Volume 4 Número 1 - abctp

Transcrição

ISSN 1808-9909
Volume 4, Número 1, 2008
PLANT CELLCULTURE
&
MICROPROPAGATION
Cultura de Células
&
Micropropagação de Plantas
Publicação Científica da Associação Brasileira
de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 4, n. 1, p. 1-54, 2008
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation , editada semestralmente pela Editora da
Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos
de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600
exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇ‹O BRASILEIRA DE CULTURA DE
TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.
Para se associar à ABCTP consulte o site: <www.abctp.ufla.br>
PERMUTA
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation deseja fazer permuta com revistas de áreas afins.
ABCTP
Universidade Federal de Lavras Departamento de Biologia
Setor de Fisiologia Vegetal Caixa Postal: 3037 Lavras MG CEP 37200-000
E-mail: [email protected]
FICHA CATALOGR˘FICA
Diretoria
Presidente Renato Paiva UFLA
Secretário Moacir Pasqual UFLA
Secretário Adjunto Antônio Carlos Torres EMBRAPA Hortaliças
Tesoureiro Guilherme Augusto Canella Gomes Benger do Brasil
Comissão Editorial
Editor Chefe
Renato Paiva UFLA
Conselho Editorial
Antônio Carlos Torres EMBRAPA Hortaliças
Moacir Pasqual UFLA
Renato Paiva UFLA
Secretaria
Daiane Peixoto Vargas UFLA
Fernanda Carlota Nery UFLA
Leticia Caravita Abbade UFLA
Nomenclatura Científica
Manuel Losada Gavilanes UFLA
Revisão de Português
Jane Cherem
Revisão de Inglês
Renato Paiva UFLA
Revisão de Referências Bibliográficas
Márcio Barbosa de Assis
Editoração Eletrônica
Luciana Carvalho Costa Editora UFLA
Christyane Aparecida Caetano Editora UFLA
Isabel Cristina de Oliveira Editora UFLA
Editores Associados
Ricardo Tadeu de Faria UEL
Eugenia Jaciara Bolacel Braga UFPEL
Consultoria Científica(Vol. 4, N.1)
Alexandre Hoffmann EMBRAPA
Antônio da Silva Souza EMBRAPA
Arie Fitzgerald Blank UFS
Giulio Cesare Stancato IAC
Janay Almeida Santos-Serejo EMBRAPA
José Eduardo Brasil Pereira Pinto UFLA
José Magno Queiroz Luz UFU
Maria de FátimaArrigoni-Blank UFS
Maurício Reginaldo Alves dos Santos EMBRAPA
RicardoAntônio Ayub UEPG
Ricardo Tadeu de Faria UEL
Vivian Loges UFRPE
ISSN 1808-9909
Plant Cell Culture & Micropropagation
CONTEÐDO
Micropropagação de abacaxi ornamental (Ananas comosus var. ananassoides) por estiolamento e
regeneração de plântulas.
Micropropagation of ornamental pineapple (Ananas comosus var. ananassoides) by plantlets etiolation
and regeneration.
Gabrielen de Maria Gomes Dias, Ana Cristina Portugal Pinto de Carvalho, Marcos Vinícius Marques
Pinheiro, João Paulo Saraiva Morais...................................................................................................................
1
Micropropagação, aclimatização e composição química do óleo essencial de Hortelã Japonesa
(Mentha Arvensis L.).
Micropropagation, acclimatization and chemical composition of the essential oil of japanese mint
(Mentha Arvensis L.).
Valéria Oliveira Fonseca, Andrea Santos da Costa, Maria de Fátima Arrigoni-Blank, Arie Fitzgerald
Blank, Péricles Barreto Alves, Túlio Henrique Barreto de Santana.............................................................
8
Micropropagação de Anthurium plowmannii Croat.
Micropropagation of Anthurium plowmannii Croat.
Yara de Oliveira Schiavinato, Thiago Nogueira. Lucon, Antonio Fernando Caetano Tombolato, Wilson
Barbosa, Renato Ferraz de Arruda Veiga.....................................................................................................
15
Indução in vitro de brotos em Paricá (Schizolobium parahyba var. amazonicum).
In vitro shoot induction in parica (Schizolobium parahyba var. amazonicum).
Iulla Naiff Rabelo de Souza Reis, Osmar Alves Lameira, Iracema Maria Castro Coimbra Cordeiro, Allan
Guerreiro Carneiro, Silvaney Fonseca Ferreira.............................................................................................
21
Aperfeiçoamento do teste com coleóptilo de Trigo (Triticum aestivum L. ) para a detecção de
reguladores vegetais.
Improvement of an assay with wheat coleoptile (Triticum aestivum L.) to detect plant regulators.
Daniel Diego Costa Carvalho, Denilson Ferreira Oliveira, Moacir Pasqual.................................................
28
Sucrose on in vitro cultures of Calendula officinalis L.
Sacarose no Cultivo in vitro de Calendula Officinalis L.
Cristiane Pimentel Victório, Alice Sata, Maria Apparecida Esquibel, Celso Luiz Salgueiro Lage..............
34
Concentrações e composição do meio de Murashige & Skoog na micropropagação da Menta.
Concentrations and composition of the Murashige & Skoog media in the micropropagation of the
Mentha sp.
Solange Machado Tonietto, Clarissa Belotto Perini, Adilson Tonietto........................................................
42
COMUNICAÇ‹O CIENT¸FICA
Multiplicação e enraizamento in vitro do mandacaru (Cereus jamacaru P. DC.).
In vitro multiplication and rooting of mandacaru (Cereus jamacaru P. DC.).
Alexandre Bosco de Oliveira, Josefa Diva Nogueira Diniz, Jacqueline Leite Almeida...............................
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.4, n.1, p. 1-54, 2008
48
MICROPROPAGAÇ‹O
DE
ABACAXI
Micropropagação
de abacaxi
ornamental...ORNAMENTAL
(Ananas comosus var. ananassoides) POR ESTIOLAMENTO
E REGENERAÇ‹O DE PL˜NTULAS
1
MICROPROPAGATION OF ORNAMENTAL PINEAPPLE
(Ananas comosus var. ananassoides) BY PLANTLETS ETIOLATION AND REGENERATION
GABRIELEN DE MARIA GOMES DIAS1, ANA CRISTINA PORTUGAL PINTO DE CARVALHO2,
MARCOS VIN¸CIUS MARQUES PINHEIRO1, JO‹O PAULO SARAIVA MORAIS3
Graduandos emAgronomia, bolsistas do PIBIC/CNPq Laboratório de Cultura de Tecidos e Genética Vegetal Embrapa Agroindústria
Tropical/EMBRAPA Universidade Federal do Ceará/UFC Cx. P. 3761 60511-110 Fortaleza, CE [email protected];
[email protected]
2
Bióloga, Doutora, Pesquisadora III Centro Nacional de Pesquisa Agroindústria Tropical/CNPAT Embrapa Agroindústria Tropical/
EMBRAPA Cx. P. 3761 60511-110 Fortaleza, CE [email protected]
3
Farmacêutica, Mestre Analista B Centro Nacional de Pesquisa Agroindústria Tropical/CNPAT Embrapa Agroindústria
Tropical/EMBRAPA Cx. P. 3761 60511-110 Fortaleza, CE - [email protected]
1
RESUMO
Objetivou-se neste trabalho, avaliar a multiplicação in
vitro de segmentos nodais estiolados para produção de mudas
de abacaxi ornamental, Ananas comosus (L.) Merr. var.
ananassoides (Baker) Coppens e F. Leal. Talos foram inoculados
nos meios de cultura: MS sem regulador de crescimento; MS +
10 øM de ácido indolbutírico (AIB); MS + 10 øM de ácido
naftalenoacético (ANA) e MS + 10 øM de ácido indolacético
(AIA) e mantidos no escuro, a 25 µ 2ÀC. Aos 60 dias após a
inoculação, avaliou-se número de brotos/talo, número de nós/
broto, comprimento de brotos, distância entre os nós e número
total de nós/talo. Não houve diferença estatística para todas as
variáveis estudadas. O uso de meio MS + 10 øM de ANA
promoveu os maiores valores numéricos para número de brotos
(3,42) e número total de nós/explante (11,25). Para a regeneração
de plântulas, foram inoculados segmentos nodais, oriundos de
talos estiolados in vitro, contendo dois nós, nos meios: MS sem
regulador de crescimento; MS + 4,44 ø M de 6benzilaminopurina (BAP); MS + 8,88 øM de BAP e MS +
13,32 øM de BAP. As culturas foram incubadas sob fotoperíodo
de 16 horas, a 25 µ 2oC. Aos 30, 45 e 60 dias de cultivo, o
número de plântulas regeneradas por nó não diferiu
estatisticamente nos meios de cultura testados. Aos 60 dias, os
meios de cultura contendo 4,44 ø M e 8,88 ø M de BAP
induziram os maiores valores para o número de plântulas
regeneradas/nó, 1,34 e 1,33, respectivamente.
Termos para indexação: Ananas comosus, Bromeliaceae, cultura
de tecidos, floricultura.
ABSTRACT
The objective of this work was to evaluate the in vitro
multiplication of etiolated nodal segments for Ananas comosus
(L.) Merr. var. ananassoides (Baker) Coppens e F. Leal plantlets
production. Stems were inoculated in the following media: MS
without growth regulator; MS + 10 mM indolbutiric acid (IBA);
MS + 10 mM naphtalenacetic acid (NAA); MS + 10 mM
indolacetic acid (IAA), and stored in darkness at 25 µ 2ÀC. At
60 days after inoculation, the number of shoot/stem; number of
nodes/shoot; shoot length, internode length and total number of
nodes/stem were evaluated. No statistical differences were
observed for all the analyzed parameters. The use of MS + 10
mM NAA promoted the highest (3.42) shoot number and total
number of nodes/shoot (11.25). For plantlet regeneration, nodal
segments from in vitro etiolated stems with two nodes were
inoculated in MS without growth regulator; MS + 4.44 mM 6benzylaminopurine (BA); MS + 8.88 mM BA and MS + 13.32
mM BA. The flasks were incubated under photoperiod of 16
hours, at 25 µ 2ÀC. After 30, 45 and 60 days of culture, no
statistical significant differences were observed. After 60 days
of culture, the use of 4.44 øM and 8.88 øM BA induced the
highest values of number of regenerated plantlets/node, 1.34
and 1.33, respectively.
Index terms: Ananas comosus, Bromeliaceae, tissue culture,
floriculture.
INTRODUÇ‹O
No Ceará, o cultivo de abacaxi ornamental ocupa
uma área de aproximadamente 30 ha, concentrando-se na
Região Metropolitana, pelo clima favorável, proximidade
de Fortaleza e facilidade de escoamento da produção, por
porto e/ou por aeroporto (SEAGRI, 2006).
De acordo com Baima (2004), em 2003, as
exportações de abacaxi ornamental, no Ceará, alcançaram
US$ 298,9 mil, aumentando 38% em 2004, atingindo US$
412,9 mil. Esses valores representaram 29% do total
(Recebido em 14 de fevereiro de 2007 e aprovado em 10 de abril de 2008)
2
DIAS, G. DE M. G.. et al.
exportado do setor flores e plantas ornamentais. As
variedades mais comercializadas foram: Ananas comosus
var. erectifolius (L.B. Sm.) Coppens e F. Leal., A. comosus
var. bracteatus (Lindl.) Coppens e F. Leal e A. comosus var.
ananassoides, sendo os principais países importadores
Holanda, Estados Unidos, Portugal e Alemanha.
Tradicionalmente, os plantios de abacaxi ornamental
têm sido feitos com mudas propagadas vegetativamente,
retiradas de diferentes partes da planta: coroa, filhote e
rebentão (BORGES et al., 2003). Esta forma de propagação
apresenta como desvantagens lentidão (DEWALD et al.,
1988), favorecimento à disseminação de pragas e doenças,
como o patógeno causador da fusariose (CABRAL et al.,
1985) e desuniformidade do material propagativo em
tamanho e vigor (GARITA & GŁMEZ, 2000). A
micropropagação apresenta-se como uma alternativa viável
de propagação vegetativa. Permite obter maior taxa de
multiplicação, excelente qualidade fitossanitária e
estabilidade genética das mudas obtidas, material em
quantidade suficiente em menor período de tempo,
independente da época do ano (CORREIA et al., 1999) e
ainda plantas com alta uniformidade em peso e tamanho
(GARITA & GOMÉZ, 2000).
O principal método utilizado in vitro, atualmente,
consiste na proliferação de gemas axilares (CORREIA et
al., 1999; BORGES et al., 2003; COSTA & ZAFFARI, 2005).
Nesse sistema, é comum ocorrerem simultaneamente a
proliferação de gemas axilares e a formação de gemas
adventícias na base do explante. Esses dois fenômenos
dificilmente podem ser separados, pois ambos se devem
aos efeitos da citocinina presente no meio de cultura sobre
todo o tecido (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Entretanto, esses autores ressaltam que a utilização de
gemas adventícias é desejável como sistema, desde que a
formação do calo seja mínima ou nula.
A micropropagação de abacaxizeiro comestível (A.
comosus var. comosus (L.) Merr.), por meio de segmentos
nodais estiolados foi relatada, pela primeira vez, por Kiss
et al. (1995). Posteriormente, vários trabalhos foram
desenvolvidos, no Brasil, tais como os de Sá et al., (2000),
Barboza & Caldas (2001), Pereira et al. (2001), Praxedes et
al. (2001) e Moreira et al. (2003), e com abacaxi ornamental
por Carvalho et al. (2005). Esse método, comparado com a
propagação por gemas axilares, tem a vantagem de evitar
lesões na zona de regeneração, minimizando a formação
de calo, e consequentemente proporcionando baixos níveis
de variação somaclonal (KISS et al., 1995).
Objetivou-se neste trabalho, estabelecer um
protocolo para micropropagação de abacaxi ornamental A.
comosus (L.) Merr. var. ananassoides (Baker) Coppens e F.
Leal, induzindo o estiolamento de segmentos nodais e a
posterior regeneração de plântula.
MATERIALE MÉTODOS
O trabalho foi realizado no Laboratório de Cultura
de Tecidos e Genética Vegetal da Embrapa Agroindústria
Tropical (CNPAT), em Fortaleza, Ceará, e desenvolvido de
abril a agosto de 2005.
Estiolamento
Os explantes utilizados foram plântulas de A.
comosus var. ananassoides, estabelecidas in vitro com
altura de 2 a 3 cm, que foram totalmente desfolhadas,
deixando-se apenas o talo.
O meio de cultura utilizado foi o MS (MURASHIGE
& SKOOG, 1962), suplementado com 30 g L-1 de sacarose e
solidificado com ágar a 5,5 g L-1. O pH foi ajustado para 5,8
antes da autoclavagem, que foi realizada a 121ÀC, por 15
minutos.
Em capela de fluxo laminar, os talos foram inoculados
em tubos de ensaio, contendo 10 mL de meio, e mantidos
em sala de crescimento, a 25 µ 2ÀC, no escuro por 60 dias.
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, constituído de quatro tratamentos e cinco
repetições, e a unidade experimental por seis explantes. Foram
testados os seguintes tratamentos: T1 - MS sem regulador de
crescimento (MS0); T2 - MS + 10 øM de ácido indolbutírico
(AIB); T3 - MS + 10 øM de ácido naftalenoacético (ANA); e
T4 - MS + 10 øM de ácido indolacético (AIA).
As avaliações ocorreram aos 60 dias, observandose o número de brotos estiolados por talo; número de nós
por broto; comprimento de brotos e distância entre os nós,
Micropropagação de abacaxi ornamental...
obtida através da divisão do comprimento dos brotos pelo
número de nós por broto estiolado. O número total de nós
por talo foi obtido a partir da multiplicação do número de
brotos estiolados/talo pelo número de nós/broto estiolado.
Os dados foram submetidos à análise de variância
e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, a 5 %
de probabilidade. Os dados referentes ao número de brotos
por talo e número de nós por broto estiolado foram
transformados para raiz de (x + 0,5).
3
brotos nos talos, impossibilitando uma contagem precisa
do número deles, além da expressiva presença de calos
nos explantes. Por essas razões, o tratamento foi retirado
da análise estatística.
Não foram identificadas diferenças estatísticas
para todas as características avaliadas (Tabela 1). Para o
número médio de brotos estiolados produzidos por talo,
tais resultados confirmam os obtidos por Carvalho et al.
(2005) para o abacaxi ornamental Ananas comosus var.
bracteatus e por Barboza & Caldas (2001) para o abacaxi
Regeneração
Para a regeneração de plântulas foram utilizados,
como explantes, brotos estiolados in vitro, aos 60 dias
de cultivo no meio MS acrescido com 10 øM de ANA. A
escolha desses brotos foi em função do maior número
total de nós formados nesse meio de cultura. Os brotos
estiolados foram seccionados em segmentos contendo
apenas dois nós, colocados horizontalmente, em frascos
com capacidade de 220 mL, contendo 30 mL de meio de
cultura.
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, constituído de quatro tratamentos e oito
repetições, e cada unidade experimental por um frasco
contendo 4 segmentos. Utilizaram-se os seguintes
tratamentos: T1 MS0; T2 - MS + 4,44 ø M de 6benzilaminopurina (BAP); T3 - MS + 8,88 øM de BAP; e
T4 MS + 13,32 øM de BAP.As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25 µ 2ÀC, foto período
de 16 horas e intensidade luminosa de 30 ømol m-2 s-1.
Aos 30, 45 e 60 dias procedeu-se à contagem do
número de plântulas regeneradas/nó.
e as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5 % de
probabilidade. Os dados referentes a essa variável foram
transformados para raiz de (x + 0,5).
RESULTADOS E DISCUSS‹O
Estiolamento
comestível, Ananas comosus var. comosus (híbrido
PExSC-52), que também não registraram diferenças
significativas para o número de brotos formados por
explante, nos diferentes tratamentos, aos 60 e 35 dias no
escuro, respectivamente. Sá et al. (2000) propagaram, por
meio de segmentos estiolados, abacaxizeiro comestível,
registrando as maiores médias para o número de brotos
(6,0) no meio contendo 10 øM de ANA e de BAP, aos 45
dias no escuro. O maior número de brotos, registrado por
Carvalho et al. (2005) e Barboza & Caldas (2001), foi de
1,96 e 1,60 por explante, respectivamente. Neste trabalho,
o maior valor alcançado para essa característica foi 3,42,
no meio com 10 øM de ANA , aos 60 dias de incubação
no escuro.
O número médio de nós obtido por broto variou
de 2,90 a 3,97, sendo esse último o valor registrado no
tratamento T1 (Tabela 1). Para essa mesma característica,
Carvalho et al. (2005) também obtiveram o maior valor
(7,75) nesse meio de cultura. O número de nós/broto
estiolado registrado, também aos 60 dias, foi 7,60, por
Barboza & Caldas (2001) no mesmo meio de cultura. As
diferenças em metabolismo e estabilidade das auxinas
podem contribuir para diferentes respostas in vitro. A
instabilidade do AIA, aliada à sua inativação ou
destruição metabólica nas células, pode estar relacionada
com o crescimento mais lento dos explantes (BARBOZA
& CALDAS, 2001), provavelmente acarretando a
Aos 30 dias, observou-se que, nos explantes
mantidos no tratamento T4, ocorreu intensa indução de
formação de brotações múltiplas, quando se utilizou essa
auxina (Figura 1D).
4
TABELA 1 Número de brotos estiolados por talo, número de nós por broto, comprimento de brotos, distância entre os
nós e número total de nós por talo de abacaxi ornamental Ananas comosus var. ananassoides, em diferentes tratamentos,
após 60 dias no escuro(1). Fortaleza (CE), Embrapa Agroindústria Tropical, 2005.
Características avaliadas
(1)
Meio de cultura
Número de
brotos/
talo
Número de
nós /broto
Comprimento
de brotos (cm)
Distância entre
os nós (cm)
Número total
de nós/talo
MS sem regulador
de crescimento
2,08 a
3,97 a
3,52 a
0,84 a
7,72 a
MS + AIB a 10 M
2,53 a
2,90 a
2,39 a
0,72 a
6,83 a
MS + ANA a 10 M
3,42 a
3,51 a
2,67 a
0,73 a
11,25 a
CV %
24,28
19,27
63,52
28,21
22,41
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a nível de 5% de probabilidade.
FIGURA 1 Brotos de abacaxi ornamental Ananas comosus var. ananassoides estiolados nos meios: MS sem regulador
de crescimento (A), MS com 10 M de AIB (B), MS com 10 M de ANA (C), MS com 10 M de AIA (D), após 60 dias
no escuro. Fortaleza (CE), Embrapa Agroindústria Tropical, 2005. Barras: 2,5 cm.
O comprimento dos brotos estiolados é uma variável
importante, pois está diretamente relacionada com o
número de nós que serão recuperados em novas brotações,
quando colocados em condições de luz. Com relação a
essa característica, numericamente, o valor registrado no
MS0 (Figura 1A) foi superior aos registrados nos meios
contendo auxina (Tabela 1 e Figuras 1B, 1C e 1D).
Entretanto, Carvalho et al. (2005), utilizando esse mesmo
meio de cultura, para abacaxi ornamental, registraram brotos
que atingiram 6,19 cm. Já Kiss et al. (1995), Barboza &
Caldas (2001), Praxedes et al. (2001) e Moreira et al. (2003),
utilizando o mesmo meio de cultura, para abacaxi
comestível, registraram brotos que atingiram em média
7,74 cm, 4,8 cm, 2,28 cm e 2,60 cm de comprimento,
respectivamente, após cerca de 35 dias de incubação in
vitro, no escuro. Sá et al. (2000) registraram as maiores
médias para o tamanho dos segmentos estiolados, 4,3
cm, 45 dias após a inoculação dos explantes no meio
adicionado de 10øM de ANA e de BAP. O comprimento
dos brotos estiolados, no meio MS sem fitorreguladores,
aos 60 dias no escuro, alcançou 3,52 cm. Praxedes et al.
(2000) ressaltam que o estiolamento in vitro do
abacaxizeiro cv. Pérola pode ser obtido sem aplicação
exógena de ANA e AIA.
5
Os brotos estiolados apresentaram coloração
Embora o número total de nós por talo ter sido
branca, indicando ausência ou reduzida atividade
estatisticamente igual em todos os tratamentos estudados,
fotossintética dos explantes. Além disso, as folhas tinham
o maior valor, 11,25, foi registrado no meio com ANA.
coloração branca, sem a expansão dos limbos (Figura 1).
Barboza et al. (2001) conseguiram, em média, 17,0 nós/
Barboza & Caldas (2001) relataram que, no escuro, os
explante, aos 60 dias no escuro, no meio contendo essa
entrenós do talo da plântula do abacaxizeiro comestível se
mesma auxina. Os resultados foram superiores aos
alongaram, separando os nós que, normalmente, em
registrados por Carvalho et al. (2005), 6,17, em razão,
presença de luz, permanecem próximos uns aos outros. Os
provavelmente da variedade estudada.
autores ressaltam que há muito tempo esse comportamento
tem sido observado em plantas crescendo no escuro, e
que para fins de micropropagação, a separação dos nós
facilita o desenvolvimento de gemas axilares e a
manipulação de plântulas regeneradas. O mesmo
comportamento foi observado para a variedade de abacaxi
ornamental estudada, bem como por Carvalho et al. (2005)
para a variedade bracteatus.
A distância entre os nós foi estatisticamente igual
em todos os tratamentos (Tabela 1). Entretanto, Carvalho
et al. (2005) constataram que os valores obtidos nos meios
adicionados com AIB (1,06 cm) e com AIA (0,89 cm) e no
MS0 (0,80 cm) foram equivalentes entre si e superiores aos
obtidos no meio contendo ANA (0,50 cm). Neste trabalho,
o maior valor registrado para essa característica, foi 0,84
cm, no meio MS0.
