INNO-LiPA CFTR Italian Regional - Biometrix

Rev. 01 – Jun/2013
INNO-LiPA CFTR Italian Regional
Instruções de Uso
USO PRETENDIDO
O INNO-LiPA CFTR Italian Regional é um ensaio de sondas em linha para identificação e
detecção in vitro de 21 mutações do gene humano do regulador de condutância
transmembranar da fibrose cística (CFTR) e as respectivas sequências de tipo selvagem em
amostras de sangue total, swabs bucais e manchas de sangue secas.
Este teste de genotipagem qualitativo fornece informações para o teste do portador em
adultos em idade reprodutiva, pode ser utilizado como uma ajuda na triagem de recémnascidos, assim como no teste de diagnóstico de confirmação.
Não é indicado para efeitos de diagnóstico autônomo ou triagem pré-natal.
O kit também contém reagentes de amplificação destinados para a amplificação do ácido
nucleico de 15 regiões do gene do regulador de condutância da transmembrana da fibrose
cística (CFTR) em apenas uma reação. A reação é realizada através da reação de polimerização
em cadeia (PCR).
O kit INNO-LiPA CFTR Italian Regional fornece um teste de triagem de multiparâmetros para
mutações do gene CFTR, e discrimina entre indivíduos normais saudáveis, portadores
saudáveis e doentes afetados.
PRINCÍPIO DO TESTE
O INNO-LiPA CFTR Italian Regional teste baseia-se no princípio da hibridação reversa. O DNA
amplificado marcado com biotina é quimicamente desnaturado, os filamentos separados são
hibridizados com sondas oligonucleotídicas específicas como linhas paralelas nas tiras de
membrana. Em seguida, é executada a etapa de lavagem rigorosa para remover qualquer
material amplificado hibridizado incompatível.
Após a lavagem rigorosa, a estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina é adicionada e
liga-se a quaisquer híbridos com biotina formados anteriormente. A incubação com uma
solução de substrato contendo um cromógeno resulta em um precipitado púrpuro-castanho.
Esta reação é terminada por uma etapa de lavagem e o padrão de reatividade das sondas é
registrado.
O kit INNO-LiPA CFTR Italian Regional também contém uma solução de iniciador e tampão de
amplificação para a preparação padronizada de material amplificado com biotina. A
amplificação baseia-se na reação de polimerização em cadeia (PCR).
A amostra de DNA que se pretende amplificar por meio de PCR é introduzida em uma mistura
de reagentes que contém um excesso em desoxinucleosídeo 5’-trifosfatos (dNTPs), iniciadores
com biotina e polimerase de DNA Hot Star Taq®. Os iniciadores co-amplificarão o éxon/íntron 4,
o éxon 6a, o éxon 6b, o éxon 7, o éxon 8, o éxon 10, o íntron 10/éxon 11, o éxon/íntron 12, o
íntron 17a/éxon 17b, o éxon 18, o éxon 19, o éxon 20, o éxon 21, o éxon 22 e o éxon 24 do
gene CFTR. Durante o processo de aquecimento, as duas cadeias da hélice de DNA são
separadas (desnaturação) para expor as sequências alvo aos iniciadores.
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Estes iniciadores são complementares às regiões que flanqueiam a sequência alvo. Por
conseguinte, quando aquecidos a uma determinada temperatura, estes iniciadores prendem-se
às regiões alvo (emparelhamento).
Em outra temperatura, e com os dNTPs, a polimerase de DNA HotStar Taq® faz extender os
iniciadores anelados ao longo do molde alvo (extensão). Deste modo são, com um ciclo de
desnaturação, produzidos duas cópias exatas biotiniladas do molde alvo, anelamento e
extensão. Após 30 ciclos, obtêm sequências alvo multiamplificadas com biotina.
Os produtos de amplificação são consequentemente hibridizados com 1 tira de tipagem em
que 41 sondas específicas de sequência são divididas por 38 linhas, uma linha de marcação e
uma linha de controle (figura 1, consulte Resultados).
REAGENTES
Descrição, preparo e condições recomendadas de conservação
-
-
-
Os reagentes, abertos ou fechados, e guardados a uma temperatura de 2 a 8°C nas
embalagens originais, ficam estáveis até à data de expiração do kit. Não congele os
reagentes, com a exceção do tampão de amplificação e da solução do iniciador que
podem ser congelados. Não utilize os reagentes para além da data de validade.
Não se deve guardar o kit junto de qualquer fonte de contaminação com DNA,
especialmente junto de produtos de amplificação de DNA.
Todos os reagentes devem ser levados à temperatura ambiente (20 - 25°C)
aproximadamente 60 minutos antes da utilização e deverão ser recolocados
imediatamente no frigorífico após o uso.
Alterações na aparência física dos reagentes do kit podem indicar instabilidade ou
deterioração.
Recomendamos que guarde o tubo horizontalmente para minimizar a possibilidade de
enrolamento das tiras antes da utilização.
REAGENTES FORNECIDOS
COMPONENTE
QUANTIDADE
Tiras
1x 20
Solução de
Desnaturação
1x 1 mL
Solução de
Hibridação
1x 80 mL
Conjugado 100x
1x 0,8 mL
DESCRIÇÃO
Contém 20 tiras INNO-LiPA CFTR Italian Regional
assinaladas com uma linha vermelha de marcação.
Solução alcalina contendo EDTA. Deve fechar o frasco
imediatamente após a utilização, a exposição
prolongada da solução ao ar resulta na rápida
deterioração da força de desnaturação.
Tampão SSC, com 0,5% SDS, para ser pré-aquecida até
pelo menos atingir os 37°C, mas não pode exceder os
47°C (todos os cristais devem ser dissolvidos antes da
sua utilização).
