EFAR - Diss - Bruna Caroline Vieira Pitol

Transcrição

Universidade Federal de Ouro Preto
Escola de Farmácia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
(CIPHARMA)
Análise da expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV nas
lesões intraepiteliais cervicais
Bruna Caroline Vieira Pitol
Ouro Preto – MG - Brasil
Junho de 2012
Universidade Federal de Ouro Preto
Escola de Farmácia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
(CIPHARMA)
Análise da expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV nas
lesões intraepiteliais cervicais
Bruna Caroline Vieira Pitol
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas da Escola de Farmácia da
Universidade Federal de Ouro Preto, para obtenção do Grau de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Angélica Alves Lima
Co-orientadora: Profa. Dra. Cláudia M.Carneiro
Ouro Preto – MG - Brasil
Junho de 2012
Dedico este trabalho...
Aos meus pais, Fioravante e Alzeni, e aos meus irmãos,
Marcus, Sandra e Dudu. Uma família especial, que apesar
dos obstáculos, permanece sempre unida.
Agradecimentos
Pitol, BCV
À Deus e ao meu anjo da guarda, por não me deixarem desistir do meu caminho.
Aos meus pais, Fioravante e Alzeni, pela luta e esforços diários em busca da minha
formação. Aos meus irmãos Sandra e Dudu, pelas palavras de incentivo. À Deni, pelo
carinho durante tantos anos.
Ao meu irmão Marcus, por ser tão especial! Obrigada por sempre estar ao meu lado.
Você é e sempre será meu maior exemplo.
À Profa. Dra. Angélica Alves Lima, minha orientadora, por todo o aprendizado e
oportunidades proporcionadas durante todos estes anos. Por tornar possível a conclusão
deste projeto e contribuir para minha formação profissional. Por ser um exemplo de
professora que possui ética e respeito pelos seus alunos. E também pela amizade e
delicadeza sempre presentes. Minha eterna gratidão!
À Profa. Dra. Cláudia Martins Carneiro, minha co-orientadora, por ser imprescindível
para a realização deste projeto. Por todo o aprendizado repassado ao longo destes anos e
pela disponibilidade e paciência em me ajudar em tantos momentos. Muito obrigada!
Ao Laboratório Tafuri, em especial ao Dr. Alexandre Tafuri, pela colaboração e
disponibilidade na realização deste projeto.
À Profa. Dra. Ilka Afonso Reis, pela colaboração e por ser fundamental na conclusão
das análises estatísticas.
Aos professores, funcionários e alunos do LIMP (Laboratório de Imunopatologia) e
LPC (Laboratório de Pesquisa Clínica), por toda a ajuda na execução deste projeto.
Obrigada por me receberem e colaborarem em diversos momentos. Em especial à Carol
e Paula, pelo auxílio nos momentos em que precisei.
À equipe da Profa. Dra. Angélica A. Lima, alunas: Bárbara, Lenita, Priscila, Paula e em
especial à Pri e Nayara (companheiras de tantos momentos), por toda a ajuda prestada
para a realização deste trabalho. Muito obrigada pela amizade sempre presente!
À Profa. Dra. Rita de Cássia Stocco, pelo suporte prestado para a execução deste
trabalho.
Agradecimentos
Pitol, BCV
Ao Prof. Roney Luiz de Carvalho Nicolato, exemplo de profissional farmacêutico.
Obrigada pelo carinho, ensinamentos e por manter as portas do LAPAC sempre abertas.
Aos Profs. Dr.Luiz Fernando de Medeiros Teixeira e Dr.Laser Antônio Machado
Oliveira, pelas sugestões na banca de qualificação.
Às amigas Dani e Ana, pelos bons momentos e apoio diários. Sem vocês o caminho
teria sido mais árduo. Obrigada por dividirem comigo tantas experiências nesta casa.
À Rep. Caixotinho, meu refúgio. Obrigada por sempre fazer parte das minhas melhores
lembranças. Atuais moradoras pelos bons momentos e pela ajuda nestes dois anos. Em
especial à KT, por ter cuidado tanto de mim em tempos difíceis!
Às amigas Débora, Luana, Priscilla, Caru, Jamily, Mari e KT! Irmãs para a vida toda.
Obrigada pelas inúmeras palavras de apoio, pela presença constante e por torcerem
tanto pelo meu sucesso. Amo muito vocês!
Aos amigos Rodrigo, Giani e Dani, por serem os sobreviventes da Farmácia 04/2 em
OP! Rodrigo, obrigada por tudo ao longo destes anos. Jamais te deixarei!
Aos amigos da turma de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela convivência e
momentos compartilhados.
Aos verdadeiros amigos de Ouro Preto, GV e Divino das Laranjeiras, pelo
companheirismo.
Aos professores e funcionários do programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas-Cipharma, pela oportunidade.
À FAPEMIG, CAPES e CNPq pelo financiamento e apoio na realização deste trabalho.
Às pacientes, que concordaram em participar deste projeto, permitindo que o material
biológico fosse utilizado nesta tese.
À todas as pessoas que torcem verdadeiramente por mim, meu muito obrigada!
“Ser feliz é encontrar força no perdão, esperanças nas batalhas,
segurança no palco do medo, amor nos desencontros. É agradecer a Deus
a cada minuto pelo milagre da vida.”
Fernando Pessoa
Sumário
Pitol, BCV
1) Introdução..................................................................................................................... 1
2) Objetivos ...................................................................................................................... 4
2.1) Objetivo Geral ....................................................................................................... 5
2.2) Objetivos Específicos ............................................................................................ 5
3) Revisão da literatura ..................................................................................................... 6
3.1) Papilomavírus Humano (HPV).............................................................................. 7
3.1.1) Estrutura e organização do genoma viral ........................................................ 7
3.1.2) Classificação dos Papilomavírus..................................................................... 8
3.2) Desenvolvimento do câncer cervical ................................................................... 10
3.2.1) Transmissão viral .......................................................................................... 11
3.2.2) Infecção pelo HPV ........................................................................................ 12
3.2.3) Remissão ou persistência da infecção por HPV e/ou das lesões precursoras 15
3.2.3.1) Remissão ................................................................................................ 15
3.2.3.2) Persistência ............................................................................................. 15
3.2.4) Progressão de um clone de células infectadas para pré-câncer e invasão..... 16
3.2.4.1) Ciclo celular ........................................................................................... 16
3.2.4.2) Mecanismo carcinogênico ...................................................................... 18
3.3) Diagnóstico das lesões intraepiteliais cervicais e do HPV .................................. 20
3.3.1) Citologia........................................................................................................ 21
3.3.2) Colposcopia................................................................................................... 23
3.3.3) Histologia ...................................................................................................... 23
3.3.4) Técnicas moleculares para detecção do DNA do HPV ................................ 24
3.4) Biomarcadores e o diagnóstico do câncer cervical .............................................. 25
3.4.1) Proteína p53 .................................................................................................. 27
i
Sumário
Pitol, BCV
3.4.2) Proteína p16 .................................................................................................. 27
3.4.3) Teste para análise dos biomarcadores ........................................................... 28
3.5) Tratamento ........................................................................................................... 29
4) Metodologia ............................................................................................................... 31
4.1) Amostragem ........................................................................................................ 32
4.2) Imuno-histoquímica ............................................................................................. 32
4.2.1) Preparação das lâminas ................................................................................. 33
4.2.2) Desparafinização ........................................................................................... 33
4.2.3) Recuperação antigênica ................................................................................ 33
4.2.4) Bloqueio da atividade da peroxidase endógena ............................................ 33
4.2.5) Anticorpo primário........................................................................................ 34
4.2.6) Anticorpo secundário .................................................................................... 34
4.2.7) Revelação ...................................................................................................... 35
4.2.8) Contra-coloração e montagem das lâminas .................................................. 35
4.3) Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE) ......................................................... 36
4.4) Fotodocumentação e análise da marcação imuno-histoquímica ......................... 36
4.5) Análise estatística ................................................................................................ 37
5) Resultados .................................................................................................................. 40
5.1) Caracterização da amostra selecionada, revisão e reclassificação dos laudos
anatomopatológicos .................................................................................................... 41
5.2) Padronização ........................................................................................................ 42
5.3) Análise da expressão das proteínas de ciclo celular ............................................ 46
5.3.1) Proteína p16 .................................................................................................. 46
5.3.2) Proteína p53 .................................................................................................. 51
5.4) Análise do Papilomavírus Humano (HPV) ......................................................... 53
5.5) Correlação entre a expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV ......................... 58
ii
Sumário
Pitol, BCV
5.6) Análise da eficiência diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos das proteínas
p16, p53 e L1/HPV ..................................................................................................... 60
5.7) Comparação dos métodos de análise imuno-histoquímica: quantitativo x
qualitativo (parâmetro distribuição)............................................................................ 65
6) Discussão .................................................................................................................... 67
6.1) Proteínas do ciclo celular: p16 e p53 ................................................................... 68
6.2) Análise do HPV ................................................................................................... 70
6.3) Proteínas do ciclo celular e HPV ......................................................................... 72
6.4) Eficiência diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos das proteínas p16, p53 e
L1/HPV ....................................................................................................................... 73
6.5) Análise imuno-histoquímica ................................................................................ 74
7) Conclusão ................................................................................................................... 79
8) Referências ................................................................................................................. 81
9) Anexos...................................................................................................................... 102
iii
Lista de Figuras
Pitol, BCV
Figura 1: Organização estrutural do genoma do HPV, destacando a localização e
algumas funções da região reguladora LCR e das ORFs E e L. ....................................... 9
Figura 2: Etapas da carcinogênese cervical................................................................... 11
Figura 3: Epitélio cervical. ............................................................................................ 13
Figura 4: Complexos ciclinas-CDKs nas fases do ciclo celular. ................................... 17
Figura 5: Mecanismos de controle do ciclo celular....................................................... 20
Figura 6: Parâmetros considerados na análise qualitativa..Erro! Indicador não definido.
Figura 7: Diluições testadas para o anticorpo anti-p16 ......Erro! Indicador não definido.
Figura 8: Diluições testadas para o anticorpo anti-p53 ......Erro! Indicador não definido.
Figura 9: Diluições testadas para o anticorpo anti-L1/HPV ......................................... 45
Figura 10: Padrão de marcação observado na imuno-histoquímica utilizando anticorpo
anti-p16 ................................................................................ Erro! Indicador não definido.
anti-p53 ................................................................................ Erro! Indicador não definido.
anti-L1/HPV ........................................................................Erro! Indicador não definido.
Figura 13: Curva ROC para as proteínas p16 e L1/HPV, isoladas ou em associação. . 62
Figura 14: Valor Preditivo Positivo (VPP), Valor Preditivo Negativo (VPN) e
Eficiência (Ef) diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos de L1/HPV e p16 ............. 64
iv
Lista de Tabelas
Pitol, BCV
Tabela 1: Sistemas de classificação das lesões cervicais. ............................................. 21
Tabela 2: Anticorpos primários e condições utilizadas na imuno-histoquímica. .......... 35
Tabela 3: Diagnóstico das amostras extraído dos laudos do Laboratório Tafuri. ......... 41
Tabela 4: Expressão da proteína p16 de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 46
Tabela 5: Análise do padrão de imunorreatividade da p16 em relação ao parâmetro
distribuição de acordo com o diagnóstico histopatológico. ............................................ 47
intensidade de acordo com o diagnóstico histopatológico. ............................................ 48
topografia de acordo com o diagnóstico histopatológico. .............................................. 49
Tabela 8: Expressão da proteína p53 de acordo com o diagnóstico histopatológico. ... 51
Tabela 9: Expressão da proteína L1/HPV de acordo com o diagnóstico histopatológico.
........................................................................................................................................ 54
Tabela 10: Análise do padrão de imunorreatividade da L1/HPV em relação ao
parâmetro distribuição de acordo com o diagnóstico histopatológico. .......................... 54
parâmetro intensidade de acordo com o diagnóstico histopatológico. ........................... 55
parâmetro topografia de acordo com o diagnóstico histopatológico. ............................. 56
Tabela 13: Análise da expressão da L1/HPV e p16, pelo método quantitativo, de acordo
com diagnóstico histopatológico. ................................................................................... 59
Tabela 14: Análise da expressão da L1/HPV e p16, pelo método qualitativo (parâmetro
distribuição), de acordo com diagnóstico histopatológico. ............................................ 59
Tabela 15: Análise da eficiência diagnóstica das proteínas p16 e L1/HPV, isoladas ou
em associação, considerando os resultados do método quantitativo. ............................. 63
em associação, considerando os resultados do parâmetro distribuição do método
qualitativo. ...................................................................................................................... 63
Tabela 17: Análise da concordância entre os métodos quantitativo e qualitativo na
avaliação da expressão da p16. ....................................................................................... 66
avaliação da expressão da p53. ....................................................................................... 66
avaliação da expressão da L1/HPV. ............................................................................... 66
v
Lista de Abreviaturas
Pitol, BCV
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ACOG: American College of Obstetricians and Gynecologists (Sociedade Americana
de Obstretas e Ginecologistas)
ACS: American Cancer Society (Sociedade Americana do Câncer)
ASCUS: Células Escamosas Atípicas de Significado Indeterminado
CDK: Cyclin Dependent Kinase (Quinase Dependente de Ciclina)
CDKI: Inhibitor of Cyclin Dependent Kinase (Inibidor de Quinase Dependente de Ciclina)
E: Early (Precoce)
E2F: Fator de transcrição
FDA: Food and Drug Administration (Agência Reguladora dos EUA de Alimentos e
Medicamentos)
HPV: Human Papillomavirus (Papilomavírus Humano)
HSIL: High Grade Squamous Intraepithelial Lesion (Lesão Intraepitelial Escamosa de Alto
Grau)
INCA: Instituto Nacional do Câncer
IHQ: Imuno-histoquímica
JEC: Junção Escamo-Colunar
L: Late (Tardia)
LCR: Long Control Region (Região Reguladora)
LSIL: Low Grade Squamous Intraepithelial Lesion (Lesão Intraepitelial Escamosa de Baixo
Grau)
NIC: Neoplasia Intraepitelial Cervical
NIC I: Neoplasia Intra-epitelial Cervical Grau I
NIC II: Neoplasia Intra-epitelial Cervical Grau II
NIC III: Neoplasia Intra-epitelial Cervical Grau III
ORF: Open Reading Frame (Região de Leitura Aberta)
pb: pares de bases
PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
PV: Papilomavírus
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismos dos Comprimentos dos
Fragmentos de Restrição)
vi
Lista de Abreviaturas
Pitol, BCV
SUS: Sistema Único de Saúde
VLP: Vírus Like Particle (Partículas Semelhantes ao Vírus)
WHO: World Health Organization ( Organização Mundial de Saúde)
vii
Resumo
Pitol, BCV
O câncer cervical é o terceiro tipo de tumor mais frequente na população feminina
mundial. A associação entre o Papilomavírus Humano (HPV) e as lesões préneoplásicas e neoplásicas do colo uterino está bem estabelecida. As oncoproteínas virais
E6 e E7 interferem nos mecanismos de controle do ciclo celular da célula hospedeira e a
investigação de proteínas regulatórias deste ciclo pode apontar algum biomarcador, que
auxiliaria na definição da gravidade da neoplasia intraepitelial cervical. Objetivo:
Analisar a expressão das proteínas do ciclo celular p16 e p53 e da L1 do vírus HPV
(L1/HPV) em cervicites, neoplasias intraepiteliais cervicais e carcinomas e discutir a
possível utilização como biomarcadores da gravidade destas lesões. Metodologia: Um
total de 150 amostras de biópsias obtidas dos arquivos do Laboratório Tafuri, Belo
Horizonte, MG, no período de 2006 a 2011, distribuídas de acordo com o diagnóstico
histopatológico em LB, NIC I, NIC II, NIC III e CEI, foram submetidas ao
procedimento de imuno-histoquímica para avaliar as proteínas p16, p53 e L1/HPV.
Foram considerados dois métodos de análise da imuno-histoquímica: quantitativo e
qualitativo (distribuição, intensidade e topografia). Resultados: A expressão da proteína
p16 aumentou significativamente com a gravidade da lesão, independente do critério de
análise, quantitativo (p=0,000) ou qualitativo (p=0,000), sendo que a quantificação
permitiu diferenciar alguns graus de lesão. Associação estatisticamente significativa foi
verificada também em relação aos parâmetros intensidade (p=0,000) e topografia
(p=0,001). A expressão da proteína p53 não variou com a gravidade das lesões, seja
pelo método quantitativo ou qualitativo. A proteína L1/HPV foi menos expressa nas
lesões mais graves e associação significativa foi verificada entre o padrão de expressão
da L1/HPV e o diagnóstico histopatológico tanto na análise quantitativa (p=0,000)
quanto na qualitativa (p=0,006). A eficiência diagnóstica do teste da p16 e L1/p16 foi
maior em relação à L1 isolada. Não foi observada melhoria no diagnóstico quando o
teste da p16 foi associado à análise da L1/ HPV por imuno-histoquímica. A
concordância entre os métodos de análise quantitativa e qualitativa não foi muito
elevada, sendo maior na avaliação da p16 (k=0,617) e menor em L1/HPV(k=0,172).
Conclusão: A proteína p16 parece promissora como biomarcador no prognóstico da
neoplasia intraepitelial cervical. Por outro lado, a p53 não tem valor na avaliação de
qualquer grau de NIC ou carcinoma. O padrão de expressão da L1/HPV sugere a fase da
infecção viral (produtiva ou de transformação). A análise conjunta da p16 e L1/HPV
pode ser útil para ser aplicada juntamente com a histologia, auxiliando na diferenciação
do grau da lesão, além de sugerir a fase da infecção e direcionar o acompanhamento das
pacientes. A utilização dos biomarcadores na rotina depende da padronização de
variáveis relacionadas à técnica de imuno-histoquímica e dos métodos de interpretação
dos resultados. O método quantitativo mostrou maior precisão, entretanto, apresenta
dificuldades na padronização e execução.
viii
Abstract
Pitol, BCV
Cervical cancer is the third most frequent type of tumor in the female population
worldwide. The association between human papillomavirus (HPV) and cervical preneoplastic and neoplastic lesions of the cervix is well established. The viral
oncoproteins E6 and E7 interfere with the mechanisms of cell cycle control of the host
cell and the investigation of this cycle regulatory proteins may point a biomarker that
would help in the prognosis of cervical intraepithelial neoplasia. Objective: To analyze
the expression of cell cycle proteins p16 and p53 and HPV L1 virus (L1/HPV) in
cervicitis, cervical intraepithelial neoplasias and carcinomas and discuss the possible
use as biomarkers in the prognosis of these lesions. Methodology: A total of 150 biopsy
samples taken from the archives of the Laboratory Tafuri, Belo Horizonte, MG, in the
period 2006 to 2011, distributed according to the histopathological diagnosis of LB,
CIN I, CIN II, CIN III and CIS, underwent the procedure immunohistochemistry to
evaluate the protein p16, p53 and L1/HPV. We considered two methods of analysis of
immunohistochemistry, quantitative and qualitative (distribution, intensity and
location). Results: The expression of p16 protein increased significantly with the
severity of the lesion, regardless of the criteria for analysis, quantitative (p = 0.000) or
qualitative (p = 0.000), and quantification was possible to differentiate some degree of
lesion. A statistically significant association was found also for the intensity parameters
(p = 0.000) and topography (p = 0.001). The p53 protein expression did not vary with
the severity of lesions, whether quantitative or qualitative method. L1/HPV The protein
was expressed in less severe lesions and a significant association was found between the
expression pattern and histopathological diagnosis of L1/HPV both in quantitative
analysis (p = 0.000) and in qualitative (p = 0.006). The diagnostic efficiency of the test
and p16 L1/p16 was higher compared to L1 alone. No improvement was observed when
the test in the diagnosis of p16 has been associated to the analysis of L1 / HPV by
immunohistochemistry. The agreement between the methods of quantitative and
qualitative analysis was not very high, being higher in the evaluation of p16 (k = 0.617)
and lowest in L1/HPV (k = 0.172). Conclusion: The p16 protein appears promising as a
biomarker in the prognosis of cervical intraepithelial neoplasia. Moreover, p53 is not
important in the evaluation of any grade CIN or carcinoma. The pattern of expression
suggests L1/HPV phase of viral infection (production or processing). The combined
analysis of p16 and L1/HPV can be useful to be applied in conjunction with histology,
helping to differentiate the degree of lesion, and suggest the stage of infection and direct
monitoring of patients. The use of biomarkers in the routine depends on the
standardization of variables related to the technique of immunohistochemistry and
methods of interpreting the results. The quantitative method showed greater precision,
however,
presents
difficulties
in
standardization
and
implementation.
ix
1) Introdução
Introdução
Pitol, BCV
O câncer cervical ou do colo do útero é o terceiro tipo de tumor mais frequente
entre as mulheres, com aproximadamente 529 mil novos casos e uma média de 275 mil
óbitos por ano em todo o mundo. Sua incidência é cerca de duas vezes maior em países
em desenvolvimento quando comparada aos mais desenvolvidos (INCA, 2011).
