Anais do I Simpósio de Reprodução Minitub

1
Sumário
RESUMO: SELEÇÃO DE SUÍNOS MACHOS JOVENS COMO DOADORES DE
SÊMEN (Prof.Dr.Dr.h.c.Karl-Fritz Weitze - Fundação Escola de Medicina Veterinária de Hannover) __________ 1
HYGIENE MEASURES IN BOAR SEMEN PRODUCTION (Prof.Dr.Dagmar WaberskiUniversity of Veterinary Medicine Hannover) _____________________________________________ 14
HOW TO IMPROVE BOAR SEMEN PRODUCTION EFFICIENCY: A VIEW OF THE
US SEMEN PRODUCTION SYSTEM (Phil Burke – Minitube of America) _________________ 20
O PAPEL DO DILUENTE DE SÊMEN NA EFICIÊNCIA DE PROGRAMAS DE
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL DE SUÍNOS (Prof.Dr.Dr.h.c.Karl Fritz. Weitze - Fundação Escola de
Medicina Veterinária de Hannover) ___________________________________________________ 32
RESUMO: SELEÇÃO DE SUÍNOS MACHOS JOVENS COMO DOADORES DE
SÊMEN
Prof.Dr.Dr.h.c Karl Fritz Weitze
Fundação Escola de Medicina Veterinária de Hannover, Alemanha
Os machos jovens chegam nas centrais de inseminação com idade média de 150 – 170 dias,
ou seja pré-púberes, e permanecem normalmente no quarentenário. Nesta idade pode-se coletar os
primeiros ejaculados contendo espermatozóides, com diferenças entre as raças e dentro das raças. A
qualidade do ejaculado é caracterizado por uma concentração baixa de espermatozóides e uma
porcentagem alta de células com gota citoplasmática persistente. Dependendo da raça é
recomendável começar o treinamento com 180 dias de idade. Como norma de avaliação do
rendimento espermático, podem ser usados os dados da Tabela 1.
Tabela 1: Requerimentos espermatológicos para cachaços jovens, com 7 meses de idade
(Hühn 1970)
Categoria de avaliação
I
II
III
Número de espermatozóides x10
65
45
25
Volume de ejaculado (ml)
160
140
120
0,4
0,3
0,2
9
9
Concentração 10 /ml
No período de quarentena se inicia o treinamento para saltar ao manequim. Para garantir um
treinamento rápido e seguro é fundamental que o quarentenário disponha de instalações adequadas
para a coleta (sala de coleta) e de pessoal capacitado para realizar os procedimentos necessários.
Esse manejo só é possível em centrais de grande porte.
Recomenda-se realizar o treinamento dos jovens após o manejo dos demais reprodutores
(antes da limpeza da sala). É fundamental que o ambiente esteja calmo, sem ações que possam
distrair a atenção dos cachaços. Os machos em treinamento podem ser alojados com acesso visual
da rotina de coleta dos demais doadores. Para que a aprendizagem seja mais rápida, é necessário
que o cachaço já tenha contato com a mão do operador na primeira monta ao manequim.
Interrupções ou transtornos durante estas primeiras tentativas de coleta podem levar a dificuldades
na expressão da cadeia de reflexos e impedir a integração dos cachaços na inseminação artificial.
Depois da primeira ejaculação exitosa os cachaços devem ser mantidos em repouso por 4 – 7 dias,
antes da próxima coleta. Nesta fase deve-se testar os cachaços quanto a sintomas que possam
impedir o seu uso na inseminação artificial, como fase pré-monta prolongada, comportamento
hipersexual, agressividade.
Tabela 2: Valores padrões para medidas testiculares de cachaços jovens (Hühn 1970)
Característica
Idade (meses)
6
7
Comprimento testículo + epidídimo
11,5cm
12,0cm
Largura testículo
5,1cm
5,5cm
Comprimento cauda do epidídimo
1,4cm
1,8cm
Tabela 3: Requerimentos mínimos para o desenvolvimento dos orgãos sexuais de cachaços
jovens (Hühn 1970)
Característica
9
Limite
n
10 espermatozóides/ejaculado
abaixo 12 cm
15
17,63
acima 12 cm
88
24,30
abaixo 5,5 cm
23
19,82
acima 5,5 cm
80
24,33
Comprimento testículo + epidídimo
Largura do testículo
Considerando o desenvolvimento rápido do suíno com um intervalo de gerações curto, se
examina os cachaços jovens precocemente dentro dos testes de rendimento corporal. Dentro destes
exames de rendimento (engorda) também se considera características de importância para o
posterior uso como reprodutor, as funções dos membros, andamento e tamanho dos órgãos genitais,
etc. Com respeito ao desenvolvimento dos órgãos sexuais dos cachaços jovens existem dados
padrões para a seleção/ eliminação (Tabelas 1 a 3). As medidas levantadas num número grande de
animais são altamente correlacionadas à produtividade do testículo e à capacidade de
armazenamento do epidídimo, facilitando assim a seleção dos animais com maior desenvolvimento
na idade de 6 ou 7 meses, respectivamente.
Enquanto as demais características dos órgãos como: simetria/ assimetria, forma,
elasticidade do tecido, etc. existem também valores padrões a serem considerados na seleção.
A conformação dos órgãos sexuais parece ser pouco considerada no trabalho diário numa
central, como mostram dados obtidos de 12 cachaços com alterações das membranas plasmáticas
dos espermatozóides.
Foram realizados exames repetidos clínicos da saúde sexual dos animais e avaliada a
higiene e técnica de coleta de sêmen na mesma central. No instituto se realizou um exame
espermatológico em relação à morfologia, motilidade (Sperm Vision®), estado de membrana
(citometria de fluxo) e estado de cromatina nuclear (SCSA).
Na central se realizou a diluição bifásica do sêmen, aplicando a maior parte do diluente à
temperatura ambiental depois de uma pré-diluição com diluente a 32°C. Aplicando uma diluição
manual monofásica numa parte do sêmen resultou numa melhora significativa da porcentagem de
membranas alteradas, mantendo ainda um numero elevado de cachaços com sêmen alterado (Figura
1). Na pesquisa de outras causas se considerou a coleta de sêmen e efeito de cachaço. Não
encontrando erros na coleta, verificou se no exame clinico, que dentre os 12 cachaços, 11 mostraram
alterações do escroto, testículos ou epidídimo como: papiloma, engrossamento da pele, assimetria
testicular, microrquia, consistência flácida testicular, epidídimo pequeno. Esta alta incidência de
alterações pode ser sinal de um descuido para com os animais, não apenas dos cachaços em
trabalho de rotina mas também daqueles no quarentenário.
Figura 1: Resultados de exames espermatológicos repetidos de 12 cachaços adultos com
taxa aumentada de células com defeitos da membrana
Figura 2: Achados clínicos dos órgãos sexuais
Como mostra a Figura 2, os reprodutores manifestaram alterações do escroto, dos testículos
e dos epidídimos, resultando em regulação térmica alterada e espermatogênese e/ou mudanças e
armazenamento das células espermáticas comprometidas.
A conclusão foi que quase todos os cachaços com sêmen alterado mostraram alterações dos
órgãos genitais. Interações entre qualidade do sêmen, especialmente das membranas dos SPZ e a
saúde sexual dos animais são então provável. Existe a impressão, que não se presta suficiente
atenção à saúde sexual dos cachaços tanto no rebanho dos animais adultos como também nos
jovens. Vale ressaltar, que apenas cachaços sexualmente saudáveis podem produzir continuamente
SPZ em boa qualidade e número alto.
Para assegurar a qualidade dos reprodutores nas centrais nacionais a Associação Nacional
de Criadores de Suínos oficializou um manual de inseminação artificial, elaborado por membros da
nossa unidade, que no seu capítulo do atendimento veterinário disse:
A vigilância regular do plantel de reprodutores assim como o controle
espermatológico/higiênico da produção de sêmen requer entre outras coisas uma vez por ano um
exame clínico dos órgãos sexuais dos cachaços. Os reprodutores jovens são introduzidos apenas
depois dum exame clinico realizado durante o tempo de quarentena. Em relação à aquisição de
reprodutores jovens (isto é a regra nas centrais alemãs) devem ser cumpridas “prescrições de
garantia”, que em relação aos órgãos sexuais e a capacidade de monta exigem que o vendedor se
responsabilize, que o reprodutor possua órgãos sexuais normalmente desenvolvidos e que o cachaço
mostre boa libido como pré-condição para o uso na inseminação artificial, assegurando que monte
regular ao manequim e que facilite a coleta de sêmen sem transtornos.
Para assegurar estas informações/ qualidades dos animais é indispensável realizar um
exame andrológico dos cachaços jovens por veterinários experimentados.
Pela importância do exame realizado corretamente achamos necessário de descrever os
fatores fundamentais deste.
O exame andrológico facilita informações diagnósticas em relação a
- Saúde genética (fenotípica)
- Saúde geral - Saúde sexual
- Aptidão de montar (potentia coeundi)
- Capacidade de fertilizar (potentia generandi)
O procedimento inclui uma identificação do animal, levantamento de anamnese/ história do
animal, realização do exame clinico geral e especifico do trato genital (exame morfológico, funcional
do comportamento sexual e exame espermatológico). Uma lista de “check up”, como usado na Escola
de Hannover, facilita muito o levantamento de todo a informação, mostrado na Figura 3.
O exame morfológico verifica a completa presença dos órgãos sexuais como também o
desenvolvimento segundo idade e massa corporal como também desvios existentes da norma ou
sintomas patológicos (veja Tab. 1 e 2).
O exame morfológico se realiza num brete ou durante a coleta de sêmen (Figura 4) Aspectos
do exame do escroto são: simetria, grossura da pele, alterações da pele, aderências, vermelhidão; na
palpação calor aumentado e mobilidade.
Achados patológicos no escroto são lesões, abscessos, papilomas, sarna.
Os testículos são examinados com as duas mãos, uma mão levanta o testículo do lado
ventral, a outra mão apalpa o órgão. Se levanta informações em relação a forma, tamanho, posição,
simetria, consistência, dor (Figura 5,6).
Figura 3: Lista de “check up” andrológico de reprodutores suínos (Escola de Medicina
Veterinária de Hannover)
Figura 4: O que examinamos morfologicamente?
