MR: Aporte de las Ciencias Básicas y de Diagnóstico

Aportes de las ciencias básicas y de diagnóstico
Dr. Manuel Alvarez
Presidente
Es con verdadero placer que les doy la bienvenida a todos ustedes. Este Simposio virtual sobre la
Enfermedad de Chagas, la cual sigue siendo un importante problema de nuestro Continente, tiene como
fin la presentación de distintos trabajos especialmente elegidos, que nos ayudarán en la actualización del
Diagnóstico de dicha enfermedad.
El estudio de las Ciencias Básicas del Trypanosoma cruzi , es de prioridad nacional y debería seguir
si éndolo, as í como en todos los pa íses de Latinoamérica, que sufren esta endemia. La Enfermedad de
Chagas (Trypanosomiasis Americana) constituye un gran problema biomédico social en el continente
americano. Es una de las parasitosis de mayor morbilidad entre sus habitantes, especialmente en
aquellos de bajo nivel económico que viven en las áreas rurales sometidas a temperaturas extremas y
cuyas viviendas posibilitan el albergue del insecto transmisor de la infecci ón, ya que en zonas
urbanizadas el control de la transmisión vertical, transfucional y/o inmunosuprimidos, está debidamente
normatizado.
Es por todas estas razones que este Simposio Virtual será de gran ayuda para el intercambio de
opiniones entre profesionales de distintos países de nuestro continente, y nos dará a todos una
perspectiva m ás actualizada de los avances y aportes que se desarrollan en cada región.
Quisiera agradecer a todos los autores por enviar sus trabajos, como así también a las autoridades del
Simposio por hacer efectivo el mismo.
Dr. Manuel Alvarez
Director Técnico Asistente - Instituto Nacional de Parasitología - "Dr. Mario Fatala Chab én"
Tope
Relatos
Papel das citocinas proinflamatorias e do tipo T1 (Interferon-gama e TNF alfa) na Patogenia da
Cardiopatia Chagasica Cronica humana.
Dr. Edecio Cunha-Neto y cols
Expressão imunohistoquímica de moléculas de adesão e antígenos de histocompatibilidade na
miocardite chagásica crônica.
Dr. Luiz Alberto Benvenuti
Diagnostico anatomopatologico da doença de Chagas.
Dr. Edison Reis Lopes
Niveles plasmaticos de CK y receptores solubles en la infeccion chagasica humana y
experimental.
Drs. Beatriz Basso, Liliana Cervetta y Edgardo Moretti
Tope
Papel das Citocinas proinflamatórias e do tipo T1
(Interferon-gama e TNF-alfa) na Patogenia da
Cardiopatia Chagásica Crônica humana
Edecio Cunha-Neto*,
Renata C. Ferreira*, Lúcia Abel*, Jorge Kalil*#
*Laboratório de Imunologia, Instituto do Coração (InCor), Hospital das Clínicas
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
#Disciplina de Imunologia Clínica e Alergia, Departamento de Clínica Médica
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Introdução
A patogênese da cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) ainda é assunto de intenso debate, pois não
são conhecidos os fatores de susceptibilidade ou "pontos-chave", que levam 30% dos indivíduos a
desenvolver a CCC após a infecção pelo Trypanosoma cruzi enquanto que os restantes 70%
permanecem na forma indeterminada (IND), sem dano cardíaco clinicamente significativo. A principal
característica do tecido cardíaco na CCC é uma miocardite difusa, incluindo a destruição das fibras
cardíacas e substituição por fibrose cicatricial, associada a um considerável infiltrado inflamatório difuso,
composto por linf ócitos T e macrófagos, num processo que lembra a reaçã o de hipersensibilidade
retardada. Estas células inflamatórias têm sido implicadas como os efetores da destruiçã o do tecido
cardíaco, na aparente ausência do T. cruzi . Utilizando-se t écnicas ultra-sensíveis, como o PCR (1) e a
imuno-histoquímica (2), encontram-se indícios da presença do T. cruzi no coração de pacientes com
CCC; entretanto, tais indícios também s ão encontrados no coração de chagásicos portadores da forma
indeterminada (3;4). No coração de pacientes da forma indeterminada, sem sintomas cardíacos,
identifica-se uma miocardite focal (5) onde a inflamação é bem menos intensa e pode estar associada
com restos parcialmente destruídos do parasita (6). Além disso, em pacientes CCC ou IND, outros órgãos
são parasitados pelo T. cruzi de forma análoga ao coração (7-9), sem apresentarem sinais de destruição
ou dano funcional. Em conjunto, estes dados sugerem que a simples presença do T. cruzi não é
suficiente para a indução da miocardite difusa e da destruição do tecido cardíaco.
Há algumas décadas, foi postulada a hipótese auto-imune da patogênese da CCC, onde a agressão ao
tecido cardíaco na CCC na ausência do T. cruzi in situ seria consequência de uma resposta imunológica
contra algum antígeno do T. cruzi , que apresentasse reação cruzada imunológica com um componente
cardíaco. A favor dessa hipótese, Ribeiro-dos -Santos et al. demonstraram que linf ócitos T CD4+, ou
auxiliadores, de camundongos cronicamente infectados com T. cruzi podem transferir a inflamação
cardíaca para camundongos não-infectados (10). Também foi observado que tanto anticorpos do soro
(11) quanto linfócitos T CD4+ (12) de camundongos infectados reconhecem a miosina cardíaca, a
proteína mais abundante do coração (Resultados revisados em (13)). Recentemente, nosso grupo
demonstrou a presença de reação cruzada imunológica entre antígenos cardíacos e do T. cruzi . Tanto
linfócitos T obtidos de biópsia endomiocárdica de paciente CCC (14) como do sangue periférico (15) e
anticorpos (16) reconheceram cruzadamente a miosina cardíaca, e uma proteína recombinante de T.
cruzi chamada B13 (17-19).
Entretanto, pouco se sabe sobre o perfil de citocinas - os mediadores respons áveis pela inflamação e
efetuação imunológica - produzidas pelos linf ócitos infiltrantes do tecido card íaco, e mesmo dos linfócitos
do sangue periférico desses pacientes. Animais infectados com o T.cruzi apresentam na fase aguda da
infecção um perfil de citocinas proinflamatórias, como a Interleucina-12 (IL-12) induzida pelo parasita, e
citocinas geradas em sua presença, como o Interferon -gama (IFN-gama) e do o Fator de Necrose
Tumoral-alfa (TNF-alfa) (Revisão em (20)). O envolvimento das citocinas inflamatórias na patog ênese da
cardiopatia chagásica crônica é notório. O TNF-alfa foi identificado proeminentemente no tecido cardíaco
de cardiopatas chagásicos em estudos de imuno-histoquímica (21;22). O aumento do TNF-alfa
plasmático tem sido associado à presença da cardiomiopatia, especialmente na forma dilatada (23;24).
Esta apresenta características muito semelhantes com a doença cardíaca causada pelo T. cruzi . Os
pacientes com doença de Chagas, quando comparados com pacientes com cardiomiopatia dilatada de
outras etiologias, evoluem para um prognóstico pior em um curto período de tempo (25).
Em função do conhecido efeito inotrópico negativo do TNF-alfa e da sua capacidade de induzir
cardiomiopatia dilatada em animais experimentais (26) e em seres humanos(27) e da detecção de níveis
elevados de TNF-alfa no tecido cardíaco e no sangue circulante de pacientes com insuficiência cardíaca
(23;24;28), focalizamos o estudo na quantificação do próprio TNF-alfa e do Interferon-gama, sendo esta
última capaz de induzir a produção do TNF-alfa. Estudamos a produção de citocinas por linfócitos do
tecido cardíaco de pacientes CCC e em células do sangue periférico entre cardiopatas chagásicos,
portadores da forma indeterminada (sem qualquer sinal de cardiopatia e isentos de sintomas digestivos IND) e controles normais (N), com o objetivo de identificar uma possível associação entre a produção de
tais citocinas e a CCC. Todos os pacientes inclu ídos neste estudo foram acompanhados pelos Drs.
Barbara Ianni, Charles Mady, Edimar Bocchi e Fernando Bacal, do Instituto do Coração, Hospital das
Clínicas-Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Resultados e discussão
O envolvimento das citocinas inflamatórias na patogênese da cardiopatia chagásica crônica é notório.
Formas tripomastigotas de T. cruzi aumentavam significativamente a produção de IL-12 por células
mononucleares de sangue periférico (CMSP) de indivíduos normais (Fig.1), provavelmente devido à
habilidade das glicoproteínas do tipo mucina de tripomastigotas induzirem a produção desta citocina
(Dados não mostrados e ref.(29)). A análise da produ ção de citocinas pelas CMSP de chagásicos e
controles normais em resposta à prote ína B13 e à PHA (fitoemaglutinina) indicou um desvio para um
perfil de citocinas do tipo T1, com altos níveis de IFN -gama e supressão recíproca de IL-4 em pacientes
chagásicos, tanto CCC quanto IND (Fig.2). Quando analisamos a produção de IFN-gama pelas CMSP
dos mesmos pacientes, agora classificados como altos (³ 1 ng/ml) ou baixos (<1 ng/ml) produtores da
citocina, o número de altos produtores em resposta ao antígeno B13 do T. cruzi foi três vezes maior entre
os cardiopatas chagásicos do que entre os portadores da forma indeterminada da Doença de Chagas
(53% vs 15%, P=0.06; Fig. 3). Em resposta à PHA, o número de altos produtores foi duas vezes maior
entre os cardiopatas chagásicos do que entre os portadores da forma indeterminada da Doença de
Chagas (68% vs 31%, P=0.07; Fig. 3). Este resultado sugere que os pacientes cardiopatas chagásicos
apresentam uma capacidade de montar uma resposta com IFN-gama (T1) mais intensa do que os
pacientes portadores da forma indeterminada. A freqüência de células produtoras de IFN-gama após
estímulo com PHA foi significativamente maior em CMSP de pacientes cardiopatas chagásicos do que
portadores da forma indeterminada (P=0.05) ou indivíduos normais (P=0.005; Fig. 4). Este resultado
sugere a existência de um n úmero aumentado de linfocitos T secretores de IFN -gama (tipo T1) no sangue
periférico de pacientes cardiopatas chagásicos. Considerando a existência de um importante infiltrado
inflamat ório no tecido cardíaco de cardiopatas chagásicos, passamos a estudar a produção de citocinas
por linhagens de linfócitos T obtidas de biópsias endomiocárdicas de 10 pacientes cardiopatas
chagásicos obtidas como descrito (14). IFN-gama e o TNF-alfa foram produzidos por 9/10 e 8/10
linhagens após estímulo por PHA, respectivamente, enquanto que IL-2 and IL -10 foram produzidas por
4/10 e 3/10 linhagens, respectivamente; IL-1a, IL-1b, IL-4, IL-6 e IL-12 não foram detectadas (Fig. 5). A
produção predominante de IFN -gama e TNF-alfa pelas células do infiltrado inflamat ório de cardiopatas
chagásicos pode ser a consequ ência de da migração de linfócitos T tipo T1 observados no sangue
periférico (Figs.1-4). Tais linfócitos podem ter sido gerados na periferia ap ós a interação com macrófagos
que, ao endocitar o T. cruzi , passsaram a expressar a molécula coestimulat ória B7 (30) e produzir IL-12
(29), um fenômeno que provavelmente acontece ao longo da infec ção crônica de baixo grau pelo T. cruzi .