Estreptavidina marcada com fosfatase alcalina em
tampão Tris com estabilizadores proteicos e 0,01% de
MIT/0,098% CAA como conservante. Prepare uma
solução de trabalho do conjugado através da diluição
de 1/100 em diluente do conjugado. Para o teste
manual, prepare 2 mL de solução de trabalho do
conjugado para cada teste com mais de 2 mL extra. A
solução de trabalho do conjugado permanece estável
durante 24 horas se for armazenada no escuro e à
temperatura ambiente (20 - 25°C).
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Diluente do
conjugado
1x 80 mL
Substrato
BCIP/NBT
100x
1x 0,8 mL
Tampão
Substrato
1x 180 mL
Solução de
Lavagem 5x
1x 80 mL
Tampão de
amplificação
1x 0,30 mL
Solução de
iniciador
1x 0,30 mL
Tabuleiros de
incubação
Cartão de leitura
Folha de
relatório de
dados
Tampão fosfato com NaCl e Triton® contém
estabilizadores proteicos e 0,01% MIT/0,1% CAA como
conservante.
BCIP e NBT em DMF, prepare uma solução de trabalho
do substrato através da diluição de 1/100 em tampão
de substrato. Para teste manual, prepare 2 mL de
solução de trabalho do substrato para cada teste com
mais 2 mL extra. A solução de trabalho do conjugado
permanece estável durante 24 horas se for
armazenada no escuro à temperatura ambiente (2025°C).
Tampão Tris com NaCl e MgCl2. Contém 0,01% de
MIT/0,1% de CAA como conservantes.
Tampão fosfato com NaCl, Triton®, Contém 0,01% de
MIT/0,1% de CAA como conservantes. Contém 0,05%
de MIT/0,5% de CAA como conservantes. Dilua 1/5 em
água destilada antes da utilização: Para teste manual,
prepare 8 mL de solução de trabalho de lavagem para
cada teste com mais 10 mL extra. Armazenada a uma
temperatura de 2-8°C a solução de lavagem de
trabalho permanece estável durante 2 semanas.
Contém todos os dNTPs e 0,05% de NaN3 como
conservantes. Deixe descongelar completamente antes
de utilizar.
Contém iniciadores com biotina, MgCl2 e 0.05% de
NaN3 como conservantes. Deixe descongelar
completamente para poder dissolver o MgCl2
totalmente antes de utilizar e ir para uma temperatura
de 20- 25°C.
3
-
1
Para a identificação de sondas positivas.
2
Para guardar tiras processadas.
MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO
-
Luvas descartáveis
Pontas pipetas estéreis descartáveis (de preferência com filtros de algodão)
Pipetas ajustáveis para fornecer 1-20 µL, 20-200 µL e 200-1000 µL
Microtubos estéreis
Suportes para microtubos
Centrífuga de microtubos
Água destilada e esterilizada em autoclave
Água destilada ou deionizada
Vórtex ou agitador equivalente
Materiais necessários especificamente para amplificação
-
Equipamento e termociclador de DNA
Tubos MicroAmp® PCR (0,2 mL)
Polimerase de DNA Qiagen HotStarTaq® (utilização recomendada de polimerase de
DNA Qiagen HotStart Taq® Categoria n.º 203203)
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Materiais necessários especificamente para o procedimento INNO-LiPA
-
Agitador orbital, recíproco ou oscilador
Definições recomendadas
Agitador orbital:


o diâmetro do movimento circular deve ser igual ou superior a 13 mm.
a velocidade recomendada para um movimento circular de 13 mm é de 160 rpm.
Agitador recíproco:

a velocidade recomendada para o movimento de ida e volta é de 80 movimentos por
minuto.
Agitador oscilador:


o movimento de agitação não deve exceder os 13° para evitar derramar líquido
a velocidade recomendada é de 50 rpm.
-
Sistema de aspiração
Termômetro calibrado
Pinças para manipulação das tiras
Provetas graduadas (10, 25, 50 e 100 mL).
Cronômetro (2 horas ± 1 minuto).
Banho de água com plataforma agitadora (80 rpm; tampa inclinada, temperatura
ajustável para um mínimo de 47°C ± 0,5°C)
Materiais opcionais:
- Multipipetas de dispensação (Multipipetas, Eppendorf® ou equivalente).
- Equipamento para automatização de passos de processamento de tiras. Para mais
informações, contate o distribuidor.
AVISOS E PRECAUÇÕES
-
-
-
Apenas para utilização profissional.
Deve esterilizar por autoclavagem todas as pontas de pipetas e tubos. Recomendamos
a utilização de pontas de pipetas com filtros de algodão. Utilize apenas materiais de
laboratório descartáveis.
Utilize uma ponta de pipeta nova por cada alíquota de amostra.
Não misture reagentes de kits diferentes, exceto se os componentes tiverem códigos de
lote idênticos.
Para evitar a contaminação da PCR, maximize a separação das etapas pré e pósamplificação. Não coloque as amostras, o equipamento ou os reagentes na área onde
executou a etapa anterior. Se for necessário voltar a uma área de trabalho anterior,
realize as etapas de descontaminação adequadas.
Utilize pinças para manipular as tiras e use luvas descartáveis. Não pegue as tiras com
as mãos.
Utilize apenas lápis para escrever nas tiras. Os reagentes do ensaio podem remover a
tinta das tiras.
Para obter resultados precisos, utilize um banho-maria para os passos de lavagem e
hibridização, e verifique se a temperatura é 47°C ± 0,5°C. Não utilize um agitador de ar
quente. Utilize um termômetro calibrado para fazer um controle de temperatura
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-
-
rigoroso. Feche sempre a tampa do banho-maria para manter a temperatura. Se a
temperatura for muito baixa, o ensaio pode produzir resultados falsos positivos; se a
temperatura for muito elevada, pode produzir sinais fracos ou resultados falsonegativos. Utilize um banho-maria com agitação de tampa inclinada para um controlo
de temperatura óptimo.
