DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – AMOSTRAS CLÍNICAS

WHO GLOBAL SALM-SURV
NÍVEL III
Capacitação Integrada
MINISTÉRIO DA SAÚDE
SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE
Coordenação de Vigilância das Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar
Coordenação Geral de Laboratórios de Saúde Pública
Laboratório de Referência Nacional de Cólera e outras Enteroinfecções Bacterianas
Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ
Instituto Adolfo Lutz
Campylobacter spp.:
Diagnóstico Laboratorial
Métodos clássicos e moleculares
Grace N.D. Theophilo & Miyoko Jakabi
2008
Gênero Campylobacter
Introdução
Embora várias espécies de Campylobacter estejam associadas à doença no
homem, as espécies C. jejuni, C. coli e C. lari são as mais frequentemente isoladas
em casos de gastrenterite humana. O microrganismo é transportado ao trato
intestinal dos animais de sangue quente e assim, contamina os alimentos de origem
animal. A espécie C. jejuni é reconhecida como a principal causadora de
gastrenterite bacteriana aguda e as demais com menor freqüência. Tendo em vista
que o gênero Campylobacter é conhecido como causador da doença diarréica
humana e os alimentos de origem animal têm sido associados com muitas destas
doenças, a presença de qualquer espécie de Campylobacter em alimentos,
representa um potencial risco para a saúde humana.
Histórico
O gênero Campylobacter foi proposto, em 1963, quando incluía 2 espécies,
Campylobacter fetus e C. bubulus. Esta classificação tem sido revisada,
especialmente pela diversidade ecológica, importância clínica e como resultado da
aplicação de novos métodos taxonômicos.
O reconhecimento de certas espécies do gênero Campylobacter como
patógenos para o homem, nestes últimos 20 anos, reforçou a importância deste
gênero na medicina veterinária. Algumas espécies são consideradas zoonoses
importantes tais como o C. jejuni, o C. coli e o C. fetus subsp. fetus os quais
resultaram em estudos dirigidos para a taxonomia, epidemiologia, biologia molecular
e patogenia. Estudos recentes em modelos animais têm ajudado a elucidar, os
mecanismos patogênicos desses agentes, especialmente quanto aos fatores de
virulência. A descoberta de novos campilos ou campylo-like-organisms (CLO)
relacionados com a saúde dos hospedeiros e a aplicação de novas técnicas
moleculares permitiu a reclassificação das espécies pela biologia molecular.
No sistema atual de classificação, a família Campylobacteriaceae é
constituída
pelos
gêneros
Arcobacter,
Dehalospirillum,
Campylobacter, este com 18 espécies e muitas subespécies:
Sulfurospirillum
e
- Campylobacter canadensis
- Campylobacter coli
- Campylobacter concisus
- Campylobacter curvus
- Campylobacter fetus
Campylobacter fetus subsp. fetus
Campylobacter fetus subsp. venerealis
- Campylobacter gracilis
- Campylobacter helveticus
- Campylobacter hominis
- Campylobacter hyointestinalis
Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis
Campylobacter hyointestinalis subsp. lawsonii
- Campylobacter insulaenigrae
- Campylobacter jejuni
Campylobacter jejuni subsp. doylei
Campylobacter jejuni subsp. jejuni
- Campylobacter lanienae
- Campylobacter lari
- Campylobacter mucosalis
- Campylobacter rectus
- Campylobacter showae
- Campylobacter sputorum
Campylobacter sputorum subsp. bubulus
Campylobacter sputorum subsp. sputorum e
- Campylobacter upsaliensis.
Características Gerais
Embora várias espécies de Campylobacter estejam associadas às doenças,
as espécies C. jejuni, C. coli e C. lari são as espécies mais frequentemente isoladas
em casos de gastrenterite humana.
Entre as principais características do gênero destacam-se a forma de bacilos
curvos, espiralados, muito finos e compridos (0,2 a 0,5 nm de largura e 0,5 e 5nm de
comprimento). São Gram-negativos e móveis por um único flagelo polar que
apresenta de duas a três vezes o comprimento da célula. O flagelo é responsável
pelo seu movimento característico em forma de saca-rolha ou em vaivém. Em
culturas jovens é possível a observação da morfologia semelhante a uma asa de
gaivota. Não formam esporos, mas em culturas envelhecidas adquirem a forma
cocóide, correspondente a formas não cultiváveis. São quimiorganotróficos e não
fermentam e nem oxidam açúcares, obtendo energia a partir de aminoácidos ou de
componentes intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico.
A grande maioria é oxidase positivo e redutores de nitrato. As espécies C. coli
e C. lari são muito semelhantes e a diferenciação é feita através de testes
bioquímicos: o C. lari não é capaz de hidrolisar o indoxilacetato, mas cresce em
presença de 30 µg de ácido nalidíxico. C. jejuni subsp doylei diferencia-se do C.
jejuni subsp jejuni por não ser capaz de reduzir nitrato e nem crescer a 42ºC.
A característica mais marcante do gênero Campylobacter é a microaerofilia,
requerendo tensão baixa de oxigênio para sua multiplicação. O crescimento é inibido
quando a concentração de O2 é menor que 3% e maior que 15%, sendo 5% a
concentração ideal. Além disso, são também capnofílicos, ou seja, requerem cerca
de 10% de CO2 para sua multiplicação (Doyle & Jones, 1992).
As espécies C. jejuni, C. coli e C. lari são denominadas de campilobacteres
termofílicos, visto que crescem em uma faixa bastante estreita de temperatura, que
varia entre 30 e 47ºC, com um ótimo de 42ºC (Park, 2002).
Esses microrganismos são altamente sensíveis ao sal, sendo essa
sensibilidade variável em função da temperatura. Assim, não se multiplicam em
meios contendo 2% de NaCl, quando mantidos a 30ºC ou 35ºC. A 4ºC são sensíveis
a 1% de NaCl. São também bastantes sensíveis ao pH ácido, crescendo na faixa de
pH entre 5,5 - 8,0, com valor ótimo próximo do neutro (6,5-7,5).e à desidratação.
Epidemiologia
A campilobacteriose é uma zoonose de distribuição mundial. As espécies de
Campylobacter são organismos associados a animais de sangue quente, sendo
comensais do trato gastrintestinal de bovino, suíno, ovino, cachorro, gato, roedores
silvestres e domésticos, aves domésticas e pássaros. Foi demonstrado que um
grande porcentual dos animais de corte contém este organismo nas fezes. As aves
constituem o principal reservatório de C. jejuni, sendo possível encontrar em fezes e
carcaças
de
aves
recém
abatidas.
Apesar
de
serem
portadoras
desse
microrganismo, não apresentam sinais clínicos da enfermidade. O suíno é o principal
portador de C. coli, podendo ter C. jejuni como comensal habitual. Muitos casos de
enterite humana estão associados ao consumo de água e alimentos de origem
animal, contaminados ou resultantes do contato com animais.