O perfil de produção de citocinas do tipo proinflamatório/T1 pelas células infiltrantes da les ão cardíaca na
CCC é consistente com um mecanismo de destruiçã o tecidual por hipersensibilidade retardada.
Tendo em vista os resultados indicando a produção significativa de TNF-alfa por células infiltrantes da
lesão card íaca (Fig.5 e (21))(22) e a observa ção de altos níveis plasm áticos de TNF-alfa entre pacientes
portadores de insufici ência cardíaca (23;24), estudamos os níveis plasm áticos de TNF-alfa entre
chagásicos indeterminados ou portadores de diferentes graus de cardiomiopatia, pacientes portadores de
cardiomiopatia dilatada idiopática e controles normais. Os valores médios de TNF-alfa plasm ático entre
chagásicos indeterminados, cardiopatas leves e moderados foram semelhantes e cerca de 5 vezes
maiores que os controles normais, enquanto que os valores médios entre os cardiopatas chagásicos com
disfunção grave encontram-se 2 vezes maiores que aqueles grupos; e semelhantes aos identificados
entre os pacientes portadores de cardiomiopatia dilatada idiopática. (Fig 6).O fato de que chagásicos
indeterminados chagásicos sem disfunção ventricular já apresentavam níveis médios 5 vezes maiores
que os controles sugere que a infecção cr ônica pelo T. cruzi em si é capaz de induzir esse aumento de
TNF-alfa plasm ático. Já os pacientes com disfunção ventricular acentuada apresentam aumentos ainda
mais intensos nos níveis de TNF-alfa plasm ático, comparáveis aos apresentados pelos portadores de
cardiopatia dilatada idiopática, provavelmente em consequência dos mecanismos de baixo débito e
translocação bacteriana intestinal aventados anteriormente (31).
A observação de que pacientes chagásicos em geral e cardiopatas graves em especial apresentam uma
propensão para a produção de citocinas inflamatórias como o IFN-gama e o TNF-alfa pode fornecer um
substrato fisiopatológico para a a fibrose e disfunção cardíaca da cardiopatia chagásica crônica. O
Interferon-gama, cuja produção é aumentada pela IL-12 secretada por macrófagos em resposta à
infecção crônica pelo T. cruzi , é capaz de iniciar uma reação inflamatória do tipo hipersensibilidade
retardada, que culmina em fibrose tecidual, que é abundante e encontra-se correlacionada com a
disfunção cardíaca na cardiopatia chagásica crônica, e induz a produção do TNF-alfa por macrófagos
teciduais, com seus conhecidos efeitos inotrópico negativo e indutor de cardiomiopatia em animais (26) e
no homem (27). Assim, nossos dados permitem lançar a hipótese de que pacientes com maior
predisposi ção a produção de citocinas inflamatórias podem ter maior predisposiçã o a evoluir para a
cardiopatia chagásica ap ós a infec ção. Por outro lado, é possível imaginar o uso de terapias inibidoras da
síntese e ação de citocinas em pacientes com cardiopatia chagásica crônica instalada, a exemplo de
estudos com a cardiopatia dilatada idiopática (32).
Figura 1. O Trypanosoma cruzi é capaz de induzir a produção de Interleucina -12 por c élulas mononucleares do sangue periférico
humano.
Produção de IL-12 (Média +SE) induzida por T. cruzi em CMSP humanas. CMSP de indivíduos
normais,soronegativos, foram isoladas atraves de separação por gradiente de densidade (Ficoll-Hypaque)
e cultivadas (5x105 /poço), na presença ou ausência de formas tripomastigotas vivas de T. cruzi
( 10.000/poço) por 48 horas. A dosagem da citocina IL-12 foi realizada com metodologia "sandwich
ELISA" com anticorpos monoclonais e padrões R&D.
Figura 2. Células mononucleares de sangue periférico de chagásicos estimuladas com prote ína B13 apresentam desvio para
produção de citocinas T1 (Interferon -gama) e supressão de citocinas T2 (IL-4) em comparação a controles normais.
*Níveis médios citocinas produzidas por 32 pacientes Chagásicos e 15 controles normais. Teste de
estimulação in vitro com células mononucleares (500.000/poço) estimuladas pela proteína B13 (5 ug/ml)
por 48h. A dosagem de citocinas foi realizada com metodologia "sandwich ELISA" com anticorpos
monoclonais e padrões Endogen e R&D.
*IFN-gama, Chagásicos x Normais, P<0.01
**IL-4, Normais x Chagásicos, P<0.05
Figura 3. Pacientes portadores de CCC apresentam maior frequência de altos produtores de IFN-gama do que chagásicos
indeterminados ou controles normais, em resposta a prote ína B13 ou mitógeno PHA.
Número de pacientes produzindo altos (³ 1 ng/ml) ou baixos (<1 ng/ml) níveis de IFN-gama em cada um
dos grupos clínicos (19 pacientes cardiopatas chagásicos, 13 chagásicos Indeterminados e 15 controles
normais). Teste de estimulação in vitro com células mononucleares (500.000/poço) estimuladas pela
proteína B13 ou PHA (5 ug/ml) por 48h. A dosagem de citocinas foi realizada com metodologia "sandwich
ELISA" com anticorpos monoclonais e padrões Endogen e R&D.
*B13: CCC x IND, P=0.06
** PHA: CCC x IND, P=0.07
n
Figura 4. Pacientes portadores de CCC apresentam maior n úmero de c élulas produtoras de IFN-gama no sangue periférico do que
chagásicos indeterminados ou controles normais, em resposta ao mitógeno PHA.
Enumeração de células produtoras de IFN -gama no sangue periférico. 50.000 CMSP são incubadas com
PHA por 72h em placas Millititer previamente sensibilizadas com anticorpo anti-IFN gama. A quantificação
é realizada atrav és da t écnica ELISPOT com anticorpos Endogen e com o uso de um microscópio de
dissecção ( aumento 32x).
* P < 0.05, CCC vs. IND
P < 0.005, CCC vs. N
Figura 5. Produ ção de citocinas por linhagens de linf ócitos T obtidos de biópsias endomiocárdicas de 10 pacientes cardiopatas
chagásicos após estímulo com PHA.
Fragmentos de biópsias endomiocárdicas foram colocados em cultura com 20U/ml Interleucina 2 para
crescimento dos linfócitos T. A popula ção de linfoblastos foi amplificada até 95-99% CD3+. As linhagens
dos 10 pacientes (p1-p10) foram estimuladas com PHA (5 ug/ml) em presença de celulas mononucleares
irradiadas e as citocinas secretadas no sobrenadante de cultura foram quantificadas após 48h com
metodologia "sandwich ELISA".
Figura 6. Níveis médios de TNF-alfa em chagásicos indeterminados, portadores de cardiopatia chag ásica cr ônica de vários
graus de severidade, portadores de cardiopatia dilatada idiop ática e controles normais.
Os níveis de TNF-alfa (média +SE) foram detectados em amostras de plasma anticoagulados com EDTA
pelo m étodo de "sandwich ELISA", utilizando kit de alta sensibilidade da R&D (limite de detecção=0,5
pg/ml). Classificação pela fração de ejeção (ecocardiografia) entre os pacientes portadores de cardiopatia
chagásica crônica: CCC Leve: FE ³ 0,65; CCC Moderada:FE entre 0,4 e 0,65; CCC Grave:FE £ 0,4
* P<0,001 vs N
** P<0,001 vs CCC mod, CCC leve, IND e N
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Endereço para correspondência:
Dr Edecio Cunha-Neto
Laboratorio de Imunologia, Instituto do Coração (Incor) HC -Fac. Medicina USP
Av Dr Eneas de C. Aguiar, 500-3 o andar S ão Paulo, SP 05403-000 Brasil
Fax +5511-2829350
email: [email protected]
Tope
Expressão imunohistoquímica de moléculas de adesão
e antígenos de histocompatibilidade na miocardite
chagásica crônica
Dr. Luiz Alberto Benvenuti
Laboratório de Anatomia Patológica do InCor
A cardiomiopatia chagásica crônica constitui ainda um importante problema de saúde pública nos
países latino-americanos. Ela desenvolve-se em cerca de 20 a 30% dos pacientes infectados pelo
Trypanosoma cruzi, geralmente muitos anos ou décadas após o contato com esse agente, podendo
apresentar-se com ou sem insuficiência cardíaca. No primeiro grupo os pacientes apresentam
cardiomegalia e sinais e sintomas congestivos, secundários ao baixo débito cardíaco. No segundo grupo
predominam as arritmias e transtornos da condução cardíaca, com graus variáveis de sintomatologia, não
havendo insuficiência cardíaca.
Na cardiomiopatia chagásica crônica, o exame microscópico do miocárdio costuma evidenciar
miocardite linfocitária, com graus variáveis de intensidade de caso para caso, acompanhada de fibrose e
hipertrofia dos cardiomiócitos. Ninhos de amastigotas não costumam ser encontrados. A imunotipagem das
células inflamatórias, realizada por técnica imunohistoquímica, tem demonstrado que a grande maioria das
células são linfócitos T, e dentre esses predominam os linfócitos T CD8+, havendo uma relação entre o
número de linfócitos T CD4+ e o número de linfócitos T CD8+ de cerca de 0,3.
Existe ainda considerável controvérsia concernente à patogenia da cardiomiopatia chagásica crônica.
Seu desenvolvimento tardio, geralmente muitos anos ou décadas após a infecção inicial e a presença de
miocardite linfocitária não relacionada à presença de ninhos parasitários, que conforme já mencionado são
muito raros, sempre intrigou os pesquisadores.
A teoria imunoalérgica, desenvolvida inicialmente por Margarino Torres a partir do final da década de
20, preconiza a ocorrência de reação de hipersensibilidade aos escassos parasitas presentes no miocárdio,
gerando-se então a miocardite linfocitária, que seria a lesão primordial desencadeadora da cardiomiopatia.
A partir do final da década de 50 Köberle desenvolve a teoria autonômica, que propõe uma completa
reformulação na patogenia da fase crônica da doença. Segundo essa teoria a cardiomiopatia chagásica
crônica é fundamentalmente secundária à denervação parasimpática do coração, devida ao parasitismo e
destruição neuronal ocorrida na fase aguda da doença, com consequente predomínio do sistema simpático,
o que levaria a dilatação e hipertrofia das câmaras cardíacas. Nesse contexto a miocardite linfocitária não
seria relevante na cardiomiopatia chagásica crônica.
Nos anos 70 iniciou-se o desenvolvimento das teorias de autoimunidade, com os trabalhos de Cossio
na área da imunidade humoral e Teixeira na área da imunidade celular. Essas teorias preconizam a
ocorrência de reação cruzada entre os cardiomiócitos e o T. cruzi, havendo resposta imunológica
inicialmente dirigida contra o parasita porém levando a agressão imunológica do cardiomiócito, devida à
presença de antígenos comuns entre os mesmos. Essas teorias ganharam maior impulso a partir dos anos
80, com trabalhos que vieram a identificar antígenos comuns entre os cardiomiócitos e o T. cruzi.
