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UNIVERSIDADE CEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA MARTINA MÁRCIA MELO COQUEIRO Identificação e diferenciação molecular pela Análise de Restrição de DNA Ribosomal Amplificado (ARDRA-PCR) das espécies de Acinetobacter isoladas de pacientes de hospitais de São Luis-MA SÃO LUIS 2014 MARTINA MÁRCIA MELO COQUEIRO Identificação e diferenciação molecular pela Análise de Restrição de DNA Ribosomal Amplificado (ARDRA-PCR) das espécies de Acinetobacter isoladas de pacientes de hospitais de São Luis-MA Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação Universidade em Biologia CEUMA, Parasitária como parte da dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Orientadora: Drª Maria Rosa Quaresma Bomfim Coorientador: Dr. Valério Monteiro-Neto. SÃO LUIS 2014 MARTINA MÁRCIA MELO COQUEIRO Identificação e diferenciação molecular pela Análise de Restrição de DNA Ribosomal Amplificado (ARDRA-PCR) das espécies de Acinetobacter isoladas de pacientes de hospitais de São Luis-MA A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / , considerou o(a) candidato(a) ( ) APROVADA ( ) REPROVADA 1) Examinador __________________________________ 2) Examinador ___________________________________ 3) Examinador ___________________________________ 4) Presidente (Orientador)_____________________________ A DEUS por sempre guiar e iluminar o meu caminho. Aos meus pais, Edvaldo e Socorro, pelo exemplo, dedicação e amor. À minha irmã e sobrinha pelo amor e carinho. Agradecimentos À minha querida orientadora, Prof. Drª. Maria Rosa Quaresma Bomfim, por todo o apoio, incentivo e disposição, serei sempre grata. Ao meu noivo, Fabrício da Ascensão Lima Pinheiro, por todo carinho, dedicação, amor e por sempre estar ao meu lado. À amiga Patrícia Cristina Saldanha Ribeiro pela fundamental ajuda na realização deste trabalho. A Margareth Penha que sempre está disposta a nos ajudar no Laboratório de Pesquisa. Ao Laboratório Cedro por ceder as amostras clínicas utilizadas neste estudo. À Universidade Ceuma por fornecer a infraestrutura necessária para a execução da parte experimental desta pesquisa. RESUMO Acinetobacter é um patógeno oportunista que tem causado sérias infecções em pacientes hospitalizados, principalmente àqueles lotados em Unidades de Terapia Intensiva. A espécie Acinetobacter baumannii se destaca como um dos mais importantes patógenos clínicos no ambiente hospitalar, caracterizado por apresentar resistência à maioria dos antimicrobianos utilizados na prática clínica. Estudos têm demonstrado que Acinetobacter apresenta resistência a diferentes antimicrobianos devido à presença de genes intrínsecos e adquiridos que lhes confere a capacidade de produzir a enzima β-lactamase, o mais prevalente mecanismo de resistência aos fármacos β-lactâmicos. Algumas espécies de Acinetobacter têm emergido como importantes patógenos hospitalares, dentre elas àquelas conhecidas por formarem o complexo A. calcoaceticus-A.baumanii. O grande problema na atualidade com relação à identificação das espécies envolvidas nestes processos infecciosos é que os métodos fenotípicos não diferenciam as espécies infectantes. Neste aspecto, no presente estudo foi avaliada a técnica de ARDRA-PCR (Análise de Restrição de DNA Ribosomal Amplificado) para identificar as espécies de Acinetobacter em 142 isolados oriundos de 119 pacientes internados em 12 hospitais de São Luis-MA. Os resultados obtidos mostraram que o método automatizado Vitek®2 (Biomerieux, França) identificou 138 (97.2%) isolados como sendo A. baumannii, 2 (1.4%) como A. ursingii e 2 (1.4%) como A. lwoffii. A investigação da presença de quatro subgrupos de carbapenemases pela técnica de PCR multiplex mostrou um maior número de isolados apresentando simultaneamente os genes blaOXA-51 e blaOXA-23. O gene blaOXA-51, foi o segundo mais observado. Além disso, os genes blaOXA-24 e blaOXA-58 foram também detectados. A reação de PCR específica detectou o gene blaOXA-51 em 140 (98.6%) isolados. A técnica de ARDRA-PCR detectou diferenças intraespecíficas entre os 142 isolados, demonstrando ser uma ferramenta molecular útil para o estudo da diversidade genética das espécies de Acinetobacter spp. Palavras chave: Identificação/diferenciação; ARDRA-PCR; Acinetobacter spp. ABSTRACT Acinetobacter is an opportunistic pathogen that has caused serious infections in hospitalized patients, especially those admitted to intensive care units. The Acinetobacter baumannii species stands out as one of the most important clinical pathogens in the hospital environment, characterized by presenting resistance to most antimicrobial agents used in clinical practice. Studies have shown that Acinetobacter is resistant to different antimicrobial due to the presence of intrinsic and acquired gene that confers them the ability to produce the enzyme β-lactamase the most common mechanism of resistance to β-lactam drugs. Some Acinetobacter species have emerged as important nosocomial pathogens, among them those known to form A. calcoaceticus-A.baumani complex. The major problem today with identification of the species involved in these infectious processes is that the phenotypic methods do not differentiate the infecting species. In this respect, the present study evaluated the technique ARDRA-PCR (Restriction Analysis of Amplified Ribosomal DNA) to identify 142 species of Acinetobacter isolates from 119 patients admitted to 12 hospitals in São Luis-MA. The results obtained using the automated method Vitek®2 (Biomerieux, France) revealed that 138 (97.2%) isolates were A. baumannii, 2 (1.4%) as A. ursingii and 2 (1.4%) and A. lwoffii. Investigating the presence of four subgroups of carbapenemase by multiplex PCR technique found a higher number of isolates with both the blaOXA-51 and blaOXA-23 genes. The blaOXA-51 gene was the second most prevalent. Furthermore, blaOXA-24 and blaOXA-58 genes were also detected. The specific PCR detected the blaOXA-51 gene in 140 (98.6%) isolates. The technique of PCR-ARDRA intraspecific differences detected between the 142 isolates demonstrated to be a useful tool for studying the molecular genetic diversity of the species Acinetobacter spp. Keywords: Differentiation/identification; ARDRA-PCR; Acinetobacter spp. LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Lista de espécies do gênero Acinetobacter com nomes válidos... 19 Tabela 2 - Perfis ARDRA-PCR das 32 espécies de Acinetobacter constantes do Genbank utilizadas na digestão in silico e construção da matriz fenotípica para a geração do dendrograma................................................................................. 39 Tabela 3 - Sequência de iniciadores usados para detecção por MultiplexPCR dos genes blaOXA nos isolados de Acinetobacter spp................................................................................................. 41 Tabela 4 - Características gerais dos 142 pacientes provenientes de hospitais públicos e privados de São Luís-MA.............................. 44 Tabela 5 - Distribuição por hospital dos espécimes clínicos de onde os isolados foram recuperados.......................................................... 45 Tabela 6 - Distribuição setorial dos 142 isolados recuperados de espécimes clínicos de pacientes atendidos em doze hospitais de São Luis-MA............................................................................. 45 Tabela 7 - Perfil fenotípico de susceptibilidade dos isolados microbianos avaliados pelo Vitek2..................................................................... 46 Tabela 8 - Frequência de detecção dos genes para oxacilinase (OXA) por mPCR nos isolados avaliados...................................................... 48 Tabela 9 - Análise comparativa entre perfil fenotípico de susceptibilidade aos antibióticos e presença de genes para oxacilinases................................................................................... 49 Tabela 10 - Perfis obtidos no ARDRA-PCR para os 142 isolados de Acinetobacter avaliados no presente estudo................................. 53 Tabela 11 - Resultado da análise de similaridade genética entre as sequências obtidas dos isolados quando submetida ao Blastn do Genbank................................................................................... 57 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Perfis representativos dos resultados obtidos pela mPCR para a detecção simultânea dos genes tipo blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-58 em alguns isolados do estudo........................................... 47 Figura 2 - Gel de agarose 2% mostrando o produto de amplificação por PCR específica do gene blaOXA-51 de alguns isolados do estudo.............................................................................................. 51 Figura 3 - Gel de agarose 1% mostrando o produto de amplificação por PCR específica para o gene da região 16S ribossomal de alguns isolados do estudo........................................................................... 52 Figura 4 - Gel de poliacrilamida 6% representando os produtos da digestão enzimática de alguns isolados identificados do estudo................... 53 Figura 5 - Dendrograma de similaridade genética derivado do coeficiente de similaridade DICE implementado pelo programa NTSYS mostrando as relações filogenéticas entre os 142 isolados do estudo e as 32 espécies de referência de Acinetobacter do Genbank.......................................................................................... 55 Figura 6 - Árvore filogenética construída pelo programa Mega versão 5.2 usando o algoritmo de neighbor joining com valor de bootstrap de 1000 replicatas. A árvore foi baseada na sequência nucleotídica do fragmento de 1.432bp de 28 isolados que foram sequenciados e 32 sequências de diferentes espécies de Acinetobacter provenientes do Genbank........................................ 57 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ACB Complexo Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii AFLP Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados (do inglês, Amplified fragment length polymorphism) AMI Amicacina AMP Ampicilina AmpC Enzima cefalosporinase cromossomal β-lactamase de classe C ARDRA Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (do inglês, Amplified ribosomal DNA restriction analysis ARI-1 Acinetobacter resistente ao imipenem (do inglês, Acinetobacter resistant imipenem) ASB Ampicilina/sulbactam Bap Proteína associada ao biofilme (do inglês, biofilm associated protein) BHI Brain Heart Infusion CAZ Ceftazidima CIM Concentração inibotória mínima CIP Ciprofloxacina CHDL β-lactamases da classe D que hidrolisam carbapenêmicos (do inglês, Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase) CLSI Clinical Laboratory Standards Institute CPM Cefepime CT Cefoxitina dATP Desoxiadenosina trifosfatado dCTP Desoxicitidina trifosfatado dGTP Desoxiguanosina trifosfatado DNA Ácido desoxiribonucléico (do inglês, DeoxyriboNucleic Acid) dNTP Desoxiribonuleotídeo trifosfatado dTTP Desoxitimidina trifosfatado EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês, Ethylenediaminetetraacetic acid) ESBL β-lactamase de amplo espectro (do inglês, Expended-Spectrum β- lactamases) FDA Food and Drug Administration GEN Gentamicina IMI Imipenem Kb Kilobase KPC Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase MBLs Metalo-β-lactamases MER Meropenem Mpcr Reação em cadeia pela polimerase multiplex OMP Proteína de membrana externa (do inglês, outer membrane protein) OXA Oxacilinase Pb Pares de base PBP Proteína ligadora de penicilina (do inglês, penicillin binding protein) PBS Solução salina tamponada com fosfato (do inglês, phosphatebuffered saline) PCR Reação em cadeia pela polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction) RFLP Polimorfismo de tamanho do fragmento de restrição PFGE Eletroforese em gel de agarose em campo pulsado (do inglês, Pulsed Field Gel Electrophoresis) POL Polimixina B RAPD Amplificação randômica do DNA polimórfico REP-PCR PCR das sequências palindrômicas extragênicas repetidas (do inglês, Repetitive Extragenic Palindromic elements) Rpm Rotação por minuto TBE Tris-Borato-EDTA TE Tris-EDTA TGC Tigeciclina TSA Ágar de soja tríptica (do inglês,Tryptic Soy Agar) TSB Caldo de soja tríptica (do inglês, Tryptic Soy Broth) TZP Piperacilina/tazobactam UTI Unidade de terapia intensiva LISTA DE SÍMBOLOS ºC Grau Celsius µg Micrograma µL Microlitro µM Micromolar HCl Ácido Clorídrico L Litro MG Miligrama MgCl2 Cloreto de magnésio mL Mililitros mM Milimolar mV Milivolt nº Número Ng Nanograma pH Potencial hidrogeniônico Pmol Picomol V Volts SUMÁRIO 1 2 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.2.1 2.3 14 18 19 22 24 27 27 3 4 4.1 4.2 5 5.1 INTRODUÇÃO.................................................................................. REVISÃO DE LITERATURA............................................................. CARACTERÍSTICAS GERAIS DO GÊNERO Acinetobacter............ PATOGENICIDADE E FATORES DE VIRULÊNCIA......................... Mecanismos de resistência a antimicrobianos............................ Produção de β-Lactamases............................................................ β-Lactamases do tipo OXA............................................................... MÉTODOS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DO GÊNERO Acinetobacter....... JUSTIFICATIVA................................................................................ OBJETIVOS DA PESQUISA............................................................ OBJETIVO GERAL............................................................................ OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................. ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA............................................... 5.2 ISOLADOS BACTERIANOS....................................................................... 35 5.3 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS.................................... ANÁLISE MOLECULAR.................................................................... Extração do DNA Genômico Para Amplificação........................... Ensaios de PCR Para a Detecção do Gene blaOXA-51.................... Desenho dos Iniciadores e Ensaios de PCR................................. Escolha da Enzima de Restrição e Ensaio de ARDRA-PCR........ Aferição do Tamanho Molecular dos Fragmentos Gerados pelo ARDRA-PCR e Confecção do Dendrograma........................ Ensaios de Multiplex-PCR (mPCR) Para a Detecção de Genes blaOXA................................................................................................ PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DOS PRODUTOS DE PCR DE ALGUNS ISOLADOS.......................................................... 35 36 36 37 37 38 5.4.6 5.5 5.6 5.7 6 7 ANÁLISE COMPUTACIONAL DAS SEQUÊNCIAS PARA INFERÊNCIAS FILOGENÉTICAS........................................................................................ ANÁLISES ESTATÍSTICAS............................................................... RESULTADOS.................................................................................. DISCUSSÃO..................................................................................... 8 CONCLUS ÃO..................................................................................... REFERÊNCIAS.................................................................................................... 