Figura 5: a) lesões com abscessos, b) sarna no escroto
Figura 6: Técnica de palpação
Uma mão levanta o testículo do lado ventral, a outra palpa o órgão
Figura 7: Medições com o “compasso pélvico”
Tabela 4: Desenvolvimento testicular no cachaço Landrace (Meersmann)
Peso em kg
Idade em meses
Comprimento cm
Diâmetro cm
30 - 90
3-5
4,5 - 7,5 ( 3 - 8,7)
2,7 – 4,4 (1,5–5,8)
90 - 150
6-8
7,3 – 8,7 (5,8-11)
4,4 – 5,8 (3,7-7,5)
150 - 190
9 - 11
9,1 - 9,6 (7,2-11,1)
5,4 – 6,1 (3 – 7,7)
190 - 250
12 - 30
9,7 – 11 (8,2-12)
5,9 – 7,2 (4,9-8,0)
Achados patológicos no testículo são orchitis, periorchitis (inflamação do tecido germinativo /
das paredes testiculares), hidrocele/hematocele (infiltração do saco escrotal com liquido abdominal /
sangue). Hipoplasia (subdesenvolvimento) ou atrofia (ausência).
Figura 8: orchitis; aumento de tamanho, vermelhão, dor, consistência firme
Em relação aos achados palpáveis nos epidídimos podemos apalpar a cabeça e cauda do
epidídimo. Verifica-se a forma (por ex. ovoide, bem delimitada), tamanho (cm), posição, simetria,
consistência (flácida, tenso elástica), separável do testículo (bem delimitado) sensibilidade (dor).
Na figura 9 a. e b. verificamos a posição obliqua do epidídimo com a cabeça na posição
ventro-cranial, a cauda dorso-caudal e o corpo na face cranial do testículo.
Achados patológicos podem ser o subdesenvolvimento (hipoplasia uni- ou bilateral), a aplasia
(falta do órgão), que pode ser parcial (segmental). Aumento de volume devido a espermatocele
(obturação do canal epididimal), e a inflamação do órgão (epididimite) com aumento de volume e
sensibilidade (dor).
Figura 9 a., b.: Posição do epidídimo. (eixo longitudinal inclinado)
Figura 10: Cordão espermático e linfonodos inguinais
O cordão espermático (musculus cremaster, conducto espermático, plexo pampiniformis) se
apalpa com uma mão, quando a outra levanta o testículo em posição cranial. Grossura, consistência,
simetria, motilidade e dor são achados a levantar. Em relação aos linfonodos inguinais (apalpável na
fenda inguinal) e necessário verificar o tamanho e a consistência, eventualmente a sensibilidade no
caso de aumento.
Figura 11: Pênis emitido com balanopostite (inflamação aguda da mucosa).
A adspecçao facilita levantar informações sobre forma, lesões, cor e umidade da mucosa,
neoformações.
O prepúcio é visível no animal em andamento e durante a monta ao manequim. Achados do
prepúcio e do divertículo prepucial são principalmente aumento de volume em consequência de
acúmulo de líquido (esmegma, urina). Muitos cachaços jovens já mostram desde logo esta dilatação,
que torna se aumentar com a idade levando dificuldades e emitir o pênis a contaminação do sêmen
com germes, que crescem em numero grande no líquido acumulado (Figura 12).
Figura 12: Prepúcio dilatado (urina no divertículo prepucial)
O exame funcional (comportamento sexual) realiza se quando o cachaço monta ao
manequim. A libido se mede via tempo de reação (intervalo entre primeiro contato visual até a
primeira tentativa de montar). O tempo de reação deve ser menos do que 15 minutos. A cadeia de
reflexos sexuais deve ser completa e não perturbada inclusive uma coleta de sêmen fisiológica.
Atividade sexual reduzida (falta de libido) pode ser um problema nos cachaços adultos
(especialmente em época de verão) assim como nos cachaços jovens quando introduzidos na
quarentena.
O comportamento sexual do cachaço é coordenado pelo sistema nervoso central , baseado
na presença de hormônios sexuais, secretados pelas gônadas, que estão controladas pelo sistema
nervoso central. Como o suíno atual descende do ancestral selvagem, sua atividade reprodutiva
depende de certos câmbios estacionais, que podem afetar também a atividade sexual no verão,
associado com níveis reduzidos de andrógenos. Esta diminuição da atividade sexual frequentemente
está associada com um número aumentado de ejaculados de má qualidade, caracterizados por
motilidade reduzida e taxa incrementada de alterações morfológicas (gota citoplasmática persistente,
acrossomas em desprendimento etc.). Tempo quente, especialmente associado com alta umidade,
está associado com este problema já desde muito tempo. Interessante é que parece existir uma clara
variação individual entre cachaços em relação a sua “resistência térmica”, como mostram
experiências de centrais de sêmen. Por definição, a falta de libido pode ser diagnosticada, quando
cachaços bem treinados necessitam mais do que 15 minutos para montar ao manequim.
Falando de problemas de libido no senso mais amplo, diferentes fatores podem ser
associados com atividade sexual reduzida:
1. Problemas físicos e de saúde
2. Uso excessivo, especialmente em cachaços jovens
3. Deficiência nutritiva, super nutrição
4. Problemas psíquicos (estresse, tratamento falso durante a coleta)
5. Masturbação frequente
6. Estresse climático (tempo quente e úmido)
Movimento excessivo dos membros traseiros durante a coleta pode indicar membros ou pés
coxos ou debilidade do sistema muscular e/ou circulatório. Infecções ou apenas influenza podem
reduzir o interesse do cachaço na atividade de monta. Quando não existem dúvidas de que técnicas
inadequadas de coleta podem ser a causa, o cachaço deve ser examinado pelo veterinário para
identificar o problema.
Cachaços jovens (6 ate 10 meses de idade) devem ser usados com cautela, como já foi
mencionado anteriormente, coletando sêmen não mais do que 3 vezes em duas semanas (intervalos
de 6/7 dias). Também cachaços adultos não podem ser usados excessivamente (geralmente 2 vezes
por semana) exceto para tempo curto 3 vezes por semana, menos devido a sua força física, mas
mais devido a resultados de câmbios na composição da secreção acessória que pode alterar a
sobrevivência dos SPZ durante a preservação.
Subnutrição severa e falta de libido não acontecem em condições normais de uma central,
mas é conhecido muito tempo, de que cachaços “super-condicionados”, nutridos com excesso de
carbohidratos sobre tempo mais longo, mostram libido reduzida, assim que a manutenção de
cachaços em condições corporais corretas é importante, não somente em relação a problemas de
libido, mas também para otimizar produção espermática e “output”. Quando a outro lado níveis baixos
de nutrição são aplicados para manter um estado físico bom, então durante períodos frios de inverno
podem acontecer uma redução da produção espermática e / ou qualidade seminal em consequência
duma retenção reduzida de proteína e gordura, quando temperaturas ambientais descem abaixo de
20°C.
Problemas psicológicos também podem ser importantes. O efeito de isolamento durante o
desenvolvimento puberal parece ser relatado à falta de experiência em participar no comportamento
de monta durante adolescência. Experiência negativa durante o período de treinamento de cachaços
jovens ou tamanho inadequado do manequim etc. podem impedir comportamento de monta normal
também. Tratamento hormonal de cachaços com problemas de libido (aplicação de testosterona)
pode intuitivamente ser uma tentativa lógica, podendo produzir melhora de curto tempo em desejo
sexual e atividade de monta, mas resultando também numa supressão de espermatogênese quando
usado em tempo prolongado. A aplicação de medicamentos (prostaglandinas etc.) para melhorar a
libido não é recomendável em muitos casos em que uma causa genética deve ser considerada, para
evitar a transmissão destes defeitos na cria.
Finalmente estresse climático, mencionado já anteriormente, não é responsável somente para
a chamada “sub-fertilidade de fêmeas no verão”, mantidas em temperaturas temperadas ou
subtropicais (mais ou menos pronunciados pela alteração da duração da luz do dia sobre o ano), mas
também afeta cachaços com a descrita redução de libido e qualidade seminal. Mantendo os cachaços
em condições confortáveis, facilitando refrigeração extra e circulação de ar, e um problema ainda não
resolvido mundialmente, pois refrigeração normalmente está associada com fluxo de ar alto e/ou
incremento significativo de umidade relativa, quando ventiladores fortes são usados para manter
sistemas laminares úmidas. Manter cachaços em condições refrigeradas durante o verão é
recomendável facilmente, mas difícil de realizar.
O exame espermatológico inclui a avaliação do ejaculado em relação a volume,
concentração, numero total de SPZ, cor, consistência, cheiro do sêmen, motilidade e morfologia dos
SPZ, tempo de sobrevivência do sêmen diluído, conteúdo bacteriano (exame microbiológico).
A suma dos achados andrológicos baseado nas informações de anamnese, exame geral
clínico, exame específico do trato genital e do comportamento sexual (exame morfológico via
adspeccao e palpação), da avaliação do comportamento sexual e do exame espermatológico facilita:
- Melhorar significativamente a seleção dos cachaços jovens
- Identificar futuros candidatos de risco
- Decidir sobre o futuro de cachaços com achados espermatológicos alterados
HYGIENE MEASURES IN BOAR SEMEN PRODUCTION
1*
1
2
1
Prof.Dr.Dagmar Waberski , A. Weyand , J. Seedorf , K.F. Prof.Dr.Dr.h.c.Karl Fritz Weitze
1
Unit for Reproductive Medicine / Clinic for Pigs and Small Ruminants, University of Veterinary
2
Medicine Hannover, Germany, Faculty Agricultural Science, University of Applied Sciences
Osnabrück, Germany
Summary
Extended boar semen is highly susceptible to bacterial growth. Bacterial contamination may occur at
all steps during semen collection and processing. In the present paper the sources and consequences
of bacterial contamination in boar semen are reviewed. Special emphasize is laid on the description of
hygiene measures and sanitary guidelines for boar AI centres.
Introduction
In the last decade, semen production efficiency in boar AI stations has increased enormously with up
to 2,000 semen doses produced per hour. At the same time, demands on semen quality have become
increasingly important. Semen doses aim to be a quality product exhibiting high biosecurity, high
genetic value and high fertility. In addition, a shelf life enabling a few days storage on farm or long
distance shipping is wanted. Bacterial contamination during semen collection and processing is a main
concern in production of semen portions. The purpose of the present paper is to review critical steps in
hygiene on the route from semen collection to processing. Recommendations for hygiene measures
and sanitary guidelines in boar AI stations will be given.
