ar
durante a transferência de
líquido sobre o “chip”
Repetir a hibridização do produto(s) PCR em outro “chip(s)” . Pipetar
cuidadosamente para evitar a formação de bolhas de ar.
PapilloCheck®
HYBRIDISATION CONTROL
FAILED (CONTROLE DE
HIBRIDIZAÇÃO FALHOU)
Instruções de Uso
Temperatura incorreta da
solução de lavagem II
A segunda etapa de lavagem deve ser realizada a 50°C. Certificar-se que a
solução de lavagem II esteja aquecida a 50°C.
Temperatura incorreta do
banho-maria
A segunda etapa de lavagem deve ser realizada a 50°C. Verificar a temperatura
do banho-maria. Certificar-se que o banho-maria esteja ajustado a uma
temperatura de 50°C. Se necessário, confirmar a temperatura utilizando um
termômetro.
Preparação errônea do mix de
hibridização
Repetir a preparação do mix de hibridização com os volume corretos e hibridizar
os produtos PCR em outro “chip”.
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
32
PROBLEMA e causa
Comentários e sugestões
4°
8°
IVD
PCR CONTROL FAILED
(CONTROLE PCR FALHOU)
A HotStarTaq® DNA
Polymerase não foi adicionada
ao MasterMix.
Repetir a análise PapilloCheck® iniciando com a preparação da reação de
PCR.
HPV DNA-Chip
Adição de uma HotStarTaq®
DNA
Polymerase ao MasterMix que
não reagiu adequadamente
PCR.
Adição da enzima UracilNGlicosilase não diluída ao
MasterMix.
PCR.
Mix de reacção não foi
misturado o suficiente
PCR. Tomar cuidado misturando totalmente a reação mix.
Inibidores de PCR estão
presentes na amostra.
Repetir a extração DNA e a análise PapilloCheck®.
A hibridização foi realizada sem
a adição do produto PCR.
Repetir hibridização.
Mistura insuficiente do Mix de
Hibridização.
Repetir hibridização.
Problemas com o
termociclador.
Verificar tanto o desempenho do termociclador e respectiva programação esta
correta (etapas PCR, “ramp” de aquecimento, volume).
Atenção: Utilizar tanto o GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems)
ou o Veriti™ 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) em combinação
com o PapilloCheck®.
PapilloCheck®
SAMPLE CONTROL FAILED
(AMOSTRA CONTROLE FALHOU)
Não existe adição de DNA da
amostra à reação PCR.
Repetir a análise PapilloCheck® iniciando com a preparação da reação PCR.
Preparação DNA falhou.
Repetir a extração DNA.
Material de amostra insuficiente
Falha na coleta de amostras. A amostra está muito clara. Concentrar a
amostra de acordo com o descrito no capítulo 9.1 e repetir a extração DNA ou
então, repetir a coleta da amostra.
Instruções de Uso
PCR E/OU AMOSTRA NÃO
FALHARAM, MAS APRESENTAM
UM VALOR SNR DE 0
Este resultado é classificado como válido se o CheckReport™ Software
detectar pelo um tipo de HPV na amostra com um sinal acima de um patamar
definido. A amostra e/ou controle de PCR pode então apresentar sinais de
fluorescência baixos ou até mesmo ausentes devido à uma competição
genotipagem
de papillomavirus
humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33,
durante a reação
PCR.
Kit diagnóstico para a
Xn
REF 465 060
uso em diagnóstico
in vitro
10. Para
ASSISTÊNCIA
TÉCNICA
A Greiner Bio-One dispõe de um departamento de assistência técnica que conta com cientistas
experientes, com uma vasta experiência teórica e prática em biologia molecular e nos produtos
oCheck®. Se tiver quaisquer dúvidas ou dificuldades relativamente aos produtos oCheck®, não
hesite em contactar o seu distribuidor local Greiner Bio-One.