30 33 34 34 34 35 35 40 41 41 42 43 44 59 68 69 14 1 INTRODUÇÃO Nas últimas décadas tem sido observado um aumento significativo no número de casos de infecções hospitalares causadas por Acinetobacter spp., e vários surtos têm sido registrados em todo o mundo. As espécies envolvidas nessas infecções são difíceis de multirresistência serem à maioria erradicadas dos porque antimicrobianos frequentemente disponíveis apresentam (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). As bactérias pertencentes ao gênero Acinetobacter spp., têm se tornado patógenos predominantes no ambiente hospitalar, sendo isolado principalmente de pacientes imunodeprimidos e lotados em Unidades de Terapia Intensiva (UTI’s), e provavelmente, essas infecções estão relacionadas a procedimentos invasivos utilizados em pacientes nestas unidades (BERGOGNE-BÉRÉZIN; TOWNER, 1996; TOWNER, 1997). Algumas espécies do gênero Acinetobacter têm emergido como importantes patógenos hospitalares, dentre elas aquelas conhecidas por formarem o complexo A. calcoaceticus-A. baumannii constituído pelas espécies A. calcoaceticus, A. baumannii, A. nosocomialis (conhecido como Acinetobacter genoespécie 13TU), e A. pittii (conhecido como Acinetobacter genoespécie 3) (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). Estudos têm apontado as três últimas espécies como as mais comumente associadas com infecções humanas. Destas, A. baumannii tem sido a mais isolada em diferentes tipos de infecções oportunistas, incluindo septicemia, pneumonia, endocardite, meningite, peritonite em pacientes submetidos à diálise peritoneal, infecção de pele e tecidos, e infecção do trato urinário (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). Assim, o controle das infecções causadas por A. baumannii se tornou um problema de saúde pública em muitos países devido à capacidade que esse microorganismo apresenta de adquirir genes de resistência de forma muito rápida levando à multirresistência (BERGOGNE-BÉRÉZIN; TOWNER, 1996; LANDMAN et al., 2002). Além das espécies que formam o complexo A. calcoaceticus-A. baumannii, outras espécies como A. junii, A. johnsonii, A. ursingii e A. schindleri podem estar, acidentalmente, associadas a infecções (DIJKSHOORN et al., 2007; Di NOCERA et al., 2011). 15 Por outro lado, ressalta-se a importância do conhecimento das espécies que estão emergindo e acometendo os pacientes, principalmente aqueles em estado crítico com alto risco de vida (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). Atualmente, a identificação em laboratório de microbiologia clínica das espécies de Acinetobacter é difícil de ser realizada porque estas bactérias apresentam características fenotípicas semelhantes e também devido ao seu metabolismo pouco ativo (LA ESCOLA et al., 2006). Além disso, um clone da mesma linhagem pode expressar características diferentes (LUPSKI, 1987). Neste aspecto, a diferenciação entre as espécies deste complexo é feita apenas por métodos genotípicos, metodologia esta ainda restrita aos laboratórios de referência. Diferentes técnicas de tipagem molecular têm sido utilizadas para o estudo da epidemiologia dos surtos das infecções causadas por Acinetobacter, tais como: fagotipagem, eletroforese de proteínas, análise do conteúdo total plasmidial, Polimorfismo de tamanho do fragmento de restrição (PCR-RFLP), Ribotipagem, Eletroforese em gel de agarose em campo pulsátil (PFGE), amplificação randômica do DNA polimórfico (RAPD), PCR das sequências palindrômicas extragênicas repetidas (REP-PCR), entre outras. Por outro lado, algumas destas técnicas têm baixo poder discriminatório, enquanto outras são demoradas e complexas necessitando de equipamentos sofisticados e profissionais qualificados para executar (VILA et al., 1996; WOODFORD; FAGAN; ELLINGTON, 2006; PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). A diferenciação entre os isolados do complexo A. calcoaceticus-A. baumannii é clinicamente importante uma vez que as espécies pertencentes a este complexo apresentam características biológicas e patogênicas distintas, o que pode ser relevante na eficácia do tratamento. Há uma necessidade de realização de estudos moleculares epidemiológicos para que se possa entender melhor a relação filogenética entre as genoespécies. Os resultados serão úteis para um melhor tratamento clínico e controle da infecção (SEIFERT et al., 1993; DIEZ et al., 2004; IDZENGA et al., 2006). A compreensão dos mecanismos fundamentais das infecções causadas por Acinetobacter, incluindo as fontes originais dos organismos infecciosos, sua clonalidade e distribuição geográfica, é importante para o desenvolvimento de medidas apropriadas de controle da infecção. A identificação genotípica permite a 16 investigação da expansão clonal podendo ser utilizada também para identificar a fonte da infecção (ECKER et al., 2006). Nos últimos anos inúmeras técnicas moleculares têm sido utilizadas para detectar genes específicos em algumas espécies de Acinetobacter, como por exemplo, a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), que geralmente é aplicada para a detecção de genes de resistência à antimicrobianos que expressam βlactamases de amplo espectro (ESBL-Extended-spectrum β-lactamase), as metaloβ-lactamases (MBLs) e também as carbapenemases (KPCs) (TENOVER et al., 1995; NEELEMAN et al., 2004; WALSH et al., 2010). Variações na técnica tradicional de PCR têm sido implementadas por pesquisadores em todo o mundo para o diagnóstico de doenças infecciosas causadas por diferentes patógenos. Entre essas variações destaca-se a MultiplexPCR (mPCR). Esta permite a amplificação de vários alvos em um único ensaio de PCR. Neste caso, mais de uma sequência alvo é amplificada pela utilização de múltiplos pares de iniciadores em um único tubo de reação. Esta metodologia tem o potencial de promover economia de tempo e de trabalho laboratorial sem comprometer o desempenho do experimento (ELNIFRO et al., 2000). A mPCR tem sido utilizada com sucesso para a detecção e diferenciação de clones de diferentes espécies bacterianas, inclusive para Acinetobacter, com perfil de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos (WOODFORD; FAGAN; ELLINGTON, 2006; WOODFORD et al., 2006). Além das aplicações na área de diagnóstico, técnicas moleculares baseadas na PCR têm sido aplicadas também para fins taxonômicos, tais como o ARDRAPCR (Polymerase chain reaction - Amplified ribosomal DNA restriction analysis). Este método consiste da amplificação por PCR do DNA ribossomal, em seguida o produto amplificado é digerido com uma enzima de restrição e o resultado é observado em gel. Até o momento, cinco enzimas (CFOI, AluI, Mbol, RsaI e MspI) têm sido as mais utilizadas em análises por ARDRA-PCR para a diferenciação das linhagens de Acinetobacter spp. Padrões de restrição são examinados visualmente e comparados com uma biblioteca de perfis de estirpes de referência das espécies descritas (NEMEC et al., 2009). Ressalta-se que, a análise de restrição da região do DNA ribossomal amplificado tem sido muito utilizada para estudos da diversidade genética intraespécie para diferentes micro-organismos. 17 O valor do método ARDRA-PCR está na sua rapidez e capacidade para avaliar diferenças entre grupos filogenéticos, efetuando análises em vários níveis de classificação, inclusive em estudos de evolução, gerando novos marcadores para estudos de genética de populações (JORGENSEN; CLUSTER, 1989). Além disso, os resultados obtidos por ARDRA-PCR com um grande número de linhagens bacterianas de diferentes espécies têm demonstrado uma boa correlação com aqueles obtidos pela técnica de hibridização, considerada padrão ouro para a classificação taxonômica de vários micro-organismos, incluindo os pertencentes ao gênero Acinetobacter (DIJKSHOORN et al., 1998; JAWAD et al., 1998a). Neste cenário, e devido ao aumento no número de infecções hospitalares causadas por diferentes espécies de Acinetobacter, é de suma importância a identificação rápida e correta da espécie infectante, bem como o conhecimento do perfil de resistência dos isolados frente aos antimicrobianos β-lactâmicos, especialmente os carbapenêmicos, considerados as drogas de escolha para o tratamento de infecções causadas por bactérias que expressam β-lactamases de amplo espectro. A identificação das espécies de Acinetobacter é fundamental a fim de se averiguar se as linhagens epidemiologicamente relacionadas são também geneticamente relacionadas. Além disso, o conhecimento do perfil de resistência das linhagens deste micro-organismo que estão circulando no ambiente hospitalar poderá ajudar os profissionais de saúde na escolha de antimicrobianos mais efetivos na prática clínica. 18 2 REVISÃO DE LITERATURA A história do gênero Acinetobacter teve início em 1911 quando Beijerinck, um microbiologista holandês, utilizando meio mínimo enriquecido com acetato de cálcio, isolou este micro-organismo a partir do solo, denominando-o de Micrococcus calcoaceticus. Nas décadas seguintes vários micro-organismos similares foram descritos. Em 1954, Brisou e Prevot, propuseram a formação do gênero Acinetobacter (oriundo do grego akinetos, não móveis) para separar as bactérias imóveis daquelas que apresentam motilidade e pertencentes ao gênero “Achromobacter”. Baumann et al. (1968), propôs que diversas bactérias oxidasenegativas classificadas no grupo Moraxella na verdade pertenciam ao gênero Acinetobacter e que a subclassificação em espécies baseada em características fenotípicas era impossível. No ano de 1971, o gênero Acinetobacter foi oficialmente reconhecido pelo Subcomitê em Taxonomia de Moraxella e outras bactérias afins (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Em 1974, este gênero foi listado pela primeira vez no Manual Bergey de Bacteriologia Sistemática e a linhagem A. calcoaceticus foi considerada a cepa padrão para o gênero e espécie. Posteriormente, Bouvet e Grimont (1986), baseados em estudos de hibridização DNA-DNA, descreveram 12 genoespécies de Acinetobacter, que podiam ser diferenciadas por vinte e oito testes fenotípicos, algumas destas receberam denominação: Acinetobacter calcoaceticus, A. lwofii, A. haemolyticus, A. baumannii, A. johnsonii e A. junii. Posteriormente foram incluídas mais espécies genômicas a este esquema, pois apesar dos diversos estudos de hibridização já realizados, sempre surgem novas variedades não classificadas sugerindo que a variedade deste gênero vai além dos grupos já descritos (NEMEC et al., 2001). Atualmente, o gênero Acinetobacter compreende 34 espécies com denominações formalmente definidas (Tabela 1) (KIM et al., 2014). O gênero Acinetobacter apresenta uma grande diversidade que pode ser observada pela variedade de grupos fenotípicos e de grupos de DNA homólogos que têm sido definidos (LUIZ, 2006; POIREL et al., 2010). 19 Tabela 1 – Lista de espécies do gênero Acinetobacter com nomes válidos A. baumannii A. brisouii A. junii A. schindleri A. nosocomialis A. gerneri A. kookii A. soli A. pittii A. grimontii A. lwoffii A. tandoii A. calcoaceticus A. guillouiae A. nectaris A. tjernbergiae A. baylyi A. gyllenbergii A. parvus A. towneri A. beijerinckii A. haemolyticus A. puyangensis A. ursingii A. bereziniae A. harbinensis A. qingfengensis A. venetianus A. boissieri A. indicus A. radioresistens A. bouvetii A. johnsonii A. rudis Fonte: Adaptada de Kim et al. (2014) As espécies A. calcoaceticus, A. baumannii, A. genoespécie 3 e A. genoespécie 13TU são intimamente relacionadas sendo difícil diferenciá-las através das suas características fenotípicas. Assim, em 1992, foi proposto o agrupamento dessas espécies no complexo Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ACB) (GERNER-SMIDT; TJERNBERG; URSING, 1991; GERNER-SMIDT, 1992). Ou seja, o conhecimento da biologia e ecologia das espécies deste gênero bacteriano ainda é limitado, isso porque a identificação em nível de espécie também é limitada (VANEECHOUTTE; DE BAERE, 2007). Por outro lado, o sistema de identificação fenotípica, composto por diferentes testes bioquímicos (biotipagem), padrões de susceptibilidade a antimicrobianos, reações sorologias, tipagem de fagos e de perfis de proteínas tem sido amplamente utilizados, mas alguns estudos têm mostrado que este esquema não cobre a variabilidade genômica de todas as espécies do gênero Acinetobacter (GERNER-SMIDT; TJERNBERG; URSING, 1991; VANEECHOUTTE; DE BAERE, 2007). Estes métodos têm sido gradativamente substituídos por métodos moleculares (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). 2.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO GÊNERO Acinetobacter As espécies do gênero Acinetobacter são morfologicamente do tipo coco bacilos, gram-negativos, pleomórficos, aeróbios estritos, não fermentadores de açúcares, imóveis, oxidase-negativos e catalase positivos que pertencem à família Moraxellaceae. Podem ser cultivadas in vitro em meios comumente utilizados na 20 rotina dos laboratórios onde formam colônias planas, por vezes mucóides de coloração branco-acinzentada com diâmetro de 1,5 a 3mm em temperatura de 37ºC e que apresentam um conteúdo de G + C em seu DNA de 39% a 47% (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). O número de genes, nas espécies já sequenciadas de Acinetobacter, varia de 3690 em A. baumannii a 2874 em A. radioresistens. As espécies que formam o complexo A. calcoaceticus-A.baumannii possuem os maiores genomas (3.94Mb) e estão mais intimamente relacionadas, já A. radioresistens possui o menor genoma (3.16Mb) (PELEG et al., 2012; SAHL et al., 2013). A filogenia do sequenciamento do gene 16S rRNA demonstrou que A. radioresistens é o clado mais basal entre Acinetobacter spp., previamente sequenciadas (SAHL et al., 2013). As espécies pertencentes a este gênero apresentam uma elevada versatilidade nutricional e metabólica adaptando-se facilmente a diferentes ambientes, assim, são amplamente distribuídas na natureza e encontradas em água, solo, lama, vegetais, fezes animais e colonizando a pele humana sendo geralmente consideradas não patogênicas em indivíduos saudáveis (BERLAU et al., 1999; DIJKSHOORN et al., 2005). Algumas linhagens são isoladas de alimentos e outras são capazes de sobreviver em diversos equipamentos médicos e até mesmo na pele humana saudável (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). Além disso, este agente pode sobreviver em condições ambientais adversas tais como a dessecação, soluções desinfetantes e variações de temperatura, podendo ser encontrado no ambiente hospitalar em equipamentos de diálise, ventiladores mecânicos, no sistema de ventilação, nas fontes de água, nas preparações medicamentosas e em desinfetantes (McDONALD et al., 1998; GUSTEN et al., 2002; LANDMAN et al., 2002; BERNARDS et al., 2004). Devido a sua capacidade de sobreviver em diversas superfícies (úmidas e secas) tornaram-se importantes fontes de infecção no ambiente hospitalar para pacientes debilitados (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). Algumas espécies do gênero Acinetobacter são clinicamente mais importantes do que outras, talvez isso seja explicado pela presença de determinados genes apenas em espécies patogênicas e ausentes nas demais. Peleg et al. (2012) identificaram 51 genes, incluindo 12 supostos operons, presentes apenas em linhagens patogênicas de A. baumannii, A. pittii e A. nosocomiallis. Um desses operons é o csu que inclui os genes CsuA/BABCDE e codifica proteínas envolvidas 21 em uma chaperona que parece ser importante na montagem do pilli, aderência a superfícies abióticas e formação de biofilme (PELEG et al., 2012). A espécie A. baumannii é considerada clinicamente a mais importante e com o maior número de surtos e relatos de multirresistência aos antimicrobianos. Esta