Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS 72396 96 tests HBe Ag - 96 - Bio-Rad

Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS
96 tests HBe Ag - 96 tests HBe Ab
72396
DISPOSITIVO PARA DETECÇÃO DE ANTIGÉNIOS HBe
E ANTICORPOS ANTI-HBe POR TÉCNICA IMUNOENZIMÁTICA
IVD
Controlo da qualidade de fabrico
Todos os produtos fabricados e comercializados pela empresa Bio-Rad são submetidos a
um sistema de garantia da qualidade, desde a recepção das matérias primas até à
comercialização do produto final.
Cada lote de produto final é objecto de um controlo de qualidade, sendo comercializado
apenas quando em total conformidade com os critérios de aceitação.
A documentação relativa à produção e ao controlo de cada lote encontra-se arquivada na
nossa empresa.
ÍNDICE
1. OBJECTIVO DO TESTE
2. INTERESSE CLÍNICO
3. PRINCÍPIO DO TESTE
4. COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO
5. MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
6. PRECAUÇÕES
7. INSTRUÇÕES DE HIGIENE E SEGURANÇA
8. RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES
9. CONSERVAÇÃO - VALIDADE
10. AMOSTRAS
11. MODO DE FUNCIONAMENTO
12. CÁLCULOS E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
13. VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DOS DEPÓSITOS
DE REAGENTES
14. DESEMPENHOS
15. BIBLIOGRAFIA
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1 - OBJECTIVO DO TESTE
Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS permite a determinação qualitativa, por técnica imunoenzimática, do
antigénio do vírus da hepatite B (Ag HBe) e/ou dos anticorpos dirigidos contra o antigénio do vírus
da hepatite B (Anti-HBe) eventualmente presentes no soro ou no plasma humano.
2 - INTERESSE CLÍNICO
A presença do antigénio HBe traduz geralmente multiplicação viral activa e significa infecciosidade
do indivíduo. O antigénio HBe aparece precocemente na hepatite viral de tipo B e a sua manutenção
(superior a um mês) traduz um risco de agravamento da hepatopatia).
O aparecimento de anticorpos contra o antigénio HBe demonstra uma redução da replicação viral e
representa geralmente um prognóstico clínico favorável.
3 - PRINCIPIO DO TESTE
a) Detecção do antigénio HBe
A detecção do Ag HBe assenta numa técnica imunoenzimática de tipo “sandwich” em dois tempos,
utilizando um anticorpo Anti-HBe humano e um par de anticorpos monoclonais Anti-HBe, marcados
(Acm1 e Acm2) de origem murina, que reconhecem epítopos diferentes.
A fase sólida é constituída por 12 tiras de 8 poços em polistireno, sensibilizados com anticorpos Anti
HBe humano.
Os dois anticorpos monoclonais estão ligados a peroxidase.
A quantificação compreende as etapas reaccionais seguintes :
1. Incubação das amostras e dos controlos, em presença do primeiro anticorpo Anti-HBe humano,
fixado na fase sólida.
2. Lavagem, seguida de incubação dos complexos insolubilizados com o par de anticorpos
monoclonais marcados com peroxidase.
3. Eliminação por lavagem do conjugado que ficou livre, seguida de revelação da actividade
enzimática ligada à fase sólida, por adição do substrato.
4. Paragem da revelação, seguida de leitura das densidades ópticas a 450/620 nm e interpretação
dos resultados.
b) Detecção dos anticorpos anti-HBe
Para a detecção dos anticorpos anti-HBe, o dispositivo utiliza a mesma fase sólida que para o Ag
HBe. O teste baseia-se no princípio da competição entre o anticorpo insolubilizado e o anticorpo
presente na amostra, perante uma quantidade limitada de antigénio HBe, de origem plasmática,
utilizado como reagente de neutralização. A revelação processa-se, em seguida, por meio de uma
outra mistura do par de anticorpos monoclonais (Acm1 e Acm2) marcados com peroxidase.
O teste compreende as etapas reaccionais seguintes:
1. Incubação das amostras e dos controlos, em presença do primeiro anticorpo Anti-HBe humano,
imobilizado na fase sólida, e do antigénio de neutralização.
2. Lavagem, seguida de incubação dos complexos insolubilizados com o par de anticorpos
monoclonais, marcados com peroxidase.
3. Eliminação, por lavagem, do conjugado que ficou livre, seguida de revelação da actividade
enzimática ligada à fase sólida, por adição do substrato.
4. Paragem da revelação, seguida de leitura das densidades ópticas a 450/620 nm e interpretação
dos resultados.
4 - COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO
Todos os reagentes são destinados a utilização no diagnóstico in vitro.
Os reagentes são fornecidos em quantidade suficiente para realizar 2 x 96 determinações em 1 a
12 manipulações independentes e segundo as combinações seguintes :
• 96 determinações de Ag HBe e 96 determinações de Ac HBe
• ou 2 x 48 determinações de Ag HBe e 2 x 48 determinações de Anti-HBe simultaneamente.