A infecção por HPV é reconhecida mundialmente como a causa principal do
câncer cervical (zur Hausen, 1974; zur Hausen, 1976; zur Hausen, 1977; zur Hausen,
2009). O mecanismo carcinogênico exercido pelo vírus está relacionado com a atuação
das oncoproteínas virais E6 e E7 sobre os mecanismos de controle do ciclo celular,
desregulando os processos celulares de proliferação (Boulet et al., 2007; Moody &
Laimins, 2010).
Atualmente, a realização do exame de Papanicolaou ou preventivo é a estratégia primária
utilizada na prevenção do câncer cervical (WHO, 2010). A eficácia da detecção precoce de
anormalidades citológicas através deste exame é responsável pela redução na incidência do
câncer, bem como na taxa de mortalidade (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010). No entanto, o
diagnóstico preciso do tipo de lesão existente só ocorre a partir do exame anatomopatológico
(Sellors & Sankaranarayanan, 2003).
Um problema vigente, no que se refere ao diagnóstico histopatológicos, é a baixa
reprodutibilidade intra e inter-observadores. Isto ocorre porque os critérios de
classificação adotados são muito subjetivos. O diagnóstico diferencial entre as lesões de
baixo grau (Neoplasia Intraepitelial Cervical grau I – NIC I) e as de alto grau (Neoplasia
Intraepitelial Cervical graus II e III – NIC II e III) é muito variável entre os patologistas,
principalmente na transição de NIC I para NIC II. A conduta clínica das pacientes
depende da graduação das lesões, uma vez que as de baixo e alto graus são tratadas de
formas diferentes (Martin & O'leary, 2011).
O rastreamento das lesões cervicais, tanto no âmbito citológico quanto no
histológico, é baseado somente na análise microscópica de critérios morfocitológicos do
material analisado. Este tipo de avaliação não fornece suporte a respeito da dinâmica de
regressão ou progressão das lesões pré-neoplásicas (Baak et al., 2006). Sendo assim,
muitas mulheres com lesões que iriam regredir voluntariamente estão sendo tratadas
desnecessariamente, gerando transtornos à paciente, pois muitas vezes o tratamento é
invasivo. Ao passo que outras mulheres com lesões com potencial de evolução para
carcinoma invasor podem não estar sendo tratadas (Martin & O'leary, 2011).
2
Introdução
Pitol, BCV
Neste contexto, a identificação de biomarcadores que possam fornecer
informações sobre a progressão ou regressão das lesões e, portanto, melhorar o
prognóstico e diagnóstico, pode representar significativo avanço nos programas de
rastreamento e prevenção do câncer cervical (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010). A
busca por novos marcadores e pelo entendimento da correlação entre os já existentes
vêm sendo objeto de muitas pesquisas atualmente.
Um marcador eficiente deve ser (a) sensível, para não subdiagnosticar os casos
que necessitam de tratamento e (b) preciso, para identificar apenas os casos realmente
positivos. O ideal é que o biomarcador esteja especificamente associado à evolução da
doença, apresentando capacidade de discriminar lesões de baixo e alto graus com risco
de progredir daquelas com maior chance de regredir espontaneamente (Wentzensen &
von Knebel Doeberitz, 2007).
No caso do câncer cervical, considerando que o HPV interfere nos mecanismos de
controle do ciclo celular da célula hospedeira, a investigação de proteínas regulatórias
deste ciclo pode apontar algum biomarcador na identificação de lesões cervicais com
risco real de evolução para carcinoma (Tsuda et al., 2003; Wang et al., 2004).
Atualmente, as proteínas regulatórias do ciclo celular, como a p53, ciclina D1,
ciclina E, CDK4 e inibidores de ciclinas (p21, p27, p16) vem sendo amplamente
estudadas (Ghobashy et al., 2004; Bahnassy et al., 2006, Pinto et al., 2012). A
expressão das proteínas de supressão tumoral, como a p16 e p14, em células epiteliais
do colo do útero, tem sido relacionada com lesões de alto grau (Wang et al., 2005;
Bulten et al., 2006). Já a relação da expressão da p53 com as lesões pré-neoplásicas e
neoplásicas da cérvice não está bem estabelecida (Herbsleb, 2001; Turkcuoglu et al.,
2007). Além disso, há um grande interesse na inclusão de testes para análise do DNA do
HPV nos programas de triagem diagnóstica do câncer cervical (Agoff et al., 2003;
Godoy et al., 2008; Gatta et al., 2011; Martin & O'leary, 2011). Uma opção mais
recente de avaliação viral é a análise da expressão das proteínas L1 e E6/E7 do HPV
(Yoshida et al., 2008; Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al.,
2010; Frega et al., 2011).
Neste estudo foram analisadas as proteínas do ciclo celular p16 e p53 e a proteína
L1 do vírus HPV como possíveis biomarcadores da gravidade da neoplasia intraepitelial
cervical.
3
2) Objetivos
Objetivos
Pitol, BCV
2.1) Objetivo Geral
Analisar a expressão das proteínas do ciclo celular p16 e p53 e da L1 do vírus
HPV (L1/HPV) em cervicites, neoplasias intraepiteliais cervicais e carcinomas e
discutir a possível utilização como biomarcadores da gravidade destas lesões.
2.2) Objetivos Específicos
- Correlacionar o padrão de expressão da p16 e p53 com o da L1/HPV e avaliar
estas proteínas, isoladamente ou associadas, como possíveis biomarcadores da
gravidade da neoplasia intraepitelial cervical;
- Comparar dois métodos de análise da imuno-histoquímica das proteínas p16,
p53 e L1/HPV: quantitativo e qualitativo (parâmetro distribuição);
- Avaliar o desempenho e a eficiência diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos
das proteínas p16, p53 e L1/HPV.
5
3) Revisão da literatura
Revisão da Literatura
Pitol, BCV
O entendimento da etiologia do câncer cervical foi um grande desafio para os
pesquisadores (zur Hausen, 2009). Inicialmente, atribuíram a ocorrência da neoplasia ao
vírus Herpes Simples tipo 2 (Rawls et al., 1968; Naib et al., 1969; Nahmias et al.,
1970). Entre 1974 e 1976, zur Hausen e colaboradores mostraram a importância do
Papilomavírus Humano (HPV) na gênese e evolução do tumor cervical (zur Hausen et
al., 1974; zur Hausen et al., 1976; zur Hausen et al., 1977). Posteriormente, Meisels e
Fortin observaram que os tipos celulares, denominados coilócitos, encontrados em
esfregaços cervicais de pacientes com displasias leves, seriam indicativos de alteração
celular provocada pelo HPV (Meisels & Fortin, 1976; Meisels et al., 1977). Em 1982,
surgiram os primeiros trabalhos relatando o isolamento de tipos de HPV em amostras
cervicais (Gissmann et al., 1982 a,b; Zachow et al., 1982; Green et al., 1982). O
primeiro estudo epidemiológico sobre HPV e câncer cervical foi publicado em 1987 (de
Villiers, 1987).
A partir de então, muitos projetos vêm sendo conduzidos em todo o mundo para
avaliar, principalmente: (a) a interação do vírus com a gênese do câncer, (b) os
mecanismos envolvidos na infecção viral e no desenvolvimento de lesões, bem como
remissão ou progressão destes eventos, (c) a prevalência da infecção por HPV, (d) os
fatores associados ao vírus e importantes na carcinogênese, (e) diferentes métodos de
detecção do HPV, (f) testes para melhoria da sensibilidade e especificidades no
prognóstico e diagnóstico do câncer cervical e (g) vacinas profiláticas e terapêuticas ou
outros tipos de tratamento. Além disso, atualmente muito se discute a respeito do papel
do HPV em neoplasias anogenitais, da orofaringe e da pele (Campo, 2003; Forslund,
2007; Giuliano et al., 2008; zur Hausen, 2009; Munday et al., 2010; Marklund et al.,
2011).
3.1) Papilomavírus Humano (HPV)
3.1.1) Estrutura e organização do genoma viral
Os Papilomavírus (PVs) apresentam tropismo por células epiteliais e infectam
pele e membranas mucosas de órgãos genitais, esôfago, boca, laringe de mamíferos,
aves e reptéis, causando lesões (de Villiers et al., 2004; Doorbar, 2005). Na maioria dos
casos essas lesões tendem a regredir espontaneamente, sem graves consequências
clínicas. No entanto, algumas proliferações papilomatosas induzidas por tipos
7
Pitol, BCV
específicos de PVs, associadas a determinados fatores de risco, podem evoluir para um
tumor maligno (Matsukura & Sugase, 2001; zur Hausen, 2002; Clifford et al., 2003;
Muñoz et al., 2003).
O Papilomavírus Humano (HPV) é um vírus não envelopado, com simetria
icosaédrica, cujo genoma consiste em dupla fita de DNA circular, com
aproximadamente 8000 pares de bases, envolvido em uma capa protéica, o capsídeo
viral, com 72 capsômeros e diâmetro aproximado de 54nm (de Villiers et al., 2004).
O genoma do HPV é dividido em 8 regiões abertas de leitura (Open Reading
Frames, ORF) e uma região de controle (Long Control Region, LCR). Os genes são
denominados E (early) ou L (late), de acordo com a sua expressão, mais precoce (E) ou
mais tardia (L), nos estágios de diferenciação do epitélio do hospedeiro (Figura 1).
Inicialmente, são expressos E1, E2, E5, E6 e E7. A expressão de E4 ocorre durante todo
o processo. Posteriormente, nos estágios finais da diferenciação, são expressos os genes
estruturais, L1 e L2 (Schiffman et al., 2007; Steben & Duarte-Franco, 2007). Os genes
contidos nas ORFs expressam proteínas específicas, com funções distintas (Figura 1).
As ORFs E1 e E2 codificam proteínas envolvidas na regulação da replicação do DNA
viral; sendo que E2 também está envolvida na transcrição do DNA viral. A proteína E4
contribui diretamente para a liberação de novos vírus na superfície epitelial, pois
desestabiliza as redes de citoqueratina das células. As proteínas codificadas pelas ORFs
E5, E6 e E7 são oncoproteínas responsáveis pela transformação celular acarretada pela
infecção viral. Os genes L1 e L2 codificam as proteínas capsídicas, principal e
secundária, respectivamente (Doorbar, 1996; Hamid et al., 2009; D'abramo &
Archambault, 2011).
A LCR é responsável por regular a expressão e transcrição dos genes virais. Esta
região também contém sítios de ligação para as proteínas virais E1 e E2 e numerosos
sítios de ligação para fatores de transcrição celular (Butz et al., 1993; Kurvinen et al.,
2000; Stoler, 2003; Howley et al., 2006).
3.1.2) Classificação dos Papilomavírus
Os Papilomavírus (PVs) pertencem à família Papillomaviridae e são agrupados
em diferentes gêneros, espécies e tipos. Cada tipo pode ser dividido em subtipos e
variantes (de Villiers et al., 2004; Hazard, 2007; Leto et al., 2011).
8
Pitol, BCV
Figura 1: Organização estrutural do genoma do HPV, destacando a localização e algumas
funções da região reguladora LCR e das ORFs E e L. Fonte: D’Abramo & Archambault, 2011,
modificado.
Um PV é reconhecido como novo tipo viral se ele tiver seu genoma clonado e a
sequência de DNA da ORF L1 diferir em mais de 10% de um tipo viral já conhecido.
Diferentes gêneros de PVs compartilham menos de 60% de similaridade da sequência
da região L1. Diferentes espécies, contidas no mesmo gênero, compartilham entre 60 e
70%. Diferenças entre 2 e 10% da sequência da ORF L1 identificam um novo subtipo
viral e divergências abaixo de 2% identificam uma nova variante (de Villiers et al.,
2004; de Villiers & Gunst, 2009).
Até 2010 foram descritos 29 gêneros da família Papillomaviridae, que abrigam
189 tipos de PVs, dentre os quais 120 foram isolados de humanos, 64 de mamíferos não
humanos, 3 de aves e 2 de reptéis (Bernard et al., 2010).
Em relação ao HPV, a frequência de associação a casos de câncer cervical
possibilitou classificá-los em vírus de baixo e alto risco oncogênico (Muñoz et al.,
2006; Steben & Duarte-franco, 2007).
9
Pitol, BCV
Os HPVs considerados de baixo risco oncogênico, como os tipos 6 e 11, são
responsáveis pelas lesões benignas que atingem a região anogenital, como as verrugas
genitais (condilomas) e uma porcentagem das lesões intraepiteliais escamosas de baixo
grau (LSIL), que geralmente possuem tendência à regressão (Greer et al., 1995;
Koutsky, 1997; Ho et al., 1998). Os HPVs de alto risco oncogênico mais prevalentes
são os tipos 16 e 18. Estes são responsáveis por causar 41-67% das lesões intraepiteliais
escamosas de alto grau (HSIL), 16-32% das lesões intraepiteliais escamosas de baixo
grau (LSIL) e 6-27% das células escamosas atípicas de significado indeterminado
(ASC-US) (Clifford et al., 2006). Estima-se que 70% das neoplasias cervicais sejam
causadas pelos tipos 16 e 18 e em 99,7% dos cânceres de colo de útero encontra-se
algum tipo viral (Koutsky, 1997; Walboomers et al., 1999).
Existem tipos de HPV considerados de risco indeterminado, dependendo da sua
relação com a ocorrência do câncer cervical (Bernard et al., 2010).
3.2) Desenvolvimento do câncer cervical
As neoplasias cervicais surgem via uma série de passos: (1) transmissão do HPV,
(2) infecção viral, (3) remissão ou persistência da infecção, (4) progressão de um clone
de células infectadas para pré-câncer e invasão (Schiffman et al., 2007).
Estes passos são acompanhados de uma série de eventos e modificações
moleculares e celulares que poderão constituir alvos importantes para prognóstico,
diagnóstico e tratamento. A Figura 2 ilustra os passos envolvidos na carcinogênese
cervical (2D) e as alterações celulares que os acompanham nas infecções transitórias ou
persistentes (2A e 2B). A seguir, serão descritos os principais passos na evolução ao
câncer cervical.
10
Pitol, BCV
A
B
C
D
Figura 2: Etapas da carcinogênese cervical. Imagens de: esfregaço cervical coletado em exame
citológico (A); biópsias de colo uterino obtidas em exame anatomopatológico (B); colo do útero
provenientes de colposcopia. Modelo esquemático dos principais passos no desenvolvimento do
câncer cervical (D). O losango verde representa a transmissão do HPV. Fonte: Schiffman et al.,
2007, adaptado.
3.2.1) Transmissão viral
A transmissão do HPV ocorre através do contato direto com o tecido epitelial
(Burchell et al., 2006; Roberts et al., 2007), sendo a relação sexual com um parceiro
infectado a via de infecção mais comum (Gavillon et al., 2010). A probabilidade de
adquirir HPV através de um único contato entre pessoas com lesões genitais está em
torno de 60 a 80% (Oriel, 1971; Barrasso et al., 1987; Boon et al., 1988; TortoleroLuna, 1999; Muller & Bauch, 2010).
Embora as relações sexuais com penetração sejam importantes na transmissão,
admite-se que a aquisição do HPV possa ocorrer, também, de outras formas, como:
contatos sexuais sem penetração, fômites (toalha, roupas íntimas), auto-inoculação ou
perinatal (Marrazo et al., 2001; Schiffman & Kjaer., 2003; Winer et al., 2003).
Independente da forma de contágio, a entrada do vírus nas células epiteliais ocorrerá
11
Pitol, BCV
através de microlesões que promovem a perda da integridade da pele ou da mucosa
(Frazer, 2004).
Estudos sugerem que heparan sulfato proporciona a fixação inicial do HPV no
tecido epitelial (Longworth & Laimins, 2004). O vírus entra na célula por endocitose
mediada por clatrina ou caveolina (Bousarghin et al., 2003; Day et al., 2003). Uma
outra via endocítica, sinalizada por tirosina quinase, que transporta o vírus ao
endossomo tardio/lisossomo também foi descrita (Nicol et al., 2010).
3.2.2) Infecção pelo HPV
Nas mulheres, a infecção pelo HPV é de grande interesse e constitui objeto da
maioria dos estudos sobre esse vírus, devido a sua associação com o câncer cervical. O
HPV infecta também as células epiteliais da região genital masculina, e
aproximadamente 40-48% dos tumores de pênis são atribuídos à infecção pelo
papilomavírus (Chaux & Cubilla, 2012).
No sexo feminino, o HPV infecta o epitélio escamoso estratificado da região
denominada junção escamo-colunar (JEC) e o seu ciclo de vida está diretamente ligado
à diferenciação das células epiteliais (Bodily & Laimins, 2011).
A JEC (Figura 3A) consiste na região de encontro entre o epitélio escamoso
estratificado (ectocérvice) e o epitélio escamoso colunar (endocérvice) (Schiffman et
al., 2007) (Figura 3A).
A localização da JEC é variável, uma vez que ela pode encontrar-se ao nível do
orifício externo do canal endocervical (recém-nascidas) ou mover-se para fora do
mesmo (menarca). Essa dinâmica depende da influência de alguns fatores como idade,
hormônios e período do ciclo menstrual (Crum, 2005).