espécie é o segundo bacilo Gram-negativo não fermentador mais prevalente em infecções hospitalares, sendo superado apenas pelo gênero Pseudomonas (DIJKSHOORN et al., 2007; PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Na grande maioria das infecções causadas por este patógeno, o tratamento é difícil de ser realizado devido à expressão do fenótipo de resistência às várias classes de antimicrobianos, incluindo os carbapenêmicos, o que se torna uma grande preocupação pela falta de terapias eficazes e assim uma urgência clínica e epidemiológica global (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Recentemente, como consequência do desenvolvimento das técnicas de identificação laboratoriais, A. pittii e A. nosocomialis também emergiram como espécies clinicamente importantes, com cada vez mais relatos de surtos e resistência aos antibióticos (PELEG et al., 2012). As genoespécies do complexo ACB diferem nas suas características biológicas e patogênicas, por exemplo, A. calcoaceticus é considerado um patógeno ambiental sendo raramente apontado como causa de doenças graves, foi observada também diferenças entre as genoespécies na sua capacidade de colonizar a pele humana, susceptibilidade a antimicrobianos e mecanismos de resistência (TJERNBERG, 1990; GERNER-SMIDT, 1992; SEIFERT et al., 1997; BERLAU et al., 1999; RIBERA et al., 2004; LIM; SHIN; KIM, 2007; KO et al., 2008; PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008; SHENG et al., 2009). As espécies A. lwoffii, A. ursingii e A. parvus são regularmente encontradas em isolados clínicos e estão associadas a infecções mais graves, sendo considerados patógenos emergentes. Outras espécies como A. johnsonii e A. radioresistens foram identificadas apenas como colonizadoras da pele humana ou raramente causando doenças em humanos. Até o momento, segundo a literatura, a espécie A. calcoaceticus ainda não foi identificada como causador de doenças humanas graves (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008; TURTON et al., 2010). Alguns fatores de virulência que permitem a sobrevivência e adaptação de Acinetobacter spp., no ambiente hospitalar são a sua habilidade em captar o ferro do meio ambiente, resistência à dessecação, produção de uma cápsula polissacarídica em algumas linhagens e a capacidade de aderir a diferentes superfícies pela 22 formação de biofilmes e aderência às células do epitélio respiratório através de pili (FOURNIER; RICHET, 2006; LEE et al., 2006). 2.2 PATOGENICIDADE E FATORES DE VIRULÊNCIA As bactérias pertencentes ao gênero Acinetobacter causam, principalmente, infecções oportunistas em pacientes críticos internados em UTI (DIJKSHOORN; NEMEC; SEIFERT, 2007). No passado estas espécies eram consideradas organismos de baixa virulência (JOLY-GUILLOU, 2005). Apesar da grande quantidade de estudos envolvendo as espécies do gênero Acinetobacter, pouco se sabe sobre o seu verdadeiro potencial patogênico e fatores de virulência (HOWARD et al., 2012). O maior número de isolados obtidos de secreção respiratória e urina demonstra que a colonização é mais comum do que a infecção, isto enfatiza também que a patogenicidade dessas espécies é baixa, no entanto, uma vez desenvolvida a infecção esta pode ser grave. Tem sido observado que a maioria das infecções envolve órgãos com elevada quantidade de fluido, como o trato respiratório e urinário, mas também no peritônio. O acúmulo de fluido peritoneal pode estar associado aos dispositivos de longa permanência (FOURNIER; RICHET, 2006; DIJKSHOORN; NEMEC; SEIFERT, 2007). Ao contrário de muitas bactérias Gram-negativas que não resistem à dessecação e não sobrevivem em ambiente seco, os membros do gênero Acinetobacter, principalmente A. baumannii, podem sobreviver em ambiente inanimado por longos períodos de tempo, o que contribui para a sua permanência e transmissibilidade em ambiente hospitalar (BEGGS et al., 2006). A capacidade que as espécies de Acinetobacter apresentam de sobreviver em superfícies secas e na pele é uma característica importante na sua epidemiologia. Essa resistência à dessecação pode explicar também o motivo de espécies que apresentam uma baixa resistência como A. johnsonii, A. junii e A. lwoffii não serem comumente relacionadas a surtos hospitalares, ao contrário do que acontece com A. baumannii que, devido a sua patogenicidade e capacidade de sobreviver em superfícies secas, é a espécie mais importante do gênero sendo responsável por cerca de 80% dos surtos hospitalares (FORSTER et al., 1998; AYGUN et al., 2002; BEGGS et al., 2006). Foi demonstrado por Jawad et al. (1998b) 23 que A. baumanni é capaz de sobreviver por uma média de 27 dias em ambiente com umidade relativa de 31%. Um estudo realizado por Wendt et al. (1997) mostrou que linhagens de A. baumannii isoladas de fontes secas (fronhas e bancada de trabalho) apresentaram maiores taxas de sobrevivência do que as linhagens isoladas de fontes molhadas (urina e esgoto). Alguns isolados de Acinetobacter podem sobreviver por mais de quatro meses sob condições secas. Essa característica parece estar mais relacionada com a linhagem do que com a espécie (WENDT et al., 1997). Outros fatores de virulência implicados no sucesso do estabelecimento de infecções em algumas espécies de Acinetobacter, principalmente A. baumannii, são a formação de biofilme e a capacidade de aderência às células epiteliais, consideradas uma etapa essencial e o primeiro passo na colonização do hospedeiro (BEACHEY, 1981). O biofilme é constituído de comunidades microbianas caracterizadas por células ligadas, irreversivelmente, a um substrato e incorporadas em uma matriz polimérica extracelular produzida por elas próprias. A formação de biofilme parece ser uma característica patogênica importante principalmente na pneumonia associada à ventilação mecânica e infecções intravasculares (COSTERTON; STEWART; GREENBERG, 1999). Um estudo realizado por Lee et al. (2008) demonstrou uma alta capacidade de linhagens de A. baumannii em formar biofilme e aderir a células epiteliais do trato respiratório. Essa característica juntamente com a resistência a vários antimicrobianos podem contribuir para a sobrevivência e disseminação desse micro-organismo no ambiente hospitalar. Gurung et al. (2013), utilizando o método do teste em tubo, demonstraram que 50% dos isolados de A. baumannii foram produtores de biofilme, além disso, a resistência a amicacina, ceftazidima, ciprofloxacino, ceftriaxona e ofloxacino foi maior nos isolados produtores do que nos isolados não produtores de biofilme. Assim, a formação de biofilme é importante na patogênese de algumas infecções causadas por A. baumannii (RODRÍGUEZ-BAÑO et al., 2008). A proteína associada ao biofilme (Bap) é um componente essencial na formação e maturação do biofilme em diversas superfícies, incluindo as encontradas em ambiente hospitalar. Esta proteína, encontrada em A. baumannii, parece contribuir para a aderência às células eucarióticas devido a sua propensão em aumentar a hidrofobicidade da superfície da bactéria (BROSSARD; CAMPAGNARI, 24 2012). A formação de biofilme por A. baumannii permite o seu crescimento em condições e ambientes desfavoráveis (HOWARD, 2012). Outro importante fator de virulência de A. baumannii é a proteína de membrana externa (OMP). Um estudo realizado por Choi et al. (2005) demonstrou que a Omp38 é uma potente citotoxina que induz a apoptose em células epiteliais nas infecções causadas por este micro-organismo. Esta apoptose pode romper a mucosa e permitir o acesso das bactérias ou dos produtos bacterianos para os tecidos profundos (CHOI et al., 2005). Nos últimos anos, as fosfolipases C e D têm sido consideradas importantes fatores de virulência em A. baumannii. A fosfolipase D permite que essa bactéria sobreviva no soro humano e invada células epiteliais pulmonares, já a fosfolipase C aumenta a toxicidade para células epiteliais (CARMARENA et al., 2010; JACOBS et al., 2010). 2.2.1 Mecanismos de resistência a antimicrobianos A resistência antimicrobiana é um problema crescente percebido desde o início do uso dos primeiros antimicrobianos e reflete a seleção Darwiniana, uma vez que essas drogas matam ou impedem o crescimento das bactérias suscetíveis, mas permitem a sobrevivência e multiplicação das linhagens bacterianas resistentes (LIVERMORE; DUDLEY, 2000; TENOVER, 2006). Apesar da resistência a antimicrobianos não ser um fato novo, o número e a amplitude de micro-organismos resistentes, juntamente com a grande quantidade de localizações geográficas atingidas, é algo alarmante e sem precedentes (LEVY; MARSHALL, 2004). Nas últimas décadas, o uso indiscriminado de antimicrobianos e de quimioterápicos tem exercido uma pressão seletiva sobre vários gêneros de microorganismos levando ao surgimento de espécies resistentes ou até mesmo multirresistentes. Atualmente, observa-se que um grande número de espécies tem desenvolvido resistência à maioria dos antimicrobianos convencionais (PERESBOTA et al., 2003; PITTET, 2005; DEPARDIEU et al., 2007). Alguns micro-organismos podem utilizar várias formas para escapar da ação letal de um determinado antimicrobiano, tais como: (i) diminuição do acúmulo intracelular da droga, alteração da permeabilidade da membrana externa e ativação 25 da bomba de efluxo; (ii) alteração do sítio de ação da droga e (iii) degradação enzimática da droga, este é o principal e mais frequente mecanismo de resistência. A existência de vários destes mecanismos no mesmo micro-organismo pode explicar a multirresistência (DEPARDIEU et al., 2007). As bactérias podem apresentar mecanismos de resistência intrínsecos ou extrínsecos (adquiridos). Os intrínsecos são naturais da espécie, como por exemplo, sistemas de efluxo e β-lactamases do tipo AmpC. Os adquiridos estão relacionados a mutações cromossomais ou aquisição de genes de resistência de outros microorganismos através da transferência horizontal. Essa transferência é o principal mecanismo de disseminação de resistência bacteriana e pode ocorrer por transformação, transdução ou conjugação. Os genes de resistência podem ainda, ser incorporados ao cromossomo por recombinação (DZIDIC; SUSKOVIC; KOS, 2008). A seleção e vantagens adquiridas pelas linhagens resistentes; a transferência e disseminação de genes de resistência entre as bactérias através de plasmídeos, transposons e integrons; e a propagação epidêmica dos isolados resistentes entre pacientes, hospitais e países são fatores que contribuem para o aumento da resistência. A relativa importância desses processos varia de acordo o patógeno e o antimicrobiano (LIVERMORE; DUDLEY, 2000). Nos últimos anos têm aumentado os relatos de casos de infecções hospitalares causadas por linhagens multirresistentes de Acinetobacter. O termo multirresistente não apresenta uma definição padrão, geralmente é utilizado na caracterização de isolados resistentes a três ou mais classes de antimicrobianos usados em tratamentos (PEREZ et al., 2007). Até o início da década de 70 as infecções causadas por A. baumannii eram tratadas com sucesso com ampicilina, gentamicina, ácido nalidíxico ou minociclina. A partir de 1975 vários surtos demonstraram o aumento da resistência em isolados clínicos das espécies de Acinetobacter (BERGOGNE-BÉRÉZIN; TOWNER, 1996). Atualmente uma elevada proporção de linhagens pertencentes a este gênero tornouse clinicamente resistente à maioria dos antibióticos utilizados na clínica. Uma das características mais alarmantes desse patógeno é a sua capacidade de desenvolver resistência a todos os antimicrobianos disponíveis, incluindo os carbapenêmicos que são considerados agentes antimicrobianos de escolha no tratamento de infecções graves causadas por este micro-organismo (POIREL; NORDMANN, 2006; 26 GARNACHO-MONTERO; AMAYA-VILLAR, 2010). O rápido surgimento de linhagens de A. baumannii com esta característica demonstra a capacidade que esse microorganismo possui em responder rapidamente às pressões seletivas do ambiente (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Os carbapenêmicos pertencem à classe dos antimicrobianos β-lactâmicos de amplo espectro derivados da tienamicina, possuem estabilidade frente à maioria das beta-lactamases de amplo espectro (ESBL), por isso são utilizados no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes (RODLOFF; GOLDSTEINM; TORRES, 2006). No entanto, a elevação dos índices de resistência a estes antimicrobianos tem sido observada em todo o mundo, inclusive no Brasil, isto representa um sério problema, uma vez que, os carbapenêmicos são considerados um dos últimos recursos para o tratamento de infecções causadas por isolados multirresistentes (WALSH et al., 2002). Assim, para o tratamento das infecções causadas por Acinetobacter spp., resistentes aos carbapenêmicos restam apenas antibióticos potencialmente mais tóxicos, como a polimixina ou ampicilinasulbactam para o qual muitos isolados já são resistentes (GALES et al., 2003). A resistência aos β-lactâmicos está associada a uma variedade de mecanismos que incluem β-lactamases, diminuição da permeabilidade de membrana devido à perda ou redução na expressão de porinas, alteração nas proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) e superexpressão de bombas de efluxo. A combinação de vários destes mecanismos pode estar presente no mesmo microorganimo (CLARK, 1996; FERNÁNDEZ-CUENCA et al., 2003). No entanto, o mecanismo mais comum de resistência aos antibióticos β-lactâmicos, em A. baumannii, é a presença de β-lactamases que são enzimas capazes de hidrolisar o anel β-lactâmico, transformando os antibióticos correspondentes em produtos inativos (ZARRILLI et al., 2009). Em especial, as β-lactamases da classe B de Ambler (também denominadas de metalo-β-lactamases, MBLs) e da classe D de Ambler (OXA-carbapenemases), têm sido identificadas mundialmente em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos. (AFZAL-SHAH; WOODFORD; LIVERMORE, 2001; NAAS et al., 2005). 27 2.2.2 Produção de β-Lactamases As β-Lactamases são enzimas que protegem as bactérias da ação letal dos antibióticos β-lactâmicos (MEDEIROS, 1997). A sua produção é o principal e mais comum mecanismo de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos. Uma vez que, as penicilinas, cefalosporinas e carbapenêmicos são os antimicrobianos mais utilizados no tratamento de várias infecções, a presença de tais enzimas desempenha um papel fundamental na escolha do melhor tratamento (BUSH; JACOBY, 2010). As β-lactamases são consideradas também o mais diverso grupo de enzimas relacionadas à resistência em bactérias Gram-negativas. Mais de cinquenta diferentes tipos já foram identificados em A. baumannii (DIJKSHOORN; NEMEC; SEIFERT, 2007). A classificação das β-lactamases pode ser feita de acordo com suas propriedades funcionais (classificação de Bush) ou características moleculares (classificação de Ambler). A classificação de Ambler foi feita de acordo com a homologia de aminoácidos e resultou em quatro classes (A, B, C, D), as enzimas pertencentes às classes moleculares A, C e D possuem serina no seu sítio ativo, já as pertencentes à classe B são metalo-β-lactamases e possuem zinco no seu sítio ativo. A classificação de Bush foi feita baseada no grupo específico de substrato e perfil de inibição em uma tentativa de agrupar essas enzimas de acordo com o seu fenótipo em isolados clínicos (AMBLER, 1980; BUSH; JACOBY; MEDEIROS, 1995; BUSH; JACOBY, 2010). As carbapenemases são β-lactamases que possuem a peculiar capacidade de hidrolisar os mais potentes β-lactâmicos, os carbapenêmicos, sendo responsáveis pelo aumento da concentração inibitória mínima (CIM) detectada em ensaios de susceptibilidade (QUEENAN; BUSH, 2007; POIREL; PITOUT; NORDMANN, 2007). 