O emprego de novas técnicas de pesquisa, particularmente a imunohistoquímica e técnicas de
biologia molecular, associadas à possibilidade de estudo de biópsias miocárdicas, veio fornecer novos e
importantes dados. A relevância da miocardite linfocitária na patogenia da cardiomiopatia chagásica crônica
ficou patente em estudo prévio de nosso grupo, que demonstrou maior incidência e severidade da
miocardite em biópsias endomiocárdicas de pacientes apresentando cardiomiopatia chagásica crônica com
insuficiência cardíaca, comparada aos casos de cardiomiopatia chagásica crônica sem insuficiência
cardíaca (forma arritmogênica) e aos pacientes na forma indeterminada da doença.
Recentemente, com o uso de técnicas imunohistoquímicas, foi demonstrada a presença de formas
isoladas do parasita, ou mais precisamente de antígenos parasitários, na maioria dos corações de pacientes
portadores de cardiomiopatia chagásica crônica, tanto em material de autópsia como de biópsia miocárdica.
Além disso, em trabalho prévio foi demonstrado associação entre a inflamação miocárdica (avaliada pelo
número de linfócitos T CD8+) e a presença, porém não a quantidade, de antígenos parasitários no
miocárdio. Adicionalmente, técnicas de biologia molecular revelaram a presença de DNA parasitário na
miocardite chagásica crônica. Esses achados fortaleceram a noção da persistência do parasita no miocárdio
na fase crônica da doença, hipótese já aventada préviamente, pondo em dúvida a teoria que explicava a
miocardite chagásica crônica como puramente autoimune, situação em que não haveria papel ativo para o
parasita na fase crônica.
Uma teoria moderna sobre a patogenia da cardiomiopatia chagásica crônica deve levar em
consideração todas as descobertas acima relatadas. Uma possibilidade tentadora seria a que atribui à
miocardite linfocitária, provável lesão fundamental desencadeadora da cardiopatia chagásica crônica, um
componente autoimune desencadeado pela presença “ in loco” do parasita ou antígeno parasitário, num
contexto similar à antiga teoria imunoalérgica.
Nessa apresentação relatarei os resultados de recente pesquisa de nosso laboratório referente à
expressão imunohistoquímica de moléculas de adesão e antígenos de histocompatibilidade na
cardiomiopatia chagásica crônica, comparativamente à rejeição aguda celular cardíaca e à cardiomiopatia
dilatada idiopática.
Escolhemos comparar a miocardite da cardiomiopatia chagásica crônica à rejeição cardíaca celular
pois a última, particularmente nos grau moderado e bordeline severo, apresenta características
histopatológicas semelhantes à primeira. O infiltrado inflamatório é predominantemente linfocitário, com
graus variáveis de intensidade, associado a agressão aos cardiomiócitos. Visto de determinada perspectiva,
a rejeição aguda celular pode ser considerada semelhante à miocardite autoimune, pois em ambos
processos patológicos o infiltrado inflamatório linfocitário agride os cardiomiócitos, que estão apresentando
antígenos recohecidos como não-próprios ao sistema imunológico do paciente.
A cardiomiopatia chagásica crônica com dilatação cardíaca tem sido frequentemente citada como
modelo para o entendimento da patogênia da cardiomiopatia dilatada idiopática, apesar das sensíveis
diferenças morfológicas entre ambas, particularmente no que concerne à miocardite e fibrose. Entretanto,
estudos em humanos, utilizando material obtido por biópsia endomiocárdica de pacientes portadores de
cardiomiopatia dilatada diagnosticada clinicamente, e utilizando métodos imunohistoquímicos, têm
evidenciado a presença de miocardite linfocitária bordeline num pequeno sub-grupo (cerca de 8% dos
casos) e evidências de ativação imunológica no miocárdio, com aumento do número de células
inflamatórias infiltrantes em cerca de 40% dos casos. Apesar desses resultados sugerirem a participação de
fenômenos imunológicos na patogenia da doença, existe ainda considerável controvérsia a respeito da
relação causal entre a miocardite linfocitária viral e a cardiomiopatia dilatada.
Foram estudadas biópsias endomiocárdicas do ventrículo direito e fragmentos do ventrículo esquerdo
de pacientes portadores de cardiomiopatia chagásica crônica, cardiomiopatia dilatada ou submetidos a
transplante cardíaco. Os procedimentos que originaram esses fragmentos foram realizados com intuito
diagnóstico ou terapêutico, no Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (INCOR), no período compreendido entre 1993 e 1997. Como controle utilizouse fragmentos de aurículas direitas de pacientes portadores de doença isquêmica do coração, submetidos a
cirurgia de revascularização do miocárdio.
Os fragmentos de tecido foram congelados em isopentano e mantidos em nitrogênio líquido até o uso
o
ou imediatamente seccionados em criostato, sendo então as lâminas mantidas em congelador a –70 C até o
uso. O restante do material foi processado normalmente para o diagnóstico rotineiro.
O grupo “ Chagas” constou de 12 casos, selecionados por preencherem os seguintes critérios: 1)
paciente portador de doença de Chagas, confirmada por testes sorológicos; 2) paciente com idade igual ou
superior a 18 anos; 3) corte histológico da amostra ventricular congelada apresentando cinco ou mais
campos de grande aumento - 400X (CGA); 4) amostra apresentando ao exame histopatológico miocardite
linfocitária crônica, com contagem de linfócitos T CD8+ por CGA igual ou superior a quatro.
O grupo “ transplante cardíaco” constou de nove casos, selecionados por preencherem os seguintes
critérios: 1) paciente com idade igual ou superior a 18 anos, não portador de doença de Chagas; 2) paciente
submetido a transplante cardíaco há dois ou mais meses da data da obtenção da amostra; 3) corte
histológico da amostra ventricular congelada apresentando cinco ou mais CGA; 4) amostra apresentando ao
exame histopatológico rejeição aguda celular grau 3A (moderada, multifocal), com contagem de linfócitos T
CD8+/CGA igual ou superior a quatro; 5) ausência de rejeição aguda celular de grau 2 (moderada, focal) ou
superior, diagnosticada por biópsia endomiocárdica, nos 30 dias anteriores à obtenção da amostra. Todos
pacientes deste grupo estavam sendo submetidos a imunosupressão, de acordo com protocolo habitual do
INCOR, utilizando-se ciclosporina, corticosteróides e azatioprina.
O grupo “ cardiomiopatia dilatada” constou de nove casos, selecionados por preencherem os
seguintes critérios: 1) paciente portador de cardiomiopatia dilatada, segundo critérios clínicos; 2) paciente
com idade igual ou superior a 18 anos; 3) corte histológico da amostra ventricular congelada apresentando
cinco ou mais CGA.
Como grupo “ controle” utilizou-se oito amostras coletadas prospectivamente, de casos que
preencheram os seguintes critérios: 1) paciente portador de doença isquêmica do coração, submetido a
cirurgia de revascularização do miocárdio no INCOR; 2) paciente com idade inferior a 60 anos; 3)
possibilidade técnica de colher-se fragmento da aurícula direita durante o ato cirúrgico; 4) amostra auricular
apresentando ao exame histopatológico ausência de miocardite linfocitária, com contagem de linfócitos T
CD8+/CGA igual ou inferior a dois.
As características das amostras selecionadas e dos pacientes dos quatro grupos encontram-se na
tabela 1.
Tabela 1 - CARACTERÍSTICAS DAS AMOSTRAS SELECIONADAS E DOS PACIENTES
CASO
B95/1703
B94/1828
B94/1768
B93/1510
B93/595
B93/338
B95/1070
B95/1051
B93/2032
B94/1536
B94/1782
B95/1008
B95/525
B94/2204
B94/1680
B94/1792
B94/1547
B94/2019
B94/1471
B95/1163
B95/690
B95/73
B96/2061
B97/104
B97/772
B97/945
B97/946
B97/955
B97/1017
B97/1458
B96/1122
B96/1141
B96/1175
B96/989
B96/1148
B96/1118
B96/751
GRUPO IDADE SEXO AMOSTRA
Chagas
49
M
BEM
Chagas
39
M
BEM
Chagas
51
M
BEM
Chagas
47
F
Crioabl. (VE)
Chagas
32
M
TC (VE)
Chagas
30
M
TC (VE)
Chagas
49
M
BEM
Chagas
50
M
BEM
Chagas
55
M. Crioabl. (VD)
Chagas
55
M
BEM
Chagas
50
M
BEM
Chagas
34
F. BEM
TC
47
M
BEM
TC
48
M
BEM
TC
40
M
BEM
TC
49
M
BEM
TC
28
M
BEM
TC
53
M
BEM
TC
42
M
BEM
TC
48
F
BEM
TC
50
M
BEM
CMD
49
F
BEM
CMD
44
F
BEM
CMD
20
M
BEM
CMD
18
M
BEM
CMD
43
M
BEM
CMD
36
M
BEM
CMD
42
M
BEM
CMD
45
M
BEM
CMD
26
F
BEM
Controle
50
M
Aur. dir.
Controle
59
M
Aur. dir.
Controle
50
M
Aur. dir.
Controle
53
M
Aur. dir.
Controle
50
F
Aur. dir.
Controle
54
M
Aur. dir.
Controle
56
M
Aur. dir.
DIAG.
M. discr.
M. mod.
M. mod.
M. mod.
M. mod.
M. mod.
M. mod.
M. discr.
M. mod.
M. mod.
M. discr.
M. mod.
Rej. 3A
Rej. 3A
Rej. 3A
Rej. 3A
Rej. 3A
Rej. 3A
Rej. 3A
Rej. 3A
Rej. 3A
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
Hipertr.
D. B.
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
CMD
CMD
CMD
D. isq.
CMD
CMD
D. isq.
D. reum.
D. isq.
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
D. isq.
D. isq.
D. isq.
D. isq.
D. isq.
D. isq.
D. isq.
∆ T CGA CD8+/CGA
14
8,8
9
15,0
5
11,8
20
6,8
20
15,8
20
12,7
12
8,3
13
4,1
20
9,5
8
10,3
13
6,3
11
17,7
53 11
4,5
2
20
4,2
18 18
14,7
14 12
27,5
46 13
34,9
5
20
16,7
5
14
9,7
3
13
13,2
99
9
23,9
15
0,5
15
0,6
10
0,2
14
0,1
8
0,3
5
0,4
9
0,1
13
0,5
12
1,6
17
0,3
15
1,2
18
0,2
16
0,3
14
2,0
10
0,7
15
0,4
B96/747
Controle
48
M
Aur. dir.
Hipertr.
D. isq.
-
13
0,8
DIAG.=diagnóstico histopatológico; D.B.=doença cardíaca de base; ∆ T=intervalo entre o transplante e a coleta da amostra (meses);
CGA=número de campos de aumento 400X; CD8+/CGA=número de linfócitos T CD8+ por campo de aumento 400X; TC=transplante
cardíaco; CMD=cardiomiopatia dilatada; M=sexo masculino; F=sexo feminino; BEM=biópsia endomiocárdica; Crioabl.=crioablação de foco
arritmogênico; VE=ventrículo esquerdo; VD=ventrículo direito; Aur. dir=aurícula direita; M. discr.=miocardite linfocitária de grau discreto; M.
mod.=miocardite linfocitária de grau moderado; Rej. 3A=rejeição aguda celular de grau 3A; Hipertr.=hipertrofia; D. isq.=doença isquêmica;
D.reum.=doença reumática.