Regeneração
Nas três avaliações efetuadas, não houve diferença
no número de plântulas regeneradas por nó, entre os
tratamentos testados (Tabela 2 e Figura 2). Aos 30 dias, o
menor (0,17) e o maior (0,38) valores numéricos foram
registrados, respectivamente, no meio MS0 e no meio
acrescido de BAP a 4,44 øM. Resultados semelhantes
foram obtidos por Carvalho et al. (2005), aos 30 dias, sendo
1,01, o maior valor registrado no meio contendo 8,88 mM
de BAP. Aos 45 e 60 dias, os maiores valores numéricos
foram constatados nos meios contendo 8,88 øM (0,94) e
4,44 øM de BAP (1,34), respectivamente. Carvalho et al.
(2005) obtiveram 1,33 e 1,13 plântulas regeneradas/nó, aos
45 dias no meio contendo 8,88 øM e aos 60 dias, no meio
com 4,44 øM de BAP, respectivamente.
TABELA 2 Número de plântulas regeneradas por nó, em diferentes meios de cultura, a partir de segmento estiolado,
do abacaxi ornamental Ananas comosus var. ananassoides, aos 30, 45 e 60 dias após inoculação nos meios de cultura
(1)
. Fortaleza (CE), Embrapa Agroindústria Tropical, 2005.
Meio de cultura
Período de cultivo
30 dias
45 dias
60 dias
MS sem regulador de
crescimento
0,17 a
0,31 a
0,44 a
MS + BAP a 4,44 M
0,38 a
0,84 a
1,34 a
MS + BAP a 8,88 M
0,25 a
0,94 a
1,33 a
MS + BAP a 13,32 M
0,21 a
0,77 a
1,09 a
CV %
17,35
24,76
26,22
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a nível de 5% de
probabilidade.
(1)
6
FIGURA 2 Plântulas de abacaxi ornamental Ananas comosus var. ananassoides regeneradas em meio MS sem
regulador de crescimento (A), MS com 4,44 M de BAP (B), MS com 8,88 M de BAP (C), MS com 13,32 M de BAP (D),
após 60 dias de inoculação. Fortaleza (CE), Embrapa Agroindústria Tropical, 2005. Barra: 1,5 cm.
Considerando-se que, 60 dias após a inoculação dos
explantes em meio MS adicionado de 10 øM de ANA, foram
obtidos, em média, 11,25 nós por explante, e que esses nós,
cultivados em meio MS contendo 8,88 øM de BAP, aos 45
dias regeneraram, em média, 0,94 plântulas, pode-se estimar
uma taxa de multiplicação de 10,58 ao final de 105 dias.
Entretanto, utilizando-se o meio contendo 4,44 øM de BAP,
a taxa de multiplicação seria 15,08, ao final de 120 dias. Tendo
em vista que as taxas de multiplicação estimadas por Carvalho
et al. (2005), para a variedade de abacaxi ornamental
bracteatus, nas mesmas condições de cultivo, foram de 51,90
e 72,26, respectivamente, verifica-se que a variedade
estudada apresenta uma taxa de propagação bem inferior.
CONCLUS›ES
O método de estiolamento de segmentos nodais e
regeneração de plântulas é viável para a multiplicação in
vitro do abacaxi ornamental A. comosus var. ananassoides.
O meio MS, adicionado da auxina AIA, não foi
adequado para indução in vitro de estiolamento de brotos
em A. comosus var. ananassoides.
O meio MS + 10 øM de ANA para o estiolamento de
brotos, seguido de MS + BAP de 4,44 øM a 8,88 øM para
a regeneração de plântulas, são os mais adequados para a
multiplicação in vitro do abacaxi ornamental Ananas
comosus var. ananassoides, usando segmentos nodais
estiolados.
AGRADECIMENTOS
Ao ETENE/FUNDECI/Banco do Nordeste do Brasil
S/A, pelo financiamento da pesquisa e ao CNPq, pela
concessão de bolsas.
RFER¯NCIAS BIBLIOGR˘FICAS
BAIMA, S. Sistema de Informação GerencialAgrícola SIGA
da Secretaria de Agricultura e Pecuária do Ceará SEAGRI
[mensagem recebida] por <[email protected]>
em 20 fev. 2004.
BARBOZA, S. B. S. C.; CALDAS, L. S. Estiolamento e
regeneração na multiplicação in vitro de abacaxizeiro
híbrido PE x SC-52. Pesquisa Agropecuária Brasileira,
Brasília, v. 36, n. 3, p. 417-423, 2001.
BORGES, N.S.S.; CORREIA, D.; ROSSETTI, A.G. Influência
do meio bifásico na multiplicação de gemas e no
alongamento de brotos in vitro de Ananas lucidus Miller.
Revista Brasileira de Horticultura Ornamental,
Campinas, v.9, n.1, p.37-44, 2003.
CABRAL, J.R.S.; MATOS, A.P. de; SOUTO, G.F.
Reação de germoplasma de abacaxi à inoculação
com Fusarium moniliforme var. Subglutinans. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 20, n. 7, p. 787-791,
1985.
CARVALHO, A.C.P.P. de; BRAGA, E.P.; SANTOS, M.R.A.
dos; MORAIS, J.P.S. Micropropagação de abacaxi
ornamental (Ananas comosus var. bracteatus) por meio da
indução ao estiolamento e regeneração de plântulas.
Revista Brasileira de Horticultura Ornamental,
Campinas, v. 11, n. 2, p. 121-126, 2005.
CORREIA, D; OLIVEIRA, P.M.A. de; RIBEIRO, K.A.;
SILVEIRA, M.R.S da. Avaliação da multiplicação in vitro
do abacaxi ornamental (Ananas lucidus Miller). Fortaleza:
Embrapa Agroindústria Tropical, 1999. 2p. (Pesquisa em
Andamento, 56).
COSTA, T. da; ZAFFARI, G.R. Micropropagação de
Ananas bracteatus (Shultz) cv. estriatus Hort. Revista
Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v. 11,
n. 2, p. 109-113, 2005.
DeWALD, M.G.; MOORE, G.A.; SHERMAN, W.B.; EVANS,
M.H. Production of pineapple plants in vitro. Plant Cell
Reports, New York, v. 7, n. 7, p. 535-537, 1988.
GARITA, H.; GŁMEZ, L. Micropropagation de la variedad
de piña Champaka F-153. Agronomia Costarricense, San
José, v. 24, n. 1, p. 63-73, 2000.
GRATTAPAGLIA,
D.;
MACHADO,
M.A.
Micropropagação. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.;
7
BUSO, J.A. (Ed.). Cultura de tecidos e transformação
genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI:Embrapa-CNPH,
1998. v. 1, p.183-260.
KISS, E.; KISS, J.; GYULAI, G.; HESZKY, L.E. A novel
method for rapid micropropagation of pineapple.
HortScience, Alexandria, v. 30, n.1., p. 127-129, 1995.
MOREIRA, M.A.; PASQUAL, M.; CARVALHO, J.G. de;
FR˘GUAS, C.B. Estiolamento na micropropagação do
abacaxizeiro cv. Pérola. Ciência e Agrotecnologia, Lavras,
v. 27, n. 5, p. 1002-1006, 2003.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid
growth and bio assays with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum, Copenhagem, v. 15, n. 3, p. 473497, 1962.
PEREIRA, F.D.; BRAGA, M.F; S˘, M.E.L.; ALCINO,
O.A.G.; COLENGHI, I.C. Influence of BAP and NAA on
multiplication of pineapple cv. Perolera, from in vitro
etiolated shoots. Bioscience Journal, Uberlândia, v. 17,
n. 2, p. 49-60, 2001.
PRAXEDES, S.C.; SILVA JR., A.F. da; FIGUEIREDO, F.L.B.;
FIGUEIREDO, M. de L.; C˜MARA, F.A.A.; OLIVEIRA,
O.F. de. Estiolamento in vitro do abacaxizeiro Pérola em
presença de ANA e AIA. Caatinga, Mossoró, v. 14, n.1/2,
p. 13-15, 2001.
S˘, M.E.L. de; PEREIRA, F.D.; BRAGA, M.F.; MUSTAF˘,
P.C.; ALVES, A.P. Propagação in vitro de abacaxi (Ananas
comosus) por meio de segmentos estiolados. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 16.,
2000, Fortaleza. Resumos... Fortaleza: Sociedade Brasileira
de Fruticultura, 2000. p. 21.
SEAGRI (Secretaria da Agricultura e Pecuária do Governo
do Estado do Ceará). O Agronegócio da Floricultura
Cearense. Gerência de Flores: Instituto Agropolos. 5p. 2006.
8
MICROPROPAGAÇ‹O,
ACLIMATIZAÇ‹O
FONSECA, V. O.
et al.
E COMPOSIÇ‹O QU¸MICA DO ŁLEO ESSENCIAL
DE HORTEL‹ JAPONESA (Mentha arvensis L.)
MICROPROPAGATION, ACCLIMATIZATION AND CHEMICAL COMPOSITION
OF THE ESSENTIAL OIL OF JAPANESE MINT (Mentha arvensis L.)
VALÉRIA OLIVEIRA FONSECA1, ANDREA SANTOS DA COSTA2, MARIA DE F˘TIMAARRIGONI-BLANK3,
ARIE FITZGERALD BLANK4, PÉRICLES BARRETOALVES5, TÐLIO HENRIQUE BARRETO DE SANTANA6
Graduando em Engenharia Agronômica, bolsista ITI-A/CNPq Departamento de Engenharia Agronômica Universidade Federal de
Sergipe/UFS Av. Marechal Rondon s/n 49100-000 - São Cristóvão, SE [email protected]
2
Engenheira Agrônoma, Mestre, bolsista DTI/CNPq Departamento de Engenharia Agronômica Universidade Federal de Sergipe/
UFS Av. Marechal Rondon s/n 49100-000 São Cristóvão, SE [email protected]
3
Bióloga, Professora Adjunta do Núcleo de Ciências Biológicas Campus Prof. Alberto Carvalho Universidade Federal de Sergipe/
UFS Av. Vereador Olímpio Grande s/n 49500-000 Itabaiana, SE [email protected]
4
Engenheiro Agrônomo, Professor Adjunto Departamento de Engenharia Agronômica Universidade Federal de Sergipe/UFS Av.
Marechal Rondon s/n 49100-000 São Cristóvão, SE [email protected].
5
Químico, Professor Associado Departamento de Química Universidade Federal de Sergipe/UFS Av. Marechal Rondon s/n
49100-000 São Cristóvão, SE [email protected]
6
Graduando em Engenharia Agronômica, bolsista PIBIC Departamento de Engenharia Agronômica Universidade Federal de
Sergipe/UFS Av. Marechal Rondon s/n 49100-000 São Cristóvão, SE [email protected]
1
RESUMO
A menta japonesa (Mentha arvensis L.) é uma espécie
aromática e seu óleo essencial é empregado em indústrias de
alimentos, cosmética e farmacêutica. Objetivou-se, no presente
trabalho, desenvolver um protocolo de micropropagação e
aclimatização da menta japonesa, e realizar a análise do óleo
essencial de plantas micropropagadas e não micropropagadas.
Para a micropropagação foram testados segmentos nodal, foliar
e internodal do genótipo UFC provenientes de plantas
estabelecidas in vitro e inoculados em meio MS associado a
reguladores de crescimento: MS (controle); MS + 9,3 mM
CIN + 8,9 mM BAP + 2,2 mM AIA ; MS + 8,9 mM BAP +
5,4 mM ANA e MS + 4,4 mM AIA. Para aclimatização das
mudas testaram-se quatro substratos: PCB [pó de coco +
calcário (1 g L-1) + 12 g L-1 de Biosafra® (3-12-6)]; PCBV1 [pó
de coco + vermiculita (1:1 v/v) + calcário (1 g L-1) + Biosafra®
(3-12-6) (12 g L-1)]; PCBV2 [pó de coco + vermiculita (2:1 v/
v) + calcário (1 g L-1) + Biosafra® (3-12-6) (12 g L-1)]; VMS
(vermiculita + sais do MS). As amostras dos óleos essenciais
foram analisadas utilizando-se a cromatografia gasosa acoplada
à espectrometria de massas. Segmentos nodais foram os mais
efetivos na micropropagação, podendo ser utilizado o meio de
cultura MS na ausência de reguladores de crescimento. O
substrato constituído de pó de coco mais 1 g L-1 de calcário e
12 g L -1 de Biosafra ® (3-12-6) pode ser utilizado na
aclimatização de mudas micropropagadas de M. arvensis
genótipo UFC . A qualidade do óleo essencial foi mantida
após micropropagação.
ABSTRACT
Japanese mint (Mentha arvensis L.) is an aromatic
species and its essential oil is used by food, cosmetic and
pharmaceutical industries. The objective of this work was to
develop a protocol for micropropagation and acclimatization
of japanese mint and analyze essential oil of micropropagated
and non micropropagated plants. For the micropropagation,
nodal, leaf and internodal segments of the genotype UFC
obtained from in vitro established plants were inoculated in
the following MS medium associated with growth regulators:
MS (control); MS + 9.3 mM KIN + 8.9 mM BAP + 2.2 mM
IAA; MS + 8.9 mM BAP + 5.4 mM NAA and MS + 4.4 mM
IAA. For acclimatization, four substrates: PCB [coconut dust
+ limestoon (1 g L-1) + 12 g L-1 Biosafra® (3-12-6)]; PCBV1
[coconut dust + vermiculite (1:1 v/v) + limestoon (1 g L-1) +
Biosafra ® (3-12-6) (12 g L -1 )]; PCBV2 [coconut dust +
vermiculite (2:1 v/v) + limestoon (1 g L-1) + Biosafra® (3-126) (12 g L-1)] and VMS (vermiculite + MS salts) were used.
Essential oil samples were analyzed using gas chromatography
with mass spectrometry. Nodal segments inoculated in the
absence of growth regulators were the most effective for
micropropagation. The substrate coconut dust + 1 g L -1
limestoon + 12 g L-1 Biosafra® (3-12-6) may be used for
acclimatization of M. arvensis genoty pe UFC
micropropagated plantlets. The essential oil s quality was
maintained after micropropagation.
Termos para indexação: Mentha arvensis, regulador de
crescimento, pó de coco, mentol.
Index terms: Mentha arvensis, growth regulator, coconut dust,
menthol.
(Recebido em 28 de novembro de 2007 e aprovado em 10 de abril de 2008)
Microprogação, aclimatização e composição química...
INTRODUÇ‹O
A Mentha arvensis L. (Lamiaceae) conhecida como
hortelã japonesa e hortelã pimenta é uma espécie aromática,
originária do sul da China cujo óleo essencial se distingue
de outras mentas pela ausência de cineol e por elevado
teor de mentol, empregado como flavorizante e aromatizante
de alimentos, bebidas, perfumes, produtos de higiene bucal
e preparações farmacêuticas, no tratamento de problemas
respiratórios e gastrintestinais (KUMAR et al., 2002).
Devido as suas condições climáticas favoráveis, o Brasil
que já foi o maior produtor de menta, hoje tem produção
insignificante, ficando atrás da China e do Paraguai. Em
relação ao mercado de óleo essencial de menta, são
comercializados por ano mais de 5.000 toneladas que, em
valores históricos de US$ 10,00 kg-1, perfaz em US$ 50
milhões por ano (MAIA, 1998).
A cotação do óleo é baseada nos teores dos diversos
componentes químico-orgânicos encontrados em seu óleo,
tais como: mentol (principal constituinte), mentona, isomentonas, piperitona, cariofileno, pinenos, furfurol, limoneno,
canfeno, acetato de mentilo, valerianato de mentilo, piperitona,
alcohol etílico, etc. (HERBOTECNIA, 2007).
A micropropagação de plantas medicinais tem se
difundido devido à possibilidade de produzir um grande
número de plantas homogêneas e com elevada qualidade
sanitária, à possibilidade de conservar o germoplasma,
garantindo a manutenção da biodiversidade, além de auxiliar
no melhoramento genético (FLORES et al.; 2006).
Para o gênero Mentha, o sucesso na multiplicação
in vitro tem sido estudado por diversos autores, os quais
têm observado diferenças entre genótipos, explantes e
reguladores de crescimento na micropropagação dessa
espécie. Shasany et al. (1998) constataram que explantes
internodais de M. arvensis cultivares Himalaia e Kalka
quando inoculados em meio MS (MURASHIGE & SKOOG,
1962) contendo 2,0 øg mL-1 de ANA + 10,0 øg mL-1 de BAP
e 1,0 øg mL-1 de ANA + 5,0 øg mL-1 de BAP induziram à
formação de calos, primórdios foliares e raízes. Piza et al.
(2004) observaram que o meio MS suplementado com 1,0
mg L-1 de ANA e 2,0 mg L-1 de BAP promove a multiplicação
9
de segmentos nodais dessa espécie, com 12 brotos por
explante. Para regeneração de segmentos nodais de M.
piperita L. o meio MS + 1,0 mg L-1 de BAP proporcionou um
maior número de brotações (GHANTI et al., 2004), enquanto
que para explantes foliares a concentração de 2,0 mg L-1
BAP foi efetiva (WALI & SIDDIQUI, 2003). Porém Kukreja
(1996) estudando a micropropagação e regeneração de
brotos em folhas e segmentos nodais de M. piperita
observou que o meio MS suplementado com 2-3 mg L-1
cinetina + 1,0 mg L-1 AIA, ou 2-3 mg L-1 BAP + 0,25 mg L-1
AIA foi eficiente na produção de brotos. Chishti & Siddiqui
(2003a) com segmento apical constataram que o MS com 9,3
øM KIN + 8,9 øM BAP + 2,2 øM AIA seguido de MS + 4,4
øM AIA originaram um maior número de brotos por explante.
Na fase de aclimatização, o substrato utilizado na
preparação das mudas, é um fator importantepois ele pode
facilitar ou impedir o crescimento e desenvolvimento das
plantas micropropagadas, influenciando diretamente no
sucesso da aclimatização (COUTO et al., 2003).
O pó de coco surge como uma das alternativas no
preparo de substratos para a formação de mudas.
Atualmente, o pó de coco tem sido indicado como substrato
agrícola, principalmente por apresentar uma estrutura física
vantajosa, proporcionando alta porosidade, alto potencial
de retenção de umidade e por ser biodegradável. É um
meio de cultivo 100% natural e indicado para germinação
de sementes e propagação de plantas (ROSA et al., 2001).
Objetivou-se, neste trabalho, avaliar tipos de
explantes e regulares de crescimento na micropropagação,
aclimatização das mudas micropropagadas e análise do
óleo essencial de plantas antes e após a micropropagação.
MATERIAL E MÉTODOS
Micropropagação
O ensaio foi conduzido no Laboratório de Cultura
de Tecidos e Melhoramento Vegetal do Departamento de
Engenharia Agronômica da Universidade Federal de
Sergipe.
Como fonte de explantes foram testados segmentos
nodal, foliar e internodal do menta japonesa genótipo UFC
10
FONSECA, V. O. et al.
provenientes de plantas estabelecidas in vitro. O meio de
cultivo utilizado foi o MS, acrescido de 30 g L-1 de sacarose
e 7 g L-1 de ágar. O pH do meio foi ajustado para 5,7 + 0,1 e
posteriormente autoclavado (121oC e 1,05 atm) por 20
minutos. Após a inoculação dos explantes, os frascos de
250 mL contendo 25 mL de meio, foram mantidos em sala de
crescimento com fotoperíodo de 16 horas de luz, temperatura
de 25 + 2oC e intensidade luminosa de 30 mmol m-2 s-1. O
delineamento experimental foi o inteiramente casualizado,
com quatro tratamentos, utilizando-se o meio MS (controle);
MS suplementado com 9,3 mMCIN + 8,9 mM BAP + 2,2 mM
AIA ; MS + 8,9 mM BAP + 5,4 mM ANA e MS + 4,4 mM
AIA, sendo seis repetições com quatro frascos contendo
dois explantes cada frasco.
Aos 35 dias após implantação do ensaio as
variáveis, regeneração (%), número de brotos, comprimento
de brotos (cm), número de folhas e raízes (%) foram
avaliadas. Os dados obtidos foram submetidos a análises
de variância pelo teste F e, quando significativas, as médias
foram comparadas pelo teste de Duncan (p < 0,05).
Aclimatização
Foram utilizadas mudas micropropagadas do
genótipo UFC de M. arvensis, procedendo-se à lavagem
em água corrente para eliminação do meio de cultura
aderido às raízes e transplantadas em bandejas de
poliestireno expandido com 72 células contendo os
diferentes substratos e mantidas em estufa agrícola
protegida com tela sombrite 50% e nebulização intermitente.
O delineamento experimental foi o inteiramente
casualizado, sendo quatro substratos PCB - Pó de coco + 1
g L-1 de calcário + 12 g L-1 de Biosafra® (3-12-6), PCBV - Pó
variáveis massa (g) fresca e seca de raiz foram transformadas
em raiz de (x+0,5). Os dados obtidos foram submetidos a
análises de variância pelo teste F e, quando significativas,
as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (p < 0,05).
Extração, teor e análise química do óleo essencial
Os óleos essenciais de folhas frescas foram obtidos
por hidrodestilação através de aparelho do tipo clevenger
(GUENTHER, 1972), por aproximadamente 2 horas. Os
teores foram estimados com base no peso da matéria seca
(mL 100 g-1) e obtidos utilizando-se quatro amostras.
Amostras dos óleos essenciais foram analisadas
utilizando-se cromatografia gasosa em equipamento
Shimadzu QP5050A, interfaceada com espectroscopia de
massa (CG/EM), dotada de coluna capilar DB-5 (30 m x 0,25
mm x 0,25 mm) nas seguintes condições: gás de arraste
hélio (fluxo 1,0 mL.min-1); tipo de injeção split a 250oC (1/
20); detector a 280oC, programação da coluna 80oC durante
1,5 minuto, com aumento de 4oC por minuto para 180oC,
seguido de 10oC por minuto até 300oC, finalizando com 10
min. de isoterma a 300oC. Os espectros de massas foram
obtidos por impacto eletrônico a 70 eV. A identificação dos
constituintes foi determinada com base na comparação do
índice de retenção (VAN DEN DOOL E KRATZ, 1963)
relativo a uma série de n-alcanos homólogos obtido pela
co-injeção de amostras do óleo com uma mistura linear de
hidrocarbonetos, bem como com o banco de dados NIST21
e NIST107 da biblioteca do CG/EM e publicação de
espectro de massas (ADAMS, 1995).
Micropropagação
de coco + calcário (1 g L-1) + Biosafra® (3-12-6) (12 g L-1) +
Os diferentes segmentos oriundos de plantas
vermiculita (1:1 v/v), PCBV - Pó de coco + calcário (1 g L ) +
estabelecidas in vitro apresentaram diferenças
Biosafra® (3-12-6) (12 g L-1) + vermiculita (2:1 v/v) e VMS
significativas para todas as variáveis analisadas, sendo o
Vermiculita + sais do MS com quatro repetições. Cada
segmento nodal o que proporcionou melhores resultados
unidade experimental foi constituída por cinco mudas.
Aos 30 dias foram avaliadas as variáveis número de
(Tabelas 1 e 2). Explantes internodais não foram efetivos
na regeneração de brotações do genótipo UFC. Resultados
brotos, comprimento de raiz (cm), comprimento de parte aérea
diferentes foram obtidos por Shasany et al. (1998), em que
(cm) e massa (g) fresca e seca de parte aérea e raiz. As
os segmentos internodais foram eficientes na regeneração
-1
de M. arvensis, cultivares Himalaia e Kalka, em meio MS
suplementado com 2,0 øg mL-1 de ANA + 10,0 øg mL-1 de BAP
e 1,0 øg mL-1 de ANA + 5,0 øg mL-1 de BAP. Acredita-se que
essas diferenças sejam devido aos genótipos utilizados.