2.2.2.1 β-Lactamases do tipo OXA As OXA-carbapenemases são enzimas pertencentes à classe D de Ambler (CHDLs) e têm sido consideradas mundialmente como as mais comuns, sendo o principal mecanismo de resistência aos carbapenêmicos em espécies de Acinetobacter (BROWN; AMYES, 2006; POIREL; NAAS; NORDMANN, 2010). Essas 28 enzimas são codificadas pelos genes blaOXA e podem ser classificadas em oito subgrupos dos quais OXA-23, OXA-24/40, OXA-51, OXA-58 e OXA-143 já foram identificados em A. baumannii (HIGGINS et al., 2009; HIGGINS et al., 2010a). As enzimas do tipo OXA que apresentam um elevado grau de similaridade genética são agrupadas no mesmo subgrupo. Essa classificação foi feita de acordo com a identidade entre as sequências de aminoácidos das variantes dessas enzimas (BROWN; AMYES, 2006; FEIZABADI et al., 2008). A denominação dessas enzimas se deve ao fato de hidrolisarem a oxacilina mais eficientemente do que as benzilpenicilinas. As oxacilinases hidrolisam também a meticilina, amoxicilina, cefaloridina e, até certo ponto, cefalotina. Apenas algumas destas enzimas hidrolisam as cefalosporinas de amplo espectro, já a propriedade de hidrolisar os carbapenêmicos parece ser intrínseca a elas (POIREL; NORDMANN, 2006). A eficiência hidrolítica das oxacilinases contra os carbapenêmicos é menor do que a capacidade das MBLs, porém foi demonstrado que as enzimas do tipo OXA podem ser superexpressadas quando associadas com elementos móveis como o ISAba1 resultando na diminuição da suscetibilidade a estes antimicrobianos (POIREL; NORDMANN, 2006; TURTON et al., 2006a). Essas enzimas são resistentes a inibição por clavulanato e tazobactam (POIREL; NORDMANN, 2006). É elevada a incidência das linhagens bacterianas resistentes aos carbapenêmicos associadas às oxacilinases, essas linhagens estão relacionadas a surtos infecciosos e contribuem para o óbito dos pacientes (BROWN; AMYES, 2006). A grande maioria das oxacilinases tem sido descobertas em A. baumannii (QUEENAN; BUSH, 2007). O mecanismo de ação das oxacilinases se inicia pela ligação não covalente da enzima ao antibiótico formando um complexo intermediário. Em seguida o anel βlactâmico é atacado pelo grupo hidroxila ligado ao resíduo de serina do sítio ativo da enzima formando um grupo acil-éster. A hidrólise desse éster resulta na liberação da droga inativa (LIVERMORE, 1995). A primeira oxacilinase foi identificada em um isolado clínico de A. baumannii em 1985 na Escócia. Esta enzima, que é codificada por plasmídeo, foi inicialmente denominada ARI-1. Posteriormente, com o sequenciamento do seu gene, a enzima recebeu o nome de OXA-23 (PATON et al., 1993; SCAIFE et al., 1995; DONALD et al., 2000). 29 Outras enzimas fazem parte do sub-grupo da OXA-23, tais como: OXA-27 e OXA-49, ambas identificadas em isolados de A. baumannii, a primeira em Singapura e a segunda na China (AFZAL-SHAH; WOODFORD; LIVERMORE, 2001; POIREL; NORDMANN, 2006). Entre as oxacilinases, as variantes que fazem parte do subgrupo da OXA-23 têm sido detectadas em todo o mundo e são apontadas como as carbapenemases predominantes em espécies de Acinetobacter de muitas regiões geográficas (CORRÊA et al., 2012). No Brasil, o primeiro relato de linhagens de A. baumannii produtoras dessa enzima foi em um trabalho realizado por Dalla-Costa et al. (2003) na cidade de Curitiba-PR. Depois, outros relatos de isolados clínicos de espécies de Acinetobacter produtores de OXA-23 foram feitos em Porto Alegre-RS, Rio de Janeiro-RJ, Niterói-RJ, São Paulo-SP, Belo Horizonte-MG, Blumenau-SC e São Luís-MA (CARVALHO et al., 2009; FURTADO et al., 2011). Poirel et al. (2008) identificaram o gene blaOXA-23 em cinco isolados de A. radioresistens sensíveis aos carbapenêmicos, esta espécie apresenta uma baixa virulência e é considerada comensal da pele de indivíduos saudáveis. Os autores sugerem que esta espécie é a progenitora dos genes blaOXA-23 que estão surgindo como fontes de resistência a estes antimicrobianos em A. baumannii de todo o mundo. A disseminação deste gene pode estar associado com elementos de inserção, como ISAba1 (POIREL et al., 2008). O segundo grupo de oxacilinase é representado pelo sub-grupo OXA-24 que apresenta cerca de 60% de similaridade com o sub-grupo OXA-23. Esta enzima foi identificada em isolados multirresistentes de A. baumannii e tem sido descrita como endêmica na Espanha onde é responsável por vários surtos (BOU et al., 2000; ACOSTA et al., 2011; TENA et al., 2013). Dados da literatura têm mostrado que a enzima OXA-51 é encontrada em todos os isolados de A. baumannii e parece ser um componente intrínseco desta espécie, sugerem também que a detecção do gene blaOXA-51 pode ser usado como um método simples e confiável para a identificação dessa espécie (TURTON, 2006b; MOROVAT et al., 2009; NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012). O sub-grupo da enzima OXA-58 apresenta 59% de similaridade com o subgrupo de OXA-51 e menos de 50% de identidade com as outras oxacilinases (POIREL; NORDMANN, 2006). Esta enzima foi primeiramente identificada em um isolado de A. baumannii resistente aos carbapenêmicos em Tolouse, França (POIREL et al., 2005). Atualmente já foi demonstrado a sua ocorrência em vários 30 países como Argentina, Kuwait, Reino Unido e Grécia demonstrando a ampla distribuição desse gene (COELHO et al., 2006; POURNARAS et al., 2006). No Brasil o gene blaOXA-58 foi identificado no Rio de Janeiro, Niterói e São Paulo (ANTONIO et al, 2011; FIGUEIREDO et al, 2011; GUSATTI et al., 2012). A disseminação dos genes blaOXA em espécies de Acinetobacter é uma preocupação crescente uma vez que, as linhagens que possuem estes genes, apresentam resistência a quase todos os antibióticos com exceção das polimixinas e tigeciclina (COELHO et al., 2006). 2.3 MÉTODOS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DO GÊNERO Acinetobacter Devido às limitações apresentadas pelos métodos fenotípicos utizados na rotina de identificação e diferenciação das espécies do gênero Acinetobacter, uma variedade de métodos genotípicos têm sido explorados e aplicados para investigar a diversidade ou filogenia deste micro-organismo (VANEECHOUTTE; DE BAERE, 2007). Entre estes métodos pode-se citar: (1) DNA “fingerprinting” como AFLP (polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados) que se baseia na amplificação seletiva por PCR de um subconjunto de fragmentos derivados da digestão total do DNA genômico pelo uso de uma combinação de enzimas de corte raro e de corte frequente que clivam a molécula em sítios específicos. A técnica envolve três passos: (i) restrição do DNA genômico e ligação a iniciadores adaptadores, (ii) amplificação seletiva de conjuntos de fragmentos da restrição enzimática e, (iii) a análise em gel dos fragmentos amplificados (VOS et al.,1995). As técnicas que utilizam a PCR seguida de hibridização apresentam algumas limitações tais como: requerem o isolamento do agente; o perfil gerado depende da qualidade do DNA isolado; a disponibilidade de sondas preparadas a partir do DNA de cada espécie dificulta ou impossibilita a detecção de espécies mais distanciadas filogeneticamente; a utilização de sondas marcadas radioativamente e a necessidade de utilização de estrutura laboratorial mais complexa. Por isso, essas técnicas são difíceis de ser padronizadas (MEYER et al., 1995); (2) Polimorfismo de tamanho do fragmento de restrição (RFLP) é um método fácil de executar e tem sido utilizado para fins filogenéticos e taxonômicos. Por esta abordagem, sequências conservadas (DNA ribossomal 16-23s, gene recA e da região intergênica 31 espassadora 16S-23S e etc.) são amplificadas por PCR e os produtos amplificados são digeridos com uma ou várias enzimas de restrição. Os fragmentos da digestão enzimática são separados por eletroforese em géis de agarose ou de poliacrilamida e os padrões de restrição podem ser utilizados para criar uma biblioteca de identificação (DIJKSHOORN; NEMEC, 2008) e (3) o sequenciamento completo do gene 16s rRNA (de aproximadamente 1500pb) tem sido utilizada para a diferenciação de Acinetobacter, entretanto, o sucesso deste método depende da padronização de um método de identificação das espécies, uma vez que o sequenciamento poderá fornecer dados sobre a diversidade e relações filogenéticas intraespécies (VANEECHOUTTE; DE BAERE, 2007). Ressalta-se que, apesar de diversos métodos já terem sido avaliados para a identificação genotípica de Acinetobacter spp., apenas o sequenciamento da região 16S-23 ITS tem sido considerado o padrão ouro para a diferenciação entre as espécies que formam o complexo A. calcoaceticus-A. baumannii. Entretanto, o sequenciamento é um método caro e ainda não disponível em laboratórios de rotina, ficando ainda restrito aos laboratórios de pesquisa (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Por outro lado, a técnica de mPCR tem sido utilizada para detectar a presença de diferentes genes de resistência a diferentes antimicrobianos, em especial aos β-lactâmicos do tipo OXA. Tem sido preconizado na literatura que a presença do gene blaOXA-51 pode ser usado como um método simples e confiável para a identificação da espécie A. baumannii. Segundo Mostachio et al. (2009) a mPCR apresenta resultados consistentes com os da PCR tradicional, sendo assim, uma ferramenta útil para a detecção de genes que codificam as oxacilinases. A proposta de utilizar o ARDRA-PCR se deve ao fato de ser uma técnica simples, de fácil execução e que não necessita de equipamentos caros e especializados. A grande vantagem da utilização deste método é o uso de DNA da região que codifica o gene 16s rRNA, considerada conservada entre as bactérias, mas que, ao mesmo tempo, apresenta variabilidade e quantidade de informações suficientes que podem revelar, claramente, as relações filogenéticas entre as espécies de Acinetobacter (VANEECHOUTTE; DE BAERE, 2007). Assim, o ARDRAPCR poderá se constituir em um método extremamente útil para a identificação e diferenciação entre as espécies de Acinetobacter oriundas de amostras clínicas. Pelas vantagens apresentadas acima, neste trabalho a eficiência da técnica de 32 ARDRA-PCR será avaliada em função da detecção e diferenciação de Acinetobacter spp., em isolados clínicos de pacientes internados em diferentes hospitais públicos e privados de São Luis-Maranhão. 33 3 JUSTIFICATIVA Nos últimos anos tem havido um aumento significativo no número de infecções hospitalares causadas por diferentes espécies do gênero Acinetobacter mostrando que este micro-organismo é um grave problema de saúde pública em todo o mundo. Estudos epidemiológicos têm demonstrado a necessidade da utilização de técnicas capazes de distinguir as espécies que fazem parte do complexo A. calcoaceticus-A. baumannii, porque estas são as mais envolvidas em infecções humanas. A identificação das espécies circulantes de Acinetobacter é de fundamental importância epidemiológica a fim de se averiguar se as linhagens epidemiologicamente relacionadas são também geneticamente relacionadas. A análise clonal deste patógeno poderá auxiliar na identificação da fonte (ambiental ou pessoal) dos isolados e na distinção de linhagens com potencial infeccioso. Por outro lado, a demonstração do perfil de resistência das linhagens circulantes em pacientes hospitalizados poderá influenciar na tomada de decisões e adoção de medidas terapêuticas mais eficazes no tratamento das infecções hospitalares que envolvam as diferentes espécies do gênero Acinetobacter. Além disso, a diferenciação molecular por ARDRA-PCR dessas espécies poderá contribuir para o conhecimento da prevalência deste micro-organismo em hospitais públicos e privados da cidade de São Luis-MA. Neste contexto, no presente estudo foram utilizadas as técnicas de PCR específica para a detecção do gene blaOXA-51, gene intrínseco à espécie A. baumannii; o ensaio de mPCR para detectar a presença de diferentes genes de resistência do tipo OXA e o ARDRA-PCR, com iniciadores especialmente desenhados para este trabalho, para identificar e diferenciar as espécies de Acinetobacter. 34 4 OBJETIVOS DA PESQUISA 4.1 OBJETIVO GERAL Determinar e diferenciar, por ARDRA-PCR, as espécies de Acinetobacter em isolados clínicos de pacientes procedentes de hospitais da rede pública e privada de São Luis-Maranhão. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar o perfil de susceptibilidade dos isolados a diferentes antimicrobianos usados na prática clínica. Estudar a prevalência de espécies de Acinetobacter não baumannii nas amostras clínicas dos pacientes. Pesquisar pela técnica de Multiplex-PCR a presença de genes de resistência às β-Lactamases do tipo oxacilinase (blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 e blaOXA-58) nos isolados bacterianos. Confirmar os resultados fenotípicos obtidos pela automação frente a Reação em Cadeia pela Polimerase dos isolados pertencentes à espécie Acinetobacter baumannii pela amplificação do gene blaOXA-51. Avaliar a capacidade de um ensaio ARDRA-PCR em identificar e diferenciar espécies de Acinetobacter envolvidas em infecções de pacientes procedentes de hospitais da rede pública e privada de São Luis-Maranhão. Averiguar pelo sequenciamento, de alguns isolados, se a técnica de ARDRAPCR é capaz de demonstrar se as linhagens são geneticamente relacionadas entre si. 35 5 MATERIAL E MÉTODOS 5.1 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA Em atendimento às exigências da Resolução 466/2013 do Conselho Nacional de Saúde, que norteia a pesquisa envolvendo seres humanos, este projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do CEUMA, parecer consubstanciado nº. 249.579 de 25/03/2013. 5.2 ISOLADOS BACTERIANOS Neste estudo foram avaliados 142 isolados de Acinetobacter spp., oriundos de 119 pacientes internados em 10 hospitais públicos (H1 a H10) e dois da rede privada (H11 e H12) situados em São Luis – MA, no período de junho de 2012 a junho de 2013. Os isolados bacterianos foram provenientes dos seguintes espécimes clínicos: secreção traqueal, swab nasal, sangue, swab anal, fragmento de ferida, urina, líquido pleural e secreção ocular. Os setores de internação dos pacientes foram a Unidade de Terapia Intensiva, unidade semi-intensiva, emergência, clínica médica, unidade intermediária, centro cirúrgico, oncologia, UTI-Neo e ambulatório. Os dados coletados dos pacientes foram idade, gênero, acomodação ou setor de origem e sua unidade hospitalar de procedência (pública ou privada). 5.3 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS As linhagens bacterianas foram previamente isoladas pela utilização de Protocolos Operacionais Padrões e depois foram identificadas pelo método automatizado Vitek® 2 (Biomerieux, França) com o cartão para identificação de Gram negativo (GN TEST KIT VITEK II). Todos os isolados foram submetidos ao teste de susceptibilidade aos antimicrobianos segundo as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2014) pelo método de microdiluição em equipamento de automação Vitek® 2 (Biomerieux, França) com o cartão AST N239. Os resultados de resistência foram confirmados pelo método de dico difusão (Kirby-Bauer) e método 36 epsilométrico (E-test). Os antimicrobianos avaliados foram os seguintes: amicacina (AMI), ampicilina (AMP), ampicilina/sulbactam (ASB), cefepime (CPM), cefoxitina (CT), ceftazidima (CAZ), ciprofloxacina (CIP), gentamicina (GEN), imipenem (IMI), meropenem (MER), piperacilina/tazobactam (TZP), polimixina B (POL) e tigeciclina (TGC). O Food and Drug Administration (FDA) e o CLSI ainda não estabeleceram critérios interpretativos para Acinetobacter spp. à tigeciclina. Alguns autores sugerem a CIM ≤ 2 μg/mL para susceptibilidade (JONES et al., 2007; KARAGEORGOPOULOS et al., 2008). Durante os estudos, os isolados bacterianos foram estocados em freezer a 80ºC, no meio líquido Brain Heart Infusion BHI-DIFCO (OXOID®, Basingstoke, ENGLAND) acrescido de 15% de glicerol. Alíquotas destes 142 isolados bacterianos foram gentilmente cedidos pelo Laboratório Cedro, São Luis - MA. No Laboratório de Biologia Molecular de Micro-organismos Patogênicos do UNICEUMA, os isolados foram recuperados em placa contendo o meio de cultura TSA (Tryptic Soy Agar) e incubados por um período aproximado de 16 horas a uma temperatura de 37°C em estufa bacteriológica. Posteriormente uma colônia foi passada para o caldo TSB (Tryptic Soy Broth) e incubada nas mesmas condições supracitadas. Uma alíquota de 2 mL de cada cultivo foi utilizada para a extração do DNA a ser utilizado como molde nos experimentos de biologia molecular. 