metabolismo peri-parto em cadelas
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metabolismo peri-parto em cadelas
1 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde Departamento de Medicina Veterinária Curso de Medicina Veterinária em Betim Aline Araújo França Gabriella Matoso Lima Diamantino METABOLISMO PERI-PARTO EM CADELAS: CARACTERIZAÇÃO E COMPARAÇÃO ENTRE AS RAÇAS PASTOR ALEMÃO E BULDOGUE INGLÊS Betim 2013 2 Aline Araújo França Gabriella Matoso Lima Diamantino METABOLISMO PERI-PARTO EM CADELAS: CARACTERIZAÇÃO E COMPARAÇÃO ENTRE AS RAÇAS PASTOR ALEMÃO E BULDOGUE INGLÊS Monografia apresentada ao Curso de Medicina Veterinária em Betim da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Medicina Veterinária. Orientador: Guilherme Ribeiro Valle Betim 2013 3 Aline Araújo França Gabriella Matoso Lima Diamantino METABOLISMO PERI-PARTO EM CADELAS: CARACTERIZAÇÃO E COMPARAÇÃO ENTRE AS RAÇAS PASTOR ALEMÃO E BULDOGUE INGLÊS Monografia apresentada ao Curso de Medicina Veterinária em Betim da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Medicina Veterinária. ____________________________________________ Prof. Guilherme Ribeiro Valle (orientador) – PUC Minas ____________________________________________ Prof. Hudson Nunes da Costa – PUC Minas ____________________________________________ Profa. Christina Malm – UFMG Betim, 18 de junho de 2013 4 Dedico este trabalho aos Mestres e Doutores que nos ensinam e guiam, aos familiares que sempre nos apoiam e nos dão força, e aos amigos que nos proporcionam momentos de alegria. 5 AGRADECIMENTOS Agradecemos ao orientador Professor Guilherme Ribeiro Valle por todo o conhecimento transmitido, toda dedicação e atenção despendida ao nos orientar. A Professora Fernanda Guimarães por todas as oportunidades e pela indicação ao projeto de iniciação científica. Ao Gregório Guilherme Almeida por toda dedicação e ajuda prestada, foi de grande importância em nosso trabalho, e por abrir as portas do Laboratório, LAC, do Hospital Veterinário Animal Center. Agradecemos aos médicos veterinários Rodrigo Leite e Thiago Martins, por disponibilizarem os animais e as instalações do Canil Don Martir para a realização deste trabalho. Agradecemos também a funcionária Flávia Letícia do laboratório de Patologia Clínica do Hospital Veterinário da PUC Minas por toda paciência, e aos alunos Matheus Zolini e Lígia Soares pela ajudas na etapa de coleta no canil. Enfim, a todos muito obrigada, este experimento é a realização de um sonho e sem vocês nada seria possível. 6 "As muralhas estão lá para deter aqueles que não querem realmente transpô-las, Elas estão lá para deter os outros. Para nos dar a chance de mostrar a força das nossas aspirações" "Muita gente passa a vida lamentando seus problemas. Sempre acreditei que quando se aplica um décimo da energia das reclamações na tentativa de resolver o problema, tem-se a surpresa em constatar que tudo pode dar certo." "A lição final" do Randy Pausch 7 RESUMO O presente estudo discute possíveis problemas no periparto de cadelas, que podem acarretar prejuízos à saúde da fêmea e da ninhada. Foram utilizadas 13 cadelas, sendo cinco da raça Pastor Alemão e oito da raça Buldogue Inglês. Pesagem das cadelas e dos filhotes, coleta de leite, citologia vaginal, coleta de sangue para realização de hemogramas e análises bioquímicas dos níveis séricos de cálcio, fósforo, albumina, magnésio e proteínas totais foram realizadas. De acordo com as análises estatísticas pode-se perceber que as cadelas da raça Pastor Alemão possuíram maior desafio na criação dos filhotes do que as da raça Buldogue Inglês, e ainda assim conseguiram manter o peso e apresentaram menor taxa de mortalidade acumulada dos filhotes. A bioquímica sérica aponta para a diminuição dos níveis de proteína total, albumina, globulina e cálcio total no pré-parto atingindo níveis mínimos no parto, com elevação gradativa ao longo do pós-parto em ambas as raças, que também apresentaram hipocalcemia no parto com retorno aos níveis normais entre sete e 14 dias pós-parto. Os dados levantados neste estudo apontam que as cadelas da raça Pastor Alemão possuem uma maior habilidade materna. Palavras-chave: Cão; Periparto; Buldogue Inglês; Pastor Alemão; Bioquímica 8 ABSTRACT The present research discusses possible problems that may occur in bitches´s postpartum that can lead to health problems of the female and her brooding. Thirteen bitches were utilized in this study, being five of the German Shepherd breed and eight of the British Bulldog breed. For the verification of these problems, the research used weighing bitches and puppies, milk collection, vaginal cytology, blood counts, as well as biochemical analysis of serum calcium, phosphorus, albumin, total protein and magnesium. According to the statistical analysis, it can be seen that the German Shepherd bitches faced a greater challenge than the British Bulldogs while raising their offspring, and still managed to keep the weight and had lower cumulative mortality rate of pups. The serum biochemistry points to the decreased levels of total protein, albumin, globulin and total calcium in antepartum reaching minimum levels at the birth of the offspring, with gradual increase throughout the postpartum in both races, that also presented hypocalcemia at birth with a return to normal levels between seven and fourteen days postpartum. The data collected in this study indicate that the bitches of the German Shepherd breed have a higher maternal efficiency. Keywords: Dog; Peripartum; English Bulldog; German Shepherd; Biochemistry 9 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Coleta de sangue na veia jugular de cadela Buldogue Inglês................... 23 FIGURA 2 Centrifugação para obtenção de soro sanguíneo...................................... 24 FIGURA 3 Realização do teste Somaticell® no leite coletado das cadelas........... 25 Introdução de swab pela vulva de cadela Buldogue Inglês para citologia vaginal....................................................................................... 25 Aparelho portátil para medição de glicose e corpos cetônicos circulantes Optium Xceed (Abbott Laboratories).................................... 37 Concentração sérica de proteínas totais em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto................................ 48 Concentração sérica de globulinas em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto........................................... 49 Concentração sérica de albumina em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto. ........................................... 49 Concentração sérica de cálcio total em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto........................................... 49 Correlação entre cálcio total e cálcio livre (iônico) em cadelas das raças Buldogue Inglês (r2 = 0,92; p<0,0001) e Pastor Alemão (r2=0,95;p<0,0001). ................................................................................ 50 Concentração sérica de cálcio livre (ionizado) em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto................ 50 Concentração sérica de fósforo em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto............................................. 51 FIGURA 4 FIGURA 5 FIGURA 6 FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9 FIGURA 10 FIGURA 11 FIGURA 12 FIGURA 13 Concentração sérica de magnésio em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto............................................. FIGURA 14 Correlações entre as concentrações séricas de Ca e P em cadelas das raças Buldogue Inglês (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período periparto (r=0,01 e P=0,95; Spearman) ......................................................... 52 52 10 LISTA DE TABELAS TABELA 1 Características físicas de cadelas e ninhadas das raças Pastor Alemão e buldogue inglês no periparto......................................................... 29 30 TABELA 2 Hemograma de cadelas da raça Pastor Alemão e Buldogue Inglês no periparto TABELA 3 Contagem de células somáticas (CCS) e contagem diferencial de leucócitos no leite de cadelas Pastor Alemão e Buldogue Inglês........... 31 Citologia vagina de cadelas da raça Pastor Alemão e Buldogue Inglês no pós-parto.................................................................................................... 31 Cetonemia e glicemia de cadelas Pastor Alemão e Buldogue Inglês no periparto...................................................................................................... 40 TABELA 4 TABELA 5 11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Ca Cálcio D-30 Trinta dias pré-parto D0 Dia do parto D7 Sete dias pós-parto D14 Quatorze dias pós-parto D21 Vinte e um dias pós-parto D30 Trinta dias pós-parto GH Hormônio do crescimento g/dL Gramas por decilitro IGF-2 Fator de crescimento semelhante à insulina 2 LH Hormônio luteinizante Mg Magnésio NO Óxido nítrico OT Ocitocina P Fósforo PGF2α Prostaglandina F2 alfa PGI2 Prostaglandina I2 PRL Prolactina PTH Paratormônio P4 Progesterona 12 SUMÁRIO CAPÍTULO 1: ASPECTOS GERAIS DO PERI-PARTO DAS CADELAS .... 14 1. 1 INTRODUÇÃO GERAL................................................................................ 14 1.2 OBJETIVOS...................................................................................................... 15 1.3 REVISÃO DA LITERATURA........................................................................ 1.3.1 Ciclo reprodutivo da cadela ......................................................................... 1.3.1.1 Ciclo estral.................................................................................................... 1.3.1.2 Gestação ....................................................................................................... 1.3.1.3 Parto.............................................................................................................. 1.3.1.4 Pós-parto e lactação..................................................................................... 15 15 15 16 18 19 1.4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 1.4.1 Animais e delineamento experimental ........................................................ 1.4.2 Desenvolvimento corporal das cadelas e ninhada....................................... 1.4.3 Coletas de sangue........................................................................................... 1.4.4 Coletas de leite................................................................................................ 1.4.5 Citologias vaginais ........................................................................................ 1.4.6 Análises estatísticas....................................................................................... 21 21 22 22 24 25 26 1.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 26 1.6 CONCLUSÃO................................................................................................... 32 CAPÍTULO 2: METABOLISMO ENERGÉTICO............................................. 33 2.1 REVISÃO DA LITERATURA........................................................................ 2.1.1 Glicemia........................................................................................................... 2.1.2 Cetonemia....................................................................................................... 2.1.3 Dosadores portáteis de glicose e corpos cetônicos plasmáticos.................. 33 34 35 36 2.2 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 2.2.1 Dosagens de glicose e corpos cetônicos......................................................... 2.2.2 Análises estatísticas........................................................................................ 