Nesse estudo utilizamos os seguintes anticorpos primários: 1) anti-linfócitos T citotóxicos/supressores
(CD8), diluído 1:10 (Dakopatts, Dinamarca); 2) anti-ICAM-1 (CD54), diluído 1:20.000 (Chemicon
International Inc., Temecula, CA, USA); 3) anti-VCAM-1 diluído 1:2.000 (R&D System, Minneapolis, MN,
USA); 4) anti-LFA-1 (CD11a), diluído 1:2.000 (R&D System, Minneapolis, MN, USA) e 5) anti-HLA classe I,
diluído 1:40.000 (Dakopatts, Dinamarca). As reações foram realizadas pela técnica da streptavidina-biotinaperoxidase, em cortes de congelação. O revelador utilizado foi a diaminobenzidina e as laminas
contacoradas com hematoxilina.
A intensidade do processo inflamatório miocárdico foi avaliada, em cada caso, pela razão entre o
número de linfócitos imunoreativos frente ao anticorpo anti-CD8 e o número de campos de aumento 400X
avaliados (CGA), até o máximo de 20 campos.
A expressão imunohistoquímica de ICAM-1, VCAM-1, LFA-1 e HLA-I foi avaliada independentemente
por dois observadores, que desconheciam a que grupo pertencia cada amostra. Atribuímos um escore para
as células endoteliais e intersticiais e outro para os cardiomiócitos. As células endoteliais e intersticiais
foram consideradas em conjunto, pois julgamos pouco fidedigna a distinção entre esses dois tipos celulares
com a metodologia empregada. As eventuais discrepâncias entre os escores assinalados pelos dois
observadores foram dirimidas por nova análise desses casos, pelos dois observadores simultaneamente.
Os critérios utilizados para a definição dos escores para as células endoteliais e intersticiais foram os
seguintes:
0- ausência ou ínfima positividade;
1- poucas células positivas ou numerosas células apresentando fraca coloração, claramente visíveis
apenas no aumento de 100X ou superior;
2- moderado número de células positivas ou numerosas com intensidade de coloração moderada,
muito evidentes no aumento de 100X;
3- numerosas células positivas, intensamente coradas, evidentes no aumento de 40X.
Os critérios utilizados para a definição dos escores para os cardiomiócitos foram os seguintes:
0- ausência de positividade;
1- raras células positivas, apresentando coloração fraca ou moderada, por vezes restrita a segmentos
do sarcolema, detectadas com dificuldade e apenas no aumento de 400X;
2- pequeno número de células positivas, apresentando coloração moderada, evidentes no aumento
de 400X;
3- moderado número ou numerosas células positivas, intensamente coradas, já visíveis no aumento
de 100X.
Para a análise estatística dos escores os casos foram agrupados, somando-se aqueles com escores 0
e 1 (escore baixo) e aqueles com escores 2 e 3 (escore alto).
A comparação dos escores entre os grupos foi feita pelo teste exato de Fisher. A intensidade de
inflamação miocárdica, avaliada pelo número médio de linfócitos T CD8+/CGA, foi comparada entre os
grupos Chagas e transplante cardíaco e entre os grupos cardiomiopatia dilatada e controle pelo teste de
Wilcoxon. Análise de concordância entre os escores foi feita pelo coeficiente de correlação de Spearman,
incluindo-se conjuntamente os dados dos quatro grupos. Foi considerado significante p ≤ 0,05 e, na análise
de concordância, consideramos apenas os valores de r≤-0,7 ou ≥0,7.
A positividade observada para as moléculas de adesão estudadas e para HLA-I esteve sempre
restrita à superfície de determinados tipos celulares (membrana citoplasmática).
ICAM-1 foi positivo em células endoteliais/intersticiais em todos os casos dos quatro grupos
estudados, notando-se frequentemente positividade também em células endocárdicas. Os cardiomiócitos
foram positivos em alguns casos dos grupos Chagas e transplante cardíaco.
VCAM-1 foi positivo em células endoteliais na maioria dos casos, particularmente em vênulas e
arteríolas. Casos com denso infiltrado inflamatório perivascular apresentaram, por vezes, fraca
imunoreatividade em linfócitos infiltrantes. VCAM-1 nunca foi positivo em cardiomiócitos.
HLA-I foi positivo em células endoteliais/intersticiais em todos os casos dos quatro grupos estudados,
notando-se frequentemente positividade também em células endocárdicas. Os cardiomiócitos foram
positivos em vários casos, particularmente nos grupos Chagas e transplante cardíaco.
LFA-1 foi positivo exclusivamente em células arredondadas infiltrantes, consistentes com linfócitos.
O número de CGA, o número médio de linfócitos T CD8+/CGA e os escores atribuídos a cada caso
encontram-se na tabela 2.
Tabela 2 - NÚMERO DE CAMPOS AVALIADOS (CGA), NÚMERO MÉDIO DE LINFÓCITOS T (CD8+/CGA)
E ESCORES ATRIBUÍDOS A CADA CASO
caso
grupo
B95/1703
B94/1828
B94/1768
B93/1510
B93/595
B93/338
B95/1070
B95/1051
B93/2032
B94/1536
B94/1782
B95/1008
B95/525
B94/2204
B94/1680
B94/1792
B94/1547
B94/2019
B94/1471
B95/1163
B95/690
B95/73
B96/2061
B97/104
B97/772
B97/945
B97/946
B97/955
B97/1017
B97/1458
B96/1122
B96/1141
B96/1175
B96/989
B96/1148
B96/1118
B96/751
B96/747
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
Chagas
TC
TC
TC
TC
TC
TC
TC
TC
TC
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
CMD
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
CGA CD8+/
ICAM-1
ICAM-1 VCAM-1
HLA-I
HLA-I LFA-1
CGA cél. end./int. cardiom.
cél. end./int. cardiom.
14
8,8
2
0
1
3
3
1
9
15,0
3
0
1
3
3
2
5
11,8
2
0
1
3
2
2
20
6,8
2
0
2
3
1
2
20
15,8
3
1
1
3
2
2
20
12,7
2
0
2
2
1
2
12
8,3
2
0
0
3
2
2
13
4,1
3
0
2
3
3
3
20
9,5
3
1
3
3
3
3
8
10,3
2
0
0
2
2
1
13
6,3
3
0
1
3
2
2
11
17,7
3
1
1
3
2
2
11
4,5
2
2
0
2
2
1
20
4,2
3
1
2
3
2
2
18
14,7
2
2
0
2
1
2
12
27,5
3
1
2
3
3
3
13
34,9
3
0
2
2
2
2
20
16,7
2
0
1
3
1
1
14
9,7
2
0
3
2
2
2
13
13,2
2
1
2
3
2
3
9
23,9
3
0
2
2
2
3
15
0,5
1
0
1
2
0
1
15
0,6
3
0
0
3
1
2
10
0,2
2
0
1
2
0
1
14
0,1
1
0
0
1
0
0
8
0,3
2
0
0
2
0
1
5
0,4
2
0
0
2
0
1
9
0,1
1
0
0
2
0
1
13
0,5
2
0
0
1
0
0
12
1,6
2
0
1
3
1
1
17
0,3
1
0
0
2
0
0
15
1,2
2
0
1
3
0
1
18
0,2
3
0
1
3
0
1
16
0,3
2
0
1
2
0
1
14
2,0
2
0
1
3
0
1
10
0,7
1
0
0
2
0
0
15
0,4
2
0
1
3
0
1
13
0,8
2
0
1
3
0
1
CGA=número de campos de aumento 400X; CD8+/CGA=número de linfócitos T CD8+ por campo de aumento 400X; cél. end./int.=células
endoteliais/intersticiais; cardiom.=cardiomiócitos; TC=transplante cardíaco; CMD=cardiomiopatia dilatada.
No grupo Chagas, o número médio de linfócitos T CD8+/CGA variou de 4,1 a 17,7, com mediana de
9,9, média de 10,6 e desvio padrão de 4,1. Os escores para ICAM-1 em células endoteliais/intersticiais foi
alto em todos os casos. Houve positividade para ICAM-1 em cardiomiócitos em 3 (25%) dos 12 casos
(Figura 1A), sendo sempre o escore baixo. Notamos que os cardiomiócitos positivos encontravam-se nos
focos inflamatórios ou em sua proximidade. VCAM-1 foi positivo em 10 (83,3%) dos 12 casos (Figura 1E),
obtendo-se escore baixo em 8 casos (66,7%) e alto nos demais 4 casos (33,3%). Os escores para HLA-I em
células endoteliais/intersticiais foi alto em todos os casos. Houve positividade para HLA-I em cardiomiócitos
em todos os casos (Figura 1C), sendo o escore alto em 10 casos (83,3%) e baixo em 2 casos (16,7%). É
interessante salientar que encontramos áreas desprovidas de infiltrado inflamatório, com positividade em
cardiomiócitos. LFA-1 foi positivo em todos os casos (Figura 1G), obtendo-se escore alto em 10 casos
(83,3%) e baixo nos demais 2 casos (16,7%).
No grupo transplante cardíaco, o número médio de linfócitos T CD8+/CGA variou de 4,2 a 34,9, com
mediana de 14,7, média de 16,6 e desvio padrão de 10,4. Os escores para ICAM-1 em células
endoteliais/intersticiais foi alto em todos os casos. Houve positividade para ICAM-1 em cardiomiócitos em 5
(55,6%) dos 9 casos (Figura 1B), sendo o escore baixo em 7 casos (77,8%) e alto nos demais 2 casos
(22,2%). Da mesma forma que no grupo Chagas, observamos que os cardiomiócitos positivos localizavamse nos focos inflamatórios ou em sua proximidade. VCAM-1 foi positivo em 7 (77,8%) dos 9 casos (Figura
1F), obtendo-se escore baixo em 3 casos (33,3%) e alto nos demais 6 casos (66,7%). Os escores para HLAI em células endoteliais/intersticiais foi alto em todos os casos. Houve positividade para HLA-I em
cardiomiócitos em todos os casos (Figura 1D), sendo o escore alto em 7 casos (77,8%) e baixo nos demais
2 casos (22,2%). A positividade em cardiomiócitos ocorreu em áreas com e sem infiltrado inflamatório. LFA1 foi positivo em todos os casos (Figura 1H), obtendo-se escore alto em 7 casos (77,8%) e baixo nos
demais 2 casos (22,2%).