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ETIQUETAGEM
NATUREZA DOS REAGENTES
R1
MICROPLACA : 12 tiras de 8 poços sensibilizados
com anticorpos Anti-HBe humanos provenientes de soro positivo
em Ag HBs, inactivado
R2
SOLUÇÃO DE LAVAGEM CONCENTRADA (20X)
Tampão Tris-NaCI pH 7,4
Conservante : ProClinTM 300 (0,04 %)
R3
CONTROLO NEGATIVO (COMUM AOS TESTES Ag HBe/ANTI-Be)
Soro humano negativo em anticorpos anti-HIV1 e anti-HIV2,
em antigénio HBs e em anticorpos anti HCV
Conservante : Azida sódica a 0,1%
R4
CONTROLO POSITIVO TESTE ANTI-HBe
Soro humano contendo anticorpos anti-HBe e potencialmente
positivo em Ag HBs, negativo em anticorpos anti-HIV1
e anti-HIV2 e em anticorpos anti-HCV, inactivado
Conservante : Azida sódica a 0,1%
R5
CONTROLO POSITIVO TESTE Ag HBe
Diluente sintético contendo plasma humano desfibrinado ou soro
positivo em Ag HBe e em Ag HBs, negativo em anticorpos
anti-HIV1, anti-HIV2 e em anticorpos anti-HCV, inactivado
Conservante : Azida sódica a 0,1 %
R6
ANTIGÉNIO DE NEUTRALIZAÇÃO
Diluente sintético contendo plasma humano desfibrinado ou soro
positivo em Ag HBe e em Ag HBs, negativo em anticorpos
anti-HIV1, anti-HIV2 e em anticorpos anti-HCV, inactivado
Conservante : Azida sódica a 0,1 %
R7a
CONJUGADO TESTE ANTI- HBe, CONCENTRADO 5X
2 anticorpos monoclonais murinos (Acm1 e Acm2)*
Anti-HBe ligados a peroxidase
R7b
CONJUGADO TESTE AG HBe, CONCENTRADO 5X
2 anticorpos monoclonais murinos (Acm1 e Acm2)*
Anti-HBe ligados a peroxidase
R8
TAMPÃO SUBSTRATO DA PEROXIDASE
Solução de ácido cítrico e de acetato de sódio, pH 4.0,
contendo 0,015 % de H2O2 e 4 % de dimetilsulfoxida (DMSO)
R9
R10
CROMOGÉNIO
Solução corada de rosa contendo tetrametilbenzidina (TMB)
SOLUÇÃO DE PARAGEM
Solução de ácido sulfúrico 1N
FRASCO VAZIO PARA O R2 DILUÍDO
APRESENTAÇÃO
2 placas
1 frasco
235 ml
1 frasco
8 ml
1 frasco
1,5 ml
1 frasco
1,5 ml
1 frasco
8 ml
1 frasco
3 ml
1 frasco
3 ml
1 frasco
60 ml
1 frasco
5 ml
1 frasco
28 ml
1 frasco
25 ml
* Não trocar os dois conjugados.
5 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
•
•
•
•
•
•
Água destilada ou completamente desmineralizada.
Lixívia e bicarbonato de sódio.
Papel absorvente.
Luvas descartáveis.
Tubos de polistireno (12 x 75 mm) descartáveis
Pipetas automáticas ou semi-automáticas reguláveis ou fixas, com uma capacidade de
distribuição de 50 µl, 100 µl, 200 µl e 1 ml
• Provetas graduadas de 10 ml, 50 ml, 100 ml, 1 000 ml
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•
•
•
•
•
Agitador tipo vórtex
Recipiente para resíduos contaminados
Sistema de lavagem automático, semi-automático ou manual para microplaca*
Recipiente para banho-maria ou incubadora a seco com termóstato até 37°C ± 1°C*
Aparelho de leitura para microplacas, equipado com filtros de 450 e 620 nm*
(*) Para uma informação mais precisa sobre os aparelhos validados pelos nossos serviços técnicos
é favor contactar-nos.
6 - PRECAUÇÕES
A qualidade dos resultados depende da correcta implementação das seguintes boas práticas de
laboratório :
• Não misturar reagentes de lotes diferentes durante um mesmo ensaio.
NOTA : É possível utilizar outros lotes de solução de lavagem (R2, identificação do rótulo: cor
verde 20X), de tampão substrato (R8, identificado como TMB buf. a azul), de cromogénio (R9,
identificado como TMB 11X. a violeta) e de solução de paragem (R10, identificada como 1N a
vermelho), para além dos fornecidos com o dispositivo, desde que se utilize apenas um mesmo
lote destes produtos no decorrer de um ensaio. Estes reagentes podem ser utilizados com outros
produtos da nossa empresa. Para além disso, a solução de lavagem (R2, identificação do rótulo:
cor verde 20X) pode ser misturada com as outras 2 soluções de lavagem incluídas nos kits de
reagentes Bio-Rad (R2, identificações dos rótulo: cor azul 10X ou cor laranja 10X) quando
adequadamente reconstituídas, desde que apenas uma mistura seja utilizada num determinado
ensaio. Para informações mais pormenorizadas é favor contactar os nossos serviços técnicos.
• O nome do teste, bem como um número de identificação específico do teste, estão referidos no
quadro de cada microplaca. Este número de identificação específico figura igualmente em cada
tira.
Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS : Número específico de identificação = 56.
Esta identificação deve ser verificada antes de cada utilização. Qualquer tira cujo número de teste
não esteja presente ou seja diferente do acima referido não deverá ser utilizada.
• Não utilizar reagentes cujo prazo de validade tenha terminado.
• Antes da utilização é necessário aguardar 30 minutos para que os reagentes estabilizem à
temperatura ambiente (18-30°C) e uma hora para a solução de lavagem diluída (R2).
• Reconstituir cuidadosamente os reagentes, evitando qualquer contaminação.
• Não efectuar o teste em presença de vapores reactivos (ácidos, alcalino, aldeídos) ou de poeiras
que possam alterar a actividade enzimática do conjugado.
• Utilizar recipientes de vidro perfeitamente lavados e enxaguados com água destilada ou, de
preferência, material descartável.
• Não deixar secar a microplaca entre o final da lavagem e a distribuição dos reagentes.
• Utilizar uma ponta de distribuição nova para cada soro.