36 36 37 2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 37 2.4 CONCLUSÃO................................................................................................... 39 CAPÍTULO 3: METABOLISMO MINERAL ................................................... 40 3.1 REVISÃO DA LITERATURA....................................................................... 40 3.2 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 3.2.1 Dosagem de proteína total, globulinas, albumina, cálcio, fósforo, magnésio, séricos....................................................................................................................... 3.2.2 Análises estatísticas........................................................................................ 46 46 46 13 3.3 RESULTADO E DISCUSSÃO...................................................................... 3.4 CONCLUSÃO................................................................................................... 46 54 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO GERAIS.............................................................. 55 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 56 ANEXOS.................................................................................................................. Anexo 1: Níveis de garantia e ingredientes das rações utilizadas no experimento 61 62 14 CAPÍTULO 1: ASPECTOS GERAIS DO PERI-PARTO DAS CADELAS 1.1. Introdução Geral Atualmente, os cães desempenham importante papel na sociedade como animais de estimação ou companhia, além das finalidades de caça, guarda de rebanhos, guarda de domicílios e propriedades, por meio de diversas raças especializadas. Servem também como modelo experimental para estudos aplicáveis a outras espécies, como o próprio ser humano, e aos carnívoros selvagens ameaçados de extinção (LUZ, 2012). Neste contexto, a forte inter-relação entre a reprodução e fatores como o meio ambiente e a nutrição implica na utilização de conceitos recentes, provenientes da constante investigação sobre a interferência desses fatores no desempenho reprodutivo (GRUNERT et al., 2005). No pós-parto de cadelas podem ocorrer diversos problemas, acarretando em prejuízos à saúde da fêmea e da ninhada. A tetania puerperal, ou hipocalcemia pós-parto, é uma condição que se desenvolve no peri-parto como resultado da diminuição da concentração plasmática de cálcio (Ca), resultado das exigências da mineralização do esqueleto fetal e da lactação. A lactação leva a um decréscimo considerável das reservas de Ca do organismo da cadela podendo o Ca da dieta não ser capaz de compensar esta exigência, sendo necessário recorrer às reservas ósseas, por intermédio do paratormônio (PTH) (COSTA, 2010). Metrite é uma inflamação do endométrio e miométrio (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). A metrite puerperal aguda é uma doença grave que causa sintomatologia e ocorre, geralmente, nos primeiros três dias após o parto, embora possa se estender até uma semana pós-parto ou mesmo desenvolver-se ainda durante a gestação (COSTA, 2010). Já a mastite é a inflamação da glândula mamária, normalmente devido a infecção bacteriana, que ocorre frequentemente em fêmeas lactantes (COSTA, 2010), embora possa surgir em cadelas com galactorréia associada à pseudogestação (DOSHER, 2009; KUSTRITZ, 2010). Pode ser uma condição aguda e pôr em risco a vida da fêmea, levando-a a apresentar sintomatologia sistêmica (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). A agalactia é uma condição na qual a cadela falha em produzir leite. Ela pode ser primária, quando é resultado de anormalidades morfofisiológicas, ou secundária, resultante de deficiências nutricionais, estresse, parto prematuro, terapia progesterônica, metrite, mamite e 15 doenças sistêmicas diversas. Nesses casos, deve-se procurar corrigir a causa primária (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Entretanto, além dessas condições clínicas comuns em cadelas no pós-parto, condições subclínicas relacionados ao metabolismo energético e de minerais poderiam causar comprometimento da habilidade materna, resultando em desenvolvimento inadequado e/ou mortalidade da ninhada. 1.2 Objetivos O presente estudo teve como objetivo geral caracterizar o metabolismo energético e de minerais no pós-parto de cadelas. Além disso, objetivou-se comparar este perfil metabólico entre as raças Pastor Alemão e Buldogue Inglês e estabelecer relações entre eles e a habilidade materna das cadelas. 1.3. REVISÃO DE LITERATURA 1.3.1 Ciclo reprodutivo da cadela 1.3.1.1 Ciclo estral A cadela é uma fêmea monoéstrica predominantemente não-estacional, com intervalo interestro de 5-12 meses, e os estádios do seu ciclo estral são: o proestro e estro, que correspondem à fase folicular; o diestro, que representa a fase luteínica; e o anestro, fase de quiescência. São descritas a seguir, conforme Johston, Kustritz e Olson (2001). Clinicamente, o proestro (3-21dias; média de nove dias) pode ou não estar associado a uma descarga vaginal hemorrágica, causada pela diapedese eritrocitária nos vasos endométriais e ruptura capilar subepitelial. Durante este período, a fêmea apresenta a vulva edemaciada e hipertrofiada, a cérvix dilatada, o endométrio espessado e há aumento na atividade glandular e no crescimento dos ductos e túbulos das glândulas mamárias. Estas modificações são causadas pelo aumento da concentração de estrógenos circulantes nesta fase. A manifestação comportamental da fêmea caracteriza-se pela atração do macho, entretanto sem permitir a cópula. O estro é caracterizado pela receptividade sexual e aumento crescente das concentrações plasmáticas de progesterona (P4), com duração média de uma semana, 16 podendo variar de dois dias a três semanas. Na maioria dos ciclos, o pico pré-ovulatório do hormônio luteinizante (LH), que desencadeia as ovulações, ocorre um dia antes da transição comportamental de proestro para estro, embora o início do estro e a primeira cobertura possam ocorrer 2-3 dias antes até 4-5 dias após o pico de LH. Ao final do estro, inicia-se o diestro, fase progesterônica com duração de 60 dias, período semelhante ao da gestação, caso tenha ocorrido concepção. Ao final do diestro ou da gestação, inicia-se o anestro, com duração de 3-4 meses, antes que se inicie novo proestro. O ciclo completo tem duração média de seis meses, embora possa ter quatro a 12 meses de duração, dependendo da raça da cadela. 1.3.1.2 Gestação A gestação da cadela tem duração média de 59 a 62 dias (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Concentrações elevadas de P4 são necessárias para a manutenção da gestação, pois ela é responsável pelo desenvolvimento das glândulas endometriais, secreção de fluidos uterinos, crescimento endometrial, manutenção da placenta, inibição da motilidade uterina e eliminação da resposta leucocitária intrauterina (OLIVEIRA; MARQUES JÚNIOR, 2006). A relaxina, hormônio polipeptídico produzido no corpo lúteo e na placenta, tem ação semelhante e sinérgica à da P4 na manutenção da quiescência do útero durante a gestação (GRUNERT et al., 2005). Havendo fertilização dos ovócitos, os embriões formados permanecem nas tubas uterinas por até 6-8 dias, chegando, em seguida, à luz uterina após relaxamento do istmo das tubas uterinas. No útero, os embriões ficam livres e se movimentam entre os cornos por até 14-16 dias de gestação, sendo nutridos pelas secreções das glândulas endometriais, estimuladas pela P4. Nenhum mecanismo de reconhecimento materno da gestação foi ainda identificado na cadela (LUZ; FREITAS; PEREIRA, 2005). A partir de 14-16 dias de gestação, os embriões se fixam no endométrio e inicia-se a formação das placentas, endoteliocoriais zonárias (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). A calcificação do esqueleto fetal ocorre em torno de 40 dias, mesmo momento a partir do qual há um desenvolvimento corporal dos fetos muito acelerado, que não é acompanhado pelo útero, situação que leva a gradativo estiramento da parede uterina (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). 17 O aumento da demanda de Cálcio (Ca) e fósforo (P) para a mineralização dos esqueletos fetais, no terço final da gestação, torna importante o aumento da ingestão desses minerais. Entretanto, apesar do aumento da demanda nutricional de Ca durante a gestação e lactação, suas necessidades são normalmente supridas com alimentação balanceada, não sendo necessária qualquer suplementação, o que poderia predispor eclampsia e distocia nas cadelas, bem como calcificação de tecidos moles fetais (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Ao longo da gestação, o desenvolvimento mamário ocorre a fim de que a fêmea possa produzir leite suficiente para a lactação da ninhada. Intensa proliferação do epitélio lóbuloalveolar ocorre por influência sinérgica da P4, prolactina (PRL) e fator de crescimento semelhante a insulina 2 (IGF-2) (GREGERSON, 2006). A estimulação mamária pela P4, tanto no diestro como na gestação, levam à produção exacerbada de hormônio do crescimento (GH) pelo tecido mamário, o que pode causar hiperglicemia nas cadelas nessa fase, devido a resistência periférica à insulina induzida pelo GH (KOOISTRA; OKKENS, 2002). O volume abdominal ocupado pelo útero faz com que a cadela passe a sofrer restrição de espaço estomacal, causando-lhe redução do consumo de alimentos (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 2006). Assim, é importante que a cadela esteja em boa condição corporal antes de entrar em reprodução, pois fêmeas muito magras podem não conseguir, durante a gestação, ingerir alimento suficiente para atender suas próprias necessidades nutricionais sua e dos fetos em desenvolvimento (CARCIOFI; PRADA, 2003). Além disso, fêmeas subnutridas apresentam taxa de concepção reduzida e maior risco de perda gestacional (TONIOLLO; VICENTE, 2003). A alimentação da fêmea interfere na sobrevivência embrionária, estando os fatores nutricionais entre as principais causas de reabsorção embrionária, abortamentos espontâneos não infecciosos, especialmente na segunda metade da gestação, além de poder levar a outras enfermidades, como prolapsos vaginais (TONIOLLO; VICENTE, 2003). Os filhotes nascidos de cadelas desnutridas podem estar abaixo do peso, o que tende a comprometer o desenvolvimento da ninhada, havendo ainda o risco de hipoglicemia em cadelas com baixo peso corporal ao final da gestação e início da lactação (JACKSON, 2005). Deficiências de ácidos graxos essências como o Omega 3 e 6, foram associadas a desenvolvimento placentário ruim, ninhadas pequenas e com baixo peso ao nascer e parto prematuro (PRESTES; LANDIM-ALAVARENGA, 2006). 