O movimento gerado pela agitação do banho-maria durante a hibridização e na
lavagem rigorosa pelo agitador orbital ou oscilador durante a revelação da cor é crítico.
Ajuste a velocidade destes instrumentos cuidadosamente para maximizar o movimento
dos reagentes na tira sem respingar as soluções entre as cavidades do trabalho.
Evite respingar a placa com o banho-maria. Ajuste o nível de água no banho-maria para
que fique entre um terço e metade da altura da placa. Evite o deslizamento da placa,
imobilizando-a com pesos.
Não deixe que as tiras sequem entre passos.
Deixe ficar cada tira na mesma cavidade durante o procedimento.
Aspire o líquido de uma cavidade com uma pipeta (esta pode ser instalada em um
aspirador por vácuo).
INFORMAÇÕES DE SEGURANÇA
Tóxico! (T) R61-20/21-36, S53-9-20-23-36/37/39-45-60
Contém N, N-dimetilformamida: SUBS BCIP/NBT 100x.
Irritante! (Xi) R43, S23-24-37-60
Contém 2-cloroacetamida: RINSE SOLN 5x, SUBS BUF, CONJ DIL
Corrosivo! (C) R34, S20-23-26-36/37/39-45-60
Contém hidróxido de sódio: DENAT SOLN
R20/21
Nocivo por inalação e em contato com a pele.
R34
Provoca queimaduras.
R36
Irritante para os olhos.
R43
Pode causar sensibilização em contato com a pele.
R61
Risco durante a gravidez com efeitos adversos na descendência.
S9
Manter o recipiente em um local bem ventilado.
S20
Não comer nem beber durante a utilização.
S23
Não inalar vapor/aerossol.
S24
Evitar o contato com a pele.
S26
Em caso de contato com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e
consultar um especialista.
R36/37/39 Usar vestuário de proteção, luvas e equipamento adequados para proteção
dos olhos/face.
S37
Use luvas adequadas.
S45
Em caso de acidente ou de indisposição, consultar imediatamente o médico (se
possível mostrar-lhe o rótulo).
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S53
S60
Evitar a exposição - obter instruções específicas antes da utilização.
Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resíduos
perigosos.
-
Deve tratar a amostra como potencialmente infecciosa. Deste modo, todos os
componentes sanguíneos e materiais biológicos devem ser considerados como sendo
potencialmente infecciosos e devem ser manipulados como tal. Este teste só deve ser
efetuado por técnicos com formação adequada. Todos os componentes sanguíneos e
materiais biológicos devem ser eliminados em conformidade com os procedimentos de
segurança estabelecidos.



Autoclavagem durante 15 minutos no mínimo a 121°C.
Incineração do material descartável.
Misture os resíduos líquidos com hipoclorito de sódio para que a concentração final seja
de ± 1% de hipoclorito de sódio. Deixar repousar durante a noite antes de eliminar os
resíduos.
Cuidado: Neutralize o líquido residual que contenha ácido antes de adicionar o hipoclorito de
sódio.
-
É necessário utilizar equipamento de proteção pessoal: utilize luvas e óculos de
segurança quando manipular agentes perigosos ou infecciosos.
Manuseie os resíduos de acordo com as diretrizes de eliminação de resíduos da
instituição.
Cumpra todos os regulamentos ambientais, federais, locais e nacionais.
COLETA, MANIPULAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS LiPA
Nota: Os reagentes não são fornecidos.
Extração de DNA: com sangue total
Pode-se utilizar os métodos mais comuns para a extração de DNA por “salting-out” ou métodos
baseados em colunas para preparar o DNA genômico a partir de amostras de sangue total
anticoagulantes-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
Armazene as amostras de DNA a uma temperatura de -15/-25°C.
O DNA extraído deve ter uma concentração ≥ 0,02 ug/µL. A pureza (A260nm/A280nm) deve ser ≥ 1,5.
Extração de DNA: com swabs bucais
Preparo das soluções
1. Solução NaOH 50 mM:
→ Dissolva 0,2 g de NaOH em 50 mL de água destilada esterilizada em autoclavagem.
→ Ajuste o volume para 100 mL.
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2. Tampão Tris HCl 1 M pH 8.0:
→ Dissolva 12,11 g de Tris em 50 mL de água destilada esterilizada em autoclavagem.
→ Ajuste para pH 8.0 com HCI 5 M. → Ajuste o volume para 100 mL.
Protocolo
-
Colete células da boca passando uma escova estéril durante 30 segundos pelo lado
interior da bochecha.
Prepare imediatamente as células coletadas ou armazene-as a uma temperatura
ambiente de 4°C.
Mergulhe a escova em um microtubo de polipropileno contendo 600 µL de NaOH 50 mM
e centrifugue.
Aqueça durante 5 minutos e a 95°C o tubo com a escova lá dentro.
Retire a escova com cuidado.
Neutralize a solução de DNA com 60 µL de tampão Tris 1M pH 8.0 e centrifugue.
Depois da preparação, armazene as células de DNA bucal a uma temperatura de 2 a
8°C ou a -15 a -25°C.
Extração de DNA: manchas de sangue seco
Preparo das soluções
1. NaCl 10mM/EDTA 10mM:
→ Dissolva 0,058 g de NaOH + 0,372 g em 50 mL de água destilada esterilizada em
autoclavagem.
→ Ajuste o volume para 100 mL.
2. 50mM de solução NAOH:
→ Dissolva 0,2 g de NaOH em 50 mL de água destilada esterilizada em autoclavagem.
→ Ajuste o volume para 100 mL.
3. Tampão 1M Tris-HCl pH 7.5:
→ Dissolva 12,11 g de Tris em 50 mL de água destilada esterilizada em autoclavagem.