Sources of bacterial contamination
Bacterial contamination may occur during complete semen processing starting from semen collection
until sealing of semen tubes or bags. Freshly collected boar semen commonly contains bacteria,
mostly being gram-negative such as Enterobacteriaceae. Sources of bacterial contamination during
semen collection are listed in Table 1. Bacteria are either from the animal‟s origin, from the
environment or from human. In addition to the cleanness of the boar, the semen collection area and
the personnel, the collection technique will strongly influence the initial number of bacteria in an
ejaculate. Although not completely avoidable, the degree of bacterial contamination during semen
collection should be as low possible. Further bacterial contamination may arise during semen
examination and semen processing as listed in Table 2. Bacteria can enter the semen by direct
contact with any material or fluid or simply by air. Field data demonstrate that the bacterial content in
semen differs between AI centers. Raw semen and extended semen of 3 boars from 17 German
semen collection centres were examined for quantitative bacterial content, type of bacteria and
resistance to common antibiotics. Bacterial content varied between less than 1000 up to 100 million
CFU/ml in raw ejaculates and between 0 and 1 million CFU/ml in extended semen, depending on the
boar studs. Semen doses from three semen collection centres were free of bacterial content. (Fig. 1).
* Corresponding author: Unit for Reproductive Medicine, University of Veterinary Medicine Hannover,
Buenteweg 15, D-30559 Hannover, Germany; [email protected]
Consequences of bacterial contamination
Bacterial genera from studies that examined contaminants in freshly collected, undiluted boar
ejaculates (reviewed in 1) show that the majority of bacteria are not considered primary pathogens in
pigs. Thus, in most cases they do not affect the clinical health status of the boar or fertility of the sows.
Bacterial contamination in extended semen portions can influence fertility by several mechanisms:
1. Competition for nutrients between sperm and bacteria
2. Sperm damage of sperm by bacterial waste products
3. Sperm damage by direct cell-to-cell interaction between bacteria and sperm
4. Development of resistance against antimicrobials and transfer of resistance information to other
bacteria genera
5. Genital infection with loss of fertility and /or general disease in sows.
Detrimental effects of bacteria on sperm induce sperm-to-sperm agglutination, acrosome damage,
loss of sperm motility and reduced shelf-life. Field investigations on 23 North American farms, in which
the primary complaint was sperm agglutination in association with decreased sperm longevity and
herd fertility, found single or multiple genera bacterial contamination as the causative agent in 66 %
and 34 % of the cases, respectively (2). Consequences of bacterial contamination depend on the
degree of contamination, the type of bacteria and their resistance to antibiotics. Contamination of
semen with multi-resistant bacteria occurs mainly in the laboratory during semen processing.
Experimental inoculation of semen with bacteria commonly showing multiresistency against
antimicrobials, i.e. Alcaligenes xylosoxidans, Burkholderia cepacia, Enterobacter cloacae, E. coli,
Serratia marcescens or Stenotrophomonas maltophilia leads to sperm agglutination and loss of
motility during storage (2). This is in accordance with our own observations from field cases in which
sperm in extended semen was reported to be “dead” after 48 h of storage and high numbers of such
bacteria were found. The extent of microbiological growth and the consequences for sperm in
extended semen are not predictable since they are influenced by the type of bacteria, the susceptibility
to the antibiotic used, storage length, storage temperature, pH in the semen portions, and the
presence of other bacterial genera. Semen extenders provide a perfect environment for bacterial
multiplication, especially at common storage temperatures above 15°C. Many of the bacteria are very
adaptive to changing situations and may survive in the laboratory even under sparse conditions.
Hygiene measures to avoid bacterial contamination
Hygiene measures must be based on:
1. Knowledge of sources of bacterial contamination
2. Adequate design of semen collection area and the laboratory
3. Establishment of sanitation guidelines
4. Training of personnel in individual and general hygiene
5. Regulator monitoring for bacterial contamination, definition of critical control points
6. Use of antimicrobials in extended semen to control bacterial growth
Sanitation measures in the semen collection area are listed in Table 3. The semen collection area
should be separated from the boar boxes, with exclusion of air from the boar housing site. Boars
should be clean, dry and free of straw and other particles when used for semen collection. Hygiene
during semen collection includes the use of clean, surface intact phantoms, clean single–use gloves,
sterile semen collection vessels/bags covered by sterile gauze and an appropriate semen collection
technique avoiding the contamination of the ejaculate with the bacterial-rich fluid of the preputial cavity
and/or the pre-secretion. From the hygienic point of view, the use of automatic semen collection
systems is advantageous, since the semen is not exposed to air during collection (3). Before and
during transport to the laboratory, semen vessels have to be kept closed in order to prevent
contamination by aerial microorganisms. Once arrived in the laboratory, further major potential
sources of contamination are any materials coming into the contact with the semen or extender. High
standard sanitary protocols are necessary to keep the number of microorganisms in the laboratory as
low as possible. Details of hygienic measures in the laboratory are outlined in Table 4. Laboratories
should be strictly separated from the collection area including air transmission. Laboratory work flow
from semen examination until filling should be in-line (straight), thereby avoiding cross-traffic between
personnel. Laboratory desks, floors and walls should be as empty as possible. Only single-use
disposable wipes should be allowed to prevent cross-contamination. Any material or equipment is a
potential source of contamination and impairs cleaning, especially where corners and niches are
formed. The contact between semen and any other material should be minimized. Extenders may be a
source of contamination when stored overnight at room temperature. Semen colours used in some AI
stations to mark different breeds of boars have been identified as a major source of bacterial
contamination in diluted semen. Antibiotics are helpful to control bacterial growth in extended semen,
however, they can not compensate for hygienic deficiencies in semen collection or processing. Special
care needs to be taken for triggering the development of resistant bacteria by creating reservoirs of
extended semen in laboratory sinks or drains. Therefore, a semen waste procedure should be
established without using laboratory sinks and drains. Modern filling machines allow a hygienic filling
of semen with no major risk of contamination. However, daily care of the machine and especially of the
tubes according to sanitary guidelines and manufacturer‟s recommendations is demanded. Repeated
use, cleanings, sterilization and simply aging affect surface attributes of filling tubes which may attract
bacteria and ultimately evolve in biofilms as a source of contamination. Formation of a biofilm begins
with the attachment of free-floating microorganisms to a surface. These first colonists adhere to the
surface initially through weak, reversible van der Waals forces. If the colonists are not immediately
separated from the surface, they can anchor themselves more permanently using cell adhesion
structures. Once colonization has begun, the biofilm grows through a combination of cell division and
recruitment. The development of a biofilm may allow for the aggregate cell colony(ies) to be
increasedly antibiotic resistant. Water and extender tubes are particulary susceptible to the formation
of biofilms. Once created, biofilms are tenacious and hard to remove. The purpose of cleaning is to
remove semen and extender residues and dirt. The purpose of disinfection is to reduce the numbers of
living microorganisms. To be effective, disinfection must be preceded by thorough cleaning. Cleaning
has to be both as effective and as gentle as possible in order to protect personnel, sperm and the
material itself. The manufacturer‟s instructions must be followed, especially regarding the dilution of
the product; too weak and the product will not work effectively; too strong and residues of the cleaning
product may impair human health or sperm quality. Instructions regarding contact time must always be
followed.
A high hygienic consciousness of the station`s personnel has to be created and established
permanently. Schedules should give clear instructions to staff on what is required to ensure effective
cleaning/disinfection, and the following points should be considered:
1. What is to be cleaned and disinfected (structure, equipment, utensils coming into contact
with water, extender or semen)
2. What chemicals and equipment will be used
3. The method of cleaning/disinfection
4. What protective clothing will be worn and precautions to be taken
5. When it is to be cleaned/disinfected (after use, daily, weekly, monthly)
6. Who will carry out cleaning/disinfection
7. Monitoring arrangements.
Conclusion
Extended boar semen is highly susceptible to bacterial growth, especially when the semen is stored
for several days. Basic guidelines for hygienic boar semen production are: collection of raw ejaculates
with the lowest germ content, semen processing without additional bacterial contamination, and
prevention of uncontrolled bacterial growth during storage. To ensure these, efficient sanitary
guidelines with regard to the collection area, the laboratory and personnel need to be established. A
profound hygienic consciousness of AI staff has to be created and trained regulary. The development
of future strategies including lower storage temperature and alternative sperm compatible
antimicrobials with low risk of producing resistant bacteria genera should be encouraged.
Acknowledgement:
Studies underlying this review were supported by the Development Association for Biotechnology
Research (FBF, Bonn e.V.).
References:
1. Althouse GC, Lu KG (2005): Bacteriospermia in extended porcine semen. Theriogenology 63, 573584.
2. Althouse GC, Kuster CE, Clark SG, Weisiger RM (2000): Field investigations of bacterial
contaminants and their effects on extended porcine semen. Theriogenology 53, 1167-1176.
3. Lellbach C, Leiding C, Rath D, Stähr B (2007): Effects of automated collection methods on semen
th
quality and economic efficiency of boar semen production. Proc. 6 Int Conf on Boar Semen
Preservation, Aug 12-15, 2007, Alliston, Ontario, Canada, PS1, 10.
Table 1:
Sources of bacterial contamination during semen collection
Boar
Penis
Preputium
Preputial cavity fluids
Pre-sperm fraction
Skin
Hair
Respiratory secretions
Faeces
Environment
Dummy
Floor
Air
Semen collection vessel
Any other material
Human
Clothes
Shoes
Gloves
Skin
Hair
Respiratory secretions
Table 2:
Sources of bacterial contamination during semen processing
Material
Water
Extender
Tubes
Vat including lid
(bacteria in condensation!)
Semen dyes
Laboratory material
Non-laboratory
material
material not in use
Environment (Laboratory)
Air
Insects
Floor
Sinks/Drains
(semen reservoirs!)
Furnishings
Walls
or
Human
Clothes
Shoes
Skin
Hair
Respiratory secretions
Table 3:
Hygiene measures during semen collection
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Semen collection area separated from animals
Establish sanitary guidelines for semen collection area and personnel
Clean semen collection area (dummy, floor, etc.)