5.4 ANÁLISE MOLECULAR Os estudos de biologia molecular (extração do DNA, amplificações pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), digestão enzimática, detecção de genes de resistência as oxicilinases por mPCR e análise por eletroforese dos produtos amplificados para a identificação e diferenciação dos isolados) foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular de Microrganismos Patogênicos da Universidade CEUMA. 5.4.1 Extração do DNA Genômico Para Amplificação O DNA genômico dos isolados foi extraído utilizando-se o kit “Wizard® Genomic DNA Purification Kit” (Promega®) seguindo-se o protocolo original do 37 fabricante. A concentração e a pureza do DNA extraído foram verificadas por eletroforese em gel de agarose 0,8%, em tampão TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA) [100 mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5 EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a 85 mV durante 1 hora (MANIATS; FRITCH; SAMBROOK, 1989). Após a corrida, os géis foram corados em uma solução de brometo de etídio e água destilada (1:1000), durante 20 minutos e observados em transiluminador ultravioleta comparando-se a intensidade de banda com um padrão comercial de massa molecular (Mass DNA Ladder, BioLabs New England). 5.4.2 Ensaios de PCR Para a Detecção do Gene blaOXA-51 Inicialmente, a fim de se confirmar quais isolados pertenciam a espécie A. baumannii, o DNA de todas os isolados foi submetido à PCR específica para a detecção do gene blaOXA-51, com o par de iniciadores previamente descritos por Woodford et al. (2006) e mostrados na Tabela 2. Cada tubo de reação teve um volume final de 25 µL, contendo 1 µL de cada iniciador específico (10 pmol/L), acrescidos de 12,5 µL de PCR Master Mix - Promega® [Taq DNA polimerase (dNTPs, MgCl2, tampão de PCR [pH 8,5]), 1,5 µL de água livre de nuclease e 3 µL do molde DNA, correspondendo à aproximadamente 100 ng. A reação de amplificação foi feita em termociclador Mycycler Bio rad modelo 580BR3578 sob as seguintes condições: 94ºC por 5 minutos (desnaturação inicial) seguidos de 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 62ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto e um passo de extensão final a 72ºC por 7 minutos. Os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 2%, segundo Maniats; Fritch; Sambrook (1989). 5.4.3 Desenho dos Iniciadores e Ensaios de PCR Os ensaios de ARDRA-PCR para diferenciar as espécies de Acinetobacter nos isolados clínicos de pacientes procedentes de hospitais da rede pública e privada de São Luis-Maranhão foram conduzidos da seguinte forma: desenho de iniciadores específicos e a escolha da enzima de restrição. Para diferenciar os isolados de Acinetobacter spp., pelo método ARDRAPCR, inicialmente um par de iniciadores foi especialmente desenhado a partir da região do DNA ribossomal 16S. Os iniciadores foram denominados como: 38 Acin01FW: 5’-CGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAG-3’ e Acin01RV: anti-senso: 5’-GATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACG-3’. Estes iniciadores amplificam um fragmento de 1432 nucleotídeos que, após o processo de digestão enzimática, gera fragmentos que permitem diferenciar as espécies de Acinetobacter. As amplificações por PCR específica foram feitas em termociclador Mycycler Bio rad modelo 580BR3578, em um volume final de 25 µL, contendo 20 picomoles de cada iniciador (senso e anti-senso), 12,5 μL do Master Mix PCR-kit, contendo 500 units/mL de Taq DNA polimerase, 400 µM de dATP, dGTP, dCTP, dTTP e 3 mM de MgCl2, (PROMEGA, MADISON - WI USA) acrescido de 2 µL de DNA molde (mais ou menos 100 ng). A reação de amplificação seguiu as seguintes condições: 94ºC por 5 minutos (desnaturação inicial) seguidos de 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 62ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto e um passo de extensão final a 72ºC por 7 minutos. A fim de verificar a eficiência da PCR e determinar o tamanho do fragmento de DNA amplificado foram aplicados em gel de agarose 1%, em torno de 5 µL do produto da PCR acrescido de 2 µL de tampão de amostra (Blue/Orange 6X Loading Dye, Promega, EUA). O marcador de tamanho molecular 1 Kb DNA ladder (INVITROGEN, Life Technologies, EUA) foi usado como padrão comparativo na interpretação dos resultados. O gel foi submetido à eletroforese em tampão TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA) [100 mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5 EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a 100 V durante 1 hora (MANIATIS; FRITCH; SAMBROOK, 1989). Após a eletroforese, foi feita a coloração do gel com brometo de etídio durante 20 minutos e em seguida foi observado em transiluminador de luz ultravioleta. 5.4.4 Escolha da Enzima de Restrição e Ensaio de ARDRA-PCR A determinação da enzima de restrição que melhor diferenciasse os isolados de Acinetobacter por ARDRA-PCR foi feita através de digestões in silico utilizandose o programa de informática NebCutter, http://tools.neb.com/NEBcutter2/. Foram utilizadas 124 sequências da região 16S RNA ribossomal de 32 diferentes espécies de Acinetobacter disponíveis no Genbank conforme descrito na Tabela 2. 39 Tabela 2 - Perfis ARDRA-PCR das 32 espécies de Acinetobacter constantes do Genbank utilizadas na digestão in silico e construção da matriz fenotípica para a geração do dendrograma Espécie Bacteriana A. baumannii A. calcoaceticus A. genomosp. 13TU A. pittii A. ursingii A. junii A. schindleri A. johnsonii Acinetobacter sp. Acinetobacter sp A. septicus A. haemolyticus A. lwoffii A. bereziniae A. towneri A. oleivorans A. guillouiae A. gerneri A. radioresistens A. brisouii A. rudis A. antiviralis A. boissieri A. nectaris A. seohaensis A. marinus A. tjernbergiae A. rhizosphaerae A. kyonggiensis A. venetianus Uncultured acinetobacter Uncultured acinetobacter Número Genbank NC-011595 EU513394.1 FJ860879.1 HE651911.1 KB849719.1 HE651918.1 AJ275040.2 KC904088.1 JF710649.1 JQ039977.1 EF611419.1 KC329832.1 KC178575.1 HE651922.1 HQ180191.1 NR_102814.1 KC904086.1 HE651926.1 GU145275.1 DQ832256.1 EF204258.3 DQ314740.1 JQ771141.1 JQ771132.1 AY633608.1 AY633607.1 HE651928.1 AY364536.1 FJ527818.1 KJ545603.1 KC011150.1 JQ885539.1 Perfil ARDRA-PCR in silico 39-94-95-146-173-175-182-222-306 74-81-95-146-175-182-222-438 86-88-95-149-175-182-222-519 81-95-102-175-182-222-235-438 81-146-175-189-404-437 39-146-173-175-199-306-404 22-149-163-175-404-519 81-147-166-175-180-224-440 76-149-151-175-404-518 47-81-151-156-175-404-437 81-146-175-188-404-437 66-81-149-169-175-181-222-438 146-169-175-404-519 81-149-175-189-404-437 37-107-150-175-404-519 81-94-95-146-175-182-222-438 81-148-173-175-404-437 94-95-146-175-182-334-404 146-175-189-194-210-518 24-81-95-146-175-404-438 13-39-81-89-151-163-173-175-181-210225 11-43-81-95-144-175-182-184-211-253 146-166-175-184-334-404 11-146-166-175-182-184-211-334 81-147-175-180-404-437 146-175-180-182-222-518 81-146-175-181-189-223-438 81-146-175-187-405-438 81-111-148-175-404-438 34-39-81-112-148-173-175-195-209228 72-95-146-175-182-222-518 54-147-149-397-698 Experimentalmente, objetivando-se diferenciar entre si as espécies de Acinetobacter que foram isoladas a partir dos espécimes clínicos, foram feitas digestões enzimáticas do fragmento específico de 1432pb obtido por PCR para cada um dos isolados. A enzima de restrição BfaI (INVITROGEN-BRL), previamente 40 selecionada pelo NebCutter foi usada em todas as digestões. Em cada tubo de reação de digestão, contendo 25 μL do produto amplificado (com aproximadamente 1 μg de DNA) foi adicionado 1 Unidade da enzima BfaI, 5 μL do NEBuffer 10X, mais 1x de soro albumina bovina acetilada (INVITROGEN-BRL). Foi acrescentada água Mili-Q estéril até completar o volume final de 50 μL. O tubo de reação foi colocado em banho Maria a 37ºC por 1 hora e 20 minutos. Em seguida, foi colocado a 80ºC por 20 minutos e armazenado a -20ºC até a análise eletroforética em gel de poliacrilamida. 5.4.5 Aferição do Tamanho Molecular dos Fragmentos Gerados pelo ARDRA-PCR e Confecção do Dendrograma Para a análise do perfil de migração dos fragmentos gerados pela digestão enzimática, o produto digerido foi aplicado em gel de agarose 2,5% da seguinte forma: em uma das canaletas do gel foi aplicado o padrão de tamanho molecular, 100pb DNA Ladder (INVITROGEN-BRL). Para uma melhor interpretação dos perfis obtidos, em uma das canaletas foi aplicado 10 μL da mesma amostra não digerida e a seguir 10 μL do produto digerido. A eletroforese para a completa separação dos fragmentos foi feita a 80 volts em TBE 1X por 2 horas. Após a corrida o gel foi corado com brometo de etídio (10µg/mL) e a visualização do perfil eletroforético feita sob luz ultravioleta e o gel fotografado. Para a confecção do dendrograma, os perfis apresentados no gel de poliacrilamida foram medidos usando-se o programa LabImage version 2.7.0 (Kapelan GmbH, 1999-2003). O tamanho dos fragmentos em pares de base (pb) obtido para cada perfil apresentado no gel foram dispostos em tabelas para a confecção da matriz fenotípica baseada na presença (1) ou ausência (0) de cada fragmento. Para a análise do agrupamento dos fragmentos foi utilizado o Software de taxonomia numérica e sistema de análise multivariada (NTSYS versão 2.1, Exeter Software, New york, NY, EUA). As linhagens foram correlacionadas entre si pela apresentação de um coeficiente de correlação de Sorensen-Dice maior que 90 calculado pelo programa NTSYS (ROHLF, 2000). 41 5.4.6 Ensaios de Multiplex-PCR (mPCR) Para a Detecção de Genes blaOXA A técnica de multiplex-PCR foi utilizada a fim de detectar a presença de genes codificadores de resistência às oxacilinases (blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 e blaOXA-58) mais frequentes em Acinetobacter spp. As reações de mPCR foram feitas em termociclador Mycycler Bio rad modelo 580BR3578 em um volume final de 25 µL, contendo 1 µL de cada iniciador específico (10 pmol/L) descritos na Tabela 3, acrescidos de 12,5 µL de PCR Master Mix - Promega® [Taq DNA polimerase (dNTPs, MgCl2, tampão de PCR [pH 8,5]), 1,5 µL de água livre de nuclease e 3 µL do molde DNA, correspondendo à aproximadamente 100 ng de DNA. A reação de amplificação seguiu as seguintes condições: 94ºC por 5 minutos (desnaturação inicial) seguidos de 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 62ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto e um passo de extensão final a 72ºC por 7 minutos. Os produtos da mPCR foram mensurados em gel de agarose 2% e corado com brometo de etídio (10µg/mL), como previamente descrito (MANIATIS; FRITCH; SAMBROOK, 1989). Tabela 3 - Sequência de iniciadores usados para detecção por Multiplex-PCR dos genes blaOXA nos isolados de Acinetobacter spp. Gene blaOXA-23 Tamanho (pb) 501 Iniciadores 5’ -3’ GATCGGATTGGAGAACCAGA ATTTCTGACCGCATTTCCAT blaOXA-24 246 GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA AGTTGAGCGAAAAGGGGATT blaOXA-51 353 TAATGCTTTGATCGGCCTTG TGGATTGCACTTCATCTTGG blaOXA-58 599 AAGTATTGGGGCTTGTGCTG CCCCTCTGCGCTCTACATAC Autores Woodford et al. (2006) 5.5 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DOS PRODUTOS DE PCR DE ALGUNS ISOLADOS Os isolados bacterianos que deram perfis diferentes entre si, pela análise de ARDRA-PCR, tiveram seu DNA novamente amplificado por PCR específica a fim de se verificar por sequenciamento a eficiência da metodologia de ARDRA-PCR em 42 diferenciar os isolados de Acinetobacter spp. Além disso, foram escolhidos aleatoriamente 24 isolados, entre aqueles que mostraram perfil ARDRA-PCR para A. baumannii. Para tal, o fragmento específico de 1432pb, amplificado pela PCR com o par de iniciadores desenhados para este estudo, foi purificado com o Kit comercial Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), seguindo-se as instruções do fabricante. Após a purificação, a qualidade dos produtos foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1%, quantificando-se através de comparação com um padrão de massa molecular (N3237S Mass DNA Ladder da New England BioLabs). O sequenciamento de cada produto purificado foi feito pelo método da terminação da cadeia por dideoxinucleotídeos (SANGER; NICKELEN; COULSON, 1977), em ambas as direções da dupla fita (senso positivo e senso negativo) com o “Kit ABI Prism BigDye” no sequenciador automático ABI 3130 Genétic Analyser (Applied Biosystems). As amostras foram sequenciadas pelo menos três vezes em cada sentido da fita perfazendo um total de seis sequências da mesma amostra. Todos os sequenciamentos foram feitos pela empresa Myleus Biotecnologia Ltda, sediada em Belo Horizonte-MG. 5.6 ANÁLISE COMPUTACIONAL DAS SEQUÊNCIAS PARA INFERÊNCIAS FILOGENÉTICAS Para as análises computacionais das sequências, os eletroferogramas obtidos durante o sequenciamento (TechnelysiumPty. Ltd. foram analisados no programa ChromasPro http://www.technelysium.com.au/chromas.html). A similaridade das sequências nucleotídicas obtidas foi verificada com o auxílio do programa BLASTn do pacote BLAST 2.0 (Basic AlignmentSearch Tool – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (ALTSCHUL et al., 1997). Para as análises comparativas foram selecionadas aleatoriamente 32 sequências de isolados de referências de diferentes espécies de Acinetobacter, constantes do Genbank. As sequências foram alinhadas e analisadas pelo programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, versão 5.2), http://www.megasoftware.net/. O nível de reprodutibilidade da árvore filogenética foi garantido pela análise de bootstrap de 1000 repetições. 43 5.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS Os dados foram analisados pelo programa estatístico SPSS (v.18). O desfecho representou o perfil de sensibilidade aos antibióticos testados. A variável de exposição principal foi a detecção de genes para oxacilinases do tipo blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 e blaOXA-58 nos isolados. As covariáveis englobaram o perfil do paciente, origem do material coletado e espécie bacteriana. Inicialmente foi realizada a estatística descritiva dos dados por meio de frequência absoluta, percentual, médias e desvio padrão. As medidas de associação diferença do risco (DR) e o teste Exato de Fisher foram utilizados para análise da associação entre as prevalências dos genes nos isolados. A extensão de FreemanHalton para o teste Exato de Fisher foi utilizada para analisar a associação entre detecção de oxacilinases nos micro-organismos isolados e o padrão de sensibilidade aos antibióticos testados. O nível de significância adotado foi de 5% (p<0.05). 