• A lavagem dos poços é uma etapa essencial da manipulação : respeitar o número de ciclos de
lavagem prescritos e assegurar que todos os poços são cheios e, depois, completamente
esvaziados. Uma lavagem deficiente pode dar origem a resultados incorrectos.
• Nunca utilizar o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de revelação.
• Verificar a exactidão e a precisão das pipetas, bem como o bom funcionamento dos aparelhos
utilizados.
• Não alterar o modo de procedimento.
• Controlar a solução de revelação enzimática antes da distribuição. Ela deve ser rosa. Se se
apresentar de cor azulada, a solução de revelação está alterada e não deve ser utilizada para o
teste.
7 - INSTRUÇÕES DE HIGIENE E SEGURANÇA
Todos os reagentes do dispositivo são destinados a utilização do diagnóstico in vitro.
• Usar luvas descartáveis na manipulação dos reagentes e das amostras e lavar cuidadosamente as
mãos após a sua manipulação.
• Não "pipetar com a boca".
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• O material de origem humana utilizado na preparação do reagente R3 (controlo negativo) foi
analisado e comprovado como não reactivo em antigénio de superfície em relação ao vírus da
hepatite B (Ag HBs), em anticorpos dirigidos contra os vírus de imunodeficiência humana (antiHIV-1 e anti-HIV-2) e em anticorpos dirigidos contra o vírus da hepatite C (anti-HCV).
• O material de origem humana utilizado para a preparação do reagente R1 (microplaca sensibilizada)
foi testado e considerado não reactivo em relação aos anticorpos contra o vírus de
imunodeficiência humana (anti-VIH-1 e anti-VIH-2) e em relação aos anticorpos conta o vírus da
hepatite C (VHC). É reactivo em antigénio de superfície do vírus da hepatite B (Ag HBs). Foi
inactivado por meio fotoquímico.
• O material de origem humana utilizado na preparação dos reagentes R4 (controlo positivo teste
Anti-HBe), R5 (controlo positivo teste Ag HBe) e R6 (antigénio de neutralização) foi analisado e
comprovado como não reactivo em anticorpos dirigidos contra os vírus de imunodeficiência
humana (anti-HIV-1 e anti-HIV-2) e em anticorpos anti-HCV. Os reagentes R5 e R6 são positivos
em antigénio de superfície do vírus da hepatite B (Ag HBs), o reagente R4 é potencialmente
positivo em antigénio de superfície do vírus da hepatite B (Ag HBs). Foram inactivados por meio
fotoquímico.
• Pelo facto de nenhum método poder garantir, de forma absoluta, a ausência de vírus HIV, HBV ou
HCV ou outros agentes infecciosos, estes reagentes de origem humana, bem como as amostras
dos doentes, devem ser considerados como potencialmente infecciosos e, como tal, manipulados
com as precauções habituais.
• Considerar o material directamente em contacto com as amostras e os reagentes de origem
humana, bem como as soluções de lavagem, como produtos contaminados.
• Evitar o derramamento de amostras ou soluções que as contenham.
• As superfícies contaminadas devem ser lavadas com lixívia diluída a 10 %. Se o líquido
contaminante for um ácido, as superfícies contaminadas deverão ser previamente neutralizadas
com bicarbonato de sódio e, em seguida, lavadas com lixívia e secas por meio de papel
absorvente. O material utilizado para a limpeza deverá ser eliminado num contentor especialmente
destinado a resíduos contaminados.
• As amostras, os reagentes de origem humana, bem como o material e produtos contaminados,
deverão ser eliminados após descontaminação :
- por imersão em lixívia à concentração final de 5% de hipocloreto de sódio (1 volume de lixívia
para 10 volumes de líquido contaminado ou de água), durante 30 minutos,
- ou por esterilização em autoclave à temperatura de 121°C, durante um mínimo de 2 horas. A
esterilização em autoclave constitui o melhor método para inactivar os vírus HIV e HVB.
ATENÇÃO : NÃO INTRODUZIR NA AUTOCLAVE SOLUÇÕES CONTENDO HIPOCLORETO DE
SÓDIO.
• Não esquecer a neutralização e/ou a esterilização em autoclave das soluções ou efluentes de
lavagem ou de qualquer líquido que contenha amostras biológicas, antes de as deitar fora.
• A ficha de dados de segurança está disponível a pedido.
• A manipulação e eliminação dos produtos químicos deve ser efectuada em cumprimento das boas
práticas de laboratório.
• Evitar qualquer contacto do tampão substrato, do cromogénio e da solução de paragem com a
pele e as mucosas (toxicidade, irritação ou queimadura).
• Certos reagentes contêm azida sódica.
Este composto pode formar, com as canalizações de chumbo ou de cobre, azidas altamente
explosivas. Para evitar qualquer acumulação de tais azidas nas canalizações, ao eliminar estes
reagentes pela canalização, neutralizá-los e lavar a canalização com água abundante.
• Alguns reactivos contêm ProClin™ 300 (0.04%, 0.1 % e/ou 0,5%)
Xi Irritante
R43 : Pode causar sensibilização em contacto com a pele
S28-37 : Após contacto com a pele, lavar imediatamente com bastante água e sabão.
Usar luvas adequadas.
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8 - RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES
Nota : antes de utilizar, deixar os reagentes estabilizar à temperatura ambiente (18-30°C)
Microplaca (R1)
Cada suporte quadro que contém 12 tiras está acondicionado numa bolsa de alumínio selada. Corte
a bolsa com a ajuda de tesouras ou escalpelo de 0,5 a 1 cm acima da soldadura. Abra a bolsa e
retire o quadro. Coloque as tiras não-utilizadas de volta na bolsa. Feche cuidadosamente a bolsa e
guarde-a de novo a +2-8 °C.