Clean clothes and boots for personnel
Clean single-use gloves
Single-use or sterilized semen vessels/bags and sterile gauze/filters
Boars: clean, dry, trimmed preputial hair
Hygienic semen collection technique:
- if necessary: clean dry preputial opening with single-use wipe
- manual removal of fluid from the preputial cavity after mounting
- keep the tip of penis free during fixation of the penis thus avoiding the contact of
semen with the gloved hand
- hold the penis at a downward angle to the boar to avoid preputial fluid flow into the
semen vessel
- discard sperm-free pre-secretion (rich in bacteria!)
- remove gauze/filter with gel fraction carefully (don`t wring!) immediately after
collection
- close the semen collection vessel/bag
- fast transfer into the laboratory
Table 4:
Hygiene measures during semen processing
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Laboratory separated from semen collection area (including air!) and other units of the AI
station (storage, packing, cleaning, office, etc.)
In-line work flow without crossing of people
Keep only necessary equipment and material in the laboratory
Establish sanitary guidelines for cleaning and disinfection considering laboratory and
equipment, water, personal hygiene
Establish a semen waste procedure without use of sinks and drains in the laboratory
Preferentially single-use
disposable
products;
if
not
ensure
cleaning
and
sterilization/desinfection
Only use single-use disposable wipes and towels
Avoid storage of extenders over night or longer
No use of semen dyes
raw
1,E+08
extended
1,E+07
Bacterial numbers per ml
1,E+06
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Boar stud
Fig. 1: Bacterial numbers in raw and extended semen of in 17 different boar studs (means of 3 boars)
HOW TO IMPROVE BOAR SEMEN PRODUCTION EFFICIENCY: A VIEW OF THE
US SEMEN PRODUCTION SYSTEM.
Phil Burke
Technical Services Manager – Porcine
Minitube of America, PO Box 930187, Verona, WI, USA
[email protected]
What is the definition of efficiency?
Simplified Definition :The ratio of the output to the input of any system
What should we measure and how? What get‟s measured gets managed, so a stud needs to focus on
the correct measurements to achieve these business objectives.
Stud efficiency is the maximum number of processable and saleable doses produced at „least‟ cost.
Background
In the USA, over 95% of producers are using Artificial Insemination on their farms. This has grown
from around 9% in 1993 and by 2005 this had reached 90% AI usage. Since then, slower growth has
continued and today‟s prediction is 95-97% AI usage.
Non-users tend to be smaller farms or groups that will not use AI on any animals based on their
religious beliefs.
In Canada, AI usage is more regionalized, with 90%+ usage in some provinces. In Mexico, 85% AI is
being used, but this is changing rapidly with 3 or 4 large (300-400 head) studs planned to be built in
2010. Delivery logistics in Canada and Mexico can be challenging.
Reproductive performance in US sow herds is at an all-time high with many farms consistently
achieving over a 90% Farrowing Rate and over a 12.5 Total Born. Slower growth and less staff
turnover has contributed to this success. Many studs today are only 75% utilized due to oversupply of
studs and semen and better on-farm dose management.
Currently there are over 141 AI studs in the US, totaling over 29,840 boar spaces. Very few new studs
have been built in the last 2-3 years. The newer studs are typically 300 - 600 boar spaces.
The largest single stud in the US is 800 boars in Missouri. Average stud size is 210 boar spaces.
Larger, newer studs are more efficient, cost effective and can more easily justify the investment in the
latest technology, as it can be leveraged over more boars and more importantly, more doses.
With the challenging North American pig business in the last 2 years, many smaller (150 head or less)
have closed in the US and this trend will continue.
In 5 years time, there will be 30-40 fewer studs in the US as the levels of efficiency continue to
improve and new technology allows the larger studs to leverage superior boars across a larger sow
base.
Labor costs are $700-720 per boar space or between $0.59 – 0.71 per dose on the most efficient
studs.
Semen production per boar space averages between 98-102 doses per working boar per month at 3
billion „viable‟ cells or 294-306 billion „viable‟ cells per boar per month.
Sperm cell production per day is typically 10-12 billion cells on average, with some exceptional boar
lines achieving 15 billion cells per day.
Boars are typically collected 1.1 -1.2 times per week or every 4-5 days based on Monday to Friday
collection days. On most commercial studs, Monday and Thursday would be the busiest collection
days with around 85% of all the semen collected for the week being collected on these 2 days. The
largest studs may collect up to 10,000 doses on a Monday morning. Many studs start at 2 or 3 am on
a Monday.
Around 6% of all collections are trashed/ discarded after assessment under the microscope. This
figure can triple with some boar lines during the summer months.
The greatest efficiency driver is semen sales. The best studs with the best genetics can sell in excess
of 95% of all the potential doses available on each collection day and this can dramatically boost
efficiency and reduce the cost per dose. On occasions, some studs have over-committed to fulfill
orders and this can be damaging to the studs long term availability.
Ultimately, the consumer dictates the efficiency of the stud, as he/ she buys the product, which
influences the retailer, which communicates with the meat packer and this determines the boar type
that offers the best meat quality, Feed Conversion (FC) and Average Daily Gain (ADG) growth
characteristics. AI boars are not selected or indexed on semen output or morphology characteristics.
To achieve the best efficiency, while maintaining the highest quality control standards, requires
tremendous commitment and investment in talented people and new technologies.
Stud Location
This will always be a compromise between health and biosecurity and the access and proximity to the
sow base.
Keeping the stud open and healthy is the most important component of stud efficiency.
Closed studs create zero efficiency.
The selection of a suitable „biosecure‟ location is essential when planning a stud.
In setting up an AI Stud, consideration should be given to its site in relation to the risk of disease
introduction. Precautions taken against the entry of infection into health-monitored herds from outside
must prevent all direct contact with other pigs and minimize indirect contact.
Location
The AI Stud will be:
i.
As far away from other pigs as possible (prefer 3km).
ii.
As far from public highways as possible.
iii.
Away from other livestock, especially swine markets and swine slaughter plants
(minimum 8 km).
iv.
Away from workers' houses.
v.
Where farm roads do not go through the AI Stud.
vi.
Located in acceptable topography.
The Compound Perimeter
a.
A clear demarcation of the "boar compound" should be made. The compound includes
the buildings that house the AI Boars, the perimeter fence, and everything therein.
b.
Two types of fences should be utilized:
i.
Perimeter fence (away from the buildings).
ii.
A compound fence segregating feed bins, load-outs, etc.
iii.
Chain link or electrified high tensile wire is acceptable. The height and strength
of fencing depends on the type of farm and other relevant circumstances.
"Keep Out" signs should be placed at the active areas of the perimeter fence
iv.
Climate
Studs in the US and in particularly the northern Midwest, have to be designed to cope with extreme
weather. In the summer it can exceed 40 deg C and in the winter it can exceed minus 40 deg C.
Providing an ideal climate with adequate air flow, heating, cooling and humidity control can be
challenging. In the summer, the aim is to keep the temperature below 30 deg C and below 85%
Relative Humidity (RH %). In arid climates, evaporative cooling works well. In areas with high humidity,
evaporative cooling only intensifies the issues associated with high humidity.
Several studs have attempted to use air conditioning (often large household units) over the years with
little or no success. Very few of the installs used industrial AC units that would be capable of
controlling, managing and surviving the challenging air quality and atmosphere in and around a boar
barn.
Around 30-40% of the US studs, in particular the larger 300+ commercial studs, now use air filtration
in the boar barns as a disease control measure. Most use the 95% DOP filtration and relatively few
use the true HEPA 98% filtration (HEPA costs 10 times more to install than the DOP with only 3%
additional protection).
Sows and gilts have a higher return rate in the summer and a boars semen output is lower and the
ejaculate discard rate is higher. All these factors add pressure to the remaining, active and working
boar population. Having a reserve of 10% more boars in the summer or connecting the isolation via a
walkway or pneumatic delivery system can be of great value during the summer months, by offering
some added dose availability.
Stud Purpose
Boar studs fall into 4 main categories – genetic nucleus, commercial, internal/integrator or a combination
of all of these types. The purpose and function of the stud will determine the size, logistics and
ergonomics necessary to manage the day-to-day activities performed by the facility.
Present building costs in the US would be $2300-2500 per boar space, excluding genetic cost and site
preparation. Site preparation can cost $900-1200 per boar space on some projects.
Internal studs, utilized by the larger corporate producers, would have adequate boars to supply semen on
a 1:175 to 1:200 ratio (boar: sow), with average usage around 6 – 6.25 doses per sow per year. With the
down-cycle in the pig market, many producers are using and ordering around 7% less semen than
rd
previous years. This can be explained by lower sow inventories, fewer 3 inseminations and less
wastage.
Stud Size
Approximately 29,840 boars are housed in 141 studs.
Size breakdown:Size
(head)
0-99
100-199
200-299
300-399
400-499
500++
Totals
# of Studs
35
37
32
11
18
8
141
Actual
Boars
1860
4820
7340
3560
7440
4820
29840
% of
Total
6
16
24
13
25
16
100
Barn Design
Barn design has developed well over the last 15 years. In the early days of stud construction, most
studs were built as small sow farms with gilt pens and a dummy. Today, the studs are designed by
managers and stockmen to optimize doses per collector per hour, ease of movement and boar and
staff safety.
Walkways should be a width of 0.75m maximum to the front and rear of the crate. All crates should
have a front and rear gate with a „boar‟ proof spring-loaded latches. All flooring under the boars should
be fully slatted. This allows the boars and the collections to stay cleaner and have less bacteria/
contamination issues.
In the US, welfare codes allow both crates and pens to house boars. This can range from 100% pens
to 10% pens and 90% crates depending upon the stud. Typical combinations ratios of crates Vs pens
would be 80:20, 90:10 or 95:5.
Pens would typically measure 1.5m X 2.15m, with a totally slatted floor. Crates of different sizes would
typically be used to accommodate different ages and genotypes. These would measure 0.6m X 2.1m
to 0.7m X 2.4m with fully slatted floor with the slat openings perpendicular to the crates. The crates
would also be 12-15cm higher than a conventional gestation crate to accommodate larger framed
boars and be constructed with a heavier gauge steel. Crate divisions should be constructed of vertical
steel bars to stop boars climbing.
Individual drinkers should be secured to each boar space, to ensure adequate water intake. A water
flow meter can be incorporated into each row of crates to monitor water usage and detect and correct
water supply issues.
Adequate lighting, particularly above the collection area is needed. Fluorescent lighting is preferable.