44 6 RESULTADOS Com relação à identificação das espécies de Acinetobacter recuperados dos espécimes clínicos, o método automatizado Vitek®2 (Biomerieux, França) identificou 138 (97.2%) isolados como sendo A. baumannii, 2 (1.4%) como A. ursingii (isolados 30 e 71) e 2 (1.4%) como A. lwoffii (isolados 126 e 142). A média de idade dos pacientes variou de 50,03 ± 24,62 anos. A Tabela 4 mostra os dados gerais dos pacientes que foram agrupados em diferentes grupos etários. Observou-se que a maioria tinha mais de 60 anos, representando esta faixa etária 40,3% dos pacientes, seguidos pelos pacientes com idades entre 41 a 60 anos (26,1%). No que diz respeito ao gênero, homens e mulheres representaram, respectivamente, 56,3% e 43,7% dos pacientes (Tabela 4). Os setores de origem do material clínico que representaram as maiores frequências no estudo foram: UTI (adulto e neonatal) (58%), Emergência (10,1%) e Clínica Médica (9,2%) (Tabelas 3 e 5). Além disso, observou-se que 95,8% dos exames eram provenientes de unidades públicas de saúde (Tabela 4). Tabela 4 - Características gerais dos 142 pacientes provenientes de hospitais públicos e privados de São Luís-MA Variáveis Faixa etária (em anos) ≤10 11-20 21-40 41-60 >60 Gênero Masculino Feminino Acomodação (Setor de origem) UTI Emergência Clínica Médica Unidade Semi-intensiva Unidade Intermediária UTI Neonatal Centro Cirúrgico Oncologia Ambulatório Procedência dos pacientes Hospital Público Hospital privado f = frequência absoluta. % = frequência relativa. F (%) 9 10 21 31 48 (7,6) (8,4) (17,6) (26,1) (40,3) 67 52 (56,3) (43,7) 64 12 11 8 7 5 3 3 6 (53,8) (10,1) (9,2) (6,7) (5,9) (4,2) (2,5) (2,5) (5,0) 114 5 (95,8) (4,2) 45 É possível observar a distribuição dos diferentes tipos de espécimes clínicos obtidos em cada hospital, bem como o setor hospitalar de atendimento e ou alocação dos pacientes (Tabelas 5 e 6). Ressalta-se que, em alguns casos foram utilizados mais de um espécime clínico provenientes do mesmo paciente, obtidos de diferentes sítios e coletados em diferentes períodos de tempo da infecção. Observou-se que secreção traqueal, swab nasal e sangue representaram, respectivamente, 54,9%, 16,9% e 11,2% do total da amostragem (Tabela 5). Tabela 5 - Distribuição por hospital dos espécimes clínicos de onde os isolados foram recuperados Hospitais H01 H02 H03 H04 H05 H06 H07 H08 H09 H10 H11 H12 Total Nº de isolados Secreção Traqueal % Swab nasal % Sangue % Swab anal % Fragmento de ferida % Urina % Liquido pleural % Secreção Ocular % 44 45 11 3 7 5 17 2 1 1 5 1 142 27(61,4) 27(60,0) 5(45,5) 1(33,3) 1(14,3) 1(20) 8(47,0) 1(100) 1(100) 5(100) 1(100) 78(54,9) 12(27,2) 1(2,2) 2(18,1) 1(33,3) 1(14,3) 3(60) 4(23,5) 24(16,9) 3(6,8) 7(15,6) 1(33,3) 2(28,6 ) 1(20) 1(5,9) 1(50) 16(11,2) 1(2,3) 2(28,6) 1(5,9) 4(2,8) 1(2,2 ) 4(8,9) 3(27,3) 8(5,6) 5(11,1) 1( 9,1) 1(14,3) 2(11,7) 9(6,3) 1(2,2) 1(0,7) 1(50) 1(0,7) Tabela 6 - Distribuição setorial dos 142 isolados recuperados de espécimes clínicos de pacientes atendidos em doze hospitais de São Luis-MA Hospital UTI SI EM CM UI CC ON UTI N AM Setor % % % % % % % % % H01 30(75) 4(10) 6(15) H02 20(55,6) 1(2,7) 3(8,3) 6(16,7) 3(8,3) 3(8,3) H03 3(42,9) 4(57,1) H04 3(100) H05 2(33,3) 2(33,3) 1(16,7) 1(16,7) H06 1(20) 1(20) 2(60) H07 4(36,4) 2(18,2) 5(45,4) H08 1(33,3) 1(33,3) 1(33,3) H09 1(50) 1(50) H10 2(66,6) 1(33,3) H11 3(100) H12 1(100) Total 64(53,8) 8(6,7) 12(10,1) 11(9,2) 7(5,9) 3(2,5) 3(2,5) 5(4,2) 6(5,0) UTI: Unidade de Terapia Intensiva; SI: Semi Intensiva; EM: Emergência; CM: Clínica Médica; UI: Unidade Intermediária; CC: Centro Cirúrgico, ON: Oncologia; UTI N: Unidade de Terapia Intensiva Neonatal; AM: Ambulatório 46 Com relação à identificação fenotípica do perfil de resistência dos isolados frente a diferentes antimicrobianos, o método de microdiluição no Vitek® 2 (Biomerieux, França) mostrou que a maioria dos isolados apresentou resistência simultânea a diferentes drogas testadas (Tabela 7). Nesse aspecto, adotou-se a definição de multirresistência para o isolado que demonstrou resistência a pelo menos três antimicrobianos de diferentes classes, como sugerido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2010). Tabela 7 - Perfil fenotípico de susceptibilidade dos isolados bacterianos avaliados pelo Vitek2 Agente antimicrobiano Amicacina Ampicilina Ampicilina/Sulbactam Cefepime Cefoxitina Ceftazidima Ciprofloxacina Polimixina B Gentamicina Imipenem Meropenem Piperacilina/Tazobactam Tigeciclina Perfil de Sensibilidade Sensível Intermediário 107 (75,4%) 18 (12,7%) 12 (8,5%) 9 (6,3%) 12 (8,5%) 142 (100%) 66 (46,4%) 13 (9,3%) 13 (9,2%) 10 (7,0%) 133(93,7%) 5 (3,5%) 30 (21,1%) 3 (2,1%) 1 (0,7%) 2 (1,4%) 2 (1,4%) 6 (4,2%) 1 (0,7%) 1 (0,7%) 1 (0,7%) 9 (6,3%) Resistente 30 (21,1%) 142 (100%) 94 (66,2%) 127 (89,4%) 141 (99,3%) 131 (92,3%) 128 (90,1%) 70 (49,3%) 128 (90,1%) 128 (90,1%) 131 (92,3%) - Os resultados da triagem fenotípica para a detecção do perfil de susceptibilidade a diferentes antimicrobianos foram também avaliados por métodos moleculares. A investigação da presença de quatro subgrupos de carbapenemases do tipo oxacilinase (OXA) foi feita pela técnica de PCR multiplex para a detecção simultânea dos genes blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-58, nos 142 isolados. A Figura 1 mostra o perfil genético representativo obtido para essas oxacilinases com alguns dos isolados bacterianos. Tamanho dos fragmentos para cada gene: blaOXA23=501pb; blaOXA-24=246pb, blaOXA-51=353pb, blaOXA-58=599pb. Analisando-se a distribuição dos quatros genes do tipo OXA detectados nos isolados, observou-se um maior número de isolados apresentando simultaneamente os genes blaOXA-51 e blaOXA-23. O gene blaOXA-51, isoladamente, foi o segundo mais 47 observado. Além disso, os genes blaOXA-24 e blaOXA-58 foram também detectados (Tabela 8). Analisando-se a Figura 1, que mostra representativamente os perfis de resistência para essas oxacilinases, é importante notar que o isolado 30, identificado pelo Vitek2, como A. ursingii apresentou perfil de resistência para três tipos de oxacilinases (blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-51). Além disso, nesta amostra observou-se, um fragmento adicional de aproximadamente 320pb, amplificado inespecificamente durante a reação de mPCR. No isolado 71, identificado como A. ursingii foram observados fragmentos de 501pb e 353pb, compatíveis com os genes blaOXA-23 e blaOXA-51. E nos isolados 126 e 142, foram identificados perfis de blaOXA-24 e blaOXA-58, com fragmentos de 246 e 599pb, respectivamente. Estes dois isolados haviam sido identificados pelo Vitek2 como pertencentes à espécie A. lwoffii. Figura 1 - Perfis representativos dos resultados obtidos pela mPCR para a detecção simultânea dos genes tipo blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-58 em alguns isolados do estudo Legenda: Canaleta 01: 100 pb DNA ladder (Promega); Can30 (blaOXA-23,24,51); Can34 (blaOXA-24,51); Can37 (blaOXA-51) Can38 (blaOXA-51); Can51 (blaOXA-23,51); Can63 (blaOXA-24,51); Can71(blaOXA-23,51); Can126 (blaOXA-24); Can142 (blaOXA-58); Can55 (blaOXA-51); Can56 (blaOXA-23,51); Can88 (blaOXA-23,51); Can61 (blaOxa-51); CN : controle negativo dos reagentes usados na mPCR. 48 Tabela 8 - Frequência de detecção dos genes para oxacilinase (OXA) por mPCR nos isolados avaliados Genes blaOXA-23, blaOXA-51 blaOXA-51 blaOXA-24, blaOXA-51 blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 blaOXA-24 blaOXA-58 Frequência 130 (91,6%) 7 (4,9%) 2 (1,4%) 1 (0,7%) 1 (0,7%) 1 (0,7%) O perfil comparativo entre os resultados da análise fenotípica (Tabela 7) com o perfil de amplificação por mPCR (Tabela 8) dos genes para as oxacilinases está demonstrado na Tabela 8. Dos 128 isolados resistentes ao imipenem e meropenem, 127 apresentaram o gene bla-OXA23 (p<0,001). Enquanto que dos 13 isolados que foram sensíveis a esses antimicrobianos apenas dois apresentaram este gene (Tabela 9). Todos os 94 isolados resistentes a ampicilina/sulbactam foram positivos para a presença dos genes blaOXA-23 (p<0,001) e blaOXA-51 (p<0,015). Entre os 18 isolados sensíveis a este antimicrobiano, 16 apresentaram o gene blaOXA-51 e em apenas 6 foram detectados o gene blaOXA-23 (Tabela 9). Entre os 127 isolados resistentes ao cefepime, 126 foram positivos para o gene blaOXA-23 (p<0,001). Dos 12 isolados sensíveis, 2 foram positivos para esse gene. Todas os isolados resistentes apresentaram também o gene blaOXA-51 (p<0,003) (9). Em relação à ceftazidima, 128 dos 131 isolados resistentes apresentaram o gene blaOXA-23 (p<0,001) e 2 dos 9 isolados sensíveis também apresentaram esse gene. 130 dos 131 isolados resistentes possuíam o gene blaOXA-23 (p<0,031) (Tabela 9). Entre os 128 isolados resistentes a ciprofloxacina, 124 foram positivos para o gene blaOXA-23 (p<0,001). Dos 12 isolados sensíveis a esse antibiótico, quatro apresentaram esse gene (Tabela 9). 49 Tabela 9 - Análise comparativa entre perfil fenotípico de susceptibilidade aos antibióticos e presença de genes para oxacilinases (n=142) OXA 23 Presença Ausência F (%) f (%) OXA 24 Presença Ausência f (%) f (%) Amicacina Sensível Intermediário Resistente 96 5 29 (73,8) 11 (3,8) 0 (22,4) 1 P =0,657 (91,7) (0) (8,3) 3 0 1 (75,0) 104 (0) 5 (25,0) 29 P =1,000 (75,4) (3,6) (21,0) 106 5 29 (75,7) 1 (3,6) 0 (20,7) 1 P =0,433 (50,0) (0) (50,0) 1 0 0 (100) 106 (0) 5 (0) 30 P =1,000 (75,2) (3,5) (21,3) Ampicilina Sensível Intermediário Resistente 0 0 130 (0) 0 (0) 0 (100) 12 P =1,000 (0) (0) (100) 0 0 4 (0) 0 (0) 0 (100) 138 P =1,000 (0) (0) (100) 0 0 140 (0) 0 (0) 0 (100) 2 P =1,000 (0) (0) (100) 0 0 1 (0) 0 (0) 0 (100) 141 P =1,000 (0) (0) (100) Ampicilina/ Sulbactam Sensível Intermediário Resistente 6 30 94 (4,6) 12 (23,1) 0 (72,3) 0 P <0,001* (100) (0) (0) 4 0 0 (100) 14 (0) 30 (0) 94 P <0,001* (10,1) (21,7) (68,1) 16 30 94 (11,4) 2 (21,4) 0 (67,1) 0 P =0,015* (100) (0) (0) 1 0 0 (100) 17 (0) 30 (0) 94 P =0,126 (12,1) (21,3) (66,7) Cefepime Sensível Intermediário Resistente 2 2 126 (1,5) 10 (1,5) 1 (97,0) 1 P <0,001* (83,4) (8,3) (8,3) 4 0 0 (100) 8 (0) 3 (0) 127 P <0,001* (5,8) (2,2) (92,0) 11 2 127 (7,9) 1 (1,4) 1 (90,7) 0 P =0,003* (50,0) (50,0) (0) 0 1 0 (0) 12 (100) 2 (0) 127 P =0,021* (8,5) (1,4) (90,1) Cefoxitina Sensível Intermediário Resistente 0 0 130 (0) 0 (0) 1 (100) 11 P =0,085 (0) (8,3) (91,7) 0 1 3 (0) 0 (25,0) 0 (75,0) 138 P =0,028* (0) (0) (100) 0 1 139 (0) 0 (0,7) 0 (99,3) 2 P =1,000 (0) (0) (100) 0 0 1 (0) 0 (0) 1 (100) 140 P =1,000 (0) (0,7) 99,3) Ceftazidima Sensível Intermediário Resistente 2 0 128 (1,5) 7 (0) 2 (98,5) 3 P <0,001* (58,3) (16,7) (25,0) 3 0 1 (75,0) 6 (0) 2 (25,0) 130 P =0,001* (4,3) (1,4) (94,2) 9 1 130 (6,4) 0 (0,7) 1 (92,9) 1 P =0,031* (0) (50,0) (50,0) 0 1 0 (0) 9 (100) 1 (0) 131 P =0,014* (6,4) (0,7) (92,9) Padrão de sensibilidade OXA 51 Presença Ausência f (%) F (%) OXA 58 Presença Ausência f (%) f (%) 50 Tabela 9 - Análise comparativa entre perfil fenotípico de sensibilidade aos antibióticos e presença de genes para oxacilinases (n=142) (continuação) Padrão de sensibilidade OXA 23 Presença Ausência F (%) f (%) OXA 24 Presença Ausência f (%) f (%) OXA 51 Presença Ausência f (%) F (%) OXA 58 Presença Ausência f (%) f (%) Ciprofloxacina Sensível Intermediário Resistente 4 2 124 (3,1) 8 (1,5) 0 (95,4) 4 P <0,001* (66,7) (0) (33,3) 3 0 1 (75,0) 9 (0) 2 (25,0) 127 P =0,003* (6,5) (1,4) (92,0) 12 2 126 (8,6) 0 (1,4) 0 (90,0) 2 P =1,000 (0) (0) (100) 0 0 1 (0) 12 (0) 2 (100) 127 P =1,000 (8,5) (1,4) (90,1) Gentamicina Sensível Intermediário Resistente 57 6 67 (43,8) 9 (4,6) 0 (51,5) 3 P =0,163 (75,0) (0) (25,0) 2 0 2 (50,0) 64 (0) 6 (50,0) 68 P =1,000 (46,4) (4,3) (49,3) 65 6 69 (46,4) 1 (4,3) 0 (49,3) 1 P =1,000 (50,0) (0) (50,0) 1 0 0 (100) 65 (0) 6 (0) 70 P =0,507 (46,1) (4,3) (49,6) Imipenem Sensível Intermediário Resistente 2 1 127 (1,5) 11 (0,8) 0 (97,7) 1 P <0,001* (91,7) (0) (8,3) 3 0 1 (75,0) 10 (0) 1 (25,0) 127 P =0,002* (7,3) (0,7) (92,0) 11 1 128 (7,9) 2 (0,7) 0 (91,4) 0 P =0,009* (100) (0) (0) 1 0 0 (100) 12 (0) 1 (0) 128 P =0,098 (8,5) (0,7) (90,8) Meropenem Sensível Intermediário Resistente 2 1 127 (1,5) 11 (0,8) 0 (97,7) 1 P <0,001* (91,7) (0) (8,3) 3 0 1 (75,0) 10 (0) 1 (25,0) 127 P =0,002* (7,2) (0,7) (92,0) 11 1 128 (7,9) 2 (0,7) 0 (91,4) 0 P =0,009* (100) (0) (0) 1 0 0 (100) 12 (0) 1 (0) 128 P =0,098 (8,5) (0,7) (90,8) Piper/tazob Sensível Intermediário Resistente 2 0 128 (1,5) 8 (0) 1 (98,5) 3 P =0,505 (66,7) (8,3) (25,0) 2 1 1 (50,0) 8 (25,0) 0 (25,0) 130 P <0,001* (5,8) (0) (94,2) 10 0 130 (7,1) 0 (0) 1 (92,9) 1 P =0,018* (0) (50,0) (50,0) 0 0 1 (0) 10 (0) 1 (100) 130 P =1,000 (7,1) (0,7) (92,2) Tigeciclina Sensível Intermediário Resistente 122 9 0 (93,1) 11 (100) 4 (100) 129 (93,5) 131 (93,6) 2 (100) 1 (100) 132 (93,6) (6,9) 0 (0) 0 (0) 9 (6,5) 9 (6,4) 0 (0) 0 (0) 9 (6,4) (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0,0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) P =0,630 P =1,000 P = 0,999 P =1,000 f = frequência absoluta. % = frequência relativa. *Diferenças estatisticamente significantes (P <0,05) através do teste de probabilidade de Exato de Fisher (Freeman-Halton extension). 51 A reação de PCR utilizada para confirmar a identificação fenotípica dos isolados, pela amplificação do gene blaOXA-51, mostrou um fragmento especifico de 353pb em 140 (98.6%) isolados. Nesta investigação, somente dois isolados (126 e 142) não apresentaram o gene blaOXA-51, que é considerado intrínseco em A. baumannii e serve para a identificação dessa espécie. O fragmento específico do gene blaOXA-51 em alguns dos isolados é mostrado na Figura 2. Figura 2 - Gel de agarose 2% mostrando o produto de amplificação por PCR específica do gene blaOXA-51 de alguns isolados do estudo Legenda: CN (controle o reagentes utilizados no mPCR; 100 pb DNA ladder (Promega); Isolados nºs: 61, 71, 88, 89, 105 e 122, respectivamente. A técnica de ARDRA-PCR foi feita, não somente para confirmar os resultados fenotípicos obtidos, mas também com o intuito de detectar diferenças intraespecíficas entre os 142 isolados. Para tal, o DNA foi submetido a ensaios de PCR com um par de iniciadores específicos, desenhados para esta finalidade. Este par de iniciadores amplificou um fragmento de tamanho de1432pb, como esperado, em todos os isolados. A Figura 3 mostra um perfil representativo para o DNA de alguns desses isolados amplificados. 