Solução de lavagem concentrada (20X) : R2
Diluir 20 vezes a solução em água destilada. Obtém-se assim a solução de lavagem pronta a utilizar.
75 ml de solução pronta a ser utilizada são necessários para uma tira. Homogeneizar.
Conjugado teste Anti -HBe (R7a)
Diluir a 1/5 a solução R7a na solução R2 previamente diluída, sabendo que é necessário prever,
consoante o número de tiras utilizadas :
Nº de tiras utilizadas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Volume de solução R7a (ml)
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
qsp com R2 diluído (ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Homogeneizar.
O conjugado também pode ser utilizado sem pré-diluição, depositando cerca de 80 µl de R2 diluído
pronto a utilizar e depois 20 µl de conjugado 5X. Agitar.
Conjugado teste Ag HBe (R7b)
Utilizar o mesmo protocolo que para o conjugado R7a.
Solução de revelação enzimática (R8 + R9)
Diluir o reagente R9 no reagente R8, respeitando a diluição de 1/11 (1 volume de R9 em 10 volumes
de R8). Homogeneizar.
10 ml são necessários e suficientes para 1 a 10 tiras.
9 - CONSERVAÇÃO - VALIDADE
O dispositivo deve ser conservado a +2-8°C. Cada elemento do dispositivo conservado a +2-8°C
pode ser utilizado até ao termo do prazo de validade indicado naembalagem (salvo indicação
específica)
R1 : Uma vez aberta a bolsa selada sob vácuo, as tiras de micro-poços conservadas a +2-8 °C na
bolsa cuidadosamente selada de novo podem ser utilizadas durante 1 mês.
R2 : A solução de lavagem diluída pode ser armazenada à temperatura ambiente (2-30°C) durante 2 semanas.
A solução de lavagem concentrada (R2) pode ser armazenada à temperatura de +2-30°C.
R7a : O conjugado diluído teste Anti-HBe pode ser armazenado durante 8 horas à temperatura
ambiente (18-30°C). A Solução de Acção Conjugada deve ficar ao abrigo da luz, à temperatura
ambiente (18-30°C).
R7b : O conjugado diluído teste Ag HBe pode ser armazenado durante 8 horas à temperatura
ambiente (18-30°C). A Solução de Acção Conjugada deve ficar ao abrigo da luz, à temperatura
ambiente (18-30°C).
R8 + R9 : Após a reconstituição, o reagente armazenado em local escuro pode ser utilizado durante
6 horas à temperatura ambiente (18-30°C).
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10 - AMOSTRAS
Recolher uma amostra de sangue segundo a prática habitual.
Os testes são efectuados em amostras não diluídas de soro ou de plasma (recolhidos com
anticoagulantes como EDTA, heparina, citrato).
Uma hemólise muito pronunciada pode afectar os desempenhos do teste. As amostras que
apresentem agregados devem ser clarificadas por centrifugação antes do teste. As partículas ou
agregados de fibrina em suspensão podem fornecer resultados falsamente positivos.
As amostras devem ser conservadas a + 2-8°C se a detecção for efectuada no prazo de 7 dias ou
podem ser conservadas congeladas a –20°C por vários meses.
Evitar os processos repetidos de congelação/descongelação. As amostras que tiverem sido
congeladas e descongeladas mais de 3 vezes não deverão ser utilizadas.
Se for necessário transportar as amostras, estas deverão ser acondicionadas segundo a
regulamentação em vigor para o transporte de agentes etiológicos e, de preferência, deverão ser
transportadas congeladas.
NÃO UTILIZAR SOROS CONTAMINADOS, HIPERLIPÉMICOS, HIPER-HEMOLIZADOS OU HIPERPROTEICOS.
NOTA : Não se observou qualquer interferência em amostras contendo até 100 mg/l de bilirrubina,
bem como em amostras lipémicas contendo até 36 g/l de trioleína e em amostras hemolizadas
contendo até 2,5 mg/ml de hemoglobina.
Verificou-se uma diminuição das razões em amostras negativas sobrecarregadas com 45 mg/ml de
albumina, reproduzindo uma hiperproteinemia.
11 - MODO DE FUNCIONAMENTO
Os testes Ag HBe e Anti-HBe podem ser efectuados na mesma placa. Neste caso, aconselhamos :
• Teste Anti-HBe : Colunas 1 a 6
• Teste Ag HBe : Colunas 7 a 12
Para as lavagens, o volume mínimo é de 0,55 ml por lavagem e por poço.
a) Protocolo do teste Anti-HBe
1. Preparar a solução de lavagem.
2. Retirar da embalagem de protecção o suporte e o número de tiras necessárias. Voltar a guardar
as tiras não utilizadas dentro da embalagem, fechando-a de novo.
3. Distribuir pelos poços, sucessivamente (plano de placa sugerido) :
• A1, B1, C1 : 100µl de controlo negativo (R3)
• D1 : 100 µl de controlo positivo (R4)
• E1, F1, G1 : 100 µl de amostra desconhecida.
Em função do sistema utilizado é possível modificar a posição ou a ordem de distribuição dos
controlos.
NOTA : Visualmente, uma nítida diferença de coloração pode ser observada entre um poço vazio
transparente e um poço contendo uma amostra (amarelo claro). É possível verificar, por leitura
fotométrica a 490 nm, a presença de amostras nos poços. (ver Capítulo 13 : VERIFICAÇÃO
ESPECTROFOTOMÉTRICA DOS DEPÓSITOS DOS REAGENTES).