Para o número de brotos por explante, não houve
diferenças significativas entre os tratamentos (Tabela 1).
Resultados divergentes foram obtidos por Chishti &
Siddiqui (2003b) utilizando explantes foliares de M.
arvensis, em que o meio MS com 9,3 mM CIN + 8,9 mM
BAP + 2,2 mM AIA seguido de 8,9 mM BAP + 5,4 mM
ANA foi eficiente na multiplicação dos brotos.
Entretando, para o comprimento das brotações no
segmento nodal, a utilização de 8,9 mM BAP + 5,4 mM ANA foi
a que proporcionou menores valores, porém não diferindo do
controle e das concentrações de 9,3 mM CIN + 8,9 mM BAP +
2,2 mM AIA (Tabela 1). Quanto ao número de folhas, o meio de
cultivo na ausência de reguladores de crescimento,
proporcionou a menor média em segmentos nodais (Tabela 2).
Em relação à formação de raízes nos explantes in
vitro, os segmentos foliar e nodal induziram à formação de
raízes em todos os tratamentos, porém não diferindo
estatisticamente entre si. Entretanto, pela análise dos tipos
de explantes dentro de cada tratamento, nota-se a
superioridade dos segmentos nodais em relação ao foliar
(Tabela 2). Com isso, pode-se inferir que não só os
reguladores de crescimento afetam a indução e crescimento
das raízes, mas também os tipos de explantes e genótipo.
TABELA 1
UFC.
11
Assim, para a regeneração de plantas de hortelã
japonesa genótipo UFC, segmentos nodais são os mais
efetivos, podendo ser utilizado o meio de cultura MS, na
ausência de reguladores de crescimento. Resultados
semelhantes a esses foram obtidos na multiplicação de M.
citrata Ehrh. (GODOY et al., 2005).
Aclimatização
Na implantação do ensaio, as mudas
micropropagadas apresentavam altura média de 6,0 cm.
Observa-se que não houve diferença significativa entre
os diferentes substratos testados para as variáveis, número
de brotos, comprimento de parte aérea, massa seca de raiz
e de parte aérea. Já para comprimento de raiz, nota-se que
o substrato que contém apenas pó de coco apresentou
maior desenvolvimento do sistema radicular, porém não
diferindo estatisticamente dos substratos PBCV (1:1) e
PBCV (2:1) (Tabela 3).
Em relação à biomassa fresca de raiz, houve
diferenças significativas entre os diferentes substratos
avaliados, sendo que o substrato que contém apenas pó
de coco proporcionou um aumento significativo na
massa, entretanto não diferindo do substrato PBCV. O
substrato vermiculita + sais do MS resultou em uma
menor massa fresca de parte aérea, embora não
apresentando diferença significativa do PBCV (1:1) e do
PBCV (2:1) (Tabela 4).
Regeneração (%), número de brotos e comprimento de brotos (cm) in vitro de M. arvensis - genótipo
Reguladores de
Explante
Folha
Crescimento ( M)
Nodal
Regeneração (%)
Folha
Nodal
Número de brotos
Folha
Nodal
Comprimento de brotos (cm)
Controle
3,6 aB
100 aA
0,29 aB
1,90 aA
0,21 aB
3,60 abA
9,3CIN + 8,9BAP + 2,2 AIA
0,0 aB
100 aA
0,00 aB
1,90 aA
0,00 aB
3,77 abA
8,9BAP + 5,4ANA
0,0 aB
100 aA
0,00 aB
1,87 aA
0,00 aB
2,79 bA
4,4AIA
0,0 aB
100 aA
0,00 aB
2,00 aA
0,00 aB
3,98 aA
CV (%)
7,24
31,44
37,51
* Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem estatisticamente
entre si, pelo teste de Duncan (p<0,05).
12
TABELA 2 Número de folhas e raízes (%) in vitro de M. arvensis - genótipo UFC.
Reguladores de
Crescimento ( M)
Explante
Folha
Nodal
Folha
Número de folhas
Nodal
Raízes (%)
Controle
1,43 aB
12,64 bA
39,29 aB
85,71 aA
9,3CIN + 8,9BAP + 2,2AIA
0,00 aB
14,60 abA
45,00 aB
100,00 aA
8,9BAP + 5,4ANA
0,00 aB
14,29 abA
33,33 aB
95,83 aA
4,4 AIA
0,00 aB
16,54 aA
45,83 aB
91,67 aA
CV (%)
28,22
28,16
* Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem
estatisticamente entre si, pelo teste de Duncan (p<0,05).
TABELA 3 Número de brotos, comprimento de raiz e de parte aérea de mudas aclimatizadas de M. arvensis - genótipo UFC.
Substrato
Número de brotos
Compri mento
de raiz (cm)
Parte aérea (cm)
PBC
8,900 a
15,600 a
23,050 a
PBCV (1:1)
10,000 a
14,875 ab
25,900 a
PBCV (2:1)
10,800 a
14,600 ab
24,100 a
VM S
10,900 a
12,125 b
22,975 a
CV (%)
26,86
9,86
8,04
* Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas e nas linhas, não diferem estatisticamente entre si, pelo
teste deTukey (p<0,05).
Dentre os substratos usados, aqueles compostos
listados de acordo com a ordem de eluição (Tabela 5).
por pó de coco mostraram-se eficientes na aclimatização
Em relação ao teor de óleo essencial, a micropropagação
de mudas micropropagadas do genótipo UFC de M.
não alterou essa variável, permanecendo em 3,1%
arvensis. Na região Nordeste do país, a utilização do pó
(Tabela 5).
de coco, em mistura com outros materiais, reduz o custo de
Os compostos principais nos dois tipos de
aquisição de substratos comerciais, além de ajudar a
propagação das plantas, foram o mentol com 69,9% e
minimizar os problemas ambientais promovidos pelo
77,85% e a mentona com 12,95% e 14,29%, em plantas
acúmulo de resíduos provenientes da indústria de
obtidas por propagação in vitro e convencional por
processamento de coco, que é amplamente disponível
estaquia, respectivamente (Tabela 5).
Comparando os dois tipos de produção das plantas,
nessa região.
nota-se que o nível de mentol foi inferior em plantas
Análise do óleo essencial
provenientes do cultivo in vitro, enquanto que o limoneno
Dos componentes presentes no óleo essencial
apresentou um nível mais elevado nessa condição.
de plantas propagadas convencionalmente por estaquia
Provavelmente, isso se deve a não conversão do limoneno
e micropropagadas do genótipo UFC de M. arvensis, 15
em mentol. Gershenzon et al. (2000) avaliaram a composição
constituintes foram identificados e encontram-se
de monoterpenos durante o desenvolvimento de folhas
13
TABELA 4 Valores médios de massa fresca e seca de raiz e parte aérea de mudas aclimatizadas de M. arvensis genótipo UFC.
Substrato
Massa Fresca (g)
Massa Seca (g)
Raiz
Parte aérea
Raiz
Parte aérea
PBC
570,800 a
4646,650 ab
55,500 a
512,950 a
PBCV (1:1)
414,350 ab
4832,350 a
71,950 a
633,000 a
PBCV (2:1)
192,600 b
4252,100 ab
76,350 a
598,500 a
VM S
62,000 b
2640,850 b
51,050 a
513,750 a
CV (%)
26,09
24,77
15,81
23,35
* Médias seguidas das mesmas letras minúsculas nas colunas e nas linhas, não diferem estatisticamente entre si, pelo teste
deTukey (p<0,05).
TABELA 5 Composição química do óleo essencial de Mentha arvensis - genótipo UFC.
Picos
Compostoa
IRb
Porcentagem na plantas
Micropropagadas
Não Micropag adas
1
Tricicleno
929
0,27
0,08
2
-Pineno
973
0,68
0,18
3
Mirceno
985
0,46
0,08
4
3-Octanol
992
0,00
0,48
5
Limoneno
1025
9,25
1,22
6
Linalo l
1096
0,00
0,19
7
Mentona
1153
12,95
14,29
8
Isomentona
1161
2,18
1,81
9
Neo mentol
1166
1,00
1,51
10
Isopulegona
1172
0,00
0,07
11
Mentol
1175
69,90
77,85
1192
0,00
0,21
12
- Terpineol
13
Pulegona
1234
0,00
0,26
14
Piperitona
1249
0,00
1,17
15
Acetato de mentol
1286
2,95
0,27
Total Identificado (%)
99,66
99,67
Teor (%)
3,16
3,10
de menta durante 55 dias de idade e verificaram que os
níveis de mentol atingem os maiores valores ao redor de 40
dias de idade, enquanto que nesse período são registrados
os menores teores de limoneno, uma vez que esse composto
é convertido em mentol à medida que ocorre a maturação
das folhas.
CONCLUS›ES
Segmentos nodais são mais efetivos na
micropropagação de M. arvensis - genótipo UFC, podendo
ser utilizado o meio de cultura MS, na ausência de
reguladores de crescimento.
14
A aclimatização de mudas micropropagadas pode
ser realizada utilizando-se o substrato pó de coco mais 1 g
L-1 de calcário e 12 g L-1 de Biosafra.
A qualidade do óleo essencial foi mantida após a
micropropagação de M. arvensis - genótipo UFC.
REFERENCIAS BIBLIOGR˘FICAS
ADAMS, R.P. Identification of essential oil components
by gas chromatography/mass spectroscopy. Carol Stream:
Allured Publishing corporation, 1995. 469p.
CHISHTI, N.T.N; SIDDIQUI, B.A. Clonal propagation of
Mentha arvensis L. by use of shoot tip. Advances in Plant
Sciences, n.16, v.1, p.13-16, 2003a.
CHISHTI, N.T.N.; SHAWL, A.S.; KALOO, Z.A.; BHAT,
M.A.; SULTAN, R. Clonal propagation of Mentha arvensis
L. through nodal explant. Journal of Biological Scienes,
v. 8, n.9, p. 1416-1419, 2006.
COUTO, M.; WAGNER JÐNIOR, A.; QUEZADA, A.C.
Efeito de diferentes substratos durante a aclimatização de
plantas micropropagadas do porta-enxerto mirabolano 29C
(Prunus cerasifera EHRH.) em casa de vegetação. Revista
Brasileira de Agrociência, v.29, n.2, p. 125-128, 2003.
FLORES,R.; MALDANER, J.; NICOLOSO, F.T. Otimização
da micropropagação de Pfaffia tuberosa (Spreng.). Hicken.
Ciencia Rural, Santa Maria, v.36, n.3, p.845-851, mai-jun, 2006.
GERSHENZON, J; McCONKEY, ME; CROTEAU, R.B.
Regulation of monoterpene accumulation in leaves of
peppermint. Plant Physilogy, 122, p.205-213, 2000.
GHANTI, K.; KAVIRAJ, C.P.; VENUGOPAL, R.B; JABEEN,
F.T.Z.; RAO, S. Rapid regeneration of Mentha piperita L.
from shoot tip and nodal explants. Indian Journal of
Biotechnology, n.3, v.4, p.594-598, 2004.
GODOY, L.; HECTOR, E.; DIAZ, B.; CHEA, A.; TORRES,
A. The effect of growth regulators on the in vitro
multiplication of Mentha piperita and Mentha citrata.
Cultivos Tropicales, n.26, v.1, p.73-75, 2005.
GUENTHER, E. The essential oils: volume one - history,
origin in plants, production, analysis. Malabar: Krieger
Publishing Company, 1972. 427p.
HERBOTECNIA. Tecnologías de cultivo y poscosecha de
plantas medicinales, aromáticas y tintóreas. Mentha
arvensis. Disponível em:<http://www.herbotecnia.com.ar/
exotica-mentajaponesa.html>. Acesso em: 10 mar. 2007.
KUKREJA,A.K. Micropropagation and shoot regeneration
from leaf and nodal explants of peppermint (Mentha piperita
L.). Journal of Spices and Aromatic Crops, n.5, v.2, p.111119, 1996.
KUMAR SJR; BAHL RP; BANSAL AK; GUPTA V; SINGH
SS. High economic returns from companion and relay
cropping of bread wheat and menthol mint in the wintersumer season in north Indian plains. Industrial Crops and
Products, n.15, p.103-114, 2002.
MAIA, N.B. Produção e qualidade do oléo essencial de
duas especies de menta cultivadas em solução nutritiva.
1998. 105 p.Tese (Doutorado em Solos e Nutrição de
Plantas) Escola Superior de Agricultura Liuz de Queiroz,
Piracicaba, 1998.
MURASHIGE, T., SKOOG, F. A revised medium for rapid
growth and bioassays with tabacco tissue culture.
Physiologia Plantarum, v.15, p.473-497, 1962.
PIZA, I.M.T.; DINIZ, S.P.S.; LIMA, G.P.P. Protocolo de
Micropropagación de Mentha arvensis L. In: Encuentro
Latinoamericano y del Biotecnología Agrícola, 5., 2004,
República Dominicana. Anais eletrônicos... República
Dominicana, 2004. Disponível em:<http://www.redbio.org/
rdominicana/redbio2004rd/Memoria_REBIO_2004/
index.htm>.Acesso em: 20 abr. 2007.
ROSA, M.F.; SANTOS, F.J.de.S.; MNOTENEGRO, A.A.T.;
ABREU, F.A.P.de; CORREIA, D.; ARAÐJO, F.B.S.de.;
NOR›ES, E.R.V. Caracterização do pó da casca de coco
verde usado como substrato agrícola. Fortaleza:
EMBRAPA CNPAT, p.1-6, 2001. (Circular Técnica, 54).
SHASANY, A. K.; KHANUJA, S. P. S.; DHAWAN, S.;
YADAV, U.; SHARMA, S.; KUMAR, S. High regenerative
nature of Mentha arvensis internodes. Indian Academy of
Sciences, n.5, p. 641-646,1998.
VAN DEN DOOL, H.; KRATZ, J.D.J. A generalization of
the retention index system including linear temperature
programmed gas-liquid artitionchromatography. Journal
of Chromatography. 11, 463-471, 1963.
WALI, S.A.; SIDDIQUI, B.A. High frequency of multiple
shoot regeneration in Mentha piperita L. - a multipurpose
herb. Physiology and Molecular Biology of Plants, n.9,
v.1, p.153-156, 2003.
MICROPROPAGAÇ‹O
DE
Anthurium
plowmannii
Croat.
Croat.
Micropropagação de
Anthurium
plowmannii
15
MICROPROPAGATION OF Anthurium plowmannii Croat.
YARA DE OLIVEIRA SCHIAVINATO1, THIAGO NOGUEIRA LUCON2,
ANTONIO FERNANDO CAETANO TOMBOLATO3, WILSON BARBOSA4,
RENATO FERRAZ DEARRUDAVEIGA3
Bióloga, bolsista FAPESP Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento do Jardim Botânico/NPD-Jardim Botânico Instituto Agronômico
de Campinas/IAC Cx. P. 28 13001-970 Campinas, SP [email protected]
2
Biólogo, bolsista CNPq Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento do Jardim Botânico/NPD-Jardim Botânico Instituto Agronômico
de Campinas/IAC Cx. P. 28 13001-970 Campinas, SP [email protected]
3
Engenheiro Agrônomo, Doutor, Pesquisador Científico VI Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento do Jardim Botânico/NPDJardim Botânico Instituto Agronômico de Campinas/IAC Cx. P. 28 13001-970 Campinas, SP [email protected];
[email protected]
4
Biólogo, Mestre, Pesquisador Científico VI Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento do Jardim Botânico/NPD-Jardim Botânico
Instituto Agronômico de Campinas/IAC Cx. P. 28 13001-970 Campinas, SP [email protected]
1
RESUMO
A cultura de tecidos tornou-se um importante instrumento
visando a conservação e multiplicação das espécies vegetais. Essa
técnica acelera os métodos convencionais de propagação
vegetativa, fornecendo mudas de alto padrão livre de pragas e em
curto espaço de tempo, em quantidade suficiente para a demanda.
Foram analisados através da micropropagação de Anthurium
plowmannii Croat., o desenvolvimento de explantes de folhas e
secções de raízes de aproximadamente 1 cm, obtidos da coleção
do Jardim Botânico do Instituto Agronômico de Campinas, em
câmara clara e escura. Os explantes foram inoculados nos meios
MS, MS + 6-BA (1,0 mg L-1) e Pierik 1. Para cada meio utilizaramse 48 frascos, sendo 24 contendo secções de raízes e 24 contendo
folhas, subdivididos em três repetições de oito frascos.
Semanalmente, foram observadas e anotadas as formações de
calo, brotamentos e contaminações. No ensaio em câmara clara,
os primeiros resultados de brotamento e formação de calos
surgiram após duas semanas nos explantes de raízes e após 15
semanas nos explantes de folhas. No ensaio em câmara escura, os
primeiros resultados surgiram após duas semanas nos explantes
de raízes e após cinco semanas nas folhas, ocorrendo também
brotamento e formação de calo. Os resultados obtidos mostraram
que o melhor meio de cultura para brotamento foi o Pierik 1 e
para formação de calos o MS acrescido de 1,0 mg L-1 de 6-BA,
tanto em câmara clara quanto escura. As observações foram obtidas
até que os explantes necessitassem de transferência de meio ou,
os não regenerados, entrassem em colapso, geralmente, com
necrose total dos tecidos.
Termos para indexação: Araceae, cultura de tecidos, explantes,
luminosidade, Anthurium plowmannii.
ABSTRACT
The tissue culture became an important instrument for
the conservation and multiplication of plant species. This
technique speeds up the conventional methods of vegetative
propagation, supplying plants with high standard and sanity in
a short space of time and sufficient amount to attend the demand.
In these assays, the micropropagation of Anthurium plowmannii
Croat., was carried out in light and dark chambers, using leaves
and roots segments of approximately 1 cm length as explants.
The explants were inoculated in the following medium: MS, MS
+ 1.0 mg L-1 6-BA and Pierik 1. For each medium, 48 bottles were
used, with half containing root sections and half containing leaf
segments, subdivided in 3 repetitions of 8 flasks. Callus and
shoot formation and contaminations were observed weekly. On
light chamber, the first results of shoot and calluses formation
appeared after two weeks in root explants and after 15 weeks in
leaf explants. On dark chamber, the first results appeared after
two weeks in root explants and after five weeks in leaves, showing
also the formation of shoots and callus. The obtained results
showed that the best culture medium for shoot induction was the
Pierik 1 and for callus formation the MS + 1.0 mg L-1 6-BA,
maintained in dark or light chambers. The observations were
obtained until the explants needed to be transferred to a new
medium or those that showed no regeneration collapsed, generally,
with total necrosis of tissues.
Index terms: Araceae, tissue culture, explant, light, Anthurium
plowmannii.
INTRODUÇ‹O
A família Araceae é largamente distribuída por todo
Brasil, ocorrendo espécies desde as áreas subtropicais ao
sul até as florestas equatoriais do extremo norte. São
conhecidos 106 gêneros e cerca de 3 mil espécies das quais
cerca de 450 ocorrem no Brasil (TOMBOLATO & CASTRO,
2005). O gênero Anthurium é herbáceo, epífito, suas flores
são hermafroditas e apresentam o fenômeno da protogenia,
no qual a parte feminina da flor está receptiva quando a
(Recebido em 03 de maio de 2007 e aprovado em 22 de abril de 2008)
16
SCHIAVINATO, Y. de O. et al.
parte masculina ainda está imatura. Esse fenômeno dificulta
a autofecundação e favorece cruzamentos naturais entre
plantas diferentes.
O antúrio (Anthurium andraeanum Linden) é a
segunda flor tropical mais comercializada no mercado
mundial, perdendo lugar apenas para orquídeas. No Brasil,
a principal região produtora fica no Vale do Ribeira, no estado
de São Paulo, sendo cultivado sob telado (TOMBOLATO
& CASTRO, 2005). O Anthurium plowmannii Croat.,
conhecido como antúrio-concha, é uma planta epífita e
rupícola, de folhas rosuladas, nativa da região Amazônica
até os afloramentos calcários e graníticos do Centro-Oeste
e o Leste do Brasil. Possui o caule curto e coberto de raízes
grossas, de 10-30 cm de comprimento por 3-6 cm de diâmetro.
Folhas com lâminas inteiras e onduladas nas margens,
brilhantes, coriáceas de 10-40 cm de comprimento por 1-2
cm de diâmetro. A inflorescência dessa espécie é ereta, com
espata verde ou tingida de vinácea ou arroxeada, de 8-25 cm
de comprimento, com pedúnculo de 6-30 cm. Esta espécie é
utilizada para ornamentação, principalmente em vasos,
diferentemente do Anthurium andraeanum que é também
usado como flor de corte (IMENES et al., 2002;
TOMBOLATO & CASTRO, 2005).
A propagação vegetativa in vitro, também
denominada micropropagação por causa do tamanho dos
propágulos utilizados, é a aplicação mais prática da cultura
de tecidos e aquela de maior impacto no setor produtivo
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Com a
necessidade em suprir, de um lado, as demandas comerciais
e, de um outro, a intensa degradação dos ambientes
naturais, a técnica de cultura de tecido tornou-se um
importante instrumento visando à conservação e
multiplicação das espécies vegetais. Essa técnica
possibilita uma propagação livre de pragas e acelera os
métodos convencionais de propagação vegetativa,
fornecendo aos produtores mudas de alto padrão e em
quantidade suficiente para a demanda comercial em todas
as épocas do ano.
Atualmente, a atividade comercial de
micropropagação concentra esforços principalmente na
limpeza clonal e na multiplicação de espécies ornamentais,
herbáceas e arbustivas. Na floricultura, essa técnica é
amplamente utilizada para a propagação clonal e limpeza
de vírus. A multiplicação é rápida e a qualidade,
uniformidade e quantidade de plantas produzidas é maior
que aquela obtida por métodos convencionais
(TOMBOLATO & COSTA, 1998).
Castro et al. (1992), indicam a existência de
aproximadamente 1000 protocolos específicos definidos
para a propagação in vitro de espécies ornamentais. Alguns
fatores adicionais favorecem as aplicações comerciais da
propagação in vitro de plantas ornamentais. Um desses
fatores refere-se ao fato da propagação através de sementes
resultar, muitas vezes, em segregações genéticas,
originando indivíduos diferentes.
Tombolato & Quirino (1996) observaram que as
diferentes variedades de Anthurium andraeanum não
reagem de maneira idêntica aos métodos de propagação.
Independentemente da constituição do meio de cultura,
algumas variedades apresentam maior taxa de multiplicação
e enraizamento que outras. A partir dessa experiência,
objetivou-se, no presente trabalho definir o melhor método
para propagação in vitro, formação de calo e regeneração,
do Anthurium plowmannii Croat.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram colhidos frutos maduros de Anthurium
plowmannii (Figura 1), produzidos na coleção do Jardim
Botânico do IAC, para a obtenção das sementes para a
germinação in vitro.
FIGURA 1 Frutos maduros de A. plowmannii.
17
Esterilização da espádice
meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962). As plântulas
A espádice, contendo os frutos maduros, foi lavada
com água corrente e sabão e borrifada com solução
antibiótica 50%, (produto comercial Nistatina 100.000 U.I.
mL-1). Depois de duas horas da aplicação da solução
antibiótica, a espádice foi desinfetada com álcool 70% por
dois minutos e transferida para outro recipiente com
hipoclorito de cálcio 2,5% por 10 minutos. Em seguida, a
espádice foi colocada em solução fungicida à base de
Thiram 50% por duas horas. Na câmara de fluxo laminar, os
frutos foram retirados da espádice e descontaminados com
álcool 70% por dois minutos e hipoclorito de cálcio 2,5%
por dez minutos, finalizando a esterilização.
com 3 meses de crescimento in vitro (Figura 3) forneceram
os explantes para o ensaio de regeneração.