Em países desenvolvidos, a diarréia por Campylobacter é mais freqüente nos
meses quentes, onde são afetados todos os grupos étnicos de ambos os sexos,
sendo a carne de ave mal cozida o principal veículo. Em países em
desenvolvimento, a enfermidade parece ser mais freqüente em crianças pequenas.
C. jejuni e C. coli são agentes causais importantes de diarréias agudas de viajantes
que visitam regiões em desenvolvimento.
Clinicamente, o gênero Campylobacter tem sido reconhecido como agente de
enterocolite humana transmitida por alimentos em diversas partes do mundo. Duas
espécies deste gênero, C. jejuni e C. coli são isoladas na maioria dos casos de
infecções por Campylobacter, com proporções diversas em cada país.
Nos Estados Unidos, acredita-se que seja mais freqüente que Salmonella e
Shigella juntos. Muitas investigações clínicas e epidemiológicas têm estabelecido
que C.jejuni é uma das causas mais comuns de enterite bacteriana esporádica neste
país, alcançando cerca de 2,4 milhões de casos anualmente, segundo o CDC. Na
Inglaterra, a freqüência estimada é semelhante à de Salmonella, estimando-se um
número de casos semelhante ao dos Estados Unidos.
No Brasil, tem-se demonstrado que C. jejuni é também importante agente de
gastrenterite aguda e crônica, afetando principalmente crianças. Nos países em
desenvolvimento, a enterocolite é endêmica e a freqüência de casos assintomáticos
é elevada. Os quadros sintomáticos são mais comuns na infância e início da
adolescência, decrescendo com a idade.
As infecções por Campylobacter são usualmente esporádicas, ocorrendo nos
meses de verão e início do outono, causadas pela ingestão de alimentos cozidos e
manipulados inapropriadamente, com maior incidência no consumo de frangos. A
incidência de infecção segue uma distribuição bimodal, com elevado índice em
bebês e crianças jovens, seguida de um segundo pico de adultos jovens, entre 20 e
40 anos. Os surtos normalmente acontecem nos meses de primavera e outono e
nos últimos anos estes têm sido associados à ingestão de água e alimentos
contaminados.
Patogenia e Fatores de Virulência
Campilobacterioses são infecções agudas que acometem homens e animais
causadas por algumas espécies do gênero Campylobacter. Estas infecções podem
resultar em doenças diarréicas de severidade variável. A transmissão dos animais às
pessoas tem sido conhecida para as espécies C. jejuni, C. coli, C. lari e C.
upsaliensis. A espécie C. fetus subespécie venerealis causa aborto enzoótico em
gado bovino, enquanto o C. fetus subsp. fetus causa a mesma doença em ovinos,
ocasionalmente em suínos e, esporadicamente em bovinos.
O microrganismo é adquirido pela ingestão de alimentos contaminados ou por
contato com fezes de animais infectados. A espécie C. jejuni é sensível ao pH
gástrico, devendo ser ingerido um inóculo de 104 para que haja infecção, entretanto,
em alguns casos, doses da ordem de 500 microrganismos são capazes de causar
infecção (Robinson, 1981; Black et al., 1988 ).
A espécie C. upsaliensis raramente é isolada de diarréia, entretanto, causa
bacteremia em pacientes imunocomprometidos. São mais resistentes ao poder
bactericida do soro que as outras espécies termotolerantes. A fonte de infecção
ainda não está bem estabelecida, embora animais, em especial os cachorros, e
alimentos como leite não pasteurizado e seus derivados já foram relacionados como
veículos dessa bactéria. À semelhança de outros patógenos entéricos, a
transmissão fecal-oral e de pessoa a pessoa são importantes vias de transmissão.
Embora os microrganismos não se multipliquem à temperatura ambiente, uma
pequena dose infecciosa (500 células) pode facilmente causar uma contaminação
cruzada entre carnes cruas e processadas. Esta é uma possível causa para o fato
de campilobacteriose ser mais freqüente que a salmonelose em muitos países.
Os sintomas de infecção por Campylobacter incluem dor abdominal aguda,
diarréia (que pode ser aquosa ou conter sangue), náusea, dor de cabeça, dor
muscular e febre. A diarréia se inicia geralmente após 24 horas do início dos
sintomas. O período de infecção é de 1 a 7 dias, afetando tanto o intestino delgado
como o grosso. A doença é autolimitante. A infecção por Campylobacter depende
dos fatores do hospedeiro e do patógeno. O microrganismo é excretado nas fezes
durante várias semanas após terem sido cessados os sintomas.
A enfermidade varia desde uma forma branda de curta duração a um quadro
mais severo e prolongado com características semelhantes a shigelose ou
salmonelose. Algumas vezes a infecção pode mimetizar um quadro de apendicite
aguda e resultar em cirurgia desnecessária. Mortes causadas pela infecção com C.
jejuni são raras, mas quando ocorrem atingem principalmente crianças, idosos ou
pacientes portadores de doenças de base (Tauxe, 1992).
A diarréia em neonatos pode apresentar-se sanguinolenta e sem nenhum
outro sintoma. Também pode desenvolver febre severa e persistente necessitando
diferenciar de febre tifóide.
Pacientes imunocomprometidos podem evoluir para colicistite aguda,
pancreatite, cistite, artrite reativa e outras complicações como síndrome de urêmico
hemolítico, nefrite intersticial, hepatite e síndrome de Guillén-Barré (GBS).
Atualmente, Campylobacter é conhecido como principal microrganismo associado
com GBS. A GBS é um distúrbio auto-imune do sistema nervoso periférico (fraqueza
muscular normalmente simétrica e ascendente), podendo ser confundida com
botulismo.
Infecções extra-intestinais podem ocorrer em pacientes HIV positivos e
imunocomprometidos, podendo causar bacteremia, bursite, artrite, infecções no trato
urinário, endocardite, peritonite, aborto e septicemia neonatal.
Estudos epidemiológicos realizados tanto em países desenvolvidos como em
desenvolvimento sugerem a existência de cepas com diferentes graus de
patogenicidade e distintas respostas dos afetados pela bactéria.
Sintomatologias clínicas variadas indicam a existência de diferentes
mecanismos de virulência entre as cepas de distintas regiões geográficas. O C.
jejuni é considerado mais virulento devido a sua resistência à fagocitose, seguido de
C. coli que é mais benigna.
Muitas cepas podem invadir as células epiteliais, causando inflamações na
própria lâmina e abscessos nas criptas semelhantes às produzidas por Shigella,
aparecendo hemácias e leucócitos nas fezes (diarréia inflamatória e disenteria).
Podem atravessar a mucosa intestinal e proliferar na lâmina própria e gânglios,
semelhante à infecção por Salmonella (infecções extraintestinais), embora a ação do
soro iniba a bacteremia na maioria dos casos.
Algumas cepas produzem toxinas termolábeis muito semelhantes à do Vibrio
cholerae e Escherichia coli enteropatogênica (ETEC), que estimula a adenilciclase,
provocando acúmulo de AMP cíclico responsável por alterações nos processos
secretórios e absortivos da mucosa intestinal.