FIGURA 1. A- Positividade para ICAM-1 na membrana citoplasmática de cardiomiócito (cabeças de seta) e em células endoteliais/intersticiais
(setas) no caso B95/1008 do grupo Chagas; B- Positividade para ICAM-1 no disco intercalar dos cardiomiócitos (cabeças de seta) no caso
B94/1792 do grupo Transplante Cardíaco; C- Imunoreatividade para HLA-I na membrana citoplasmática dos cardiomiócitos (cabeças de
seta), em células intersticiais (seta) e em células endoteliais de capilares (dupla cabeça de seta), no caso B95/1008 do grupo Chagas; DImunoreatividade para HLA-I na membrana citoplasmática dos cardiomiócitos (cabeças de seta), em células intersticiais (seta) e no
endocárdio (dupla cabeça de seta) no caso B94/1792 do grupo Transplante Cardíaco; E- Células endoteliais de vênulas positivas para
VCAM-1 (setas) no caso B93/1510 do grupo Chagas; F- VCAM-1 positivo em células endoteliais de vênula (seta) e em células inflamatórias
infiltrantes (cabeças de seta) no caso B94/1471 do grupo Transplante Cardíaco; G- LFA-1 positivo exclusivamente em linfócitos infiltrantes no
caso B93/1510 do grupo Chagas; H- LFA-1 positivo exclusivamente em linfócitos infiltrantes no caso B95/690 do grupo Transplante
Cardíaco. Barra= 25µ (A-D) ou 50µ (E-H)
No grupo cardiomiopatia dilatada, o número médio de linfócitos T CD8+/CGA variou de 0,1 a 1,6,
com mediana de 0,4, média de 0,5 e desvio padrão de 0,5. ICAM-1 em células endoteliais e intersticiais foi
positivo em todos os casos (Figura 2A). Obtivemos escore alto em 6 casos (66,7%) e baixo nos demais 3
casos (33,3%). Nenhum caso apresentou positividade para ICAM-1 em cardiomiócitos. VCAM-1 foi positivo
em 3 (33,3%) dos 9 casos, obtendo-se sempre escore baixo (Figura 2E). HLA-I em células
endoteliais/intersticiais foi positivo em todos os casos (Figura 2C), obtendo-se escore alto em 7 casos
(77,8%) e baixo nos demais 2 casos (22,2%). Houve positividade para HLA-I em cardiomiócitos em 2
(22,2%) dos 9 casos, sempre com escore baixo. LFA-1 foi positivo em 7 (77,8%) dos 9 casos (Figura 2G),
obtendo-se escore baixo em 8 casos (88,9%) e alto em 1 caso (11,1%).
No grupo controle, o número médio de linfócitos T CD8+/CGA variou de 0,2 a 2, com mediana de 0,6,
média de 0,7 e desvio padrão de 0,6. ICAM-1 em células endoteliais/intersticiais foi positivo em todos os
casos (Figura 2B). Obtivemos escore alto em 6 casos (75%) e baixo nos demais 2 casos (25%). Nenhum
caso apresentou positividade para ICAM-1 em cardiomiócitos. VCAM-1 foi positivo em 6 (75%) dos 8 casos,
obtendo-se sempre escore baixo (Figura 2F). HLA-I em células endoteliais/intersticiais foi positivo em todos
os casos (Figura 2D), obtendo-se sempre escore alto. Nenhum caso foi positivo para HLA-I em
cardiomiócitos. LFA-1 foi positivo em 6 (75%) dos 8 casos (Figura 2H), obtendo-se sempre escore baixo.
(
FIGURA 2. A- Positividade para ICAM-1 em células endoteliais de uma vênula (seta) e em células intersticiais (cabeças de seta) no caso
B95/945 do grupo Cardiomiopatia Dilatada; B- Positividade para ICAM-1 em células endoteliais/intersticiais no caso B96/1175 do grupo
Controle; C- Imunoreatividade para HLA-I restrita às células endoteliais/intersticiais no caso B96/2061 do grupo Cardiomiopatia Dilatada; DImunoreatividade para HLA-I presente exclusivamente em células endoteliais (setas) e intersticiais (cabeças de seta) no caso B96/989 do
grupo Controle; E- Fraca imunoreatividade para VCAM-1 em células endoteliais de vaso de pequeno calibre (seta) no caso B97/104 do grupo
Cardiomiopatia Dilatada; F- VCAM-1 positivo em células endoteliais de arteríolas (setas) no caso B96/989 do grupo Controle; G- LFA-1
positivo exclusivamente em raros linfócitos (cabeças de seta) no caso B97/104 do grupo Cardiomiopatia Dilatada; H- LFA-1 positivo
exclusivamente em raros linfócitos (cabeças de seta) no caso B96/989 do grupo Controle. Barra= 25µ (A-D) ou 50µ (E-H)
A porcentagem de escores baixo e alto de cada grupo encontra-se na tabela 3.
Tabela 3 - PORCENTAGEM DE ESCORES BAIXO E ALTO DE CADA GRUPO
grupo
ICAM-1
ICAM-1
VCAM-1
HLA-I
HLA-I
LFA-1
cél. end./int.
cardiom.
cél. end./int.
cardiom.
Baix
Alto Baixo Alto Baixo Alto Baixo Alto Baixo Alto Baixo Alto
o
Chagas
0
100
100
0
66,7 33,3
0 100
16,7 83,3
16,7
83,3
TC
0
100
77,8 22,2
33,3 66,7
0 100
22,2 77,8
22,2
77,8
CMD
33,3
66,7
100
0
100
0
22,2 77,8
100
0
88,9
11,1
Controle
25
75
100
0
100
0
0 100
100
0
100
0
cél. end./int.=células endoteliais/intersticiais; cardiom.=cardiomiócitos; TC=transplante cardíaco; CMD=cardiomiopatia dilatada.
Não houve diferença entre a intensidade de inflamação miocárdica, avaliada pelo número médio de
linfócitos T CD8+/CGA entre os grupos Chagas e transplante cardíaco e entre os grupos cardiomiopatia
dilatada e controle. Houve diferenças entre os grupos quanto aos escores ICAM-1 em células
endoteliais/intersticiais (p=0,038), VCAM-1 (p=0,002), HLA-I em cardiomiócitos (p<0,001) e LFA-1
(p<0,001). Os grupos Chagas e transplante cardíaco apresentaram maior porcentagem de escores altos
comparado aos grupos cardiomiopatia dilatada e controle. Não houve diferença estatística entre os grupos
Chagas e transplante cardíaco, em relação aos escores para ICAM-1 em células endoteliais/intersticiais,
ICAM-1 em cardiomiócitos, VCAM-1, HLA-I em células endoteliais/intersticiais, HLA-I em cardiomiócitos e
LFA-1. Houve correlação entre os escores atribuídos a ICAM-1 em células endoteliais/intersticiais e LFA-1
(p<0,001; r=0,700) e entre os escores atribuídos a HLA-I em cardiomiócitos e LFA-1 (p<0,001; r=0,763).
Neste estudo o grupo controle (miocárdio "normal") expressou constitutivamente ICAM-1 em células
endoteliais e intersticiais, sendo porém negativos os cardiomiócitos. É interessante notar que a maioria dos
nossos casos (75%) obteve escore alto para células endoteliais/intersticiais, devido à alta sensibilidade do
método imunohistoquímico utilizado, que consistiu na técnica da estreptavidina-biotina-peroxidase, com
incubação do anticorpo primário por tempo prolongado (“ overnight” ).
Os dados da literatura confirmam nossos achados, atestando a expressão constitutiva de ICAM-1 em
células endoteliais e intersticiais no miocárdio "normal".
A expressão de VCAM-1 esteve restrita às células endoteliais, particularmente de vênulas e
arteríolas, conforme relatada em trabalhos prévios. A alta porcentagem de casos positivos (75%), sempre
com escore baixo, deveu-se novamente à alta sensibilidade do método imunohistoquímico utilizado.
Os escores baixos obtidos para LFA-1, positivo na maioria dos casos (75%) exclusivamente em
linfócitos presentes no interstício do miocárdio, deveu-se ao pequeno número dessas células (média de
linfócitos T CD8+/CGA de 0,7), como seria de se esperar no miocárdio “ normal” .
Observamos aumento da expressão imunohistoquímica (“ overexpression” ) de ICAM-1 em células
endoteliais/intersticiais na miocardite chagásica crônica, comparada ao grupo controle (miocárdio “ normal” ).
Esse resultado contrasta com o obtido por estudo prévio de REIS e colaboradores, que não referiram
diferença na expressão imunohistoquímica de ICAM-1 em células endoteliais no miocárdio de pacientes
cardiopatas chagásicos apresentando miocardite linfocitária, comparado aos pacientes não chagásicos. Tal
discrepância pode dever-se a vários fatores, como diferença na origem do material analisado, proveniente
de autópsia no estudo anterior, com tempo “ post-mortem” não referido, e obtido “ in vivo” no presente
trabalho, o que provavelmente conferiu maior preservação antigênica ao nosso material; à diferente técnica
imunohistoquímica utilizada, mais sensível no atual trabalho; à eventual diferença na intensidade da
miocardite chagásica e à diferente definição das células avaliadas nos dois estudos. É importante salientar
que enquanto avaliamos conjuntamente as células endoteliais e intersticiais, por acharmos pouco fidedigna
a diferenciação das mesmas pela metodologia empregada, REIS e colaboradores tentaram avaliar apenas
as células endoteliais, apesar de não haver referência em seu trabalho aos critérios que permitiram
distinguir as células endoteliais dos pequenos vasos (predominantemente capilares) das outras células do
interstício do miocárdio.
Detectamos ICAM-1 na superfície dos cardiomiócitos em 3 (25%) dos 12 casos avaliados, ao
contrário do estudo prévio de REIS e colaboradores, que não referiu positividade para ICAM-1 em
cardiomiócitos em nenhum dos 9 casos analisados. Tal diferença é provavelmente consequência das várias
diferenças metodológicas entre os dois estudos, já anteriormente mencionadas.
A expressão imunohistoquímica de LFA-1 esteve presente e restrita aos linfócitos infiltrantes, tanto no
atual trabalho quanto no estudo anterior.
Pela revisão bibliográfica feita, o presente trabalho é o primeiro a avaliar a expressão
imunohistoquímica de VCAM-1 na miocardite chagásica crônica.
O aumento da expressão imunohistoquímica de ICAM-1 em células endoteliais/intersticiais e VCAM-1
em células endoteliais de vênulas e arteríolas do grupo Chagas, comparado ao grupo controle, é compatível
com o esperado aumento de adesividade e interação entre as células endoteliais e os leucócitos circulantes,
promovendo o processo inflamatório observado na miocardite chagásica crônica.
A indução de ICAM-1 no sarcolema dos cardiomiócitos na miocardite chagásica crônica pode
promover a firme adesão entre os linfócitos infiltrantes, que expressam LFA-1 (ligante do ICAM-1) e os
cardiomiócitos, fundamental para que possa haver citotoxicidade direta. Entretanto esse processo parece ter
importância restrita devido à fraca positividade para ICAM-1 em cardiomiócitos, observada apenas em 3
(25%) dos 12 casos analisados, sempre com escore baixo.
O aumento local na expressão de moléculas de adesão pode ser interpretado como consequente à
presença de elevada quantidade de citocinas na miocardite chagásica crônica, destacando-se o papel
indutor do interferon-gama, fator de necrose tumoral e interleucina-1.
A comparação estatística entre os grupos Chagas e transplante cardíaco não mostrou diferenças
entre os mesmos quanto aos escores atribuídos às moléculas de adesão. Em ambos houve aumento da
expressão de ICAM-1 e VCAM-1 em células endoteliais/intersticiais comparado ao grupo controle, com
indução de ICAM-1 em cardiomiócitos. Se tivéssemos maior número de casos para análise, talvez
obtivéssemos diferença estatisticamente significante quanto à expressão de ICAM-1 em cardiomiócitos e de
VCAM-1 (em células endoteliais). Essa suposição baseia-se na constatação que o grupo Chagas apresentou
menor número de casos positivos para ICAM-1 em cardiomiócitos (25%), sempre com escore baixo,
comparado ao grupo transplante cardíaco (62,5% de casos positivos, sendo 2 com escore alto). Além disso,
o grupo Chagas apresentou menor porcentagem de escore alto para VCAM-1 (33,3%), comparado ao grupo
transplante cardíaco (66,7%). Num futuro trabalho seria interessante a utilização de método que permitisse
a quantificação da expressão de ICAM-1 e VCAM-1, o que certamente aumentaria a sensibilidade de
detecção de diferenças entre os grupos, eliminando ainda o caráter subjetivo das avaliações
semiquantitativas.