Para o ensaio de regeneração in vitro de A.
plowmannii, os explantes utilizados foram folhas jovens
inteiras e secções de raízes de aproximadamente 1 cm
(Figura 4 e 5). Esses explantes foram inoculados em três
meios diferentes, meio MS, meio MS + 6-BA (1,0 mg L-1) e
meio Pierik 1 (TOMBOLATO & QUIRINO, 1996). Para cada
meio foram inoculados 48 frascos, sendo 24 contendo
secções de raízes e 24 contendo folhas, que foram
subdivididos em três repetições de oito frascos. Foram
montados dois ensaios, um que permaneceu em câmara
Inoculação
clara com 16 horas de fotoperíodo e outro que permaneceu
Após a esterilização, já na câmara de fluxo laminar,
com o auxílio do bisturi, os frutos foram abertos e deles
retiradas as sementes (Figura 2) que foram inoculadas em
em câmara escura a 25ÀC.
Fruto
(tecido)
Semente
FIGURA 4 Explante de folha utilizado no ensaio de
regeneração.
FIGURA 2 Frutos e sementes de A. plowmannii.
FIGURA 3 Plântula de A. plowmannii obtida por
germinação de semente em meio MS.
FIGURA 5 Explante de raiz com 1 cm de comprimento
utilizado no ensaio de regeneração.
18
As observações do ensaio foram feitas
semanalmente e anotadas as formações de calo,
brotamento e contaminações. As observações dos ensaios
instalados estenderam-se por seis meses.
O primeiro resultado do ensaio em câmara clara
(Tabela 1) foi obtido após duas semanas da inoculação,
houve brotamento de explante de raiz em frasco com meio
MS + 6-BA (1,0 mg L-1), enquanto que, nos explantes
foliares, houve a formação de calo e brotamento somente
após 15 semanas.
Na Tabela 1, pôde-se observar que o meio MS
mostrou-se menos eficaz, pois apresentou apenas 3
explantes com regenerações e 1 com calo, portanto uma
quantidade inferior em relação aos outros meios utilizados.
Já o meio Pierik 1 foi o qual proporcionou melhores
resultados de brotamento tanto em folhas (3 explantes)
quanto em raízes (4 explantes) (Figura 6 e 7). No meio MS
+ 6-BA (1,0 mg L-1) ocorreu a formação de calos em sete
explantes foliares, em câmara clara.
No ensaio da câmara escura (Tabela 2), o primeiro
resultado foi observado após duas semanas, ocorrendo o
brotamento de explante de raiz em frasco com meio Pierik 1.
Enquanto que brotamento em folhas surgiram em meio MS
+ 6-BA (1,0 mg L-1) após cinco semanas e após 12 semanas,
formação de calo em frasco com meio Pierik 1 e MS + 6-BA
(1,0 mg L-1).
Na Tabela 2, pôde-se observar que o meio MS não
apresentou nenhum resultado em câmara escura, para a
propagação via calo ou brotamento da espécie A.
plowmannii. Já no meio P1, obtiveram-se 6 brotamentos
em explantes de raiz. O meio MS + 6-BA (1,0 mg L-1) foi o
meio mais apropriado para formação de calo nos explantes
de folhas, 4 explantes (Figura 8), e raízes, 3 explantes.
Todos os calos obtidos em folhas apresentaram
regeneração. Já os calos oriundos de raízes formaram-se,
porém não se desenvolveram, permanecendo pequenos e
de coloração marrom. Os calos de raízes formados em
câmara clara e escura foram observados em seis explantes,
sendo que metade deles necrosaram.
Segundo Chan et. al., (2003) na cultura in vitro de
Araceae, especificamente em Anthurium, os explantes de
folhas ou raízes quando inoculados em meio MS
acrescidos das citocininas 6-BA e IBA e mantidos em câmara
clara com fotoperíodo de 16 horas, apresentaram formações
de brotamentos, enraizamento e multiplicação de plântulas.
As auxinas, 2,4-D, zeatina entre outras, foram utilizadas
para formação de calos, enquanto que as citocininas como
6-BA, para brotamento de raiz e desenvolvimento de
plântulas. Explantes foliares de A. andraeanum Linden,
quando deixados em câmara escura e inoculados em meio
TABELA 1 Número de brotos, de formação de calos e de contaminação observados no Anthurium plowmannii,
cultivado in vitro, em câmara clara.
Meio
Número
inicial de
explantes
(folha)
Número
inicial de
explantes
(raiz)
folhas
Brotamento
Calo
Contaminação
raiz
Brotamento
Calo
Contaminação
MS
24
1
(4,16%)
1
(4,16%)
4
(16,6%)
24
2
(8,33%)
0
(0%)
2
(8,33%)
P1
24
3
(12,5%)
0
(0%)
6
(25%)
24
4
(16,6%)
2
(8,33%)
3
(12,5%)
MS+6BA
24
0
(0%)
7
(29,16%)
0
(0%)
24
1
(4,16%)
0
(0%)
2
(8,33%)
19
Pierik 1, acrescido de auxinas, zeatina e 2,4-D, apresentaram
formação de calo. Esse resultado foi comprovado no
experimento realizado com folhas jovens, conforme
literatura e protocolo descritos por Tombolato et al. (2002).
FIGURA 8 Formação de calo no explante de folha de
A. plowmannii.
FIGURA 6
plowmannii.
Brotamento no explante de raiz de A.
FIGURA 7 Brotamento e formação de calo no explante
de folha de A.plowmannii.
Os resultados obtidos no ensaio com A.
plowmannii mostraram que o melhor meio para a formação
de calos, tanto nos explantes de folhas quanto nos de
raízes, foi o meio MS + 6-BA (1,0 mg L-1) e o melhor meio
para brotamento foi o Pierik 1, também em folhas e raízes,
porém apresentou melhores resultados nos explantes de
raízes.
Esses resultados são totalmente opostos ao
esperado, pois para formação de calos o hormônio mais
comum e com melhores resultados foram as auxinas e não
as citocininas, como foi observado nesse ensaio.
Quando se compararam os resultados obtidos com
A. plowmannii com A. andraeanum Linden observaramse resultados conflitantes, pois no A. andraeanum a
formação de calo ocorreu em folhas inoculadas em meio
TABELA 2 Número de brotos, de formação de calos e de contaminação observados no Anthurium plowmannii
cultivado in vitro, em câmara escura.
Meio
Número
inicial de
explantes
(folha)
MS
24
P1
24
MS+6BA
24
Número
inicial de
explantes
(raiz)
folhas
Brotamento
Calo
Contaminação
0
(0%)
1
(4,16%)
2
(8,33%)
0
(0%)
2
(8,33%)
4
(16,6%)
1
(4,16%)
1
(4,16%)
0
(0%)
24
24
24
raiz
Brotamento
Calo
Contaminação
0
(0%)
6
(25%)
0
(0%)
0
(0%)
1
(4,16%)
3
(12,5%)
1
(4,16%)
3
(12,5%)
3
(12,5%)
20
Pierik 1, que continha auxina e não em meio MS acrescido
de citocinina, o mesmo ocorreu para formação de calos em
raízes.
No A. andraeanum o meio MS acrescido de 6-BA
foi utilizado para brotamento, o que não ocorreu na espécie
A. plowmannii cujo maior brotamento aconteceu no meio
Pierik 1.
Segundo Tombolato et al. (2002), o A. andraeanum
apresentou rápida formação de calo em explantes de
lâminas foliares quando esses foram colocados em
câmara escura. Esse foi um dos pontos no qual o resultado
do ensaio condiz com a literatura, sendo que os primeiros
calos formados nos explantes foliares em câmara escura
ocorreram, após 12 semanas, e nos explantes foliares em
câmara clara, após 15 semanas. Houve, portanto três
semanas de diferença, ou seja, os resultados obtidos em
explantes de folhas foram mais rápidos naqueles que
permaneceram no escuro. Porém, os explantes foliares
que ficaram em câmara clara também apresentaram
formação de calo, mas levaram um tempo maior para se
formarem.
CONCLUS›ES
O meio mais eficaz para formação de calo, em
explantes de folhas e raízes, nas condições desses ensaios
foi o MS + 6-BA (1,0 mg L-1). Para a regeneração, o meio
mais eficaz foi o de Pierik 1, em ambos os explantes, porém
com melhores resultados nos explantes de raízes.
Não houve diferença entre a indução de calo entre
o cultivo em câmara clara e em câmara escura.
REFER¯NCIAS BIBLIOGR˘FICAS
CASTRO, C. E. F; SILVEIRA, R. B. A; PEREIRA I. T. M.
Propagação de plantas ornamentais. In: CASTRO, C. E. F;
ANGELIS, B. L. D; MOURA, L. P. P; SILVEIRA, R. B. A;
ANGELIS, G. Neto; SATO, N. T. Manual de Floricultura.
Maringá, 1992, p. 53-79.
CHAN, L. K; TAN C. M; CHEW, G. S. Micropropagation of
the Araceae ornamental plants. Acta Horticulturae, Leuven,
n. 616, p. 383-390, 2003.
GRATTAPAGLIA, D; MACHADO, M. A.
Micropropagação. In: TORRES, et al.[ed]. Cultura de
Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília:
EMBRAPA, 1998. v.1, p. 183-260.
IMENES, S. D. L; WOLFF V. R. dos S; BERGMANN, E. C;
IDE, S. Primeiros registros da ocorrência de Acutaspis
umbonifera (Newstead,1920) e Acutaspis litrorana lepage
(Hemiptera, Diaspididae) em Anthurium andreanum lind.
(Araceae), no Brasil, 1942. Arquivo Instituto Biológico, São
Paulo, v. 69, n. 2, p. 85-89, abr/jun, 2002.
growth and bioassays with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum, v. 15, n. 3, p. 473-479. 1962.
TOMBOLATO, A. F.C; QUIRINO E. A. Multiplicação in
vitro de novas seleções de A. andraeanum Linden. Revista
Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v.2 n.1,
p.37-46, 1996.
TOMBOLATO, A. F. C; RIVAS, E. B; COUTINHO, L. N;
BRGMANN, E. C; IMENES, S. L; FURLANI, P. R; CASTRO,
C. E. F; MATHHES, L. A; SAES, L. A; COSTA, A. M. M;
TAGLIACOZZO, G. M. D; LEME, J. M. O cultivo de antúrio,
Instituto Agronômico(IAC), Campinas : IAC, 2002.
TOMBOLATO, A. F. C; CASTRO, A. C. R. Antúrio. In:
TERAO D; CARVALHO, A. C. P. P; BARROSO, T. C. da S.
F. Flores Tropicais, Tropical Flowers. Brasília, DF:
EMBRAPA Informação Tecnológica, 2005.
TOMBOLATO, A.F.C; COSTA, A.M.M. Micropropagação
de plantas ornamentais. Campinas, Instituto Agronômico,
1998. 72p. (Boletim Técnico 174).
INDUÇ‹O IN
VITRO
BROTOS
Indução
in vitroDE
de brotos
em paricá...EM PARIC˘
(Schizolobium parahyba var. amazonicum)1
21
IN VITRO SHOOT INDUCTION IN PARICA
(Schizolobium parahyba var. amazonicum)
IULLA NAIFF RABELO DE SOUZA REIS2, OSMARALVES LAMEIRA3,
IRACEMA MARIA CASTRO COIMBRA CORDEIRO4,ALLAN GUERREIRO CARNEIRO5,
SILVANEY FONSECA FERREIRA6
Parte da Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural da Amazônia/UFRA Av. Tancredo Neves, 2501, Montese 66077-530
Belém-PA, pelo primeiro autor.
2
Doutoranda em Fisiologia Vegetal Universidade Federal de Viçosa/UFV Av. PH Rolfs, s/n Campus Universitário 36570-000
Viçosa, MG [email protected]
3
Pesquisador, Doutor Embrapa Amazônia Oriental/EMBRAPA Cx. P. 48 66095-100 Belém, PA [email protected]
4
Doutoranda em Sistemas Agroflorestais Universidade Federal Rural da Amazônia/UFRA Av. Tancredo Neves, 2501 66077-530
Belém, PA [email protected]
5
Cientista da Computação Centro Universitário do Pará/CESUPA Av. Governador José Malcher, 1963 66060-230 Belém, PA
[email protected]
6
Bióloga, Mestre em Ciência Animal
Universidade Federal do Pará/UFPA Cx. P. 479 66075-110
Belém, PA
[email protected]
1
RESUMO
Na micropropagação, órgãos e tecidos de plantas são
introduzidos in vitro, estabelecidos e mantidos em culturas
assépticas para regenerar novas plantas. Objetivou-se, no
trabalho, induzir brotações in vitro em três tipos de explante de
paricá inoculados em meio MS modificado contendo 6benzilaminopurina (BAP) e suplementado de sacarose e ácido
giberélico (AG3). Os tratamentos testados para indução de
brotações foram constituídos de três concentrações de sacarose
(0, 30 e 60 g L-1), duas concentrações de AG3 (0 e 0,5 mg L-1) e
três fontes de explantes (segmentos apicais, nodais e
intercotiledonares). O delineamento experimental adotado foi
inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 3 x 3 x 2, com 4
repetições. Enquanto o AG3 não exerceu influência sobre a
indução e comprimento de brotações, o uso de sacarose mostrouse essencial para a multiplicação in vitro dessa espécie a partir
de segmentos nodais e intercotiledonares.
Termos para indexação: Micropropagação, ácido giberélico, 6benzilaminopurina, sacarose, explantes.
ABSTRACT
During the process of micropropagation, organs and
tissues of plants are introduced in vitro, established and
maintained in aseptic cultures to regenerate new plants. The
objective of this work was to induce in vitro shoots in three
explant types of parica inoculated in MS medium containing 6benzylaminopurine (BAP), supplemented with sucrose and
gibberellic acid (GA3). The treatments tested for shoot induction
consisted of three sucrose concentrations (0.30 and 60 g L-1),
two GA3 concentrations (0 and 0.5 mg L-1) and three explant
sources (apical, nodal and intercotyledon segments). The
experimental design used was a completely randomized, in a
factorial 3 x 3 x 2, with 4 repetitions. While the use of GA3 had
no influence on the induction and length of shoots, and the use
of sucrose showed to be essential for in vitro multiplication of
this species from nodal and intercotyledon segments.
Index terms: Micropropagation, gibberellic acid, 6benzylaminopurine, sucrose, explants.
INTRODUÇ‹O
O Schizolobium parahyba (Vell.) Blake var.
amazonicum (Ducke) Barneby é uma espécie florestal, de
ocorrência na Amazônia, que vem sendo utilizada
principalmente para a produção de lâminas para
compensados, além de fornecer matéria-prima para
obtenção de celulose, entre outras aplicações (FALESI &
SANTOS, 1996; CARVALHO & VIÉGAS, 2004). A árvore é
indicada para plantios comerciais, sistemas agroflorestais
e reflorestamento de áreas degradadas, devido ao seu
rápido crescimento e ao bom desempenho, tanto em
formações homogêneas quanto em consórcios (SOUSA et
al., 2005).
Apesar da facilidade de se obter mudas pelo
método convencional, os plantios de paricá precisam ser
(Recebido em 16 de maio de 2007 e aprovado em 29 de abril de 2008)
22
REIS, I. N. R. de S. et al.
formados com plantas que tenham características de
interesse, como fuste reto e crescimento uniforme, para
melhorar seu rendimento. No entanto, no estado do Pará, os
plantios de paricá apresentam grande variação de
crescimento e de produtividade. Assim, o desenvolvimento
de metodologias de micropropagação in vitro tem sido
apontado como alternativa potencial para produção de
mudas de paricá, pela possibilidade de multiplicar fragmentos
vegetais e obter-se milhares de mudas geneticamente iguais
à planta mãe e com maior uniformização dos plantios.
Na micropropagação, órgãos e tecidos de plantas
são introduzidos in vitro, estabelecidos e mantidos em
culturas assépticas para regenerar novas plantas
(HARTMANN et al., 2002). As técnicas in vitro têm
mostrado vantagens sobre os métodos da propagação
tradicional, pois as culturas são iniciadas com fragmentos
de plantas (explantes), requerem pequeno espaço para
manter ou para aumentar o número de plantas e podem
produzir plantas livres de patógenos (GEORGE, 1993).
A multiplicação é a segunda fase da propagação in
vitro de plantas, com objetivo de multiplicar as gemas ou
as microestacas, para posterior enraizamento. As plantas
desenvolvidas a partir desses explantes, por possuírem
gemas pré-existentes, geralmente são fiéis na reprodução
do genótipo da planta matriz (HARTMANN et al., 2002).
A exemplo do que acontece em outros eventos, os
reguladores de crescimento são fundamentais para o
estabelecimento da competência e determinação celular,
condições necessárias para a formação de meristemas
caulinares e/ou radiculares nas plantas. As citocininas são
os reguladores de crescimento mais utilizados na
multiplicação in vitro, sendo a 6-benzilaminopurina (BAP)
bastante empregado para essa finalidade, enquanto que
as giberelinas incrementam tanto a divisão celular quanto
o alongamento das células formadas (TAIZ & ZEIGER,
2004), mas têm como principal efeito estimular o
crescimento de órgãos já formados. No entanto, podem
inibir a iniciação de outros processos de formação de
órgãos (GEORGE & SHERRINGTON, 1984). De acordo com
Guerra et al. (1998), um dos principais efeitos e aplicações
das giberelinas em cultura de tecidos é o alongamento das
brotações, durante a multiplicação.
Plantas e tecidos cultivados in vitro necessitam de
suprimento exógeno de carboidratos como fonte de
carbono, uma vez que tais plantas não são completamente
autotróficas e, portanto, não têm condições de realizar a
fotossíntese para sustentar seu crescimento e diferenciação
(MINOTTA, 1981; GARCIA et al., 2002). Muitos estudos
têm sido conduzidos para definir o tipo e a concentração
da fonte de carbono que permitam o desenvolvimento e
estabelecimento da cultura (PAIVA NETO & OTONI, 2003),
sendo que a sacarose é a principal fonte de carbono usada
no meio de cultura para propagação in vitro de plantas
superiores (TAHA et al., 2001; ALKHATEEB, 2001).
Objetivou-se, no trabalho, induzir brotações in vitro
em três tipos de explante de paricá, Shizolobium parahyba
var. amazonicum inoculados em meio MS contendo 6benzilaminopurina (BAP), suplementados ou não de
sacarose e ácido giberélico (AG3).
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi desenvolvido no laboratório de
Biotecnologia e Recursos Genéticos da Embrapa Amazônia
Oriental (Belém/PA). As sementes de paricá procedentes
do município de Ji-Paraná, no estado de Rondônia, foram
obtidas através da Associação das Indústrias Exportadoras
de Madeiras do Estado do Pará (AIMEX).
Como fontes de explante, foram utilizadas plântulas
germinadas in vitro, com 20 dias de cultivo. Os explantes,
com tamanho de aproximadamente 1,0 cm, foram inoculados
na posição vertical em frascos contendo 40 mL de meio de
cultura básico MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) com as
concentrações de NH4NO3 e Fe-EDTA reduzidas à metade
(demais componentes em suas concentrações normais),
solidificado com ágar 0,6%, suplementado com BAP (3 mg
L-1) e 0,1% de ácido cítrico, ajustado em pH 5,8 e
autoclavados a 120ÀC e 1,2 atm durante 20 minutos. As
culturas foram mantidas em sala de crescimento sob
temperatura de 24 µ 1ÀC, fotoperíodo de 16 horas de luz
branca fria e irradiância de 25 ømol m-2 s-1.
Indução in vitro de brotos em paricá...
Os tratamentos testados foram constituídos de três
concentrações de sacarose (0, 30 e 60 g L -1), duas
concentrações de ácido giberélico - AG3 (0 e 0,5 mg L-1) e
três tipos de explantes (segmento apical SA; segmento
nodal SN e segmento intercotiledonar SIC), constituindo
um arranjo fatorial 3 x 3 x 2, totalizando 72 unidades
experimentais, sendo que cada uma foi constituída por um
frasco contendo três explantes, em delineamento
inteiramente casualizado. As avaliações foram realizadas
após 20 dias de cultivo, avaliando-se o número e o
comprimento dos brotos.
e quando houve efeito significativo, as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de
probabilidade através do programa estatístico Sisvar
(FERREIRA, 2002). Os dados de número de brotos foram
transformados para (X + 0,5)½.
Para as variáveis estudadas, a análise de variância
indicou que somente ocorreu significância entre tipos de
23
de brotos foi obtido quando a giberelina estava associada
com a citocinina BAP, enquanto Figueredo et al. (2001)
constataram que o AG3 é necessário para o alongamento
das brotações de biribá (Rollinia mucosa Jacq.). Alguns
efeitos negativos do AG3 foram observados por Deccetti
(2000) e Moraes et al. (2004) no desenvolvimento de
brotações de araticum-bravo (Annona glabra L.), e na
proliferação de gemas axilares do porta-enxerto de pereira
(Pyrus calleryana Decne), respectivamente. O efeito do
AG 3 na proliferação de brotações varia conforme a
interação existente com outros reguladores de crescimento,
dependendo da espécie que está sendo micropropagada
(GEORGE, 1996).
Neste estudo foi observado que no meio MS
suplementado com 3 mg L-1 de BAP, mas na ausência de
sacarose, não houve formação de brotações, indicando
que mesmo com a presença de citocinina, há necessidade
de adição de carboidrato ao meio de cultivo para
multiplicação in vitro de paricá, independente do explante
utilizado (Figura 1).
explantes, concentrações de sacarose e a interação entre
os mesmos. Tal fato demonstra que a presença do regulador
de crescimento AG3, associado ao BAP, não influenciou
2
na formação e alongamento de brotos.
et al. (2006), em que a presença de AG3 não exerceu efeito
no número médio de brotações alongadas de unha de gato
(Uncaria guianensis (J. F. Gmel.). Na investigação de Yui
et al. (1990) com macieira (Malus domestica Borkh) cv.
Golden Delicious, foi observado que não houve diferença
significativa para os níveis de 0; 0,01; 0,1 e 1 mg L-1 de AG3,
indicando que esse regulador de crescimento não foi
necessário para a multiplicação in vitro dessa espécie. Esse
fato também foi verificado por Ochatt & Caso (1983) e
Melo-Farias et al. (1998) com pêssego (Prunus persica (L.)
Bastsch) e porta-enxerto de pereira Old Home x Farmingdale,
respectivamente.
Por outro lado, no estudo de Oliveira et al. (2001)
com bilimbi (Averrhoa bilimbi L.), o maior desenvolvimento
aA
1,8
NÀ médio de brotos
Resultados semelhantes foram obtidos por Pereira
aA
2,2
SA
SN
aA
bA
1,6
SIC
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,2
0
cA
bAB
0,4
aB aB aB
0
30
60
-1
Sacarose (g L )
Letras distintas entre si comparam: minúsculas, os explantes dentro
de cada concentração de sacarose; e maiúsculas, as concentrações
de sacarose em cada tipo de explante, ao nível de 5% de
probabilidade pelo Teste de Tukey.
FIGURA 1 Número médio de brotos de paricá a partir de
segmentos apicais (SA), nodais (SN) e intercotiledonares
(SIC), submetidos a diferentes concentrações de sacarose,
em meio MS com 3 mg L-1 de BAP. Embrapa Amazônia
Oriental, Belém-PA, 2007.