Na mulher adulta, na qual a JEC encontra-se fora do orifício externo, ocorre a
metaplasia escamosa cervical. Neste processo, o epitélio escamoso estratificado
progressivamente substitui o epitélio glandular, originando a região chamada zona de
transformação cervical, revestida pelo epitélio escamoso metaplásico. O tecido
metaplásico é especialmente susceptível ao potencial carcinogênico das infecções
persistentes pelo HPV (Schiffman et al., 2007). Os vírus penetram no epitélio através de
microlesões e infectam as células localizadas na camada basal, acompanhando a
evolução celular até a superfície (Figura 3B). Nas células basais, o HPV replica seu
12
Pitol, BCV
DNA, utilizando as proteínas virais E1 e E2, primeiras a serem expressas, e a
maquinaria de replicação da célula hospedeira. Nesta fase, o genoma viral encontra-se
como um plasmídio extra-cromossômico (epissomo), separado do DNA celular.
Posteriormente poderá haver a expressão das proteínas virais E6 e E7, que atuam nos
reguladores do ciclo celular, promovendo uma desregulação e um atraso na
diferenciação do epitélio. Este atraso permite a replicação do DNA epissomal viral nas
células epiteliais supra-basais, coordenadamente a replicação dos cromossomos da
célula hospedeira e o genoma do vírus é distribuído para as células filhas. Finalmente,
quando a diferenciação das células epiteliais para queratinócitos maduros ocorre, as
proteínas estruturais do HPV, L1 e L2, são expressas no núcleo da célula. A montagem
dos vírus maduros é iniciada e eles são liberados, tornando-se aptos a infectarem novas
células (Jeon & Lambert, 1995; Frazer, 2004; Bodily & Laimins, 2011).
A
B
Figura 3: Epitélio cervical. A) Colo uterino, evidenciando a localização do epitélio da
endocérvice e da ectocérvice; B) Ampliação do epitélio escamoso estratificado da ectocérvice,
epitélio colunar da endocérvice e da zona de transformação. Os núcleos das células estão
coloridos para indicar a expressão das proteínas virais na diferenciação do epitélio. O losango
verde representa o HPV. Fonte: Bodily & Laimins, 2011, modificado.
13
Pitol, BCV
A infecção por HPVs de alto risco resulta na integração do DNA epissomal ao
genoma da célula hospedeira. Esta integração promove a ruptura do gene viral E2,
causando a superexpressão dos genes E6 e E7, devido à perda da repressão da
transcrição mediada por E2. Por outro lado, nas infecções por HPVs de baixo risco, que
levam à formação de lesões benignas (verrugas), não ocorre integração do DNA viral ao
genoma do hospedeiro (Frazer, 2004).
Ainda não é claro porquê somente em alguns casos ocorre a integração viral,
sendo esta uma das condições necessárias para transformação maligna das células
epiteliais (Southern & Herrington, 1998; Ferenczy & Franco, 2002).
Em resumo, o ciclo da infecção pelo HPV divide-se em: (a) fase “produtiva”, que
consiste no estabelecimento da infecção viral, através da replicação do DNA e
expressão das proteínas virais e/ou (b) fase de “transformação”, característica de HPVs
de alto risco, onde ocorre a integração do DNA viral ao da célula hospedeira (Doorbar,
2005; Schiffman et al., 2007).
A infecção pelo HPV pode manifestar-se de três formas: clínica, latente ou
persistente.
A forma clínica é visível a olho nu e consiste em lesões benignas, as verrugas
genitais (condilomas), formadas a partir da proliferação das células do epitélio
escamoso, local onde ocorre a replicação do DNA do HPV (Stoler, 2003).
Na forma latente, o HPV só pode ser diagnosticado através da pesquisa do DNA
viral, uma vez que o indivíduo não apresenta nenhuma manifestação clínica e possui
citologia/histologia normais. Nesse caso, o DNA viral não se encontra integrado ao
genoma da célula hospedeira e sua replicação ocorre em níveis muito baixos (Stoler,
2003). Não se sabe quanto tempo o vírus pode permanecer no estado de latência
(Schiffman & Kjaer, 2003). A emergência do estado latente explicaria o surgimento de
picos secundários de infecção em mulheres mais velhas (pós-menopausa) e em
indivíduos HIV positivos imunossuprimidos (Sawaya et al., 2003; Strickler et al.,
2005).
Na forma persistente, o genoma do HPV integra-se ao DNA da célula hospedeira,
o que desencadeia mecanismos determinantes para o desenvolvimento do câncer
cervical (Stoler, 2003).
14
Pitol, BCV
3.2.3) Remissão ou persistência da infecção por HPV e/ou das lesões precursoras
3.2.3.1) Remissão
Geralmente a infecção pelo HPV é eliminada 12 a 18 meses após a exposição ao
vírus. Aproximadamente 10% das mulheres não conseguem eliminar a infecção
(Richardson et al., 2003; Stanley, 2008).
A regressão dos estágios pré-câncer para a normalidade, embora menos
frequente que a reversibilidade da infecção viral, também ocorre. Mulheres com
diagnóstico de lesões precursoras, principalmente as de baixo grau podem apresentar
regressão espontânea sem graves consequências clínicas (Wright Jr. et al., 1994; Zhang
et al., 2010).
A remissão da infecção por HPV ou das lesões pré-cancerosas pode ser atribuída
à atuação de mecanismos imunológicos humorais (Bontkes et al., 1999) e celulares (de
Gruijl et al., 1999). A imunidade mediada por células, com atuação das células T CD8+
(citotóxicas) e TCD4+ (auxiliares), é responsável por eliminar a infecção pelo HPV
(Stanley, 2008). Uma apresentação adequada aos linfócitos, realizada pelas proteínas
HLA de classe II (Human Leukocytes Antigens), é necessária para uma resposta imune
eficaz. Diversos estudos demonstraram associações entre os alelos ou haplótipos HLA e
a infecção pelo HPV (Araújo-Souza et al., 2008).
As células de Langerhans encontradas no epitélio escamoso são responsáveis por
desencadear uma resposta imune anti-HPV. No entanto, esta função é inibida pelas
mudanças na expressão de citocinas, no tecido infectado (Stanley, 2008).
Diversos fatores afetam o status imune do indivíduos e, portanto, podem interferir
na remissão da infecção por HPV e das lesões pré-neoplásicas, determinando o retorno à
normalidade ou a persistência e progressão ao câncer. Estes fatores vem sendo alvo de
muitos estudos atualmente (Schiffman et al., 2007; Araújo-Souza et al., 2008; Stanley,
2009).
3.2.3.2) Persistência
A infecção persistente pelos HPVs de alto risco oncogênico é o fator mais
importante para o desenvolvimento do câncer cervical (Woodman et al., 2001; Stanley,
2008).
15
Pitol, BCV
Define-se como persistência viral a detecção de um mesmo tipo de HPV duas ou
mais vezes em um período de aproximadamente 6 a12 meses (Franco et al., 1999; Liaw
et al., 2001; Schiffman & Kjaer, 2003).
A capacidade do vírus HPV de driblar o sistema imune está diretamente ligada a
dois fatos: (1) maior concentração de antígenos virais nas células em estágios finais da
diferenciação epitelial, que estão programadas para a morte celular natural e, portanto,
distantes da vigilância do sistema imune e (2) a replicação viral não induz citólise,
viremia ou qualquer outro sinal que possa desencadear uma resposta inflamatória
(Stanley, 2009).
Se a infecção viral persistir por longos períodos, uma série de eventos
irreversíveis causados pelo vírus pode levar a progressão das lesões nas células do
hospedeiro e, consequentemente, ao desenvolvimento do câncer.
3.2.4) Progressão de um clone de células infectadas para pré-câncer e invasão
A progressão para o câncer cervical está diretamente ligada à atuação das
oncoproteínas E6 e E7 do HPV na maquinaria de controle do ciclo celular, promovendo
a desregulação do mesmo (Boulet et al., 2007; Moody & Laimins, 2010
3.2.4.1) Ciclo celular
O ciclo celular é um processo complexo que envolve proteínas regulatórias que
direcionam a célula através de uma sequência específica de eventos, que resultam na
divisão celular e produção de duas células-filhas (Ward, 2002). É dividido em intérfase
(G1, S e G2) e mitose (M) (Figura 4).
A integridade genômica durante a divisão é verificada por reguladores
específicos, nos pontos de checagem (checkpoints). Caso alguma anormalidade seja
detectada, a progressão do ciclo é interrompida, até que o reparo seja realizado. Se o
reparo não ocorrer, a célula sofre apoptose (Schafer, 1998).
Os complexos formados pelas proteínas denominadas quinases dependentes de
ciclinas (CDKs 1, 2, 4 e 6) e pelas ciclinas (A, B, D e E) são responsáveis por regular a
parada ou progressão do ciclo celular, particularmente nas fases de transição de G1 para
16
Pitol, BCV
S e de G2 para M (Figura 4). As CDKs são ativadas e inativadas ao longo do ciclo. No
estado ativado, determinado, em parte, pelas ciclinas, as CDKs promovem a
fosforilação de proteínas que regulam os principais eventos do ciclo celular. Os níveis
de ciclinas oscilam durante as fases do ciclo celular, uma vez que estas proteínas são
sintetizadas em etapas específicas, de acordo com as necessidades celulares, sendo
degradadas após a utilização (Paulovich et al., 1997).
Figura 4: Complexos ciclinas-CDKs nas fases do ciclo celular. A atividade ciclina/CDK é
bloqueada por uma série de inibidores específicos. CDK = quinase dependente de ciclina; CIC =
ciclina. Fonte: Ward, 2002, modificado.
Fatores de crescimento, provenientes do meio externo, se ligam a receptores
específicos na membrana plasmática das células e induzem as mesmas a entrarem no
processo de divisão celular. Imediatamente ocorre a síntese de ciclina D, que irá se ligar
às CDKs 4 e 6, ativando-as, permitindo a progressão pela fase G1 do ciclo (Jeannon &
W.J., 1998) (Figura 4).
A formação do complexo ciclina E-CDK2 permite o início da fase S e a
duplicação do DNA (Figura 4). A transição de G2 para M é iniciada pela expressão da
ciclina A, que irá formar o complexo ciclina A-CDK2. Na mitose o complexo ciclina BCDK1 estimula a célula a entrar em processo de divisão (Stewart & Pietenpol, 2003).
A atividade dos diferentes complexos ciclinas-CDKs é regulada por proteínas
quinases (Wee1) e fosfatases (Cdc25), níveis das proteínas ciclinas, proteínas do
17
Pitol, BCV
complexo ubiquitina e pela presença ou ausência de proteínas inibidoras de CDKs,
denominadas CDKIs (Bahnassy et al., 2006).
Duas classes de CDKIs foram descritas: a família Cip/Kip, que compreende as
proteínas p21, p27 e p57 e a família INK4a, que compreende as proteínas p15, p16, p18
e p19 (Sherr & Roberts, 1999). Os CDKIs da família INK4a são específicos sobre os
complexos ciclina D/CDK 4 e 6, que atuam em G1. Já os CDKIs da família Cip/Kip são
inespecíficos, atuando sobre diversos tipos de complexos ciclinas/CDKS, como ciclina
E/CDK2, A/CDK2 e ciclina B/CDK1 (Clarke & Chetty, 2001). A Figura 4 indica os
locais de atuação dos complexos ciclinas-CDKs e das CDKIs nas fases do ciclo celular.
3.2.4.2) Mecanismo carcinogênico
Os genes codificadores de proteínas que atuam induzindo ou estimulando a
progressão do ciclo celular são chamados proto-oncogenes. Estes, ao sofrerem algum
tipo de mutação se tornam oncogenes. Já as proteínas envolvidas na repressão do ciclo
são codificadas pelos genes denominados supressores tumorais (Ward, 2002).
As oncoproteínas E7 e E6 do HPV interferem na ação das proteínas supressoras
tumorais pRB e p53, respectivamente. A inibição dos mecanismos exercidos por estas
proteínas, por meio do HPV, permite a instalação do fenótipo maligno (Moody &
Laimins, 2010).
No ciclo celular normal, a pRB encontra-se no seu estado ativo, hipofosforilado,
ligada ao fator de transcrição E2F, impedindo a progressão das células da fase G1 para a
fase S (Figura 5A). Quando a célula é estimulada a se dividir, a associação das ciclinas
D ou E com suas respectivas quinases formam um complexo ativo que promove a
fosforilação da pRB e a liberação de E2F. Ao ser ativado, este fator induz a transcrição
de genes que codificam proteínas importantes na fase S, entre elas, a proteína p16
(Schafer, 1998; Ward, 2002). Esta tem a função de inibir o complexo ciclina D1/CDK 4
e 6 e, consequentemente, a fosforilação da pRB, impedindo a liberação do fator E2F e a
transição da fase G1 para S (Figura 5A).
No epitélio infectado pelo HPV de alto risco oncogênico (Figura 5B), a ligação de
E7 à pRB desfaz o complexo pRB/E2F, resultando na degradação da pRB através do
sistema proteassomo-ubiquitina e na liberação de E2F, que induz a transcrição de vários
genes, inclusive o da p16, tornando esta proteína superexpressa (Cheng et al., 1995;
18
Pitol, BCV
Boyer et al., 1996; Kim & Zhao, 2005; Mansour et al., 2007). E7 também afeta a
expressão de genes da fase S pela interação direta com o fator E2F e com histonas
diacetilases (HDACs), propiciando um ambiente favorável à replicação viral (Hwang et
al., 2002; Longworth & Laimins, 2004).
Por outro lado, a proteína p53, em condições normais, é ativada em resposta a
danos ocorridos na molécula de DNA. A fim de reparar a lesão no material genético a
p53 induz a transcrição do gene p21wap1/cip1, que inibe a fosforilação da pRB e acarreta a
permanência da célula na fase G1 (Figura 5A). Caso o reparo não seja possível, a célula
será encaminhada para a apoptose através da ativação da transcrição de genes próapoptóticos como bax, bcl-2 e c-myc (El-deiry, 1993; Hunter & Pines, 1994; Graña &
Reddy, 1995; Pluquet & Hainault, 2001; Cadwell & Zambetti, 2001).
A atividade transcricional da p53 pode ser inibida quando ela se liga à proteína
MDM-2, uma ligase de ubiquitina que irá marcá-la para degradação (Figura 5A). No
entanto, a p53 exerce uma auto-regulação sobre a transcrição do gene MDM-2. Em
resposta a estímulos celulares, ocorre a ativação da transcrição do gene CDKN2A, que
codifica a proteína p14, que tem como função ligar-se à MDM-2 e impedir a degradação
da p53 (Finlay, 1993; Wu et al., 1993; Haines et al., 1994; Zhang et al., 1998).
No epitélio infectado pelo HPV, uma das maiores consequências da ação de E7
sobre a pRB é o aumento nos níveis da proteína p53 (Figura 5B). Em contrapartida, a
oncoproteína E6 do HPV utiliza muitos mecanismos para inibir a atividade da p53
(Demers et al., 1994).
E6 recruta a proteína E6-AP (E6 associated protein ligase), formando o
complexo E6-E6AP, que se liga à p53, marcando-a para degradação proteolítica através
da via da ubiquitina. A degradação da p53 resulta em diminuição da apoptose e
imortalização celular (Scheffner et al., 1990; Boulet et al., 2007). A Figura 5B ilustra a
interação de E6 e p53.
Em resumo, E7 e E6 agem sinergicamente nas vias pRB e p53 para a
imortalização celular e transformação maligna (Boulet et al., 2007).
19
Pitol, BCV
Figura 5: Mecanismos de controle do ciclo celular. (A) Epitélio normal. (B) Epitélio infectado
pelo HPV, destacando a ação das oncoproteínas E7 e E6 sobre as proteínas pRB e p53,
respectivamente.. Fonte: Pinto et al, 2012, modificado.
3.3) Diagnóstico das lesões intraepiteliais cervicais e do HPV
Atualmente, o diagnóstico das lesões malignas e pré-malignas do colo uterino é
baseado fundamentalmente em três exames: citologia, colposcopia e histologia. Além
destes, as técnicas moleculares para detecção do DNA do HPV e tipagem viral podem
complementar o diagnóstico, apesar de não serem utilizadas na rotina clínica e não
constarem nos guias de condutas atuais.
20
Pitol, BCV
3.3.1) Citologia
Introduzida pelo médico George Papanicolaou na década de 40, a avaliação
citológica das células da cérvice e da vagina foi proposta como forma de triagem do
câncer cervical. Apesar de ser a primeira técnica de rastreamento usada para detecção de
alterações citológicas, ainda hoje é preconizada como a principal estratégia no controle
do câncer do colo do útero, sendo denominado exame preventivo ou de Papanicolaou
(INCA, 2011).
O exame citológico consiste na avaliação das células descamadas esfoliadas da
ectocérvice e endocérvice do colo uterino. A Tabela 1 expõe as nomenclaturas
citopatológica e histopatológica utilizadas desde 1941 para o diagnóstico das lesões
cervicais escamosas, bem como suas equivalências.
A nomenclatura dos exames citopatológicos utilizada no Brasil é baseada no
Sistema de Bethesda (2001). Para os exames histopatológicos, é usada a nomenclatura
de Richart (1965;1967) (INCA, 2011).
Tabela 1: Sistemas de classificação das lesões cervicais.
NIC: neoplasia intraepitelial cervical. ; HSIL: lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau; LSIL:
lesõesintra-epiteliais escamosas de baixo grau; AIS: adenocarcinoma in situ. Fonte: INCA, 2011,
modificado.
O sistema Bethesda foi criado para padronizar laudos citológicos de esfregaços
cervicovaginais. De acordo com a nomenclatura proposta por este sistema, a lesão intra21
Pitol, BCV
epitelial escamosa (SIL) abrange o espectro de atipias escamosas não invasivas
associadas ao HPV, que variam desde alterações celulares associadas a uma infecção
transitória pelo HPV até alterações celulares anormais que representam precursores de
alto grau para um câncer escamoso invasor. Esse espectro se divide nas categorias de
baixo grau (LSIL) e de alto grau (HSIL). As lesões de baixo grau abrangem as
alterações celulares anteriormente denominadas displasia leve e NIC I ao passo que as
lesões de alto grau abrangem displasia moderada, displasia acentuada ou NIC II, NIC
III. Outro conceito adotado, são as células escamosas atípicas de significado
indeterminado (ASCUS), que agrupam as atipias que não estão relacionadas à
reatividade nem a lesões pré-neoplásicas e neoplásicas (INCA, 2011).
Os critérios clássicos para o diagnóstico citológico do HPV, que acometem as
células escamosas são representados pela coilocitose, que pode ser definida como
alteração em células escamosas maduras contendo um, dois ou mais núcleos
discarióticos apresentando uma grande cavidade ou área clara que circunda o núcleo
proeminente, com bordas bem definidas e a zona periférica amiúde em borrão (Koss &
Durfee, 1956; Meisels & Fortin, 1976); e pela disceratose que é um processo anormal
de maturação das células profundas que se apresentam arredondadas, com citoplasma
densamente eosinofílico e núcleo picnótico (Purola & Savia, 1977).