18 1.3.1.3 Parto O parto é definido como o conjunto de eventos fisiológico que conduzem o útero a expulsar o feto a termo e seus anexos (TONIOLLO; VICENTE, 2003). Possui três estádios, mas constitui um processo contínuo. O estádio 1 envolve contrações miometriais e com dilatação da cervical. O estádio 2 é a expulsão do feto através do canal de parto dilatado. O estádio 3 é a expulsão da placenta. Os estádios 2 e 3 são fundidos em espécies polítocas, como a cadela (REENCE, 2006). Não é um evento estimulado, mas sim é o resultado da remoção de diversos efeitos inibitórios à contração miometrial (GIBBS; LYE; CHALLIS, 2006). Para que o parto ocorra, deve haver contração miometrial produtiva e relaxamento cervical. Entretanto, o mecanismo desencadeador do parto ainda não é completamente esclarecido para cadelas (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Ao se aproximar o momento do parto, a relaxina causa relaxamento e dilatação da cérvix e relaxamento da sínfese pubiana e dos ligamentos pélvicos, possibilitando a expansão da cavidade pélvica facilitando a passagem dos fetos pelas vias fetais (GRUNERT et al., 2005). O principal evento endócrino do parto é a alteração da proporção estrógenoprogesterona, devido à queda de P4. O declínio desse hormônio reflete no descolamento da placenta, dilatação da cérvix e aumento da contratilidade uterina. Ocorre o aumento da sensibilidade do miométrio à ocitocina (OT), e esta estimula a produção de prostaglandina F2alfa (PGF2α) pelo útero (OLIVEIRA; MARQUES JÚNIOR, 2006). Durante a gestação, o miométrio é pouco responsivo às uterotoninas, como OT e PGF2, ocorrendo contrações de baixas frequência e amplitude. Dentre os inibidores da ação miometrial estão a P4, a relaxina, o óxido nítrico (NO) e a prostraglandina I2 (PGI2). Estudos em ratos apontam que o NO é o principal responsável pela inibição da atividade contrátil miometrial durante a gestação, havendo redução dos seus níveis ao se aproximar o final da gestação, o que ocorre em associação à maior atividade da OT no miométrio aumentando as concentrações de Ca intracelular, além de estimular a produção placentária de PGF2α (GIBBS; LYE; CHALLIS, 2006). A contração miometrial é resultante da elevação dos níveis intracelulares de Ca, seja por aumento do influxo desse íon através da membrana plasmática dos leiomiócitos ou pela mobilização dos seus estoques citoplasmáticos (GIBBS; LYE; CHALLIS, 2006). 19 1.3.1.4 Pós-parto e lactação A cadela possui o intervalo longo entre o parto e o restabelecimento da atividade ovariana cíclica. A atividade do ovário não recomeça até três a cinco meses após o diestro/gestação anterior, descartando assim, diferentemente do que ocorre em outras espécies, qualquer influência da lactação sobre o desenvolvimento folicular do próximo proestro/estro (MÉO, 2000). Cadelas que estiveram gestantes permanecem em lactação por 45 a 60 dias, embora esse período possa ser reduzido em caso de morte da ninhada ou desmame precoce (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). No início da lactação os níveis circulantes de PRL são elevados, como resultado da sua maior liberação ao parto, e assim continuam, ao longo da lactação por estímulo da mamada dos filhotes (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001; GIBBS; LYE; CHALLIS, 2006). No início da lactação, os níveis circulantes de Prolactina (PRL) estão elevados, como resultado da sua maior liberação no parto, e assim continuam, ao longo da lactação, por estímulo da mamada dos filhotes. Ao realizarem a sucção das tetas, as crias estimulam vias nervosas aferentes que inibem a liberação de dopamina pelo hipotálamo, com consequente desbloqueio da liberação de PRL pela adenohipófise (GREGERSON, 2006). Além disso, a mesma estimulação das tetas desencadeia a liberação neurohipofisária de OT, possivelmente tendo a serotonina como um dos mediadores dessa liberação (WAKERLEY, 2006). A OT, por sua vez, estimula a contração das células mioepiteliais dos alvéolos mamários, além de, aparentemente, estimular também a liberação de PRL adenohipofisária (GREGERSON, 2006). A PRL também é produzida no próprio tecido mamário, mas esta tem ação apenas local (GREGERSON, 2006). Imediatamente após o parto, a primeira secreção mamária é o colostro, de vital importância para proporcionar imunidade passiva aos filhotes recém-nascidos, concedida na forma de imunoglobulinas e outros fatores imunes absorvidos pela mucosa intestinal dos filhotes. Além dos benefícios nutricionais e imunológicos do colostro, o volume de líquido ingerido imediatamente após o nascimento contribui significativamente para a normalidade do volume circulatório pós-natal dos filhotes (DOMINGOS; ROCHA; CUNHA, 2008). Diversas formas de colostro são produzidas durante as primeiras 24-72 horas após o nascimento, até se tornar leite. A composição do colostro possui concentrações mais baixas de proteínas, gorduras e sólidos totais do que o leite (CASE; CAREY; HIRAKAWA, 1998). Entre sete e 37 dias de lactação, a composição média do leite em sólidos totais (22,7%), gordura (9,5%) e 20 proteína (7,5%) não varia. Entretanto, o percentual de açúcares se eleva gradativamente do 7º (3,5%) até o 30º dia de lactação (4,1%) (OFTEDAL, 1984). Durante a lactação, considerando ninhadas com ingestão exclusiva de leite até 25 dias, cada filhote ingere de 15 a 17% de seu peso corporal em leite diariamente, representando, para filhotes da raça Beagle, 160 a 175g de leite/dia, resultando em ganho de peso médio de 36,8g/dia (OFTEDAL, 1984). O peso dos filhotes diminui ligeiramente ou não muda no primeiro dia de vida, recuperando-se no segundo dia e, logo depois, começa a aumentar. Um filhote canino deve duplicar seu peso em 10 a 12 dias de vida, com um aumento diário em média de 2g para cada quilograma de peso calculado para um adulto (DOMINGOS; ROCHA; CUNHA, 2008). A dificuldade em mamar e/ ou pouco leite da mãe pode promover uma queda brusca do peso, levando o filhote a óbito. A amamentação também ajuda a controlar a temperatura, pois o leite materno é 3 a 4°C superior a temperatura corpórea (DOMINGOS; ROCHA; CUNHA, 2008). Constantemente estimulada pela PRL, a quantidade de leite produzido é regulada pela sua demanda, por meio de fatores químicos, como produtos da hidrólise da caseína, e mecânicos, como a distensão alveolar, que inibem a sua produção (NEVILLE, 2006). A cadela produz cerca de 8% do seu peso corporal em leite diariamente, atingindo o pico de produção às quatro semanas de lactação (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 2006). Para cadelas Beagle com ninhadas de 5-7 filhotes, isso representa aproximadamente 1,0L de leite produzido por dia (OFTEDAL, 1984). As exigências nutricionais da cadela para mantença e lactação determinam aumento do seu consumo de alimento, que pode chegar a duas a três vezes o consumo da mantença (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Entretanto, há limitação física do aparelho digestório (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 2006). Cadelas de porte pequeno podem chegar a aumentar em 4,5 a 9,0% sua capacidade de ingestão de alimentos, mas as de porte grande e gigante não ultrapassam 3,2%. Essa situação determina, nestas últimas, mobilização de gordura corporal para suprir suas necessidades energéticas nesse período, o que desencadeia balanço energético negativo (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 2006). Para que uma cadela com 5-8 filhotes obtenha da dieta a energia necessária para não perder condição corporal durante a lactação, considerando sua capacidade de ingestão máxima, a dieta deveria fornecer 4.200kcal/kg em energia metabolizável (CASE; CAREY; HIRAKAWA, 1998). A involução uterina pós-parto na cadela está histologicamente completada em 90 a 120 dias, com o útero atingindo seu peso pré-gestacional em 60-120 dias, e aspecto 21 ultrassonográfico pré-gestacional em 105 dias (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). A cadela permanece eliminando secreção vaginal serossanguinolenta durante um período de três semanas (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Entretanto, mesmo não havendo lesão endometrial física, como na gestação, 90 a 120 dias são necessários para a recuperação endometrial após ação da P4 do diestro/gestação (JEUKENNE; VERSTEGEN, 1997; PURSWELL; PARKER, 2000), sob pena de haver infertilidade (WANKE; LOZA; REBUELTO, 2006). As principais mudanças relacionadas à recuperação do endométrio são observadas durante as primeiras nove semanas pós-parto, quando ocorre intensa necrose celular e do tecido conectivo, com sua expulsão como lóquio e/ou reabsorção (OLIVEIRA; MARQUES JÚNIOR, 2006). 1.4. MATERIAL E MÉTODOS 1.4.1 Animais e delineamento experimental Este experimento foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da PUC Minas em 12 de setembro de 2011, com o protocolo no 084/2011. Foram utilizadas 13 cadelas, cinco da raça Pastor Alemão e oito da raça Buldogue Inglês, e suas respectivas ninhadas, pertencentes a um canil localizado na região metropolitana de Belo Horizonte-MG. As cadelas em reprodução e gestantes eram mantidas em grupos de três a cinco animais em canis coletivos com abrigo de piso cimentado e solário de terra ou grama. As cadelas paridas ficavam em canis individuais (maternidade) com as respectivas ninhadas até o desmame, que ocorria aos 30 dias após o parto. Todos os animais do canil eram submetidos a manejo sanitário por meio de calendário anual de vacinações contra as principais doenças infecciosas dos cães (Recombitek C6/CV, Merial; Rabsin-i, Merial; Pneumodog, Merial), controle de parasitas gastrointestinais (Drontal Plus, Bayer) e de ectoparasitas e vetores (Scalibor, MSD Saúde Animal). As cadelas eram alimentadas com ração comercial (Cibau Adult Formula, Farmina Anexo 1) fornecida duas vezes ao dia e água à vontade. A alimentação das cadelas gestantes era modificada, a partir dos 30 dias de gestação, para o fornecimento, à vontade, de ração para filhotes (Cibau Puppy Formula, Farmina - Anexo 1) o que continuava até 30 dias pós-parto. 22 À medida que as cadelas apresentavam cio eram acasaladas com cães do mesmo canil ou de outros canis, de acordo com a orientação zootécnica definida pelo proprietário. Estes acasalamentos ocorriam por monta natural ou inseminação artificial, em momento definido pelo responsável pela assistência veterinária do canil. Em seguida, sendo diagnosticadas gestantes aos 25 dias pós-cobertura, por ultrassonografia, as cadelas eram incluídas no experimento. As cadelas gestantes e suas respectivas ninhadas eram acompanhadas e submetidas às coletas de dados aos 30 dias de gestação (D-30), no dia do parto (D0) e aos sete, 14, 21 e 30 dias pós-parto (D7; D14, D21 e D30). Próximo a época do parto, as cadelas eram encaminhadas para os canis maternidade. As cadelas da raça Pastor Alemão tinham seus filhotes por parto normal, sob a supervisão do funcionário do canil. As Buldogue Inglês ficavam sob observação nos dias finais da gestação e, assim que começassem os.primeiros sinais de parto, eram submetidas à cesariana, conforme técnica de rotina. 1.4.2 Desenvolvimento corporal de cadelas e ninhadas As cadelas foram pesadas em todos os momentos, sendo a pesagem de D0 realizada após o nascimento dos filhotes. Desde D0 até D30 foram pesadas as ninhadas e anotado o número de filhotes vivos. No dia do parto eram anotados, além do peso e o número de filhotes vivos, o número de natimortos. 1.4.3 Coletas de sangue As cadelas eram submetidas pela manhã, em jejum de 12 horas, à coletas de sangue por punção da veia jugular (figura 1) ou cefálica com obtenção de amostras sanguíneas para exames de bioquímica e hemograma nos dias D-30, D0, D7, D14, D21 e D30. Para dosagem da glicemia e cetonemia eram utilizadas gotas de sangue aplicadas em aparelho próprio. Para a obtenção de soro para demais dosagens bioquímicas, amostras de 5,0mL de sangue ficavam em repouso por 30 minutos em tubo Vacuntainer para separação do soro e, em seguida, centrifugadas a 3200 rpm por 5 minutos (figura 2). O soro obtido era aliquotado, armazenado em tubos eppendorf e congelado a -20ºC até o momento das análises. 23 Para avaliação do hemograma, amostras de 4,0mL de sangue foram coletadas da mesma forma, porém imediatamente transferidas para tubos contendo EDTA, homogenizadas e resfriadas por no máximo 24 horas, até a realização do exame. A contagem global de leucócitos e de hemácias foi realizada utilizando citômetro de impedância semiautomático (CELM CC 530). O volume globular (hematócrito) foi aferido utilizando tubos de Wintrobe, preenchidos com sangue total e centrifugado a 11000 rpm por 5 minutos. A contagem total de plaquetas foi estimada em lâmina de esfregaço sanguíneo corada e a contagem relativa de leucócitos foi feita visualmente pela diferenciação de 100 leucócitos, realizada em esfregaço sanguíneo corado com Panótico sob microscopia óptica, conforme técnicas de rotina. . Figura 1: Coleta de sangue na veia jugular de cadela Buldogue Inglês 24 Figura 2: Centrifugação para obtenção de soro sanguíneo 1.4.4 Coletas de leite As cadelas foram submetidas, a partir de D0 até D30, à coletas de leite por ordenha manual para avaliação da contagem diferencial de células somáticas. Para tanto, um pool de leite de diversas glândulas mamárias era obtido em frascos plástico. Deste material eram confeccionados esfregaços em lâminas de vidro, os quais eram imediatamente fixados pelo calor e, posteriormente, corados pelo método de Giensa. A contagem diferencial de 100 leucócitos era realizada em microscópio óptico. Do mesmo pool de leite, uma amostra de 2,0mL era submetida ao teste Somaticell®, um indicador da Contagem de células somáticas (CCS) normalmente utilizado para leite bovino (figura 3). 