Quando foi usado 30 g L-1 de sacarose, segmentos
nodais e intercotiledonares não diferiram estatisticamente
entre si, com respectivamente 1,71 e 1,72 brotações por
explante, sendo superiores ao segmento apical, que
apresentou em média 0,21 brotações por explante. Por
outro lado, na concentração de 60 g L-1 de sacarose,
segmentos intercotiledonares foram mais eficientes (2
brotações/explante) que segmentos nodais, que formaram
em média 1,53 brotos, e segmentos apicais, que
apresentaram 0,27 brotos por explante. Nota-se ainda que
não houve diferença significativa entre as concentrações
de 30 e 60 g L-1 de sacarose para cada tipo de explante
avaliado (Figura 1).
Da mesma forma, Pinto et al. (1994) observaram que
segmentos nodais de pau-santo (Kielmeyra coriacea
Mart. e Zucc) apresentaram maior capacidade de produção
de brotos em relação aos segmentos apicais. Rodrigues et
al. (2006) verificaram que as concentrações de 30, 45 e 60 g
L-1 de sacarose apresentaram melhores resultados em
macieira (Malus domestica), sendo a maior taxa de
multiplicação obtida com os explantes de ápices caulinares,
enquanto que Flores et al. (1999) obtiveram maior número
de brotações a partir de segmentos apicais de Malus
prunifolia Steud., quando utilizaram 45 g L-1 de sacarose
no meio MS.
Os resultados referentes ao número de brotos
obtidos neste trabalho se assemelham ao que já foi relatado
por Cordeiro et al. (2004) utilizando 3 mg L-1 de BAP e 3 %
de sacarose. Para esse autor, a baixa multiplicação de brotos
em paricá está relacionada com características da própria
planta.
Quanto ao comprimento dos brotos, foi verificado
que no meio de cultivo contendo 30 g L-1 de sacarose,
segmentos nodais (0,32 cm) e intercotiledonares (0,46 cm)
não diferiram significativamente entre si, e foram mais
eficientes que segmentos apicais, os quais obtiveram
brotos medindo em média 0,14 cm, conforme observa-se
na Figura 2.
No meio de cultura básico MS, contendo 60 g L-1
de sacarose, os segmentos intercotiledonares apresentaram
0,8
Comprimento médio dos brotos
(cm)
24
aA
SA
SN
0,7
SIC
0,6
aB
0,5
0,4
bA
aA
0,3
bA
0,2
0,1
0
aA aB
0
cA
aC
30
60
-1
Sacarose (g L )
Letras distintas entre si comparam: minúsculas, os explantes dentro
de cada concentração de sacarose; e maiúsculas, as concentrações
de sacarose em cada tipo de explante, ao nível de 5% de
probabilidade pelo Teste de Tukey.
FIGURA 2 Comprimento médio (cm) de brotos de paricá
a partir de segmentos apicais (SA), nodais (SN) e
intercotiledonares (SIC), submetidos a diferentes
concentrações de sacarose, em meio MS com 3 mg L-1 de
BAP. Embrapa Amazônia Oriental, Belém-PA, 2007.
resultados mais satisfatórios, com comprimento médio dos
brotos de 0,71 cm, diferindo estatisticamente de segmentos
nodais (0,37 cm) e apicais (0,11 cm). Com relação à diferença
entre concentrações de sacarose dentro de cada tipo de
explante, observou-se que, para segmentos apicais e
nodais, não houve diferença significativa do comprimento
dos brotos entre as concentrações de 30 e 60 g L-1 de
sacarose (Figura 2).
Ao contrário do verificado neste estudo, Sabá et
al. (2002) observaram que segmentos apicais foram mais
eficientes que segmentos nodais na formação e
comprimento de brotações de jaborandi (Pilocarpus
jaborandi Holmes). Por sua vez, Andrade et al. (2000)
verificaram que não houve diferença significativa entre
segmentos apicais e nodais, em relação ao comprimento
das brotações de aroreira (Myracrodruom urundeuva
Allem.).
De acordo com Nicoloso et al. (2003), as
concentrações de 30, 45 e 60 g L -1 de sacarose
proporcionaram o maior comprimento das brotações em
ginseng brasileiro [Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen],
sendo que, nessas mesmas concentrações de sacarose, o
comprimento médio dos brotos de macieira (Malus
domestica) variou entre 1 e 3 cm, e a maior taxa de
multiplicação foi obtida a partir de ápices caulinares
(RODRIGUES et al., 2006).
A Figura 3 ilustra brotações formadas a partir de
segmento apicais (3A), nodais (3B) e intercotiledonares
(3C), evidenciando o aparecimento de lenticelas nos
últimos dois explantes, as quais estão freqüentemente
presentes no cultivo in vitro de paricá.
Notou-se então que diferentes explantes
respondem de forma diferenciada, mesmo quando
submetidos às mesmas condições de cultivo. Esse fato
está relacionado com o que já foi mencionado por Gaspar
et al. (1996), no qual as respostas de células, tecidos e
órgãos cultivados in vitro podem variar de acordo com as
condições da cultura, tipo de explante e genótipo.
Similarmente ao verificado por Cordeiro et al. (2004),
também trabalhando com paricá, foi observada a presença
de calos em todos os tratamentos contendo sacarose. Essas
estruturas iniciaram-se na base do explante, apresentando
inicialmente coloração bege e textura friável. A oxidação
também se fez presente, tornando-se mais expressiva a
partir dos 20 dias de cultivo.
De acordo com Bassan et al. (2006), a formação de
calos na micropropagação in vitro não é desejável. No
entanto, o aparecimento dessas estruturas na base de
explantes nodais, ápices caulinares ou brotações é muito
comum em espécies lenhosas. Jones et al. (1990) verificaram
25
a formação de calos na base de explantes de acácia (Acacia
saligna H. L. Wendl.) inoculados em meio de cultivo sem
adição de reguladores de crescimento. Borges Júnior et al.
(2004) observaram o aparecimento de calos em propágulos
de acácia negra (Acacia mearnsii De Wild.) submetidos à
multiplicação em meio de cultura B5 (GAMBORG et al.,
1968), contendo citocinina.
CONCLUS›ES
O AG3 não exerceu influência sobre a indução e
comprimento de brotações de paricá, e a sacarose mostrou
ser essencial para a multiplicação in vitro dessa espécie, a
partir de segmentos nodais e intercotiledonares.
ALKHATEEB, A.A. Influence of different carbon sources
and concentrations on in vitro root formation of date palm
(Phoenix dactylifera L.) cv Khanezi. Zagazig J. Agric. Res.
v.28, n.3, p.597 608. 2001.
ANDRADE, M.W.de; LUZ, J.M.Q.; LACERDA, A.S.;
MELO, P.R.A.de. Micropropagação de aroreira
(Myracrodruom urundeuva Fr. All). Ciência e
Agrotecnologia, Lavras, v.24, n.1, p.174 -180. jan./mar. 2000.
BASSAN, J.S.; REINIGER, L.R.S.; ROCHA, B.H.G.;
SEVERO, C.R.P.; FLORES, A.V. Oxidação fenólica, tipo de
explante e meios de cultura no estabelecimento in vitro de
canafístula (Peltophorum dubium (Spreng.) Taub.).
Ciência Florestal, Santa Maria, v.16, n.4, p.381-390, 2006.
Disponível em: <http://www.ufsm.br/cienciaflorestal/
artigos/v16n4/A3V16N4.pdf.>. Acesso em: 03 jan. 2007.
FIGURA 3 Brotações de paricá a partir de segmentos apicais (A), nodais (B) e intercotiledonares (C), inoculados em
meio MS com 60 g L-1 de sacarose e 3 mg L-1 de BAP. Embrapa Amazônia Oriental, Belém-PA, 2007.
26
BORGES JUNIOR, N.; SOBROSA, R.C.; MARTINSCORDER, M.P. Multiplicação in vitro de gemas axilares de
acácia-negra (Acacia mearnsii De Wild.). Revista ˘rvore,
Viçosa, v.28, n.4, p.493-498, 2004. Disponível em: <http://
www.scielo.br/pdf/rarv/v28n4/22599.pdf>. Acesso em: 03
jan. 2007.
CARVALHO, J.G. de C.; VIÉGAS, I. de J.M. Caracterização
de Sintomas de Deficiências de Nutrientes em Paricá
(Schizolobium amazonicum Huber ex. Ducke). Belém:
Embrapa, 2004. Circular Técnica, 37. Disponível em: <//
http: http://www.cpatu.embrapa.br/online/circular/
Circ.tec.37.pdf./> Acesso em: 07 fev. 2006.
CORDEIRO, I.M.C.C.; LAMEIRA, O.A.; OHASHI, S.T.;
ROSAL, L.F. Efeito de BAP sobre a proliferação in vitro de
Schizolobium amazonicum Huber ex Ducke (Paricá).
Cerne, Lavras, v.10, n.1, p.118-124, jan./jun. 2004.
DECCETTI, S. F. C. Propagação in vitro de Annona glabra
L. 2000. 101p. Dissertação (Mestrado em Agronomia)
Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
FALESI, I. C., SANTOS, J. C. dos. Produção de mudas de
paricá (Schizolobium amazonicum Huber). Belém: FCAP,
1996. 16 p. (Informe Técnico, 20)
FERREIRA, D. F. SISVAR Sistemas de análises de
variância para dados balanceados: programa de análises
estatísticas e planejamento de experimentos. Versão 4.3.
Lavras: UFLA, 2002.
FIGUEREDO, S. F. L.; ALBARELLO, N.; VIANA, V. R. C.
Micropropagation of Rollinia mucosa (Jacq.) Baill. In Vitro
Cellular and Developmental Biology Plant, Wallingford,
v.37, n.4, p.471-475, jul/aug. 2001. Disponível em: <http://
www.springerlink.com/content/y3223827w7h36k45/>.
Acesso em 05 jan. 2007.
FLORES, R.; LESSA, A.O.; PETERS, J.A.; FORTES, G.R.de
L. Efeito da sacarose e do benomyl na multiplicação in
vitro da macieira. Pesquisa Agropecuária Brasileira,
Brasília, v.34, n.12, p.2363-2368, dez. 1999.
GAMBORG, O.L.; MILLER, R.A.; OJIMA, K. Nutrient
requeriments of suspension cultures of soybean root cells.
Experimental Cell Research, New York, v.50, p.151-158, 1968.
GARC¸A, J.L.; TRONCOSO, J.; SARMIENTO, R.;
TRONCOSO, A. Influence of carbon source and
concentration on the in vitro development of olive zygotic
embryos and explants raised from them. Plant Cell, Tissue
and Organ Culture, v.69, p.95 100, 2002.
GASPAR, T.; KEVERS, C.; PENEL, C.; GREPIN, H.; REID,
D. M.; THORPE, T. A. Plant hormones and plant growth
regulators in plant tissue culture. In Vitro Cell Development
Biology Plant, Columbia, v. 32, p.272-289, oct./dec. 1996.
GEORGE, E.F. Plant Propagation by Tissue Culture. Part
1. The technology: Exegetics Ltd., England, 1993. 574p.
GEORGE, E. F. Plant propagatation by tissue culture: part
2: The practice. Exegetics Ltd., England, 1996. 574 p.
GEORGE, E.F.; SHERRINGTON, P.D. (Ed.). Plant
propagation by tissue culture. Eversley: Exegetics, 1984.
709p.
GUERRA, M. P.; TORRES, A. C.; TEIXEIRA, J. B.
Embriogênese somática e sementes sintéticas. In: TORRES,
A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos
e transformações genéticas de plantas. Brasília, DF:
EMBRAPA/CBAB, 1998. p.533-568.
HARTMANN, H. T.; KESTER, D. E.; DAVIES, F. T.;
GENEVE, R. L. Plant Propagation: Principles and Pratices.
7 ed. New Jersey: Prentice Hall, 2002. 880p.
JONES, T.C.; BATCHELOR, C.A.; HARRIS, P.J.C. In Vitro
Culture and Propagation of Acacia Species (A. Bivenosa,A.
Holosericea, A. Salicina, A. Saligna, and A.
Sclerosperma). International Tree Crops Journal, Oxon,
v.6, n.2/3, p.183-192, 1990.
MELO-FARIAS, P. C.; PETERS, J. A.; NAKASU, B. H.
Micropropagação de porta-enxerto de Pereira Old Home x
Farmingdale. Revista Brasileira de Agrociência, Pelotas,
v.2, n.2, p.71-78, 1998.
MINOTTA, G. Ricerche sull impiego di differenti carboidrati
nei substrati di micropropagazione del susino. Rivista della
Ortoflorofrutticoltura Italiana, v.65, p.343-352, 1981.
MORAES, L.K.A.de; FELISBINO, C.; CRESTANI, L.;
SILVA, A.L.da. Estabelecimento e multiplicação in vitro de
Pyrus calleryana D-6 em sistema de cultura dupla-fase .
Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.26, n.3,
p.403-405, dez. 2004. Disponível em: <http://www.scielo.br/
pdf/rbf/v26n3/23132.pdf>. Acesso em 05 jan. 2007.
27
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p. 473-497,
1962.
concentrações de benzilaminopurina na multiplicação in
vitro de brotos de Kielmeyera coriacea. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, v.29, n.6, p.867-873,
jun. 1994.
NICOLOSO, F.T.; ERIG, A.C.; RUSSOWSKI, D.; MARTINS,
C.F. Efeito de doses e fontes de carboidratos no
crescimento de plantas de ginseng brasileiro (Pfaffia
glomerata (Spreng.) Pedersen) cultivadas in vitro. Ciência
e Agrotecnologia, Lavras, v.27, n.1, p.84-90, 2003.
RODRIGUES, M.de M.; MELO, M.das D.; ALOUFA, M.A.I.
Propagação vegetativa in vitro e análise estrutural de
macieira. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.41,
n.1, p.171-173, jan. 2006. Disponível em: <http://
atlas.sct.embrapa.br/pdf/pab2006/01/41n01a24.pdf>.
Acesso em: 10 jan. 2007.
OCHATT, S. J.; CASO, O. H. In vitro propagation of peach:
II. a medium for in vitro multiplication of 56 peach cultivars.
Fruit Varieties Journal, Massachucetts, v.40, n.2, p.3948, 1983.
OLIVEIRA, A. K. D. de; ROCHA, R. H. C.; OLIVEIRA, O. F.
de; C˜MARA, F. A. A.; Multiplicação in vitro do Bilimbi
utilizando-se diferentes concentrações de reguladores de
crescimento. Caatinga, Mossoró, v.14, n.1/2, p.37- 41, 2001.
PAIVA NETO, V.B., OTONI, W.C. Carbon sources and their
osmotic potential in plant tissue culture: Does it matter?
Scientia Horticulturae. v.97, p.193 202, 2003.
PEREIRA, R.de C.A.; PINTO, J.E.B.P.; BERTOLUCCI,
S.K.V.; CASTRO, E.M.de; SILVA, F.G. Germinação, avaliação
do ácido giberélico e posição do explante no alongamento
in vitro de Uncaria guianensis (Aublet) Gmelin Rubiaceae
(unha-de-gato). Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.30,
n.4, p.637-642, jul./ago. 2006. Disponível em: <http://
www.editora.ufla.br/revista/30_4/art07.pdf>. Acesso em 10
jan. 2007.
PINTO, J.E.B.P.; ARELLO, E.F.; PINTO, C.A.B.P.;
BARBOSA, M.H.P. Uso de diferentes explantes e
SAB˘, R.T.; LAMEIRA, O.A.; LUZ, J.M.Q.; GOMES,
A.P.R.; INNECCO, R. Micropropagação do jaborandi.
Horticultura Brasileira, Brasília, v.20, n.1, mar. 2002.
Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/hb/v20n1/
14428.pdf>. Acesso em: 03 jan. 2007.
SOUSA, D.B.de; CARVALHO, G.S.; RAMOS, E.J.A. Paricá
(Schizolobium amazonicum Huber ex Ducke). Manaus:
INPA. n.13, 2005. 2p. (Informativo Técnico Rede Sementes
da Amazônia). Disponível em: <http:www.rsa.ufam.edu.
br8080sementesespeciespdfdoc13.pdf>. Acesso em 22
mai. 2006.
TAHA, H.S., BEKHEET, S.A., SAKER, M.M.. Factors
affecting in vitro multiplication of date palm. Biologia
Plantarum, v.44, n.3, p.431 433, 2001
TAIZ, L; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 3a edição. Porte
Alegre: Artmed, 2004. 719 p.
YUI, E.; CORREA, D. M.; PASQUAL, M.; PINTO, J. E. B. P.
Micropropagação in vitro da macieira (Malus domestica
Borkh) cultivar Golden Delicious. Ciência e Prática,
Lavras, v.14, n.1, p.56-61, 1990.
APERFEIÇOAMENTO
28
DOCARVALHO,
TESTED. D.
COM
COLEŁPTILO DE TRIGO
C. C. et al.
(Triticum aestivum L.) PARA A DETECÇ‹O
DE REGULADORES VEGETAIS
IMPROVEMENT OF AN ASSAY WITH WHEAT COLEOPTILE
(Triticum aestivum L.) TO DETECT PLANT REGULATORS
DANIEL DIEGO COSTA CARVALHO1, DENILSON FERREIRA OLIVEIRA2, MOACIR PASQUAL3
Engenheiro Agrônomo, Mestrando Departamento de Fitopatologia/DFP Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037
37200-000 Lavras, MG [email protected]
2
Químico, D. Sc., Professor Associado Departamento de Química/DQI Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037
37200-000 Lavras, MG [email protected]
3
Engenheiro Agrônomo, Doutor, Professor Titular Departamento de Agricultura/DAG Universidade Federal de Lavras/UFLA
Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG [email protected]
1
RESUMO
Com vistas a aperfeiçoar um teste já existente para a
detecção de reguladores de plantas, esta pesquisa, objetivou-se
estabelecer uma metodologia para a obtenção de coleóptilos de
trigo (Triticum aestivum L.) que pudessem ser mantidos durante
20 h, sem curvamento, em tubos contendo uma solução aquosa
de sacarose a 2%, sem rotação. Um resultado satisfatório foi
obtido com coleóptilos de plântulas estioladas com
aproximadamente 2,5 cm de altura, eretas e com diâmetro de
caulículo igual a 2 mm, da variedade de trigo BRS-49. Com esse
aperfeiçoamento, tornou-se possível identificar, em um único
teste e sem o uso de máquinas para a rotação de tubos, promotores
e inibidores do crescimento de plantas. Como controles para tal
teste podem ser empregados glifosato a 7,968 g mL-1 (inibidor) e
2,4-D a 1,5 mg mL-1 (promotor).
Termos para indexação: Bioensaio, cultura de tecidos,
reguladores de crescimento.
ABSTRACT
In order to improve an existing test to detect plant
regulators, this research aimed to establish a methodology to
obtain wheat coleoptiles (Triticum aestivum L.) able to stand,
without bending, during 20 h in a tube containing an aqueous 2%
sucrose solution with no rotation. A satisfactory result was
obtained with coleoptiles from approximately 2.5 cm etiolated
plantules of the BRS-49 wheat cultivar, which were erected and
with 2.0 mm diameter caulicles. With this improvement, it became
possible to identify, in a single test, without the use of tube
rotating machines, plant growth promoters and inhibitors. As
controls for this test, it is possible to use glyphosate at 7.968 g
mL-1 (inhibitor) and 2,4-D at 1.5 mg mL-1 (promoter).
Index terms: Bioassay, tissue culture, growth regulators.
INTRODUÇ‹O
Algumas substâncias orgânicas, denominadas
reguladores de crescimento de plantas, são capazes de
influenciar os processos fisiológicos vegetais quando em
baixas concentrações (ZAGO et al., 2000). Para detectá-los
de forma rápida em amostras de origem vegetal ou
microbiana faz-se necessário o emprego de procedimentos
de fácil execução e baixo custo. Para tanto, uma das
alternativas descritas na literatura consiste no emprego de
coleóptilo de aveia (Avena sativa L.) que, apesar de muito
sensível aos promotores do crescimento de plantas, torna
bastante difícil a identificação dos inibidores (ANTOLIC
et al., 2003; BONNER, 1949; NITSCH & NITSCH, 1996;
SIROIS, 1966). Há também o teste com ervilha (Pisum
sativum L.) que, de forma análoga, é mais ajustado para a
detecção de promotores, principalmente auxinas (HOSSEL
et al., 2005; UEDA et al., 1999). Outra possibilidade descrita
diz respeito ao emprego de radículas de plantas como
Cenchrus ciliaris L., mas a falta de sensibilidade a vários
reguladores do crescimento de plantas ainda persiste
(NITSCH & NITSCH, 1996; PASQUAL, 2001). A melhor
alternativa parece corresponder ao uso de coleóptilo de
trigo (Triticum aestivum L.), que permite identificar
promotores (ABDELBAR & MIELKE, 1979; CARVALHO
et al., 2003b) e inibidores do crescimento de plantas
(BAUER et al., 2005; CARVALHO et al., 2006).
O grande problema relacionado ao uso de coleóptilo
de trigo consiste no seu curvamento quando em solução
nutritiva (CARVALHO et al., 2003a), o que pode ser
contornado com o uso de máquinas rotativas que,
(Recebido em 26 de fevereiro de 2007 e aprovado em 28 de maio de 2008)
Aperfeiçoamento do teste com coleóptilo de trigo...
entretanto, elevam consideravelmente o custo do teste
(HANCOCK & BARLOW, 1953; NITSCH & NITSCH, 1996).
Em decorrência, objetivou-se neste trabalho aprimorar este
teste de forma a torná-lo menos oneroso.
MATERIAL E MÉTODOS
Sementes de trigo (Triticum aestivum L. var. BRS49), doadas pela Embrapa Trigo, foram semeadas em areia
umedecida e autoclavada a 120 ÀC, sob pressão de 1,2
Kgf/cm2, durante 60 minutos. Após três dias a 24 oC, na
ausência de luz, as plântulas estioladas obtidas (com
altura média de 2,5 cm) tiveram os 2 mm apicais cortados
e descartados, aproveitando-se para o teste os
coleóptilos, que correspondiam aos 4 mm seguintes. Em
cada tubo de cultura de 15 x 150 mm foram colocados
0,5, 1,0 e 2,0 mL de solução de sacarose a 2 % (g mL-1),
tamponada em pH 5,0 com K2HPO4 (1,794 g mL-1) e ácido
cítrico monohidratado (1,019 g mL) (NITSCH & NITSCH,
1996). Em cada tubo, que correspondia a uma repetição
(empregaram-se três repetições por tratamento),
colocaram-se cinco coleóptilos, que foram mantidos no
escuro a 26 oC, em sala de crescimento, por 20 horas.
Para se testar o efeito da agitação, os tubos foram
envoltos por papel alumínio, conforme descrito por
Pasqual et al. (1998), e colocados em mesa agitadora
(Quimis, modelo Q225M), regulada em 60 rpm, que foi
mantida na referida sala de crescimento. Após 20 horas,
os coleóptilos foram retirados dos tubos e dispostos
lado a lado, sobre superfície preta, para serem
fotografados com câmera digital. As imagens obtidas
foram ampliadas (3,28 vezes) e impressas, para que as
medições dos coleóptilos fossem realizadas com uma
régua. Uma vez fotografados, os coleóptilos foram
liofilizados e pesados em balança analítica. Para a
realização dos cálculos estatísticos, empregaram-se os
valores médios de massa seca de coleóptilo por tubo,
enquanto para a variável comprimento, o valor medido
para cada coleóptilo correspondeu a uma repetição. Os
dados obtidos foram separadamente submetidos à
análise de variância (ANAVA) e ao teste de Scott &
29
Knott (1974), a 5 % de probabilidade, no programa
SISVAR (FERREIRA, 2000).