Apesar de a literatura ser unânime em apresentar a coilocitose como critério
patognomônico para o diagnóstico de HPV, tem-se estudado a introdução de novos
critérios morfológicos denominados não clássicos ou secundários para o diagnóstico de
HPV com o objetivo de ampliar a sensibilidade do teste de Papanicolaou aproximandose da sensibilidade obtida em análises histológicas e em métodos de detecção do
DNA/HPV por captura híbrida ou reação em cadeia da polimerase (Collaço & Pinto,
1994). Alguns exemplos de critérios não clássicos são: Bi ou Multinucleação (Luzzatto
et al., 1990); Disceratose Leve (De Borges et al.,1989); Núcleo Hipercromático
(Cecchini et al., 1990); Núcleo em Borrão (Cavaliere et al., 1990); Queratinização
(Hudock et al., 1995), entre outros.
A eficácia da detecção precoce do câncer do colo do útero através do exame de
Papanicolaou, associada ao tratamento em estádios iniciais da doença, tem acarretado
uma redução das taxas de incidência de câncer cervical invasor que pode chegar a 90%.
(Gustafsson et al., 1997).
22
Pitol, BCV
Muitas variáveis podem influenciar na qualidade dos esfregaços cervicais, como:
o método de coleta, preparação da lâmina, fixação do material, coloração, o que pode
gerar resultados falso-positivos e falso-negativos (Perez, 2001; Grace et al., 2002).
Sendo assim, novas tecnologias estão sendo desenvolvidas visando a melhoria da
qualidade e sensibilidade do exame citopatológico, como a citologia em meio líquido e
a leitura automatizada das lâminas (Arbyn et al., 2008; Anttila et al., 2011).
A frequência de realização do exame citopatológico é variável dependendo do
país, porém, os protocolos da American Cancer Society (ACS) e American College of
Obstetricians and Gynecologists (ACOG) recomendam realização anual entre os 21 e 30
anos e a cada dois ou três anos para mulheres com 30 anos ou mais, caso três exames
consecutivos sejam negativos (Wright et al., 2003, CDC, 2005).
Atualmente, no Brasil, o Ministério da Saúde preconiza que a realização do exame
citopatológico deve iniciar aos 25 anos para as mulheres que já tiveram atividade sexual
e seguir até os 64 , uma vez por ano e, após dois exames anuais consecutivos negativos,
a cada 3 anos (INCA, 2011).
Na ocorrência de alterações importantes na citologia, os exames colposcópico e
histológico são recomendados, com o intuito de confirmar a presença da lesão e
classificar a alteração citológica (INCA, 2011).
3.3.2) Colposcopia
A colposcopia é realizada por um aparelho conhecido como colposcópio, que
permite visualizar o colo uterino, sob luz brilhante, com aumento de 10 a 40 vezes
(Silva Filho et al., 2000). As imagens permitem verificar pequenas alterações
impossíveis de serem vistas sem o equipamento. Produtos químicos e corantes para
utilizados para o realce de áreas a serem avaliadas.
O exame é indicado para mulheres que apresentaram resultado anormal do exame
de Papanicolaou. A colposcopia permite um melhor direcionamento da área na qual será
realizada a biópsia (Ferris et al., 1991).
3.3.3) Histologia
O exame histológico ou anatomopatológico (AP) é baseado no critério arquitetural
e celular, sendo considerado o padrão ouro de diagnóstico morfológico. Este exame é
23
Pitol, BCV
realizado em amostras retiradas de uma superfície suspeita de presença de lesão ou
malignidade. A nomenclatura utilizada (classificação de Richart) reúne as lesões
intraepiteliais escamosas em um grupo denominado neoplasia intraepitelial cervical
(NIC), subdividido em NIC I, II e III conforme o grau da lesão (Sellors &
Sankaranarayanan, 2003).
A classificação histopatológica vigente é categorizada em graus I, II e III,
dependendo da proporção da espessura do epitélio que apresenta células maduras e
diferenciadas (INCA, 2011).
Em NIC I, a maturação está presente em dois terços do epitélio e as células
epiteliais contêm atipias variáveis que podem incluir o efeito citopático do HPV
(coilocitose). Além disso, estão presentes discretas anormalidades nucleares, assim
como
ocasionais
figuras
mitóticas
presentes
no
terço
basal
(Sellors
&
Em NIC II a maturação está presente em mais da metade do epitélio e a atipia
nuclear é evidente em ambas as camadas epiteliais. Figuras mitóticas estão presentes em
dois terços da camada basal do epitélio (Sellors & Sankaranarayanan, 2003).
Já em NIC III a maturação pode estar ausente ou confinada ao terço superior do
epitélio. As anormalidades nucleares estão presentes na maioria ou em toda espessura
do epitélio, figuras mitóticas são encontradas em todos os níveis do epitélio e mitoses
atípicas são freqüentes (Sellors & Sankaranarayanan, 2003).
O diagnóstico de carcinoma escamo-celular microinvasivo é baseado na
profundidade da invasão do estroma e atribui-se um limite superior, que de acordo com
a literatura varia de 3 a 5 milímetros. O carcinoma invasor de células escamosas é
composto por células escamosas de grau variado de diferenciação (Sellors &
3.3.4) Técnicas moleculares para detecção do DNA do HPV
Várias metodologias podem ser utilizadas para a pesquisa do DNA do HPV em
amostras clínicas. A escolha da metodologia adequada para o diagnóstico depende da
disponibilidade de infra-estrutura e de recursos (INCA, 2011).
24
Pitol, BCV
Dentre as metodologias disponíveis para a detecção do DNA-HPV podemos citar:
Hibridação In Situ, Hibridação Southern Blotting, Captura Híbrida, Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR).
Para a genotipagem do HPV existem as seguintes técnicas: RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism), Hibridação em Microplaca, Hibridação Reversa,
Microarray (chips de DNA), Sequenciamento, PCR tipo-específica (Saiki, 1988; ElufNeto et al., 1994; Lorincz, 1996; Villa et al., 2000; Iftner & Villa, 2003; Lie et al.,
2005; Molijn et al., 2005; Molden et al., 2005; Rosenblatt et al., 2005; Dalstein et al.,
2009; Nicol et al., 2010).
A possibilidade do uso dos testes moleculares para detecção do DNA-HPV no
rastreamento do câncer cervical está sendo analisada. Foi comprovada a maior
sensibilidade dessas técnicas em comparação ao exame citopatológico, embora a
especificidade seja menor, levando mais mulheres para a colposcopia (Cuzick et al.,
2008). Outra alternativa para evitar que muitas mulheres saudáveis sejam encaminhadas
desnecessariamente para a colposcopia é encaminhar somente aquelas que apresentaram
teste positivo para HPV e exame citopatológico alterado (Leinonen et al., 2009).
É importante destacar que a redução da mortalidade por câncer do colo do útero é
decorrente da realização periódica do exame citopatológico. O teste de HPV, embora
importante, ainda não é usado rotineiramente como método de rastreamento (INCA,
2011).
3.4) Biomarcadores e o diagnóstico do câncer cervical
Um rastreamento eficiente e completo do câncer cervical deve consistir na
realização da citologia cérvico-vaginal. Entretanto, há um interesse na pesquisa de
marcadores moleculares que possam aumentar a especificidade destes testes além de
indicar lesões pré-neoplásicas que apresentem a possibilidade de evolução para o
carcinoma invasor. Assim, os biomarcadores representariam uma alternativa futura para
o prognóstico de lesões nos estágios pré-malignos, auxiliando no tratamento
(Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
A detecção precoce de anormalidades citológicas através do exame de
Papanicolaou é responsável pela redução na incidência e na taxa de mortalidade por
câncer cervical. No entanto, a subjetividade dos critérios morfocitológicos utilizados
25
Pitol, BCV
para liberação de resultados e a incapacidade de diferenciar as lesões com probabilidade
de regredir ou progredir para carcinoma invasivo estão sob questionamentos (Wang et
al., 2004).
As condutas clínicas referente às lesões intraepiteliais escamosas de baixo (LSIL)
e alto grau (HSIL) são muito bem definidas e constam no guia de conduta elaborado
pelo INCA denominado “Diretrizes Brasileiras para o Rastreamento do Câncer do Colo
do Útero” (INCA, 2011). No entanto, a identificação de biomarcadores pode fornecer
informações importantes a respeito da gravidade destas lesões (Anghebem-Oliveira &
Merlin, 2010).
Biomarcador é qualquer molécula que possa ser detectada e medida revelando
processos biológicos normais ou patológicos (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
Um marcador eficiente na triagem do câncer cervical precisa ser sensível e
específico, para não subdiagnosticar os casos que necessitam de tratamento e para
identificar apenas os casos realmente positivos. O marcador deve estar especificamente
associado à progressão da doença, apresentando a capacidade de discriminar lesões de
baixo e alto grau com risco de progredir daquelas com maior chance de regredir
espontaneamente (Wentzensen & von Knebel Doeberitz, 2007).
Como discutido, a carcinogênese cervical está intimamente relacionada com
reguladores do ciclo celular, os quais podem funcionar como possíveis biomarcadores.
Vários têm sido estudados como a ciclina D1, ciclina E, CDK4, inibidores de ciclinas
(p21, p27, p16), p53 e Ki-67 (Bahnassy et al., 2006; Branca et al., 2008; Pinto et al.,
2012). Destes, a p53 tem sido associada com a presença de lesões cervicais neoplásicas
(Herbsleb, 2001; Turkcuoglu et al., 2007) e sua progressão (Wang et al., 2004).
Enquanto, a expressão de proteínas de supressão tumoral, como p16, em células
epiteliais do colo uterino tem indicado lesão de alto grau em vários estudos (Klaes et al.,
2001; Wang et al., 2004; Wang et al., 2005; Bulten et al., 2006). O uso desta proteína
como marcador associado à citologia e histologia tem sido muito discutido (Pinto et al,
2012).
26
Pitol, BCV
3.4.1) Proteína p53
Descrito pela primeira vez em 1979, o gene P53 codifica uma fosfoproteína
nuclear de 53 KD e 393 aminoácidos, nomeada p53 (Lee & Bernstein, 1995; Wang &
Wang, 1996; Akasi & Koeffler, 1998). A proteína p53 tem um papel fundamental na
proliferação das células, uma vez que exerce mecanismos de controle no ciclo celular
(Finlay et al., 1989; Harris, 1996; Wang & Harris, 1997; Brenna & Syrjänen, 2003).
O gene p53 é caracterizado como o mais frequentemente mutado em cânceres
humanos. É possível encontrá-lo com alguma anormalidade em até 50% de neoplasias
de diferentes origens histológicas (Pietsch et al., 2006).
A p53, em seu estado mutado, acumula-se no núcleo da célula devido ao aumento
na sua estabilidade e redução no processo de degradação (Nataraj et al., 1995). Por
apresentar uma maior sobrevida, a proteína pode ser detectada pelo método de imunohistoquímica. Estudos relatam que imuno-histoquímica positiva para p53 ocorre na
maioria dos casos de câncer cervical (Tan et al., 2008).
A relação entre a expressão da p53 e a infecção pelo HPV de alto risco não é
muito bem delineada, uma vez que a porcentagem de positividade da expressão desta
proteína entre grupos HPV positivos e negativos é muito semelhante (Troncone et al.,
1998). Muitos pesquisadores relatam não ter encontrado relação significativa entre a
expressão da p53 e o prognóstico do câncer cervical, o que poderia ser explicado pelo
mecanismo de atuação do HPV sobre a p53, uma vez que a oncoproteína viral E6
promove a degradação desta proteína (Skomedal et al., 1999; Horner et al., 2004;
Bastos, 2007; Bragança et al., 2008; Hanprasertpong et al., 2010; Tosun et al., 2010).
A detecção de anormalidades na proteína p53 em neoplasias é um alvo importante
de vários estudos. Agentes que podem restaurar ou mimetizar a função da p53 parecem
ser uma proposta promissora para terapia do câncer em geral. (Lowe, 1995).
O gene CDKN2A, localizado no cromossomo 9p21, contém 3 éxons e codifica a
fosfoproteína nuclear p16, um importante regulador do ciclo celular (Murphy et al.,
2004).
27
Pitol, BCV
Diversos estudos vêm sendo realizados sobre a função da p16 na gênese do câncer
cervical (Hirama et al., 1996; Kim et al., 1998; Klaes et al., 2001; Sano et al., 2002).
A alta frequência das deleções da p16 em linhagens tumorais sugeriu um papel
importante desta proteína na carcinogênese (Soufir & Basset-Seguin, 2001; Sharpless et
al., 2003).
A hiperexpressão da p16 é uma característica de alterações displásicas e
neoplásicas do epitélio cervical e tem sido atribuída às infecções de HPV de alto risco
oncogênico (Sano et al., 1998; Agoff et al., 2003; Eleutério et al., 2007). Portanto, a
p16 poderia representar um sensível marcador de células com expressão ativa da
infecção pelo HPV (Klaes et al., 2001; Sano et al., 2002).
Outros estudos não confirmam as mutações da p16 nas lesões precursoras do
câncer cervical (Dong et al., 2001). Alguns artigos relatam que a mutação e deleção da
p16 em neoplasia cervical é um evento raro, sendo que não foram detectadas alterações
no gene desta proteína em muitos estudos (Hirama et al., 1996; Tsuda et al., 2003).
Atualmente, a p16 tem sido sugerida como um biomarcador no diagnóstico de
lesões escamosas cervicais de alto grau e também no prognóstico relacionado à
evolução dessas lesões. Acredita-se que a p16 tenha potencial para ser utilizada como
um teste auxiliar aos métodos de rastreamento do câncer cervical (Murphy et al., 2004;
von Knebel Doeberitz, 2001; Godoy et al., 2008; Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
3.4.3) Teste para análise dos biomarcadores
Alguns marcadores podem ser identificados através da técnica de imunohistoquímica que consiste na identificação de antígenos nos tecidos utilizando
anticorpos (Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
Inicialmente, o antígeno liga-se a um anticorpo primário, que por sua vez irá se
ligar a um anticorpo secundário, o qual está associado a um complexo de visualização
(complexo avidina-biotina-enzima-cromógeno ou polímero com amplificação) (Leong
et al., 2010).
Este procedimento é aplicável a secções de parafina, esfregaços e suspensões
celulares. Cada anticorpo reconhece um único antígeno, que pode ser uma proteína de
uma célula normal, neoplásica ou proteínas virais (Leong et al., 2010).
28
Pitol, BCV
Atualmente está disponível um grande número de anticorpos primários para uso
em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos de parafina, permitindo o exame
imuno-histoquímico de biópsias, peças cirúrgicas e de necropsias arquivados por muitos
anos. Esfregaços citopatológicos também podem ser avaliados por exames imunocitoquímicos (Leong et al., 2010).
O antígeno tecidual deve permanecer insolúvel e a sua estrutura terciária não deve
estar alterada para que o sítio antigênico se ligue ao anticorpo. No entanto, as múltiplas
ligações decorrentes do longo período de fixação do tecido em formalina podem
bloquear o acesso de anticorpos aos epítopos alvos, mascarando o antígeno. Dessa
forma, faz-se necessária a recuperação antigênica, que pode ocorrer através de métodos
enzimáticos ou através do calor (Leong et al., 2010).
A técnica de imuno-histoquímica pode sofrer interferência de muitas variáveis
pré-analíticas que influenciam na leitura dos resultados, como: fixação do tecido,
processos de recuperação antigênica, diluição dos anticorpos, tipos de anticorpos,
reagentes utilizados, entre outros. Dessa forma, é imprescindível a padronização de uma
forma de interpretação dos resultados que forneça segurança ao observador (Mulvany
et al., 2008).
Geralmente a análise da imuno-histoquímica é realizada de maneira qualitativa, o
que gera muitas dúvidas em relação à segurança dos resultados. Estudos vêm sendo
realizados com o objetivo de estabelecer uma forma quantitativa de análise, o que seria
um método mais sensível e específico (Sullivan & Chung, 2008).
3.5) Tratamento
Não existe um tratamento definitivo ou de rápida resolução contra a infecção pelo
HPV. Em geral o combate ao vírus depende muito do sistema imunológico de cada
indivíduo, uma vez que a maioria das mulheres que entram em contato com o HPV tem
a capacidade de eliminá-lo espontaneamente (Rosenblatt et al., 2005).
No entanto, existem duas vacinas disponíveis para a comercialização contra o
vírus HPV. São vacinas profiláticas, isto é, que induzem a formação de anticorpos
neutralizantes capazes de prevenir a infecção pelo HPV. Elas são constituídas pela
proteína estrutural do capsídeo viral, a L1, resultando na formação de pseudopartículas
virais, as VLPs (Virus-like particles). Estas são desprovidas do genoma viral e por isso
são consideradas seguras (zur Hausen, 2008). Uma delas, aprovada em 2006, é a vacina
29
Pitol, BCV
quadrivalente (Gardasil®), produzida pelo Laboratório Merck Sharp & Dohme, que
protege contra os tipos 6, 11, 16 e 18 (Lowy & Schiller, 2006; Villa et al., 2005; Villa et
al., 2011). A outra é a vacina bivalente, aprovada em 2008, que protege contra os tipos
de HPV 16 e 18 (Cervarix®, GlaxoSmithKline Biologicals) (Deschuyteneer et al.,
2010).
As vacinas quadrivalente (tipos 6, 11, 16 e 18) e bivalente (tipos 16 e 18) também
podem oferecer proteção cruzada contra os tipos 31 e 45, não cobertos pela vacina
(Einsten et al., 2011).
As vacinas terapêuticas são baseadas na indução da imunidade celular contra
células expressando antígenos virais, visando a regressão das lesões associadas ao HPV.
Ainda não há nenhuma vacina terapêutica disponível no mercado. Estudos com VLPs
combinadas com as proteínas E7/L1 demonstraram algum efeito terapêutico em
modelos animais, mas em humanos têm mostrado pouca eficácia; algumas mulheres
com NIC tiveram regressão da lesão (Thomisson et al., 2008).
Vários aspectos devem ser levantados sobre a vacinação. Embora dados tenham
demonstrado sua eficiência na proteção de mulheres não infectadas, muitas questões
devem ser discutidas, como: faixa-etária da vacinação, grupo a ser vacinado (homens,
crianças), preço, inserção no serviço público e o fato da vacina não proteger contra
muitos tipos virais, entre outros itens (zur Hausen, 2008).
Em relação às alterações citológicas, o Ministério da Saúde preconiza o
seguimento pelos profissionais da saúde, após resultado de exame citopatológico
alterado, de condutas clínicas padronizadas no documento: “Diretrizes Brasileiras para o
rastreamento do Câncer do Colo do Útero (INCA, 2011).
Enfim, o estudo de biomarcadores passíveis de associação com os exames
existentes, é fundamental para auxiliar no prognóstico das lesões precursoras do câncer
cervical e, consequentemente, fornecer informações importantes para futuramente
direcionar o tratamento.
30
4) Metodologia
Metodologia
Pitol, BCV
4.1) Amostragem
Neste trabalho foram utilizadas amostras de biópsias cervicais fixadas em formol
e incluídas em parafina, obtidas dos arquivos do Laboratório Tafuri (LT), localizado em
Belo Horizonte, Minas Gerais (MG).
Fundado em 1959, o LT realiza exames citológicos e anatomopatológicos
particulares e de diversos convênios, incluindo o SUS. Este laboratório foi escolhido
por ser o local para o qual são encaminhadas as biópsias de mulheres residentes em
Ouro Preto.