Por outro lado, podemos interpretar nossos resultados, que revelaram semelhança de padrões entre a
miocardite chagásica crônica e a rejeição aguda celular de grau moderado, com base no fato de que ambos
processos patológicos apresentaram a mesma intensidade de atividade inflamatória, que parece ser o
principal fator relacionado à expressão das moléculas de adesão.
No presente trabalho demonstramos expressão imunohistoquímica de HLA-I em células endoteliais e
intersticiais do miocárdio “ normal” . Por outro lado, os cardiomiócitos foram sempre negativos para HLA-I.
Estes resultados estão de acordo com estudos prévios que analisaram o miocárdio “ normal” .
É interessante salientar que como praticamente todas células nucleadas expressam HLA-I na
superfície celular, provavelmente os cardiomiócitos do miocárdio normal o fazem em níveis muito baixos,
insuficientes para detecção por métodos imunohistoquímicos, mesmo de alta sensibilidade, como o utilizado
neste estudo. Por outro lado, justamente devido à alta sensibilidade do método imunohistoquímico utilizado,
o grupo controle sempre apresentou escores altos para HLA-I em células endoteliais/intersticiais, o que
impediria a detecção de eventual “ overexpression” dessa molécula nos demais grupos.
A indução de HLA-I na superfície dos cardiomiócitos, observada na miocardite chagásica crônica,
implica na exposição ao sistema imunológico de peptídeos, originados de proteínas próprias dessas células
(“ self” ) ou de proteínas derivadas de antígenos replicantes intracelulares, para reconhecimento pelos
linfócitos T CD8+. Apesar do T. cruzi ser um parasita intracelular, a escassez de antígenos parasitários
detectados na miocardite chagásica crônica contrasta com a abundância de HLA-I em cardiomiócitos,
detectada no presente estudo em todos os casos de miocardite chagásica crônica, sempre com escore alto.
Portanto, acreditamos que os peptídeos apresentados pelas moléculas de classe I sejam fundamentalmente
derivados do próprio cardiomiócito (“ self” ).
Apesar de nas doenças autoimunes haver geralmente aumento da expressão de HLA-I nas células
alvo, deve-se considerar que a simples detecção da apresentação de antígenos próprios para
reconhecimento pelo sistema imunológico, via linfócitos T CD8+, como na miocardite chagásica crônica,
não implica necessariamente na existência de reação autoimune.
Em qualquer ambiente inflamatório, com aumento local de citocinas, como na miocardite chagásica
crônica, há provavelmente aumento da expressão de HLA-I em diferentes tipo celulares, para que seja
possível maior vigilância imunológica. Tal fato não implica necessariamente em quebra da tolerância
imunológica, podendo os antígenos apresentados serem adequadamente reconhecidos como próprios, sem
desencadeamento da resposta imunológica.
A comparação entre os grupos Chagas e transplante cardíaco não revelou diferenças estatisticamente
significantes quanto aos escores atribuídos para HLA-I em células endoteliais/intersticiais e em
cardiomiócitos. Ambos os grupos apresentaram apenas escores altos para HLA-I em células
endoteliais/intersticiais e os cardiomiócitos foram positivos em todos os casos dos dois grupos,
predominando o escore alto.
Da mesma forma que para as moléculas de adesão, acreditamos que essa semelhança de padrões
deva ser atribuída, fundamentalmente, à mesma intensidade do processo inflamatório miocárdico nos dois
grupos. Sabe-se que o aumento local de citocinas, demonstrado em estudos prévios abordando tanto a
miocardite chagásica crônica quanto a rejeição aguda celular, pode promover aumento da expressão celular
de HLA-I. Adicionalmente, alguns trabalhos prévios abordando diferentes graus de rejeição aguda celular
têm demonstrado correlação entre a intensidade do processo inflamatório e o grau de indução de HLA-I em
cardiomiócitos.
Portanto, acreditamos que a indução de HLA-I na superfície celular é um fenômeno relativamente
inespecífico, acompanhante do processo inflamatório e que a sua indução em cardiomiócitos na miocardite
chagásica crônica não pode ser interpretada como evidência segura de reação autoimune contra os
cardiomiócitos. Por outro lado, a indução de HLA-I em cardiomiócitos é obviamente compatível com a
hipótese de reação imunológica, tanto na rejeição aguda celular quanto na miocardite chagásica crônica.
Considerando-se conjuntamente os escores dos quatro grupos, houve correlação estatística entre os
escores atribuídos a LFA-1 e a ICAM-1 em células endoteliais/intersticiais e entre LFA-1 e HLA-I em
cardiomiócitos. Considerando-se que LFA-1 é o ligante do ICAM-1, estando presente apenas nos linfócitos
infiltrantes, percebemos um sinergismo entre o processo inflamatório linfocitário e a expressão de ICAM-1 e
HLA-I. Tal verificação reforça a hipótese de que o aumento de expressão de ICAM-1 e HLA-I é função direta
do processo inflamatório.
Em resumo, podemos concluir que:
1. Na miocardite chagásica crônica e na rejeição aguda celular de grau moderado houve aumento da
expressão de ICAM-1 e VCAM-1 em células endoteliais/intersticiais do miocárdio, o que sugere que essas
moléculas participem efetivamente no desenvolvimento do processo inflamatório observado nesses estados
patológicos.
2. Na miocardite chagásica crônica e na rejeição aguda celular de grau moderado houve indução de
ICAM-1 em cardiomiócitos em alguns casos, o que pode promover adesão linfocitária a essas células via
receptor LFA-1 expresso em linfócitos, facilitando a ocorrência de citotoxicidade direta.
3. Na miocardite chagásica crônica e na rejeição aguda celular de grau moderado houve indução de
HLA-I em cardiomiócitos em todos os casos, sugerindo apresentação de antígenos próprios (“ self” ) para
reconhecimento pelo sistema imunológico via linfócitos T CD8+.
4. A miocardite chagásica crônica apresentou expressão imunohistoquímica de ICAM-1 em células
endoteliais/intersticiais, LFA-1 e HLA-I com a mesma localização e intensidade da observada na rejeição
aguda celular de grau moderado apresentando a mesma intensidade de inflamação miocárdica.
5. Houve menor expressão de ICAM-1 em cardiomiócitos e de VCAM-1 (em células endoteliais) na
miocardite chagásica crônica, comparada com a rejeição aguda celular de grau moderado apresentando a
mesma intensidade de inflamação miocárdica. Tais diferenças não foram estatisticamente significantes,
havendo necessidade de estudo de maior número de casos para se confirmar ou negar essas diferenças.
6. A cardiomiopatia dilatada não apresentou infiltrado inflamatório miocárdico e exibiu expressão
imunohistoquímica de ICAM-1, VCAM-1, LFA-1 e HLA-I semelhante ao miocárdio “ normal” , o que sugere a
atuação de diferentes mecanismos patogenéticos comparativamente à miocardite chagásica crônica.
Niveles plasmaticos de CK y receptores solubles en la
infeccion chagasica humana y experimental
Beatriz Basso, Liliana Cervetta y Edgardo Moretti
Cátedra de Pediatría y Neonatología
Facultad de Ciencias Médicas, Univ. Nac. de Córdoba
y Laboratorio del Servicio Nacional de Chagas
Córdoba, Argentina
La Enfermedad de Chagas es una de las principales endemias en América Latina, donde existen mas de
20 millones de individuos infectados. Si bien la transmision a través del insecto vector est á disminuyendo
en varios países por las medidas sanitarias adoptadas, a ún existen extensas áreas en riesgo. Por otra
parte, las vías congénita y transfusional adquieren importancia epidemiológica, debido a la gran cantidad
de individuos capaces de transmitir la infecci ón. La mayor incidencia de casos agudos ocurre en niños, y
en la mayoría de ellos es clínicamente inaparente, (Moya y col. 1985, 1989) por lo cual es esencial contar
con adecuadas herramientas diagnósticas, así como marcadores de eficacia terapéutica y predictores
evolutivos.
La etapa aguda está caracterizada por un estado de inmunosupresión que favorece la instalación y
diseminación del parásito en el huésped . (Kierszenbaum, Moretti, Stein, 1991,1993) seguida de
parasitemia y producción incrementada de mediadores inflamatorios. Uno de los interrogantes aún sin
respuesta es cuales son los mecanismos del parásito y del huésped determinantes de que, pasado el
período agudo, en un alto porcentaje de casos el Trypanosoma cruzi se comporte toda la vida como un
comensal, mientras que en aproximadamente el 30% de las personas infectadas induce algún grado de
patología card íaca o digestiva de distinta gravedad. Algunos grupos de investigación actualmente
sostienen que el nivel de parasitemia inicial puede determinar, de alguna manera, la aparición de
sintomatología en la fase crónica (Tarleton 1997). Por ello, si bien el desarrollo de vacunas tradicionales
tanto en Enfermedad de Chagas como en otras enfermedades parasitarias, parece una meta difícil de
alcanzar en el corto plazo, actualmente se piensa en estrategias basadas en la inmunointervención, a fin
de prevenir el desarrollo de la patología. Para ello es necesario avanzar en el conocimiento de los
mecanismos involucrados en la resistencia y en la patogenia de la enfermedad.
Por las características del T. cruzi , con un estadio intracelular y otro extracelular, la infección por este
parásito representa un gran desafio para el sistema inmune del hospedador. En efecto, una respuesta
efectiva contra el T. cruzi requiere de la inducci ón de múltiples mecanismos efectores, entre los que se
incluyen una potente respuesta de anticuerpos contra las formas extracelulares y una respuesta celular
eficaz contra el estadio intracelular. Por otra parte, en los estadios iniciales de la infecci ón es esencial la
respuesta innata o inespecífica, a trav és de sus efectores y moduladores celulares y moleculares. Así, las
citoquinas (CK) y mediadores solubles juegan un papel fundamental durante la infecci ón, ya que su
actividad determina, en gran medida el inicio, duraci ón y composici ón de las distintas vías efectoras de la
respuesta inmune (Fresno et al. 1997). En los últimos años se han realizado numerosos estudios
tendientes a analizar el rol que cumplen estos mensajeros químicos durante la infección por T. cruzi. Los
primeros trabajos que se realizaron en este sentido asociaron la producci ón de CK liberadas por los
linfocitos T helper (Th) 1, como el interferón gamma (IFN-g ) con el control de la parasitemia durante la
fase aguda de la infección experimental (Reed 1988, Torrico et al. 1991). En contraste, la producción de
CK de tipo Th2, en particular IL-10, se ha relacionado principalmente con un incremento en la
susceptibilidad a la infección (Reed et al.1994). En consecuencia, el estudio de los niveles endógenos de
algunas CK en una infecci ón dada, ayudaría a determinar el fenotipo celular principalmente involucrado
en la respuesta y, eventualmente, efectuar inferencias acerca del pronostico y evolución de la infección.
(Zhang & Tarleton 1996).