Cepas de Campylobacter são capazes de produzir toxina citoletal distendida
(CLDT) e tem sido a toxina mais estudada por causar aumento e distenção de
células. São inativadas por aquecimento a 70ºC, por 15 minutos e por tripsina.
Foi demonstrada a existência de plasmídeos em células de C. jejuni, embora
o seu papel e função na doença ainda não estejam esclarecidos.
Estudos experimentais, em camundongos e pintos, indicaram que C. jejuni
localizam-se nas criptas contendo muco, onde se realiza a colonização, sem
aderência às células epiteliais das microvilosidades (Lee et al., 1986). A grande
motilidade e a forma espiralada facilitam a colonização do muco. O C. jejuni é
atraído quimiotaxicamente pela mucina, podendo utilizá-la como substrato para
crescimento. Experimentalmente, a colonização das criptas cecais pelo C. jejuni é
diminuída ou impedida pela colonização de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae
e Citrobacter diversus que ocupam os mesmo nichos ecológicos, produzindo
metabólitos antagonistas do C. jejuni.
O tratamento com antibióticos é recomendado somente para as formas mais
severas, sendo dispensado nos casos brandos. As espécies C. jejuni e C. coli são
sensíveis a uma variedade de agentes antimicrobianos, inclusive macrolídeos,
fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, cloranfenicol e tetraciclina. A eritromicina tem
sido a droga de escolha para o tratamento de C. jejuni nas infecções do trato
gastrointestinal e a ciprofloxacina é uma boa droga alternativa. A terapia inicial das
infecções por Campylobacter com eritromicina ou ciprofloxacina é efetiva na
eliminação do organismo pelas fezes e pode também reduzir a duração dos
sintomas associados à infecção (Blaser, 1995).
C. jejuni geralmente é susceptível a eritromicina com taxas de resistência
menor que 5%. Contudo, em C. coli este percentual é variável e alguns estudos
relatam resistência de mais de 80% de algumas cepas. Embora a ciprofloxacina seja
efetiva
no
tratamento
de
infecções
por
Campylobacter,
a
resistência
fluoroquinolonas durante o tratamento tem sido documentada. Alguns estudos “in
a
vitro” sugerem que o aumento da resistência a esta classe de antimicrobianos está
associado ao uso de antibióticos em aves, o que acarretaria na diminuição da
efetividade destas drogas no futuro (Velásquez et al., 1995).
PRINCIPAIS ESPÉCIES ASSOCIADAS ÀS INFECÇÕES
Campylobacter fetus
O C. fetus subespécie fetus é primariamente associado com bacteremia e
infecções extraintestinais em pacientes com doenças de base, sendo também
associado com aborto séptico, artrite séptica, abscessos, meningites, endocardites,
aneurismas, trombo- flebites e peritonites. Embora a gastrenterite possa ocorrer com
essas espécies, à incidência é, provavelmente, subestimada porque esta espécie
não cresce bem a 42ºC e apresenta sensibilidade a cefalotina, antimicrobiano usado
em alguns meios seletivos comuns para a cultura de fezes.
C. fetus subespécie venerealis raramente tem sido isolado de infecções
humanas, sendo o agente causador de campilobacteriose venérea em bovinos,
determinando infertilidade. A diferença entre as subespécies é a capacidade de
crescimento do C. fetus fetus em meio de glicina a 1%.
Campylobacter hyointestinalis
Anteriormente, esta espécie somente era isolada de animais, sendo o agente
causador de doenças como ileíte em porcos. Atualmente, tem sido recuperada de
swabs retais de homens homossexuais com proctite. Apresentam reações
bioquímicas similares a C. fetus fetus, diferenciando pelo seu crescimento a 42ºC e
produção de H2S em TSI.
Campylobacter consisus e Campylobacter rectus
O C. consisus está associado primariamente a doenças periodontais e
também tem sido isolado de pacientes com bacteremia. Seu papel em doenças
diarréicas ainda não está bem estabelecido e alguns estudos sugerem que o
microrganismo não é patogênico ao homem (Engberg et al., 2000; Goossens et al.,
1990; Steele & Owen, 1988; Van Etterijck et al., 1996).
O C.rectus é primariamente isolado de pacientes com infecções periodontais ativas,
mas também tem sido isolado de pacientes com infecções pulmonares (Rams et al.,
1993).
Campylobacter upsaliensis
É uma espécie termotolerante que raramente é isolada de diarréias e produz
bacteremia em pacientes imunocomprometidos. São mais resistentes ao poder
bactericida do soro que as outras espécies termófilas, razão pela qual podem
sobreviver no sangue. A sua fonte de infecção ainda não se encontra bem
estabelecida, mas parece estar relacionada ao convívio com animais, especialmente
cães e consumo de leite não pasteurizado e seus derivados.
Campylobacter jejuni e Campylobacter coli
C. jejuni subespécie jejuni é o agente causal de diarréias, sendo considerado
o mais virulento devido a sua maior resistência a fagocitose.
C. jejuni subespécie doylei diferencia-se da subespécie jejuni pela sua
incapacidade de reduzir nitrato a nitrito e não crescer a temperatura de 42ºC, sendo
raramente recuperado de pacientes com infecções gastrentestinais.
C. coli produz uma diarréia mais branda do que o C. jejuni. Ambos encontramse como comensais do trato intestinal de um amplo grupo de animais,
principalmente todas as variedades de aves de criação devido a sua adaptação à
temperatura de 42-43ºC.
O espectro da doença provocada por estas espécies pode variar desde casos
assintomáticos àqueles mais severos. As infecções sintomáticas normalmente são
auto-limitantes, porém as recaídas podem ocorrer em 5 a 10% dos pacientes não
tratados. Infecções por Campylobacter podem mimetizar uma apendicite aguda
ocasionando cirurgias desnecessárias.
Infecções extra-intestinais têm sido descritas seguidas de enterites e incluem
bacteremia, hepatite, colecistite, pancreatite, aborto, sepse neonatal, síndrome
urêmica hemolítica, nefrite, prostatite, infecções do trato urinário, peritonite,
miocardite, artrite séptica e formação de abscessos (Skirrow & Blaser, 2000).
Bacteremia tem sido relatada numa taxa de 1,5/1000 casos de infecções intestinais
com maior incidência nos idosos (Skirrow et al., 1993). A doença diarréica
persistente e bacteremia podem ocorrer em hospedeiros imunocomprometidos bem
como em pacientes portadores do HIV.
Campylobacter lari
Esta espécie tem sido isolada do intestino de gaivotas e outros animais assim
como do homem, porém sua patogenicidade humana ainda não foi totalmente
elucidada. Diferencia-se das demais espécies pela reação negativa na prova do
indoxil acetato e pela sua resistência natural ao ácido nalidíxico.