4. Adicionar rapidamente 50 µl de antigénio neutralizante (R6) por poço. Homogeneizar.
Cobrir com película adesiva, deixar incubar durante 3 horas ± 10 minutos a 37°C ± 1°C.
NOTA : Visualmente, uma coloração rosa pode ser observada após adição do antigénio
neutralizante R6. É possível verificar, por leitura fotométrica a 490nm, a presença do antigénio
neutralizante R6 nos poços. (ver Capítulo 13 : VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DOS
DEPÓSITOS DOS REAGENTES).
5. Preparar a solução de conjugado R7a antes do fim da primeira incubação.
6. Retirar a película adesiva, esvaziar por aspiração o conteúdo de cada poço para o recipiente de
resíduos e, em seguida, lavar quatro vezes.
7. Distribuir rapidamente 100 µl da solução de conjugado R7a pré-diluído (Ver Capítulo 8 :
RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES) por poço ou, uma vez que o conjugado também pode ser
utilizado sem diluição prévia, depositar cerca de 80 µl de R2 diluído e depois 20 µl de conjugado
R7a por poço. Homogeneizar.
50
Cobrir com película adesiva e deixar incubar durante 30 minutos (mínimo 25 minutos, máximo 40
minutos) a 37°C ± 1°C. Retirar a película adesiva, esvaziar por aspiração o conteúdo de cada poço
para o recipiente de resíduos e, em seguida, lavar cinco vezes.
NOTA : Visualmente, uma coloração violeta pode ser observada após adição do conjugado R7a.
É possível verificar, por leitura fotométrica a 620 nm, a presença do conjugado R7a nos poços.
(Ver Capítulo 13 : VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DOS DEPÓSITOS DOS
REAGENTES).
8. Preparar a solução de revelação enzimática (R8 + R9).
9. Distribuir rapidamente 80 µl da solução de revelação por poço e colocar a placa 30 minutos ±
5 minutos ao abrigo da luz e à temperatura ambiente (+ 18 –30°C).
NOTA : A distribuição da solução de revelação, que tem a coloração rosa, pode ser controlada
visualmente nesta fase da manipulação: Observa-se uma diferença de coloração significativa
entre um poço vazio e um que contenha a solução de revelação rosa. (Para a verificação
automática, ver o parágrafo 13 : VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS
AMOSTRAS E DOS REAGENTES)
10. Adicionar rapidamente 100 µl da solução de paragem (R10) em cada poço.
NOTA : A distribuição da solução de paragem, que é incolor, pode ser controlada visualmente
nesta fase da manipulação. A coloração do substrato, rosa (para as amostras negativas) ou azul
(para as amostras positivas), desaparece dos poços, que passam assim a incolores (amostras
negativas) ou amarelos (amostras positivas), após adição da solução de paragem.
11. Aguardar 4 minutos antes da leitura.
12. Limpar cuidadosamente a superfície inferior da placa e proceder à leitura da densidade óptica a
450/620 nm, nos 30 minutos que se seguem à paragem da reacção.
b) Protocolo do teste Ag HBe
1. Preparar a solução de lavagem.
2. Retirar da embalagem de protecção o suporte e o número de tiras necessárias. Voltar a guardar
as tiras não utilizadas dentro da embalagem, fechando-a de novo.
3. Distribuir pelos poços, sucessivamente (plano de placa sugerido) :
• A1, B1, C1 : 100 µl de controlo negativo (R3)
• D1 : 100 µl de controlo positivo (R5)
• E1, F1, G1 : 100 µl da amostra desconhecida
Em função do sistema utilizado é possível modificar a posição ou a ordem de distribuição dos
controlos.
NOTA : Visualmente, uma nítida diferença de coloração pode ser observada entre um poço vazio
transparente e um poço contendo uma amostra (amarelo claro). É possível verificar, por leitura
fotométrica a 490 nm, a presença das amostras nos poços. (Ver Capítulo 13 : VERIFICAÇÃO
ESPECTROFOTOMÉTRICA DOS DEPÓSITOS DOS REAGENTES).
4. Cobrir com película adesiva, deixar incubar durante 3 horas ± 10 minutos a 37°C ± 1°C.
5. Preparar a solução de conjugado R7b antes do fim da primeira incubação.
6. Retirar a película adesiva, esvaziar por aspiração o conteúdo de cada poço para o recipiente de
resíduos e, depois, lavar quatro vezes.
7. Distribuir rapidamente 100 µl da solução de conjugado R7b pré-diluída (Ver Capítulo 8 :
RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES) por poço ou, uma vez que o conjugado também pode
ser utilizado sem diluição prévia, depositar primeiro 80 µl de R2 diluído e depois 20 µl de
conjugado R7b por poço. Homogeneizar.
Cobrir com película adesiva e deixar incubar 30 minutos (mínimo 25 minutos, máximo 40 minutos)
a 37°C ± 1°C.
NOTA : Visualmente, uma coloração azul turquesa pode ser observada após adição do conjugado
R7b. É possível verificar, por leitura fotométrica a 620nm, a presença do conjugado R7b nos poços.
(Ver Capítulo 13 : VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DOS DEPÓSITOS DOS REAGENTES).
8. Retirar a película, esvaziar o conteúdo de cada poço no contentor de resíduos e, depois, lavar cinco vezes.
9. Preparar a solução de revelação enzimática (R8 + R9).
51
10. Distribuir rapidamente 80 µl da solução de revelação por poço e colocar a placa 30 minutos ±
5 minutos ao abrigo da luz e à temperatura ambiente (+18 -30°C).