25 Figura 3: Realização do teste Somaticell® no leite coletado das cadelas 1.4.5 Citologias vaginais De D7 a D30, eram realizadas citologias vaginais (figura 4) das cadelas para quantificação de neutrófilos em relação ao total de células (neutrófilos e células epiteliais), com o objetivo de identificar sinais de infecção uterina. Para tanto, um swab de algodão era introduzido pela vulva da cadela até atingir a vagina, onde eram realizados movimentos de rotação e, após retirada do swab, confecção de esfregaço em lâmina de microscopia. Após secas ao ar, as lâminas eram fixadas em álcool a 70ºGL por 10 minutos e coradas em Panótico. Sob microscopia óptica, eram contadas 600 células e feita a proporção entre células epiteliais e neutrófilos, sendo estes últimos expressos em percentual de neutrófilos no esfregaço. 26 Figura 4: Introdução de swab pela vulva de cadela Buldogue Inglês para citologia vaginal. 1.4.6 Análises estatísticas Foram apresentados os métodos estatísticos utilizados nas análises relativas ao desenvolvimento corporal de cadelas e ninhadas, hemograma, qualidade do leite e citologia vaginal, em todos os casos sendo considerado o nível de significância de 5% (P<0,05). Para as diversas variáveis, à exceção das taxas de mortalidade de filhotes, as comparações entre momentos em cada raça, ou para o total de animais, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis, e para as comparações entre raças em cada período o teste de Mann-Withney. Para a taxa de mortalidade filhotes por período e taxa de mortalidade acumulada de filhotes nascidos vivos utilizou-se o teste de Qui-quadrado. 1.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO A tabela 1 mostra os resultados da evolução do peso corporal das cadelas, e desenvolvimento das ninhadas. O peso corporal das cadelas foi semelhante entre raças em cada momento (P>0,05) e também entre os tempo avaliados para cada raça (P>0,05). Além disso, as taxas de ganho ou 27 perda de peso no pós parto por semana de ambas as raça foi semelhante (P>0,05). Isso mostra que, apesar de serem raças diferentes, seus pesos corporais e evolução foram semelhantes no período. O número de filhotes para criar também foi semelhante entre as raças em todas as fases (P>0,05), mas o peso total das ninhadas foi diferente entre raças em todos os períodos (P<0,05), menor para as cadelas da raça Buldogue Inglês. Observa-se tabela 1 que, apesar do menor peso das ninhadas da raça Buldogue Inglês, e destas apresentarem condição corporal semelhante à raça Pastor Alemão, as taxas de ganho de peso semanal das ninhadas foram semelhantes nos diversos tempos de avaliação para as duas raças (P>0,05). Observa-se que, apesar do menor desafio, cadelas da raça Buldogue Inglês para criar suas ninhadas, elas mantiveram condição corporal semelhante às Pastor Alemão. Além disso, apesar de terem um mesmo número de filhotes por ninhada que as cadelas da raça Pastor Alemão ao longo de todos os tempos (P>0,05) e taxa de mortalidade de filhotes semelhante a cada tempos (P>0,05), a taxa de mortalidade de filhotes ao final de 30 dias foi maior nas ninhadas Buldogue Inglês (P<0,05). Domingos, Rocha e Cunha (2008) relatam que o filhote canino deve ter um ganho de peso diário médio de 2g para cada quilograma de peso calculado para a idade adulta. Assim, considerando-se o ganho de peso entre D0 e D14 para as ninhadas de cada raça, obteve-se 22,9g/dia para os filhotes Buldogue Inglês e 51,4g/dia para os Pastor Alemão. O cálculo de ganho de peso esperado para estes filhotes foi, baseando-se no peso médio das cadelas em D30 como peso à idade adulta para cada raça, de 50g/dia para Buldogue Inglês e 66g/dia para Pastor Alemão. Confrontando o ganho de peso esperado e o obtido pelos filhotes deste experimento, obteve-se que os filhotes Pastor Alemão atingiram 78% do peso esperado aos 14 dias, e os filhotes Buldogue Inglês chegaram a 46% do peso esperado. O conjunto dos dados apresentados como condição corporal das cadelas ao longo dos tempos e peso das ninhadas, permite identificar uma pior habilidade materna das cadelas da raça Buldogue Inglês em relação às cadelas da raça Pastor Alemão. Considerando que a alimentação da ninhada é exclusivamente de leite até pelo menos 25 dias de vida (OFTEDAL, 1984), o menor desenvolvimento das ninhadas Buldogue Inglês deve estar ligado à qualidade e/ou quantidade de leite produzido pela cadela. Não sendo possível avaliar diretamente a quantidade e composição do leite das cadelas neste estudo, indiretamente isso pode ser inferido pelo desenvolvimento das ninhadas. Entretanto, qual seria a causa da pior produção leiteira das cadelas Buldogue Inglês? Avaliando os dados da tabela 2, não houve diferença nos perfis hematológicos que indicassem condições infecciosas diferenciadas entre raças no pós-parto, dentre elas as mais 28 comuns, mamite e metrite (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Para a primeira, especificamente, na tabela 3 observa-se CCS elevadas e contagem diferencial de leucócitos no leite apresentando grande maioria de neutrófilos, ambos como indicativos de mamite, semelhantes entre as raças; e para a segunda, especificamente, na tabela 4 percentual de neutrófilos na citologia vaginal, como indicativo de infecção uterina, também semelhante entre raças. Estes resultados indicam que condições infecciosas do pós-parto não parecem ter sido a causa da pior habilidade materna das cadelas Buldogue Inglês. Diante da falta de evidências de que a pior produção leiteira das Buldogue Inglês seja por causa infecciosa, nos capítulos seguintes serão avaliados os perfis bioquímicos indicativos do metabolismo energético e de minerais das cadelas. 29 Tabela 1: Características físicas de cadelas e ninhadas das raças Pastor Alemão e Buldogue Inglês no período periparto. Momento em relação ao parto 1 Parâmetro D-30 D0 D7 D14 P2 B2 P B P B P B 33,4 25,0 28,4 23,7 26,7 23,7 29,2 23,5 Peso cadela (kg) 1,2 4,4 2,7 3,4 4,8 3,3 3,8 3,5 27,8 25,7 24,8 25,4 (média dp) 5,5 3,8 4,1 4,2 0,8 a 1,0 1,0 ab 1,0 1,1 ab 1,0 Taxa de ganho/perda de peso cadela por período 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,0 (peso final/peso inicial) 0,9 1,0 1,0 (média dp) 0,1 0,1 0,1 6,6 5,7 6,6 5,6 6,4 5,1 Filhotes vivos 1,4 2,3 1,4 2,2 1,1 1,7 6,1 6,0 5,6 (média dp) 1,9 1,9 1,6 3,3 x 1,4 y 5,7 x 2,4 y 7,8 x 3,0 y Peso total filhotes vivos (kg) 1,3 0,9 1,2 1,4 1,6 1,9 2,3 a 3,7 a 4,9 ab (média dp) 1,4 2,1 3,0 1,5 1,6 1,4 1,4 Taxa de ganho/perda de peso ninhada por período 0,2 0,5 0,2 0,1 (peso final/peso inicial) 1,6 1,4 (média dp) 0,4 0,2 0/27 6/46 0/27 1/40 1/27 4/39 (0,0) (13,0) (0,0) (2,5) (3,7) (10,3) Taxa mortalidade filhotes por período (%) 6/73 1/67 5/66 (8,2) (1,5) (7,6) 0/27 1/40 1/27 5/40 (0,0) (2,5) (3,7) (12,5) Taxa mortalidade acumulada filhotes nascidos vivos (%) 1/67 6/67 (1,5) a (9,0) b 1) D-30 = 30 dias pré-parto; D0 = dia do parto; D7, D14, D21 e D30 = 7, 14, 21 e 30 dias pós-parto; 2) P = Pastor Alemão; B = Buldogue Inglês; 3 Continua na próxima página D21 P 30,9 4,3 D30 B 23,7 3,4 P 29,8 2,7 25,9 5,1 1,1 b 0,1 25,9 4,3 1,0 0,0 1,0 ab 0,1 1,0 0,1 6,5 1,3 6,5 1,3 5,6 1,6 12,5 x 3,4 5,8 b 3,8 1,3 0,1 1,3 0,3 0/61 (0,0) 6/67 (9,0) b 1,5 0,3 1,4 0,3 0/35 (0,0) 1/27 (3,7) 4,6 y 3,1 7,2 b 4,9 1,3 0,3 0/26 (0,0) 4,3 1,9 5,0 2,0 3,8 y 2,5 1,3 0,1 1,0 0,0 1,0 0,0 4,9 1,7 9,9 x 2,4 B 23,7 3,3 0/26 (0,0) 4/35 (11,4) 4/61 (6,6) 5/40 (12,5) 1/27 9/40 (3,7) x (22,5) y 10/67 (14,9) b 30 Continuação Tabela 1 3) Peso cadela: (P>0,05 05 Kruskal-Wallis); Taxa de ganho/perda de peso cadela por período (>1,0 ganho; <1,0 perda): entre raças a cada período (P>0,05 Mann-Whitney); entre períodos para cada raça, em P a-b indica diferença entre tempos avaliados (P<0,05 Kruskal-Wallis), em B (P>0,05 Kruskal-Wallis); entre períodos todos os animais (P>0,05 Kruskal-Wallis); Filhotes vivos: (P>0,05 05 Kruskal-Wallis); Peso total filhotes vivos: entre raças a cada período, x-y indica diferença entre raças (P<0,05 Mann-Whitney); entre períodos todos os animais (P>0,05 Kruskal-Wallis); Taxa de ganho/perda de peso ninhada por período (>1,0 ganho; <1,0 perda): entre raças a cada período (P>0,05 Mann-Whitney); entre períodos para cada raça (P>0,05 Kruskal-Wallis); entre períodos todos os animais (P>0,05 Kruskal-Wallis); Taxa mortalidade filhotes por período: (P>0,05 Qui-quadrado); Taxa mortalidade acumulada filhotes nascidos vivos: a-b indica diferença entre períodos, x-y indica diferença entre raças (P>0,05 Qui-quadrado). Tabela 2: Hemograma de cadelas da raça Pastor Alemão e Buldogue Inglês no período periparto. Momento em relação ao parto 1 Hemograma D-30 D0 D7 D14 P2 B2 P B P B P B 39,4 38,9 35,1 33,0 35,2 35,0 38,5 37,0 Hematócrito (%) 4,8 5,8 2,4 5,4 4,5 3,7 5,2 5,4 16,5 18,5 21,0 15,9 19,4 16,6 20,0 14,6 Global de leucócitos (x103) 3,5 10,8 3,6 4,8 6,3 4,4 7,7 5,8 11,8 6,8 4,0 4,8 6,4 5,9 7,8 5,9 Eosinófilo (%) 7,1 5,0 1,4 4,8 5,6 6,3 5,0 6,3 16,8 13,5 8,0 9,3 13,8 18,0 19,6 15,9 Linfócito (%) 4,4 6,0 3,4 2,7 5,2 11,8 7,6 6,9 3,5 5,2 4,0 3,3 2,6 3,6 2,4 4,3 Monócito (%) 3,0 2,6 2,7 3,9 2,6 3,9 2,0 2,5 0,3 1,7 1,3 2,2 2,8 1,2 0,4 0,8 Bastonete (%) 0,5 2,1 1,5 2,4 5,2 1,8 0,9 1,4 67,8 72,8 82,8 80,3 73,8 71,3 69,8 73,0 Segmentado (%) 6,3 9,5 4,5 6,8 8,4 10,6 8,2 10,7 3,9 5,7 2,7 2,7 3,0 2,7 3,1 2,7 Plaquetas (x105) 2,6 2,8 2,5 0,6 2,1 1,6 1,4 1,6 1) D-30 = 30 dias pré-parto; D0 = dia do parto; D7, D14, D21 e D30 = 7, 14, 21 e 30 dias pós-parto; 2) P = Pastor Alemão; B = Buldogue Inglês. D21 P 39,5 2,4 22,7 14,0 10,5 7,9 13,0 8,5 2,5 1,7 0,0 0,0 74,0 10,4 2,1 1,0 D30 B 40,8 3,7 14,3 5,8 6,3 5,9 16,4 6,7 5,0 4,7 1,3 2,2 71,0 12,9 2,0 1,7 P 41,9 5,5 17,6 8,1 8,2 4,1 17,2 7,6 5,6 1,8 1,0 2,2 68,0 7,8 3,4 1,2 B 39,9 5,2 16,2 3,5 6,7 7,0 13,3 7,1 4,6 3,5 3,4 4,3 71,9 10,0 1,8 1,2 31 Tabela 3: Contagem de células somáticas (CCS) e contagem diferencial de leucócitos no leite de cadelas da raça Pastor Alemão e Buldogue Inglês. CCS 3 P2 609773 B2 655482 Momento em relação ao parto 1 D7 D14 D21 P B P B P B 1352662 1515713 963873 1235658 922909 81881 Eosinófilos (%) 2,02,8 1,53,7 0,250,5 0,00,0 6,48,4 0,00,0 7,412,3 Linfócitos (%) 31,421,7 26,326,2 40,046,3 8,47,6 17,620,2 4,85,5 Macrófagos (%) 16,819,4 41,831,6 1,83,5 46,726,4 15,018,4 Bastonetes (%) 0,00,0 0,00,0 0,00,0 0,00,0 29,818,8 30,520,8 8,011,3 22,913,6 Leite Segmentados (%) D0 D30 P 1885120 B 1423774 0,51,0 5,03,9 0,00,0 10,46,0 15,312,7 33,532,6 13,718,0 33,541,1 12,816,4 34,410,9 5,88,2 11,614,6 0,00,0 0,00,0 0,00,0 0,00,0 0,30,5 0,00,0 40,228,4 11,819,1 50,430,3 46,520,7 52,029,2 15,020,2 1) D0 = dia do parto; D7, D14, D21 e D30 = 7, 14, 21 e 30 dias pós-parto; 2) P = Pastor Alemão; B = Buldogue Inglês; 3) CCS = contagem de células somáticas. Tabela 4: Citologia vaginal de cadelas da raça Pastor Alemão e Buldogue Inglês no pós-parto. Citologia Vaginal D7 P2 27,319,8 B2 23,832,7 P 4,68,7 Momento em relação ao parto 1 D14 D21 B P B 6,79,6 9,611,1 20,428,6 D30 P 4,25,0 B 31,433,5 Neutrófilos (%) 25,127,6 1) D7, D14, D21 e D30 = 7, 14, 21 e 30 dias pós-parto; 2) P = Pastor Alemão; B = Buldogue Inglês. 