CONTROLE
Os animais e aves utilizados como alimentos são sujeitos a contaminações
por uma grande variedade de microrganismos patogênicos, incluindo o gênero
Campylobacter. Por esta razão o controle do mesmo deve ser realizado em toda a
cadeia produtiva até a mesa do consumidor.
Práticas simples no local de produção podem reduzir o patógeno, como por
exemplo, o fornecimento de água clorada para as aves que tem se mostrado efetivo.
O transporte das aves para o abatedouro é outra etapa que envolve risco de
infecção entre os animais. Os riscos podem ser diminuídos pela estrita atenção a
higiene (veículos e gaiolas devem ser limpas e sanitizadas) e redução do stress dos
animais durante o transporte.
A contaminação pode ocorrer no abate devido a processos inadequados
durante a evisceração, depenagem e resfriamento. A separação de operações
(áreas sujas e limpas) e boas práticas de processamento contribuem na minimização
das contaminações. Além disso, tratamentos químicos e físicos têm sido
empregados no processamento. A sanitização de carnes de aves pode ser realizada
utilizando-se o cloro, ácido acético e ácido lático. A radiação ionizante com aplicação
de dose de 3,0 KGy tem sido proposta
para o controle desse patógeno nas
carcaças de frango.
Embora a aplicação de boas práticas de produção e processamento minimize
a contaminação de carcaças de frangos, a educação e conscientização dos
consumidores na manipulação correta desses produtos são de fundamental
importância no controle e prevenção de doenças causadas por este patógeno.
Falhas durante o transporte, armazenamento e manipulação (cocção
inadequada e contaminação cruzada) podem favorecer a multiplicação do patógeno
e, conseqüentemente, a ocorrência de surtos.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – AMOSTRAS DE ORIGEM ALIMENTAR
As técnicas de isolamento de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli em
alimentos necessitam de meios de enriquecimento para recuperação das células
lesadas metabolicamente. Os alimentos a serem analisados podem estar altamente
contaminados com flora competitiva tornando difícil o isolamento de Campylobacter.
Além disso, o número do microrganismo pode estar presente em quantidade baixa
ou as células podem estar injuriadas como conseqüência das condições ambientais,
de armazenamento e processamento (aquecimento, dessecação, congelamento e
acidificação).
Em geral, são incorporados antibióticos nos meios de cultura como agentes
seletivos entre os quais temos: trimetroprima, vancomicina, anfotericina, cefalotina,
polimixina
B,
actidiona,
colistina
e
rifampicina.
São
adicionados
também
suplementos como: sulfato ferroso, metabissulfito de sódio, piruvato de sódio
(suplemento FBP), cisteina, hematina, sangue de cavalo e extrato de levedura.
Alimentos congelados ou refrigerados devem ser pré-incubados por pelo
menos 6 horas a 37ºC em microaerofilia, evitando-se os meios que contenham
polimixina ou rifampicina, uma vez que células submetidas ao frio sofrem alterações
tornando-se sensíveis a temperatura de 42ºC e a esses antibióticos.
PREPARO DAS AMOSTRAS
As amostras embaladas podem ser conservadas refrigeradas e protegidas do
ar por uma a três semanas. Uma vez aberta a embalagem, a amostra deve ser
analisada, pois a introdução do oxigênio provoca dano celular.
Enriquecimento seletivo
1. Carnes bovina, suína ou aves
Alíquotas de 25g da amostra são homogeneizadas em 100 mL de caldo de
enriquecimento seletivo. Incubação a 42ºC/48 horas em atmosfera de microaerofilia.
Para carcaças, podem ser utilizadas enxaguadura (carcaças de 1 a 2 kg enxágüe
com 100 a 400 mL de água peptonada tamponada, retirar 25 mL e colocar em 25 mL
de meio de enriquecimento em concentração dupla), ou swab de superfície.
2. Alimentos congelados
Park & Sanders desenvolveram um método de enriquecimento seletivo com
uma etapa de reparação de células injuriadas, recomendado pelos autores para
frangos congelados. A preparação da amostra deve ser efetuada conforme
procedimento
descrito
no
item
anterior,
empregando
para
tal
caldo
de
enriquecimento isenta de agentes seletivos. As amostras colhidas devem ser
submetidas à incubação inicial de 31-32º/3-4 horas em atmosfera de microaerofilia,
sem agitação seguindo-se a adição da cefoperazona (32 mg/L) e da cicloheximida
(100 mg/L). Incubação em microaerofilia a 35-37ºC/2 horas, sem agitação e em
seguida incuba-se a 42ºC/40-42 horas sob agitação.
3. Alimentos líquidos com exceção da água
Centrifugar 250 mL da amostra a 16.000 x g durante 20 minutos a 4ºC.
Descartar a gordura e o sobrenadante. Suspender o pellet em 2-5 mL de caldo de
enriquecimento. Proceder conforme metodologia descrita no item 1.
4. Água
Para isolamento da bactéria em amostras de água é necessário filtrar um grande
volume de água (1 a 4 litros) em membrana filtrante. Colocar a membrana em um
meio de enriquecimento seletivo. Incubar durante 24-48 horas a 42°C em
microaerofilia. Semear em ágar seletivo. Se a água for clorada, adicionar 5 mL de
tiossulfato de sódio 1M por litro, no momento da coleta. Para água do mar ou com
alto teor de sal, lavar o filtrado com 100-1000 mL de tampão fosfato estéril.
Campylobacter é sensível a altas concentrações de sal. Para isolar esse
microrganismo de rios, o uso de mecha de Moore também é recomendável.
Semeadura em meios sólidos diferenciais
A partir do caldo de enriquecimento, estriar uma alçada em placa de ágar
Blaser (Campy-BAP) e uma alçada em uma placa de ágar Campylobacter Charcoal
Diferencial (CCDA). Opcionalmente, podem ser utilizados o ágar Skirrow e o ágar
Butzler em substituição ao CCDA ou Campy-BAP. Acondicionar as placas em jarra
com atmosfera de microaerofilia e incubar a 42ºC/48 horas.
Confirmação
Selecionar as colônias típicas (1 a 3) de cada placa para os testes de
confirmação. As colônias de Campylobacter nos diversos meios são semelhantes,
podendo ser lisas, convexas e brilhantes, com bordas perfeitas, ou planas,
translúcidas e lustrosas, com bordas irregulares e espalhadas. Geralmente são
incolores, com tonalidades creme ou acinzentadas, cujo diâmetro das colônias varia
de 1-2 mm, podendo ainda se apresentar de puntiformes a 4-5 mm. Nos meios com
sangue (ágar segundo Blaser, Skirrow ou Butzler), não apresentam hemólise.