NOTA : A distribuição da solução de revelação, que tem a coloração rosa, pode ser controlada
visualmente nesta fase da manipulação: observa-se uma diferença de coloração significativa entre
um poço vazio e um poço contendo a solução de revelação rosa. (Para a verificação automática,
consultar o parágrafo 13 : VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS
AMOSTRAS E DOS REAGENTES)
11. Adicionar rapidamente 100 µl da solução de paragem (R10) em cada poço.
NOTA : A distribuição da solução de paragem, que é incolor, pode ser controlada visualmente
nesta fase da manipulação. A coloração do substrato, rosa (para as amostras negativas) ou azul
(para as amostras positivas, desaparece dos poços, que se tornam incolores (amostras negativas)
ou amarelos (amostras positivas), após adição da solução de paragem.
12. Aguardar 4 minutos antes da leitura.
13. Limpar cuidadosamente o fundo da placa e proceder à leitura da densidade óptica a 450/620 nm,
nos 30 minutos que se seguem à paragem da reacção.
c) Protocolo dos testes Anti-HBe e Ag HBe na mesma placa
Os protocolos são idênticos aos descritos anteriormente. Apenas a disposição na placa sofre
alterações.
• Teste Anti-HBe : Colunas 1 a 6
• Teste Ag HBe : Colunas 7 a 12
12 - CÁLCULOS E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
a) Teste Anti-HBe
1. Calcular a densidade óptica média dos controlos negativos : DO R3
Exemplo : Controlo Negativo R3
DO
1
1,607
2
1,410
3
1,552
Soma =
4,569
D.O. Média R3 = 4,569 / 3 = 1,523
É possível eliminar um valor de um controlo negativo se a sua DO se afastar mais de 25% da média.
Repetir então o cálculo da média com os outros dois valores.
2. Cálculo do valor cut-off
Para cada placa, o valor cut-off é igual a :
Valor cut-off = VS = DO R3 x 0,4
Exemplo :
DO R3 = 1,523
VS
= 1,523 x 0,4 = 0,609
3. Validação do teste anti-HBe
DO R3 > 0,900
DO R4 < 0,150
4. Cálculo das razões
Para cada amostra, calcular a razão:
Razão = DO amostra/V. cut-off
5. Interpretação dos resultados
Todas as amostras cuja razão seja inferior ou igual a 0,9 são consideradas como positivas (razão ≤ 0,9).
Todas as amostras cuja razão seja superior a 1,1 são consideradas como negativas (razão > 1,1).
Para as razões compreendidos entre 0,9 e 1,1 (0,9 < razão ≤ 1,1), recomenda-se repetir o teste anti
HBe numa amostra posterior.
Aconselha-se repetir o teste nas amostras positivas em duplicado. Se, após a repetição do teste,
pelo menos um dos dois valores for positivo, a amostra é considerada como positiva.
52
b) Teste Ag HBe
1. Calcular a densidade óptica média dos controlos negativos : DO R3
Exemplo : Controlo Negativo R3
DO
1
10,023
2
0,022
3
0,026
Soma =
0,071
D.O. Média R3 = 0,071 / 3 = 0,024
É possível eliminar um valor de um controlo negativo quando a sua DO se afastar mais de 25 % da
média.
Repetir então o cálculo da média nos outros dois valores.
2. Cálculo do valor cut-off
Para cada placa, o valor cut-off é igual a :
Valor cut-off = VS = DO R3 + 0,025
Exemplo :
DO R3
= 0,024
Incremento = 0,025
VS
= 0,024 + 0,025 = 0,049
3. Validação do teste Ag HBe
DO R3 < 0,060
DO R5 > 0,800
4. Cálculo das razões
Para cada amostra, calcular a razão :
DO amostra
Razão = ----------------VS
5. Interpretação dos resultados
Todas as amostras cuja razão seja inferior a 1 são consideradas como negativas (razão < 1).
Todas as amostras cuja razão seja superior ou igual a 1 são consideradas como positivas (razão ≥ 1).
Aconselha-se repetir o teste nas amostras positivas em duplicado. Se, após a repetição do teste,
pelo menos um dos 2 valores for positivo, a amostra é considerada como positiva.
13 - VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTICA DOS DEPÓSITOS DOS REAGENTES
TESTE ANTI-HBe
VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E CONTROLOS
A presença das amostras e dos controlos nos poços pode ser verificada por leitura fotométrica a
490 nm.
A DO deve ser superior a 0,050
Visualmente, uma nítida diferença de coloração pode ser observada entre um poço vazio
transparente e o que contém uma amostra (amarelo claro).
VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DE AG DE NEUTRALIZAÇÃO (R6)
A presença de R6 nos poços pode ser verificada por leitura fotométrica a 490nm com um cálculo de
delta de DO.
Delta de DO = (DO a 490nm do poço em presença da amostra (ou do controlo) e do antigénio
neutralizante R6) – (DO a 490 nm do poço em presença unicamente da amostra (ou do controlo).
A diferença de DO deve ser superior a 0,150
Visualmente, uma coloração rosa pode ser observada após adição do R6.
VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DO CONJUGADO (R7a)
A presença do conjugado pode ser verificada por leitura fotométrica a 620 nm.
A DO deve estar compreendida entre 0,070 e 0,200 (0,070 ≤ DO ≤ 0,200)
Visualmente, uma coloração violeta pode ser observada após adição de R7a.
VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DA SOLUÇÃO DE REVELAÇÃO (R8 + R9)
A presença da solução de revelação pode ser verificada por leitura fotométrica a 490 nm.
A DO deve ser superior a 0,100.
Visualmente, uma coloração rosa pode ser observada após adição da solução de revelação.