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
33
11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO
PAPILLOCHECK®
11.1
Desempenho analítico do PapilloCheck®
11.1.1 Sensibilidade analítica
HPV DNA-Chip
O limite de detecção (LD) foi estabelecido usando plasmídeos de referência para cada tipo de HPV
detectável contendo a região E1 obtida com o PapilloCheck®. Os LD estão resumidos na Tabela 8.
4°
8°
IVD
Tabela 8: Limites de detecção para os tipos de HPV detectáveis
Genótipo do HPV
Cópias / reação
pg/ml**
HPV 6
30*
0,052
HPV 11
150*
0,26
HPV 16
50*
0,086
HPV 18
300*
0,516
HPV 31
300*
0,522
HPV 33
300*
0,519
HPV 35
750*
1,29
HPV 39
30*
0,052
HPV 40
30*
0,052
HPV 42
30*
0,052
PapilloCheck
HPV 43
100*
HPV 44
30*
0,052
HPV 45
50*
0,087
HPV 51
30*
0,051
HPV 52
100*
0,174
HPV 53
30*
0,052
HPV 56
30*
0,052
HPV 58
150*
0,255
HPV 59
50*
0,087
®
0,175
Instruções de Uso
Kit
diagnóstico para100*
a genotipagem de
papillomavirus humano tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33,
HPV 66
0,171
HPV 68
30*
0,052
HPV 70
30*
0,052
Xn
REF 465 060
Para
in vitro
HPV 73uso em diagnóstico
200*
0,338
HPV 82
30*
0,052
* A concentração validada de cada plasmídeo referência HPV foi preparada em 2 séries de diluição diferentes e
mensuradas em 3 repetições da concentração testada (ou seja, um total de 6 repetições por concentração). Além disso,
cada teste continha 10ng de DNA humano. No caso de variação dos dados validados, as concentrações do plasmídeo
específico foram aumentadas ou diminuídas e testado novamente (6 repetições a partir de duas séries de diluição
independentes). O limite de detecção foi a menor concentração onde as 6 repetições eram positivas.
Greiner
GmbH
** Analisadas diretamente,
semBio-One
consideração
da preparação DNA. O total se refere ao DNA-HPV contido no plasmídeo.
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
34
11.1.2 Especificidade analítica – Tipos de HPV
Plasmídeos referência para os tipos HPV listados foram testados com 2,12 x 106 cópias /reação
PCR.
HPV 6b, HPV 11, HPV 13, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV 35,
P V 54,
DNA
- C h 55,
ip
HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HHPV
HPV
HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 71, HPV 73,
HPV 74, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85, HPV 91.
Detectaram-se as hibridações cruzadas seguintes:
HPV 55 dá um sinal na sonda HPV 44. Como resultado, CheckReport™ Software apresenta um
resultado combinado HPV 44/HPV 55.
HPV 13 pode apresentar reação cruzada com a sonda HPV 11 mas não resultam em um sinal falso
positivo, já que o HPV 13 não está presente nas amostras cervicais.
11.1.3 Especificidade analítica – Organismos não HPV
4°
8°
IVD
Os microrganismos a seguir Não-HPV foram testados com o PapilloCheck® (5-10ng de DNA
genômico). Nenhum sinal positivo foi detectado.
Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffii, Actinobacillus actinomycetemcomitans
Serovar c, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis,
Bifidobacterium breve, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Candida albicans,
Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter
freundii, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter koseri, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Eikenella
corrodens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococcus durans, Enterococcus
faecali, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium nodatum , Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis,
Hafnia alvei, Kingella denitrificans, Klebsiella®
oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus,
Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners, Lactobacillus rhamnosus,Lactobacillus vaginalis, Mogibacterium timidum,
Morganella morganii, Mycoplama hominis, Mycoplasma buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans,
Mycoplasma genitalium, Mycoplasma orale, Mycoplasma pirum, Mycoplasma salivrium, Mycoplosma pneumoniae,
Neisseria elongata, Neisseria gonorrhoeae, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptostreptococcus anaerobius,
Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Proteus hauseri,
Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus ssp. aureus, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus agalactiae,
Streptococcus constellatus, Streptococcus criceti, Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus
intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus
sobrinus, Tannerella forsythensis (anteriormente: Bacteroides forsythus), Treponema denticola, Ureaplasma uralyticum,
Veillonella parvula.