El paradigma de la polarización Th1-Th2 en enfermedades parasitarias se visualiza en la Leishmaniasis
experimental, donde claramente un aumento de CK producidas por LiTh1 (IL2, TNF alfa e IFNgama) se
correlaciona con resolución de la infección, en cambio, incrementos de IL4, IL6 e IL10, sintetizadas por Li
Th2 están asociadas con un mal pronostico de la enfermedad (Scott 1989). Dicha asociación entre perfil
Th1 con resistencia y Th2 con susceptibilidad , no parece ser tan clara en la infecci ón por T. cruzi. , donde
existiría un mayor equilibrio entre los dos tipos celulares, Th1 y Th2 y, por ende, entre las CK por ellos
producidas, mas que una polarizaci ón neta de la respuesta (Zhang & Tarleton 1996). Además, la
producción de CK por otras células, como por ejemplo macrófagos y células NK (respuesta inmune
innata) juega un rol crucial en estadios tempranos, cuando aun no se ha desencadenado la respuesta
adaptativa.
Por otra parte, en infecciones humanas de diversa etiología, en los últimos años se ha centrado la
atención en la medición de moléculas que pueden ser eficaces marcadores evolutivos. Se conoce que el
Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNFa ) y la Interleuquina 6 (IL6) están involucrados en procesos
inflamatorios y en la patogénesis del shock s éptico (Olsson et al. 1993, Wilson et al 1998), cuando su
producción está incrementada a nivel sistémico. Asimismo, la producción de receptores de CK, su
liberación y la posibilidad de su medición por métodos inmunoenzimáticos (Rubin et al 1986 ) puede tener
interés clínico (Moretti et al.1994, 2000).
Tope
Con estos antecedentes, y los resultados obtenidos en estudios previos por nuestro grupo de trabajo,
decidimos abordar el estudio de los niveles plasmáticos de CK y receptores solubles en la Enfermedad de
Chagas experimental (TNFa , IL-6 e IL -10)y en la infección humana (TNFa , IL-6 y receptor soluble de IL2 (IL-2R). Las determinaciones se realizaron empleando el método inmunoenzimático (ELISA).
El desarrollo a nivel experimental se realizó:
1. En un modelo de vacunaci ón de ratones BALB/c con formas de cultivo de Trypanosoma rangeli,
parásito muy similar al T. cruzi pero no patógeno para el hombre. Se empleó este modelo, por cuanto se
demostró en estudios previos que se lograba conferir protección a los animales frente a la infecci ón por
formas virulentas del T. cruzi, incluso cuando el desafío con T. cruzi se realizó por per íodos mayores de 9
meses pos inmunización( Basso et al. 1991, Introini et al. 1998).
2. En ratones infectados y tratados con Benznidazol, droga tripanomicida de uso en humanos.
En todos los grupos se analizaron los niveles plasmáticos de CK en distintos períodos post infección
A nivel humano, se estudiaron niños de hasta 14 años, con infección aguda demostrada por métodos
parasitológicos, y otro grupo de la misma edad que cursaba la etapa indeterminada de la infección. En un
subgrupo de los pacientes con infección aguda se analizaron muestras apareadas pre y post tratamiento.
Como control se incluyó un grupo de niños no chagásicos.
Modelo experimental:
Efecto de la vacunaci ón
Como se puede observar en la Fig 1, los niveles de CK en los animales previamente vacunados fueron
significativamente diferentes a los s ólo infectados, en estrecha correlación con las parasitemias obtenidas
en los respectivos grupos. En efecto los resultados obtenidos con TNFa (Fig 1a) muestran que, a partir
del día 13 post infección (pi) los niveles aumentaron dramáticamente en los ratones sólo infectados. En
cambio, los animales inmunizados mostraron concentraciones significativamente menores, aunque
superiores a los ratones control, no infectados. Merece destacarse que los animales vacunados
resolvieron la infecci ón, sobreviviendo en un 95% más allá de 320 días p.i. En cambio, los ratones sólo
infectados murieron durante la infecci ón aguda, antes de los 25 días. La Fig 1 b muestra el perfil de IL6 a
lo largo del período agudo en ambos grupos, observándose un comportamiento similar a TNFa .
Nuevamente el grupo de animales infectados mostró un significativo incremento en sus niveles
plasmáticos a partir del día 13 p.i. Finalmente, en la Fig. 1 c se observan las concentraciones de IL10 en
ambos grupos. En los animales solo infectados esta CK mostró elevadas concentraciones plasmáticas,
nuevamente asociadas a las parasitemias, mientras que los animales previamente inmunizados
mantuvieron sus niveles dentro del rango de la normalidad
Figura 1a
Figura1b
Figura 1c
Tope
Efecto del tratamiento
A los fines de analizar el efecto del tratamiento paraciticida sobre los niveles de CK proinflamatorias, y
consecuentemente, si la determinación plasmática podía ser marcador de eficacia terap éutical, se
realizaron dos tipos de tratamientos, uno completo a partir del dia de la infección, con dosis controladas
de Beznidazol.y el segundo incompleto, consistió en disolver la droga en el agua del bebedero. La Fig 2,
resume los resultados obtenidos. Como puede observarse, los ratones que recibieron un adecuado
tratamiento antiparasitario nunca presentaron parasitemia detectable, y los niveles de TNFa (2a) e IL6
(2b) se mantuvieron dentro de la normalidad durante todo el período de estudio. Por el contrario, el grupo
sometido a tratamiento incompleto presentaron parasitemia detectable y valores incrementados de ambas
CK.
Figura 2a
Figura 2b
Tope
Infección humana
El estudio en pacientes que cursaban el periodo agudo de la infecci ón permitió analizar los niveles de las
mismas CK proinflamatorias en la infecci ón natural. La Fig 3a muestra la concentraci ón plasmática de
TNFa , revelando niveles significativamente incrementados con respecto a los niños no chagásicos. Por
su parte, cuando estos niños recibieron tratamiento paraciticida, se observ ó una tendencia descendente
de esta CK. También merece mencionarse que los niños con infecci ón en estado intermedio mostraron en
promedio, niveles ligeramente incrementados de TNFa . Con respecto al estudio de los niveles séricos de
IL6, (Fig. 3b) también se observó una tendencia en el grupo de niños con infección aguda a presentar
niveles elevados, aunque mostrando en este caso mayor dispersión. Cuando se dosaron los niveles de
IL2-R, se observó un marcado incremento de este receptor a nivel plasmático (Fig. 3c), y una disminuci ón
en respuesta a una adecuada terapéutica antiparasitaria.
Figura 3a
Figura 3b
Figura 3c
Tope
Los mecanismos responsables del desarrollo de patología en la enfermedad de Chagas todavía no han
sido bien dilucidados, aún cuando existen diversas hipótesis, recrudeciendo en los ultimos años la
discusion entre quienes defienden la patogenia autoinmune y quienes atribuyen el daño a la accion
directa del parásito. Sin embargo, cada vez resulta mas evidente el rol que tienen las CK en los
mecanismos fisiopatogenicos.(Tarleton 1997). Como es sabido, la síntesis de estas moléculas a nivel
local tiene efectos beneficiosos para el huésped; pero cuando esta producción no es regulada, y alcanzan
elevadas concentraciones a nivel sistémico, generalmente resulta perjudicial, con pérdida de proteínas,
hipovolemia, coagulaci ón vascular diseminada y, en última instancia, shock seguida de muerte. En este
sentido, se conoce que TNF-a e IL -6 desempeñan un rol importante como mediadores del shock en
sepsis bacterianas, en fiebres hemorrágicas virales y en la patogenia de infecciones parasitarias como la
malaria. (Tittus, et al. 1991, Wilson 1998)
En la infecci ón experimental, hemos detectado un marcado incremento en la producci ón de TNF-a , IL-6 e
IL-10 durante el período agudo, en forma paralela a la parasitemia y asociado a la muerte de los
animales. Sin embargo, en el modelo desarrollado en nuestro laboratorio, la aplicaci ón de un esquema de
vacunaci ón previa indujo una fuerte protecci ón frente a la infecci ón con T. cruzi, con bajas parasitemias,
elevada sobrevida y un marcado descenso en la liberación sistémica de estas CK, cuyas concentraciones
se acercaron a las de los animales sin infectar. En el caso de IL-10 la vacunación se asoció a niveles
plasmáticos normales durante todo el curso del estudio.
La estrecha asociación observada entre síntesis incrementada de CK proinflamatorias, elevadas
parasitemias y muerte de los animales sugiere que tales moléculas pueden estar involucradas en la
patogenia de la enfermedad en este modelo. Estos resultados concuerdan con los de otros autores, como
Truyens y col (1995), quienes demostraron que la caquexia asociada a la infección por T. cruzi está
mediada por la elevada producci ón de TNF-a . Por otra parte, Chandrasekar y col (1996) detectaron una
importante producción de CK proinflamatorias (IL-6, TNF-a , IL-1b ) en el miocardio de ratones infectados
con T. cruzi, sugiriendo que la liberación exacerbada de estas moléculas pueden contribuir al daño celular
en el tejido cardíaco.
En otros estudios realizados observamos que la síntesis de IFNg , CK tipo Th1 con actividad protectora,
estuvo preservada en los animales inmunizados. Además concomitantemente, con la vacunación
experimental se incrementó la síntesis de IL12, CK liberada por los macrófagos, que estimula la actividad
lítica de las células NK y la producción de IFNg . (Meyer et al., 1997, Trinchieri, 1995). Tomados en
conjunto, los resultados demuestran que la resistencia inducida por la vacunación experimental está
claramente asociada a un perfil de CK favorable para la resoluci ón de la infección
El efecto del tratamiento antiparasitario en la infección experimental es claramente demostrativo de la
probable utilidad de la determinación plasmática de TNF e IL-6 como marcadores de eficacia terapéutica.
En efecto, cuando el tratamiento se efectuó en forma controlada, y en dosis equivalentes a las utilizadas
en humanos, no se detectaron parásitos circulantes en los animales y los niveles de las CK ensayadas se
encontraron dentro de l ímites normales. En cambio, la administración incompleta de la droga, no eliminó
las parasitemias y, consecuentemente, no redujo sustancialmente los niveles de CK proinflamatorias. Por
otra parte, se confirmó lo observado con el modelo de vacunación, respecto a la asociación que existe
entre bajas parasitemias, bajos niveles de IL-6 y TNF-a y resolución de la infección.
Con respecto a lo que ocurre en la infección humana, los resultados obtenidos al dosar TNF-a en niños
chagásicos confirman lo observado a nivel experimental y, por otra parte, muestran que en la serie
estudiada por nosotros, esta CK permanece moderadamente elevada en algunos pacientes que cursaban
el período indeterminado. Si este hallazgo se confirma en mayor número de pacientes, podría tener
potencial interés para determinar su asociación con la evoluci ón cl ínica de la enfermedad. Actualmente
nos encontramos analizando la relación entre los niveles de TNF-a y de sus receptores solubles, debido a
la actividad moduladora de los mismos, que pueden neutralizar la acción inflamatoria de la CK, por lo cual
se encuentran entre los potenciales candidatos terapéuticos para ser usados como "anticitoquina" en
enfermedades infecciosas, autoinmunes y procesos tumorales (Olsson et al, 1993 ).
El incremento en los niveles plasmáticos de IL-2R, en los niños con infección aguda, ya observado en
nuestro laboratorio (Moretti et al. 1994), puede explicarse por que este receptor es marcador de
activación linfocitaria, y se conoce que el T. cruzi produce, durante las primeras fases de la infección una
activación policlonal que, juntamente con la inmunosupresi ón, favorece su instalaci ón y diseminación en
el huésped (Montes et al 1996,1999).