Para serem testados, os seguintes
fitorreguladores, com suas respectivas concentrações,
foram dissolvidos na solução de sacarose: ácido
giberélico (GA 3 ) (2,0 mg L -1 ), ácido 2,4diclorofenoxiacético (2,4-D) (1,5 mg L -1), ácido
indolacético (AIA) (1,5 mg L-1) e 6-benzilaminopurina
(BAP) (3,0 mg L-1). Além deles, o herbicida comercial
Agrisato 480 CS, fabricado pela Alkagro do Brasil Ltda,
na concentração de 7,968g de glifosato L-1, também foi
estudado, empregando-se como testemunha a solução
de sacarose a 2 % (g mL-1), tamponada em pH 5,0. Todo
o procedimento foi igual ao citado anteriormente, exceto
pelo fato de não ter havido agitação em nenhum dos
experimentos. Antes da análise estatística, os valores
foram convertidos em porcentagem, atribuindo-se 100
% aqueles obtidos com a solução de sacarose
(testemunha).
Ao empregar apenas solução de sacarose,
observou-se que o problema de curvamento dos
coleóptilos de trigo era muito acentuado (Figura 1), o
que tornava bastante trabalhoso e pouco confiável a
medida do comprimento do coleóptilo. Ademais,
acreditava-se que o referido curvamento poderia
interferir de forma significativa no tamanho e na massa
do coleóptilo.
Realizou-se, então, um experimento durante o
qual os coleóptilos foram mantidos em solução de
sacarose, com e sem agitação. Observou-se que, em
todos os casos, não havia qualquer diminuição da
curvatura dos coleóptilos, que continuavam com o
aspecto apresentado na Figura 01. Como a agitação do
meio não tinha surtido qualquer efeito, propôs-se que
a falta de homogeneidade no comportamento dos
coleóptilos deveria estar refletindo a heterogeneidade
das plântulas empregadas. Em decorrência, um novo
experimento com solução de sacarose foi realizado,
30
CARVALHO, D. D. C. C. et al.
FIGURA 1 Curvamento de coleóptilos de trigo mantidos em solução de sacarose a 2%, provenientes de plântulas
estioladas, com altura variando entre 2,0 e 4,0 cm, eretas (70 80%) e com diâmetro de caulículo igual a 2 mm (Barra
corresponde a 1,10 cm).
FIGURA 2 Coleóptilos de trigo mantidos em solução de sacarose a 2%, provenientes de plântulas estioladas, com
aproximadamente 2,5 cm de altura, eretas e com diâmetro de caulículo igual a 2 mm (Barra corresponde a 0,85 cm).
sendo que, desta vez, buscou-se empregar apenas
aqueles coleóptilos que eram provenientes de plântulas
estioladas, com aproximadamente 2,5 cm de altura, eretas
e caulículo com diâmetro em torno de 2 mm, que foram
obtidas com base nos procedimentos descritos por
Osório (1992). Com isso, independente da agitação e
do volume de solução nos tubos, observou-se que os
coleóptilos apresentaram um curvamento bem reduzido
(Figura 2).
Observou-se também que os valores obtidos para
os comprimentos e massas dos coleóptilos eram
estatisticamente idênticos para todas as condições
estudadas (Tabela 1). Ou seja, os resultados mostravam
que era possível trabalhar com volumes de solução no
tubo de 0,5 a 2,0 mL, sem a necessidade de agitação, o que
simplificava o procedimento.
Uma vez comprovada que a variação de volume
entre 0,5 e 2,0 mL nos tubos não afetava os resultados do
experimento, optou-se por empregar o volume de 2,0 mL
para a condução dos ensaios com as substâncias
reguladoras do crescimento de plantas, já que assim se
obtinha melhor molhamento dos coleóptilos. Quanto às
concentrações de tais substâncias, buscou-se trabalhar
com valores próximos aos recomendados por Pasqual
(2001), para a cultura de tecidos vegetais.
Apesar das giberelinas (GAs) serem geralmente
efetivas para a elongação internodal (TAIZ & ZEIGER,
2006), nenhuma influência sobre os coleóptilos foi
observada para GA3 (Tabela 2).
Como as citocininas geralmente são necessárias
para a divisão de células vegetais in vitro (TAIZ & ZEIGER,
2006), esperava-se que BAP pudesse ter efeito sobre a
31
TABELA 1 Efeito do volume de solução e da agitação sobre o comprimento e a massa seca de coleóptilos de
plântulas estioladas de trigo1.
Volume (mL)
Agitação
Comprimento do coleóptilo (cm)2,3
Massa seca do coleóptilo (g)2
0,5
Com4
4,35 a
0,0030 a
Sem
4,45 a
0,0031 a
Com
4,75 a
0,0030 a
Sem
4,80 a
0,0030 a
Com
4,55 a
0,0031 a
Sem
4,60 a
0,0031 a
Coeficiente de Variação
13,1%
7,2%
4
1,0
2
2,0
Plântulas com aproximadamente 2,5 cm de altura, eretas e com diâmetro do caulículo igual a 2 mm, mantidas em solução
de sacarose a 2%; 2 Médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, fazem parte do mesmo agrupamento pelo teste
de Scott & Knott (1974), a 5% de probabilidade; 3Valores ampliados em aproximadamente 3,28 vezes; 4Mesa agitadora
a 60 rpm.
1
TABELA 2 Diferenças porcentuais promovidas pela ação de fitorreguladores, em comparação com a sacarose a 2%
(testemunha), sobre o comprimento e massa seca de coleóptilos de trigo provenientes de plântulas estioladas1.
Comprimento do coleóptilo (%)2
Massa seca do coleóptilo (%)2
98 a
97 a
2, 4-D (1,5 mg L )
132 b
128 b
AIA (1,5 mg L )
126 b
106 a
BAP (3,0 mg L )
101 a
106 a
Sacarose (2%)
100 a
100 a
Coeficiente de variação
12,8%
10,5%
Fitorreguladores
GA3 (2,0 mg L-1)
-1
-1
-1
de sacarose a 2%, sem agitação; 2 Médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, fazem parte do mesmo agrupamento
pelo teste de Scott & Knott (1974), a 5% de probabilidade.
1
massa seca dos coleóptilos, embora a chance de promover
a sua elongação parecesse pequena. No entanto, nenhum
efeito foi observado.
Já para AIA e 2,4-D, verificou-se o aumento no
comprimento dos coleóptilos. Tal resultado já era esperado,
uma vez que essas auxinas apresentam propriedades de
indução à elongação celular (TAIZ & ZEIGER, 2006).
Embora AIA não tenha influenciado a massa dos
coleóptilos, a outra auxina testada (2,4-D) proporcionou
ganho de massa estatisticamente superior aos demais
tratamentos (Tabela 2). Tal resultado está coerente com o
fato do 2,4-D ser a auxina mais empregada para a cultura de
calos, especialmente no caso de monocotiledôneas, para
as quais a concentração geralmente varia de 2,0 a 10,0
mg L-1 (PASQUAL, 2001).
Como nenhuma das substâncias testadas inibiu o
crescimento dos coleóptilos de trigo, optou-se por realizar
um novo experimento empregando-se o herbicida
comercial glifosato, cujo efeito sobre monocotiledôneas
como o trigo é elevado (MACIEL et al., 2002). Apenas
para efeito de comparação, também se utilizou o 2,4-D no
experimento, o que permitiu observar claramente o efeito
promotor e inibidor do crescimento dos coleóptilos
(Figura 3 e Tabela 3).
32
CARVALHO, D. D. C. C. et al.
FIGURA 3 Efeito inibidor e promotor do glifosato e 2,4-D no crescimento de coleóptilos de trigo [imagem correspondente
aos valores da Tabela 3: T = Sacarose (2%); H = Glifosato (7.968g L-1) e 2,4 D = 2, 4-D (1,5 mg L-1)]. (Barra corresponde
a 0,65 cm).
TABELA 03 Efeito inibidor e promotor do glifosato e 2,4-D sobre o crescimento de coleóptilos de trigo1.
Tratamentos
Comprimento do coleóptilo (%)2
Massa seca do coleóptilo (%)2
Glifosato (7,968 g L-1)
61 a
52 a
2, 4-D (1,5 mg L )
120 c
128 c
Sacarose 2%
100 b
100 b
Coeficiente de variação
6,9%
2,6%
-1
de sacarose a 2%, sem agitação; 2 Médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, fazem parte do mesmo agrupamento
pelo teste de Scott & Knott (1974), a 5% de probabilidade.
1
CONCLUS›ES
O emprego de coleóptilos provenientes de plântulas
homogêneas da variedade de trigo BRS-49 estioladas, com
aproximadamente 2,5 cm de altura, eretas e com diâmetro
de caulículo igual a 2 mm, permitiu o aperfeiçoamento do
teste existente para a detecção de reguladores do
crescimento vegetal. Com isso, torna-se desnecessária a
agitação anteriormente descrita na literatura durante a
realização dos experimentos, o que reduz consideravelmente
o custo para a detecção de substâncias inibidoras e
promotoras do crescimento de plantas.
AGRADECIMENTOS
˘ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
Minas Gerais (FAPEMIG), por uma bolsa de iniciação
científica, à Vantuil A. Rodrigues (Departamento de
Agricultura - Universidade Federal de Lavras), pelas
valiosas orientações e sugestões e à Embrapa Trigo, pelas
sementes de trigo.
ABDELBAR, M. Z.; MIELKE, E. A. Action of abscisicacid and fatty-acids in the wheat coleoptile straight
growth test. Plant Physiology, Rockville, v. 63, n. 5, p. 8080, 1979.
ANTOLIC, S.; DOLUSIC, E.; KOZIC, E. K.; KOJIC-PRODIC,
B.; MAGNUS, V.; RAMEK, M.; TOMIC, S. Auxin activity
and molecular structure of 2-alkylindole-3-acetic acids.
Plant Growth Regulation, Dordrecht, v. 39, n. 3, p. 235252, 2003.
BAUER, J. D.; CUTLER, H. G.; HUGDAHL, J. D.; GARCIA,
E. L.; MATESIC, D. F.; CUTLER, S. J. Biological evaluation
of a secondary metabolite, 9-O-methylfusarubin, from
Fusarium oxysporum. Medicinal Chemistry Research,
Cambridge, v. 14, n. 7, p. 369-381, 2005.
BONNER, J. Limiting factors and growth inhibitors in the
growth of the avena coleoptile. American Journal of
Botany, Columbus, v. 36, p. 323-332, 1949.
CARVALHO, D. D. C.; OLIVEIRA, D. F.; CAMPOS, V. P.;
PASQUAL, M.; GUIMAR‹ES, R. M.; CORR¯A, R. S. B.
Avaliação da capacidade de produzir fitotoxinas in vitro
por parte de fungos com propriedades antagônicas a
nematóides. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 30, n. 6,
p. 1230-1235, 2006.
CARVALHO, D. D. C.; PASQUAL, M.; OLIVEIRA, D. F.
Desenvolvimento de bioensaio para identificação de
promotores de crescimento plantas. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOS, 1., 2003, Lavras.
Resumos... Lavras: SBCTP, 2003a. p. 256.
CARVALHO, D. D. C.; PASQUAL, M.; OLIVEIRA, D. F.
Efeitos de fitoreguladores sobre o crescimento de
coleóptilos de trigo (Triticum aestivum L.). In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOS, 1., 2003, Lavras.
Resumos... Lavras: SBCTP, 2003b. p. 257.
FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do
Sisvar para Windows versão 4.0. In: REUNI‹O ANUAL
DA REGI‹O BRASILEIRA DA SOCIEDADE
INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45., 2000, São
Carlos, SP. Anais... São Carlos: UFSCar, 2000. p. 255258.
HANCOCK, D. R.; BARLOW, H. W. B. The assay of
growth substances by modified straight growth method.
Annual Report East Malling Research, Kent, v. 40, p. 8894, 1953.
HOSSEL, D.; SCHMEISER, C.; HERTEL, R. Specificity
patterns indicate that auxin exporters and receptors are
the same proteins. Plant Biology, Stuttgart, v. 7, n. 1, p. 4148, 2005.
MACIEL, C. D. G.; CONSTANTIN, J.; GOTO, R. Seletividade
e eficiência agronômica de herbicidas no controle de
33
capimcolchão na cultura da melancia. Horticultura
Brasileira, Brasília, v. 20, n. 4, p. 474-476, dez. 2002.
NITSCH, J. P.; NITSCH, C. Studies on the growth coleoptile
and first internode sections: a new, sensitive, straightgrowth test for auxins. Plant Physiology, Rockville, v. 31,
n. 2, p. 94-111, 1996.
OSORIO, E. A. A cultura do trigo. São Paulo: Globo Rural,
1992. 218 p.
PASQUAL, M. Meios de cultura, cultura de tecidos:
tecnologia e aplicações. Lavras: UFLA/FAEPE, 2001. 74 p.
PASQUAL, M.; HOFFMANN, A.; RAMOS, J. D. Cultura
de tecidos: tecnologia e aplicações: introdução:
fundamentos básicos. Lavras: UFLA/FAEPE, 1998. 159 p.
SCOTT, A. J.; KNOTT, M. A. A cluster analyses method
for grouping means in the analyses of variance. Biometrics,
Oxford, v. 30, n. 3, p. 502-512, 1974.
SIROIS, J. C. Studies on growth regulators .i. improved
avena coleoptile elongation test for auxin. Plant
Physiology, Rockville, v. 41, n. 8, p. 1308, 1966.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Plant physiology. 4. ed. Sunderland:
Sinauer, 2006. 764 p.
UEDA, J.; MIYAMOTO, K.; YUDA, T.; HOSHINO, T.;
FUJII, S.; MUKAI, C.; KAMIGAICHI, S.; AIZAWA, S.;
YOSHIZAKI, I.; SHIMAZU, T.; FUKUI, K. Growth and
development, and auxin polar transport in higher plants
under microgravity conditions in space: BRIC-AUX on
STS-95 space experiment. Journal of Plant Research,
Tokyo, v. 112, p. 487-492, 1999.
ZAGO, V. C. P.; DE-POLLI, H.; RUMJANEK, N. G.
Pseudonomas spp. fluorescentes: bactérias promotoras de
crescimento de plantas e biocontroladoras de fitopatógenos
em sistemas de produção agrícola. Seropédica: Embrapa/
CNPAB, 2000. 32 p. (Documentos, 127).
34
SUCROSE ON IN VITRO VICTŁRIO,
CULTURES
C. P. et al.OF Calendula officinalis L.
SACAROSE NO CULTIVO IN VITRO DE Calendula officinalis L.
CRISTIANE PIMENTELVICTŁRIO1,ALICE SATO2, MARIAAPPARECIDA ESQUIBEL3,
CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE4
Bióloga, Doutoranda em Ciências Biológicas Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/IBCCFo Universidade Federal do Rio de
Janeiro/UFRJ Av. Carlos Chagas Filho, s/n, CCS, Bloco G, sala G2-050 21952-590 Rio de Janeiro, RJ [email protected]
2
Bióloga, Doutora, Professora Departamento de Ciências Naturais Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro/UFRJ Av.
Pasteur, 458 22290-240 Rio de Janeiro, RJ [email protected]
3
Doutora, Pesquisadora Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/IBCCFo Universidade Federal do Rio de Janeiro/UFRJ Av.
Carlos Chagas Filho, s/n, CCS, Bloco G, sala G2-050 21952-590 Rio de Janeiro, RJ [email protected]
4
Doutor, Professor adjunto Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/IBCCFo Universidade Federal do Rio de Janeiro/UFRJ
Av.Carlos Chagas Filho, s/n, CCS, Bloco G 21941-590 Rio de Janeiro, RJ [email protected]
1
ABSTRACT
Sucrose is the most common carbohydrate used in culture
media of plant tissue, supplying carbon chains for the plants to
produce necessary organic compounds for development. The
objective of this study was the evaluation of in vitro
morphogenesis of Calendula officinalis L. under different sucrose
concentrations and reduced nitrogen. Cultures were maintained
in modified Murashige & Skoog (1962) medium (MS½N),
reduced at half of NH4NO3 and KNO3 solutions, supplemented
with 5, 10, 15, 20, 25, 30 and 40 g L-1 sucrose. In vitro cultures
were observed during 45 days. The concentration of 5 g L-1 sucrose
resulted in a reduction of the number of shoots, plant growth and
dry and fresh biomass accumulation. Sucrose concentrations
higher than 10 g L-1 presented no significant difference on shoot
number and shoot height. The reduction of the sucrose
concentration from 30 to 15 g L-1 showed no modification in the
parameters evaluated. Within one year of culture, the proliferation
rate was 50 shoots for the concentration 15 g L-1 sucrose. No
changes were observed in chlorophyll contents and a:b
chlorophyll ratio. Plantlets transferred to soil presented 92.9%
survival rate. In conclusion, the reduction of nitrogen improved
the cultures and the use of sucrose was optimized. HPLC method
was used to verify the presence of phenolic compounds and
rutin. Hydroalcoholic crude extracts from plantlets cultivated
in medium containing 30 g L-1 sucrose presented 0.02 mg mL-1
rutin.
sacarose. A avaliação das culturas in vitro foi feita por 45 dias. A
utilização de 5 g L-1 de sacarose resultou em reduzido número de
brotos, menor crescimento da planta e biomassa fresca e seca.
Em concentrações acima de 10 g L-1, o número e o alongamento
dos brotos não variaram de forma significativa. A redução da
concentração de sacarose de 30 para 15 g L-1 não modificou os
parâmetros de desenvolvimento avaliados. Durante um ano de
cultura, a taxa proliferativa foi de 50 brotos, para concentração
de 15 g L-1. Não foram verificadas mudanças no conteúdo de
clorofilas e na razão clorofila a:b. Plântulas foram transferidas
para o solo e apresentaram taxa de sobrevivência de 92,9%.
Conclusão, a redução de nitrogênio aprimorou as culturas e o uso
da sacarose foi otimizado. O método CLAE foi utilizado para
verificar a presença de substâncias fenólicas e rutina. O extrato
bruto hidroalcóolico de plantas cultivadas em meio contendo 30
g L-1 apresentou 0,02 mg mL-1 de rutina.
Index terms: Acclimatization, hyperhydricity, tissue culture,
micropropagation, Calendula officinalis.
and homeopathic by decoctions and tinctures from flowers
RESUMO
Sacarose é o carboidrato mais utilizado nos meios de
cultura in vitro de tecidos vegetais, fornecendo cadeias de carbono
para as plantas sintetizarem os compostos orgânicos necessários
ao desenvolvimento. Objetivou-se, neste estudo, avaliar a
morfogênese in vitro de Calendula officinalis L. sob diferentes
concentrações de sacarose e meio com concentração reduzida de
nitrogênio. As culturas foram mantidas em meio Murashige &
Skoog (1962) (MS½N) reduzido à metade das concentrações de
NH4NO3 e KNO3 e acrescido de 5, 10, 15, 20, 25, 30 e 40 g L-1 de
Several scientific studies about its efficacy have been
Termos para indexação: Aclimatização, hiperidricidade, cultura
de tecidos, micropropagação, Calendula officinalis.
INTRODUCTION
Calendula officinalis L. (Asteraceae) is highly
important to production of phytomedicines, cosmetics and
foods. In Brazil, C. officinalis is widely used in folk medicine
and leaves (BILIA et al., 2002; DANIELSKI et al., 2007).
developed (BALDUCCI-ROSLINDO et al., 1999;
KALVATCHEV et al., 1997; PEREZ-GUITIERREZ et al.,
1998). Properties such as anti-inflammatory, antiviral,
cicatrizing, antiseptic (BALDUCCI-ROSLINDO et al., 1999),
antioxidant ( ETKOVI
et al., 2004), anti-HIV
(KALVATECHEV et al., 1997) have been verified. Some of
(Recebido em 28 de março de 2008 e aprovado em 16 de junho de 2008)
Sucrose on in vitro cultures of Calendula...
these properties are associated with the action of
flavonoids, triterpenoids, sterol and essential oil
(HAMBURGER et al., 2003).
In vitro culture technique has been applied to obtain
free-pathogens raw material of quality to pharmaceutical
industry, in large-scale with genetic uniformity
characteristics (LIMA et al., 2001). Tissue culture normally
requires the incorporation of a carbon source to the culture
medium. Sucrose is the carbon source for plant growth
and the mostly used in tissue culture. It offers metabolic
energy and carbon chain which are important to the
synthesis of essential compounds (PEREIRA NETO &
OTONI, 2003). Presence of sucrose is important to improve
in vitro plant growth, photosynthesis and acclimatization
stage (XIAO & KOZAI, 2006); however photosynthesis
rates are reduced in tissue cultures. Carbohydrates reserves
accumulated during tissue culture like sucrose was
responsible for sustaining plant regrowth and root
morphogenesis in Spathiphyllum (HUYLENBROECK &
RIEK, 1995). Furthermore, some tissue culture researches
have evaluated the effects of various concentrations and
types of sugar (JAIN & BABBAR, 2003; KIM et al., 2003).
Intensificated use of C. officinalis in phytotherapy
justifies an elaboration of in vitro protocol to commercial
scale production of phytomedicines by rapid in vitro
propagation of uniform plants. Thus, suitable and
economic medium is an important step to reduce expenses
and to maintain cultures. This work had the objective of
evaluating in vitro morphogenesis of monoclonal
Calendula officinalis at different concentrations of
sucrose and reduced nitrogen, to establish an appropriate
protocol to produce plants in large scale and, to investigate
the variation of primary and secondary metabolites
produced by plantlets.
MATERIAL AND METHODS
Germination in vitro
Calendula officinalis seeds, variety dobrada
sortida , were obtained commercially from Feltrin®. The seed
tegument was complete removed. At aseptic conditions,
35
seeds were disinfected by treatment with ethanol 70% (v/
v) (1 min), commercial detergent solution (15 min),
commercial sodium hypochlorite at 20% (v/v), always
intercepted with washings in sterile distilled water. Seeds
were inoculated in tubes (145 x 22 mm), each one contained
20 mL of solid medium MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962)
supplemented with 3% (w/v) sucrose, 1.3 øM of thiamineHCl, 3 øM of pyridoxine, 4.1 øM of nicotinic acid, 0.6 mM
of myo-inositol and solidified with 7.8 g L-1 agar, pH rated
at 5.8 µ 0.1 and sterilized in autoclave at 120oC and 1.1
kgf.cm-2. Seeds, in number of 200 seeds were introduced,
two per tube in 4 repetitions of 50 seeds each. Cultures
were placed in a growth chamber at 25 µ 2oC, under white
light (Sylvania F20 W T12), 23 mmoles m-2 s-1 intensity,
photoperiod of 16/8 h. After germination, nodal segments
between 1.0 and 1.5 cm were excised from plantlets to initiate
the subcultures.
In vitro culture conditions
For each sucrose treatment, were introduced 30
nodal segments of 45 day-old plantlets. Cultures were
grown in vessels (141 x 72 mm): 5 segments per vessel in 50
ml of modified MS, reduced to half of NH4NO3 and KNO3
solutions (MS½N), and containing the same concentration
of vitamins, myo-inositol and agar. The media were
supplemented with different concentration of sucrose: 5,
10, 15, 20, 25, 30 and 40 g L-1. Cultures were maintained in
the conditions cited above, for 45 days. Morphogenesis
was evaluated for 45 days, each 15 days, considering the
criteria: number of shoots per explant, shoots height,
number of leaves per shoot and presence of roots and
callus. Besides, it was evaluated the fresh and dry weight
of total leaves per plant. The leaves were put at 60oC for 48
h, for measuring dry weight. Proliferation rate was
calculated according to formula: number shoots (after 45
days) x 8 subcultures (total per year) x number of nodal
segments per shoot.