Method of feeding
Volumetric drop feeders are ideal for feeding boars effectively and without stress. Feeders should be
adjusted every 14-days to control and manage the boars Body Condition Score (BCS).
Studs in the US with over 200 boar spaces would utilize automatic drop feeders to feed their boars
once a day, typically in the morning before collection commences. Some studs feed the boars after
collection around 12-noon. A few studs would feed twice per day using automatic drop feeders.
Studs with 100 boars or less would feed by hand.
Normal feed intake would be 2.5-3kg per day, based on weight, body condition, age and genotype.
General guidelines are shown below:
Body weight Kg
Kg/day
<160
2.3
160
2.5
205
2.7
250
3.0
295
3.3
340
3.6
Collection Crates Vs Collection Pens
A conventional stud could achieve 3 collections per collector per hour (approx.75 doses/person).
The latest studs with collection crates, collection pits and semi-automated collection, such as the
AutoMate™ from Minitube have the ability to achieve 8 (approx. 200 doses/person/hour) or more
collections per collector per hour. Some studs can even achieve as high as 11 collections per collector
per hour with a barn person delivering and returning boars to and from the collection area.
Boars are more focused in a collection crate, as there are fewer distractions. New boars should be
trained in a collection crate and then they will adapt to these surroundings. A crate should be around
0.66m internally and a minimum of 2.75m long. Entry and exit gating will be determined by the barn
design. Collecting from outside the collection crate, preferably in a collection pit, is also safer for the
collector.
An open collection pen provides many distractions, corners to investigate and creates safety issues.
This wastes time and reduces efficiency.
A collection pit (0.95m deep) with a series of collection crates (normally 4 to 6) is the best alternative in
a newly built stud. This is safer for the collector. The collector can also stand upright for the whole
duration of the collection. The addition of a semi-automated collection dummy such as the AutoMate™
from Minitube can also increase the number of collections per hour, improve safety and minimize hand
muscle fatigue. On a large stud, collectors could collect up to 50 boars per day.
Some older studs are now adding new „collection rooms‟ to accommodate this concept.
An example of a collection pit layout in a separate collection room is shown below.
Collection technique
Boars prefer to be collected by certain technicians. This is a trained response and it is essential that all
boars can be collected by all technicians to optimize barn efficiency and flexibility.
Analyzed collection data from hand-collection shows that certain collectors extract more semen per
collection than others and this can dramatically affect the number of boars to be collected per day and
also the number of hours worked on large studs on busy collection days.
When correctly using a semi-automated collection system, such as the AutoMate™, you can optimize
the volume and number of doses collected each and every time. Almost all boars are trainable to the
AutoMate™ and this can provide rapid collection, high dose outputs and minimal bacterial
contamination.
Pass-through window Vs Pneumatic delivery
Transferring the collection from the collection area to the lab should occur as soon as possible after
the collection has been completed. Walking the collection to a pass-through window takes time and
effort and slows down the collection efficiency. Installing a pneumatic delivery system into the
collection area with a direct connection to the lab ensures that the collection is delivered rapidly and
with minimal cooling. Blood samples and written communication can also be sent via this method. The
lab stays cleaner using pneumatics rather than a pass-through window.
Staffing
Good staff are hard to find in all countries. Now that the US AI market is mature and fully developed, it
is essential that good staff are retained, motivated and compensated. Many studs today have
experienced staff on higher salaries and more vacation days. This improves the stud management and
efficiency when the whole team is at work but can also impact efficiency during vacation times.
However, at the end of the day, quality and experience outweigh the additional costs and higher
vacation allowance.
rd
It is standard to work a 40-hour week in a US stud and feed and check samples every 3 weekend.
US studs start early (2 or 3 am) to ensure that semen is delivered the same day as collection to the
customer. Many studs are closed by Midday. No collections occur at weekends.
In the 1990‟s, a ratio of 1:45 (person to boar) was normal. As studs have become more efficient and
have invested in labor saving technologies, they can now operate at a 1:55 (person: boar ratio) to 1:60
ratio quite easily.
Isolation intake
Most studs receive 4 or 5 groups of new boars per year. This will total around 65-70% annual
replacement rate. Most boars are pre-trained in Isolation in an area that replicates the collection area
design in the main stud. Boars remain in isolation for 45-60 days prior to entering the main stud. Some
studs use the Isolation area in summer to supply additional semen for sale. These animals would have
passed all blood testing protocols.
Lab Design
Newer studs have high efficiency and ergonomic labs designs that minimize movement between work
stations and allow the collection from arrival in the lab to follow a one-way flow through the lab to the
semen cool room. Most studs now use walk-in semen cool rooms @ 15-17 deg C. rather than using
multiple semen storage units.
Method of measuring concentration
This area has evolved dramatically over the last 10 years. No studs in the US use a hemocytometer or
Bürker Chamber to measure concentration currently. Most studs use photometers to measure
concentration.
Many studs have now invested in Computer Aided Semen Analysis (CASA) for evaluating motility,
concentration and visual morphology at line speed. Minitube‟s SpermVision™ is the best selling CASA
system in the world. In 2008, Minitube launched an Auto-Morphology option to the SpermVision™ to
allow for sperm morphology (proximal droplets, distal droplets and tail abnormalities) to be assessed
by the computer at line-speed.
The „gold‟ standard for assessing semen quality is a counting chamber, but this technique is slow and
tedious and cannot be performed at line speed in large studs (200+ boars).
The next best option is a photometer and these are available from many suppliers and some are more
accurate than others with porcine semen. Photometer‟s are easy to use and can provide consistent
results when used correctly. However, these machines calculate concentration based on the color and
density of the semen in the cuvette or chamber. Other material in this cuvette or chamber can affect
the accuracy of the calculation, such as gel. The photometer cannot differentiate between semen and
gel.
The better alternative is to invest in a CASA system that physically counts, measures and calculates
concentration and motility on multiple fields using a high powered computer using a digital camera.
The more fields that are measured, the more accurate the results. These machines will perform at line
speed (1 machine up to 400 boars) and provide highly accurate results. An example is the
SpermVision™ from Minitube. A visual morphological assessment by a lab technician still has to be
performed.
The best machine on the market is Minitube‟s SpermVision™ with the Auto- Morphology package that
can identify and quantify the incidence of proximal droplet, distal droplet and tail abnormalities in a
sample at line speed. This is the only machine of it kind, that can perform all these tasks at line-speed.
Concentration per dose
Most US studs target 2.25 -2.75 billion „viable‟ cells per dose and can produce most doses at this
concentration with an accuracy of +/- 10%.
Concentration is falling and will continue to decrease. To measure lower concentrations with a high
accuracy requires investment in more sophisticated equipment, such as the SpermVision™.
Studs and genetic suppliers are trying to control or lower costs by leveraging superior boars across a
larger sow base by reducing the concentration per dose for terminal semen. It is likely that the
concentration per dose will be below 1.5 billion „viable‟ cells by 2015 as we continue to learn and
understand more about fertility. The introduction of new technologies, such as semen sexing, will also
drive the concentration downwards to enable the optimal utilization of superior sires.
Doses are sold as units and if you can sell more doses per collection, then your efficiency will increase
incrementally.
Volume per dose
Volume per dose is also decreasing. Standard volume per dose in the US is 65- 75ml, with the
majority still at 75ml. Using automated packaging machines will ensure (+/- 1ml) that the correct
volume is added to each dose each, every time. Manual filling is less accurate with a +/- 5ml per dose
and often more. This can waste valuable distilled water and extender and these incremental costs can
soon add up to considerable financial loss.
Extender/ Diluent
Extenders are available from many suppliers. This is one of the most important investment that you
can make when producing a quality dose of semen. Not all extenders are equal and not all suppliers
are equal. Purchase from an established (20 years or more) AI supply company that can provide
excellent quality control in manufacturing, tests each and every batch on boar semen and can offer
technical service and support to your operation. With extenders, you get what you pay for and this is
not an area to save cost. Select the product that best fits your needs and „invest‟ in a quality product.
Studs only have a reputation once, once your reputation and credibility is gone, your business is gone.
Tubes Vs Cochette Vs Pochette
Currently 3 packaging options are available in the US. All are capable of producing excellent
reproductive performance on the sow farm.
Make sure that you buy from a reputable source that has tested the product on porcine semen and
that the material is not spermicidal. Some Asian products are inexpensive, but have no quality control
or testing.
The least expensive of the 3 options is the tube and this has the largest market share in the US.
Semen QC – Efficiency Vs Quality
Semen samples need to be assessed at line-speed. With the advent of technology such as the
Automate™, this has created faster collections and delivery of semen from the barn to the lab which
has added pressure and urgency to get the semen samples evaluated and processed.
Semen assessment takes time and attention to detail. Busy US studs can analyze 400 collections on a
normal Monday and so it takes trained personnel to perform this task accurately. Starting at 2 am also
adds a fatigue factor and that is why many studs have invested in technology, such as the
Spermvision™ to minimize the „human‟ factor.
Semen must be assessed for concentration, motility, color, odor and morphology on each and every
sample consistently, repeatedly and with a high level of accuracy.
By implementing CASA technology to the production line has allowed studs to assess and analyze
semen samples at high speed and with high levels of quality control.
Morphology assessment
Real-time morphology should be performed on all ejaculates entering the lab. However, performing
semen assessment on a live sample is highly subjective and often inaccurate. A large stud in the US
needs to assess 300-400 ejaculates before Midday on busy days. This leads to obvious difficulties.
Using stained morphology in the past was the only alternative to accurately assess morphology. This
process is slow and tedious and cannot be performed at line-speed on a larger AI studs.
In the1990‟s a modified morphology technique was used to assess motility, cytoplasmic droplets and tail
abnormalities. Each category is scored visually and a composite score is compiled. This technique is
also very subjective and variable.
Today, Computer Aided Semen Analysis (CASA) will allow for real-time, line-speed measurement of
concentration, motility and morphology to be performed objectively. This data can be compiled and
analyzed to enable genetic companies and large integrators identify semen fertility characteristics to use
in genetic selection and modeling.
The large studs will invest and incorporate these new technologies quickly, efficiently and effectively.
Level of Automation
What is the cost of local labor? What is the cost of good labor? What is the cost of Automation?
Studs are getting more and more automated every year and every time technology is developed to
eliminate one area of inefficiency, it then exposes the next weakest link in the chain. There will always
be a weak link.