Isolar as colônias em ágar sangue. Incubar a 42ºC/48 horas, em
microaerofilia. As colônias suspeitas são observadas no microscópio óptico após
realização de esfregaço corado com cristal violeta por 1 minuto. As células se
apresentam em forma de “V” ou asa de gaivota. Colônias que apresentam estas
características são submetidas ao teste de sensibilidade aos antibióticos: cefalotina
(30μg), embora possa existir cepas resistentes, e ácido nalidíxico
(30μg) e as
seguintes provas são realizadas para caracterização: catalase, oxidase, fermentação
da glicose, redução de nitrato, produção de H2S, hidrólise do hipurato.
Atmosfera de Incubação
Existem vários métodos para obtenção de atmosfera adequada para o
desenvolvimento desses microrganismos.
1- Substituição de uma atmosfera normal por uma mistura apropriada de gases:
retira-se o ar contido na jarra de anaerobiose com bomba de vácuo e efetua-se a
substituição por uma mistura contendo 85% de nitrogênio, 10% de dióxido de
carbono e 5% de oxigênio.
2- Utilização de geradores de gases comerciais especiais para Campylobacter:
BBL, Oxoid, Bio-Meriex e Probac, cuja atmosfera aproximada é de 5-10% de
oxigênio e 5-12% de dióxido de carbono.
3- Geradores de hidrogênio e oxigênio para anaerobiose: o qual é utilizado sem o
catalizador de paládio.
4- Geradores opcionais: Para jarra de 2,5 L de capacidade:
½ bombril embebido em solução de sulfato de cobre (num béquer) ou
½ Alka-Seltzer (numa placa) acrescida de Sol. Sulfato de cobre
Solução de sulfato de cobre
Sulfato de cobre anidro, 25g;
Água destilada, 500 mL;
H2SO4 , 1,6 g;
Tween80, 1,0 mL.
FLUXOGRAMA DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE CAMPYLOBACTER EM
ALIMENTOS
25g amostra + 100 mL caldo de
Enriquecimento seletivo
(Caldo Brucella* + FBP + antibióticos**)
42ºC/48h (microaerofilia)
Plaqueamento em ágar seletivo
Ágar seletivo + suplemento seletivo (Merck)
Ágar CCDA modificado (Oxoid)
42ºC/48h (microaerofilia)
Isolamento
Identificação bioquímica (2º Compendium)
*Substituído por TSB
30 g
Extrato de levedura
2g
Citrato de sódio
1g
**Suplemento seletivo da CEFAR (vancomicina, trimetropima, polimixina B,
cefalotina, anfotericina)
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – AMOSTRAS CLÍNICAS
O diagnóstico para a detecção do microrganismo pode ser realizado através
do exame direto ou cultivo.
O uso de métodos sorológicos para o diagnóstico em alguns casos somente
tem valor para pesquisa, já que os países em desenvolvimento podem apresentar
elevados títulos na população.
O exame direto consiste na utilização de microscópio de campo escuro ou
contraste de fase das amostras fecais, coletadas até 2 horas após sua evacuação,
permitindo um diagnóstico presuntivo rápido quando é observada a motilidade do
tipo saca-rolha ou vai e vem, em sua maioria acompanhada por eritrócitos e
neutrófilos.
Para o cultivo e isolamento a partir de material fecal é requerida uma
atmosfera de microaerofilia, meios de cultivo seletivos para inibir a flora
acompanhante, temperatura ótima de desenvolvimento (42-43ºC), ainda que possam
desenvolver a 37ºC, pH ótimo de crescimento (6,5-6,9).
Coleta e transporte de material
A coleta da amostra pode ser realizada utilizando swab retal ou por
evacuação espontânea, devendo ser processada o mais rápido possível, visto que o
gênero Campylobacter é extremamente sensível ao oxigênio. Em pacientes
hospitalizados o exame realizado em uma única amostra usualmente fornece
resultados positivos, entretanto caso ocorra intervalo entre a coleta e análise
laboratorial superior a duas horas é necessária à utilização de meios de transporte.
O meio de transporte também é sugerido quando a amostra é coletada por meio de
swabs retais ou quando as fezes “in natura” não podem ser processadas
imediatamente após a coleta.
Muitos meios de transporte têm sido descritos para Campylobacter, incluindo
Água Peptonada Alcalina com tioglicolato e cistina, meio de Stuart modificado e
meio de Cary & Blair. Entretanto, uma modificação do meio de Cary & Blair na qual é
empregada a concentração de 1,6 g/litro de Agar, vem demonstrando melhores
resultados para a recuperação de Campylobacter e de outros enteropatógenos.
As amostras recebidas em meio de Cary & Blair devem ser armazenadas a
4ºC se o processamento não for realizado imediatamente. O uso deste meio
suplementado com sangue desfibrinado de carneiro pode ser útil para um
armazenamento prolongado de amostras fecais e recuperação de C. jejuni.
Exame Microscópico Direto
As amostras fecais podem ser examinadas através de uma coloração simples
como Gram, utilizando carbol fucsina ou solução aquosa a 0.1% de fucsina como
corante para evidenciação do microrganismo e azul de metileno para identificar
leucócitos e formas bacilares curvas.
A observação em microscópio de contraste de fase ou de campo escuro de
bacilos curvos espiralados com grande motilidade em forma circular ou de saca
rolhas nos permite um diagnóstico presuntivo rápido.
Cultivo e Isolamento
1. Semeadura Direta
Alíquotas de fezes diarréicas ou do swab de transporte podem ser semeadas, em
duplicata, diretamente em placa de agar seletivo para Campylobacter, porém
normalmente se prepara uma suspensão em uma solução tampão (Solução Salina
ou Água Peptonada 0,1%) e se utiliza 2 a 3 gotas desta suspensão para a
semeadura. Não existe necessidade de se pesar as fezes com precisão, contudo é
indicado que a suspensão obedeça a proporção de 1/10 (p/v) para que se possa
detectar a presença do microrganismo. As placas deverão ser incubadas por 48
horas em microaerofilia, nas temperaturas de 37 e 42ºC.
2. Método de Filtração para a Detecção de Campylobacter em Fezes
Esta técnica foi desenvolvida por Steele & McDermott em 1984 e é baseada
na separação do Campylobacter da flora bacteriana acompanhante visto que os
coliformes ficam retidos na superfície da membrana de celulose (0,45 μm ou 0,66
μm) enquanto os campilobacters têm a capacidade de migrar pelos poros desta
membrana e se depositarem sobre a placa que atuará como substrato para o seu
crescimento. Este método é recomendado para o isolamento das espécies
emergentes como Campylobacter upsaliensis.
Procedimento:
Em uma placa de agar seletivo, aderir, com auxílio de uma pinça, o filtro de celulose
(0,45 μm) esterilizado, até que este fique aderido ao meio. Preparar uma suspensão
do material fecal em solução fisiológica e com auxílio de micropipeta, depositar 100
μl sobre a membrana, tendo cuidado para que a solução não derrame sobre o meio.
Deixar filtrar por 30 minutos, adicionar mais 100 μl e esperar mais 30 minutos.
Retirar a membrana (utilizando uma pinça), descartá-la e estriar o filtrado com alça.