→ Ajuste para pH 7.5 com 5M HCI. → Ajuste o volume para 100 mL.
Protocolo
-
-
Colete manchas de sangue seco através da aplicação cuidadosa de algumas gotas de
sangue, retiradas do dedo ou do calcanhar, ou manchas de sangue total anticoagulante
EDTA, em papel (filtro) de recolha de amostras absorvente fabricado especialmente
(cartões de papel de filtro Schleicher & Schuell (S&S) 903 ou cartões de papel de filtro
Whatman® BFC-180). O sangue pode saturar o papel e secar ao ar durante um mínimo
de 3 horas, se não for extraído imediatamente.
Prepare o DNA imediatamente ou guarde-o à temperatura ambiente (em um local seco
e escuro).
Seque as manchas de sangue em uma estufa a 80°C durante a 15 - 20 minutos
Corte furos com um diâmetro de 3 mm (foi utilizado um furador S&S; Categoria n.º
10495010) em uma mancha de sangue seco. Coloque dois círculos furados de uma
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mancha de sangue seco em um microtubo de 1,5 mL. Para evitar a contaminação
cruzada entre amostras, lave o furador e o fórceps após a utilização em etanol e fogo.
Adicione 1 mL de NaCl 10mM/EDTA 10mM.
Agite durante 20 - 30 minutos em um agitador Eppendorf.
Elimine o sobrenadante.
Repita este passo de lavagem 3 vezes.
Centrifugue o tampão de lavagem restante a baixa velocidade rpm e elimine o
sobrenadante.
Adicione 150 µL de NaOH 50mM.
Aqueça durante 10 minutos em um bloco de aquecimento a 98°C.
Neutralize com 30 µL de Tris 1M pH 7,5.
Adicione 20 µL de água destilada de autoclave (o volume final é 200 µL).
Após o preparo, guarde a mancha de sangue seco DNA a -15/-25°C.
Preparo da mistura para PCR
Cada componente deve ser adicionado e fornecido na quantidade correta. Quantidades
superiores ou inferiores de reagentes podem resultar em uma amplificação não específica ou
mesmo impedir a amplificação.
Ciclos PCR
Selecione o perfil de temperatura correto para a amplificação do INNO-LiPA CFTR Italian
Regional.
COLETA, PREPARO E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS LiPA
Procedimento de teste de amplificação
Nota:
- Este protocolo para a amplificação multiplex de 15 regiões do gene CFTR foi concebido
para amplificação ótima com tubos MicroAmp® PCR (0,2 mL), termocicladores
GeneAmp® PCR System 9700, HotStar Taq® (Qiagen).
- Este protocolo pode ser utilizado na maioria dos termocicladores comerciais, mas pode
requerer modificações indicadas pelo fabricante do termociclador.
- Antes de proceder à utilização do protocolo, verifique se o mesmo é compatível com o
termociclador do laboratório. Certifique-se de que o termociclador está calibrado antes
de utilizá-lo.
- Tome as precauções necessárias para evitar uma amplificação não específica e
formação de dímeros de iniciadores, que podem afetar os resultados:
- Pré-aqueça (95°C) o bloco de aquecimento do termociclador antes de inserir as
amostras e inicie imediatamente o processo de termociclagem.
- Agite para misturar e rodar os reagentes antes de abrir as suas embalagens.
- A polimerase de DNA HotStar Taq® não é fornecida.
Protocolo de amplificação usando ADN de sangue total
1. Dilua cada DNA genômico em tampão TE para uma concentração entre 0,02 e 0,2 µg/µL.
2. Determine o número de tubos a preparar (N) com a seguinte fórmula: N = número de
amostras DNA + 1 (controlo negativo; sem DNA) + 1
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Utilize ponteiras com filtro de algodão para preparar a mistura principal em um tubo de 1,5 mL
esterilizado por autoclavagem:
(N x 24.3 µL) de água destilada e esterilizada por autoclavagem
+
(N x 10 µL) de tampão de amplificação (tampa transparente)
+
(N x 10 µL) de solução de iniciador AMP CFTR Italian (tampa vermelha)
+
(N x 0.7 µL) HotStar Taq® (N x 3.5 U)
Nota:
Se utilizar uma fonte de enzima Taq alternativa, assegure-se que adiciona 3,5 U por reação e,
se necessário, faça ajustes à quantidade de água destilada e esterilizada em autoclave.
O volume total desta mistura de amplificação é agora (N x 45 µL). Misture por vórtex
brevemente e divida esta mistura principal em alíquotas de 45 µL para (N-1) tubos de
amplificação esterilizados por autoclavagem.
3. Coloque 5 µL (de 0,1 a 1µg) de ADN genômico. Adicione 5 µL de água destilada (sem DNA)
ao tubo de controle negativo.
Nota:
 Não centrifugue nem misture!
 Verifique se a mistura de amplificação está no fundo do tubo!
Avance para o ponto 4.
Protocolo de amplificação com DNA proveniente de swabs bucais ou manchas de sangue seco
1. Determine o número de tubos a preparar (N) com a seguinte fórmula: N = número de
amostras DNA + 1 (controle negativo; sem DNA) + 1
Utilize ponteiras com filtro de algodão para preparar a mistura principal em um tubo de 1,5 mL
esterilizado por autoclavagem:
(N x 19,3 µL) de água destilada e esterilizada por autoclavagem
+
(N x 10 µL) de tampão de amplificação (tampa transparente)
+
(N x 10 µL) de solução de iniciador AMP CFTR Italian (tampa vermelha)
+
(N x 0.7 µL) HotStar Taq® (N x 3.5 U)
Nota:
Se utilizar uma fonte de enzima Taq alternativa, assegure-se que adiciona 3,5 U por reação e,
se necessário, faça ajustes à quantidade de água destilada e esterilizada em autoclave.