Studs can be automated in almost every area to minimize variance, optimize accuracy and reduce
wastage.
Additional automation options are:
RFID
o Each Boar has an electronic ID chip
o Each technician has an electronic ID chip
o Antennas‟s in the collection area track and communicate with the stud software to
manage and coordinate collections as they move from collection- processing packaging to ensure that the integrity of the data and ID is maintained.
Auto – Dilutor
o Preparing a semen sample for concentration analysis is controlled by an electronic
machine that accurately prepares, mixes and dispenses a precise sample to load into
the semen chamber. This ensures that the dilution is optimized each and every time.
Automatic Microscope Stage
o The CASA software controls the movement of the automated stage to ensure that the
semen assessment is based on all areas of the chamber to ensure an accurate
concentration, motility and morphology is assessed. Manual movement by a lab
technician is inconsistent and can create bias.
Automatic Semen Dispenser
o Once the ejaculate is analyzed and the number of doses determined, it is then
essential to mix the raw semen with a precise amount of extender. Controlling this
manually is time consuming and inconsistent. The lab software can communicate
directly with the Automatic Semen Dispenser and precise amount of extender can be
dispensed from the extender vat to mix with the semen.
Maternal Vs Terminal
A stud‟s efficiency can be dramatically affected by collecting and processing maternal semen doses.
Maternal boars are harder to train, produce fewer doses, and have a higher percentage of
abnormalities than terminal semen doses. Also, maternal boars are normally processed as Single-Sire
(SS) doses and therefore are handled and processed separately to the terminal semen doses.
Terminal boar semen ejaculates are „pooled‟ together. Up to 6 boars would be in a „boar pool‟. Only
boars of the same terminal line are „pooled‟ together. This increases dose throughput and reduces the
need to change tubing on every boar and is therefore more cost effective. Terminal semen would be
processed using an automated packaging machine.
A boar collection list would be created each day and all boars of the same line would be collected
back-to-back.
Often maternal semen is processed using a manual filling and sealing station and typically accounts
for less than 10% of the weekly production.
On some larger studs that supply larger quantities of SS semen, an automated packaging machine will
be dedicated to this production process. Maternal semen is higher priced than terminal semen and a
higher processing and handling cost is also charged to the customer or genetic company.
Discard or Trash Rates
All studs should trash or discard collections that do not meet the stud‟s quality specifications.
All studs have different quality control parameters to determine a passing or a failing ejaculate.
Studs that have zero trashed collections have inadequate semen quality criteria.
As a guideline, around 30% of all boars will be infertile or sub-fertile at any given time and this is
changing constantly throughout the year.
During the cooler months (winter, spring, fall) a trash rate of around 6% is considered acceptable and
normal. During the summer months, some boar lines are affected by the increase in temperature and
RH%. Boars that have small testicles and a less pendulous scrotum are most affected by extreme
heat and humidity.
Below is some actual data from a large US stud:-
Genetic line
Nov –June in the
USA
July-Oct in the USA
A
6%
14%
B
3.5%
8.9%
C
9%
23%
D
7%
16%
Order Accuracy VS Extender wastage
Precise orders and collecting to order is the ideal approach. Collecting extra doses or having late
cancellations can impact cost efficiency. At the same time, having a few additional doses can also
avoid having to go out and collect more boars and prepare fresh extender.
Using an accurate scale below the extender vat, using a programmable pump to dispense extender
accurately and a packaging machine with optical sensors will ensure that you minimize wastage and
allows for precise planning of dose output.
Using glassware or plastic-ware with a graduated scale on the side is highly inaccurate and inefficient.
No-one in the US uses glassware, it‟s expensive and needs replacing often.
Disposable Vs Re-Usable
Most studs today use predominately single-use disposable items to optimize efficiency.
Tubes and hoses can be re-used multiple times, if these are washed and sterilized correctly.
Tubes and hoses can be re-used for 30 days ,if they only come in contact with extender and washed/
sterilized correctly.
Tubes and hoses can be used for 14-days if these are used with semen. Thorough washing and
sterilization is needed. All tubes need to be inspected for splitting and cracking as these areas can
harbor bacteria.
Plastic pitchers with bag liners are the most cost-effective approach.
All microscope slides, cover slips, chambers and cuvette‟s are single use only.
Working Boars Vs Non- Working
Non-producing boars cost money. Boars that have failed ejaculates for more than 30-days rarely
return to full semen production. Strict culling policies need to be created and enforced.
If a boar is a non-producer for 30-days, replace him with a boar that can create income.
Problem boars plaque the studs efficiency and add considerable overhead in terms of feed and
medication costs.
Very few studs transport cull boars to slaughter, as these animals have little financial value, high
transportation costs and difficult to segregate during trucking. Most boars today in the US are
euthanized on-site and are then buried or composted.
Data Management
A modern stud uses sophisticated software to manage semen processing and to enable the stud
manager to access and analyze data to make business and management decisions.
This can assist in order management and day-to-day planning. Many software packages can also
invoice and manage accounts receivables.
Shipping and Packaging
The final step in the process is as important as all the other steps.
In the US, semen is delivered locally by owned couriers and state to state by UPS.
Ensuring the semen is fully cooled prior to shipping is essential. Most stud‟s ship semen in a doubleboxed Styrofoam cooler and all air voids are filled with 17 deg Celsius gel packs or polystyrene chips.
Sending the ordered product to the right place at the right time is paramount to all business. This is a
fragile and time-sensitive package and it is essential that the product is delivered on-time, every-time.
Semen is invoiced post-delivery and so the farm can see and assess the product before he/ she
decides to make payment.
Third party audits
rd
Customers expect product excellence at all times. Most studs now routinely submit samples to a 3
party to validate and certify that the semen doses meet or exceed the stud‟s dose profile. Some
customers also submit purchased doses to check the semen quality.
Benchmark
Many discussion groups are now in place in North America. These groups meet to discuss trends,
issues and new technologies. Several of these groups also benchmark stud costs and discuss areas
to improve efficiency without compromising dose quality.
Conclusions
Efficiency is a never ending journey. Daily monitoring is needed to manage a modern stud effectively
and efficiently. Boars are living creatures and need to be managed as unique individuals, in an effort
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O PAPEL DO DILUENTE DE SÊMEN NA EFICIÊNCIA DE PROGRAMAS DE
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL DE SUÍNOS
Prof.Dr.Dr.h.c.Karl Fritz Weitze
Fundação Escola de Medicina Veterinária de Hannover, Alemanha
Estender a viabilidade do sêmen líquido suíno para além do terceiro dia de preservação é
ainda um fator considerável. Desde há muito se está trabalhando no desenvolvimento de novos
meios de conservação visando prolongar a vida fértil do sêmen.
As principais funções do diluente são:
Redução do metabolismo espermático através de baixa de temperatura;
Uso de soluções de tampão para alterar o metabolismo;
Adição de substâncias nutritivas e protetoras como: glicose, buffer (bicarbonato- citrato,
HEPES, Tris etc.);
Adição de crioprotetores (glicerina,..);
Inibição do crescimento bacteriano pela redução de temperatura e adição de antibióticos.
Na pratica deve-se considerar alguns fatores básicos para manter a capacidade fertilizante do
sêmen, como: variação de pH, concentração dos ingredientes (especialmente de íons), tipo de íons,
pressão osmótica.
Para o sêmen suíno estes fatores são:
- pH 7 – 7,3;
- baixa concentração iônica (substâncias quelatórias como EDTA – para captação de íons bivalentes
-como Ca -);
- pouco Na ,
- baixa concentração de bicarbonato (3-4 mMol/l);
- pressão osmótica isotônica em relação ao ejaculado: 300 – 320 mOsmol;
-substâncias não iônicas para manter isotonia (glucose).
Atualmente distinguem-se três fatores altamente limitantes para a conservação do sêmen
suíno liquido:
- Choque térmico;
- efeito de diluição;
- envelhecimento durante o armazenamento.
O sêmen suíno é altamente sensível frente à queda de temperatura, sobretudo
imediatamente depois da ejaculação. Recomenda-se, portanto, aguardar de 10 a 20 minutos antes de
resfria-lo. Para evitar o choque térmico de frio no processo de diluição é fundamental aplicar o
diluente com temperatura idêntica à do sêmen.
Dependendo da temperatura, as membranas espermáticas alteram sua fluidez, o que
interfere com a função da membrana, especialmente no que se refere aos processos de transporte de
íons e de regulação do volume celular.
A adição de meios diluentes resulta em diluição da concentração de substâncias
extracelulares, que tem efeito imediato sobre a regulação osmótica. Importante parece ser a
concentração do plasma seminal, que no suíno é abundante no ejaculado e que devido ao grau de
diluição, resulta numa diminuição considerável da concentração restante depois da diluição, o que
tem efeito significativo para a manutenção do metabolismo, especialmente de energia da motilidade.
O efeito negativo de altos graus de diluição manifesta-se em uma perda relativamente rápida da
porcentagem de células moveis em comparação com amostras menos diluídas. Este efeito limita o
rendimento da produção de numero de doses por ejaculado, que é muito baixo na espécie suína em
comparação aos ruminantes. A eliminação parcial do plasma seminal na dose de sêmen tem também
efeitos negativos para a sobrevivência dos espermatozóides (SPZ) no trato genital da porca,
resultando numa alteração significativa da situação imune no endométrio uterino.
O envelhecimento das células no transcurso do armazenamento pode ser atribuído a
transtornos oxidativos da formação inadequada de espécies de oxigênios reativos (ROS) ou da
subsequente peroxidação de lipídeos da membrana. As mitocôndrias são o sitio principal da formação
de ROS intracelular, resultando numa interrupção do transporte de elétrons. Em consequência a
produção mitocondrial de ATP e a motilidade são afetadas. Adição de substâncias antioxidativas no
meio de conservação tende a reduzir o efeito nocivo de ROS.
Para diminuir os efeitos acima mencionados os diluentes usados para armazenamento mais
prolongado contem não apenas anti-oxidantes, mas também substâncias que podem reduzir o
choque hipotérmico quando o sêmen é refrigerado a temperaturas entre 10 e 15°C. Estes meios
facilitam o uso do sêmen liquido também em condições desfavoráveis de inverno europeu ou norteamericano, quando a temperatura ambiental desce abaixo de 15°C, dificultando a manutenção da
temperatura das doses durante o transporte noturno para as granjas. O que é assunto de pesquisas
atuais é procurar proteção do sêmen também contra temperaturas elevadas (até 25°C), que podem
surgir durante um transporte em condições tropicais por longas distancias.