A amostragem selecionada consistiu de 150 biópsias analisadas no LT, no período
de 2006 a 2011, distribuídas de acordo com o diagnóstico histopatológico (Sellors &
Sankaranarayanan, 2003) em 5 grupos de 30 amostras cada, sendo:
- LB: Lesão Benigna;
- NIC I: Neoplasia Intraepitelial Cervical grau I;
- NIC II: Neoplasia Intraepitelial Cervical grau II;
- NIC III: Neoplasia Intraepitelial Cervical grau III;
- CEI: Carcinoma Epidermóide Invasor.
As mulheres residentes em Ouro Preto e Itabirito foram procuradas e assinaram o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXO 1) permitindo que seu material,
anteriormente coletado e analisado pelo LT, fosse utilizado neste trabalho. O material
proveniente de outras cidades foi avaliado com o consentimento do LT (ANEXO 2),
devido à impossibilidade de contactar as mulheres.
O processo de seleção das amostras, bem como os procedimentos utilizados neste
trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade
Federal de Ouro Preto (UFOP), CEP No 114/2010 (ANEXO 3).
4.2) Imuno-histoquímica
As amostras foram processadas através da técnica de imuno-histoquímica,
utilizando anticorpos monoclonais anti-p16, anti-p53 e anti-L1/HPV. O sistema
utilizado foi o EnVision Dakocytomation (EnVision® + system-HRP AEC, K4004,
DAKO). Os passos realizados neste procedimento são descritos a seguir.
32
Metodologia
Pitol, BCV
4.2.1) Preparação das lâminas
Cortes histológicos com 4µm de espessura foram obtidos no micrótomo rotativo
de parafina modelo MRP 09 – LUPETEC e distendidos em lâminas previamente
preparadas através do procedimento de silanização (ANEXO 4). As lâminas silanizadas
são usadas porque permitem melhor fixação dos cortes durante a realização da técnica.
4.2.2) Desparafinização
As lâminas contendo os cortes histológicos foram desparafinizadas por imersão
em xilol e hidratadas em concentrações decrescentes de álcool, seguidas por água
destilada. O procedimento foi realizado a temperatura ambiente e está detalhado no
ANEXO 5.
4.2.3) Recuperação antigênica
Após desparafinização, os cortes foram imersos em tampão citrato 1mM, pH=6,0
e submetidos a aquecimento em forno de micro-ondas por 12 minutos para recuperação
dos sítios antigênicos. Antes da utilização, o tampão foi pré-aquecido por 6 minutos em
micro-ondas.
4.2.4) Bloqueio da atividade da peroxidase endógena
O bloqueio é necessário para evitar interferência da peroxidase tecidual na
coloração imuno-histoquímica e foi realizado com solução 1% de peróxido de
hidrogênio em metanol. Os cortes histológicos foram incubados nessa solução durante
30 minutos. Em seguida, foram realizadas 3 lavagens (5 minutos cada) com solução de
TBST (Tris-HCl 0,05M, NaCl 0,15M, pH 7,6; Tween 20 0,05%).
33
Metodologia
Pitol, BCV
4.2.5) Anticorpo primário
Os cortes foram incubados com anticorpo primário (anti-p16, anti-p53 ou antiL1/HPV), durante a noite, em câmara úmida a temperatura de 4 a 8o C.
Os anticorpos foram diluídos em Tris-HCl 0,05M contendo Tween 0,1% (antibody
diluent; S3022, DAKO).
Como controle negativo foi utilizado um coquetel de imunoglobulinas de
camundongos – IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgM (Universal Negative Control Reagent;
IS750, DAKO).
A Tabela 2 descreve os anticorpos utilizados, as diluições que foram testadas
assim como o padrão de marcação considerado neste trabalho para cada proteína
analisada.
4.2.6) Anticorpo secundário
Após a incubação com o anticorpo primário, foram realizadas 3 lavagens em
solução de TBST (5 minutos cada) e as lâminas com os cortes foram incubadas com
anticorpo secundário (EnVision® + system-HRP AEC, K4004, DAKO) ligado à enzima
peroxidase (goat anti IgG mouse conjugado com polímero marcado com peroxidase),
por 60 minutos, à temperatura ambiente.
34
Metodologia
Pitol, BCV
Tabela 2: Anticorpos primários e condições utilizadas na imuno-histoquímica.
Proteína
Anticorpo
analisada
Diluições Padrão de coloração analisado
testadas
Fornecedor
Monoclonal mouse antip16 INK4/CDKN2
p16
antibody
SIGMA (K4798)
1:125
1:150
Monoclonal mouse anti-
1: 50
human p53 protein
1: 75
DAKO (M7001)
1: 100
Monoclonal mouse anti-
1:10
human Papillomavirus
1:50
(HPV) DAKO (M3528)
1:100
p53
L1/HPV
1:100
Nuclear
(Wentzensen et al., 2007).
Nuclear
(Tan et al., 2008).
Nuclear, com ocasional
imunorreatividade
citoplasmática
(Iwasaka et al., 1992).
4.2.7) Revelação
Finalizada a reação com o anticorpo secundário, os cortes foram novamente
lavados com TBST (3 vezes, 5 minutos cada) e incubados com o substrato cromógeno
(3-amino-9-ethylcarbazole e H2O2). O tempo de incubação do substrato cromógeno para
p53, p16 e HPV foi padronizado em 20, 15 e 10 minutos, respectivamente. A indicação
da presença das proteínas é representada por precipitado de coloração vermelha no sítio
do antígeno.
4.2.8) Contra-coloração e montagem das lâminas
Após a revelação, os cortes foram lavados 3 vezes (5 minutos cada) em água
destilada. Em seguida, as lâminas foram imersas durante 1 minuto em Hematoxilina de
Mayer (DAKO) e lavadas novamente com água destilada. Finalmente, foram rinsadas
em uma solução de hidróxido de amônio 37mM (LabSynth) por 10 vezes e
35
Metodologia
Pitol, BCV
posteriormente montadas com meio aquoso Faramount Mounting Medium (S3025,
DAKO).
As lamínulas, previamente limpas com detergente extran e álcool 70%, foram
fixadas à lâmina com base para unhas.
4.3) Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE)
Cortes histológicos, das mesmas amostras submetidas ao procedimento de
imuno-histoquímica, foram corados com Hematoxilina-Eosina (HE).
Após desparafinização os cortes foram corados pela Hematoxilina, por 10
minutos e lavados em água corrente, para retirada do excesso do corante. A seguir,
foram diferenciados em álcool acidulado (100 mL de álcool absoluto e 10 gotas de
ácido clorídrico) e novamente lavados em água corrente para evitar acidificação
excessiva. Posteriormente, foram corados pela Eosina, por 30 segundos. Após a última
lavagem em água corrente, foram desidratados, em 2 banhos de álcool absoluto e
levados à estufa a 56ºC para secagem. As lâminas foram montadas com lamínula e
Entellan (Merck).
4.4) Fotodocumentação e análise da marcação imuno-histoquímica
Neste estudo foram documentadas para análise, especificamente, células da junção
escamo-colunar (JEC) ou zona de transformação cervical, região de metaplasia
escamosa ativa, onde o epitélio escamoso estratificado da ectocérvice progressivamente
substitui o epitélio glandular da endocérvice.
As fotos foram obtidas no Laboratório Multiusuários do NUPEB, UFOP. As
lâminas foram observadas em microscopia convencional em campo claro, objetiva de
40X e a imagem foi capturada por uma microcâmera digital Leica DFC340FX acoplada
ao microscópio DM5000B.
A documentação foi realizada em 10 campos por lâmina, selecionados ao acaso.
Somente a coloração nuclear foi considerada como marcação positiva, independente da
intensidade de coloração para as análises quantitativa e qualitativa.
36
Metodologia
Pitol, BCV
Na análise quantitativa foi realizada a contagem dos núcleos positivos e negativos
nos campos fotografados (Schäffer, 2009; Yonamine et al., 2009), utilizando o software
ImageJ, disponível gratuitamente na Internet (macbiophotonics.ca). A contagem
possibilitou a determinação do Índice de Marcação (IM) de cada amostra, ou seja, a
porcentagem de núcleos positivos em relação ao número total de células quantificadas:
Na análise qualitativa (escore) o padrão de imunorreatividade foi observado nos
10 campos fotografados de cada amostra e estas foram classificadas de acordo com três
parâmetros, ilustrados na Figura 6:
(a) distribuição, segundo Klaes et al., 2001: esporádica (<5% de imunorreatividade),
focal (> 5% e <25% de imunorreatividade) ou difusa (>25 % das células foram
imunorreativas);
(b) intensidade, graduada como: imunorreatividade fraca, intermediária ou forte;
(c) topografia, marcação em 1/3 basal, 2/3 basais ou na espessura total do epitélio.
4.5) Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas no software SPSS versão 17.0.
Como os dados não apresentaram distribuição normal foram escolhidos testes não
paramétricos para as análises.
Para avaliar a expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV de acordo com o
diagnóstico histopatológico foram utilizados os testes de Kruskal-Wallis e MannWhitney (análise quantitativa) e o teste Exato de Fisher (análise qualitativa).
O teste exato de Fisher e o teste da correlação de Spearman também foram
utilizados para correlacionar a expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV.
A comparação entre os métodos de análise quantitativa e qualitativa foi realizada
utilizando o coeficiente Kappa. Este tem como valor máximo o 1, que representa total
concordância entre os métodos avaliados. Valores próximos de 0 indicam nenhuma
concordância.
37
Metodologia
Pitol, BCV
A utilização das análises imuno-histoquímicas das proteínas p16, p53 e L1/HPV
no prognóstico e diagnóstico do câncer cervical foi avaliada pela Curva ROC (Receiver
Operating Characteristic) e pelo cálculo da eficiência (Ef) dos testes. As medidas de
qualidade das análises imuno-histoquímicas (sensibilidade e especificidade), de
qualidade do diagnóstico (valores preditivos positivo, VPP e negativo,VPN), a acurácia
e a área sob a curva ROC das análises das referidas proteínas foram calculados
(ANEXO 6).
O diagnóstico histopatológico foi utilizado como padrão-ouro nos cálculos das
medidas de qualidade do teste e do diagnóstico. As mulheres que apresentavam
diagnóstico de LB foram consideradas como negativas e aquelas que apresentavam
qualquer tipo de lesão (NIC I, II, III ou CEI) como positivas.
Valores de p<0,05 foram considerados como evidência de associação significativa
em todos os testes. Também foi calculado intervalo de confiança de 95%, quando
apropriado.
38
Metodologia
Pitol, BCV
Figura 6: Parâmetros considerados na análise qualitativa. Barra = 100µm.
39
5) Resultados
Resultados
Pitol, BCV
5.1) Caracterização da amostra selecionada, revisão e reclassificação dos laudos
anatomopatológicos
Neste trabalho, foram selecionadas da forma mais homogênea possível, as 150
amostras, divididas em 5 grupos de acordo com o diagnóstico histopatológico.
As informações contidas nos laudos fornecidos pelo LT estão apresentadas na
Tabela 3.
A faixa-etária das mulheres selecionadas encontrava-se entre 15 e 82 anos. As
médias e desvios-padrão de idade (anos) foram próximos nos grupos: LB (41±16); NIC
I (35±11); NIC II (38±14); NIC III (36±11) e CEI (48±14).
Tabela 3: Diagnóstico das amostras extraído dos laudos do Laboratório Tafuri.
Cervicite crônica inespecífica (n=6)
LB
Metaplasia escamosa (n=16)
Pólipo endorcervical (n=8)
Ausência de alterações celulares sugestivas do HPV (n=30)
NIC I
Displasia leve, alterações celulares sugestivas de HPV (n=30)
NIC II Displasia moderada, alterações celulares sugestivas de HPV (n=30)
NIC III
Displasia acentuada/carcinoma in situ, alterações celulares sugestivas de HPV
(n=30)
Carcinoma epidermóide invasor moderadamente diferenciado - Grau II (n=13)
CEI
Carcinoma epidermóide invasor pouco diferenciado - Grau III (n=15)
Carcinoma microinvasivo (n=2)
Após a seleção e caracterização das amostras, lâminas de cada paciente, coradas
pelo método de Hematoxilina-Eosina, foram avaliadas. A partir desta análise, as
amostras foram reclassificadas e os grupos ficaram divididos da seguinte forma: LB
(n=25); NIC I (n=34); NIC II (n=27); NIC III (n=28) e CEI (n=36).
As análises estatísticas foram realizadas considerando a distribuição dos grupos
antes e depois da reclassificação. No entanto, não houve diferença estatística em relação
aos resultados. Dessa forma, optou-se pela apresentação dos resultados utilizando a
classificação realizada no LT: 150 amostras, divididas em 5 grupos (LB, NIC I, NIC II,
NIC III, CEI), com 30 mulheres cada.
41
Resultados
Pitol, BCV
5.2) Padronização
A escolha da melhor diluição para os anticorpos primários foi o primeiro passo no
procedimento de imuno-histoquímica.
Os resultados obtidos no teste de diluição podem ser visualizados nas Figuras 7, 8
e 9.
As diluições escolhidas para os anticorpos anti-p16, anti-p53 e anti-L1/HPV
foram 1:125, 1:75 e 1:50, respectivamente.
Nestas diluições foi observada uma coloração nuclear visível com reduzida
marcação citoplasmática, possibilitando a observação e quantificação dos núcleos de
forma precisa.
42
Resultados
Pitol, BCV
Figura 7: Diluições testadas para o anticorpo anti-p16. A) Controle negativo; B) 1:100; C)
1:125; D) 1:150. As setas indicam a região de epitélio escamoso estratificado da junção
escamo-colunar (JEC). Barra = 25 µm.
43
Resultados
Pitol, BCV
Figura 8: Diluições testadas para o anticorpo anti-p53. A) Controle negativo; B) 1:50; C)
1:75; D) 1:100. As setas indicam a região de epitélio escamoso estratificado da junção
escamo-colunar (JEC). Barra = 25 µm.
44
Resultados
Pitol, BCV
Figura 9: Diluições testadas para o anticorpo anti-L1/HPV. A) Controle negativo; B) 1:10; C)
1:50; D) 1:100. As setas indicam a região de epitélio escamoso estratificado da junção escamocolunar (JEC). Barra = 25 µm.
45
Resultados
Pitol, BCV
5.3) Análise da expressão das proteínas de ciclo celular
Os resultados mostraram que a expressão da proteína p16 aumentou
significativamente com a gravidade da lesão, independente do critério de análise,
quantitativo (Tabela 4, p=0,000) ou qualitativo - parâmetro distribuição (Tabela 5,
p=0,000).
Entretanto, a diferença de expressão entre os grupos de lesão variou dependendo
do método de análise.
Na análise quantitativa (Tabela 4), foi observada diferença significativa entre o
grupo LB e todos os demais grupos apresentando algum grau de lesão (p=0,000). A
expressão da p16 nos grupos NIC I e NIC II também foi considerada estatisticamente
diferente daquela nos grupos NIC III (p=0,001 e p=0,003) e CEI (p=0,000 e p=0,001).
O padrão de expressão da p16, embora tenha aumentado de NIC I para NIC II, não
apresentou elevação estatisticamente significativa. Não houve diferença na expressão da
p16 entre os grupos NIC III e CEI (Tabela 4).
Tabela 4: Expressão da proteína p16 de acordo com o diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
p16
N
IM (%)
LB
NIC I
NIC II
NIC III
CEI
p
197
(11,4)
749a
(41,7)
824a
(44,8)
1335a,b,c
(58,6)
1619a,b.c
(58,0)
0,000*
N= média do número de núcleos positivos em 30 mulheres.
IM = média do Índice de Marcação (%) em 30 mulheres.
LB: Lesão Benigna; NIC: Neoplasia Intraepitelial Cervical; CEI: Carcinoma Epidermóide Invasor.
*Teste Kruskal-Wallis.
Teste Mann-Whitney:
a
Diferença estatística, em relação a LB;b Diferença estatística, em relação a NIC I; c Diferença estatística,
em relação a NIC II.
46
Resultados
Pitol, BCV
Na análise qualitativa, foram considerados os parâmetros distribuição, intensidade
e topografia.
O parâmetro distribuição (Tabela 5) foi a análise qualitativa comparável à
avaliação quantitativa. No grupo LB (44,8%), houve predomínio da distribuição
esporádica (< 5% de marcação). Nos grupos NIC I (60,0%), NIC II (70,0%), NIC III
(83,3%) e CEI (86,7%), a distribuição difusa (> 25% de marcação) foi predominante.
Por esta análise, ao contrário do observado na avaliação quantitativa, a expressão da p16
não foi considerada estatisticamente diferente entre os grupos apresentando algum grau
de lesão (Tabela 5, p=0,074).
distribuição de acordo com o diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
Distribuição
p16
LB
NIC I
NIC II
NIC III
CEI
Total***
Esporádica
n (%)
13
(44,8)
7
(23,3)
5
(16,7)
2
(6,7)
0
(0)
27
Focal
n (%)
10
(34,5)
5
(16,7)
4
(13,3)
3
(10,0)
4
(13,3)
26
Difusa
n (%)
6
(20,7)
18
(60,0)
21
(70,0)
25
(83,3)
26
(86,7)
96
Total***
29
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
149
p
0,000*
0.074**
n= número de mulheres; %= porcentagem de mulheres.
*Teste Exato de Fisher: LB vs. NIC I, NIC II, NIC III, CEI.
** Teste Exato de Fisher: Comparação entre os grupos NIC I, NIC II, NIC III, CEI.
*** Participante com marcação ausente foi excluída desta análise.
Os resultados da análise qualitativa dos parâmetros intensidade e topografia
encontram-se nas Tabelas 6 e 7, respectivamente.
A intensidade de marcação da proteína p16 aumentou com a gravidade da lesão,
sendo a fraca mais freqüente no grupo LB (62,1%), a intermediária em NIC I (46,7%) e
NIC II (43,3%) e a intensidade forte predominante em NIC III (56,7%) e CEI (56,7%).
47
Resultados
Pitol, BCV
Associação estatisticamente significativa (p=0,000) foi verificada na análise deste
parâmetro (Tabela 6).
Em relação à topografia, foi possível observar que quanto maior a gravidade da
lesão, maior a área do epitélio com marcação (Tabela 7). Nos grupos LB (44,8%), NIC I
(43,3%) e NIC II (60,0%) a imunorreatividade da p16 ocorreu predominantemente em
2/3 basais do epitélio. Nos grupos NIC III (76,7%) e CEI (86,7%) houve maior
freqüência de marcação no epitélio total. Associação estatisticamente significativa
(p=0,001) também foi verificada na análise deste parâmetro.).
intensidade de acordo com o diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
Intensidade
p16
LB
NIC I
NIC II
NIC III
CEI
Total***
Fraca
n (%)
18
(62,1)
9
(30,0)
9
(30,0)
2
(6,7)
0
(0)
38
Intermediária
n (%)
9
(31,0)
14
(46,7)
13
(43,3)
11
(36,7)
13
(43,3)
60
Forte
n (%)
2
(6,9)
7
(23,3)
8
(26,7)
17
(56,7)
17
(56,7)
51
Total***
29
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
149
P
0,000*
0,000**
.