6,08,9 16,223,4 20,528,8 32 1.6 CONCLUSÃO Conclui-se que houve menor habilidade materna das cadelas da raça Buldogue Inglês em relação às da raça Pastor Alemão. Não tendo havido diferença nos perfis hematológicos, CCS do leite e citologia vaginal entre as raças, condições infecciosas de glândulas mamárias e/ou uterinas não parecem ser a causa desta diferença. 33 CAPÍTULO 2: METABOLISMO ENERGÉTICO DAS CADELAS 2.1 REVISÃO DE LITERATURA O estresse que a lactação promove na cadela depende do seu estado nutricional e peso no momento do parto, do número de filhotes da ninhada e do estágio da lactação. Animais com grandes ninhadas e que apresentem, na época do parto, depósitos energéticos mínimos correm maior risco de excessiva perda de peso durante a lactação, além de terem baixa produção de leite (CASE; CAREY; HIRAKAWA et al., 2000; CARCIOFI; PRADA, 2003). A lactação é a fase de maior demanda energética da cadela (SCHROEDER; SMITH, 1995) Nesse período a fêmea precisa comer, digerir, absorver e utilizar uma grande quantidade de nutrientes para produzir leite suficiente e de composição adequada para prover o desenvolvimento dos filhotes (KELLY; WILLS, 1987) bem como para reduzir o risco de mortalidade. (CASE; CAREY; HIRAKAWA et al. 2000; CARCIOFI; PRADA, 2003). Nesse sentido, a dequada provisão de calorias pela alta ingestão energética permite produção de leite suficiente e previne que a fêmea apresente drástica perda de peso (CASE; CAREY; HIRAKAWA, et al. 2000). Durante a gestação, o crescimento fetal submete a cadela a um estresse crescente, pois suas necessidades nutricionais são cada vez maiores. A partir da sexta semana de gestação, suas necessidades energéticas, minerais e proteicas da cadela aumentam consideravelmente, em resposta ao rápido crescimento dos filhotes e de forma a preparar o organismo para a lactação. Dessa forma, deve ser fornecida dieta diferente daquela de mantença. Indica-se normalmente rações de crescimento/lactação, e aumento gradativo de até 30% na ingestão de alimento (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Cadelas gestantes mal nutridas respondem mobilizando nutrientes da gordura corporal, musculatura e tecido ósseo, podendo ocorrer morte fetal e comprometimento do desenvolvimento da ninhada (MACHADO, 2004). No final da gestação, uma adequada forma de permitir o consumo necessário de alimento, considerando a limitação física do aparelho digestório, é o fornecimento à vontade de dieta com maior densidade de proteínas, carboidratos solúveis e minerais (CASE; CAREY; HIRAKAWA, 1998), a fim de evitar quadros de cetoacidose no final da gestação, especialmente em cadelas de maior porte físico (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Cadelas com fornecimento restrito de carboidratos solúveis apresentam toxemia gestacional, caracterizada por hipoglicemia e aumento de -hidroxibutirato circulante, além 34 de maior taxa de morte fetal (ROMSOS et al., 1981), resultado de má nutrição materna e/ou ninhadas grandes (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Cadelas cuja ninhada é muito grande apresentam restrição da ingestão de alimentos no final da gestação por falta de espaço estomacal. Essa restrição de ingestão leva à metabolização de gordura corporal, levando ao quadro de cetose, que por sua vez causa anorexia e exacerbação da cetogênese, caracterizando a toxemia gestacional, que leva ao prolongamento da gestação e ocorrência de distocias (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Este quadro desse ser diagnosticado diferencialmente da diabetes gestacional, quando há hiperglicemia, glicosúria, cetonemia e cetonúria. Na toxemia gestacional há hipoglicemia e ausência de glicose na urina associadas à cetonemia e cetonúria (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). 2.1.1 Glicemia A glicose é a principal fonte de energia dos animais. Trata-se de um monossacarídeo para seu aproveitamento integral pelos animais necessita da interação entre os mediadores químicos, os hormônios insulina e glucagon, para que seja absorvida e transformada em energia (SERÔDIO; CARVALHO; MACHADO, 2008). Os valores de referência dos níveis de glicose sérica nos cães saudáveis se encontram no intervalo de 73 a 134 mg/dL. (KANEKO; HARVEY; BRUSS; 1997) Na cadela os ajustes metabólicos se tornam mais importantes da metade para o final da gestação, com o aumento da produção de P4 pela placenta e o crescimento do concepto. Nessa fase ocorre decréscimo da glicemia materna, e o seu metabolismo passa a utilizar outras fontes de energia, poupando assim glicose para o feto. O aumento das concentrações de hormônios, como lactógenos placentários, estrógeno e cortisol, atuam para reduzir a resposta aos efeitos da insulina, levando a um estado de resistência insulínica (PRESTES; LANDIMALVARENGA, 2006). Os lactógenos placentários parecem exercer efeito anabólico e diabetogênico durante a gestação, promovendo a conservação de proteínas, a liberação de ácidos graxos dos estoques de lipídeos, e diminuindo a utilização de glicose. Essa modificação do metabolismo materno é responsável pela formação de um reservatório energético materno durante os dois terços iniciais da gestação que persiste até o final desta, permitindo o crescimento fetal. A mudança no metabolismo é controlada pelos hormônios da gestação e não está relacionada à dieta do animal, mas sim ao crescimento placentário. A P4, predominante na primeira metade da 35 gestação, atua na conservação de energia, e os níveis crescentes de estrógeno, na segunda metade, são responsáveis pelo redirecionamento dessa energia para os fetos (PRESTES; LANDIM-ALVARENGA, 2006). Para determinação da glicemia, devem ser levados em consideração diferentes métodos que variam quanto à sua especificidade e sensibilidade. O tempo entre a colheita de sangue e a determinação da glicemia é importante, considerando que, a cada hora de permanência da amostra em temperatura ambiente, os valores da glicemia diminuem cerca de 10mg/100mL de sangue, a não ser que se adicione um preservativo, sendo o fluoreto de sódio o mais recomendado. O hematócrito, quando elevado, acentua a redução de glicose, devido à atividade metabólica dos eritrócitos (SERÔDIO; CARVALHO; MACHADO, 2008). 2.1.2 Cetonemia Normalmente, os corpos cetônicos são formados em pequena quantidade no organismo. Em caso de grande mobilização de gorduras, como ocorre na cetose bovina e na toxemia da prenhez dos pequenos ruminantes, eles se acumulam no organismo causando graves transtornos, como acidose metabólica e distúrbios cerebrais (VAN CLEEF; PATINO; NEIVA, 2009). Concentrações elevadas de corpos cetônicos no sangue, urina, leite e outros fluidos corporais sem os sinais clínicos que acompanham a cetose, caracterizam cetose subclínica, e este é o único meio efetivo de detectá-la (VOYVODA, 2010). A cetose é uma condição caracterizada por aumento anormal na concentração de corpos cetônicos nos fluídos corporais, como sangue, urina, leite e saliva. Esta condição é comumente encontrada em situações como diabetes mellitus, jejum prolongado, má nutrição e má absorção de nutrientes, geralmente associada com hipoglicemia. Esta síndrome denominada cetonemia é bastante frequente em bovinos, principalmente em vacas leiteiras de alta produção, devido a balanço nutricional negativo, pois o animal precisa de muita energia para a produção de leite e não consegue manter equilibrada a sua glicemia, ocorrendo assim mobilização lipídica e aumento dos corpos cetônicos no plasma(GONZALÉZ, 2008). As fêmeas, independente da espécie, são mais suscetíveis a cetose do que os machos, e esta predisposição aumenta durante a gestação e lactação (NANTES; SANTOS, 2008). Os corpos cetônicos, na falta de glicose, podem ser utilizados como fontes de energia por vários tecidos, e a conversão de ácidos graxos em corpos cetônicos é uma medida de segurança para prevenção da falta de carboidratos como fonte energética (ANDRADE, 2002). 36 2.1.3 Dosadores portáteis de glicose e corpos cetônicos plasmáticos Existem diversos analisadores portáteis ou de pequeno tamanho para glicose e corpos cetônicos circulantes, na forma de instrumentos destinados a um único teste (por exemplo: analisador de glicose Yellow springs®), com cartuchos de reagentes (por exemplo: Abbott Vision® ou HemoCue-BG®) ou na forma de fitas reagentes (Kodak Ektachem® ou Bohringer Reflotron®). Habitualmente, utiliza-se sangue venoso para determinação da glicemia (SERÔDIO; CARVALHO; MACHADO, 2008). Usualmente são utilizados testes na urina utilizando fitas reagentes para detectar e monitorar os níveis de corpos cetônicos em cães. Entretanto, este método pode subestimar os valores reais. Em contrapartida, os resultados encontrados através do uso de aparelho portátil eletrônico apresentou, em cães, boa correlação com os valores encontrados em laboratório (HENDERSON; SCHLESINGER, 2010). O Optium Xceed®, da Abbott Laboratories, representa a ultima geração em tecnologia de biossensores, que mede fácil e rapidamente os níveis de glicose e corpos cetônicos sanguíneos em humanos. Estudos em humanos mostraram que os resultados obtidos em laboratório, e os obtidos por tal dispositivo, apresentam boa correlação, além de se mostrarem muito mais sensíveis com relação aos corpos cetônicos quando comparados aos testes convencionais realizados em urina (VOYVODA, 2010). 2.2 MATERIAL E MÉTODOS 2.2.1 Dosagens de glicose e corpos cetônicos Imediatamente após a coleta de sangue para as dosagens bioquímicas, duas gotas de sangue foram utilizadas, respectivamente, para análise dos níveis séricos de glicose e corpos cetônicos utilizando-se o aparelho portátil Optium Xceed® (Abbott Laboratories) (Figura 5). As coletas de sangue foram realizadas em cinco cadelas da raça Pastor Alemão, e oito cadelas da raça Buldogue Inglês, todas em jejum alimentar, e em todos os momentos (D-30, D0, D7. D14, D21 e D30). A partir dos resultados, foi feita a comparação entre os momentos dentro de cada raça, e entre raças em todos os momentos. 37 Fonte:http://www.fibracirurgica.com.br Figura 5: Aparelho portátil para medição de glicose e corpos cetônicos circulantes Optium Xceed (Abbott Laboratories) 2.2.2 Análises estatísticas Para as duas variáveis as comparações entre momentos em cada raça, ou para o total de animais, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis, e para as comparações entre raças em cada período o teste de Mann-Withney. Em todos os casos considerou-se o nível de significância de 5% (P<0,05). 