O volume total desta mistura de amplificação é agora (N x 40 µL).
Misture por vórtex brevemente e divida esta mistura principal em alíquotas de 40 µL para (N-1)
tubos de amplificação esterilizados por autoclavagem.
2. Pipete 10 µL da preparação de DNA. Adicione 10 µL de água destilada (sem DNA) ao tubo
de controle negativo.
Nota:
 Não centrifugue nem misture!
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
Verifique se a mistura de amplificação está no fundo do tubo!
Avance para o ponto 4.
4. Coloque as amostras no bloco de aquecimento pré-aquecido e calibrado (consulte as
Instruções do fabricante do termociclador). Inicie o programa de amplificação concebido para a
amplificação INNO-LiPA CFTR Italian Regional Amplification.
Perfil de amplificação do INNO-LiPA CFTR Italian Regional (tipo de ciclador: PE-2400, PE-9600,
PE-9700):
ETAPA
TEMPERATURA
TEMPO
OBSERVAÇÕES
Consulte as instruções do fabricante da
polimerase de DNA Hot Star Taq.
1.
Desnaturação
95°C.
15 min
2.
Desnaturação
95°C.
1 min
57°C.
1 min
68°C.
1 min
68°C.
10 min
Anelamento dos
iniciadores
Extensão dos
4.
iniciadores
3.
5.
Alongamento
Repita 30 vezes os passos 2, 3 e 4 do
ciclo.
-
Nota: O mesmo perfil de amplificação é utilizado para todos os produtos INNO-LiPA CFTR.
5. Após o processo de amplificação, utilize as amostras amplificadas imediatamente com as
tiras de teste INNO-LiPA CFTR Italian Regional ou guarde as amostras a -15/-25°C.
Nota: Não armazene os produtos de amplificação de DNA juntamente com reagentes de
amplificação não utilizados.
RESULTADOS DA AMPLIFICAÇÃO
Visualização
A presença de produtos amplificados pode ser verificada com um gel de agarose a 2%. Depois
de colocar 10 µL do produto amplificado por poço, espera-se o seguinte padrão:
Íntron/Éxon
Comprimento (em bp)
Exon8
521
Exon10
491
Exon20
473
Exon6b
470
Exon24
436
Intron10/exon11
425
Exon19
411
Intron17a/exon17b
395
Exon18
348
Bandas visíveis em um gel de agarose a 2%
Banda 1
Banda 2
Banda 3 (pouca ampla)
10
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Exon21
341
Exon7
341
Éxon/intron12
331
Éxon/intron4
304
Exon6a
301
Exon22
297
Validação
Inclua pelo menos um controle negativo cada vez que realize uma amplificação.
Tal como sucede com qualquer outro novo procedimento de laboratório, enquanto não for
alcançado um grau de confiança mais elevado quanto à execução correta do procedimento do
teste, deve ser considerada a inclusão de controles positivos e negativos adicionais. Se for
desejável a inclusão dum controle positivo adicional, utilize uma amostra conhecida como
positiva.
PROCEDIMENTO DE TESTE LiPA
O procedimento LiPA padrão descreve o teste de uma tira em uma cavidade. No entanto, um
estudo de equivalência mostrou que o INNO-LiPA CFTR Italian Regional pode ser testado na
mesma cavidade do INNO-LiPA CFTR Deletions + 6. Por conseguinte, deve adicionar 10 µL de
produtos de amplificação individuais a 10 µL de solução de desnaturação, enquanto mantém
todos os outros parâmetros de protocolo iguais.
Procedimentos de manipulação
Manipulação das tiras
-
As faixas servem apenas para utilização individual!
Não pegue as tiras com as mãos, utilize pinças limpas.
Utilize um lápis para identificar as tiras do teste. Não utilize canetas, etc. Escreva a ID
(identificação) acima da linha de marcação das tiras.
Coloque as tiras de teste, com o lado da membrana virado para cima (este lado está
assinalado) nas cavidades.
Durante as várias etapas de incubação, as tiras de teste devem permanecer na mesma
cavidade.
As tiras não utilizadas ou processadas devem ser mantidas ao abrigo de luz forte e do
calor.
Para interpretar, tapar ou armazenar as tiras reveladas, aguarde até que estas estejam
completamente secas.
Tiras processadas e secas devem de preferência ser armazenadas no escuro a
temperatura ambiente (20-25°C).
Não reutilize as cavidades.
Instruções para a incubação manual
-
A incubação a 47°C ± 0,5°C durante a hibridização e a lavagem rigorosa são os passos
mais críticos para evitar sinais falsos positivos (temperatura muito baixa) ou falsos
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-
-
-
-
negativos/muito fracos (temperatura muito elevada). Um de banho-maria de agitação,
com tampa inclinada, garante um melhor controlo das variações de temperatura. É
necessário realizar um controlo rigoroso da temperatura com um termómetro calibrado.
Deve sempre fechar a tampa do banho-maria para evitar sinais positivos falsos durante
a incubação.
Não utilize um agitador de ar quente para efetuar a hibridação e a lavagem rigorosa.
Para a hibridação e a lavagem rigorosa deve colocar as cavidades na plataforma
agitadora do banho-maria. Ajuste o nível da água entre 1/3 e 1/2 da altura da cavidade.
Certifique-se que as cavidades não boiem na água. A água deve estar em contato direto
com as cavidades.
As etapas de incubação para a revelação da cor devem decorrer entre os 20 e os 25°C.
Uma temperatura inferior aos 20°C pode causar resultados mais fracos. Uma
temperatura superior aos 25°C pode causar uma cor de fundo acentuada e/ou sinais
positivos falsos.