Chlorophyll concentration
After 45 days, leaves from plantlets were removed in
groups of ten plants (60 to 65 mg) from each concentration
36
VICTŁRIO, C. P. et al.
to measure chlorophyll a and b contents. Leaves samples
were mixed in tubes with 3 ml of DMSO (dimethyl sulfoxide).
Tubes were sealed with Parafilm to prevent evaporation and
the mixtures were incubated in hot water at 60oC for 16 h, in
semi-darkness. Determination of chlorophyll concentration
was obtained by using a spectrophotometer (Spectronic
Genesys 2 SERL 3N270093004). Absorbance of the extracted
solution was measured at 649 nm and 665 nm wavelengths
to a and b chlorophyll, respectively. Total chlorophyll
concentration (chlorophyll a and b) on a fresh-weight basis
(øg mg-1) was calculated according to the following
equations: Ca = 12.19 A665 3.45 A649; Cb = 21.99 A649 5.32
A665 where Ca and Cb are chlorophyll a and b concentration
(WELLBURN, 1994):
Extraction and High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) analysis
Dried leaves of plantlets were extracted with ethanol
70% for 3 days and two washings with ethanol. It was
added 20 ml of solvent to each 1 g of dried sample. Extract
was dried using evaporation at 60 o C, then it was
resuspended in methanol and water (9:1, v/v) and
partitioned with dichloromethane. The aqueous phase was
freezing and dried by lyophilization.
HPLC /UV analysis of C. officinalis plantlets treated
with different sucrose concentration (15, 30 and 45 g.l-1)
were performed on an apparatus Shimadzu SPD-M10A
equipped with a LC-10AD pump and CBM-10A UV-vis
detector. The analytical column was Lichrosorb-RP-18 (250
mm x 4 mm i.d. x 5 mm) at ambient temperature. The mobile
phase consisted of MilliQ water 0.1% H3PO4 (v/v) (A) and
methanol (B). The chromatographic was operated in the
gradient elution with the following eluents: 1-10min (30%
B); 20 min (40% B); 60 min (100% B); 61 min (STOP). The
flow rate was 1.0 ml min-1. Peak detection was performed at
254 and 360nm. After concentration by lyophilization,
aqueous samples were resuspended at 10 mg mL-1 and 40
mg mL-1 (methanol 70%) for injection. Each sample was
filtered, and then a volume of 20 øL was injected. All
solvents for HPLC analysis were of HPLC grade and
obtained from Merck.
The flavonoid was detected by coinjection with
rutin standard (Merck) and by comparing with retention
time and the absorption spectrum of rutin. Rutin was
resuspended at 1 mg mL-1. The calibration curve showed
the linearity of the detector the tested range (0.03125
0.25 mg mL-1). Rutin concentration in crude extract was
obtained by standard curve: y = 3.10-7x 289908, where y
is the peak area and x the concentration (R2 = 0. 9977).
Phenolic compounds detection was verified by
similarities with UV spectrum from data base.
Acclimatization
At the end of 45 days, about 30 plantlets, between
6 and 8 cm, were transferred to inoculated seed plots in
isopor containers, with 9 cm2 area, and kept in a greenhouse
for 15 days. Minimum and maximum temperatures average
were 12.3ÀC and 24.1ÀC, respectively. The soil was composed
of a mixture of sand and humus. The plants were watered
once a day, during the morning, and evaluated weekly.
After two weeks, plants were transplanted into the soil
also in greenhouse. In the second month plants were
evaluated according to criteria: plant height and number
of leaves per plant.
Statistical analysis
Each sucrose concentration was replicated a
minimum of 30 times, using a completely randomized design.
Data were submitted to analysis of variance (ANOVA) and
statistical averages comparisons were made through
Tukey s test at 5% significance level. For percentages, it
was taken difference between two percentages (p1 and p2),
considering p < 0.05 level.
RESULTS AND DISCUSSION
The best method to promote germination was the
complete removal of the seed tegument, in disagreement
with the results from Costa & Ayub (2001) who obtained
100% of C. officinalis in vitro germination using cotton and
MS medium as substrate and seeds with tegument. The
highest germination rate was 64%, after 14 days (Figura
1A). The process of disinfection was more than 90% efficient.
37
Germination %
A
70
60
50
40
30
20
10
0
2
4
6
8
10
12
14
days
FIGURE 1 In vitro germination (A) of C. officinalis for 14 days, photoperiod 16 h, 25 2oC. (B-E). Germination, tissue
culture and acclimatization of C. officinalis. B- 8, 10 and 14 days in vitro, after germination; C- 40-day-old plantlets in
MS½N medium; D- Plants in soil, after 2 months. E- Flowering plant. Bar = 1 cm.
The explant cultivated under different sucrose
concentration showed statistical differences among the
parameters evaluated (Table 1). Stages of the in vitro
development of C. officinalis are showed in Figure 1 A-E:
in vitro germination, tissue culture and acclimatization.
At 5 g L-1 sucrose, shoot height and number of
shoots per explant showed low values (3.14 cm and 1.25,
respectively), whereas at 15 g L-1, these parameters
presented the major values (3.45 cm and 1.81). Langford &
Wainwright (1987) obtained to Rosa cultivars in vitro, at
10 g L-1, small and compact plants, while at 20 g L-1 sucrose
the growth was vigorous.
Addition of sucrose in the medium independent of
containing or not auxins may improve in vitro rooting
(PASQUAL et al., 1999). In this study, the sucrose
concentration did not improve rooting in C. officinallis.
According to Costa et al., 2002, a reduced rooting was also
achieved for C. officinalis plantlets. Premkumar et al. (2003)
verified that pretreatment with high sucrose concentration
induced a reduction in rooting and survival percent ex
vitro of Persea Americana Mill. Even lower levels of
sucrose can stimulate in vitro root development which is
explained by the necessity of plant to absorb carbon in
order to produce organic compounds. Besides, at the
beginning of rooting, its metabolism requires a continuous
supply of carbohydrate (FRIEND et al., 1994). Cheng et al.
(1992), verified that plants grown in the absence of sucrose
had the lowest rooting rate. But lower sucrose
concentrations (2 and 4%) were more favorable for root
development than higher concentrations (8 and 10%).
Increasing in sucrose concentration up to 40 g L1
did not induce calli formation at the base of the explants
of C. officinalis, as observed in Rosa in vitro cultures
(LANGFORD & WAINWRIGHT, 1987).
Plantlets cultured for 45 days in sucrose 5 g L-1
presented the lowest fresh (233.8 mg) and dry (9.82 mg)
weight with significant differences compared with
sucrose 30 g L-1 (518 and 32.2 mg) and 40 g L-1 (484.3
and 37.9 mg) fresh and dry weight. At 10 g L -1
concentration of sucrose, it was observed only a
significant lowering of the dry weight in relation to 30
and 40 g L-1 of sucrose. These results suggest that
synthesis of organic compounds by plantlets increased
with higher sucrose concentration.
38
TABLE 1 Morphogenesis responses of in vitro Calendula officinalis under different concentrations of sucrose,
after 45 days.
Sucrose
(g L-1)
Root
(%)
Number
shoots
Shoot height
(cm)
Number
leaves
Proliferation
rate 2 (1 year)
FW1
(mg)
DW1
(mg)
5
2,08a
1,25µ0,44b
3,14µ1,20b
5,14µ1,96b
31,4
233,8µ64,9b
9,82µ3,44b
10
4,76a
1,66µ0,70ab
4,33µ1,75a
5,19µ2,78b
57,5
401,8µ140ab
17,7µ6,47b
15
6,89a
1,81µ0,94a
3,45µ1,51ab
4,34µ2,27b
50,0
465,7µ122ab
23,5µ5,57ab
20
10,3a
1,57µ0,71ab
3,40µ1,46ab
4,48µ1,83b
42,0
419,1µ71ab
24,6µ5,41ab
25
9,10a
1,66µ0,59ab
3,79µ1,95ab
4,52µ2,29b
48,5
419,2µ135ab
24,7µ7,89ab
30
12,5
a
ab
ab
a
46,1
518,1µ232
a
32,2µ14,6a
40
3,57a
4,22µ1,89b
59,1
484,3µ59,8a
37,9µ6,78a
1,44µ0,61
1,74µ0,65ab
4,00µ1,78
4,27µ2,11ab
7,09µ3,07
1
FW fresh weight, DW dry weight. Each value is the mean µ SE. Different letters denote statistical differences
among treatments (p< 0.05, ne 30, Tukey s test). 2These values were calculated according to formula: number of
shoots (after 45 days) x 8 subcultures (total per year) x number of nodal segments per shoot = proliferation rate.
The explant cultivated under different sucrose
concentration did not show statistical difference between
a and b chlorophyll contents (Table 2).
Photosynthesis rates for plantlets are reduced or
inefficient due to poor irradiance and limited CO2 in the
gas phase on in vitro culture conditions (VIÑA et al.,
1999). Exogenous sucrose is an energy source to produce
a variety of essential and secondary metabolites. Some
studies show variations in a and b chlorophyll contents
depending on sucrose concentration (CHENG et al., 1992).
Langford & Wainwright (1987) verified chlorophyll
content reduction when decreasing the concentration of
sucrose in Rosa cultures. Sellés et al. (1997) observed in
culture of Narcissus confusus Pugsley that higher sucrose
concentrations seemed to force a heterotrophic behavior
in plantlets, probably as a consequence of the chlorophyll
degradation, visible through yellow and necrotic
appearance of cultures.
Reduced concentration of rutin was produced by
plantlets. It was verified 0.02 mg mL-1 of rutin in crude extract
of plantlets cultivated in MS with 30 g L-1 of sucrose. In
addition, it was verified probable phenolic compounds by
HPLC method, showing retention time (2.56 and 2.77 min)
and the following spectra: (209 and 212 nm) and (208 and
210 nm).
Sucrose variations between 5 and 45 g L-1 did not
change photosynthetic pigments production neither
relative concentration of phenolic compounds verified by
HPLC. Phenolic compounds were verified in other in vitro
cultures (KONCZAK-ISLAM et al., 2003; SANTOSGOMES et al., 2002). In vitro conditions may be stressful
to plant and because of this, it produces high level of
phenolic compounds (SUDHA & RAVISHANKAR, 2002).
The decrease of hyperhydricity in C. officinalis
cultures was obtained in response to reduction at half of
total nitrogen concentration. Hyperhydricity is a
morphological and physiological disorder of plants cultured
in vitro (HAZARIKA, 2006; KEVERS et al., 2004). Several
factors are associated with hyperhydricity among them
nitrogen and sucrose concentration. As much as low and
high sucrose concentrations may cause hydric stress in
plantlets as hyperhydricity (SELLÉS et al., 1997). For
example, Langford & Wainwright (1987) verified high
incidence of hyperhydricity in plantlets of Rosa and Prunus
cerasifera Ehrh., respectively, at sucrose concentrations
of 10 and 7.5 g L-1. The phenomenon of hyperhydricity
reduced the number of plantlets with ability of surviving
after acclimatization (KEVERS et al., 2004).
Transfer and acclimatization of plantlets to ex vitro
environment are the final steps and the most hazardous,
because of deficient photosynthetic performance of
plantlets. Ex vitro establishment requires major production
of carbohydrate by plantlets to survival. Thus, a moderate
sucrose concentration needs to be added to culture medium
before transferring plant to soil. In this view, sucrose 10
and 15 g L-1 did not induce differences among evaluated
parameters. On the contrary, Costa et al. (2002) did not
obtain C. officinalis rooting even with the use of sucrose
at 30 g L-1. A minimum of sucrose may be added into
culture medium for supporting growth and morphogenesis
of shoots and leaves, and to permit photosynthesis
(SOLAROVA et al., 1989). Premkumar et al. (2003) verified
that treatment with high level of sucrose decreasing in
vitro root induction and did not improve P. americana
acclimatization process. As alternative, some reports have
shown that cultures maintained in reduced or free sucrose
media and under CO2 enriched conditions, enhanced the
photosynthetic ability, the plant growth and rooting rates,
besides an increase in survival percentage of acclimatized
plants (MOSALEEYANON et al., 2004; XIAO & KOZAI,
2006).
Regenerated plantlets were successfully
transferred to soil, with 92.9% of survival. Rooting was
intensified rapidly in 1 week and after 15 days plants
39
became higher height and presented many roots, and then
were transplanted from inoculated seed plots to soil. After
2 months in soil, plants increased an average of 12.7 cm
in height and presented about 14 leaves. The highest
growth was verified between 3rd and 4th week (Figure 2).
In approximately two and half months, plants began to
develop new shoots and flowers. The increasing of
rhizogenesis may be explained by starch storage obtained
in in vitro.
Reduction of sucrose to 15 g L-1 neither affects
plantlets development of C. officinalis nor acclimatization.
7
Height increment (cm)
6
Leaf number increment
5
4
3
2
1
0
2nd week
3rd week
4th week
FIGURE 2 Growth of Calendula officinalis, after 2
months of its transference to soil.
TABLE 2 Effect of sucrose concentration on total chlorophyll contents in plantlets of Calendula officinalis, after 45
days.
Sucrose
(g L-1)
Chlorophyll concentration
(øg mg-1 of fresh weight)
Chlorophyll a1
Chlorophyll b1
Ratio a:b
5
0,54µ0,22
0,22µ0,11
2,45
10
0,62µ0,14
0,25µ0,08
2,48
15
0,61µ0,19
0,19µ0,09
3,21
20
0,58µ0,10
0,19µ0,06
3,05
25
0,68µ0,39
0,18µ0,08
3,78
30
0,63µ0,14
0,25µ0,05
2,52
40
0,65µ0,09
0,19µ0,06
3,42
1
Each value is the mean of 10 replicates µ SD.
No differences among treatments, p<0.05, Tukey s test.
40
This concentration can be used to cultivate plants and,
consequently there is a decreasing in costs to produce
plantlets in large-scale. Beside, MS reduced at half of
NH4NO3 and KNO3 improved C. officinalis cultures and
eliminated hyperhydricity.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by RECOPE RJ/FAPERJ,
FINEP, Capes/CNPq and Laboratório Simões Ltda., Brazil.
The authors are grateful to biologist Ms. Maria Núbia for
her help to acclimatize C. officinalis and Municipality of
Piraí, RJ, who granted a greenhouse to acclimatize the plants.
We are grateful to the Núcleo de Pesquisas em Produtos
Naturais (NPPN/ UFRJ/ Brazil), where HPLC analysis have
been done, and they also thank Joana Pimentel da Silva for
English revision.
REFERENCES
BALDUCCI-ROSLINDO, E.; SILVÉRIO, K. G.;ALAGOLI,
D. M. Process of repair in tooth extraction sores in treated
mice with Symphytum officinale and Calendula
officinallis compounds. Revista de Odontologia da
Universidade de São Paulo, São Paulo, v. 13, n. 2, p. 181187, 1999.
BILIA, A. R.; BERGONZI, M. C.; GALLORI, S.; MAZZI,
G.; VINCIERI, F. F. Stability of the constituents of
Calendula, Milk-thistle and Passionflower tinctures by
LC-DAD and LC-MS. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, Arlington, v. 30, n. 3, p. 613-624,
2002.
ETKOVI , G. S.; DJILAS, S. M.; ANADANOVI BRUNET, J. M.; TUMBAS, V. T. Antioxidant properties of
marigold extracts. Food Research International, Ottawa,
v. 37, n. 7, p. 643-650, 2004.
COSTA, C. M.; PILEGGI, M.; AYUB, R. A. Organogênese
indireta em explantes de folhas cotiledonares de calêndula.
Revista Ceres, Viçosa, v. 49, n. 285, p. 563-568, 2002.
DANIELSKI, L.; CAMPOS, L. M.A. S.; BRESCIANI, L. F.
V.; HENSE, H.;YUNES, R.A.; FERREIRA, S. R. S. Marigold
(Calendula officinalis L.) oleoresin: solubility in SC-CO2
and composition profile. Chemical Engineering and
Processing, Germany, v. 46, n. 2, p. 99-106, 2007.
FRIEND,A. L.; COLEMAN, M. D.; BEBRANDS, J. G. Carbon
allocation to root and shoot systems of woody plants. In:
DAVIS, T. D.; HAISSIG, B. E. (Eds.). Biology of adventitious
root formation. New York: Plenum, 1994. v. 1, p. 249.
HAMBURGER, M.; ADLER, S.; BAUMANN, D.; FORG,
A.; WEINREICHB, B. Preparative purification of the major
anti-inflammatory triterpenoid esters from Marigold
(Calendula officinalis). Fitoterapia, Rome, v. 74, p. 328338, 2003.
HAZARIKA, B. N. Morpho-physiological disorders in in
vitro culture of plants. Science Horticulturae, The
Netherlands, v. 108, p. 105-120, 2006.
HUYLENBROECK, J. M. van; RIEK, J. de. Sugar and starch
metabolism during ex vitro rooting and acclimatization of
micropropagated Spathiphyllum Petite plantlets. Plant
Science, New York, v. 111, p. 19-25, 1995.
JAIN, N.; BABBAR, S. B. Effect of carbon source on the
shoot proliferation potencial of epicotyl explants of
Syzygium cuminii. Biologia Plantarum, The Netherlands,
v. 47, n. 1, p. 133-136, 2003.
KALVACHEV, Z.; WALDER, R.; GARZARO, D. Anti-HIV
activity of extracts from Calendula officinallis flowers.
Biomedicine Pharmacotherapy, The Netherlands, v. 51, p.
176-180, 1997.
CHENG, B.; PETERSON, C. M.; MITCHELL, R. J. The role
of sucrose, auxin and explant source on in vitro rooting of
Eucalyptus sideroxylon. Plant Science, The Netherlands,
v. 87, p. 207-214, 1992.
KEVERS, C.; FRANCK, T.; STRASSER, R. J.; DOMMES,
J.; GASPAR, T. Hyperhydricity of micropropagated shoots:
a typically stress-induced change of physiological state.
Plant Cell Tissue and Organ Culture, The Netherlands,
v. 77, p. 181-191, 2004.
COSTA, C. M.; AYUB, R. A. Desenvolvimento inicial de
plântulas de Calendula officinalis germinadas in vitro com
substrato de algodão ou de meio MS. Revista Ceres,
Viçosa, v. 48, n. 279, p. 609-613, 2001.
KIM, E. K.; HAHN, E. J.; MURTHY, H. N.; PAEK, K.Y. High
frequency of shoot multiplication and bulblet formation of
garlic in liquid cultures. Plant Cell Tissue and Organ
Culture, The Netherlands, v. 73, n. 3, p. 231-236, 2003.
KONCZAK-ISLAM, I.; OKUNO, S.; YOSHIMOTO, M.;
YAMAKAWA, O. Composition of phenolics and
anthoctanins in a sweet potato cell suspension culture.
Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v. 14, p.
155-161, 2003.
41
of sucrose concentration on in vitro rooting, growth,
endogenous sugars and ex vitro survival of juvenile
avocado. Journal of Horticultural Science Biotechnology,
v. 78, n. 1, p. 46-50, 2003.
LANGFORD, P. J.; WAINWRIGHT, H. Effects of sucrose
concentration on the photosynthetic ability of rose shoots
in vitro. Annals of Botany, London, v. 60, p. 633-640, 1987.
SANTOS-GOMES, P. C.; SEABRA, R.M.; ANDRADE, P.
B.; FERREIRA, M. F. Phenolic antioxidant compounds
produced by in vitro shoots of sage (Salvia officinalis
L.). Plant Science, New York, v. 162, p. 981-987, 2002.
LIMA, S. S.; ESQUIBEL, M.A.; HENRIQUES,A. B.; SILVA,
F. O.; SILVA, P. H. B.; LAGE, C. L. S. Monoclonal culture of
erva-de-bicho (Polygonum acre H. B. K. var. aquatile) for
commercial scale production of a phyto-therapeutic
medicine. Brazilian Journal of Medicinal Plants, Botucatu,
v. 4, n. 1, p. 51-55, 2001.
SELLÉS, M.; BERGONŁN, S.; VILADOMAT, F.;
BASTIDA, J.; CODIAN, C. Effect of sucrose on growth
and galathamine production in shoot-clump cultures of
Narcissus confusus in liquid-shake medium. Plant Cell
Tissue and Organ Culture, The Netherlands, v. 49, p. 129136, 1997.
MOSALEEYANON, K.; CHA-UM, S.; KIRDMANEE, C.
Enhanced growth and photosynthesis of rain tree
(Samanea saman Merr.) plantlets in vitro under a CO2enriched condition with decreased sucrose concentrations
in the medium. Science Horticulturae, The Netherlands,
v. 103, p. 51-63, 2004.
Physiology Plantarum, Sweden, v. 15, p. 473-497, 1962.
PASQUA, B. M. G.; CUTERI, A.; VITALI, A. In vitro plant
regeneration of Visma guianensis through organogenesis.
Plant Cell Tissue and Organ Culture, The Netherlands,
v. 58, p. 81-85, 1999.
PEREIRA NETO, V. B. P.; OTONI, W. C. Carbon sources
and their osmotic potential in plant tissue culture: does it
matter? Science Horticulturae, The Netherlands, v. 97, p.
193-202, 2003.
PEREZ-GUITIERREZ, S.; VARGAS-SOLIS, R.; ZAVALA,
M.; PEREZ-GUITIERREZ, C.; PEREZ-GUITIERREZ, R. M.
Inhibitory effect of five plant extracts on heart rates of
rats. Phytotherapy Research, v. 12, p. S49-S50, 1998.
PREMBKUMAR,A.; BARCELO-MUNOS,A.; QUESADA,
M. A.; MERCADO, J. A.; PLIEGO-ALFARO, F. Influence
SOLAROVA, J.; POSPHILSILOVA, J.; CATSKY, J.;
SANTRUCEK, J. Photosynthesis and growth of tobacco
plantlets independence on carbon supply. Photosynthetica,
Czech Republic, v. 23, p. 629-637, 1989.
SUDHA, G.; RAVISHANKAR, G.A. Involvement and
interaticon of various signaling compounds on the plant
metabolic events during defense response, resitance to
stress factors, formation of secondary metabolites and their
molecular aspects. Plant Cell Tissue and Organ Culture,
The Netherlands, v. 71, p. 181-212, 2002.
VINA, G.; PLIEGO-ALFARO, F.; DDRISCOLL, S.P.;
MITCHELL, V. J.; PARRY, M.A.; LAWLOR, D.W. Effects
of CO2 and sugars on photosynthesis and composition of
avocado leaves grown in vitro. Plant Physiology and
Biochemistry, Paris, v. 37, n. 7/8, p. 587-595, 1999.
WELLBURN, A.R. The spectral determination of
chlorophylls a and b, as well as total carotenoids, using
various solvents with spectrophotometers of different
resolution. Journal of Plant Physiology, New York, v. 144,
p. 307-313, 1994.
XIAO, Y.; KOZAI, T. In vitro multiplication of statice
plantlets using sugar-free media. Science Horticulturae,
The Netherlands, v. 109, p. 71-77, 2006.
CONCENTRAÇ›ES
42
E COMPOSIÇ‹O
MEIO DE MURASHIGE
TONIETTO, S. M. etDO
al.
& SKOOG NA MICROPROPAGAÇ‹O DA MENTA
CONCENTRATIONS AND COMPOSITION OF THE MURASHIGE & SKOOG
MEDIUM IN THE MICROPROPAGATION OF Menta sp.
SOLANGE MACHADO TONIETTO1, CLARISSA BELOTTO PERINI2,ADILSON TONIETTO3
Engenheira Agrônoma, Doutora, Pesquisadora bolsista de Desenvolvimento Tecnológico Industrial DTI/CNPq Fundação Estadual
de Pesquisa Agropecuária/FEPAGRO Rua Gonçalves Dias, 570 90130-060 Porto Alegre, RS [email protected]
2
Técnica em Biotecnologia Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária/FEPAGRO Rua Gonçalves Dias, 570 90130-060
Porto Alegre, RS [email protected]
3
Engenheiro Agrônomo, Doutor, Pesquisador IV Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária/FEPAGRO Rua Gonçalves Dias,
570 90130-060 Porto Alegre, RS [email protected]
1
RESUMO
Objetivou-se, neste trabalho, determinar a
concentração mais adequada do meio de cultura Murashige &
Skoog (MS), para o estabelecimento in vitro de Mentha sp.