2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os dados de glicemia e cetonemia das cadelas estão apresentados na tabela 5. Observou-se que, nas duas raças, não houve diferença na cetonemia nos diferentes momentos avaliados (P>0,05). Evidenciou-se também que não houve diferença para cetonemia quando as duas raças foram comparadas ao longo dos momentos estudados (P>0,05). Entretanto, apesar de não ter havido diferença na glicemia para cada raça em diferentes momentos (P>0,05), observou-se glicemia mais elevada nas cadelas Buldogue Inglês em comparação com as pastor Alemão em D7, D21 e D30 (P<0,05). Observou-se que, nas duas raças, não houve diferença na cetonemia nos diferentes momentos avaliados (P>0,05). Evidenciou-se também que não houve diferença para cetonemia quando as duas raças foram comparadas ao longo dos momentos estudados (P>0,05). Embora tenha havido diferença na glicemia entre raças, com maiores taxas na Buldogue Inglês, não se observou reflexo disso na cetonemia dessas cadelas. A cetose é um 38 transtorno comum nos rebanhos leiteiros, resultado da desordem do metabolismo de carboidratos e gorduras (GEISHAUSER, 1998), e normalmente está relacionada com a dieta dos animais, podendo dessa maneira, também ser a causa da alteração de corpos cetônicos na cadela, apesar de não haver estudos na área. Cadelas cuja ninhada é muito grande apresentam restrição da ingestão de alimentos no final da gestação por falta de espaço estomacal. Essa restrição de ingestão leva à metabolização de gordura corporal, levando ao quadro de cetose, que por sua vez causa anorexia e exacerbação da cetogênese, caracterizando a toxemia gestacional, que leva ao prolongamento da gestação e ocorrência de distocias (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). A quantidade de energia metabolizável necessária para o metabolismo da vaca leiteira quatro dias pós-parto excede em 25% a sua capacidade de ingestão de alimentos, gerando aumento da utilização de reservas lipídicas corporais (DRACKLEY, 1999). A utilização de reservas lipídicas corporais resulta em maior metabolização hepática de ácidos graxos não esterificados, gerando acúmulo de triglicerídeos nos hepatócitos (lipidose hepática) que, finalmente, reduz a síntese de glicose hepática. O excesso de ácidos graxos não esterificados nos hepatócitos resulta em maior produção de corpos cetônicos e sua concentração circulante, caracterizando a cetose (DRACKLEY, 1999). No presente estudo, as cadelas da raça Buldogue Inglês apresentaram maiores valores glicêmicos em relação as da raça Pastor Alemão, no entanto, todos os valores glicêmicos encontraram-se dentro da normalidade, sendo assim isto não foi suficiente para desencadear uma metabolização significativa do tecido adiposo, o que poderia levar a cetose. O consumo de alimento durante a lactação pode chegar a duas a três vezes o consumo da mantença em cadelas (JOHNSTON; KUSTRITZ; OLSON, 2001). Entretanto, há limitação física do aparelho digestório, situação que determina em cadelas grandes e gigantes mobilização de gordura corporal para suprir suas necessidades energéticas nesse período, podendo desencadear balanço energético negativo (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 2006). Entretanto, a evolução do peso corporal das cadelas (Tabela 1, capítulo 1), associada aos dados aqui apresentados, parecem não indicar comprometimento significativo do metabolismo energético dessas cadelas, mesmo naquelas da raça Buldogue Inglês. Os níveis de glicose tendem a reduzir devido a sua utilização na lactação e ao balanço energético negativo decorrente do pós parto, entretanto os níveis nas cadelas estudadas a glicemia manteve-se dentro da normalidade e as cadelas da raça Buldogue Inglês 39 apresentaram níveis maiores de glicemia, sendo mais um indicativo de uma pior produção leiteira que acarreta em uma pior eficiência materna. 40 Tabela 5: Cetonemia e glicemia de cadelas Pastor Alemão e Buldogue Inglês no periparto. Momento em relação ao parto 1 Bioquímica sanguínea D-30 D0 D7 D14 D21 P2 B2 P B P B P B P B 0,15 0,20 0,16 0,67 0,12 0,11 0,13 0,20 0,13 0,19 0,06 0,07 0,09 1,21 0,05 0,06 0,10 0,05 0,05 0,14 Cetona (mol/L) 0,19 0,46 0,12 0,18 0,16 0,07 0,93 0,06 0,08 0,11 87,0 100,8 103,8 132,4 87,3 a 110,5 b 101,3 113,4 72,3 a 99,6 b 13,1 25,0 21,8 34,0 11,8 8,1 22,7 21,1 16,6 14,6 Glicose (mg/dL) 96,2 120,5 102,8 110,1 91,4 22,1 31,9 14,5 21,1 19,4 1) D-30 = 30 dias pré-parto; D0 = dia do parto; D7, D14, D21 e D30 = 7, 14, 21 e 30 dias pós-parto; 2) P = Pastro Alemão; B = Buldogue Inglês; a-b significa diferença significativa (P<0,05 Mann-Whitney) entre P e B num mesmo momento em relação ao parto. D30 P 0,15 0,06 B 0,21 0,10 0,19 0,09 79,3 a 101,9 b 12,5 11,2 95,7 15,2 39 2.4 CONCLUSÃO Houve diferença na glicemia entre raças ao longo da lactação, mas os níveis séricos de glicose ficaram dentro da normalidade em todos os momentos. Da mesma maneira não há indícios de alterações nos níves de corpos cetônicos circulantes o que sugere que não é o metabolismo energético das cadelas Buldogue Inglês a razão para sua pior habilidade materna em relação às cadelas Pastor Alemão. 40 CAPÍTULO 3: METABOLISMO MINERAL DAS CADELAS 3.1 REVISÃO DE LITERATURA O Ca e o P são os macroelementos minerais, quantitativamente, mais abundantes no organismo dos mamíferos domésticos, apresentando relação muito estreita um entre si e com a vitamina D (1,25 – di-hidroxicolecalciferol) (GRUNERT et al., 2005). O esqueleto funciona como maior fonte de Ca e P do organismo, quando a absorção intestinal e a reabsorção renal são incapazes de manter a concentração circulante de Ca (FIGUEIREDO, 2011). Na porção trabecular dos ossos, estes minerais estão em equilíbrio dinâmico com Ca e P dos fluidos corporais e outros tecidos do corpo, sendo os níveis de P inversamente relacionados aos de Ca no sangue (SWENSON; REENCE, 1996). A absorção de Ca e P da dieta acontece principalmente no intestino delgado superior, particularmente o duodeno, e a quantidade absorvida dependente: da fonte; proporção Ca/P sérica; pH intestinal; ingestão de lactose e níveis de Ca, P, vitamina D, ferro, alumínio, manganês e gordura da dieta. Como é o caso da maioria dos nutrientes, quanto maior é a necessidade, mais eficiente é a absorção (SWENSON; REENCE, 1996). Os animais em crescimento, gestação e especialmente em lactação requerem quantidades abundantes de Ca e P e, em algumas espécies, a relação pode ser crítica. Uma relação de Ca/P de 1:1 ou 2:1 é usualmente recomendada. A proporção é muito mais crítica se o nível de P é mínimo ou inadequado, ou se a vitamina D está limitada (SWENSON; REENCE, 1996). O Ca exerce importantes funções metabólicas, entre elas: formação da matriz óssea do esqueleto; participa como fator essencial na coagulação sanguínea; participa no processo de contração muscular; atua na transmissão de impulsos nervosos; e, ainda, regula a atividade de algumas enzimas (JACQUES, 2011). Seguramente é o elemento mineral mais abundante no organismo animal, estando 99% nos ossos e dentes e 1% nos fluidos extracelulares (GRUNERT et al., 2005). O Ca extracelular encontra-se sob a forma de três frações: Ca ionizado, aproximadamente (50-56%); Ca ligado a proteínas plasmáticas tais como a albumina (3440%); e complexado a ânions como fosfato, bicarbonato, sulfato, citrato e lactato (10%) (SHENCK ; ZALOGA; ROBERTS apud FIGUEIREDO, 2011). 41 O Ca ionizado é a forma biologicamente ativa e aquela que está sujeita a controle homeostático rígido (BARBER; ZALOGA; ROBERTS apud FIGUEIREDO, 2011). Representa, nas cadelas, 55% do Ca total, sendo um indicador mais sensível da quantidade de Ca extracelular que o Ca total (COSTA, 2010). Assim, apesar da mensuração rotineira do Ca circulante ser de sua fração total, ela pode não ser representativa do estado calcêmico do animal (CORNEJO; GAYNOR apud FIGUEIREDO, 2011). A homeostasia do Ca baseia-se na sua entrada e saída do sangue através de trocas entre três órgãos: ossos, rins e intestino. Seu movimento neste sistema é complexo e controlado pelo PTH, calcitonina e 1,25-dihidroxicalciferol ou calcitriol, metabolito ativo da vitamina D (BRESLAU; CORNEJO; GAYNAR apud FIGUEIREDO, 2011). A concentração de Ca plasmático é coordenada por ação dos hormônios calciotrópicos PTH e 1,25dihidroxicalciferol, os quais são produzidos em resposta a hipocalcemia, atuando para aumentar a entrada de Ca no plasma (GOFF, 2005). Qualquer diminuição do Ca plasmático estimula a glândula paratireóide a secretar PTH, o que, dentro de minutos, aumenta a reabsorção renal de Ca a partir do filtrado glomerular. Se a diminuição plasmática de Ca for pequena, ele retorna aos índices normais e o PTH retorna aos seus níveis basais. Entretanto, se a queda de Ca plasmático for elevada, a secreção continuada de PTH estimula a reabsorção de Ca a partir dos ossos (GOFF, 2005) e túbulos renais, além de promover aumento da sua absorção intestinal (STOCKHAM; SCOTT, 2011). O PTH estimula as bombas de Ca no sistema de membranas do osteócito que promovem o movimento de Ca do osso para o líquido extracelular. Secundariamente, o PTH induz osteoblastos a mudarem de forma e capacita osteoclastos a fazer contato com a matriz óssea ou liberar substâncias que estimulam os osteoclastos a degradar o osso por digestão enzimática e acidificação (STOCKHAM; SCOTT, 2011). A vitamina D age diretamente nas células intestinais aumentando a absorção ativa de Ca e aumentando as quantidades de proteínas de ligação de Ca nos enterócitos (DHUPA; PROULX, 1998). Além disso, aumenta a reabsorção de Ca do osso promovendo atividade osteoclástica, acentuando a resposta ao PTH (STOCKHAM; SCOTT, 2011), e estimula a absorção de Ca pelos túbulos renais (REECE, 2006). Desta maneira, contribui para aumentar ao máximo a captação de Ca da dieta e reduzir a eliminação de Ca pela urina (REECE, 2006). A calcitonina é liberada em resposta a concentração sanguínea de Ca acima do normal (REECE, 2006). Ela bloqueia a osteólise pelos osteoclastos de forma direta, e inibe a 42 reabsorção tubular renal de Ca e P (STOCKHAM; SCOTT, 2011), aumentando a sua excreção pela urina (REECE, 2006). O rígido controle endócrino do Ca faz com que seus níveis circulantes variem muito pouco (17%), comparado ao P (40%) e magnésio (Mg) (57%). Portanto, os níveis sanguíneos de Ca não são um bom indicador do estado nutricional do animal com relação a este mineral, enquanto que os níveis e P e Mg refletem diretamente os respectivos estados nutricionais (GONZÁLEZ; SCHEFFER, 2003). De acordo com Dhupa e Proulx (1998), a concentração normal de Ca sérico é de 9,4 a 11,2 mg/dL, enquanto a concentração sérica de Ca ionizado é de 5,0 mg/dL. A hipocalcemia puerperal, ou tetania puerperal, é uma enfermidade de origem metabólica de causa multifatorial, relacionada a problemas no manejo, nutrição, genética, entre outros. Acomete geralmente bovinos leiteiros de alta produção, porém cães, gatos, ovinos e caprinos também são acometidos (JACQUES, 2011). Dietas com excesso de Ca no período pré-parto podem predispor ao seu desenvolvimento por depressão da função da paratireoide, antes da demanda aguda de Ca do início da lactação (DHUPA; PROULX, 1998). Por outro lado, independentemente da depressão da paratiróide, a hipocalcemia pode ser causada por alteração nas frações iônicas do Ca, excesso de P circulante, ou ingestão deficiente de vitamina D ou Ca (SCHENCK et al. apud FIGUEIREDO, 2011). Nos cães esta condição ocorre tipicamente em fêmeas de pequeno porte, entre uma a quatro semanas pós-parto, ainda que sinais possam ocorrer no final da gestação (DHUPA; PROULX, 1998), devido às exigências da mineralização do esqueleto fetal e da lactação (COSTA, 2010). Níveis reduzidos de Ca no líquido extracelular provocam aumento da excitabilidade do tecido nervoso, podendo causar descargas espontâneas dos impulsos nervosos, resultando em tetania e convulsões (SWENSON; REENCE, 1996). Respostas adaptativas à hipocalcemia incluem vários mecanismos com o objetivo comum de normalizar os níveis de Ca no plasma sanguíneo. As células da paratireoide detectam a hipocalcemia e, em resposta, aumentam a produção e liberação de PTH (DHUPA; PROULX, 1998). Vários fatores podem influenciar a proporção da fração ionizada de Ca no sangue, sendo os mais importantes a concentração de proteínas séricas, o pH do sangue e a temperatura corporal (SENA; BOWERS apud LUSTOZA; KOGIKA; LAZARETTI, 2005). Na tentativa de estimar o grau de interferência desses fatores na avaliação laboratorial do Ca, foram desenvolvidas fórmulas de correção, sendo a mais utilizada a que considera a 43 concentração sérica de albumina na correção do valor do Ca total (LUSTOZA; KOGIKA; LAZARETTI, 2005). As proteínas totais, albumina, globulinas e fibrinogênio, estão envolvidas em múltiplas funções, tais como a manutenção da pressão osmótica e da viscosidade do sangue, o transporte de nutrientes, metabólitos, hormônios e produtos de excreção, a regulação do pH sanguíneo e a participação na coagulação sanguínea (GONZÁLEZ; SCHEFFER, 2003). A albumina é a proteína mais abundante no