Isolamento de clones de cDNA codificantes para o Factor Tecidual

Spicer, Eleanor K.; Horton, Renata; Bloem, Laura; Bach, Ronald; Wiliams, Kenneth R.;
Guha, Arabinda; Kraus, Jan; Lin, Tsung-Chung; Nemerson, Yale; Konigsberg, Wiliams
H.; Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 84, pp. 5148-5152, August 1987
Projecto Tutorial
Licenciatura em Bioquímica
3º Ano
Cecília Duarte
http://images.google.pt/
Objectivo
http://images.google.pt/
Definir a estrutura primária do Factor Tecidual através do isolamento de
clones de cDNA
Introdução
Existem duas vias de coagulação e que se relacionam
Indivíduos com deficiências nas proteínas da via extrínseca apresentam
hemorragias, ao contrario dos indivíduos com deficiências nas proteínas no inicio
da via intrínseca.
intrínseca.
Introdução
http://images.google.pt/
Os cDNA de todas as proteínas envolvidas na coagulação, com excepção
do TF (Factor Tecidual), já foram clonados e sequenciados
sequenciados..
A apoproteína foi purificada, em que 50
50--70
70%
% da sequência de amino
ácidos foi determinada.
determinada. O que permitiu a identificação numa biblioteca de
clones de cDNA, do clone com região codificante para a proteína.
proteína.
A sequência nucleotidica destes clones, juntamente com os dados da
sequência de aminoácidos, permitiu o conhecimento da estrutura primaria da
apoproteína TF.
TF.
Mecanismo de Coagulação
Via Intrínseca
Via Extrínseca
Factor Xa
Via Intrínseca
http://images.google.pt/
Ca²+
Contacto entre o sangue e
as superfícies expostas
Fosfolipidos
Plaquetários
Quininogénio
Activador
Protrombina
Precalicraína
XII
XIIa
XI
Protrombina
XIa
Ca²+
IX
VIIIa
Trombina
IXa
Ca²+
VIIIa
X
Xa
V
Ca²+
Activador
Protrombina
Trombina
Via Extrínseca
http://images.google.pt/
Ca²+
Traumatismo Tecidual
Fosfolipidos
Plaquetários
Activador
Protrombina
Factor Tecidual
Protrombina
VII
VIIa
Ca²+
Xa
X
V
Ca²+
Activador
Protrombina
Trombina
Purificação de Proteínas
http://images.google.pt/
Centrifugação
Electroforese em Gel
Cromatografia em liquido (HPLC)
Resultados
http://images.google.pt/
As sondas demonstradas na Fig.1 correspondem a DNA codificante para 3 regiões da proteína TF. As
sondas 2 e 3 têm uma correspondência de 17 bases de comprimento para todas as possíveis sequências
codificantes de péptidos isolados da região N-terminal e C-terminal do TF.
Na sonda 1 existe uma só correspondência de 45 bases, para uma sequência codificante prevista para
um péptido interno.
Resultados
http://images.google.pt/
Fig.2 mostra o mapa de restrição de cDNA
para o TF e indica as regiões contidas em
cada um dos cDNA recombinantes.
Fragmentos de restrição de dois cDNA
foram
clonados
em
M13mp19
para
determinação da sequência.
Resultados
http://images.google.pt/
Resultados
http://images.google.pt/
Na fig. 4 temos a sequência de amino ácidos onde estão descritos os 3 locais de
glicosilação N-ligados, assim como os domínios extracelular, citoplasmático e hidrofóbico.
Podemos também observar o carácter hidrofóbico para o domínio da membrana através do
gráfico.
Conclusão
http://images.google.pt/
Foi determinada a sequência estrutural do gene assim como a estrutura
primaria da apoproteína do TF humano.
A sequência de amino ácidos e as analises químicas da proteína madura,
levam à conclusão de que o TF humano é uma cadeia polipeptidica de 263
amino ácidos, que têm uma pequena relação com a vitamina K.
O activador ligado ao factor VII não necessita de proteólise prévia, logo a
coagulação pode ser simplesmente iniciada pelo complexo factor VII e TF
sem ocorrer proteólise antecipadamente.
O Factor Tecidual não mostra grande homologia com os outros factores de
coagulação dependentes da vitamina k.
Bibliografia
http://images.google.pt/
Spicer, Eleanor K.; Horton, Renata; Bloem, Laura; Bach, Ronald; Wiliams, Kenneth R.; Guha,
Arabinda; Kraus, Jan; Lin, Tsung-Chung; Nemerson, Yale; Konigsberg, Wiliams H.; Proc. Natl. Acad. Sci
USA, Vol. 84, pp. 5148-5152, August 1987.
Neshich, Goran; Neto, L. S., Jair; Estudo da Influencia de Sequências Polipeptidicas e de Codões na
Determinação da Estrutura Secundária de Proteinas; Comunicado Técnico 42, ISSN 1677-8464, Dez.
2002.
Neshich, Goran; Guelfi, Andrea; Molina, M. G., Silvia; Determinaçao da Estrutura e Estudo da Função
da Metalotioneína de Synechococcus; Comunicado Técnico 43, ISSN 1677-8464, Dez. 2002
http://ncbi.nlm.nih.gov/
http://nic.sav.sk/logos/books/scientific/node29