A amplitude do movimento gerado pelo banho-maria de agitação (procedimento de
hibridização) e o agitador (procedimento de revelação de cor) é crítico para atingir a
sensibilidade máxima e as manchas homogéneas. A superfície da tira deve ficar
totalmente submersa. A amplitude deve ser o mais alta possível e de tal forma que o
líquido e as tiras de teste se movam para frente e para trás na cavidade. No entanto, o
derrame de líquido pelos cantos da cavidade deve ser evitado!
Isto pode levar à contaminação cruzada e a resultados inválidos.
Não tampe a placa. Durante as incubações de hibridação e de lavagem rigorosa pode
deixar as cavidades destapadas no banho-maria. Tapar as cavidades com microplacas
pode causar a contaminação cruzada.
Instruções para líquido de mudança manual nas cavidades
-
-
O líquido deve ser aspirado da cavidade com uma pipeta, de preferência ligada a uma
bomba de vácuo. A placa é inclinada para um ângulo para permitir que o líquido flua
para uma extremidade da cavidade.
Adicione 2 mL da solução apropriada a cada cavidade de teste e efetue o procedimento
de teste.
A pipeta dispensadora multicanal (Eppendorf®) é útil para esta aplicação.
Repita esta etapa tantas vezes quantas as indicadas no procedimento de teste.
Nota:
-
Não deixe que as tiras sequem entre as duas etapas.
Certifique-se de que não danificou a superfície das tiras durante a aspiração. Aspire o
líquido pela parte superior da tira, acima da linha de marcação.
Certifique-se de que a tira foi cuidadosamente lavada por submersão completa na
solução de lavagem.
Adaptar a velocidade do agitador, quando necessário.
PROCEDIMENTO PARA TESTE MANUAL LiPA
Antes da incubação, verifique a temperatura (47°C ± 0,5°C) do banho-maria com um
termômetro calibrado e, se necessário, ajuste a temperatura antes de colocar a bandeja no
banho-maria. Feche sempre a tampa.
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Rev. 01 – Jun/2013
Amostras
Assegure-se de que adicionou exatamente 10 µL de amostra amplificada. Uma amostra muito
grande ou pequena pode resultar em um resultado de tipagem errado.
Desnaturação e hibridação
1. Aqueça um banho-maria de agitação a 47°C ± 0,5°C. Controle a temperatura com um
termômetro calibrado e, se necessário, ajuste a temperatura. Não exceda as temperaturas
indicadas. Pré-aqueça a Solução de hibridação e a solução de lavagem rigorosa no banhomaria até atingir uma temperatura mínima de 37°C e não superior aos 47°C. Mistura-as antes
de usar. Todos os cristais devem estar dissolvidos.
2. Utilize as pinças para retirar o número de tiras INNO-LiPA CFTR Italian Regional do tubo
(uma tira por cada teste de amostra). Inclua uma tira para a amostra amplificada de controle
em branco. Escreva um número de identificação por cima da linha de marcação vermelha da
tira.
3. Coloque o número necessário de cavidades de teste (uma cavidade para cada tira) em uma
placa.
4. Com uma pipeta dispense 10 µL de Solução de desnaturação nos cantos superiores das
cavidades.
Nota: Feche o frasco imediatamente depois de utilizá-lo.
5. Adicione 10 µL do produto amplificado INNO-LiPA CFTR Italian Regional e misture
cuidadosamente com a Solução de Desnaturação, pipetando para cima e para baixo. Utilize
sempre pontas de pipetas estéreis. Permita a desnaturação durante 5 minutos a uma
temperatura de 20 - 25°C.
6. Agite a solução de hibridação pré-aquecida e com cuidado adicione 2 mL ao produto
amplificado desnaturado presente em cada cavidade. Agite suavemente para misturar. Tenha
cuidado para não contaminar as cavidades vizinhas durante as operações com a pipeta.
7. Coloque imediatamente a tira com o lado marcado da membrana na cavidade. As tiras
devem de ficar totalmente submersas na solução.
Nota: Use luvas descartáveis e pinças.
8. Coloque a bandeja no banho agitador de água a 47°C ± 0,5°C (80 rpm; veja as Instruções
para a incubação manual), feche a tampa e incube durante 90 minutos.
Nota: Evite respingos na cavidade com água do banho. Ajuste o nível da água entre 1/3 e 1/2
da altura da cavidade. Para evitar o deslizamento da placa, imobilize-a entre dois pesos
pesados.
Lavagem rigorosa
1. Depois da hibridação, retire a placa do banho-maria.
2. Segure a placa emum ângulo baixo para que o líquido se acumule em uma extremidade da
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Rev. 01 – Jun/2013
cavidade, por cima da linha de marcação da tira, para fácil remoção. Não danifique a superfície
das faixas. Evite respingar ou transferir soluções entre cavidades.
Aspire o líquido da cavidade com uma pipeta, de preferência ligada a um aspirador por vácuo.
Adicione 2 mL de solução de lavagem rigorosa pré-aquecida a cada cavidade e lave oscilando a
placa (de 10 a 20 segundos) a uma temperatura entre 20 e 25°C. Aspire a solução de cada
cavidade. Repita esta breve etapa de lavagem mais uma vez (consulte também instruções de
mudança manual do líquido nas cavidades).
3. Por último, aspire a solução e incube cada tira em 2 mL de Solução de lavagem rigorosa
pré-aquecida em um banho-maria de água de agitação a uma temperatura de 47°C ± 0,5°C
durante 30 minutos. Feche a tampa do banho-maria.
Nota: Dilua a solução concentrada de lavagem e o conjugado durante a lavagem rigorosa.
Consulte Reagentes.
Revelação da cor
Todas as incubações seguintes devem ser realizadas em um agitador a uma temperatura de 20
a 25°C. Durante as incubações, tanto o líquido como as tiras de teste devem movimentar-se
para frente e para trás na cavidade para garantir uma coloração homogênea.