Na presente palestra se pretende abordar as possibilidades experimentais de diminuir o efeito
negativo de mudanças de temperatura, especialmente abaixo de 16°C, e o efeito nocivo de diluições
de alto grau sobre a viabilidade dos espermatozóides.
Foi desenvolvido um meio contendo substâncias para proteger contra o choque térmico (cold
shock protector = CSP), facilitando a preservação a temperaturas entre 10 e 16 °C. Os resultados
espermatológicos (Figura 1 a,b) mostram um efeito significativamente positivo em relação à
motilidade e acrossomas alterados, em comparação ao diluente BTS, usado como meio de controle.
Interessante é que os valores obtidos à temperatura de 10°C com o diluente AndrostarPlus não
mostraram diferenças significativas em comparação àqueles do AndrostarPlus a 16°C.
Figura 1 a,b:
Motilidade progressiva de semen suino incubado em dois diluentes comerciais (BTS vs
AndrostarPlus) a 16°C e 10°C ate 7 dias (n= 10 ejaculados)
100
95
90
85
MOT progr. %
80
75
AstarPlus16°
BTS 16°
AstarPlus10°
BTS10°
70
65
60
55
50
45
40
d0
d3
d5
d7
AstarPlus16°
89,64
88,32
86,87
86,01
BTS 16°
89,33
86,74
82,35
80,47
AstarPlus10°
88,18
85,53
83,56
83,13
BTS10°
89,47
81,22
78,82
77,86
Storage time (days)
Acrossomas defeituosas (SA) de semen suino incubado em dois diluentes comerciais (BTS vs
AndrostarPlus) a 16°C e 10°C ate 7 dias (n= 10 ejaculados)
14
12
10
AstarPlus16°
BTS 16°
AstarPlus10°
BTS 10°
SA %
8
6
4
2
0
d0
d3
d5
d7
AstarPlus16°
1,5
2,8
4,4
5,2
BTS 16°
1,9
3,05
6,2
6,9
AstarPlus10°
1,75
4
5,9
7,5
BTS 10°
1,9
4,2
8,4
10,8
Storage time (days)
Várias propriedades do meio de suspensão como: pH, força iônica, tipo de íons, pressão
osmótica e conteúdo de substância anti-oxidantes importantes para manter a função espermática, e
assim a fertilidade. A composição especifica do novo diluente AndrostarPlus, obviamente, é
responsável pela redução significante do efeito de choque térmico. Os resultados levam à conclusão
de que o novo diluente pode absorver alterações de temperatura não previstas – desviando da
temperatura recomendada para o armazenamento e transporte a 16°C, bem como para períodos
mais prolongados de armazenamento até 7 dias, e compensando quedas de temperatura a valores
de 10°C. Por esta razão o diluente deveria ser especificamente útil para transporte de sêmen em
condições climáticas adversas.
Considerando a necessidade de aumentar a produtividade dos cachaços, especialmente no
caso de reprodutores melhoradores genéticos, as centrais se vêem obrigadas a diluir mais os
ejaculados do que o normalmente usado. Nestes casos se deve considerar que os SPZ são lesados
devido ao choque de diluição.
As células espermáticas são diluídas durante a ejaculação, pela secreção das glândulas
acessórias, resultando numa estimulação da motilidade. Para aumentar a sobrevivência in vitro é
necessário aplicar inibidores químicos ou uma redução de temperatura para diminuir o metabolismo,
o que é realizado através de diluição. Espermatozóides reagem à diluição mostrando uma atividade
aumentada, e em seguida perda de motilidade e aumento de danos de membrana. No caso de
diluições excessivas, especialmente com apenas eletrólitos, acontece uma perda considerável de
viabilidade celular. Apesar de não existirem explicações mais detalhadas para este chamado “efeito
de diluição”, parece que surgem danos celulares, que são consequências de perdas de componentes
intracelulares e/ou causa de eliminação de substâncias extracelulares protetoras do liquido seminal.
Existem resultados experimentais que indicam que a eliminação de plasma seminal através da
diluição progressiva pode ser compensada parcialmente pela adição de albumina e adição de
+
concentrações milimolares de K para manter a motilidade espermática. Supõe-se que as células
sofrem lesões da membrana, que podem ser corrigidas pela adição destas substâncias.
Uma série de experimentos foram conduzidos para estudar o efeito pronunciado de diluição,
diluindo amostras de sêmen até graus de 1:140, resultando em números de SPZ por dose de apenas
0,5; 1 ; 1,5 bilhões de células por 80 ml (Tabela 1).
Tabela 1: Graus de diluição e número de SPZ por dose correspondente (80 ml)
2,5 bilhões = 1:3 até 1:27
1,5 bilhões = 1:13 até 1:25
1,0 bilhão = 1:9,9 até 1:71
0,5 bilhões = 1:20 até 1:140
Diferentes ensaios mostraram claramente um efeito fortemente negativo sobre a motilidade e
morfologia acrossômica das células quando o sêmen foi diluído a 1,5; 1 ou 0,5 bilhões de células por
dose (80 ml), correspondendo a graus de diluição entre 1:20 até 1:80 e mais. Deve ser mencionado
que no trabalho de rotina nas centrais o sêmen é diluído normalmente entre 1:10 e 1:20 no máximo.
Como se pode ver nas Figuras 2, 3, 4, em que o sêmen diluído em alto grau foi armazenado entre 5 e
7 dias, a motilidade progressiva característica mais importante para a manutenção da viabilidade e
fertilidade celular, entra em declínio de graus de diluição à partir de 1,5 bilhões por dose no terceiro
dia de preservação, mostrando alguns ejaculados já imediatamente depois da diluição reações
significativamente negativas da motilidade progressiva. Em todos estes casos a queda de motilidade
foi acompanhada pelo aumento significativo da percentagem de acrossomas lesionados, indicando
severo prejuizo da membrana celular (dados não mostrados). Dependendo da qualidade do diluente
usado na experimentação, essa queda de motilidade e integridade das membranas foram
parcialmente compensadas por alguns meios de proteção, desenvolvidos especialmente para esta
finalidade.
A Figura 2 mostra os dados comparando os diluentes BTS e AndrostarPlus, indicando que a
diluição a 2,5 bilhões de células, como usual na rotina, não tem um efeito negativo sobre os
parâmetros, alem de indicar uma diferença significativa entre os dois diluente em favor do
AndrostarPlus. Entretanto uma diluição a 1 bilhão de células por dose, usado frequentemente em
algumas centrais, no caso de cachaços de alta genética, o declínio da qualidade é mais pronunciado.
Figura 2 a,b:
Efeito de alto grau de diluicao (2,5; 1 e 0,5 bilhoes / 80 ml) e meio de conservacao (BTS vs
AndrostarPlus) sobre a motilidade de semen suino, n=6, 16°C
100
90
80
MOT progr. %
70
BTS 2,5
AstarPlus 2,5
BTS 1
AstarPlus 1
BTS 0,5
AstarPlus0,5
60
50
40
30
20
10
0
BTS 2,5
d0
d3
d5
87,4
84,3
78,2
91
91,1
89
81,6
72,3
53,7
AstarPlus 1
87
82,7
70,2
BTS 0,5
61
50,2
24,5
77,8
63,9
41,4
AstarPlus 2,5
BTS 1
AstarPlus0,5
tempo de preservacao dias
Acrossomas defeituosos de semen suino incubado em dois diluentes comerciais (BTS vs
AndrostarPlus) a 16 ° e 10°C ate dia 5 (n = 10 ejaculados)
25
Acrossomas defeituosos %
20
BTS 2,5
AstarPlus 2,5
BTS 1
AstarPlus 1
BTS 0,5
AstarPlus0,5
15
10
5
0
d0
d3
d5
2,2
6,8
9,6
AstarPlus 2,5
2
2,8
4,2
BTS 1
3
11,3
14,5
BTS 2,5
2
5,4
6,8
BTS 0,5
2,8
17,7
20,7
AstarPlus0,5
1,7
8,4
10,3
AstarPlus 1
armazenamento dias
Outro experimento (Figura 3) aplicou a alta diluição em ejaculados diluídos com outros
diluentes comerciais de longa duração (AndrostarPlus vs Androhep). Os dados indicam que diluições
a partir de 1:20 (1 bilhão) resultam em declínio de motilidade e qualidade acrossomal, que até o dia 3
ainda é leve, mas já indicando uma reação das células ao estresse de diluição. Neste ensaio o
diluente Androhep mostrou melhor resistência frente ao choque de diluição, que provavelmente é
causada pelo conteúdo de albumina sérica neste meio. Este fato indica que a perda de conteúdo de
plasma seminal nas doses mais diluídas pode ser compensada parcialmente por ingredientes
específicos no meio de conservação.
Para continuar na pesquisa de efeitos nocivos de altos graus de diluição, foram comparados
os meios comerciais AndrohepPlus e AndrostarPlus, ambos meios de longa preservação com efeito
especifico de proteção contra temperaturas baixas (Figura 4). Neste ensaio os graus de diluição
variam entre 1:10 e 1:70 (2,5; 1,5 e 1 bilhão de células / 80 ml). Nas amostras diluídas a 2,5 e 1,5
bilhões de células, os dois diluentes mantiveram uma alta motilidade progressiva até o dia 7 de
preservação, indicando um efeito significativamente positivo em relação a compensação do efeito
nocivo de diluição. Nas amostras diluídas a 1 bilhão de células, o diluente AndrohepPlus mostrou
ainda uma boa proteção (motilidade progressiva acima de 70 %), enquanto que no meio
AndrostarPlus verificou-se um decréscimo de 50% de motilidade. Estes resultados evidenciam que
até o terceiro dia de preservação obviamente existe ainda uma suficiente proteção, que no caso do
diluente AndrohepPlus se estende até o dia 7, provavelmente devido a seu conteúdo de albumina
sérica, que obviamente confere um efeito compensatório significativo.