plasma, perfazendo cerca de 50% do total de proteínas. É sintetizada no fígado e contribui com 80% da atividade osmótica do plasma sanguíneo, constituindo também importante reserva proteica, bem como um transportador de ácidos graxos livres, aminoácidos, metais, Ca, hormônios e bilirrubina. A hipoalbuminemia pode afetar o metabolismo de substâncias que transporta (GONZÁLEZ; SCHEFFER, 2003), mas apesar de ser comum, raramente causa sintomatologia associada à diminuição das concentrações séricas de Ca (FIGUEIREDO, 2011). Para a detecção de mudanças significativas nas concentrações de albumina sérica é necessário um período de pelo menos 30 dias, devido à baixa velocidade de sua síntese e degradação (GONZÁLEZ; SCHEFFER, 2003). Os níveis elevados de proteínas totais ou de albumina circulantes diminuem o Ca total sem, entretanto, afetar o Ca ionizado (DHUPA; PROULX, 1998). Diante disso, foi sugerido que a concentração de Ca ionizado deveria ser corrigida ou ajustada face a alterações na concentração de proteínas totais ou albumina séricas, de modo a melhorar a interpretação diagnóstica de calcemia (BARBER, 2006). Contudo, tais correções não foram ainda confrontadas com medições concomitantes de Ca ionizado (SCHENCK; CHEW apud FIGUEIREDO, 2011). A acidose metabólica, de qualquer origem, gera transposição do Ca ligado a proteínas para o estado ionizado. Já a alcalose gera o inverso, com o potencial para incitar hipocalcemia clínica. Além disso, a influência de quelantes no sangue, como o lactato e citrato, bem como condições hiperfosfatêmicas e elevados níveis de ácidos graxos livres afetam o equilíbrio do Ca, em proporção que pode não ser evidente apenas com a mensuração do Ca total (DHUPA; PROULX, 1998). Em estudo de Aroch, Srebro e Shpigel, citados por Costa (2010), a concentração plasmática de Ca total apresentou-se reduzida em todas as cadelas com hipocalcemia clínica, sugerindo que este parâmetro pode ser suficiente para o diagnóstico desta condição, na ausência dos valores de Ca ionizado. 44 Um estudo utilizando dez cadelas da raça Pastor Alemão analisou as concentrações séricas de Ca ionizado e PTH no pós-parto imediato. Observou-se baixos níveis de Ca ionizado (média de 5,34mg/dL) e declínio das concentrações de PTH a partir de 96 horas antes do parto, concluindo que os baixos níveis observados podem ter contribuído para baixa motilidade uterina das cadelas (HOLLINSHEAD et al., 2010). O P existe em combinações orgânicas dentro das células, mas o interesse principal no seu perfil metabólico reside no P inorgânico presente no plasma. A manutenção do nível de P do sangue é regulada pelos mesmos fatores que promovem a assimilação do Ca (GONZÁLEZ; SCHEFFER, 2003). Animais em crescimento, gestação e especialmente em lactação requerem quantidades abundantes de Ca e P e, em algumas espécies, a relação Ca/P pode ser crítica, especialmente se o nível de P é baixo, ou se a disponibilidade de vitamina D está limitada. Uma relação de 1:1 ou 2:1 é usualmente recomendada (SWENSON; REENCE, 1996). Excessos de ferro, alumínio ou Mg na dieta interferem na absorção de P pela formação de fosfatos insolúveis (SWENSON; REENCE, 1996). Os ossos aparentemente agem como um reservatório para o Mg, onde estão 70% do Mg corporal, mas a mobilização a partir deles é relativamente lenta. Se ocorre deficiência de Mg suficientemente intensa, a tetania e outros sintomas clínicos podem aparecer. O músculo cardíaco, músculo esquelético e o tecido nervoso dependem do equilíbrio apropriado entre íons Ca e Mg (SWENSON; REENCE, 1996). O Mg sérico representa menos de 1% do Mg corporal, sendo encontrado no plasma em três formas: a forma ionizada, fisiologicamente ativa (70%); a forma quelada, complexada com fosfato, citrato e ouros componetes (10%); e a forma ligada a proteínas (20%). Os níveis séricos de Mg ionizado em caninos são de 1,7 a 2,5mg/dL (DHUPA; PROULX, 1998). O Mg é necessário para síntese e secreção do PTH, para sua ação em seus receptores nos órgãos alvo, e possivelmente para a formação de 1,25-dihidroxicalciferol (DHUPA; PROULX, 1998). Não há controle homeostático rigoroso do Mg, o que faz com que sua concentração sanguínea reflita diretamente os níveis da dieta (GONZÁLEZ; SCHEFFER, 2003). A absorção de Mg intestinal ocorre principalmente no jejuno e íleo, em intensidade inversamente proporcional ao montante ingerido, fazendo com que baixa ingestão dietética de Mg resulte em absorção fracionada mais elevada (DHUPA; PROULX, 1998). Sua homeostase é regulada principalmente pela excreção renal e absorção intestinal, ainda que as glândulas paratireoide, tireoide e adrenal possam desempenhar algum papel, não 45 foi identificado hormônio regulatório primário para controle renal de Mg ou transporte intestinal. A vitamina D e sues metabolitos aumentam a absorção intestinal de Mg, ainda que em intensidade menor que seu efeito sobre o Ca (DHUPA; PROULX, 1998). Por representar menos de 1% do Mg corporal, o Mg sérico pode representar de forma inexata do real conteúdo de Mg nos tecidos, fazendo com que níveis normais séricos possam ocorrer mesmo na deficiência de Mg tecidual. Ainda assim, a mensuração sérica de Mg é uma técnica disponível na maioria dos laboratórios veterinários (DHUPA; PROULX, 1998). Estando 20% do Mg sérico ligado à albumina, sua mensuração sérica total pode revelar-se baixa em estados hipoalbuminêmicos, havendo uma fórmula para correção do valor de Mg sérico nos casos de hipoalbunimenia (DHUPA; PROULX, 1998). Em bovinos a febre do leite é caracterizada por hipocalcemia, hipofosfatemia e hipomagnesemia (MELENDEZ et al., 2002). Em consequência de uma drenagem súbita de Ca para o colostro no inicio da lactação, a maioria das vacas passam por período de hipocalcemia no periparto e, em 50% dos casos, essa hipocalcemia persiste por até dez dias. A consequência genérica da hipocalcemia é a perda de tônus muscular resultando em relaxamento do músculo esquelético, da musculatura lisa do útero, do esfíncter mamário e do trato digestivo, bem como menor atividade de neutrófilos (GOFF; HORST, 1998). A deficiência de Mg, importante modulador da homeostase do Ca, juntamente com a alcalose metabólica, que reduz a atividade do PTH, são comumente associadas à enfermidade na vaca (GOFF, 2005). Outra consequência grave da hipocalcemia é a diminuição da ingestão de matéria seca, o que leva a vários problemas metabólicos, como a cetose (HORST et al., 1997). Além disso, a hipocalcemia resulta em maior liberação de cortisol plasmático (GOFF; KEHRLI; HORST, 1998), o que exacerba a imunossupressão originalmente presente no parto, resultando maior ocorrência de enfermidades metabólicas e infecciosas próprias do peri-parto (OETZEL, 1998). Mamite e metrite, além de menor eficiência reprodutiva e cetose, estão associadas à hipocalcemia subclínica na vaca (DRACKLEY, 1999). Entretanto essas condições associadas a hipocalcemia subclinica ainda não foram relatadas em cadelas. 46 3.2 MATERIAL E MÉTODOS 3.2.1 Dosagens de proteínas totais, globulinas, albumina, cálcio, fósforo e magnésio séricos. As amostras de soro coletadas foram utilizadas para dosagem de Ca total, P, Mg, proteínas totais e albumina, utilizando kits comerciais de metodologia colorimétrica (Bioclin®). As absorbâncias foram medidas utilizando-se espectrofotômetro semiautomático (BA-88A, Bioclin®), em triplicata para cada amostra, além do uso de soros controles a cada análise. Utilizou-se para análises estatísticas o valor médio de cada triplicata. Os valores de globulinas foram calculados pela diferença entre os valores de proteínas totais e albumina. Os valores de Ca ionizado foram estimados a partir de um cálculo que leva em consideração as concentrações de Ca total e albumina (LUSTOZA, 2005; STOCKHAM; SCOTT, 2011), a seguir:. Cálcio ionizado = (cálcio total medida- concentração de albumina+3,5) x 0,5 3.2.2 Análises estatísticas Para as análises deste capítulo, em função de algumas perdas de amostras ocorridas, foram utilizados dados de cinco animais Pastor Alemão e seis Buldogue Inglês para análises pareadas. Para todas as variáveis, as comparações entre momentos em cada raça, e comparações entre raças em cada momento, foi utilizado o teste t de Student Pareado, utilizando o software Graphpad Prism v5.01 Para o teste de correlações entre Ca e P séricos foi utilizado o coeficiente de correlação de Spearman. Em todas as análises considerou-se o nível de significância de 5% (P<0,05). 3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos neste capítulo serão apresentados na forma de gráficos, a fim de facilitar a visualização dos resultados. Observando-se o perfil geral de proteínas totais, globulinas, albumina, e Ca total, houve diminuição dos seus níveis séricos no pré-parto atingindo níveis mínimos ao parto (D0), com elevação gradativa ao longo do pós-parto (figuras 6 a 10) em ambas as raças. As cadelas Buldogue Inglês apresentaram concentrações séricas de proteínas totais e globulinas 47 mais elevadas do que as Pastor Alemão ao longo de todo o período (p<0,001). No entanto, os níveis de albumina foram mais elevados nas cadelas Pastor Alemão (p<0,01). Não foi observada diferença estatística significante entre os diferentes tempos de coleta (P>0,05). O declínio das concentrações séricas de albumina e proteínas totais no pré-parto é relatado (VIJAYARAJAN et al., 2008; KRISHNAMURTHY et al., 2012). Pode, ser atribuído à rápida e ativa biossíntese proteica relativa ao crescimento fetal (HARAM et al., 1983; VIJAYARAJAN et al., 2008; KRISHNAMURTHY et al., 2012), bem como estar associado a um aumento do volume plasmático nas cadelas gestantes (MOSER et al., 1998). No entanto, essa última associação carece de comprovação científica na espécie canina, apesar de ser bem documentada em mulheres grávidas (HARAM, 1983; SIFAKIS; PHARMAKIDES, 2000). Aumento na concentração sérica de globulinas em cadelas no período pode estar relacionado à elevação de imunoglobulinas necessária à produção de colostro (KANEKO, 2008). Diferenças raciais podem influenciar os valores médios de globulinas (FAYOS et al., 2005), o que pode justificar a concentração sérica de globulinas mais elevada nas cadelas Buldogue Inglês em relação às Pastor Alemão, aqui observada. Proteínas totais (g/dL) 8 * * * * * * Buldogue Pastor 7 6 5 -30 0 7 14 21 30 Dias Figura 6: Concentração sérica de proteínas totais em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto. * indica diferença entre raças (P<0,05; t Student). Os limites inferiores da normalidade para proteínas totais e albumina sérica variam, respectivamente, de 4,0 a 5,4g/dL e 2,2 a 2,6g/dL (KLEY et al., 2003; KANEKO, 2008), 48 variação esta que pode ser explicada pelo estado nutricional, idade e raça do animal (KLEY et al., 2003). Entretanto, apesar dessas considerações, pode-se concluir que em todos os momentos, para ambas as raças, os animais estiveram acima dos limites de normalidade inferiores, como pode ser verificado nas figuras 6 e 8. Globulinas (g/dL) * * * 5 * * * Buldogue Pastor 4 3 -30 0 7 14 21 30 Dias Figura 7: Concentração sérica de globulinas em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto. * indica diferença entre raças (P<0,05; t Student). Albumina (g/dL) 3.0 * * * * * 2.8 Buldogue Pastor * 2.6 2.4 2.2 -30 0 7 14 21 30 Dias Figura 8: Concentração sérica de albumina em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto. * indica diferença entre raças (P<0,05; t Student). 