53
TESTE HBe Ag
VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E CONTROLOS
A presença das amostras e dos controlos nos poços pode ser verificada por leitura fotométrica a
490 nm. A DO deve ser superior a 0,050
Visualmente, uma nítida diferença de coloração pode ser observada entre um poço vazio
transparente e um que contenha uma amostra (amarelo claro).
VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DO CONJUGADO (R7b)
A presença do conjugado pode ser verificada por leitura fotométrica a 620 nm.
A DO deve ser superior a 0,210
Visualmente, uma coloração azul turquesa pode ser observada após adição de R7b.
VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DA SOLUÇÃO DE REVELAÇÃO (R8 + R9)
A presença da solução de revelação pode ser verificada por leitura fotométrica a 490 nm.
A DO deve ser superior a 0,100.
Visualmente, uma coloração rosa pode ser observada após adição da solução de revelação.
14 - DESEMPENHOS
Os desempenhos do teste MONOLISA HBe Ag/Ab PLUS a seguir resumidos foram avaliados em
2 locais, utilizando amostras de dadores de sangue, de doentes hospitalizados e de painéis
comerciais.
Além disso, a sensibilidade analítica foi avaliada por meio da norma PEI.
HBe Ag
Especificidade
A especificidade estudada numa população de 200 dadores de sangue foi encontrada a 100%
[98,51 – 100%], (IC95).
Além disso, a especificidade foi igualmente avaliada em amostras de doentes hospitalizados e
encontrada a 100 % [99,28 – 100%] IC 95 (416/416).
Foram testadas 195 amostras caracterizadas por diferentes patologias não relacionadas com a
Hepatite B (infecções virais e bacterianas, amostras positivas em factores reumatóides, autoanticorpos, ou anti ratinho, amostras de mielomas, de mulheres grávidas).
A especificidade desta população era de 99,49% [97,18 – 99,99%] (IC 95), ou seja, 194/195
amostras foram comprovadas como negativas.
1 amostra de mieloma foi comprovada como discordante.
Sensibilidade analítica
O limiar de sensibilidade avaliado por meio da Norma PEI foi encontrado a 0,64 IU /ml [0,49 – 0,84]
(IC 95%).
Sensibilidade clínica
A sensibilidade foi testada em 203 amostras provenientes de doentes com hepatites crónicas,
painéis comerciais e de seroconversões. A sensibilidade no conjunto destas amostras é de 99,51%
[97,29 – 99,99%] (IC95), ou seja, 202/203 amostras.
Precisão
A precisão do teste Monolisa™ HBe Ag/Ab Plus (HBe Ag) foi determinada por meio de 4 amostras :
1 negativa, 1 positiva fraca, 1 positiva média, 1 positiva forte em HBe Ag.
O estudo intra ensaio foi estudado testando 30 vezes cada amostra durante um mesmo ensaio.
O estudo inter ensaios foi realizado testando cada amostra em duplicado durante 20 dias, à razão
de 2 testes por dia.
Os resultados são os seguintes :
Quadro 1 : Intra ensaio
n = 30
Média das razões
Desvio padrão
CV (%)
54
amostra 1
0,356
0,05
14,20
amostra 2
5,29
0,35
6,53
amostra 3
27,24
0,63
2,31
amostra 4
45,56
2,88
6,33
Quadro 2 : Inter ensaio
n = 80
Média das razões
Desvio padrão
CV (%)
amostra 1
0,51
0,12
23,86
amostra 2
8,19
1,17
14,27
amostra 3
27,33
3,26
11,92
amostra 4
46,35
4,98
10,74
HBe Ac
Especificidade
A especificidade estudada numa população de 200 dadores de sangue foi calculada em 100%
[98,51 – 100%], (IC95).
Além disso, a especificidade foi igualmente avaliada em 206 amostras de doentes hospitalizados e
calculada em 98.54% [95,80 – 99,70%] IC 95 (203/206).
Foram testadas 198 amostras caracterizadas por diferentes patologias não relacionadas com a
Hepatite B (infecções virais e bacterianas, amostras positivas em factores reumatóides, autoanticorpos, ou anti ratinho, amostras de mielomas, de mulheres grávidas).
3 amostras foram comprovadas positivas (2 amostras HCV e 1 amostra Factor reumatóide).
A especificidade nesta população era de 98,48% [95,64- 99,69%] (IC 95), isto é, 195/198 amostras
comprovadas negativas.
Estas amostras foram submetidas à repetição dos testes; a amostra factor reumatóide foi
comprovada positiva; as 2 amostras HCV foram ou negativas ou duvidosas.
Sensibilidade clínica
A sensibilidade foi testada em 220 amostras provenientes de doentes com hepatites crónicas e de
painéis comerciais. A sensibilidade nestas amostras é de 98,64% [96,07 – 99,72 %] (IC95) ou seja,
217/220 amostras.
Precisão
A precisão de Monolisa™ HBe Ag/Ab Plus (HBe Ac) foi determinada por meio de 4 amostras :
1 negativa, 1 positiva fraca, 1 positiva média, 1 positiva forte em HBe Ac.
O estudo intra ensaio foi efectuado testando 30 vezes cada amostra durante um mesmo ensaio.
O estudo inter ensaio foi realizado testando cada amostra em duplicado durante 20 dias, à razão de
2 testes por dia.