Acondicionar as placas em jarras e incubar durante 24 a 48 h, podendo esperar até
4 ou 5 dias, em microaerofilia a 37ºC.
OBS: Se a amostra for proveniente de diarréia aquosa, não é necessário o preparo
da suspensão.
3. Enriquecimento
Alimentos e amostras ambientais usualmente contêm um baixo número de
células de Campylobacter. O uso de pré-enriquecimento no protocolo laboratorial
parece aumentar a recuperação deste microrganismo (Bolton et al., 1984), tendo
sido recomendado, geralmente para a análise de alimentos, água e outras amostras
ambientais.
O pré-enriquecimento usualmente começa com a restauração das células
danificadas
por
procedimentos
que
envolvam
a
secagem,
aquecimento,
congelamento e exposição ao oxigênio. O procedimento mais amplamente usado
consiste de uma incubação à 37ºC durante 4 horas (Humphrey, 1989; Bolton, 2000)
e em seguida a 42ºC. É necessário que o tempo de 4 horas seja limitante para
prevenir o crescimento exarcebado de contaminantes (Goosens & Bultzer, 1992).
Para amostras clínicas, alguns meios de enriquecimento vêm sendo apontados
para permitir mais facilmente a recuperação de Campylobacter em fezes, incluindo o
caldo Preston, caldo Bolton, o caldo de enriquecimento para Campylobacter (CEB) e
o caldo Park and Sanders. Estes são indicados para recuperar reduzido número de
células resultante de transporte inadequado, após o estágio agudo da infecção.
Entretanto, sua utilização como procedimento de rotina deve ser avaliada tendo em
vista que os resultados apontados na literatura indicam sua utilização em reduzido
número de amostras. No caso de material fecal proveniente de pacientes
previamente tratados com antibiótico, é necessário fazer uma etapa reconstituinte da
estrutura celular. Esta reconstituição deve ser realizada em meio contendo caldo
Brucella, succinato de sódio a 0,3%, cisteína (0,01%) e uma mistura de antibióticos
que não contenha antimicrobianos que exerçam efeito inibidor sobre as células
injuriadas, como é o caso da polimixina e da rifampicina. A incubação deve ser à
37ºC por um período de pelo menos 6 horas.
Caldo Preston
Bolton & Robertson (1982) acharam que o agar de Skirrow era
insuficientemente seletivo para a recuperação de células de Campylobacter oriundas
de amostras animais e ambientais e descreveram o meio Preston como uma
alternativa efetiva. O meio de Preston pode ser usado tanto como um caldo para
pré-enriquecimento ou como um agar para o isolamento seletivo de colônias. O meio
de Preston é baseado em um caldo nutriente que não possui extrato de levedura,
um conhecido antagonista do trimetoprim e inclui 5% (v/v) de sangue lisado de
cavalo e os antibióticos polimixina B, rifampicina (usada para suprimir o crescimento
de bactérias Gram-positivas), trimetoprim e cicloheximida. A incubação é feita em
atmosfera de microaerofilia a 42ºC.
Uma modificação à formulação original de Preston foi a inclusão do piruvato
de sódio, metabissulfito de sódio e sulfato ferroso (FBP). Esta inclusão permitiu a
incubação aeróbica e também a estocagem do caldo por até 7 dias a 4ºC.
Atualmente, a formulação do caldo de Preston, acrescido do suplemento FBP
parece ser o mais amplamente usado (Baylis et al., 2000). Os componentes do caldo
Preston estão disponíveis comercialmente e compreendem: caldo Preston
desidratado, suplemento FBP, suplemento de antibióticos, onde a cicloheximida tem
sido substituída pela anfotericina B e sangue de cavalo.
O protocolo para o pré-enriquecimento em caldo Preston usa incubação
aeróbica a 37ºC por 4 horas, seguida pela incubação a 42ºC por 48 horas (Baylis et
al., 2000).
Caldo Bolton
O caldo Bolton é recomendado nos protocolos produzidos pelo FDA-USA
(FDA BAM, 1998) para a recuperação de Campylobacter de uma grande variedade
de tipos de amostras. O meio básico e os suplementos estão disponíveis
comercialmente.
O caldo Bolton desidratado contém peptona e extrato de levedura, ácido alfacetoglutâmico, piruvato de sódio, metabissulfito de sódio, carbonato de sódio (serve
para fornecer dióxido de carbono durante o crescimento) e hemina, que foi incluída
para superar o antagonismo do trimetoprim ao extrato de levedura. O meio completo
também inclui 5% de sangue de cavalo e os antibióticos cefoperazona, vancomicina,
trimetoprim e cicloheximida.
O protocolo do FDA-USA (FDA BAM, 1998) especifica a necessidade de
atmosfera em microaerofilia para a incubação. Para a maioria das amostras, o
período de recuperação das células consiste de uma incubação a 37ºC durante 4
horas, sendo transferido em seguida para uma incubação a 42ºC durante 28-29 h
para a maioria dos tipos de amostras e 44h para produtos lácteos. Na análise de
mariscos, a primeira incubação é a 30ºC/3h, seguida por 37ºC/2h e, finalmente
42ºC/48h.
CEB – Campylobacter Enrichment Broth
Este caldo encontra-se também disponível comercialmente e possui a mesma
formulação do caldo Bolton, variando apenas na composição do suplemento de
antibióticos onde a natamicina substitui a cicloheximida.
OBS Î Caldos de pré-enriquecimento que contenham o suplemento FBP podem
ser incubados aerobicamente (em tubos ou frascos com espaço de cabeça < 1 cm)
por 4 horas a 37ºC para permitir a recuperação das células, seguida por outra
incubação de 20 a 44 horas à 42ºC (Baylis et al., 2000).
Caldo Park and Sanders
A formulação básica do caldo Park and Sanders é o caldo Brucella (Difco)
contendo peptonas, glicose, extrato de levedura, piruvato de sódio metabissulfito de
sódio. Antes da inoculação da amostra devem ser adicionados ao meio 5% de
sangue lavado de cavalo (v/v) e dois antibióticos, vancomicina e trimetoprim (ambos
na concentração de 10 mg/L). O período inicial de incubação é de 4 horas a 32ºC,
após o qual, dois outros antibióticos, cefoperazona (32 mg/L) e cicloheximida (100
mg/L), também são adicionados ao caldo que deve ser transferido para a
temperatura de 37ºC durante 4 horas. Decorrido o tempo, o caldo deverá ser
transferido novamente para a temperatura de 42ºC por 40-42 horas. Todas as três
etapas de incubação devem ser realizadas em atmosfera de microaerofilia (ISO,
1995). O uso deste meio é recomendado para amostras submetidas a tratamentos
que podem ocasionar algum tipo de estresse nas células, como o congelamento.
4. Semeadura em Agar Seletivo
Após o pré-enriquecimento, quando necessário, o isolamento é realizado através
de semeadura por estrias em placas de agar seletivo para Campylobacter, utilizando
swabs esterilizados. Na maioria dos protocolos, uma alçada do crescimento em
caldo é estriada na superfície da placa de agar seletivo, de forma a obter colônias
isoladas. Existe uma variedade de meios seletivos para Campylobacter.