49 Observando-se o perfil geral de proteínas totais, globulinas, albumina, e Ca total, houve diminuição dos seus níveis séricos no pré-parto atingindo níveis mínimos ao parto (D0), com elevação gradativa ao longo do pós-parto (figuras 6 a 10) em ambas as raças. As cadelas Buldogue Inglês apresentaram concentrações séricas de proteínas totais e globulinas mais elevadas do que as Pastor Alemão ao longo de todo o período (p<0,001). No entanto, os níveis de albumina foram mais elevados nas cadelas Pastor Alemão (p<0,01). Não foi observada diferença estatística significante entre os diferentes tempos de coleta (P>0,05). Comparando-se os perfis de Ca total com os de Ca ionizado observa-se uma correlação entre eles (Figura 10) como observado na literatura. Entretanto, da mesma forma como para Ca total, não houve diferença estatística entre as raças ao longo dos tempos estudados ou entre os tempos de coleta para cada uma das raças (P>0,05). Cálcio (mg/dL) 10.5 Buldogue Pastor 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 -30 0 7 14 21 30 Dias Figura 9: Concentração sérica de cálcio total em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto. 50 Cálcio livre (mg/dL) Figura 10 - Correlação entre cálcio total e cálcio livre (iônico) em cadelas das raças Buldogue Inglês (r2 = 0,92; p<0,0001) e Pastor Alemão (r2=0,95;p<0,0001). Buldogue Pastor 5.5 5.0 4.5 -30 0 7 14 21 30 Dias Figura 11: Concentração sérica de cálcio livre (ionizado) em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto. De acordo com Dhupa e Proulx (1998), a concentração normal de Ca sérico é de 9,4 a 11,2 mg/dL, enquanto a concentração sérica de Ca ionizado é de 5,0 mg/dL. Assim, considerando-se estes valores de referência, observa-se que houve hipocalcemia em ambas as raças em D0. A redução da calcemia observada no periparto é documentada na literatura, resultado do aumento requerimento de Ca pelo crescimento fetal e lactação (SWENSON; REENCE, 1996). Ao parto, a aceleração da lactogênese provoca aumento da movimentação de Ca do sangue materno para o leite. Porém, algumas fêmeas são incapazes de responder 51 imediatamente a essa mobilização, gerando hipocalcemia (LOPES, 2008). Por outro lado, diminuição significativa nas concentrações séricas de proteínas totais, especialmente albumina, pode induzir uma hipocalcemia (STOCKHAM; SCOTT, 2011). Apesar dos perfis séricos de proteínas totais, albumina, Ca total e Ca ionizado indicarem uma possível relação entre as reduções de seus níveis ao parto, com elevação posterior até D30 (Figuras 6, 8, 10 e 11), não é possível estabelecer, com segurança, se há uma relação entre a albuminemia e/ou proteinemia e as concentrações séricas de Ca observadas neste estudo, haja vista estarem os valores de proteínas totais e albumina dentro dos níveis considerados normais para a espécie canina (KLEY et al., 2003; KANEKO, 2008). No entanto, ficou evidente a hipocalcemia presente ao parto, com restabelecimento dos níveis normais de Ca circulantes aos 14 dias pós-parto (Figura 10). A queda de Ca sérico observada neste estudo confirma dados obtidos por Hollinshead et al. (2010), que observou concomitante declínio dos níveis circulantes de PTH. Entretanto, o mecanismo responsável por essa ausência de resposta da paratireoide à queda de Ca sérico não foi determinado naquele estudo. Na figura 12 observa-se que os níveis séricos de P, em geral, se elevaram após o parto em ambas as raças estudadas, sendo significativamente maiores nas cadelas Buldogue Inglês em relação aquelas da raça Pastor Alemão (p<0,001), entretanto não houve diferença em cada uma das raças ao longo dos tempos estudados (P>0,05). Fósforo (mg/dL) 6.5 * * 6.0 * * 5.5 Buldogue Pastor * * 5.0 4.5 4.0 -30 0 7 14 21 30 Dias Figura 12: Concentração sérica de fósforo em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto. * indica diferença entre raças (P<0,05; t Student). 52 Cerca de 5% do Ca total circulante encontra-se complexado a ânions não protéicos, dentre eles os íons fosfato (ROSOL; CAPEN, 1996). No presente estudo, não foi observada uma variação significativa nos níveis séricos de P e não houve correlação entre os níveis séricos de Ca e P (r=0,01 e P=0,95; figura 13). Diante disso, a variação dos níveis séricos de Ca não parece ter sido resultado de sua complexação com os íons P. Na figura 14, observa-se que as concentrações séricas de Mg oscilaram de forma diferente entre as duas raças, apesar de não terem sido detectadas diferenças significativas entre elas a cada momento da avaliação (P>0,05). Apesar de não ter sido verificada diferença significativa entre diferentes momentos (P>0,05), o perfil das cadelas da raça Pastor Alemão apresentou declínio da concentração até o parto seguido de crescente aumento ao longo do pós-parto. Por outro lado o declínio na concentração de Mg nas cadelas Buldogue Inglês foi observado entre o parto e a primeira semana do pós-parto, atingindo níveis de hipomagnesemia seguido de crescente aumento até D30. Os níveis séricos de Mg ionizado em caninos são de 1,7 a 2,5mg/dL (DHUPA; PROULX, 1998). Pastor Alemão Buldogues 12 Cálcio (mg/dL) Cálcio (mg/dL) 11 10 8 10 9 8 6 4 5 6 Fosfato (mg/dL) 7 8 3 4 5 6 7 Fosfato (mg/dL) Figura 13: Correlações entre as concentrações séricas de Ca e P em cadelas das raças Buldogue Inglês (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto (r=0,01 e P=0,95; Spearman). 53 Magnésio (mg/dL) 2.2 Buldogue Pastor 2.0 1.8 1.6 1.4 -30 0 7 14 21 30 Dias Figura 14: Concentração sérica de magnésio em cadelas da raça Buldogue (n=6) e Pastor Alemão (n=5) no período peri-parto. Apesar da regulação tanto de Ca como de Mg estarem relacionadas à atuação de PTH (STOCKHAM; SCOTT, 2011) a queda das concentrações de Mg observada nas cadelas Buldogue Inglês após o parto parece não estar relacionada com a mesma queda do Ca, haja vista a hipocalcemia ter sido verificada ao parto (D0) em ambas as raças, e a hipomagnesemia no pós-parto (D7) apenas nas cadelas Buldogue Inglês. Assim como o Ca, os níveis sérios de Mg são influenciados pela concentração de proteínas totais, P e PTH (STOCKHAM; SCOTT, 2011). O Mg sérico representa menos de 1% do Mg corporal dessa forma não evidência de forma exata o real conteúdo de Mg nos tecidos, fazendo com que níveis normais séricos possam ocorrer mesmo na deficiência de Mg tecidual (DHUPA; PROULX, 1998). As consequências das concentrações séricas de Mg alteradas na cadela não estão estabelecidas (STOCKHAM; SCOTT, 2011). Em bovinos a febre do leite é caracterizada por hipocalcemia, hipofosfatemia e hipomagnesemia (MELENDEZ et al., 2002), consequência de uma drenagem súbita de Ca para o colostro no inicio da lactação, o que faz com que muitas vacas passem por período de hipocalcemia no periparto que persiste por até dez dias (GOFF; HORST, 1998). A deficiência de Mg, importante modulador da homeostase do Ca, juntamente com a alcalose metabólica, que reduz a atividade do PTH, são comumente associadas à enfermidade na vaca (GOFF, 2005). 54 Grandes quantidades de Mg são mobilizadas pela glândula mamária para produção de leite, e sua reabsorção renal pode aumentar pela atuação de PTH, calcitonina, insulina e glucagon. Por outro lado hipomagnesia pode interferir na secreção de PTH, induzindo resistência sistêmica (ROSOL; CAPEN, 1996). 3.4 CONCLUSÃO Observou-se, para ambas as raças, hipocalcemia no parto com retorno aos níveis normais entre sete e 14 dias pós-parto. Entretanto, as cadelas Buldogue Inglês apresentaram hipomagnasemia no pós-parto, atingindo os níveis de normalidade aos 21 dias. 55 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO GERAIS Os dados apresentados neste trabalho mostram uma menor habilidade materna das cadelas da raça Buldogue Inglês se comparadas às cadelas da raça Pastor Alemão. Alguns fatores aqui identificados, como os níveis mais baixos de proteínas séricas e P, bem como a hipomagnesemia no pós-parto desta raça, associados à hipocalcemia também observada no mesmo período, podem ter contribuído para esta menor habilidade materna, mesmo sem ter havido hipocalcemia clínica. Entretanto, se observados os dados apresentados nas tabelas 3 e 4, os elevados desvios padrão das médias obtidas denota haver, mesmo entre animais de mesma raça, cadelas que possivelmente estariam com sinais de mamite e metrite num mesmo grupo em que havia cadelas saudáveis nestes aspectos. Diante disso, propõe-se, como continuidade deste estudo, verificar eventuais correlações entre CCS no leite, percentual de neutrófilos na citologia vaginal, concentrações séricas de corpos cetônicos, glicose, Ca ionizado, P e Mg, entre si e com os resultados de desenvolvimento das ninhadas, independentemente da raça da cadela. Acredita-se que, com estas avaliações complementares, conclusões mais claras poderão ser obtidas quanto ao metabolismo do pós-parto de cadelas de grande porte (2530kg), independentemente da raça. Quanto aos maus resultados apresentados pelas cadelas Buldogue Inglês na criação de suas ninhadas, uma vês que foram submetidas ao mesmo manejo que as cadelas Pastor Alemão, possivelmente seja um fator inerente à raça, o que exigiria modificações de manejo, inclusive nutricional, específicos para estes animais, a fim de melhorar sua habilidade materna. 56 5. REFERÊNCIAS ANDRADE, S. F. Manual de terapêutica veterinária. 2ªed. São Paulo: Roca, 2002. BARBER, P. J. Investigación de la hipercalcemia y la hipocalcemia. In C. T. MOONEY, M. E. PETERSON, U. PRESS (Ed.), Manual de enocrinología en pequeños animales. Barcelona, Espanha: Ediciones S, 2006, p. 39-61. CASE, L. P.; CAREY, D. P.; HIRAKAWA, D. A. Cuidados nutricionais dos filhotes recémnascidos. 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Ingredientes Farinha de vísceras de frango, quirera de arroz, milho integral moído*, Farinha de vísceras de frango, quirera de arroz, milho integral moído*, óleo de óleo de frango, farinha de peixe (salmão), polpa de beterraba, óleo de frango, farinha de peixe (salmão), polpa de beterraba, ovo em pó, óleo de peixe (salmão), cloreto de sódio (sal comum), cloreto de potássio, peixe (salmão), mannan-oligossacarídeo, cloreto de sódio (sal comum), cloreto levedura mannan- de potássio, cloreto de colina, levedura de cerveja, dl-metionina, vitamina a, oligossacarídeos, vitamina A, vitamina D3, vitamina E, vitamina K3, vitamina d3, vitamina E, vitamina K3, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B12, vitamina C, vitamina vitamina B12, vitamina C, vitamina H, vitamina PP, ácido pantotênico, ácido H, vitamina PP, ácido pantotênico, ácido fólico, cloreto de colina, sulfato fólico, cloreto de colina, sulfato ferroso, sulfato de cobre, sulfato de zinco, ferroso, sulfato de cobre, sulfato de zinco, sulfato de manganês, selenito sulfato de manganês, selenito de sódio, iodato de cálcio, sulfato de cobalto, de sódio, iodato de cálcio, sulfato de cobalto, extrato de yucca, zeolita, extrato de yucca, zeolita, hidrolisado de fígado suíno, betaglucanos, propionato hidrolisado de cálcio, antioxidante (BHA e BHT). *Ingrediente transgênico. Espécies de de cerveja, figado DL-metionina, suíno, fosfato betaglucanos, bicálcico, propionato de cálcio, antioxidante (b.h.a.-b.h.t.) *ingrediente transgênico. Espécies doadoras do doadoras do gene: Bacillus thuringiensis; Streptomyces viridochromogenes gene: Bacillus thuringiensis; Streptomyces viridochromogenes Enriquecimento Vitamina A 10000,00U.I., vitamina D3 1000,00 U.I., vitamina E 100,00 mg, Vitamina A 12000,00 U.I., vitamina D3 1200,00 U.I., vitamina E 120,00 U.I., por kg vitamina C 100,00mg, vitamina PP 25,00mg, vitamina B1 3,00mg, vitamina vitamina C 120,00mg, vitamina PP 30,00mg, vitamina B1 3,60mg, vitamina B2 B2 5,00mg, vitamina B6 4.00mg, vitamina B12 40,0mcg, vitamina H 0,25mg, 6,00mg, vitamina B6 4.80mg, vitamina B12 50,0mcg, vitamina H 0,30mg, vitamina K3 1,00mg, ácido fólico 0,30mg, ácido pantotênico 10,00mg, vitamina K 1,20mg, ácido fólico 0,36mg, ácido pantotênico 12,00mg, cobalto cobalto 0,25mg,cobre 30,00mg, colina 1500,00mg, ferro 40,00mg, iodo 0,25mg, cobre 30,00mg, colina 2500,00mg, ferro 40,00mg, iodo 1,50mg, 1,50mg, manganês 2,00mg, selênio 0,10mg, zinco 70,00mg. manganês 2,00mg, selênio 0,10mg, zinco 70,00mg