Figura 3 a.b:
Efeito de alto grau de diluicao (2,5; 1; 0,5 bilhoes / 80 ml) e meios de conservacao (AndrostarPlus
vs Androhep) sobre a motilidade de semen suino, n=6, 16°C
100
90
80
MOT progr. %
70
AstarPl 2,5
Ahep 2,5
AstarPl 1,0
Ahep 1,0
AstarPl 0,5
Ahep 0,5
60
50
40
30
20
10
0
d0
d3
AstarPl 2,5
85,2
82,9
d5
84
Ahep 2,5
88,5
85,4
87,2
AstarPl 1,0
79,8
62,5
64,5
Ahep 1,0
85,3
75,4
73,3
AstarPl 0,5
69,8
38
35,3
Ahep 0,5
80,4
59,5
54,7
tempo de armazenamento dias
Efeito de alto grau de diluicao (2,5; 1; 0,5 bilhoes / 80 ml) e meios de conservacao (AndrostarPlus
vs Androhep) sobre a morfologia acrossomica de semen suino , n=6, 16 °C
12
acrossomas defeituosos %
10
8
AstarPl 2,5
Ahep 2,5
AstarPl 1,0
Ahep 1,0
AstarPl 0,5
Ahep 0,5
6
4
2
0
d0
d3
d5
AstarPl 2,5
2,8
4,3
5,3
Ahep 2,5
1,8
3,1
4,2
AstarPl 1,0
4,2
5,8
7,9
Ahep 1,0
2,8
4,3
5,8
AstarPl 0,5
4,5
7,8
10,4
Ahep 0,5
3,3
6,7
7,8
armazenamento em dias
Figura 4:
Efeito de alto grau de diluicao (2,5; 1,5; 1 bilhoes /80 ml) e meio de conservacao (AndrohepPlus vs
AndrostarPlus) sobre a motilidade de semen suino, n=6, 16°C
100
90
80
MOT progr. %
70
AhepPl 2,5
AstarPl 2,5
AhepPl 1,5
AstarPl 1,5
AhepPl 1,0
AstarPl 1,0
60
50
40
30
20
10
0
d0
d3
d5
d7
AhepPl 2,5
91
90,8
89,9
90,3
AstarPl 2,5
89,2
89,2
88
87,8
AhepPl 1,5
91,2
88,9
82,5
86,8
AstarPl 1,5
88,4
84,2
66
79,5
AhepPl 1,0
89,9
84,6
71,6
76,2
AstarPl 1,0
85,7
75,2
51,9
48,6
armazenamento dias
Os dados de acrossomas alterados acompanham o transcurso da motilidade, por isto não são
mostrados. Os experimentos (não mostrados por ejaculados individuais) indicam claramente, que
ejaculados ricos em SPZ (e relativamente pobres em plasma seminal) reagem muito mais fortemente
a altos graus de diluição do que ejaculados pobres em SPZ (isto é, ricos em plasma seminal), pois
nos ejaculados com muitos SPZ se aplica uma taxa de diluição mais alta. Dependendo destas
características dos ejaculados resultam diferentes graus de diluição, pois os ejaculados são diluídos
visando um numero fixo de SPZ na dose de IA, como é uso na pratica.
Para investigar o efeito positivo da albumina sérica, anteriormente documentado, foi realizado
um ensaio na base de BTS, aplicando BSA usando três graus de diluição, anteriormente já
estudados. Os resultados demonstraram claramente a hipótese de proteção da albumina contra o
choque de diluição, apesar de que a proteção completa somente está assegurada quando o sêmen é
diluído em forma convencional (2,5 bilhões /80 ml) (Figura 5).
Figura 5:
Efeito de BSA (BTS +) vs BTS e grau de diluicao (1; 1,5; 2,5 bilhoes /80 ml) sobre a motilidade
progressiva de semen sunio, n=6, 16°C
100
90
motilidade progressiva %
80
70
BTS+ 1 bilh.
BTS 1 bilh.
BTS+ 1,5bilh
BTS 1,5 bilh
BTS+ 2,5 bilh
BTS 2,5 bilh.
60
50
40
30
20
10
0
d0
d3
BTS+ 1 bilh.
83,47
82,07
d5
72
BTS 1 bilh.
78,13
70,1
63,57
BTS+ 1,5bilh
88,03
83
77,23
BTS 1,5 bilh
82,6
76,5
67,5
BTS+ 2,5 bilh
92,67
89,56
89,13
BTS 2,5 bilh.
89
87,86
86,27
armazenamento em dias
Finalmente, foi lógico investigar o efeito hipoteticamente protetor do plasma seminal. Numa
serie de experimentos, somente em sua síntese aqui apresentados, foram usados ejaculados
centrifugados (livre de plasma seminal), e o plasma seminal separado adicionado posteriormente
numa concentração de 10 e 20 % e comparado com as amostras preservadas sem plasma seminal. A
Figura 6 mostra os resultados de diferentes experimentos, em conjunto, para evidenciar mais
claramente esses efeitos, porem os dados não puderam ser calculados estatisticamente por falta de
dados em split sample.
Os efeitos negativos de diluição, verificável após diluições a 1 e 0,5 bilhões de
espermatozóides por dose, foram claramente confirmados. Os diluentes usados mostram efeitos
protetores distintos, assinalando seus conteúdos diferentes de proteção (BTS, AndrostarPlus,
AndrohepPlus). Adição de plasma seminal de 10 e 20 % compensa amplamente o efeito negativo de
diluição. Tem-se que 20 % de plasma seminal tem efeito melhor do que 10 %: O efeito protetor é mais
verificável nos diluentes AndrostarPlus e AndrohepPlus do que no diluente BTS (não contém
substâncias especificas protetoras). Os valores para acrossomas alterados correspondem
amplamente aos valores de motilidade, porem não são mostrados aqui.
Figura 6:
Efeito de plasma seminal (10, 20 %) e dif. meios de preservacao (BTS,AstarPlus, AhepPlus) sobre a
motilidade de semen altamente diluido (1; 0,5 bul).
100
90
BTS 1,0
BTS 1,0 10
BTS 1,0 20
BTS 0,5 0
BTS 0,5 10
As 0,5 20
AstPl 1,0
AstPl 1 10
AstPl 1 20
AstPl 0,5
AstPl 0,5 10
AstPl 0,5 20
AhepPl 1
AhepPl 1 10
AhepPl 1 20
AhepPl0,5
AhepPl0,5 10
AhepPl0,5 20
80
MOT progr %
70
60
50
40
30
20
10
0
d5
Num ensaio adicional final (Figura 7 a,b) foi investigado o efeito do plasma seminal usando os
meios Androhep e AndrohepPlus, que se distinguem pelo conteúdo da substância de choque
térmico(CSP) no AndrohepPlus. Os resultados na Figura 6 foram confirmados em forma geral. O meio
AndrohepPlus se estacou por dois aspectos: primeiro mostrou apenas uma tendência não significativa
da diferença entre os valores de 1 e 0,5 bilhão /dose com adição de plasma seminal (10, 20 %),
segundo a diferença entre as amostras sem plasma seminal foi levemente significativa, indicando um
efeito especifico adicional e positivo em comparação ao dados do meio Androhep, nos quais os
valores sem e com plasma seminal se distinguiram mais claramente.
Figura 7 a, b:
Efeito de Plasma
Seminal
(10/ 20%)
sobre
a motilidade
semen
suino
V 06, 05
2008 MOT
progr:
Zusatz
von 10 / de
20%
SPl bei
altamente diluido
0,51,0;
bilhoes)
em Androhep
e vs
AndrohepPlus,
n=6
Verd (1;
Rate
0,5 Mrd.;
Androhep
AndrohepPlus
Androhep
100
MOT progr Ahep 1
AndrohepPlus
1 Mrd.
0,5 Mrd.
1 Mrd.
MOT progr Ahep10 1
0,5 Mrd.
MOT progr Ahep20 1
90
MOT progr Ahep 0,5
MOT progr Ahep 0,5 10
80
MOT progr Ahep 0,5 20
MOT progr AhepPl 1
70
MOT progr AhepPl 1 10
MOT Porgfr %
MOT progr AhepPl 1 20
60
MOT progr AhepPl0,5
MOT progr AhepPl0,5 10
50
MOT progr AhepPl0,5 20
40
30
0
10
20
0
10
20
0
10
20
0
10
20
SPlasma %
20
10
0
d5
Efeito
seminal
(10 / 20%)
e alto
de hohe
diluicao
(1; 0,5
sobre
a
V 06, de
05 plasma
2008 GAR
%: Zusatz
von 10
/ 20grau
% SPl,
Verd.
1,0;bilhoes)
0,5 Mrd.;
Androhep
vs
integridade acrossomal de semen suino
diluido em Androhep e AndrohepPlus, n=6
AndrohepPlus
Androhep
16
1 Mrd.
AndrohepPlus
0,5 Mrd.
1 Mrd.
0,5 Mrd.
14
GAR % Ahep 1
12
GAR % Ahep10 1
GAR % Ahep20 1
GAR % Ahep 0,5
GAR %
10
GAR % Ahep 0,5 10
GAR % Ahep 0,5 20
8
GAR % AhepPl 1
GAR % AhepPl 1 10
6
GAR % AhepPl 1 20
GAR % AhepPl0,5
GAR % AhepPl0,5 10
4
2
GAR % AhepPl0,5 20
0
10
20
0
10
20
0
10
20
0
10
20
SPlasma %
0
d5
Concluindo, vale ressaltar que na preservação de sêmen liquido suíno ainda existem
problemas relacionados com a alta sensibilidade dos espermatozóides ao choque térmico(descida de
temperatura abaixo de 16 °C e ao efeito nocivo de altos graus de diluição (mais de 1:20 ou seja
abaixo de 1,5 bilhões de SPZ / dose de 80 ml). Esta problemática se deve a características
especificas da membrana celular do espermatozóide suíno, que apresenta alterações de fluidez da
membrana quando a temperatura cai; em relação a sensibilidade de diluição tem-se uma eliminação
gradual de efeitos protetores específicos do plasma seminal, que durante a preservação são
eliminados gradualmente devido aos graus de diluições diferentes.
Como os resultados deste trabalho mostram, estes dois efeitos nocivos mencionados podem
ser compensados através da aplicação de meios de preservação específicos, que em sua
composição contem substâncias protetoras contra o choque térmico e/ou alto grau de diluição. Como
quase sempre numa natureza altamente complexa, estes efeitos protetores são significativos, mas
não capazes de eliminar completamente as causas detrimentais provocadas pelo manuseio artificial
durante a preservação do sêmen suíno liquido para a inseminação artificial.