PapilloCheck
Instruções de Uso
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
35
11.2
Repetibilidade
Para avaliar a repetibilidade do teste, analisaram-se cinco amostras, cada uma contendo três
templates de referência diferentes de HPV, assim como DNA genômico humano, com o PapilloCheck®.
O número de cópias dos vários HPV obtidos presentes na tabela foram variados assim como o
“background” do DNA humano (ver Tabela 9). Cada amostra foi analisada com PapilloCheck® em
HPV DNA-Chip
cinco repetições independentes. As repetições independentes foram testadas pelo
mesmo técnico
no espaço de 3 dias.
Tabela 9: Composição das amostras para testes de repetibilidade
4°
8°
IVD
Identidade da amostra
(ID)
x-vezes limite de detecção
Tipo HPV
Total de templates DNA
Amostra 1
HPV 16
HPV 18
HPV 31
DNA genômico humano
180 cópias
1500 cópias
1400 cópias
1 ng
3
10
30
Amostra 2
HPV 16
HPV 18
HPV 31
180 cópias
1500 cópias
1400 cópias
5 ng
3
10
30
Amostra 3
HPV 16
HPV 18
HPV 45
1800 cópias
450 cópias
300 cópias
5 ng
30
3
10
Amostra 4
HPV 16
HPV 18
HPV 45
10 000 cópias
5000 cópias
20 000 cópias
2,5 ng
-
HPV 18
HPV 31
HPV 45
4500 cópias
500 cópias
90 cópias
2,5 ng
30
10
3
PapilloCheck®
Amostra 5
Instruções de Uso
Para todas as cinco amostras e em cada análise repetida, os três tipos corretos de HPV foram
detectados e a análise foi negativa para o tipo não incluído. Assim 75 dos 75 resultados dos testes
únicos (5 amostras x 5 repetições x 4 templates diferentes de HPV utilizados) estavam corretas.
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
36
11.3
Reprodutibilidade
A reprodutibilidade para o PapilloCheck® Test Kit foi determinada utilizando 22 amostras clínicas
(ver Tabela 10) com concentrações de HPV próximas ao limite de detecção. A determinação foi
realizada utilizando o mesmo método, com material de amostra idênticos, através de pessoal técnico
diferente e em laboratórios diferentes com instrumentação diferente. Os resultados se apresentaram
HPV DNA-Chip
concordantes para amostras positivas, se tipos idênticos de HPV tenham sido
detectados em
infecções simples ou duplas ou se dois ou três tipos idênticos de HPV foram detectados em infecções
múltiplas com três ou quatro tipos, respectivamente.
4°
8°
IVD
Tabela 10: Resultados dos testes de reprodutibilidade
Amostra
Resultado Laboratório 1
Resultado Laboratório 2
Concordância
1
HPV 33
HPV 33
+
2
HPV 35
HPV 35
+
3
Negativo
Negativo
+
4
HPV 45
HPV 45
+
5
HPV 51, HPV 52
HPV 51, HPV 52
+
6
HPV 51, HPV 56
HPV 51, HPV 56
+
7
HPV 16, HPV 39, HPV 68
+
8
HPV 39, HPV 68
HPV 39, HPV 68
+
9
HPV 16
HPV 16
+
10
Negativo
Negativo
+
PapilloCheck®
11
HPV 56, HPV 44/45
HPV 56, HPV 44/45
+
12
Negativo
Negativo
+
13
+
14
HPV 56, HPV 44/45
HPV 56, HPV 44/45
+
15
+
16
Negativo
Negativo
+
17
HPV 16
HPV 16
+
18
HPV 16
HPV 16
+
19
HPV 45
HPV 45
+
21
HPV 53, HPV 58
HPV 53, HPV 58
+
22
HPV 31
HPV 31
+
Instruções de Uso
HPV
16 52, 53, 56, 58, 59,66, 68, HPV
16 82 em amostras cervicais.