Embora numerosas formulações de meios tenham sido descritas na literatura,
ressaltamos aqueles que tenham sido usados recente ou frequentemente:
- Meios que incluem sangue (usualmente 5-7% v/v) lavado de cavalo: Skirrow,
Campy-Cefex, Butzler (ou Butzler modificado), Preston and Exeter;
- Meios livres de sangue: Karmali ou mCCDA (Charcoal, Cefoperazone, Deoxicolato
Agar).
Composição dos Meios Seletivos
O desenvolvimento do meio de Skirrow foi a chave para o sucesso no estudo
de campilobacteres termotolerantes. Este meio contém peptonas como fonte de
nutrientes, sangue lavado de cavalo e antibióticos para prevenir o crescimento de
outros microrganismos. Estes ingredientes formam a base para a maioria dos meios
de uso comum no isolamento de Campylobacter (Post, 1995).
Todo meio para o isolamento de Campylobacter contém peptonas e
antibióticos; a maioria contém sangue e muitos incluem agentes que capturam o
oxigênio (superóxido e peróxido de hidrogênio) para superar seus efeitos tóxicos
nestas espécies.
Fonte de Nutrientes
Como Campylobacter não fermenta carboidratos, as peptonas são incluídas
no meio, como fonte de nutrientes. O caldo Preston (Bolton & Robertson, 1982) e o
Exeter (Martin et al., 1996) contêm extrato de carne e peptona. Os caldos Bolton e
CEB têm uma formulação que consiste de peptonas, extrato de levedura e um
intermediário do ciclo do ácido tricarboxílico, o ácido alfa-cetoglutárico.
Sangue
Muitos meios para Campylobacter contêm sangue (5 a 7% - v/v) para capturar
os componentes tóxicos do oxigênio que podem ser formados quando o meio é
exposto à luz. O sangue de cavalo tem-se mostrado mais eficaz.
Antibióticos
A inclusão de antibióticos no meio de isolamento é crucial para a recuperação
de Campylobacter. Esta espécie é resistente a alguns antibióticos incluindo a
vancomicina (inibe os cocos Gram-positivos), polimixina B (inibe a família
Enterobacteriaceae e Pseudomonas spp.), trimetoprim (inibe Proteus e cocos Grampositivos) e cefalosporinas (inibem Enterobacter spp., Yersinia enterocolítica,
Serratia spp. Pseudomonas aeruginosa e alguns Proteus spp.). A rifampicina foi
substituída por vancomicina no meio Preston, contudo estudos realizados por
Humphrey & Cruikshank (1985) e Humphrey (1990) encontraram que a rifampicina
pode ser inibidora de células estressadas de C. jejuni.
Antibióticos que inibem mofos e leveduras são usualmente incluídos nos
meios para Campylobacter. Até recentemente, a cicloheximida foi o antifúngico mais
amplamente utilizado, mas agora é considerado tóxico para inclusão em meios
microbiológicos. Como substitutos existem a anfotericina B, demonstrada ser um
substituto satisfatório para a cicloheximida (Martin et al., 2002) ou natamicina.
Um número de antibióticos que são comumente usados nos meios para
isolamento de Campylobacter podem adversamente afetar a recuperação de
algumas espécies ou cepas. Nachamkin et al. (2000) descreveram que a cefalotina,
colistina e polimixina B podem inibir algumas cepas de C. jejuni e C. coli e também
C. fetus subsp fetus, C. jejuni subsp. doylei e C. upsaliensis.
Incubação
As placas são incubadas em atmosfera de microaerofilia (5-6% de oxigênio;
10% de dióxido de carbono; 84-85% de nitrogênio) requerida pelo Campylobacter e
em elevadas temperaturas de 42-43ºC para selecionar as espécies termotolerantes.
Existem vários métodos para se obter uma atmosfera adequada ao
crescimento do Campylobacter, contudo, devido a praticidade do uso, têm-se
adotado com maior freqüência a utilização de envelopes geradores de gases,
comercialmente disponíveis (BBL, Oxoid, Bio-Merieux).
5. Exame das Placas
O tempo de incubação ideal é de 48 horas, porém podem ser examinadas em
18–24 h. As colônias suspeitas são planas, não hemolíticas, de aspecto aquoso, de
coloração acinzentada, com bordas irregulares e com tendência a disseminar-se
pela placa. Muitas vezes aparecem como colônias incolores. A identificação
presuntiva é necessária para sua posterior confirmação.
6. Identificação Presuntiva
Coloração de Gram
Tendo em vista que este microrganismo não é corado pela safranina,
recomenda-se o uso de carbolfucsina a 0,8% como coloração de contraste. As
espécies
do
gênero
Campylobacter
são
Gram-negativos,
bacilos
curvos,
espiralados, muito finos e compridos (0,20 a 0,50 nm de largura e 0,5 a 5,0 nm de
comprimento). Em culturas jovens é possível a observação da morfologia em forma
de asa de gaivota.
Teste de Catalase
Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio em uma lâmina de vidro;
adicionar à gota, o crescimento bacteriano com o auxílio de uma alça de platina ou
plástica. A positividade do teste é verificada pela formação de bolhas no período de
até 30 segundos.
Teste de Oxidase
Pingar uma gota de reagente (solução aquosa de dimetil-ρ-fenilenodiamina)
em uma tira de papel de filtro, previamente esterilizada. Com o auxílio de um palito
de madeira, plástico ou alça de platina, espalhar a amostra a ser testada sobre o
papel impregnado com o reagente. O resultado positivo é observado pelo
aparecimento de cor roxa. A reação deve ser interpretada em 10 a 20 segundos
após a semeadura, visto que muitos microrganismos, como alguns membros das
enterobacteriáceas, podem produzir reações falso-positivas tardias.
Motilidade
As espécies do gênero Campylobacter são móveis apresentando um único flagelo
polar que apresenta de 2 a 3 vezes o comprimento da célula. O flagelo é
responsável pelo seu movimento característico em saca-rolha ou em vaivém.
7. Diferenciação das Espécies
- Termo-tolerância
Semear a amostra, a partir de uma suspensão 1 da escala de McFarland,
preparada em solução fisiológica esterilizada, em três placas de agar sangue ou
seletivo para Campylobacter. Incubar, em atmosfera de microaerofilia, cada placa
nas temperaturas de 25ºC, 37ºC e 42ºC, respectivamente. Examinar após 3 dias, a
presença de colônias típicas de Campylobacter.
Uma alternativa é o uso de 0,5 mL desta mesma suspensão em tubos
contendo caldo Brucella. Após a incubação, verificar a presença de crescimento.