48
Resultados
Pitol, BCV
topografia de acordo com o diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
Topografia
p16
LB
NIC I
NIC II
NIC III
CEI
Total***
1/3 Basal
n (%)
7
(24,1)
5
(16,7)
1
(3,3)
0
(0)
0
(0)
13
2/3 Basais
n (%)
13
(44,8)
13
(43,3)
18
(60,0)
7
(23,3)
4
(13,3)
54
Epitélio
total
n (%)
9
(31,0)
12
(40,0)
11
(36,7)
23
(76,7)
26
(86,7)
82
Total***
29
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
149
P
0,001*
0,000**
Na Figura 10, pode-se observar o padrão de marcação obtido na imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-p16.
A marcação nuclear para p16 tornou-se mais abundante e intensa com a evolução
da lesão. Uma nítida marcação citoplasmática foi observada em lesões de alto grau (NIC
III e CEI), principalmente no carcinoma invasor.
49
Resultados
Pitol, BCV
Figura 10: Padrão de marcação observado na imuno-histoquímica utilizando anticorpo antip16. A) Controle negativo; B) Lesão Benigna (LB); C) Neoplasia Intraepitelial Cervical grau I
(NIC I); D) Neoplasia Intraepitelial Cervical grau II (NIC II); E) Neoplasia Intraepitelial
Cervical grau III (NIC III); F) Carcinoma Epidermóide Invasor (CEI). As setas indicam a região
de epitélio escamoso estratificado da junção escamo-colunar (JEC). Barra = 50 µm.
50
Resultados
Pitol, BCV
A expressão da proteína p53 não variou com a gravidade da lesão na análise
quantitativa (Tabela 8, p=0,719).
Na avaliação qualitativa do padrão de imunorreatividade da p53, também não foi
encontrada associação estatisticamente significativa em relação aos parâmetros
analisados: distribuição (p=0,349), intensidade (p=0,437) e topografia (p=0,561). Por
isso, optou-se por não apresentar as tabelas relacionadas a este método de análise.
Tabela 8: Expressão da proteína p53 de acordo com o diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
p53
N
IM (%)
LB
NIC I
NIC II
NIC III
CEI
P
1119
(59,7)
1196
(60,8)
1141
(63,0)
1146
(47,6)
1376
(51,5)
0,719*
Na Figura 11, pode-se observar o padrão de marcação obtido na imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-p53.
A marcação nuclear para p53 não variou em relação ao grau da lesão, permaneceu
semelhante em todos os tipos de lesões analisados.
51
Resultados
Pitol, BCV
Figura 11: Padrão de marcação observado na imuno-histoquímica utilizando anticorpo antip53. A) Controle negativo; B) Lesão Benigna (LB); C) Neoplasia Intraepitelial Cervical grau I
(NIC I); D) Neoplasia Intraepitelial Cervical grau II (NIC II); E) Neoplasia Intraepitelial
52
Resultados
Pitol, BCV
5.4) Análise do Papilomavírus Humano (HPV)
Na análise do HPV, inicialmente, foram comparados os dados dos laudos
anatomopatológicos com os resultados da imuno-histoquímica da proteína L1/HPV e
diferenças foram encontradas apenas no grupo LB.
De acordo com o laudo, não foram encontrados coilócitos ou outras alterações
sugestivas de HPV nas amostras de mulheres com diagnóstico de LB. Porém, pela
análise imuno-histoquímica, no grupo LB a maioria das amostras (n=26) apresentou
expressão da proteína viral e apenas 4 foram negativas para L1/HPV.
Por outro lado, houve concordância entre as análises anatomopatológicas e
imuno-histoquímica em relação à presença do HPV em todas as amostras que possuem
qualquer tipo de lesão. NIC I, NIC II, NIC III e CEI apresentaram alterações
citoarquiteturais compatíveis com a ação viral e expressão da proteína L1/HPV.
Nas Tabelas 9, 10, 11 e 12 foram apresentados os resultados da análise imunohistoquímica quantitativa e qualitativa da L1/HPV.
Associação estatisticamente significativa foi verificada entre o padrão de
expressão da L1/HPV e o diagnóstico histopatológico tanto na análise quantitativa
(Tabela 9, p =0,000) quanto na qualitativa - parâmetro distribuição (Tabela 10,
p=0,006).
No critério de avaliação quantitativo, o índice de marcação (IM) aumentou do
grupo LB para NIC II e diminuiu de NIC II para CEI (Tabela 9). Diferença significativa
foi observada entre o grupo LB e todos os demais grupos apresentando algum grau de
lesão (p=0,000). A expressão da L1/HPV no grupo NIC I foi estatisticamente diferente
do grupo NIC III (p=0,018) e não houve diferença estatística em relação ao grupo CEI
(p=0,137).
Na análise qualitativa, foi predominante a distribuição difusa (> 25%) de LB a
NIC II, enquanto de NIC III a CEI foi mais frequente a distribuição focal (5 a 25%,
Tabela 10).
53
Resultados
Pitol, BCV
Tabela 9: Expressão da proteína L1/HPV de acordo com o diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
HPV
N
IM (%)
LB
NIC I
NIC II
NIC III
CEI
p
576
(35,8)
1282a
(63,1)
1509a
(65,6)
1666a,b
(56,6)
1643a
(53,3)
0,000*
Teste Mann-Whitney:
a
Diferença estatística, em relação a LB; b Diferença estatística, em relação a NIC I.
parâmetro distribuição de acordo com o diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
Distribuição
L1/HPV
LB
NIC I
NIC II
NIC III
CEI
Total***
Esporádica
n (%)
9
(34,6)
1
(3,3)
2
(6,7)
4
(13,3)
6
(20,0)
22
Focal
n (%)
4
(15,4)
4
(13,3)
7
(23,3)
16
(53,3)
15
(50,0)
46
Difusa
n (%)
13
(50,0)
25
(83,3)
21
(70,0)
10
(33,3)
9
(30,0)
78
Total***
26
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
146
p
0,006*
0,000**
Em relação ao parâmetro intensidade na avaliação qualitativa (Tabela 11), não foi
observada associação estatisticamente significativa (p=0,317) quando se comparou o
grupo LB com os demais grupos e na comparação entre os grupos com algum tipo de
lesão (p=0,514).
54
Resultados
Pitol, BCV
parâmetro intensidade de acordo com o diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
Intensidade
L1/HPV
LB
NIC I
NIC II
NIC III
CEI
Total***
Fraca
n (%)
2
(7,7)
1
(3,3)
2
(6,7)
2
(6,7)
4
(13,3)
11
Intermediária
n (%)
19
(73,1)
11
(36,7)
17
(56,7)
15
(50,0)
14
(46,7)
76
Forte
N (%)
5
(19,2)
18
(60,0)
11
(36,7)
13
(43,3)
12
(40,0)
59
Total***
26
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
146
p
0,317*
0,514**
A análise da topografia mostrou que no grupo LB (50,0%) a imunorreatividade da
L1/HPV ocorreu predominantemente em 2/3 basais do epitélio, enquanto nos demais
grupos NIC I (76,7%), NIC II (50,0%), NIC III (73,3%) e CEI (96,7%) a frequência de
marcação foi maior no epitélio total. Associação estatisticamente significativa (p=0,009)
foi verificada na análise deste parâmetro (Tabela 12).
Na Figura 12, pode-se observar o padrão de marcação obtido na imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-HPV.
A marcação para a proteína L1/HPV foi bastante variável de acordo com o grau
da lesão. Na LB, observou-se pouca marcação para L1. Em NIC I e NIC II, houve mais
núcleos marcados, com intensidades forte e intermediária, respectivamente. Já em NIC
III e CEI, foi possível perceber uma redução na marcação nuclear para L1.
55
Resultados
Pitol, BCV
parâmetro topografia de acordo com o diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
Topografia
L1/HPV
LB
NIC I
NIC II
NIC III
CEI
Total
1/3 Basal
n (%)
1
(3,8)
0
(0)
1
(3,3)
0
(0)
0
(0)
2
2/3 Basais
n (%)
13
(50,0)
7
(23,3)
14
(46,7)
8
(26,7)
1
(3,3)
43
Epitélio total
n (%)
12
(46,2)
23
(76,7)
15
(50,0)
22
(73,3)
29
(96,7)
101
Total
26
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
30
(100,0)
146
p
0,009*
0,000**
56
Resultados
Pitol, BCV
Figura 12: Padrão de marcação observado na imuno-histoquímica utilizando anticorpo antiL1/HPV. A) Controle negativo; B) Lesão Benigna (LB); C) Neoplasia Intraepitelial Cervical
grau I (NIC I); D) Neoplasia Intraepitelial Cervical grau II (NIC II); E) Neoplasia Intraepitelial
57
Resultados
Pitol, BCV
5.5) Correlação entre a expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV
A análise de correlação foi realizada entre todas as proteínas.
Em relação à p53, nenhum dado interessante ou significativo foi observado.
Portanto, optou-se por apresentar apenas os resultados da correlação entre as análises da
p16 e L1/HPV.
Os dados foram organizados em 4 categorias de acordo com a marcação positiva
ou negativa: (1) L1-/p16-; (2) L1+/p16-; (3) L1+/p16+ e (4) L1-/p16+.
Independentemente do método de análise, foi observada diferença significativa
entre o grupo LB e os grupos apresentando algum grau de lesão (p=0,000, Tabelas 13 e
14). O coeficiente de Spearman (rs=0,507 e rs=0,530) mostrou correlação positiva entre a
expressão da L1/p16 e o diagnóstico histopatológico.
No entanto, na comparação entre os grupos com lesão (NIC I até CEI) foi
detectada uma diferença interessante, dependendo do método de análise utilizado
(Tabelas 13 e 14).
Na análise quantitativa, não houve associação estatisticamente significativa entre
os diferentes graus de lesão (p=0,284, Tabela 13). Observou-se que, nos grupos NIC I
(83,3%), NIC II (70,0%), NIC III (80,0%) e CEI (80,0%), foram predominantes a positividade
para ambas as proteínas [L1(+)/p16(+)].
Por outro lado, na análise qualitativa - parâmetro distribuição (Tabela 14), foi
observada diferença significativa entre os grupos apresentando algum tipo de lesão
(p=0,000). A positividade para ambas as proteínas [L1(+)/p16(+)] foi mais frequente nos
grupos NIC I (50,0%) e NIC II (53,3%), enquanto nas lesões mais graves, NIC III (50,0%) e
CEI (56,7%), o padrão de expressão predominante foi [L1(-)/p16(+)].
Também foi observado na análise quantitativa do grupo LB (66,7%) o predomínio
do padrão de expressão [L1(+)/p16(-)], enquanto foi mais freqüente (56,7%) na análise
qualitativa desse grupo o padrão [L1(-)/p16(-)].
58
Resultados
Pitol, BCV
Tabela 13: Análise da expressão da L1/HPV e p16, pelo método quantitativo, de acordo
com diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
Quantitativo
L1(-)/
p16(-)
L1(+)/
p16(-)
L1(+)/
p16(+)
L1(-)/
p16(+)
Total
LB
n (%)
6
(20,0)
20
(66,7)
4
(13,3)
0
(0)
30
(100,0)
NIC I
n (%)
1
(3,3)
4
(13,3)
25
(83,3)
0
(0)
30
(100,0)
NIC II
n (%)
1
(3,3)
7
(23,3)
21
(70,0)
1
(3,3)
30
(100,0)
NIC III
n (%)
1
(3,3)
4
(13,3)
24
(80,0)
1
(3,3)
30
(100,0)
CEI
n (%)
1
(3,3)
1
(3,3)
24
(80,0)
4
(13,3)
30
(100,0)
Total
10
36
98
6
150
p/rs
0,000*
0,284**
0,507***
n=número de mulheres, %=porcentagem de mulheres.
(-): p16 e L1/HPV com distribuição esporádica (<5%) e focal (5-25%); (+): distribuição difusa (>25%)
*** Coeficiente de Correlação de Spearman.
Tabela 14: Análise da expressão da L1/HPV e p16, pelo método qualitativo (parâmetro
distribuição), de acordo com diagnóstico histopatológico.
Diagnóstico
Qualitativo
L1(-)/
p16(-)
L1(+)/
p16(-)
L1(+)/
p16(+)
L1(-)/
p16(+)
Total
LB
n (%)
17
(56,7)
7
(23,3)
6
(20,0)
0
(0)
30
(100,0)
NIC I
n (%)
2
(6,7)
10
(33,3)
15
(50,0)
3
(10,0)
30
(100,0)
NIC II
n (%)
4
(13,3)
5
(16,7)
16
(53,3)
5
(16,7)
30
(100,0)
NIC III
n (%)
5
(16,7)
0
(0)
10
(33,3)
15
(50,0)
30
(100,0)
CEI
n (%)
4
(13,3)
0
(0)
9
(30,0)
17
(56,7)
30
(100,0)
Total
32
22
56
40
150
p/rs
0,000*
0,000**
0,530***
n=número de mulheres, %=porcentagem de mulheres.
(-): p16 e L1/HPV com distribuição esporádica (<5%) e focal (5-25%); (+): distribuição difusa (>25%)
*** Coeficiente de Correlação de Spearman.
59
Resultados
Pitol, BCV
5.6) Análise da eficiência diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos das proteínas
p16, p53 e L1/HPV
O desempenho dos testes imuno-histoquímicos das proteínas p16, p53 e L1/HPV
foi avaliado utilizando a curva ROC e o cálculo de eficiência (Ef) para o diagnóstico do
câncer cervical. Sensibilidade, especificidade, acurácia, valor preditivo positivo (VPP),
valor preditivo negativo (VPN) e a área sob a curva ROC dos testes das referidas
proteínas, isoladas ou em associação, foram calculados considerando os dois métodos
de análise: quantitativo e qualitativo.
Nas análises da proteína de ciclo celular p53 nenhum dado significativo foi
encontrado, mesmo quando associou-se p53 com as outras proteínas. Sendo assim,
optou-se por apresentar apenas os resultados dos testes da p16 e L1/HPV.
Pela curva ROC (Figura 13), foi possível observar que os resultados obtidos na
análise quantitativa são superiores aos da análise qualitativa, o que era esperado pelo
mostrado na comparação entre os métodos. Na Figura 13, também pode-se notar que a
diferença entre os métodos na curva da p16 foi menor que nas demais e que os
resultados foram mais discordantes em relação à análise da L1/HPV.
De modo geral, independente do critério de análise utilizado, p16 mostrou-se
melhor teste em comparação à L1/HPV (Figura 13, Tabelas 15 e 16): sensibilidade e
especificidade altas e área sobre a curva ROC mais próxima de 1, refletindo melhor
acurácia diagnóstica.
Em relação à L1/HPV, como esperado pela maior discordância entre os métodos
de análise, foram encontradas diferenças mais significativas conforme o critério
utilizado (Figura 13, Tabelas 15 e 16). Na análise quantitativa, o teste L1/HPV
apresentou maior acurácia diagnóstica (77,4%) em comparação ao qualitativo (54,7%).
Maior sensibilidade foi encontrada na análise quantitativa (91,7%), diferentemente da
qualitativa, onde foi observada maior especificidade (56,7%).
O cálculo do VPP e VPN de um teste diagnóstico depende da prevalência de
determinada doença na população e da sensibilidade e especificidade do teste.
Com base na sensibilidade e especificidade obtidas a partir da curva ROC para as
proteínas p16 e L1/HPV, isoladas e associadas, e em dados da prevalência do câncer
cervical no Brasil (p=0,2-0,8) (INCA, 2011) foi possível calcular o VPP, VPN e a
eficiência (Ef) diagnóstica dos testes (Figura 14). Os resultados do método quantitativo
60
Resultados
Pitol, BCV
e qualitativo foram muito semelhantes. Portanto, optou-se por apresentar somente os
gráficos do método quantitativo.
A eficiência (Ef) no diagnóstico do câncer cervical do teste da p16 foi maior que a
das demais proteínas testadas, reforçando a p16 como melhor marcador (Figura 14).
Considerando a prevalência de câncer cervical no Brasil 0,5%, a Ef dos testes no
método quantitativo foi: 85% (p16), 62% (L1/HPV) e 83% (p16 e L1/HPV associados).
Resultados similares, porém menores, de Ef foram obtidos no método qualitativo: 77%
(p16), 55% (L1/HPV) e 62% (p16 e L1/HPV associados).
Não foi observada melhoria no diagnóstico quando o teste p16 foi associado à
análise de HPV por imuno-histoquímica (Figuras 13 e 14, Tabelas 15 e 16).
61
Resultados
Pitol, BCV
Figura 13: Curva ROC para as proteínas p16 e L1/HPV, isoladas ou em associação. A) Método de
análise quantitativo. B) Método de análise qualitativo (distribuição).
p16;
L1/HPV;
L1/HPV e p16.
62
Resultados
Pitol, BCV
em associação, considerando os resultados do método quantitativo.
Proteínas
Sensibilidade
Especificidade
Acurácia
Área curva
(%)
(%)
(%)
ROC
p16
83,3
86,7
84,0
0,850
L1
91,7
20,0
77,4
0,558
L1/p16
79,2
86,7
80,7
0,829
em associação, considerando os resultados do parâmetro distribuição do método
qualitativo.
Proteínas
Sensibilidade
Especificidade
Acurácia
Área curva
(%)
(%)
(%)
ROC
p16
75,0
80,0
76,0
0,775
L1
54,2
56,7
54,7
0,554
L1/p16
41,7
80,0
49,4
0,608
63
Resultados
Pitol, BCV
Figura 14: Valor Preditivo Positivo (VPP), Valor Preditivo Negativo (VPN) e Eficiência (Ef)
diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos de L1/HPV e p16. A) p16. B) L1/HPV e C) p16 e
L1/HPV.
VPP;
VPN;
Ef.
64
Resultados
Pitol, BCV
5.7) Comparação dos métodos de análise imuno-histoquímica: quantitativo x
qualitativo (parâmetro distribuição)
Como mostrado anteriormente, os resultados obtidos por imuno-histoquímica
neste trabalho foram analisados pela quantificação dos núcleos marcados e pela análise
qualitativa da distribuição, intensidade e topografia da marcação (determinação do
escore). O parâmetro distribuição da avaliação qualitativa é equivalente à avaliação
quantitativa, porém menos preciso, uma vez que representa uma observação e não uma
contagem exata. Apesar das análises terem sido realizadas pelo mesmo observador,
foram encontradas diferenças no padrão de expressão das proteínas nestes dois métodos,
o que levou a apresentação e comparação das formas de análise.
Os coeficientes Kappa, obtidos a partir da comparação entre os dois métodos de
avaliação da expressão das proteínas p16, p53 e L1/HPV foram expressos nas Tabelas
17, 18 e 19.
Foi observado valor p<0,05, indicando que o valor de Kappa foi estatisticamente
diferente de zero. Logo, houve algum grau de concordância entre os parâmetros
avaliados. Este grau variou para cada proteína analisada.
O Kappa obtido da análise da marcação da proteína p16 (Tabela 17, k= 0,617)
indicou uma concordância moderada entre os métodos. Em relação à p53, o coeficiente
Kappa (Tabela 18, k=0,413) sugeriu uma fraca concordância e, para L1/HPV, o valor
k=0,172 (Tabela 19) mostrou uma concordância muito fraca. Portanto, as diferenças
entre os métodos quantitativo e qualitativo foram maiores na análise da proteína L1 do
HPV.