+
35,203, 40, 42,43, 44/55, 45,
51,
70, 73,
Xn
REF 465 060
Apenas
por pessoal
profiobtiveram-se
ssional de laboratório
Para todas
as amostras
clínicas,
resultados concordantes. Os sinais de tipos adicionais
detectados pelo Laboratório 2 para as amostras múltiplas infectadas 7 (HPV 82) e 15 (HPV 68)
ficaram mesmo acima do limite definido e os resultados discordantes foram classificados como não
problemáticos.
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
37
11.4
Robustez
Para avaliar a robustez do PapilloCheck® Test System, foram feitas variações dos parâmetros a
seguir a ser considerados:
• Temperatura de hibridização
HPV DNA-Chip
• Tempo de hibridização
• Temperatura de lavagem
• Tempo de lavagem
Todos os testes foram realizados em replicas de 3 com concentrações altas do template (1ng
plasmídeo HPV referência ou aproximadamente 200 x 106 cópias por amostra). As faixas dos valores
dos parâmetros determinados cuja detecção robusta de HPV é possível com o PapilloCheck® estão
resumidos na Tabela 11.
Tabela 11: Robustez PapilloCheck®
Parâmetro
Faixa
Temperatura de hibridização
IVD
Tempo de hibridização
Temperatura de lavagem
20-25 °C
13-17 minutos
48-52 °C
1ª. Etapa de lavagem
10-15 segundos
PapilloCheck®
60-75 segundos
Tempo de lavagem
Instruções de Uso
4°
8°
10-15 segundos
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
38
11.5
Desempenho clínico do PapilloCheck®
Para determinar o desempenho clínico do teste PapilloCheck® em termos de sensibilidade clínica
e especificidade, realizou-se um estudo comparativo utilizando PapilloCheck® e o ensaio GP5+/6+PCR EIA (7) . Para este estudo, analizaram-se amostras de 1.437 amostras representativas de
mulheres com citologia normal (grupo controle) acima de 40 anos de idade (idade média 49 anos,
HPV DNA-Chip
faixa etária 40 60 anos) e 192 amostras representativas de mulheres (idade média
34 anos, faixa
etária 30 \ 60 anos) com lesões histologicamente confirmadas ClN3+ (grupo do caso). Todas
as amostras utilizadas neste estudo foram originalmente coletadas durante a coleta de base de
mulheres do grupo de intervenção na população controlada ao acaso do ensaio POBASCAM.
Após restringir a análise do PapilloCheck® aos 14 tipos hrHPV objetivados pelo GP5+/6+-PCR-EIA,
PapilloCheck® apresentou uma sensibilidade clínica para≥ CIN3 de 95.8 % (184/192; 95 % CI 92.898.8) e uma especificidade clínica para ≥ CIN2 of 96.7 % (95 % CI 95.7-97.7). Por comparação, estas
figuras foram 96.4 % (185/192; 95 % CI: 93.9-98.9) e 97.7 % (95 % CI: 96.9-98.5), respectivamente,
para GP5+6+-PCR-EIA (ver Tabelas 5 e 6).
Tabela 5: Comparação do PapilloCheck® (tipos hrhPV) e GP5+/6+ PCR-EIA resultados estratificados para controles
e casos.
IVD
PapilloCheck®
(Tipos 14 hr HPV)
GP5+/6+-PCR/EIA
Total
-
+
-
Controles
+
total
1386 (96,5 %)
18 (1,3 %)
1404 (97,7 %)
4 (0,3 %)
29 (2,0 %)
36 (2,3 %)
1390 (96,7 %)
47 (3,3 %)
1437
Casos
+
total
®
4 (2,1 %)
3 (1,6 %)
7 (3,6 %)
4 (2,1 %)
181 (94,3 %)
185 (96,4 %)
8 (4,2 %)
184 (95,8 %)
192
PapilloCheck
Instruções de Uso
4°
8°
Tabela 6: Sensibilidade e especificidade clínica do PapilloCheck® e o GP5+/6+ PCR-EIA (resultados para um ou
mais dos 14 tipos hr HPV tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 ou 68.