52 Figura 3 - Gel de agarose 1% mostrando o produto de amplificação por PCR específica para o gene da região 16S ribossomal de alguns isolados do estudo Legenda: Isolados nºs: 30; 100 pb DNA ladder (Promega); Isolados nºs: 34, 37, 38, 56, 63, 71, 26, 142, 55, 51, 61 e 88, respectivamente. A fim de se constatar se o método ARDRA-PCR teria capacidade de diferenciar os isolados entre si, o produto amplificado de cada isolado foi submetido à digestão enzimática com a endonuclease BfaI. Os perfis eletroforéticos mostrados em gel foram medidos visualmente de forma comparativa, tendo-se um padrão molecular de uso comercial amplamente utilizado para estes fins. Observaram-se perfis homogêneos para 138 (97,1%) isolados com fragmentos de 31-39-95-146167-173-189-281-306, previamente identificados fenotipicamente e genotipicamente, como sendo A. baumannii (Tabela 10). É importante notar que fragmentos muito pequenos (entre 01 e 100 pares de base) frequentemente não aparecem no gel de poliacrilamida. É possível observar, em gel de poliacrilamida 6%, o resultado representativo da digestão enzimática/ARDRA-PCR do perfil para alguns isolados, previamente identificados pelos métodos automatizado e PCR específica para a detecção do gene blaOXA-51 (Figura 4). No referido gel a espécie A. baumannii está representada por dois isolados (14 e 72), uma A. ursingii (isolado 71) dois A. lwoffii (isolados 126 e 142). Os perfis de restrição obtidos para o isolado 71 foram fragmentos de 81-146175-189-404-437 pb, correspondendo ao perfil de uma amostra sob número de acesso no Genbank KB849719.1 depositada como A. ursingii (Tabela 10). Ressalta-se que os perfis de restrição ARDRA-PCR de três isolados identificados pelo Vitek2 como sendo: A. ursingii (isolado 30) e dois como A. lwoffii (isolados 126 e 142) não corresponderam ao perfil in silico obtido para estas espécies com sequências do Genbank. Os perfis com fragmentos de 76-149-151- 53 175-404-518pb obtidos para os isolados 30 e 126 foram semelhantes àqueles obtidos para um Acinetobacter sp., com o número de acesso no Genbank JF710649.1. Enquanto o perfil obtido para o isolado 142, identificado como A. lwoffii fenotipicamente, foi compatível com Acinetobacter sp., número de acesso no Genbank JQ039977.1 e apresentando fragmentos de 47-81-151-156-175-404- 437pb (Figura 4 e Tabela 10). Ou seja, a identificação obtida pelo método automatizado foi cordante da molecular no gênero, porém em relação à espécie houve discordância. Figura 4 - Gel de poliacrilamida 6% representando os produtos da digestão enzimática de alguns isolados identificados no estudo Legenda: ND = Não digerido; Dig = Digerido; CN=Controle negativo dos reagentes amplificados e digeridos. Tabela 10 - Perfis obtidos no ARDRA-PCR para os 142 isolados de Acinetobacter avaliados no presente estudo Isolado nº. 1 ao 29; 31 ao 70; 72 ao125; 127 ao 141 Total 138 30-126 71 142 Sequencia de referência do Genbank Acinetobacter baumannii gi|215481761:1834719871 Perfil ARDRA-PCR Genbank 39-94-95-146-173-175182-222-306 Perfil ARDRA-PCR isolados 39-94-95-146-173-175182-222-306 Acinetobacter sp. JF710649.1 Acinetobacter ursingii KB849719.1 Acinetobacter sp. JQ039977.1 76-149-151-175-404-518 76-149-151-175-404518 81-146-175-189-404437 151-156-175-404-437 81-146-175-189-404-437 47-81-151-156-175-404437 54 Para a construção de um dendrograma mostrando os perfis ARDRA-PCR dos 142 isolados, foram feitas digestões in silico com 124 diferentes sequências pertencentes a 32 espécies Acinetobacter spp., constantes no Genbank. Entre os resultados destas digestões encontrou-se o perfil obtido para 138 (97,1%) isolados como pertencentes às espécies A. baumannii, de três isolados como pertencentes a duas diferentes linhagens da espécie Acinetobacter sp., e uma como sendo da espécie A. ursingii. Utilizando-se os perfis mostrados dos produtos da PCR, em gel de agarose após digestão com a enzima BfaI, foi construída uma matriz binária baseada na presença (1) ou ausência (0) de cada fragmento digerido dos isolados. Com relação às espécies de referência, utilizou-se àquelas que apresentaram o perfil semelhante ao obtido para os isolados, bem como, 28 diferentes espécies escolhidas aleatoriamente, utilizou-se o resultado da digestão in silico obtida pelo programa NEBcutter 2.0, entre as 124 linhagens previamente analisadas (Tabela 2). A matriz foi construída pelo programa NTSYS v. 2.1 (ROHLF, 2000) que gerou um dendrograma onde foram mostrados os resultados do agrupamento dos perfis dos isolados e de 32 diferentes espécies de referência com base na média aritmética ponderada (Unweighted Pair Group Method algorithm-UPGMA). O grau de similaridade genotípica entre ambos os perfis de ARDRA-PCR, para os isolados/amostras de referência, foi estabelecido pelo coeficiente Sorensen-Dice calculado pelo programa NTSYS (ROHLF, 2000). Na análise dos agrupamentos formados no dendrograma foi possível perceber o alto grau de similaridade entre os perfis ARDRA-PCR obtidos pela digestão in silico das sequências das espécies de referência existentes no Genbank, mostrando diferenciar as espécies entre si. Além disso, esta metodologia foi capaz de agrupar os isolados, em conformidade com a espécie identificada pelo perfil ARDRA (Figura 5). 55 Figura 5 - Dendrograma de similaridade genética derivado do coeficiente de similaridade DICE implementado pelo programa NTSYS mostrando as relações filogenéticas entre os 142 isolados do estudo e as 32 espécies de referência de Acinetobacter do Genbank Legenda: Isolados nºs: 71 – A. ursingii; 30 e 126 – Acinetobacter sp.; 142 – Acinetobacter sp.; 1-29, 31-70, 72-125, 127-141 – A. baumannii 56 A fim de confirmar os resultados obtidos no ARDRA-PCR, bem como verificar a eficiência dessa metodologia em diferenciar entre si os isolados de Acinetobacter spp., o produto da PCR dos 04 isolados (30,71, 126 e 142), que mostraram um perfil diferenciado no ARDRA-PCR, e de outros 24 isolados, descritos na Tabela 11 e que foram escolhidos aleatoriamente, entre aqueles identificados por PCR como A. baumannii, tiveram o seu produto amplificado purificado e sequenciado. Obteve-se pelo sequenciamento do fragmento específico de 1432pb, com os iniciadores especialmente desenhados para o presente estudo, sequências de tamanhos variados, ou seja, de 922 a 1423pb (Tabela 11). A busca de similaridade entre as sequências dos 28 isolados com as sequências existentes no Genbank foi feita com o auxílio do programa BLASTn do pacote BLAST 2.0 (BASIC ALIGNMENT SEARCH TOOL) desenvolvido pelo NCBI (ALTSCHUL et al., 1997) e mostrou um grau de similaridade que variou de 98 a 100%. Foi observado neste estudo que os 24 isolados, escolhidos aleatoriamente entre aqueles identificados como A. baumannii, eram na maioria de secreção traqueal de pacientes de UTI, mostrando assim a importância do envolvimento desse patógeno nas infecções hospitalares (Tabela 11). As sequências nucleotídicas obtidas foram editadas para a remoção de ambiguidades e a qualidade de cada base foi avaliada utilizando o CLUSTALW software package (EMBL-EBI) (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) de modo que somente as bases de alta confiabilidade, repetidas em série nos diferentes sequenciamentos foram utilizadas para a montagem de uma fita consenso final, para cada isolado. Estas sequências estão em processo de depósito no GenBank. Análises filogenéticas foram feitas alinhando-se as sequências nucleotídicas obtidas para os 28 isolados e mais as 32 sequências de diferentes espécies de Acinetobacter existentes no Genbank, como mostrado na Tabela 11 e na Figura 6. O resultado mostrou e confirmou a similaridade genética entre os isolados e as amostras de referência do Genbank, confirmando também o perfil mostrado no dendrograma. Na árvore filogenética, resultante do alinhamento implementado pelo programa de bioinformática Mega com o algorítmo Neighbor-Joining e 1000 replicatas de bootstrap, foi possível perceber que, mesmo não se fechando o sequenciamento do fragmento todo (1432pb) para os 28 isolados analisados, o resultado do alinhamento mostrou a diferenciação, não somente das espécies de 57 Acinetobacter de referência oriundas do Genbank, mas também os isolados foram topograficamente alocados com as respectivas amostras de referência com as quais elas foram identificadas no ARDRA-PCR (Figura 6). Tabela 11 - Resultado da análise de similaridade genética entre as sequências obtidas dos isolados quando submetida ao Blastn do Genbank Isolado nº. Hospital/Setor Espécime clínico Tamanho Identidade Similaridade sequenciado % (pb) A. baumannii 01 H01/UTI/ST 922 99% A. baumannii 02 H01/UTI/ST 1018 99% A. baumannii 06 H03/UTI//ST 1020 99% A. baumannii 08 H01/UTI//ST 996 99% A. baumannii 11 H03/UTI//ST 1011 99% A. baumannii 12 H02/CM/FO 1376 99% A. baumannii 13 H05/UTI/ST 1001 99% A. baumannii 14 H02/UTI/ST 998 99% A. baumannii 16 H01/UTI/ST 1026 99% Acinetobacter sp 30 HO1/CM/SN 1376 99% A. ursingii 71 H06/UTI/ S 1357 99% A. baumannii 84 HO7/ UTI/ST 1334 99% A. baumannii 88 H12/UTI/ S 1353 99% A. baumannii 91 H01/UTI/SN 1344 99% A. baumannii 92 HO7/ UTI/ST 1374 99% A. baumannii 93 HO7/ UTI/ST 1350 99% A. baumannii 94 H01/UTI/ST 1000 100% A. baumannii 95 H02/UTI/ST 1029 99% A. baumannii 96 HO7/UTI/ST 1000 100% A. baumannii 97 H01/SI/SN 1370 99% A. baumannii 98 HO7/ SI/S 1005 99% A. baumannii 100 HO7/ SI/ST 1372 99% A. baumannii 101 H01/UTI/ST 1353 99% A. baumannii 103 H04/EM/ST 1333 99% A. baumannii 104 H08/UTI/S 1363 99% A. baumannii 105 H09/SI/ST 1352 99% Acinetobacter sp Lege 126 H10/UTI/ST 1415 98% Acinetobacter sp 142 H11/UTI/ST 1423 99% nda: UTI: Unidade de Terapia Intensiva; CM: Clínica Médica; SI: Semi Intensivo; EM: Emergência. ST: Secreção traqueal; FO: Ferida operatória; SN: Swab Nasal; S: Sangue. 58 Figura 6 - Árvore filogenética construída pelo programa Mega versão 5.2 usando o algoritmo de neighbor joining com valor de bootstrap de 1000 replicatas. A árvore foi baseada na sequência nucleotídica do fragmento de 1.432bp de 28 isolados que foram sequenciados e 32 sequências de diferentes espécies de Acinetobacter provenientes do Genbank ‘’ 59 7 DISCUSSÃO As espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter são uma importante causa de infecção no ambiente hospitalar e têm sido associadas a uma grande variedade de enfermidades em pacientes internados, principalmente naqueles em Unidades de Terapia Intensiva (SINHA; SRINIVASA; MACADEN, 2007; PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008; NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012). No presente estudo os resultados dos métodos de identificação fenotípica e molecular demonstraram que a espécie A. baumannii foi a mais detectada corroborando dados da literatura recente que tem registrado o A. baumannii como a principal espécie do gênero relacionada a infecções hospitalares (NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012; ZHENG; YUAN; LI, 2013). Dos 142 isolados utilizados no estudo, três foram identificados incorretamente quanto à espécie, pelo sistema automatizado Vitek 2, um foi identificado como A. ursingii e dois isolados como A. lwoffii. Os métodos moleculares identificaram estes isolados como sendo Acinetobacter sp. Os sistemas automatizados têm sido utilizados com grande frequência para a identificação e perfil de susceptibilidade de bactérias, esses sistemas diminuem o trabalho e o tempo de realização desses testes o que possibilita a liberação de resultados com mais rapidez (DONAY et al., 2004), no entanto, prováveis erros desses sistemas podem implicar em sérios problemas na evolução clínica dos pacientes (KULAH et al., 2009). Estudo realizado por Higgins et al. (2010b) demonstrou erro na identificação por esse sistema, uma amostra identificada como A. lwoffii era na verdade A. baumannii. Segundo Sung et al. (2000) o A. lwoffii foi uma das espécies identificadas incorretamente com maior frequência. Recentemente, Guo et al. (2014) efetuou um estudo comparativo entre métodos de identificação de diferentes micro-organismos e constatou erros de identificação no Vitek2. Tem sido descrito que infecções causadas por isolados de Acinetobacter multirresistentes apresentam taxas extremamente elevadas de mortalidade ocorrendo frequentemente em pacientes graves internados em unidades de terapia intensiva e em uso de ventilação mecânica (MARAGAKIS; PERL, 2008; JOSHI; LITAKE, 2013). Os procedimentos invasivos, como a ventilação mecânica, são um dos maiores fatores de risco para as infecções causadas por A. baumannii (FOURNIER et al., 2006). 60 Em relação ao setor de internação, a UTI (adulto e neonatal) se confirmou como o setor com o maior número de amostras 69 (58%), este resultado está de acordo com os outros trabalhos. Em um estudo realizado no Brasil por CORRÊA et al. (2012) a UTI também foi responsável pela maior parte dos isolados, 57,1%. Na Arábia Saudita 56% das amostras foram isoladas de pacientes internados na unidade de terapia intensiva (ABDALHAMID et al., 2014). Pacientes internados em UTI geralmente apresentam quadro clínico mais grave por passarem longos períodos de tempo internados. Biglari et al. (2013) sugerem que esses pacientes têm uma maior chance de serem colonizados ou infectados por Acinetobacter spp., principalmente através de feridas de tecidos moles e trato respiratório. Quanto ao tipo de espécime clínico, assim como em outros estudos, a secreção traqueal foi o espécime clínico mais frequente neste estudo. Safari et al. (2013) relataram que 74% dos seus isolados eram provenientes de aspirado traqueal. Em outro estudo realizado por Abdalhamid et al. (2014) o trato respiratório foi responsável por 52% das amostras. No Brasil, em trabalho realizado no Rio de Janeiro, 47,3% dos isolados foram provenientes do trato respiratório (CARVALHO et al., 2009). A média de idade neste estudo foi de 50,03 anos sendo que a maior parte dos pacientes (40,3%) apresentou mais de 60 anos. Em um estudo realizado em Curitiba, os pesquisadores observaram que os pacientes que foram a óbito eram em média 13,5 anos mais velhos e que a idade teve valor significativo para mortalidade. Estes dados mostram que a equipe médica deve ter um cuidado redobrado com os pacientes idosos a fim de minimizar possíveis colonizações ou infecções por A. baumannii, bem como os índices de mortalidade causados por este patógeno (MEDEIROS; YABUMOTO; MOTA, 2008). As espécies do gênero Acinetobacter têm ganhado destaque devido a sua resistência intrínseca a antibióticos e capacidade de adquirir novos genes de resistência, o que as torna resistentes a várias classes de antibióticos (SHEHATA, 2012). A. baumannii é considerado um importante patógeno no ambiente hospitalar principalmente devido a sua resistência contra múltiplas classes de antimicrobianos (PEREZ et al., 2007), constatando-se nos últimos anos um aumento continuo da prevalência de linhagens multirresistentes (NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012; ZHENG; YUAN; LI, 2013). 