65
Resultados
Pitol, BCV
avaliação da expressão da p16.
Qualitativa
Quantitativa
< 5%
5-25%
>25%
Total
< 5%
5-25%
17
2
1
20
8
14
5
27
> 25%
3
10
90
103
Total
28
26
96
150
Kappa
0,617*
(p=0,000)**
*Valor Kappa (0-1). ** Valor-p associado ao valor de Kappa.
avaliação da expressão da p53.
Qualitativa
Quantitativa
< 5%
5-25%
>25%
Total
< 5%
5-25%
1
0
0
1
5
7
2
14
> 25%
3
13
119
135
Total
9
20
121
150
Kappa
0,413*
(p=0,000)**
avaliação da expressão da L1/HPV.
Qualitativa
Quantitativa
< 5%
5-25%
>25%
Total
< 5%
5-25%
5
0
0
5
7
4
0
11
> 25%
14
42
78
134
Total
26
46
78
150
66
Kappa
0,172*
(p=0,000)**
6) Discussão
Discussão
Pitol, BCV
A associação da análise de biomarcadores aos métodos de rastreamento e
diagnóstico do câncer cervical pode melhorar a sensibilidade e a especificidade destes,
reduzindo a grande variabilidade intra e inter-observador nas classificações
morfológicas de citologia e biópsia. Portanto, atualmente, há um grande interesse na
pesquisa de novos marcadores e na possível associação e utilização dos já existentes
para triagem e diagnóstico. Dentre os biomarcadores promissores atualmente
investigados estão as proteínas regulatórias do ciclo celular, principalmente p16
(Tsoumpou et al., 2009; Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010). No sentido de melhoria
dos programas de triagem e diagnóstico do câncer cervical também muito se discute
sobre a inclusão de testes para pesquisa de HPV (Schiffman et al., 2011).
Neste trabalho, a análise do padrão de expressão das proteínas do ciclo celular p16
e p53 e da proteína L1 do HPV em amostras de biópsia de lesões benignas, neoplasias
de diferentes graus e carcinomas forneceu informações interessantes acerca da possível
utilização dessas proteínas no prognóstico e diagnóstico do câncer cervical.
6.1) Proteínas do ciclo celular: p16 e p53
A expressão da p16 aumentou significativamente com a gravidade da lesão neste
estudo. Padrão similar foi encontrado por outros pesquisadores, confirmando que a
evolução das lesões benignas ao câncer cervical é acompanhada de uma crescente
expressão desta proteína (Klaes et al., 2001; Wang et al., 2004; Queiroz et al., 2006a;
Focchi et al., 2007; Mulvany et al., 2008; Salcedo et al., 2008; Huang et al., 2010;
Yonamine et al., 2009; Missaoui et al., 2010; Reuschenbach et al., 2011).
Embora a relação entre a imunoreatividade para p16 e a gravidade das lesões
seja muito estudada e pareça bem estabelecida na literatura, grande variabilidade de
resultados tem sido observada quando se analisa a diferença de expressão entre os graus
da neoplasia. Como a maioria das lesões NIC I e um considerável número de lesões
NIC II regridem espontaneamente, a capacidade para prever o grau da neoplasia
constitui uma questão importante e menos explorada no contexto de prevenção,
diagnóstico e tratamento do câncer cervical.
Neste estudo, foi observado aumento significativo de expressão da p16 entre
NIC I/NIC II e NIC III/CEI, mas não entre NIC I e NIC II ou NIC III e CEI. Portanto,
os resultados apontam que p16, além de ser bom marcador para diferenciar LB de
68
Discussão
Pitol, BCV
qualquer grau de lesão, poderia diferenciar lesões de alto grau, no estágio de NIC II para
NIC III.
A maioria dos estudos aborda apenas que a expressão da p16 aumenta com o grau
da lesão e não enfatiza a diferença de expressão existente entre os graus da neoplasia.
Wang et al. (2004) detectaram expressão da p16 significativamente maior em NICs e
carcinoma quando comparada à cérvice normal ou apresentando apenas inflamação. Do
mesmo modo, Reuschenbach et al. (2011) encontraram uma expressão da p16 com
distribuição focal (5 - 25%) em lesões benignas e difusa (>25%) em NIC I, NIC II, NIC
III e carcinoma.
O padrão de imunorreatividade da p16 com intensidade forte e marcação no
epitélio total foram predominantes em lesões mais graves. De acordo com a literatura,
este padrão de expressão sugere infecção por HPV de alto risco (Wang et al., 2004;
Dray et al., 2005; Hariri & Oster, 2007, Omori et al., 2007; Dijkstra et al., 2010).
A graduação histológica precisa das NICs é de suma importância para o manejo
clínico das pacientes (Martin & O'leary, 2011). Neste contexto, o uso da reação imunohistoquímica para a p16 pode auxiliar na redução das discordâncias diagnósticas e
fornecer informações a respeito do comportamento de lesões com capacidade de
regressão ou progressão.
O padrão de expressão da p53, outra proteína de ciclo celular investigada em
neoplasias intraepiteliais cervicais, é muito menos previsível que o da p16 (Vassallo et
al., 2000; Queiroz et al., 2006a; Tan et al., 2008). Os resultados deste estudo
corroboram com os achados de outros pesquisadores, nos quais a expressão da p53 não
variou com a gravidade da lesão (Skomedal et al., 1999; Bastos, 2007; Bragança et al.,
2008; Hanprasertpong et al., 2010; Tosun et al., 2010). Por outro lado, Wang et al.
(2004) detectaram expressão diminuída ou estável da p53 em relação à progressão de
gravidade da NIC.
Algumas hipóteses são levantadas para explicar o padrão de expressão
diferenciado da p53 obtido em diversos estudos. Uma delas ressalta a mutação da p53.
O gene mutado expressa uma proteína que apresenta maior meia-vida do que a p53
selvagem, levando ao acúmulo no núcleo celular e consequente detecção imunohistoquímica em células neoplásicas (Nataraj et al., 1995; Weller, 1998). Por outro lado,
a inativação da proteína p53 pelo oncogene E6 do HPV de alto risco acarretaria uma
baixa expressão deste marcador em células infectadas (Horner et al., 2004). Dessa
69
Discussão
Pitol, BCV
forma, a obtenção de resultados contraditórios entre muitos pesquisadores induz
questionamentos sobre o papel da p53 no prognóstico das lesões precursoras do câncer
cervical. Portanto, os relatos da literatura sugerem que a imunoexpressão da proteína
p53 não tem valor na avaliação de qualquer grau de NIC ou carcinoma.
Uma limitação importante nos estudos é que cada proteína estudada é apenas uma
pequena parte de uma maquinaria complexa de controle do ciclo celular. A expressão da
p16 e p53 deveria refletir os efeitos da ação dos oncogenes virais E6 e E7 sobre as
células do hospedeiro e, por isso, diferenciar os graus de lesão intraepitelial cervical
(Moody & Laimins, 2010). Entretanto, os estudos confirmam que apenas a proteína p16
apresenta expressão crescente com a gravidade da lesão, sugerindo-a promissora como
marcador na carcinogênese cervical.
Como relatado, a maioria dos estudos sobre p16 foca a correlação entre a
expressão da proteína e o grau de anormalidade citológica ou histológica (Salcedo et al.,
2008; Missaoui et al., 2010; Tosun et al., 2010).). Apenas alguns discutem a inclusão da
análise da p16 como marcador de risco de progressão das lesões displásicas do colo
uterino (Wang et al., 2004; Queiroz et al., 2006a; Yonamine et al., 2009; Reuschenbach
et al., 2011) e a importância da análise imuno-histoquímica da referida proteína no
rastreamento ou triagem do câncer em associação ao teste de HPV ou de outros
marcadores (Agoff et al., 2003; Holladay et al., 2006; Bragança et al., 2008; Godoy et
al., 2008; Anghebem-Oliveira & Merlin, 2010).
6.2) Análise do HPV
A comparação dos dados dos laudos anatomopatológicos fornecidos pelo LT com
os resultados da imuno-histoquímica da L1/HPV mostraram diferenças apenas no grupo
LB. De acordo com o laudo, não foram encontrados coilócitos, ou outras alterações
sugestivas de HPV, nas amostras de mulheres com diagnóstico de LB. Porém, pela
análise imuno-histoquímica, no grupo LB, 87% das amostras (n=26) apresentaram
expressão da proteína viral. Na cito/histopatologia a presença de coilócitos é indicativa
da de infecção viral. Porém, estudos relataram que a ausência de coilocitose não implica
necessariamente na ausência de HPV. Segundo estes pesquisadores a visualização de
um coilócito característico pode depender de uma elevada carga viral (Abadi et al.,
1998; Kruse et al., 2003).
70
Discussão
Pitol, BCV
Nos últimos anos, a inclusão de exames para pesquisa de HPV na triagem do
câncer cervical tem sido amplamente discutida. Embora o teste de HPV seja
predominantemente realizado em amostras de citologia cervical, informações sobre a
presença e tipo viral são também importantes para auxiliar o patologista na revisão do
caso e na avaliação do grau de NIC (Agoff et al., 2003; Godoy et al., 2008; Gatta et al.,
2011; Martin & O'leary, 2011).
Na literatura, a maioria dos trabalhos envolvendo HPV está voltada para detecção
de DNA viral. Os testes para detecção de DNA/HPV não permitem diferenciar entre
infecções latente, subclínica ou clínica. No entanto, a discriminação do estado
infeccioso é importante para o diagnóstico de lesões pré-cancerosas. Poucos e mais
recentes estudos analisam a detecção imuno-histoquímica da proteína do papilomavírus.
Diferentemente da análise de DNA viral, que é sensível e precisa na indicação da
presença do HPV, a imunoreatividade da L1 depende da expressão da proteína viral
naquela condição avaliada e pode indicar a fase da infecção (Yoshida et al., 2008;
Galgano et al., 2010; Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al.,
2010; Gatta et al., 2011)
Neste trabalho, a expressão da proteína L1/HPV aumentou do grupo LB para NIC
II e diminuiu de NIC II para CEI, reforçando os achados de outros pesquisadores.
Huang et al. (2010) também mostraram uma correlação negativa entre L1/HPV e a
gravidade das lesões cervicais, sendo a expressão da L1 estatisticamente maior em NIC
I do que em NIC II, NIC III e carcinoma. Yoshida et al. (2008) também mostraram que
a expressão da proteína L1/HPV reduziu de LSIL para HSIL e carcinoma.
A L1 é uma proteína capsídica do HPV expressa na fase “produtiva” do ciclo de
infecção viral. Na fase de “transformação”, quando ocorre a integração do DNA do
HPV ao da célula hospedeira, a expressão da L1 é gradualmente suprimida (Hilfrich et
al., 2008). Portanto, L1 pode ser detectada frequentemente nas displasias leves e
moderadas, mais raramente nas displasias graves, podendo não ser observada em
carcinomas (Yoshida et al., 2008). Este raciocínio explica os resultados encontrados
neste e em outros estudos.
Foi também sugerido que a ausência da L1/HPV pode reduzir a resposta imune
celular, promovendo assim a progressão das lesões (Hagensee et al., 2000; McMurray et
al., 2001).
71
Discussão
Pitol, BCV
6.3) Proteínas do ciclo celular e HPV
Neste estudo, não foi observada correlação entre p53 e L1/HPV. Estudos
similares, avaliando a proteína L1 viral, não foram encontrados na literatura.
Por outro lado, estudo realizado por Vassallo et al.(2000) avaliou a expressão da
p53 e a presença de DNA/HPV em neoplasias intraepiteliais cervicais. A expressão
desta proteína foi significativamente maior em NIC I quando comparada a NIC II e III e
nenhuma correlação foi encontrada com a presença do vírus.
Quanto à relação da p16 com HPV, alguns estudos mostraram que a
hiperexpressão da p16 em lesões pré-malignas e carcinomas da cérvice uterina pode ser
atribuída às infecções pelo HPV de alto risco oncogênico (Sano et al., 1998; Agoff et
al., 2003; Eleutério et al., 2007). Isto é explicado porque a perda da repressão
habitualmente mediada pelo complexo pRB/E2F sobre o gene da p16 ocorre devido ao
HPV, uma vez que a pRB é inativada pela oncoproteína viral E7. Sendo assim, o fator
E2F livre ativa a transcrição do gene da p16 e de muitos outros necessários para a
progressão para a fase S do ciclo celular, imortalizando a célula (Wang et al., 2004;
Mansour et al., 2007). Neste caso, como a atividade transcricional do E2F não ocorre
via quinases CDKs 4 e 6, a p16 não exerce nenhum tipo de controle no ciclo celular.
Esta proteína apenas se acumula na célula ao longo do tempo, podendo ser útil como
um marcador na infecção ativa por HPVs de alto risco e na evolução das lesões
cervicais (Martin & O'leary, 2011).
Estudos recentes vêm indicando as proteínas p16 e L1/HPV como
biomarcadores interessantes para prognóstico e diagnóstico da infecção pelo HPV e de
neoplasias intraepiteliais cervicais (Yoshida et al., 2008; Galgano et al., 2010;
Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010; Gatta et al., 2011)
Foi relatado que a análise imunohistoquímica da p16 e L1 poderia ser útil para
estimar o potencial biológico das lesões cervicais. Particularmente, quando é difícil
avaliar morfologicamente o grau da lesão, o padrão de expressão da p16/L1-HPV
poderia complementar a análise, direcionando o acompanhamento e tratamento das
pacientes.
Neste trabalho, como em outros estudos (Yoshida et al., 2008; Galgano et al.,
2010; Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010; Gatta et al.,
2011), a marcação de L1/p16 foi dividida em 4 grupos, com significância biológica
72
Discussão
Pitol, BCV
diferente: L1(-)/p16(-); L1(+)/p16(-); L1(+)/p16(+) e L1(-)/p16(+), visando análise
conjunta da expressão das referidas proteínas.
L1(-) pode indicar infecção viral latente ou integração de DNA do HPV no
genoma do hospedeiro e L1(+) indica que o DNA viral está presente como uma forma
produtiva. Por outro lado, p16 indica alteração (p16 +) ou não (p16 -) no ciclo celular.
Portanto, pressupondo teste de DNA/HPV positivo: (a) L1(-)/p16(-) sugere que o
DNA está presente sem qualquer replicação viral ou alteração do ciclo celular em um
estado de latência; (b) L1(+)/p16(-) sugere que o vírus está sendo produzido, mas sem
alteração do ciclo celular; (c) L1(+)/p16(+) sugere fase produtiva de infecção viral com
alteração do ciclo celular e (d) L1(-)/p16(+) sugere integração do DNA/HPV no genoma
do hospedeiro com alteração do ciclo celular.
Assim, alguns estudos mostraram que a seqüência do estado de expressão
L1/p16 altera com o aumento da gravidade da lesão cervical na ordem de L1(-)/p16(-);
L1(+)/p16(-); L1(+)/p16(+) e L1(-)/p16(+) (Yoshida et al., 2008; Hoshikawa et al.,
2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010). A análise qualitativa deste estudo,
similar à realizada nos referidos trabalhos, apontaram na mesma direção.
Entretanto, na avaliação quantitativa das amostras deste estudo, o padrão
L1(+)/p16(+) foi mais freqüente nas lesões mais graves do que L1(-)/p16(+). Isto pode
ter ocorrido devido a diferenças no método de análise da marcação (quantitativo ou
qualitativo) e/ou limitações inerentes a imuno-histoquímica em tecidos parafinados.
6.4) Eficiência diagnóstica dos testes imuno-histoquímicos das proteínas p16, p53 e
L1/HPV
A análise da eficiência diagnóstica da proteína p53 não apresentou nenhum dado
significativo, mesmo quando ela foi associada com as outras proteínas. Este resultado
era esperado, uma vez que a expressão da p53 não apresentou nenhuma diferença
significativa entre os grupos analisados. Sendo assim, optou-se por apresentar apenas os
resultados da p16 e L1/HPV.
Neste estudo, independente do critério de análise utilizado (quantitativo ou
qualitativo), p16 mostrou-se melhor teste em comparação à L1/HPV: sensibilidade e
especificidade altas e área sobre a curva ROC mais próxima de 1.
73
Discussão
Pitol, BCV
A associação das proteínas L1 e p16 não aumentou a acurácia diagnóstica do teste
em relação à análise das proteínas isoladas. Este resultado é contrário aos achados de
outros pesquisadores. Huang et al. (2010) e Ungureanu et al. (2010) mostraram que a
associação de L1 e p16 apresentaram maior acurácia diagnóstica, sugerindo que as
proteínas combinadas são mais eficientes na detecção de lesões precoces com potencial
de evolução. Tal discordância pode ser atribuída aos critérios subjetivos adotados nos
métodos de análise, que contribui para a variabilidade de resultados entre os
observadores.
A eficiência (Ef) no diagnóstico do câncer cervical, calculada com base nos
valores preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN), do teste da proteína p16 foi maior
quando comparada à L1, mesmo quando elas foram analisadas em conjunto. Este
resultado reforça a idéia de que a associação das proteínas não apresentou uma
especificidade diagnóstica superior.
Dessa forma, percebe-se que a proteína p16 pode ser um útil biomarcador na
progressão e diagnóstico do câncer cervical. Este teste pode oferecer suporte ao
seguimento de pacientes com diagnóstico de lesão de baixo grau (NIC I). No entanto,
não se pode descartar a utilidade da L1, pois a análise da expressão desta proteína em
conjunto com a p16 pode fornecer informações importantes acerca do comportamento
das lesões cervicais.
6.5) Análise imuno-histoquímica
As discrepâncias na interpretação dos testes imuno-histoquímicos tanto em
histologia como em citologia reduzem a reprodutibilidade e dificultam a análise
comparativa dos dados de diferentes estudos (Tsoumpou et al., 2009; Martin & O'leary,
2011).
A imuno-histoquímica é uma técnica útil para detecção de biomarcadores em
pesquisa e também no diagnóstico e prognóstico do câncer. No entanto, muitos
pesquisadores destacam que esta técnica requer a normalização e padronização das
muitas variáveis envolvidas, incluindo pré-tratamento da amostra, condições de fixação
do tecido, processo utilizado para recuperação antigênica, especificidade/diluição dos
anticorpos, sistemas de detecção. Outro ponto complexo e altamente discutido e
divergente na literatura é a escolha do método de avaliação da marcação e interpretação
74
Discussão
Pitol, BCV
dos resultados gerados ( Taylor & Levenson, 2006; Mulvany et al., 2008; Leong et al.,
2010).
Poucos estudos descrevem claramente a localização da marcação considerada
(nuclear, citoplasmática ou ambas), a região do epitélio avaliada e o número de campos
ou de células analisados. A maioria ainda utiliza o método de análise qualitativo,
embora muito se discuta sobre avaliação quantitativa e sua automação (Klaes et al.,
2001; Sullivan & Chung, 2008; Yonamine et al., 2009).