14 HPV de alto risco
PapilloCheck®
GP5+/6+
Sensibilidade clínica
para ≥ CIN3
95,8 %
96,4 %
Sensibilidade clínica
para ≥ CIN2
96,7 %
97,7 %
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
39
Para avaliar a prevalência dos tipos de VPH detectados pelo PapilloCheck®, efectuou-se o rastreio
de esfregaços cervicais de 881 mulheres.9 Todas as amostras cervicais foram colhidas em meio de
coleta STM™ (Qiagen, Hilden, Alemanha). O mais comum foi o VPH 16 com uma taxa de detecção
de 19,4 %. Os tipos seguintes mais frequentes foram: VPH 31, VPH 39, VPH 51 e VPH 52. As
prevalências para todos os tipos detectáveis são apresentadas na Tabela 7.
4°
8°
IVD
Tabela 7: Tipo específico de prevalência de tipos HPV detectados pelo PapilloCheck®
Genótipo HPV
Prevalência pelo
PapilloCheck®
HPV 16
19,40 %
HPV 31
14,40 %
HPV 39
9,30 %
HPV 51
9,10 %
HPV 52
7,50 %
HPV 56
7,40 %
HPV 58
6,10 %
HPV 53
6,10 %
HPV 42
5,80 %
HPV 66
5,90 %
HPV 68
5,60 %
HPV 45
4,50 %
HPV 33
4,40 %
HPV 18
4,00 %
HPV 70
4,10 %
HPV 44/55
3,10 %
HPV 59
2,50 %
HPV 82
1,90 %
HPV 35
1,60 %
HPV 73
1,50 %
HPV 43
0,80 %
HPV 6
0,60 %
HPV 40
0,40 %
HPV DNA-Chip
PapilloCheck®
Instruções de Uso
11 42,43, 44/55, 45, 51,
0,60
% 53, 56, 58, 59,66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais.
35, HPV
3, 40,
52,
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
40
12. PAPILLOCHECK® PROTOCOLO CURTO
PCR
Sala 2
12.1 Sala 2: PCR - Setup da reação mix
¯¯ Dilua a Uracil-N-Glicosilase 1:200 em água grau PCR
¯¯ Misture a diluição UNG cuidadosamente
¯¯ Prepare a mix de reação para a quantidade necessária de reações da PCR
¯¯
1
reação
13
reações
(1 „chip“)
26
reações
(2
„chips“)
39
reações
(3
„chips“)
52
reações
(4
„chips“)
PapilloCheck®
PCR MasterMix
19,8 µl
257,4 µl
514,8 µl
772,2 µl
1029,6 µl
HotStarTaq® Polymerase (5U/µl)
0,2 µl
2,6 µl
5,2 µl
7,8 µl
10,4 µl
Uracil-N-Glycosilase (Diluição de
1:200, 0.005 U/μl)
1 µl
13µl
26 µl
39 µl
52 µl
Volume total antes da adição da
amostra DNA
21 µl
273 µl
546 µl
819 µl
1092 µl
P
R
O
T
O
C
O
L
O
¯¯ Misture o Mix de reação cuidadosamente.
¯¯ Divida em alíquotaso mix de reação: adicionar 21μl do mix de reação para cara
reação PCR dentro de um tubo de ensaio PCR 0,2ml de uma tira PCR.
C
U
R
T
O
41
Revisão: BQ-013-07 / Agosto 2011
12.2 Sala 2: PCR-adição template DNA / Reação de PCR
PCR
Sala 2
¯¯ Adicionar 5μl do template DNA para cada reação de PCR.
¯¯ Misture cuidadosamente.
¯¯ Inicie a reação de PCR de acordo com o programa preparado no termociclador.