Os resultados são os seguintes :
Quadro 1 : Intra ensaio
n = 30
Média das razões
Desvio padrão
CV (%)
amostra 1
3,15
0,05
1,7 %
amostra 2
0,69
0,04
5,7 %
amostra 3
0,42
0,04
10,5 %
amostra 4
0,03
0,00
6,6 %
amostra 1
2,39
0,23
9,6 %
amostra 2
0,81
0,077
9,5 %
amostra 3
0,59
0,09
14,5 %
amostra 4
0,03
0,01
39,3 %
Quadro 2 : Inter ensaio
n = 80
Média das razões
Desvio padrão
CV (%)
15 - BIBLIOGRAFIA
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Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press., chap. 4: 47-76
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3-BRECHOT C.; (1987)
Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l’hépatite B en 1987. Encyclopédie
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4-THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C., (1986)
L’ADN du virus de l’hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison avec
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antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), 293-297
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Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of hepatitis B
surface antigen. J. of Immunol. 117 (1); 102 – 105
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(GB)
(FR)
(ES)
(IT)
(DE)
(PT)
(SE)
(DK)
(GR)
(PL)
(LT)
(HU)
(EE)
(SK)
(CZ)
-
CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro)
Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)
Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)
Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro)
CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik)
CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
CE ( 98/79/CE in vitro )
(GB)
(FR)
(ES)
(IT)
(DE)
(PT)
(SE)
(DK)
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(SK)
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-
For in vitro diagnostic use
Pour diagnostic in vitro
Para diagnóstico in vitro
Per uso diagnostico in vitro
In-vitro-Diagnostikum
Para uso em diagnóstico in vitro
In vitro-diagnostik
In vitro diagnose
in vitro (GB)
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(ES)
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(SE)
(DK)
(GR)
(PL)
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(SK)
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-
Manufacturer
Fabricant
Fabricante
Produttore
Hersteller
Fabricante
Tillverkad av
Fremstillet af
(GB)
(FR)
(ES)
(IT)
(DE)
(PT)
(SE)
(DK)
(GR)
(PL)
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(CZ)
-
Batch code
Code du lot
Código de lote
Codice del lotto
Chargen-Bezeichnung
Código do lote
Batchnr
Batchkoden
CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro)
CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų)
CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről)
CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta)
CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy)
CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro)
(NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk)
(RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro)
(BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия)
IVD
Do stosowania in vitro
in vitro diagnostikai
Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra
In vitro diagnostiliseks kasutamiseks
Na diagnostiku in vitro
Pro diagnostiku in vitro
(NO) - Til in vitro-diagnostikk
(RO) - Pentru diagnostic in vitro
(BG) - За ин витро диагностика
Producent
Gamintojas
Gyártó
Tootja
Výrobca
Výrobce
(NO) - Produsent
(RO) - Producător
(BG) - Производител
Numer serii
Serijos numeris
Gyártási szám
Partii kood
Číslo šarže
Číslo šarže
(NO) - Partikode
(RO) - Număr de lot
(BG) - Партиден номер
(GB)
(FR)
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(IT)
(DE)
(PT)
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(HU)
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(SK)
(CZ)
- Catalogue number
- Référence catalogue
- Número de catálogo
- Numero di catalogo
- Bestellnummer
- Número de catálogo
- Katalognummer
- Katalognummer
- - Numer katalogu
- Katalogo numeris
- Cikkszám
- Katalooginumber
- Katalógové číslo
- Katalogové číslo
(GB)
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-
Authorised Representative
Représentant agréé
Representante autorizado
Distributore autorizzato
Bevollmächtigter
Representante Autorizado
Auktoriserad representant
Autoriseret repræsentant
(GB)
(FR)
(ES)
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(DK)
(GR)
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(SK)
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-
Expiry date YYYY/MM/DD
Date de peremption AAAA/MM/JJ
Estable hasta AAAA/MM/DD
Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG
Verwendbar bis JJJJ/MM/TT
Data de expiração AAAA/MM/DD
Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD
Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD
YYYY/MM/DD
(NO) - Katalognummer
(RO) - Număr de catalog
(BG) - Каталожен номер
Upoważniony Przedstawiciel
Įgaliotasis atstovas
Meghatalmazott Képviselő
Volitatud esindaja
Autorizovaný zástupca
Zplnomocněný zástupce
(NO) - Autorisert representant
(RO) - Reprezentant autorizat
(BG) - Упълномощен представител
Data ważności YYYY/MM/DD
Galioja iki YYYY/MM/DD
Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN
Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP
Použiteľné do RRRR/MM/DD
Datum exspirace RRRR/MM/DD
(NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD
(RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ
(BG) - Срок на годност година/месец/ден
(GB)
(FR)
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(IT)
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(DK)
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(HU)
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(SK)
(CZ)
- Storage temperature limitation
- Limites de températures de stockage
- Temperatura límite
- Limiti di temperatura di conservazione
- Lagertemperatur
- Limites de temperatura de armazenamento
- Temperaturbegränsning
- Temperaturbegrænsning
- - Temperatura przechowywania
- Saugojimo temperatūriniai apribojimai
- Tárolási hőmérsékleti határok
- Piirangud säilitustemperatuurile
- Skladovacia teplota od do
- Teplotní rozmezí od do
(NO) - Oppbevaringstemperatur
(RO) - Limitele de temperatură la stocare
(BG) - Температурни граници на съхранение
(GB)
(FR)
(ES)
(IT)
(DE)
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(SE)
(DK)
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(EE)
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- Consult Instruction for use
- Consulter le mode d'emploi
- Consulte las instrucciones de uso
- Consultare le istruzioni per uso
- Siehe Gebrauchsanweisung
- Consulte o folheto informativo
- Se bruksanvisningen
- Se instruktion før brug
- - Sprawdź instrukcję
- Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje
- Olvassa el a használati utasítást
- Kasutamisel vaata instruktsiooni
- Katalógové číslo
- Viz návod k použití
(NO) - Se bruksanvisninger
(RO) - Consultati prospectul de utilizare
(BG) - Виж инструкцията за употреба
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