61 Sobre o perfil de resistência dos isolados analisados no presente estudo os resultados mostraram altas taxas de resistência aos antibióticos testados, não só aos β-lactâmicos, mas também a outras classes de antimicrobianos. Para alguns antibióticos não foi observada nenhuma linhagem sensível, como foi o caso da ampicilina e da cefoxitina. A polimixina B e a tigeciclina foram os antimicrobianos mais efetivos, apresentando 100% e 93,66% de sensibilidade, respectivamente. A resistência aos antimicrobianos restringe as opções de tratamento, principalmente quando os isolados são resistentes aos carbapenêmicos que são considerados os fármacos de primeira escolha no tratamento das infecções causadas por bactérias do gênero Acinetobacter (CORRÊA et al., 2012). No entanto, nos últimos anos, tem sido observado em todo o mundo o aumento de isolados resistentes ao carbapenêmicos, restando apenas a polimixina B e tigeciclina como as últimas drogas com atividade in vitro (AL-AGAMY et al., 2014). Os perfis de 90,14% de resistência aos carbapenêmicos observados nos isolados aqui analisados concordam com os resultados de CORRÊA et al. (2012) que encontraram altas taxas de resistência entre isolados brasileiros de Acinetobacter spp. Neste mesmo estudo, as taxas de resistência ao imipenem e meropenem foram de 71,4% e 69,7%, respectivamente. Em estudo realizado no Maranhão, 86,6% dos isolados de A. baumannii foram resistentes ao imipenem (FONSECA et al., 2013). Pequisadores do Iran encontraram elevados índices de resistência ao imipenem (79,8%) e meropenem (75%) e baixa resistência a tigeciclina (2,9%) (MOHAJERI et al., 2014). Altas taxas (63,6%) de resistência ao imipenem foram também encontradas na Arábia Saudita (AL-AGAMY et al., 2014). Assim, devido à falta de novas drogas, os médicos têm considerado a tigeciclina como opção contra infecções causadas por Acinetobacter spp., multirresistentes (ROSSI, 2011). Com exceção da polimixina B e tigeciclina, as maiores taxas de susceptibilidade no presente estudo foram da amicacina (75,4%) e gentamicina (46,4%). No Teerã a polimixina B e tigeciclina apresentaram boa atividade antimicrobiana, sendo 91,2% dos isolados de A. baumannii sensíveis a estes antibióticos (MOROVAT et al., 2009). No Brasil, Corrêa et al (2012) encontraram a maior taxa de susceptibilidade para amicacina (58,8%), tetraciclina (55,4%) e gentamicina (42,9%), porém eles não utilizaram polimixina B e tigeciclina. As oxacilinases são o principal mecanismo de resistência ao carbapenêmicos entre linhagens de A. baumannii (NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012). A 62 resistência a outras classes de antimicrobianos, diferentes dos carbapenêmicos, pode estar relacionada a múltiplos mecanismos de resistência que também são encontrados em Acinetobacter spp., mas que não foram pesquisados no presente estudo. Entre esses mecanismos pode-se citar a perda ou alteração estrutural de proteínas de membrana do tipo porinas, presença de bombas de efluxo que reduzem a concentração do agente antimicrobiano no interior da bactéria, diminuição da permeabilidade da membrana externa, expressão da cefalosporinase do tipo AmpC (intrínseca em A. baumannii) e metalo-β-lactamases (MBLs) (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008; FIGUEIREDO et al., 2012). As enzimas carbapenemases do tipo OXA são as mais difundidas em A. baumanii, elas são capazes de hidrolisar os carbapenêmicos conferindo a este micro-organismo a capacidade de resistência aos antimicrobianos desta classe de fármacos (FOUAD et al., 2013). A produção da enzima OXA-23, uma beta-lactamase da classe D de Ambler, representa um importante mecanismo de resistência em isolados de A. baumannii e tem sido detectada com frequência em diferentes países (SUNG et al., 2008; CORRÊA et al., 2012; CIESLINSKI et al., 2013; FOUAD et al., 2013; AL-AGAMY et al., 2014). Neste estudo, a presença do gene blaOXA-51 foi confirmada em 140 (98,6%) isolados, todos os 138 isolados de A. baumanni foram positivas para este gene. Além disso, blaOXA-51 foi também detectado em dois isolados não-baumannii. Estes resultados estão em concordância com a literatura, onde vários autores afirmam que este gene é intrínseco à espécie A. baumannii (TURTON et al., 2006b; POIREL; NORDMANN, 2006; ABDALHAMID et al. 2014). Por outro lado, o gene blaOXA-51 foi também detectado em outras espécies não-baumannii (LEE, Y. T. et al., 2009; 2012). Estes resultados demonstram que a enzima OXA-51 é a mais prevalente em isolados de A. baumannii não só do Brasil, mas em várias partes do todo o mundo. A alta frequência dos genes blaOXA-51 e blaOXA-23 nos isolados resistentes e a baixa frequência dos mesmos nos isolados sensíveis sugere que as enzimas codificadas por estes genes podem estar relacionadas à resistência aos carbapenêmicos. Estes resultados concordam com resultados obtidos na Korea (LEE et al., 2009), Arábia Saudita (FOUAD et al., 2013) e em Taiwan (CHAN et al., 2014) onde estes genes foram detectados na maioria dos isolados de A. baumanni estudados e relacionados diretamente à resistência a estes dois carbapenêmicos. No Maranhão o gene blaOXA-23 foi recentemente detectado em 86,6% dos isolados de 63 A. baumannii resistentes a carbapenêmicos e o blaOXA-51 em 100% (FONSECA et al., 2013). Um estudo realizado em Niterói, Rio de Janeiro, também detectou uma alta frequência do blaOXA-23 e blaOXA-51 em 95,4% e 100%, respectivamente dos isolados de A. baumanni resistentes ao imipenem (CORRÊA et al., 2012). Em Belo Horizonte, MARTINS et al. (2014) encontraram estes dois genes em 93,7% e 84,3% dos isolados de A. baumanni multirresistentes. Apesar da resistência aos carbapenêmicos não poder ser atribuída somente à presença do gene blaOXA-51, a presença dos genes blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-58 foram consistentemente associados à resistência ou à diminuição da susceptibilidade (WOODFORD et al., 2006). No presente estudo um isolado apresentou os genes blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-51. Woodford et al. (2006), também identificaram dois isolados, provavelmente oriundas do Paquistão e Tailândia, que possuíam três genes blaOXA simultaneamente. A investigação da presença de quatro subgrupos de carbapenemases do tipo oxacilinase (OXA) foi feita com a finalidade de detectar os genes blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-58 nos 142 isolados estudados. Foi observado que dos 138 isolados identificados como A. baumannii, 130 (94.2%) apresentaram simultaneamente o genes blaOXA-23 e o blaOXA-51, destas 127 (97,7%) foram resistentes ao imipenem e meropenem. Além disso, isolados com perfil intermediário apresentaram também estes genes. O gene blaOXA-24 foi detectado em 4 (2,8%) isolados e o blaOXA-58 foi detectado em apenas 1 (0,7%), estes resultados estão de acordo com outros estudos que também apresentaram baixa frequência desses genes, Sohrabi et al. (2012) em um estudo realizado no Irã detectaram o gene blaOXA-24 em 1,6% dos isolados e o gene blaOXA-58 em 3,2% dos isolados de A. baumannii. Al-Agamy et al. (2014) encontraram o gene blaOXA-24 em dois isolados enquanto o gene blaOXA-58 não foi encontrado em nenhum isolado. O gene blaOXA-58 foi isolado pela primeira vez no Brasil na cidade de São Paulo (ANTÔNIO et al., 2011). A rápida detecção de isolados de Acinetobacter resistentes a carbapenêmicos e seus mecanismos de resistência é de suma importância para evitar a sua disseminação no ambiente hospitalar (CORRÊA et al., 2012). Neste aspecto, os resultados desse estudo, juntamente com os de outros pesquisadores, mostram que os elevados índices de resistência são um problema não só do Brasil, mas de todo o 64 mundo despertando maior atenção para o perigo da disseminação de linhagens multirresistentes de Acinetobacter spp. A espécie A. baumannii tem sido considerada a mais importante do gênero, do ponto de vista clínico, constituindo-se atualmente, um dos principais problemas enfrentados pelos profissionais de saúde devida sua resistência a múltiplas drogas (BIGLARI et al., 2013). Por outro lado, infecções causadas por outras espécies de não-baumannii Acinetobacter spp., têm aumentado na comunidade e em hospitais. Tem sido descrito que as infecções causadas por estas outras espécies, consideradas menos patogênicas, raramente são graves porque estes microorganismos ainda são suscetíveis a vários antimicrobianos (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008; FIGUEIREDO et al., 2011). Neste sentido, sua rápida diferenciação das outras espécies que raramente causam infecções é de suma importância (TURTON et al., 2006a). O gênero Acinetobacter tem sofrido mudanças taxonômicas ao longo da história e até o presente, 33 diferentes genoespécies foram definidas através de métodos de hibridização de DNA-DNA genômico (ESPINAL; ROCA; VILA, 2011). Apesar de ser considerado o padrão ouro, essa metodologia é laboriosa e de difícil aplicação na rotina clínica (ESPINAL; ROCA; VILA, 2011). Por isso, o sistema de identificação fenotípico tem sido amplamente utilizado para identificar ou diferenciar novos isolados, entretanto estes métodos são imprecisos, apresentam baixa capacidade de discriminação entre espécies de Acinetobacter, são complexos de executar e demorados (ESPINAL; ROCA; VILA, 2011). Alguns métodos de identificação comerciais disponíveis são conseguem separar as espécies pertencentes ao complexo A. calcoaceticus – A. baumannii, as três espécies clinicamente relevantes desse complexo são identificadas como A. baumannii pela maioria desses sistemas (PAUL; MARYAN; DANNIE, 2007; PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Entre os métodos recentemente desenvolvidos para identificar os isolados de A. baumannii incluem-se a detecção por PCR do gene blaOXA-51, que codifica uma carbapenemase intrínseca a esta espécie, Espectrometria de Massa com Ionização por PCR-electrospray, e uma nova metodologia de PCR que analisa as diferenças nos respectivos genes gyrB permitindo diferenciação entre A. baumannii e Acinetobacter genoespecie 13TU (NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012). 65 No presente estudo o gene blaOXA-51 foi detectado em todos os isolados identificados fenotipicamente como A. baumannii e em dois isolados não-baumannii, sendo uma amostra de A. ursingii (71), e outra de Acinetobacter spp. (isolado 30), sugerindo que a presença deste gene pode identificar até o nível de gênero, mas não ao de espécie. Este resultado concorda com aqueles obtidos por Lee, Y. T. et al. (2009, 2012) que identificaram pela primeira vez o gene blaOXA-51 em isolados clínicos de Acinetobacter genoespécie 13TU e A. nosocomialis. Apesar de alguns autores considerarem que a detecção do gene blaOXA-51 pode ser usada como a forma mais simples e confiável para identificação de A. baumannii (TURTON et al., 2006b; NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012; ABDALHAMID et al., 2014) a somatória dos resultados obtidos neste trabalho mais os obtidos por Lee Y. T. et al. (2009; 2012) colocam em dúvida a utilização da identificação deste gene como forma de identificação e diferenciação de A. baumannii de outras espécies de Acinetobacter. Os resultados obtidos aqui são sugestivos de que, apesar de intrínseco a A. baumannii. este gene não é exclusivo desta espécie. Outra metodologia que tem sido muito utilizada é a análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA-PCR) que apresenta muitas vantagens na identificação de espécies de Acinetobacter em relação à identificação fenotípica, uma vez que, esse método é confiável e valioso também nos estudos filogenéticos e taxonômicos (VANEECHOUTE et al., 1995; GUNDI et al., 2009; SKLARZ et al., 2009). No presente estudo, a utilidade do ensaio de ARDRA-PCR foi avaliada para a diferenciação das espécies genômicas de 142 isolados de Acinetobacter spp. Os perfis obtidos experimentalmente através da digestão enzimática destes isolados foram coincidentes com os perfis in silico obtidos com diferentes sequências do Genbank e pertencentes a 32 espécies de Acinetobacter. Além disso, a obtenção dos perfis ARDRA do fragmento de 1432pb da região 16S do RNA ribossomal, teve um importante diferencial, em relação ao que existe na literatura, pela utilização de apenas uma enzima de restrição para a execução do ARDRA-PCR. Neste método comumente são utilizadas várias endonucleases de restrição, para identificar e ou diferenciar entre si diferentes tipos de micro-organismos patogênicos, inclusive de Acinetobacter spp. Vaneechoutte et al. (1995) demonstraram que o ARDRA-PCR usando cinco enzimas de restrição é uma eficiente técnica para diferenciar as espécies do 66 complexo A. calcoaceticus-A. baumannii. Tien et al. (2012) conseguiram identificar as espécies de Acinetobacter utilizando a técnica de ARDRA-PCR com três enzimas. Kong et al. (2011) também obteve sucesso ao utilizar o ARDRA-PCR na identificação e diferenciação de linhagens de A. baumannii. O presente estudo demonstrou que a identificação dessas espécies pode ser realizada com o uso de apenas uma enzima de restrição, previamente selecionada in silico. O ARDRA-PCR tem sido um dos métodos mais aceitos e validados para a identificação de espécies de Acinetobacter com um grande acervo de perfis disponíveis (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Esta técnica apresenta várias vantagens, é um método econômico que fornece resultados de forma rápida, além disso, os equipamentos necessários para a sua execução, como termocicladores e equipamentos para eletroforese, são de fácil acesso na maioria dos laboratórios de microbiologia clínica. Todas essas características fazem dessa técnica uma das melhores alternativas na identificação de espécies do gênero Acinetobacter (CHANG et al., 2005; KONG et al., 2011). Também foi demonstrado que o ARDRA-PCR é uma importante ferramenta no estudo da diversidade genética o que pode contribuir para o melhor entendimento da epidemiologia e importância clínica das espécies de Acinetobacter principalmente às pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-A. baumannii (VANEECHOUTTE et al., 1995; TIEN et al., 2012). É importante ressaltar que o sequenciamento genômico do fragmento específico correspondente a toda região 16S do RNA ribossômico tem sido utilizado para a identificação parcial ou quase completa das espécies de Acinetobacter (CHANG et al., 2005). No presente estudo, o sequenciamento do fragmento específico de 1432pb de 24 isolados, escolhidos aleatoriamente entre os isolados identificados fenotipicamente como A. baumannii mostrou similaridade genética de 98 a 100% com A. baumannii, confirmando a identificação molecular obtido no ARDRA-PCR, e com isso, validando os resultados obtidos para os demais isolados. Além disso, o sequenciamento do produto da PCR dos quatro isolados identificados pelo Vitek 2 como sendo: A. ursingii (isolados 30 e 71) e dois como A. lwoffii (isolados 126 e 142) mostrou que apenas o isolado 71 era realmente A. ursingii, os demais foram identificados como Acinetobacter spp. Esses achados estão de acordo com a literatura a respeito da identificação fenotípica das espécies do gênero Acinetobacter, ou seja, que a mesma é insuficiente para identificar Acinetobacter em nível de espécie (CHANG et al., 2005). Os resultados do presente estudo não 67 somente suportam a aplicação do ARDRA-PCR para a determinação das espécies de Acinetobacter, mas também sugere que a maioria das espécies genômicas podem ser identificadas para considerações clínicas usando-se apenas uma enzima, nesse caso a enzima BfaI. 68 8 CONCLUSÃO A exemplo do que está descrito na literatura, os resultados obtidos no presente estudo mostraram que a espécie A. baumannii é a mais importante do gênero, e que o número de infecções causadas por espécies nãobaumannii tem aumentado no ambiente hospitalar; demonstrando a sua importância clínica, uma vez que estas podem apresentar resistência antimicrobiana e características potenciais de virulência; A resistência bacteriana a antimicrobianos avaliada pelo método automatizado Vitek2 mostrou que são altos os índices de resistência em A. baumannii, considerando quase todas as classes de antimicrobianos, com exceção da polimixina B e Tigeciclina, que ainda são efetivas contra A. baumannii; Os genes codificadores de Oxacilinases (blaOXA-23 e blaOXA-51) foram detectados em quase totalidade dos isolados de A. baumannii estudadas; A presença do gene blaOXA-51 em isolados de Acinetobacter spp., apresentados neste estudo, demonstrou que este gene necessariamente não os identifica como A. baumannii. O sequenciamento do fragmento amplificado com os iniciadores especialmente desenhado para o presente trabalho permitiu a identificação dos 28 isolados sequenciados; O ARDRA-PCR demonstrou ser uma ferramenta molecular útil para o estudo da diversidade genética das espécies de Acinetobacter spp., pois permitiu identificar e diferenciar todos os isolados entre si, pela utilização de apenas uma enzima de restrição. O dendrograma construído a partir dos perfis ARDRA-PCR, obtidos para os isolados mostrou alto grau de similaridade com os perfis obtidos pela digestão in silico das sequências de referência de Acinetobacter spp., existentes no Genbank, suportando a aplicabilidade do ARDRA-PCR para a determinação das espécies de Acinetobacter. 69 REFERÊNCIAS ABDALHAMID, B.; HASSAN, H.; ITBAILEH, A.; SHORMAN, M. Characterization of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates in a tertiary care hospital in Saudi Arabia. New Microbiologica, v. 37, p. 65-73, 2014. 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