- Teste de Sensibilidade a Antibióticos (Ácido Nalidíxico e Cefalotina)
Preparar uma suspensão na escala 1 de MaFarland, a partir do crescimento
bacteriano em 5 mL de Água Peptonada 0,1%. Semear, com auxílio de um swab,
toda a superfície de uma placa de Agar Sangue, Agar Muller Hinton ou outro meio
seletivo para o crescimento de Campylobacter. Colocar sobre a semeadura, os
discos dos antibióticos em teste, incubar em microaerofilia a 37ºC por 24-48 h. A
sensibilidade é verificada pela formação de qualquer halo de inibição.
- Hidrólise do Hipurato
Preparar uma suspensão do crescimento em 0,4 mL de uma solução de
Hipurato de Sódio a 1%. Colocar os tubos em banho-maria a 37ºC durante 2 horas,
sob agitação.
Preparar uma solução de ninhidrina a 3,5% em butanol/acetona (1:1).
Após a retirada dos tubos da incubação, adicionar 0,2 mL da solução de
ninhidrina, agitar e re-incubar por mais 10 minutos, sem agitação. A positividade do
teste é verificada pela formação de coloração violeta nos tubos.
- Hidrólise do Indoxil-Acetato
Preparar uma solução a 10% em acetona (p/v). Impregnar discos de 6mm de
diâmetro com 50 μl da solução e deixar secar.
Preparar uma suspensão em 0,3 mL de água destilada, a partir do
crescimento em placa. Adicionar um disco a cada tubo e aguardar por um período
de 10 a 15 minutos. O aparecimento de coloração azul indica a hidrólise do
composto.
- Produção de H2S
Inocular a amostra com uma picada no centro da coluna do tubo de meio para
H2S (agar TSI) e incubar a 37ºC em atmosfera de microaerofilia por até cinco dias. A
positividade do teste é verificada pelo enegrecimento do meio ao redor do inóculo.
Características fenotípicas das espécies de Campylobacter mais
C.coli
C.lari
C.upsaliensis
ssp.doylei
C.jejuni
ssp.jejuni
C.jejuni
C.hyointestinalis
C.fetus ssp.fetus
prevalentes no homem
Catalase
+
+
+
V
+
+
-
Redução de NO3
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
-
V
-
-
-hipurato
-
-
+
V
-
-
-
-indoxilacetato
-
-
+
+
+
-
+
25° C
+
V
-
-
-
-
-
37° C
+
+
+
+
+
+
+
42° C
-
V
+
-
+
+
V
Acido nalidíxico
V
R
S
S
S
R
S
Cefalotina
S
S
R
S
R
R
S
Prova
Produção de H 2 S
(TSI)
Hidrólise do:
Crescimento :
Sensibilidade:
R = Resistente
S = Sensível
V = Variável
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE CAMPYLOBACTER SP.
(PCR - Multiplex para diferenciação de C.jejuni e C.coli)
Introdução
Os métodos clássicos de identificação de C. jejuni e C. coli são muito lentos,
já que na maioria dos testes são necessários cinco dias para o isolamento e
caracterização do microrganismo. Além disso, a diferenciação de C. jejuni de outros
microrganismos do mesmo gênero é baseada no teste da hidrólise do hipurato, o
que nem sempre permite definir uma identificação precisa, visto que já existem
relatos sobre cepas de. C jejuni com ausência da enzima hipuricase.
Tendo em vista tais dificuldades com os testes fenotípicos para a
caracterização em nível de espécie de Campylobacter e o baixo espectro de provas
bioquímicas aplicadas para este fim, muitos laboratórios têm utilizado ensaios
baseados na biologia molecular para uma identificação específica destes
microrganismos.
O uso da reação de PCR aplicada para a diferenciação das duas espécies de
Campylobacter mais comumente implicadas em gastrenterite de origem alimentar no
homem é realizada segundo o protocolo da OMS (2003).
Extração do DNA
A extração do DNA de cepas de Campylobacter pela técnica de fervura é
bastante eficiente. Para tal prepare uma suspensão bacteriana a partir da raspagem
de colônias crescidas em Agar sangue a 42ºC/ 24 horas (microaerofilia) em 1 mL de
solução fisiológica e ajustar a uma DO de 625nm.
Transferir a suspensão para um tubo de 1,5mL, agitar e vortex e centrifugar a
11.000 x g durante 5-8 minutos. Descartar o sobrenadante e suspender o pellet em
200μl de água deionizada. Submeter os tubos à fervura (100ºC) durante 10 minutos
e, em seguida, mantê-los a -20ºC até a sua utilização no ensaio.
Reação da PCR
O ensaio é realizado para um volume final de 25 μl/amostra, cuja distribuição
de volume dos reagentes encontra-se listada a seguir:
Reagentes
Volume (μl) Concentração Final
Água deionizada
5,25
Tampão 50mM Tris-HCl 10X
2,5
dNTP (mix)
2,0
Primer Jun3
2,5
1,0 μM
Primer Jun4
2,5
1,0 μM
Primer Col1
2,5
1,0 μM
Primer Col2
2,5
1,0 μM
Taq DNA polimerase
0,25
1,25 U/ensaio
DNA
5,0
VOLUME FINAL
25,0
1X
≈ 100 ng
As seqüências nucleotídicas dos primers utilizados para a identificação das
duas espécies são:
Primer Col 1: 5’ AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC 3’
Primer Col 2: 5’ TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC 3’
Primer Jun 3: 5’ CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3’
Primer Jun 4: 5’ AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 3’
Amplificação:
As condições de amplificação no termociclador devem ser determinadas segundo o
protocolo:
- Desnaturação: 94ºC/5min
- 2 ciclos: 94ºC/1min; 64ºC/1min; 72ºC/1min
- 2 ciclos: 94ºC/1min; 62ºC/1min; 72ºC/1min
- 2 ciclos: 94ºC/1min; 60ºC/1min; 72ºC/1min
- 2 ciclos: 94ºC/1min; 58ºC/1min; 72ºC/1min
- 2 ciclos: 94ºC/1min; 56ºC/1min; 72ºC/1min
- 30 ciclos: 94ºC/1min; 54ºC/1min; 72ºC/1min
- Extensão final: 72ºC/10 min. Manter a 4°C.
Além das amostras para análise, devem ser adicionados controles negativo,
para evitar contaminação (água deionizada) e positivo para controle de reações falso
positivas (DNA conhecido).
Após a amplificação, deve ser realizada uma corrida eletroforética em gel de
agarose a 2% em tampão TBE 1X durante 40 minutos com potência de 100V. Para
preparo do gel de agarose prepare a solução e aqueça em banho-maria para fusão
do Agar, vertendo a seguir sobre o suporte específico. Deixe resfriar por 20-30
minutos.
A coloração do gel deve ser realizada com solução aquosa de brometo de
etídio (1 μg/mL) por 30 minutos, sendo posteriormente visualizado sob luz UV.
Os tamanhos dos fragmentos amplificados são: 773 pb para C. jejuni e 364 pb
para C. coli.
PCR-Multiplex de Campylobacter spp.
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