En resumen, independientemente de la fuente de producción o la circunstancia en que se liberan las
distintas CK, el estudio de las modificaciones que sufren estas moléculas a lo largo de un proceso
infeccioso es de sumo interés. En efecto, estos hallazgos nos ayudan a comprender la forma en que
actúa el sistema inmune como efector de la resistencia frente al T. cruzi , aportar al conocimiento de la
fisiopatogenia de la enfermedad o, inclusive, predecir la evolución de la misma y evaluar la eficacia del
tratamiento. En este sentido, como ha sido propuesto en sepsis bacterianas (Buck et al,1996, Moretti et
al.2000), la medición de estas moléculas puede proveer una nueva herramienta de laboratorio, de utilidad
cl ínica y epidemiológica en Enfermedad de Chagas.
Agradecimientos: Los autores agradecen la colaboración prestada por el Dr. Gustavo Barbieri, del
Centro de Chagas y Patología Regional de Santiago del Estero, por la provisión de los sueros humanos
empleados en el presente trabajo.
Tope
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Tope
Diagnóstico anatomopatológico da doença de Chagas
Edison Reis Lopes
Na América Latina, seja em aut ópsias com finalidade anatomoclínica seja naquelas com objetivo médico
legal, o necroscopista tem necessidade de conhecer e saber utilizar adequadamente os métodos dos
quais pode lançar mão para estabelecer o diagnóstico da infec ção chagásica e da doença de Chagas
(DC).
Inicialmente pode-se dividir os métodos utilizados para o diagnóstico acima referidos em parasitológicos e
morfológicos ( Quadro 1).
Quadro 1: Diagnóstico anatomopatológico da doença de Chagas
1. Métodos parasitológicos
1.1. Diretos (pesquisa de formas tissulares do parasita)
1.1.1. Microscopia óptica em preparados
histológicos (HE, Giemsa, etc)
1.1.2. Imunohistoquímica
1.1.3. Microscopia eletrônica
1.1.4. Microscopia confocal
1.1.5. Técnicas de Biologia Molecular
1.1.5.1. Reação em Cadeia da
Polimerase
1.1.5.2. Hibridação molecular
1.2. Indiretos
1.2.1. Imunodiagnóstico
1.2.1.1. Hemaglutinação indireta
1.2.1.2. Imunofluorescência indireta
1.2.1.3. Elisa
1.2.1.4. Fixação de complemento
1.2.2. Xenodiagnóstico "post mortem"
1.2.2.1. Artificial
2. Métodos morfológicos
As alterações morfológicas, que a DC produz nos principais órgãos lesados, são bem conhecidas e
encontram-se detalhadamente descritas especialmente em textos nacionais e de outros países da
América Latina (1,2,3,4,8,9). Os achados anatomopatológicos, especialmente aqueles do coração,
esôfago e cólon, com grande freq üência permitem, na quase totalidade dos casos que o
anatomopatologista, baseado somente nos achados morfológicos, macro e microsc ópicos, estabeleça um
diagnóstico definitivo da tripanossomíase cruzi nos chag ásicos na fase aguda ou com as formas cardíaca,
digestiva, mista ou com exacerbações agudas (reativação) da fase crônica. O mesmo não sucede, em
geral, nos chagásicos com a forma indeterminada e naqueles da forma cardíaca que falecem de modo
súbito inesperado. Nesses últimos casos o patologista tem, com freqüência, de lançar mão de métodos
parasitológicos, diretos ou indiretos, para formar o diagnóstico de infecção chagásica.
A abordagem do presente texto será limitada a análise dos métodos parasitológicos que o patologista
deve utilizar, para estabelecer o diagnóstico de infecçã o chagásica. Não serão aqui abordados os
achados morfológicos. A respeito destes devem ser consultados textos – alguns á
j anteriormente
mencionados - e artigos que tratam da anatomia patológica da DC.
Tope
1. M étodos parasitológicos diretos
A detecção das formas amastigotas do Trypanosoma cruzi em preparados histológicos permanentes
(lâminas) e mais raramente em raspados de órgãos são técnicas utilizadas desde praticamente o
descobrimento da DC e constituem os métodos parasitológicos, mais utilizados, no diagnóstico
anatomopatológico da infecção chagásica e da tripanossomíase cruzi.
Os cortes histológicos são obtidos a partir de fragmentos de órgãos devidamente processados podendo a
pesquisa de parasitas ser feita em lâminas coradas pela hematoxilina-eosina (HE) ou por outras técnicas
que permitem melhor observação da morfologia do parasita, como por exemplo, as derivadas do
Romanovsky como Giemsa e Leishman. Nestas condições as amastigotas aparecem a microscopia
óptica como organismos ovais ou esféricos com diâmetros de aproximadamente 1,5 a 3,0 x 3,0 a 6,5
micrômetros (m m) com núcleo grande e arredondado ocupando, às vezes, um terço do corpo do parasita
e cinetoplasto em forma de disco. Não há flagelo livre e sua porção intracitoplasm ática raramente é
visível. Estas formas amastigotas se reproduzem binariamente a cada 12 horas, formando "ninhos" que
podem chegar a albergar até 540 parasitas. Cumprido o ciclo intracelular do parasita o ninho se rompe e
as formas amastigotas – ao lado das tripo-mastigotas e epimastigotas – caem no interstício, local onde
podem ser encontradas isoladamente.
No período inicial da infecção, na qual tanto a parasitemia como o parasitismo tecidual são intensos,
facilmente são detectadas as formas amastigotas – especialmente quando estão nos ninhos – do T. cruzi,
inclusive em preparados corados pela clássica HE. São mais parasitadas as células musculares estriadas
e lisas, os macrófagos profissionais, as células acessórias dos órgãos linf óides, os fibroblastos e as
células de Schwann. No entanto o parasita parece multiplicar -se quase esclusivamente nas células
musculares onde se localizam os típicos ninhos de amastigotas. Nas demais células, não se encontram
ninhos típicos; no máximo, poucos parasitas, quase sempre menos de uma dezena. Na fase cr ônica da
DC o parasitismo tecidual é incomparavelmente menor que o da fase aguda, tendo mesmo se chegado a
admitir, anos atrás, que o encontro de formas amastigotas do T. cruzi em tecidos de chagásicos crônicos
era excepcional. Isto não foi comprovado em estudos mais recentes especialmente naqueles em que se
empregaram técnicas mais sensíveis de análise. Trabalhos também tem sugerido que em chagásicos
crônicos humanos haveria preponderância de parasitismo tecidual nas supra-renais, dados não
confirmados por outros autores.
Em tripanossomóticos imunossuprimidos, quando há reativação da DC, o parasitismo tecidual geralmente
torna-se acentuado, semelhando o visto na fase aguda da enfermidade Nestes casos de reativação os
dados, até agora conhecidos, sugerem que coração e encéfalo seriam os órgãos mais parasitados.
A imunohistoquímica, que é um conjunto de procedimentos que utiliza anti-corpos como reagentes
espec íficos para a detec ção de antígenos presentes em células ou tecidos, trouxe valiosa contribuição
para o diagnóstico anatomopatológico da DC (5). Como os agentes infecciosos possuem antígenos
próprios, sua detec ção nos tecidos permite diagnóstico etiológico preciso. Acresce que as técnicas
imunohistoquímicas propiciam estudo mais completo e profundo da resposta tecidual desenvolvida pelo
hospedeiro a infecção, através da caracterização fenot ípica das células inflamatórias, de citocinas e de
outros fatores participantes do processo lesional. Deve-se ainda realçar que as referidas técnicas podem
ser aplicadas, em materiais congelados, fixados (em formol ou outros fixadores habituais) e emblocados
em parafina. Lamentavelmente não há disponibilidade no mercado de anticorpos comerciais para
identificação do T. cruzi. Existem entretanto centros de pesquisa que possuem anticorpos específicos de
excelente qualidade. A identificação do T. cruzi é feita pelo delineamento das formas amastigotas
constituindo os ninhos parasitários, de material particulado intracelular (fibras musculares, neurônios,
macrófagos) ou intersticial.
Uma das grandes aplicaçõ es da imunohistoquímica é no diagnóstico diferencial entre o T. cruzi com
outros agentes infecciosos que por suas características morfológicas podem ser confundidos com o
agente etiológico da DC. Dentre estes merecem realce o Toxoplasma gondii e outros protozoários como
Isospora, Microsporidium, Leishmanias sp, etc.
A pesquisa de formas amastigotas do T. cruzi em preparados histológicos permanentes corados pela HE
e/ou por derivados do Romanosky constitue ainda o mais eficiente, prático e econômico método para o
diagnóstico anatomopatológico da infecçã o chagásica. A imunohistoquímica trouxe valioso auxílio ao
diagnóstico específico do agente etiológico.
Três outros métodos parasitológicos diretos podem ainda ser aplicados no diagnóstico da DC: a
microscopia eletrônica, a microscopia confocal (10) e as técnicas de biologia molecular (reação em
cadeia da polimerase e hibridização molecular). Nenhum constitue método de rotina sendo usados só
excepcionalmente. Nos últimos anos a reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo mais
frequentemente empregada em estudos sobre a terapêutica da DC (nos quais há necessidade de se ter a
melhor avaliação possível em rela ção ao controle da infecção) e como instrumento que tem permitido
demonstrar não ser excepcional – ao contr ário do que alguns chegaram a admitir – a persistência do T.
cruzi na fase crônica da DC.
2. M étodos parasitológicos indiretos
Dois são os métodos parasitológicos indiretos utilizados para o diagnóstico anatomopatológico da DC:
imunodiagnóstico e xenodiagnóstico.
O diagnóstico da infecção chagásica pelo imunodiagnóstico é feito por métodos imunológicos que
consistem em reações sorológicas que buscam revelar a pesquisa de anticorpos ou de ant ígenos no
organismo. Pode-se empregar as mesmas técnicas usadas no diagnóstico sorológico da DC "in vivo". Em
nossa experiência os melhores resultados para o diagnóstico sorológico "post-mortem" da infecção
chagásica são obtidos quando as reações são realizadas no líquido pericárdico. Em 1978 (6) efetuamos
análise comparativa entre os testes de hemaglutinaçã o, imunofluorescência e fixação do complemento no
líquido pericárdico obtido a autópsia de 50 indivíduos com cardite chagásica crônica comprovada
anatomopatologicamente. Em 94%, 92% e 88% respectivamente as reações de hemaglutinação,
imunofluorescência e fixação de complemento foram reagentes. Os resultados além de demonstrar que
todas três reações são eficientes para o diagnóstico pós-mortem da DC, sugeriram que o uso associado
dos três testes pode detectar mais casos de infecção chagásica do que uma reação isolada. Em nosso
entender o emprego destas reações é de grande interesse para rastrear casos de DC em necrópsias
realizadas em áreas endêmicas da tripanossomíase.
Outro método parasitológico indireto que se pode utilizar para o diagnóstico necroscópico da DC é o
xenodiagnóstico artificial(7). Este baseia-se na multiplicação do triatomíneo lançando mão para a
alimentaçã o do hematófago, de sangue previamente retirado do paciente. Em nossa experiência o teste
foi positivo em 30% dos chagásicos necropsiados. Embora constituindo mais um método diagn óstico da
DC o xenodiagnóstico artificial tem sua aplicação voltada especialmente para finalidades de pesquisa.
Tope
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