1. Lave cada tira durante 1 minuto com 2 mL de solução de trabalho de lavagem rigorosa
(Consulte Reagentes e Instruções de mudança manual do líquido nas cavidades).
2. Adicione 2 mL de solução de trabalho conjugado (consulte Reagentes) a cada cavidade e
incube durante 30 minutes agitando a placa no agitador.
Nota: Dilua a solução de substrato BCIP/NBT cerca de 10 minutos antes de terminar a
incubação do conjugado. Consulte Reagentes.
3. Lave cada tira duas vezes durante 1 minuto com 2 mL de solução de trabalho de lavagem e
adicionalmente mais uma vez com 2 mL de tampão substrato.
4. Adicione 2 mL de solução de trabalho de substrato diluído (consulte Reagentes) a cada
cavidade e incube durante 30 minutes agitando a placa no agitador.
5. Pare a revelação da cor, lavando as tiras duas vezes com 2 mL de água destilada, enquanto
agita a placa no agitador durante pelo menos 3 minutos.
6. Utilize as pinças para retirar as tiras das cavidades e coloque as mesmas em papel
absorvente. Espere até as tiras estarem totalmente secas e só depois prossiga à leitura dos
resultados. Armazene em lugar escuro as tiras secas e processadas.
PROCEDIMENTO PARA TESTE AUTOMATIZADO LiPA
Os procedimentos de teste automatizados estão disponíveis. Contate a Biometrix para obter
mais informações.
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Rev. 01 – Jun/2013
RESULTADOS DE LiPA
Leitura
A figura 1 mostra a posição das diferentes sondas oligonucleotídicas nas tiras de INNO-LiPA
Italian Regional. Uma linha é considerada positiva quando no final do teste aparecer uma faixa
de cor púrpura/castanho claro.
Figura 1: Localização da linha de marcação superior (vermelha), da linha de controle do conjugado e das 41
sondas de DNA específicas de sequência divididas sobre 38 linhas na tira INNO-LiPA CFTR Italian Regional
Validação
-
-
-
-
Inclua uma amostra de controle amplificado negativo cada vez que realize um teste. Tal
como com qualquer outro novo procedimento de teste, a inclusão de controles positivos
e negativos adicionais é recomendada até alcançar um elevado nível de confiança na
execução do procedimento de teste. Recomenda-se a utilização de DNA de referência
para validar que as condições adequadas foram estabelecidas.
A linha superior da tira INNO-LiPA CFTR Italian Regional é a linha de marcação
(vermelha). Esta linha permite orientar corretamente a tira.
A linha seguinte controla a adição do conjugado reativo e da solução de trabalho do
substrato durante o processo de detecção. Deve alinhar esta linha com a linha de
controle do conjugado no cartão de leitura de plástico. Esta linha deve estar sempre
positiva e ter aproximadamente a mesma intensidade em todas as tiras utilizadas
durante a mesma série de testes.
O resultado do ensaio de cada amostra de controle amplificado negativo não deve
apresentar nenhum sinal aparente em nenhuma das linhas da tira, exceto para a linha
de controle do conjugado.
As intensidades das cores nas sondas em uma tira podem divergir de uma linha para a
outra.
Interpretação dos resultados
-
-
Verifique primeiro se a linha de controle do conjugado está positiva (primeira linha após
a linha de marcação superior) para validar cada tira individualmente (consulte
Validação).
A linha de marcação vermelha na tira deve estar alinhada com a linha de marcação do
cartão de leitura de plástico.
A tira INNO-LiPA CFTR Italian Regional contém 20 sondas de tipo selvagem (tipos W.) e
21 sondas de tipo mutante (tipos M.). O W.L1065P=W.R1066H é a sequência de tipo
selvagem para a mutação L1065P e para a mutação R1066H. A sonda M-para a
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Rev. 01 – Jun/2013
-
mutação E217G (M.E217G) e para a mutação R334Q (M.R334Q) são ambas revestidas
em uma linha (M.E217G+M.R.334Q). Também as sondas de tipo W para as mutações
621+3A→G,
E217G
e
R334Q
são
revestidas
em
conjunto
(W.621+3A→G+W.E217G+W.R334Q).
Identifique todas as linhas, que são positivas na tira INNO-LiPA CFTR Italian Regional.
Interpretação das sondas de tipo W. e M. (exceto para as sondas revestidas em
conjunto): A presença de uma linha visível significa que ou a correspondente sequência
do tipo W. ou a correspondente sequência do tipo M. está presente em um ou ambos os
alelos. As homozigotas individuais para um determinado alelo de tipo W. apresentam
apenas um sinal positivo para a correspondente sonda do tipo W. e não apresentam um
sinal para a sonda do tipo M. As homozigotas individuais para um determinado alelo de
tipo M. apresentam apenas um sinal positivo para a correspondente sonda do tipo M. e
não apresentam um sinal para a sonda do tipo W. As heterozigotas individuais ou
compostas para determinadas mutações mostram sinais positivos para as sondas de
tipo W. e M. correspondentes.
Esquema de reação para as mutações com as sondas revestidas em conjunto:
Legenda N = alelo normal
X, Y = outras mutações diferentes de 621+3A→G, E217G ou R334Q
Esquema de reacção para
Caso 1
Caso 2
Caso 3
Caso 4
621+3A→G, E217G, R334Q
Linha 19: M.621+3A→G
Linha 20: M.E217G+M.R334Q
Linha 38:
W.621+3A→G+W.E217G+W.R334Q
Resultados possíveis
+
+
+
+
+
+
+
+
621+3A→G/N
621+3A→G/E217G
N/N
E217G/X
621+3A→G/621+3A→G 621+3A→G/R334Q
N/X
R334Q/X
X/X
E217G/R334Q
X/Y
Y/Y
E217G/N
R334Q/N
621+3A→G/X
E217G/E217G
R334Q/R334Q
Padrões de reação aparentes aberrantes
-
Quando testar uma amostra branca, pode observar uma reação positiva falsa para a
linha da sonda W.I502T, devido a uma reação cruzada com o iniciador para o éxon 22.