Tempo
Temperatura °C
Número de ciclos
20 min
37 °C
1
15 min
95 °C
1
30 s
25 s
45 s
95 °C
55 °C
72 °C
40
30 s
45 s
95 °C
72 °C
15
Manter
10 °C
P
R
O
T
O
C
O
L
O
C
U
R
T
O
42
Hibrid. e Lavagem
12.3 Sala 3: Preparação da hibridização/
Reação de hibridização
!
Sala 3
Inicie os preparativos pelo menos 30 minutos antes da hibridização..
¯¯ Dissolva os precipitados em potencial nos tampões de lavagem e hibridização e
misturar bem.
¯¯ Prepare o mix de solução de lavagem para a quantidade de “chips” de
PapilloCheck® a serem analisados.
Número de „chips“ PapilloCheck
Componentes
®
1
2
3
4
Água destilada ou deionizada
140 ml
280 ml
420 ml
560 ml
PapilloCheck® Tampão A
14 ml
28 ml
42 ml
56 ml
PapilloCheck® Tampão B
1,75 ml
3,5 ml
5,25 ml
7 ml
155,75 ml
311,50 ml
467,25 ml
623 ml
Volume total
¯¯ Aliquote o mix de solução de lavagem em três oCheck® WashBoxes.
¯¯ Pré-aqueça a solução de lavagem II em um banho-maria a 50 °C.
¯¯ Incube o total de “chips” de PapilloCheck® a ser analisado na Câmara de
Hibridização preparada à temperatura ambiente.
¯¯ Misture os produtos de PCR e centrifugue brevemente.
¯¯ Misture o Tampão de hibridização e centrifugue brevemente.
¯¯ Misture 30μl do Tampão de Hibridização PapilloCheck® com 5μl do produto
PCR.
P
R
O
T
O
C
O
L
O
¯¯ Misture completamente e centrifugue brevemente.
¯¯ Transfera 25μl do mix de hibridização em cada poço do “chip” PapilloCheck®
usando uma pipeta multicanal.
¯¯ Evite a formação de bolhas de ar.
¯¯ Incube o “chip” PapilloCheck® exatamente 15 minutos a temperatura
ambiente (20-25 °C).
C
U
R
T
O
43
12.4 Sala 3: Lavagem & Secagem /
Scaneamento e Avaliação
Hibrid. e Lavagem
Sala 3
¯¯ Remova o suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridização.
¯¯ Coloque o suporte de laminas dentro da oCheck® WashBox com solução de
lavagem I.
¯¯ Fixe o cabo oCheck®.
¯¯ Lave o(s) “chip(s)” PapilloCheck® na solução de lavagem I a temperatura
ambiente durante 10 segundos.
¯¯ Lave o “chip(s)” PapilloCheck® chip(s) na solução de lavagem II pré-aquecida
em banho-maria a 50°C durante 60 segundos.
¯¯ Lave o(s) “chip(s)” PapilloCheck® na solução de lavagem III a temperatura
ambiente durante 10 segundos.
¯¯ Remova qualquer resíduo de líquido da superfície do “chip” PapilloCheck® por
centrifugação.
1 minuto
3 minutos ou velocidade
500 g
máx.
¯¯ Scaneier o(s) “chip”(s) de PapilloCheck® com o CheckScanner™.
¯¯ Realize o scaneamento e análise como descrito no Manual do Usuário do
CheckReport™ Software.
¯¯ Crie relatórios.
P
R
O
T
O
C
O
L
O
C
U
R
T
O
44
Importador e distribuidor: Greiner Bio-One Brasil Produtos Médicos Hospitalares Ltda.
Av. Affonso Pansan, 1967 - Vila Bertini - CEP.13.473-620 - Americana - SP
FONE - (0xx)(19)-3468-9600 FAX - (0xx)(19)-3468-9601
CNPJ 71.957.310 / 0001-47 – site: www.gbo.com
Registro ANVISA Nº: 10290310039
4°
8°
IVD
HPV DNA-Chip
PapilloCheck®
Instruções de Uso
Xn
REF 465 060
Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
45

PapilloCheck - Greiner Bio-One

Transcrição

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