Neste estudo, foi escolhida a análise/quantificação apenas da marcação nuclear
por ser predominante, mais fácil de ser observada e por possibilitar maior
reprodutibilidade dos resultados. Alguns estudos também consideraram apenas a
marcação nuclear da p16, enquanto outros compararam as colorações citoplasmáticas e
nucleares (Wang et al., 2004; Wentzensen et al., 2007; Koo et al., 2009). Apesar de não
ter sido quantificada neste estudo, a marcação citoplasmática da p16 foi mais acentuada
a partir de NIC III, similar a outros trabalhos (Koo et al., 2009).
Em relação à proteína p53, a maiorira dos trabalhos considera somente a
marcação nuclear como positiva (Wang et al., 2005; Tan et al., 2008). Neste estudo,
independente do grau da lesão, a marcação nuclear foi predominante.
Na literatura de um modo geral o padrão de marcação considerado como
positivo para a proteína L1/HPV é nuclear (Yoshida et al., 2008; Galgano et al., 2010;
Hoshikawa et al., 2010; Huang et al., 2010; Ungureanu et al., 2010). No entanto,
Iwasaka et al. (1992) relataram a ocorrência de imunorreatividade citoplasmática, o que
corrobora com os achados deste estudo. A presença de marcação citoplasmática foi uma
constante em todos os tipos de lesão, acompanhando a marcação nuclear.
Em relação à área do epitélio, neste estudo, optou-se pela avaliação da junção
escamo-columar por se tratar da região mais propensa à infecção por HPV. Os outros
estudos relatam apenas ter avaliado o epitélio, sem definição da área fotografada para
avaliação (Vassallo et al., 2000; Klaes et al., 2001; Wang et al., 2004; Queiroz et al.,
2006a; Focchi et al., 2007; Wentzensen et al., 2007; Godoy et al., 2008; Mulvany et al.,
2008; Salcedo et al., 2008; Huang et al., 2010; Yonamine et al., 2009; Missaoui et al.,
2010; Reuschenbach et al., 2011).
Depois de definida a localização da marcação que será considerada e a área do
epitélio, o número de campos ou de células a ser analisado deve ser definido e o método
de análise deve ser escolhido.
75
Discussão
Pitol, BCV
Não está bem definido nos estudos, o número de campos ou células analisados
(Salcedo et al., 2008; Yonamine et al., 2009 ). Neste trabalho, foram fotografados 10
campos e procedidas as análises qualitativa e quantitativa.
Na literatura foram descritos métodos de avaliação dos biomarcadores pela
técnica imuno-histoquímica qualitativos e/ou semi-quantitativos (com diferentes
escores) e quantitativos (Queiroz et al., 2006; Yıldız et al., 2007; Godoy et al., 2008;
Salcedo et al., 2008; Yoshida et al., 2008; Koo et al., 2009; Kurshumliu et al., 2009;
Yonamine et al., 2009; Huang et al., 2010). No entanto, escores de pontuação diferentes
são usados na avaliação qualitativa, alguns levando em conta o grau e a intensidade da
marcação e outros baseando-se no percentual de células marcadas. Além disso, os
pontos de corte para a avaliação se um tecido é "positivo" ou "negativo" não estão
padronizados e variam para o mesmo antígeno nos diversos estudos (Klaes et al., 2001;
Agoff et al., 2003; Wang et al., 2004).
O método qualitativo (escore) proposto por Klaes et al. (2001) é o mais
amplamente utilizado para análise de biomarcadores associados às neoplasias
intraepiteliais cervicais. Porém, por ser baseado em critérios subjetivos, apresenta uma
elevada discordância entre os resultados nos diversos estudos devido às variações interobservador.
O método quantitativo mensura exatamente o nível da expressão da proteína in
situ. A quantificação é uma análise muito mais precisa e a difusão deste método poderia
reduzir a variabilidade entre os resultados (Cregger et al., 2006; Sullivan & Chung,
2008). Entretanto, a quantificação ainda é realizada, na maioria dos casos, manualmente
e depende da experiência e atenção do analista. A análise automatizada poderia
melhorar a capacidade de quantificar os resultados e possibilitar a padronização,
facilitando a interpretação dos estudos e tornando possível a aplicação dos
biomarcadores no prognóstico e diagnóstico das neoplasias (Cregger et al., 2006; Taylor
& Levenson, 2006; Sullivan & Chung, 2008; Leong et al., 2010).
Apesar de muitos softwares estarem disponíveis, a forma automatizada da leitura
da imuno-histoquímica ainda não está totalmente padronizada. Dependendo do tipo de
material analisado, devido ao padrão de marcação obtido, pode não ser possível a
realização da análise por meio destes programas. Sendo assim, é evidente a necessidade
de evolução desta metodologia, para que cada vez mais ela possa ser aplicável a
diferentes amostras. Os softwares disponíveis ainda não foram adequados à análise de
76
Discussão
Pitol, BCV
biomarcadores associados às neoplasias intraepiteliais cervicais (Cregger et al., 2006;
Taylor & Levenson, 2006; Sullivan & Chung, 2008; Leong et al., 2010).
Como mencionado anteriormente, neste trabalho os resultados foram analisados
pela quantificação dos núcleos marcados e pela análise qualitativa da distribuição,
intensidade e topografia da marcação (determinação do escore). O parâmetro
distribuição da avaliação qualitativa foi considerado nesta análise como equivalente à
avaliação quantitativa para efeito de comparação entre os métodos.
Foram detectadas algumas diferenças nas análises quantitativa e qualitativa das
proteínas p16 e L1/HPV. Em relação à proteína p53, não foram encontradas diferenças
nos resultados utilizando o método quantitativo ou o qualitativo, apesar da fraca
concordância entre as análises.
Na análise da proteína p16, o método quantitativo permitiu identificar diferenças
na expressão desta proteína entre os grupos que apresentam algum tipo de lesão, o que é
de suma importância, pois o diagnóstico diferencial entre os grupos com lesão de baixo
e alto grau representa a maior dificuldade entre os patologistas (Martin & O'leary,
2011). Já o método qualitativo permitiu apenas a distinção entre LB e os grupos com
algum grau de lesão.
Poucos estudos analisaram p16 quantitivamente nas neoplasias intraepiteliais
cervicais e os resultados foram similares aos achados deste estudo, ou seja, a expressão
da p16 torna-se maior de acordo com a evolução da neoplasia, indicando que esta
proteína pode ser um promissor biomarcador para a diferenciação de pacientes que
poderão ter uma NIC I persistente com a possibilidade de evolução para NIC III e
carcinoma invasivo (Godoy et al., 2008; Yonamine et al., 2009. Já os estudos utilizando
análise qualitativa encontraram resultados similares (Klaes et al., 2001; Wang et al.,
2004; Queiroz et al., 2006a; Salcedo et al., 2008; Huang et al., 2010; Missaoui et al.,
2010; Reuschenbach et al., 2011)
Na correlação do padrão de expressão entre as proteínas p16 e L1/HPV também
foram observadas, neste estudo, diferenças relevantes nos resultados de acordo com o
método de análise utilizado. Na análise quantitativa, não houve associação
estatisticamente significativa entre os diferentes graus de lesão e observou-se
predominância do padrão L1(+)/p16(+) de NICI ao CEI. Por outro lado, na análise
qualitativa, houve diferença significativa entre os graus de lesão e positividade para
ambas as proteínas foi mais frequente nos grupos NIC I e NIC II, enquanto nas lesões
77
Discussão
Pitol, BCV
mais graves (NIC III e CEI), o padrão de expressão predominante foi L1(-)/p16(+). Isto
pode levar a uma diferença de interpretação em relação à possibilidade de integração do
vírus HPV.
Também foi observado na análise quantitativa do grupo LB maior positividade
para L1/HPV, possivelmente por maior precisão na análise.
Não foram encontrados na literatura estudos utilizando o método quantitativo para
análise da proteína L1/HPV isolada nem associada à p16.
Para avaliar o grau de concordância entre os métodos de análise quantitativo e
qualitativo foi calculado o coeficiente Kappa. A maior concordância foi obtida na
análise da proteína p16 (k= 0,617). Este resultado pode ser atribuído ao fato do padrão
de expressão da p16 não gerar dúvidas, facilitando a quantificação e a determinação do
escore. É nítido, mesmo na observação menos apurada, o padrão de marcação desta
proteína. Por outro lado, concordância muito fraca (k=0,172) entre os métodos de
análise foi observada para L1/HPV, possivelmente devido à marcação, no geral, menos
intensa, necessitando de uma observação mais cuidadosa e detalhada, que poderia
induzir o observador a erro na análise do escore (qualitativa).
Em resumo, neste estudo, dependendo do método de análise utilizado, foram
encontradas diferenças significativas nos resultados de p16 e L1/HPV. O método
quantitativo pareceu mais preciso e apresentou vantagem na análise de p16 por permitir
a separação entre os graus de lesão. Os resultados de p16/L1-HPV pelo método
qualitativo foram similares ao de outros estudos levando a uma interpretação, enquanto
a análise quantitativa, por ser mais precisa, divergiu destes estudos, possibilitando outra
interpretação. Portanto, a padronização de todos os procedimentos da imunohistoquímica é fundamental para comparação dos resultados dos diversos estudos de
biomarcadores e a possível inclusão destes na prática clínica para prognóstico e
diagnóstico do câncer, com aproveitamento máximo das informações que eles podem
gerar e sem erros na interpretação dos resultados.
78
7) Conclusão
Conclusão
Pitol, BCV
- A proteína p16 parece promissora como biomarcador no prognóstico da
neoplasia intraepitelial cervical;
- A expressão da proteína p53 não tem valor na avaliação de qualquer grau de NIC
ou carcinoma;
- O padrão de expressão da L1/HPV foi relacionado com o diagnóstico
histopatológico, sugerindo a fase da infecção viral (produtiva ou de transformação);
- A análise conjunta da p16 e L1 pode ser útil para ser aplicada juntamente com a
histologia, auxiliando na diferenciação do grau da lesão, além de sugerir a fase da
infecção (produtiva ou de transformação) e direcionar o acompanhamento das pacientes;
- A utilização dos biomarcadores na rotina depende da padronização de variáveis
relacionadas à técnica de imuno-histoquímica e dos métodos de interpretação dos
resultados;
- O método quantitativo mostrou maior precisão, entretanto, apresenta
dificuldades na padronização e execução.
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9) Anexos
Anexo 1
Pitol, BCV
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
(para utilização de biópsias coletadas anteriormente a este projeto)
“ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE CICLO CELULAR E DE
PROLIFERAÇÃO NAS LESÕES INTRAEPITELIAIS CERVICAIS”
Prezada paciente____________________________________________
Você está sendo convidada a participar de um projeto de pesquisa sobre o câncer
de colo uterino e o papilomavírus humano, também chamado de HPV, principal causa
destes tumores.
Neste projeto, queremos estudar o material de mulheres que tiveram alterações
diferentes no colo uterino (leves a mais graves) para buscar um marcador que possa ser
usado para auxiliar no diagnóstico. Sabe-se que a grande maioria das lesões prémalignas de colo uterino não progredirá para lesões mais acentuadas ou até mesmo para
câncer. Entretanto, nos dias de hoje, não está disponível nenhum marcador para
estabelecer qual lesão irá progredir e qual não irá progredir. Assim, pode ser que
estejam sendo realizados tratamentos desnecessários em lesões que nunca progrediriam
para casos mais graves. Entretanto, como o câncer é uma doença de difícil tratamento
nos estágios mais avançados, a opção é faze-lo em qualquer lesão que tenha o risco de
progredir.
Você realizou há algum tempo um exame preventivo de câncer de colo uterino
(Papanicolaou) que mostrou alterações que levaram o seu médico a solicitar um exame
chamado colposcopia. Neste exame, realizado no Centro Viva Vida em Itabirito, o
médico analisou o colo uterino com uma lente de aumento. Como você apresentou
alteração na colposcopia, foi feita uma biópsia, que é a retirada de uma pequena porção
do colo uterino para ser examinada em laboratório através de microscópio (exame
histológico). O exame histológico foi realizado no Laboratório Tafuri em Belo
Horizonte e forneceu o diagnóstico definitivo das alterações encontradas em seu colo
uterino. De posse deste resultado você, provavelmente foi realizado o tratamento. No
exame histológico geralmente é analisado apenas uma pequena porção do material
obtido nas biópsias. O restante é mantido em arquivo no laboratório, em pequenos
blocos feitos de parafina, durante alguns anos e, depois, descartado no lixo hospitalar,
pois não tem mais utilidade.
O que estamos solicitando a você é a autorização para utilização dos blocos de
parafina da biópsia que você realizou, para ser estudado em nosso projeto de pesquisa.
O material que pretendemos utilizar é excedente, ou seja, já foi usado para o seu
diagnóstico no passado e agora não possui mais utilidade para você, já que o seu laudo
foi emitido, aceito pelo médico e o tratamento já estabelecido. Esclarecemos que o
bloco de parafina com a biópsia somente será retirado do Laboratório Tafuri se você nos
der autorização, assinando este Termo de Consentimento.
103
Anexo 1
Pitol, BCV
Sua participação nesse projeto é voluntária. Você não terá nenhuma vantagem
direta em ceder suas amostras para o projeto porque provavelmente já realizou
tratamento para as lesões de colo uterino que possuía. Na verdade, participando do
projeto você poderá estar ajudando outras pessoas no futuro para que o tratamento das
lesões de colo uterino seja mais melhorado.
Caso o estudo seja interrompido, o bloco de parafina com a biópsia será
devolvido ao Laboratório Tafuri.
Os dados serão armazenados em um computador disponibilizado na sala da
professora Angélica Alves Lima, coordenadora deste estudo, na Escola de Farmácia da
UFOP, localizada à Rua Costa Sena, 171, Centro, Ouro Preto. A professora Angélica é
responsável pela guarda de seu bloco de biópsia e das informações obtidas a partir dele.
Seu nome ou informações que venham a identificar você em nenhum momento
serão revelados e garantiremos seu anonimato em publicações científicas que venhamos
a realizar.
Você poderá esclarecer qualquer dúvida sobre o projeto com a Profa. Angélica
Alves Lima ou com o Prof. Roney Luiz de Carvalho Nicolato, de segunda a sexta-feira,
de 8:00 às 11:00 e de 13:00 às 17:00 horas, no LAPAC ou pelo telefone (31) 35591646. Você também poderá entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal de Ouro Preto no Campus Universitário, Morro do Cuzeiro, ICEB
II, sala 29, pelos telefones (31)3559-1368 ou (31)3559-1370 ou pelo e-mail
[email protected]
Desde já, agradecemos sua colaboração.
Eu, _______________________________________________________, após
esclarecida sobre o projeto de pesquisa, concordo em participar do estudo acima.
Assinatura da Paciente
Assinatura da Coordenadora
Ouro Preto, _____ de ___________________de 20
104
ser
Anexo 2
Pitol, BCV
105
Anexo 3
Pitol, BCV
106
Anexo 4
Pitol, BCV
Protocolo para Silanização de Lâminas
Objetivo: O silano fixa o corte na lâmina impedindo que se solte quando submetido a
alta pressão e temperatura. Deve ser usado em reações imuno-histoquímicas.
Silano (3- aminopropyl Triethoxysilane)
1.
Mergulhar as lâminas em solução de extran 2% (detergente) e deixar
overnight;
2.
Retirar da solução de extran e mergulhar em solução de álcool 70% e deixar
novamente overnight;
3.
Feito isso, limpar as lâminas e dispô-las separadas;
4.
Colocar na solução de Ácido Clorídrico 1N por 20 minutos;
5.
Dar três banhos em água destilada (mergulhos);
6.
Colocar na solução de Ácido Acético glacial 1:4 por 20 minutos;
7.
Secar a temperatura ambiente e cobertas;
8.
Colocar na solução de Silano 2% em acetona por 20 minutos;
9.
Dar um banho rápido em água destilada;
10.
Secar a temperatura ambiente e cobertas, de um dia para outro.
Soluções: Preparar as soluções no dia de usá-las e não reaproveitá-las.
Pra 600 mL de solução:
(suficiente para cobrir a cesta de lâminas)
Ácido Clorídrico a 1N
HCl -------------------------- 50 mL
H2O destilada --------------- 550 mL
Ácido Acético 1:4
Acido Acético ------------------- 150 mL
Etanol ------------------------ 450 mL
Silano 2% em Acetona
Silano ------------------------ 12 mL
Acetona ---------------------- 588 mL
107
Anexo 5
Pitol, BCV
Protocolo de desparafinização:
Solução
Xilol I
Xilol II
Xilol + Álcool 100o I
Álcool 100o I
Álcool 100o II
Álcool 950
Álcool 700
H2O Destilada
108
Tempo ( min)
30
30
30
5
5
5
5
5
Anexo 6
Pitol, BCV
Conceitos e cálculos de sensibilidade, especificidade, acurácia, valores preditivos
positivo (VPP) e negativo (VPN) e eficiência (Ef) dos testes imuno-histoquímicos
das proteínas p16, p53 e L1/HPV para diagnóstico do câncer cervical.
Observações:
a) O diagnóstico histopatológico foi considerado como padrão-ouro;
b) < 25 % de marcação – teste negativo; > 25 % marcação – teste positivo;
c) A faixa de prevalência de câncer cervical no Brasil foi 0,2 a 0,8% (INCA, 2011);
d) VP - verdadeiros positivos; VN - verdadeiros negativos; FP - falsos positivos; FN falsos negativos.
1) Sensibilidade (s): é a probabilidade de um indivíduo avaliado e doente de ter seu
teste alterado (positivo). Número de indivíduos doentes e com teste positivo/número
total de indivíduos doentes;
2) Especificidade (e): é a probabilidade de um indivíduo avaliado e normal ter
seu teste
normal (negativo). Número de indivíduos normais e com teste negativo/ número total
de indivíduos normais;
3) Acurácia (a): proporção de testes verdadeiramente positivos e verdadeiramente
negativos, em relação à totalidade dos resultados. É uma medida da correlação entre o
valor estimado e os valores reais, ou seja, mede o quanto a estimativa que obtemos é
relacionada com o “valor real” do parâmetro;
109
Anexo 6
Pitol, BCV
4) Prevalência (p): número de indivíduos com determinada doença / número de
indivíduos da população;
5) Valor preditivo positivo (VPP): é a probabilidade de um indivíduo avaliado e
com resultado positivo ser realmente doente. Foi avaliado em função da
sensibilidade, especificidade e prevalência do câncer cervical no Brasil.
6) Valor preditivo negativo (VPN): é a probabilidade de um indivíduo avaliado e com
resultado negativo ser realmente normal. Foi avaliado em função da sensibilidade,
especificidade e prevalência do câncer cervical no Brasil.
6) Eficiência diagnóstica: todo exame tem a sua sensibilidade (s) e especificidade (e)
próprias. Para cada conjunto de s e e, pode-se construir um gráfico relacionando VPP e
VPN com p (prevalência). Neste gráfico, as curvas VPP e VPN teriam a mesma direção
(para a direita), mas orientações diametralmente opostas (de baixo para cima e de cima
para baixo, respectivamente). O cruzamento de ambas vai sempre ocorrer num ponto de
prevalência média. As médias de VPP e VPN geram uma terceira curva denominada
curva de eficiência de um teste (Ef) (Kawamura, 2002).
110
Anexo 6
Pitol, BCV
111

EFAR - Diss - Bruna Caroline Vieira Pitol

Transcrição

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