Como o W.L1065P é a sequência de tipo W para a L1065P e a R1066H, uma amostra do
doente de R1066H/R1066H homozigota, L1065P/L1065P homozigota ou L1065P/R1066H
heterozigota
composta
não
apresenta
nenhum
sinal
com
a
sonda
W.L1065P=W.R1066H.
LIMITES DO PROCEDIMENTO
-
A utilização deste produto deve ser restrita ao pessoal qualificado em técnicas de
amplificação e hibridização.
Apenas a adoção de boas praticas de laboratório e a realização meticulosa dos
procedimentos específicos permitem a hibridação específica e a determinação do tipo
correto do DNA alvo.
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Rev. 01 – Jun/2013
-
-
-
Um resultado não interpretável pode ocorrer devido à presença de polimorfismos CFTR
ou outras mutações CFTR raras na região da sonda ou na região 3' dos iniciadores.
Com base na frequência de mutação na população global, um resultado homozigoto
para qualquer uma das mutações em INNO-LiPA CFTR Italian Regional é considerada
como muito rara. Por conseguinte, aconselhamos que verifique se a reação negativa do
tipo selvagem não é provocada pela deleção do éxon específico.
No caso de uma amostra heterozigótica composta, o teste LiPA não é capaz de
distinguir se as mutações detectadas estão localizadas em um ou dois cromossomos.
No entanto, pode testar as amostras de DNA parental com o INNO-LiPA CFTR para
reduzir o risco de uma interpretação incorreta.
É possível que outras mutações estejam presentes na amostra, mas que não estejam
incluídas no kit e, por conseguinte, não serão detectadas.
DESEMPENHO DO TESTE DO INNO-LiPA CFTR Italian Regional
O desempenho do INNO-LiPA CFTR Italian Regional foi avaliado internamente. Foram analisadas
85 amostras anônimas provenientes de diferentes países.
Todas as hibridizações foram realizadas manualmente e os resultados foram visualmente
interpretados. Foi documentado um genótipo para cada amostra.
Sensibilidade do diagnóstico
A sensibilidade do diagnóstico do ensaio foi calculada como o número de resultados positivos
(amplificados com êxito e um resultado interpretável no LiPA) no número total de amostras
testadas.
A sensibilidade do diagnóstico nesta avaliação foi de 97,7% (83/85; 95% CI [91,8%; 99,7%])
após um teste inicial e 98,8% (84/85; 95% CI [93,6%; 100%]) após um teste repetido de duas
amostras para cada amplificação falhada. No entanto, os testes adicionais desta amostra em
diferentes concentrações (intervalo 0,36 µg DNA – 1,08 µg DNA na mistura PCR) produziu
sempre um resultado LiPA interpretável.
Exatidão do diagnóstico
A precisão do diagnóstico do ensaio foi calculada como o número de genótipos CFTR
classificados corretamente em comparação com o resultado obtido com os métodos de
identificação de DNA alternativos (disponíveis comercialmente ou métodos internos) no
número total de amostras com um resultado interpretável no LiPA.
A precisão de diagnóstico desta avaliação foi de 96,4% (81/84; 95% CI [89,9%; 99,3%]) após o
teste inicial e 100% (84/84; 95% CI [95,7%; 100%]) após o teste de discrepância de cinco
amostras. Após o teste inicial, o INNO-LiPA CFTR Italian Regional detectou a mutação S549R
A→C (testado três vezes) em duas amostras e a mutação G1244E (testados em três vezes)
noutra amostra. Todas as três amostras foram sequenciadas, confirmando o resultado obtido
com o INNO-LiPA CFTR Italian Regional. Das 84 amostras incluídas nesta análise, 12 amostras
tinham uma mutação detectada pelo kit INNO-LiPA CFTR Italian Regional e uma amostra tinha 2
mutações diferentes.
Adicionalmente, foram avaliadas 10 amostras de swabs bucais e 20 amostras de manchas de
sangue seco de dadores de sangue saudáveis. Para todas as amostras, todas as linhas de tipo
W. foram positivas e todas as linhas M. foram negativas. A reação global é menos intensa em
comparação com os resultados obtidos em amostras de sangue completas.
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Reatividade da sonda
O desenvolvimento do ensaio foi orientado para evitar a reação cruzada com outros
polimorfismos ou mutações no gene CFTR. Foram encontrados os seguintes
polimorfismos/mutações: 621+1G→T (cinco amostras), 1898+1G→A (três amostras),
1898+1G→C (uma amostra), R334W (três amostras), R347P (seis amostras), R1066C (uma
amostra), R1162X (seis amostras) e S549R T→ G (uma amostra), não mostraram qualquer
reação cruzada com as sondas existentes nas tiras.
Precisão
O teste interno incluiu 24 amostras, analisadas em duplicado, manualmente e em Auto-LiPA,
em três lotes de membranas diferentes, foi realizado por cinco pessoas diferentes.
A interpretação dos genótipos foi idêntica em todos os casos.
Um painel de proficiência composto por três amostras com reatividade conhecido foi testado
internamente por duas pessoas diferentes. Foi observado um acordo de 100%.
IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba – PR - CEP: 82840-360
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
Website: www.biometrix.com.br
CNPJ: 06.145.976/0001-39
INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
INNOGENETICS N.V.
Technologiepark 6
9052 Gent - Belgium
Tel.: +32-9 329 13 29
REGISTRO ANVISA
80433150013
RESPONSÁVEL TÉCNICA
Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira
CRQ/PR: 09302336
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