Foram realizados dois experimentos, testando-se, no primeiro,
quatro concentrações dos sais do meio de cultura MS (30, 60,
90 e 120 %), e no experimento II quatro tratamentos sendo:
T1- sem sais e sem vitaminas; T2 - sem sais e com vitaminas;
T3 - 30% dos sais com vitaminas e T4 - 100% dos sais e sem
vitaminas. Todos os tratamentos foram suplementados com
sacarose a 30 g L-1, solidificados com agar a 7 g L-1 e ajustados
para pH 5,8. As vitaminas utilizadas foram do meio MS padrão,
mais biotina a 0,01 mg L-1. Para os dois experimentos foram
utilizadas microestacas com 1cm de comprimento, inoculadas
em frascos de vidro contendo 20 mL de meio. Após 40 e 30
dias, respectivamente para os experimentos I e II, foi avaliado
o número de nós, número de brotações, comprimento da parte
aérea e de raízes, peso da matéria seca das brotações e das
raízes. O meio MS, em sua concentração padrão, sem vitaminas
ou com 30% de sais com as vitaminas, permitiu a formação de
plantas normais.
Termos de indexação: Mentha sp., meio de cultura, vitaminas,
sais.
ABSTRACT
The objective of this work was to determine the most
adequate concentration of Murashige & Skoog (MS) culture
medium for the in vitro establishment of Mentha sp. Four salt
concentrations of MS culture medium (30, 60, 90 and 120 %)
and the effect of salt and vitamins (T1 absence of salts and
vitamins; T2 absence of salts and presence vitamins; T3 30 %
salts plus vitamins; T4 100% salts and absence of vitamins)
were tested. All treatments were supplemented with 30 g L-1
sucrose, 7 g L-1 agar and pH adjusted to 5.8. The used vitamins
were those from the MS medium plus 0.01 mg L-1 biotin. After
40 and 30 days, respectively for the analyses of salt
concentrations and the effect of salt and vitamins, bud and shoot
number, shoot and root length and shoot and root dry weight
were evaluated. The MS medium, in the standard concentration
without vitamins or MS 30% plus vitamins, promoted the
formation of normal plants.
Index terms: Mentha sp., culture media, vitamins, salts.
INTRODUÇ‹O
A micropropagação é uma ferramenta importante
na multiplicação de plantas. Através dessa técnica é
possível obter-se grande quantidade de plantas com alta
qualidade fitossanitária, em um curto espaço de tempo e
utilizando uma pequena área.
Grattapaglia & Machado (1998) citam que a
atividade comercial de micropropagação concentra-se
principalmente na limpeza clonal e na multiplicação de
espécies ornamentais herbáceas e arbustivas, e num
segundo plano de plantas lenhosas. Outro segmento em
que a exploração da micropropagação vem crescendo diz
respeito à pesquisa envolvendo plantas medicinais, também
chamadas de bioativas. Em plantas como o marmeleiro
(BERTOLUCCI et al., 2000), ginseng brasileiro (MARTINS
& NICOLOSO, 2004), menta (PHATAK & HELBE, 2002) a
micropropagação tem sido empregada não apenas na
produção de mudas, como também em estudos para
verificar o efeito dessa técnica de multiplicação sobre seus
princípios ativos.
(Recebido em 06 de julho de 2007 e aprovado em 11 de julho de 2008)
Concentrações e composição do meio de Murashige...
Segundo Maranca (1986), o gênero Mentha,
conhecido comumente como hortelã, compreende espécies
com ação medicinal, sendo conhecida principalmente pelo
sabor característico e aroma refrescante. Produz óleos
essenciais, compostos principalmente por mentol,
mentonas e mentofurano (MATOS, 1998; PHATAK &
HELBE, 2002), que são empregados na indústria
farmacêutica, do tabaco e de produtos destinados à higiene
bucal e de confeito (MATOS, 1998; SCHILCHER, 1989).
O meio mais utilizado na multiplicação in vitro,
inclusive em plantas bioativas, é o MS (MURASHIGE &
SKOOG, 1962), variando-se as concentrações dos sais
minerais, reguladores de crescimento ou dos compostos
orgânicos (MALDANER et al., 2006; PHATAK & HELBE,
2002; RIQUELME et al., 1991), de acordo com a espécie
estudada.
Segundo Termignoni (2005), os explantes mais
empregados na micropropagação são os ápices e
segmentos caulinares, pela facilidade de obtenção, número
inicial de explantes isolados da planta-mãe, viabilidade in
vitro e pelo crescimento rápido. Esses explantes mostraramse eficientes na obtenção de novas brotações para Mentha
piperita (GHANTI et al., 2004; GODOY, 2005).
Objetivou-se, neste trabalho, testar diferentes
concentrações do meio MS para o cultivo de Mentha in
vitro, estabelecendo-se, assim, um protocolo eficiente de
micropropagação para este gênero.
MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório
de Cultura de Tecidos Vegetais da Fundação Estadual de
Pesquisa Agropecuária FEPAGRO, Porto Alegre/RS.
Realizaram-se dois experimentos, nos quais foram
cultivadas microestacas de Mentha sp. de
aproximadamente 1 cm.
Experimento I os tratamentos consistiram em
diferentes concentrações (30, 60, 90 e 120 %) do meio de
cultura MS.
Experimento II os tratamentos constituíram-se de
variações da composição do meio MS, resultando em
43
quatro tratamentos: T1- sem sais e vitaminas; T2 - sem sais
e com vitaminas; T3 - 30% dos sais com vitaminas e T4 100% dos sais sem vitaminas.
Nos dois experimentos, os tratamentos foram
suplementados com sacarose a 30 g L-1, solidificados com
7 g L-1 de agar e pH ajustado para 5,8. As vitaminas
utilizadas foram: biotina (0,01 mg L-1), ácido nicotínico (0,5
mg L-1), piridoxina (0,5 mg L-1), tiamina (0,1 mg L-1) e glicina
(2 mg L-1). Após a fusão do ágar, foram vertidos 20 mL de
meio em frascos de vidro e autoclavados a uma temperatura
de 120ÀC e 1psi, por 15 min.
O delineamento experimental foi o inteiramente
casualizado, com 12 repetições e quatro explantes por
frasco. Os explantes foram mantidos em sala de crescimento
por 40 dias (Experimento I) e 30 dias (Experimento II), a
uma temperatura média do ar de 25 µ 2ÀC, fotoperíodo de
16 horas e intensidade luminosa de 5000 lux. Para cada
experimento, avaliou-se o número de nós (NN) e de
brotações (NB), o comprimento da parte aérea (CPA) e de
raízes (CR), e o peso da matéria seca da parte aérea (PSPA)
e das raízes (PSR).
e as médias comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de
5%, através do programa SANEST (ZONTA &
MACHADO, 1984).
Na análise da variância realizada para o experimento
1, observou-se que não houve efeito significativo da
concentração do meio MS para as variáveis estudadas. A
média de cada variável está listada na Tabela 1.
Pelos resultados obtidos, verificou-se que o
tratamento com 30% dos sais do meio MS permitiu o mesmo
crescimento dos explantes cultivados em meio com 100%
dos sais. A resposta não significativa, das variáveis
analisadas, ao aumento da concentração do meio MS permite
inferir que a menta possui uma baixa exigência nutricional e
facilidade para ser cultivada in vitro. Dessa forma, decidiuse por verificar a necessidade dos outros componentes do
meio de cultura, resultando no experimento 2.
44
TONIETTO, S. M. et al.
TABELA 1 Valores médios das variáveis estudadas na multiplicação in vitro de microestacas de menta. Porto Alegre,
2006.
Variável
Número de nós (NN)
Número de brotações (NB)
Média
CV%
24,65
19,67
2,12
5,26
13,13
15,48
Comprimento da raiz (CR), em cm
6,00
18,84
Peso seco da parte aérea (PSA), em g
0,545
35,34
Peso seco das raízes (PSR), em g
0,136
34,18
Comprimento da parte aérea (CPA), em cm
Através da análise da variação, para os dados
obtidos no experimento 2, constatou-se que houve
diferença significativa em todas as variáveis analisadas.
O tratamento em que foi utilizada a totalidade dos
sais do meio MS (T4) apresentou valores superiores em
todas as variáveis, sendo igualado nas variáveis número
de nós, número de brotações e comprimento de raiz, pelo
tratamento contendo 30% dos sais suplementado com as
vitaminas (T3) (Tabela 2). Geralmente, o aumento da
concentração dos sais do meio MS proporciona o aumento
das variáveis avaliadas. Villa et al. (2005), observaram o
aumento do número de folhas, brotos e comprimento da
parte aérea em segmentos nodais de amora preta, utilizando
150% do meio MS. Pascoal et al. (2002), trabalhando com
embriões imaturos de tangerina Poncã , observaram que
o valor das variáveis de parte aérea e radicular, foi
incrementado com o aumento das concentrações do meio
MS até um ponto máximo, sendo esse próximo à
concentração padrão.
Murashige (1974) relata que vários fatores
influenciam o comportamento dos explantes in vitro, sendo
muitos deles similares àqueles que limitam o crescimento
das plantas ex vitro, como a disponibilidade de nutrientes
minerais. Pierik (1990) considera que, depois dos açúcares,
os minerais constituem o grupo mais importante de
substâncias nutritivas no cultivo in vitro de plantas.
Verifica-se que, para a multiplicação in vitro da menta, os
minerais foram essenciais, dando condições para o
crescimento da parte aérea e radicular das microplantas.
Outras substâncias essenciais para o crescimento
dos tecidos e que controlam em grande parte o padrão de
desenvolvimento in vitro são as vitaminas.
Segundo Caldas et al. (1998), o efeito benéfico da
inclusão de determinadas vitaminas no meio de cultura
dependerá, em grande parte, da capacidade de biossíntese
nos tecidos ou órgãos cultivados. Bonner (1937) e Robins
& Bartley (1937) reportaram à importância da tiamina no
crescimento de segmentos radiculares de tabaco. Linsmaier
& Skoog (1965) mostraram que a tiamina era essencial para
a cultura de tecidos de tabaco e sugeriram o aumento da
sua concentração e a eliminação da piridoxina e ácido
nicotínico do meio nutritivo, pois consideraram estas
ligeiramente inibitórias ao crescimento. Dessa forma, dois
fatores podem ter contribuído para a homogeneidade dos
tratamentos do primeiro experimento: o maior período de
cultivo, possibilitando que tratamentos com menor
crescimento alcançassem os de maior crescimento, esses
limitados ao volume do frasco, e à utilização das vitaminas
em todos os tratamentos. Já no experimento 2, a ausência
de vitaminas pode ter permitido a superioridade de algumas
variáveis do T4 sobre o T2. Embora estatisticamente não
tenha havido diferença para o número de nós e de
brotações, a aparência das microplantas cultivadas em meio
MS 100% foi superior às cultivadas no meio MS 30% com
vitaminas.
Como houve crescimento normal das microplantas
em meio sem a utilização de vitaminas, pôde-se inferir que
as mesmas não apresentam uma função essencial na
45
TABELA 2 Média das variáveis estudadas na micropropagação de menta, variando-se a composição do meio de
cultura MS. Porto Alegre, 2006.
Tratamentos
Variáveis
NN
NB
CR (cm)
CPA (cm)
PSR (g)
PSPA (g)
T1
1,89 b
1,15 b
0,68 b
0,59
c
0,00 c
0,01 b
T2
2,19 b
1,68 ab
1,44 b
1,06 bc
0,00 c
0,04 b
T3
6,86 a
1,82 ab
3,05 ab
2,78 b
0,04 b
0,13 b
T4
11,98 a
2,25 a
5,77 a
5,38 a
0,09 a
0,40 a
14,81
6,751
CV%
52,09
33,82
43,38
32,15
Médias seguidas por letras distintas diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5%.
NN número de nós; NB número de brotações; CR comprimento de raiz; CPA comprimento da parte aérea; PSR
peso da matéria seca de raiz; PSPA peso seco da parte aérea; T1- sem sais e vitaminas; T2-sem sais e com vitaminas;
T3-30% dos sais com vitaminas e T4- 100% dos sais sem vitaminas.
multiplicação in vitro de menta, podendo ser dispensada
em cultivo com o meio MS na sua concentração normal de
sais.
Na variável número de brotações observou-se que
a diferença significativa foi entre os tratamentos T1 e T4.
Morfologicamente, as plantas de menta apresentam duas
gemas em cada nó, sendo esperado que, em condições
ideais, as gemas originem pelo menos duas brotações. Pelos
dados observados na Tabela 2, a presença dos sais
possibilitou a melhor condição para o crescimento das
brotações e a manifestação dessa característica
morfológica.
Todos os meios proporcionaram condições para a
indução de raízes. No entanto, apenas nos meios compostos
por sais e/ou vitaminas houve crescimento radicular
significativo. Riquelme et al. (1991) também observaram a
formação de raízes em menta, utilizando o meio MS isento
de reguladores de crescimento. Essas observações
sugerem que os reguladores de crescimento, para a indução
radicular, são dispensáveis para a menta, deduzindo-se
que o explante possui naturalmente os fatores necessários
para o enraizamento. Já Godoy (2005) observou que a
necessidade de reguladores de crescimento depende da
espécie, não sendo necessário para M.citrata Ehrh. e
recomendaram a suplementação com benzilaminopurina
para M. piperita L. Para o crescimento das raízes, observou-
se novamente a importância dos sais, que possibilitaram
um crescimento significativamente maior em relação aos
tratamentos sem sais.
Nicoloso et al. (2001) observaram, na
micropropagação do Ginseng brasileiro, que o comprimento
das brotações e peso da matéria seca da parte aérea
respondiam de forma linear positiva ao aumento da
concentração dos macronutrientes do meio MS. Porém,
não houve efeito significativo no peso da matéria seca das
raízes. Já Pereira et al. (1999), verificaram que a redução de
sais do meio MS incrementou positivamente a porcentagem
de explantes enraizados na cultivar de morangueiro Hofla
e aumentou o número e o comprimento de raízes das
cultivares Hofla e Tangi. Observa-se na Tabela 2 que a
maior concentração de sais proporcionou o maior CPA e
PSPA, enquanto que para o CR a resposta foi
estatisticamente igual ao tratamento com 30% dos sais.
Disso pode-se inferir que a redução de sais afeta
principalmente o crescimento da parte aérea na
micropropagação da menta.
Nos tratamentos onde não foram adicionados sais
notou-se uma coloração avermelhada na parte aérea. Ikranul-Haq & Zafar (2004), ao estudarem culturas embriogênicas
em algodoeiro, com diferentes fontes de nitrogênio no meio
de cultura, também fizeram essa observação, relatando que,
possivelmente, essa coloração tenha sido originada pelo
46
TONIETTO, S. M. et al.
acúmulo de antocianinas devido ao estresse fisiológico
causado pela falta de minerais.
Diante dos resultados obtidos fica evidente a
facilidade que a menta apresenta para ser micropropagada.
No entanto, a presença de minerais torna-se essencial para
o crescimento e desenvolvimento das microplantas.
CONCLUS›ES
Nas composições estudadas, os sais minerais se
apresentaram essenciais ao meio nutritivo para
multiplicação in vitro da menta.
O meio MS, em sua concentração padrão sem
vitaminas ou com 30% de sais com as vitaminas, permitiu a
formação de plantas normais.
BERTOLUCCI, S.K.V. et al. Micropropagação de
Tournefortia cf paniculata Cham. Revista Brasileira de
Plantas Medicinais, Botucatu, v. 3, n. 1, p. 43-49, 2000.
BONNER, J. Vitamin B1 a growth factor for higher plants.
Science, v. 85, p. 183-184, 1937.
CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios
nutritivos. In: TORRES, A. C. et al. (Eds.). Cultura de tecidos
e transformação genética de plantas. Brasília, DF: EmbrapaSPI, 1998. p. 87-132.
GHANTI, K. et al. Rapid regeneration of Mentha piperita
L. from shoot tip and nodal explants. Indian Journal of
Biotechnology, New Delhi, v. 3, n. 4, p. 594-598, 2004.
GODOY, L. Efecto de los reguladores del crecimiento en la
multiplicación in vitro de Mentha piperita y Mentha
citrata. Cultivos Tropicales, v. 26, n. 1, p. 73-75, 2005.
GRATTAPAGLIA,
D.;
MACHADO,
M.A.
Micropropagação. In: TORRES, A. C. et al. (Eds.). Cultura
de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília,
DF: Embrapa-SPI, 1998. p. 183-260.
IKRAM-UL-HAQ; ZAFAR, U. Effect of netrates on embryo
induction efficiency in cotton (Gossypium hisutum L.).
African Journal of Biotechnology, Pretoria, v. 3, n. 6, p.
319-323, 2004.
LINSMAIER, E.M.; SKOOG, F. Organic growth factor
requirements of tabacco tissue cultures. Physiologia
Plantarum, Copenhagen, v. 18, p. 100-127, 1965.
MALDANER, J. et al. Sacarose e nitrogênio na
multiplicação in vitro de Pfaffia glomerata (Spreng.)
Pedersen. Ciência Rural, Santa Maria, v. 36, n. 4, p. 12011206, 2006.
MARANCA, G. Plantas aromáticas na alimentação. São
Paulo: Nobel, 1986.
MARTINS, C. F.; NICOLOSO, F. T. Micropropagação de
Pfaffia tuberosa (Spreng.) Hickern. Revista Brasileira de
Plantas Medicinais, Botucatu, v. 6, n. 3, p. 53-61, 2004.
MATOS, F. J. A. Farmácias vivas: sistemas de utilização
de plantas medicinais projetadas para pequenas
propriedades. 3. ed. Fortaleza: EUFC, 1998. 220 p.
MURASHIGUE, T. Plant propagation through tisssue
culture. Annual Review of Plant Physiology, v. 25, p. 135166, 1974.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised médium for rapid
growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum, Copenhaguen, v. 15, p. 473-497, 1962.
NICOLOSO, F.T.; ERIG, A.C.; MARTINS, C.F.;
RUSSOWSKI, D. Micropropagação do Ginseng
Brasileiro[(Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen]. Revista
Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v. 3, n. 2, p.
11-18, 2001.
PASCOAL, M. et al. Cultivo in vitro de embriões imaturos
de tangerineira Poncã : concentrações do meio MS e da
sacarose. Revista Ceres, Viçosa, v. 49, n. 282, p. 181-189,
2002.
PEREIRA, J. E. S. et al. Enraizamento in vitro do morangueiro
(Fragaria x ananassa Duchesne) em diferentes
concentrações do meio MS. Ciência Rural, Santa Maria,
v. 29, n. 1, p. 17-20, 1999.
PHATAK, S.V.; HEBLE, M. R. Organogenesis and terpenoid
synthesis in Mentha arvensis. Fitoterapia, v. 73, p. 3239, 2002.
PIERIK, R. L. M. Cultivo in vitro de las plantas superiores.
Madri: Mundi-Prensa, 1990. 326 p.
47
RIQUELME, C.; GUIÑAZÐ, M. E.; TIZIO, R.
Preacondicionamiento y aclimatación, em condiciones d
invernáculo de plântulas micropropagadas de frutilla,
menta, papa y vid. Pyton, Buenos Aires, v. 52, n. 1, p. 7382, 1991.
AROMATIC AND SPICE PLANTS, 1985, Novi Sad. Acta
Horticulturae, v. 249, p. 33-44, 1989.
ROBBINS, W. J.; BARTLEY, M. A. Vitamin B1 and the
growth of excidse tomato roots. Science, v. 85, p. 246247, 1937.
VILLA, F. et al. Multiplicação in vitro da amoreira-preta
Ébano em diferentes concentrações de meio MS e BAP.
Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 29, n. 3, p. 582-589,
2005.
SCHILCHER, H. Quality requirements and quality
standards for medicinal, aromatic and spices plants. In:
INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON HEAVY METALS
AND PESTICIDES RESIDUES IN MEDICINAL,
TERMIGNONI, R. R. Cultura de tecidos vegetais. Porto
Alegre: UFRGS, 2005. 182 p.
ZONTA, E. P.; MACHADO, A. A. SANEST Sistema de
Análise Estatística para Microcomputadores. Pelotas:
UFPel, 1984.
48
COMUNICAÇ‹O
OLIVEIRA, A. B.CIENT¸FICA
de et al.
MULTIPLICAÇ‹O E ENRAIZAMENTO IN VITRO DO MANDACARU
(Cereus jamacaru P. DC.)
IN VITRO MULTIPLICATION AND ROOTING OF MANDACARU
(Cereus jamacaru P. DC.)
ALEXANDRE BOSCO DE OLIVEIRA1, JOSEFA DIVA NOGUEIRA DINIZ2, JACQUELINE LEITEALMEIDA3
Engenheiro Agrônomo, Doutorando em Agronomia/Fitotecnia, bolsista do CNPq Universidade Federal do Ceará/UFC Cx. P.
12168 60356-001 Fortaleza, CE [email protected]
2
Engenheira Agrônoma, DSc., Pesquisadora Departamento de Fitotecnia/CCA Universidade Federal do Ceará/UFC Cx. P. 12168
60356-001 Fortaleza, CE [email protected]
3
Engenheira Agrônoma, MSc., Técnica Departamento de Fitotecnia/CCA Universidade Federal do Ceará/UFC Cx. P. 12168
60356-001 Fortaleza, CE [email protected]
1
RESUMO
Dois experimentos foram realizados objetivando-se
de determinar uma metodologia para a multiplicação e o
enraizamento in vitro de mandacaru (Cereus jamacaru P.
DC.). Para a multiplicação, foram utilizadas brotações de
mandacaru com comprimento médio de 1,0 cm, retiradas de
plantas estabelecidas in vitro e inoculadas em meio de cultura
MS com diferentes concentrações de BAP e de 2-iP (0,5 e
1,0 e 2,0 mg L-1). Após 60 dias de cultivo, foram avaliados o
número de brotações, altura, biomassa fresca e seca das
brotações. Para o enraizamento, as brotações foram cultivadas
em diferentes proporções do meio MS (25, 50 e 100%) e
diferentes concentrações de AIB (0,0; 1,0 e 2,0 mg L-1). Aos
30 dias foram avaliados o número de raízes, o tamanho da
maior raiz e a biomassa fresca e seca das raízes. Nos dois
experimentos, as brotações foram inoculadas em tubos de
ensaio contendo 10 ml do meio de cultura e mantidas em sala
de crescimento com temperatura média de 26oC, fotoperíodo
de 16 horas e intensidade luminosa em torno de 2000 lux. O
mandacaru apresenta multiplicação in vitro beneficiada
quando cultivado em meio MS acrescido de 1,0 mg L-1 de 2iP. Para o enraizamento, a concentração de 25% dos sais do
meio MS, com 2,0 mg L -1 de AIB, proporciona os melhores
resultados.
matter weight of the explants were determined. For rooting,
the explants were cultivated in different MS salt (25, 50 and
100%) and IBA (0.0; 1.0 and 2.0 mg L-1) concentrations. After
30 days of culture, the number of roots, length of the biggest
root and the fresh and dry matter weight of the roots were
evaluated. In both experiments the explants were inoculated
in tubes containing 10 ml of culture medium and maintained in
a growth room with an average temperature of 26 C,
photoperiod of 16 hours and light intensity of approximately
2000 lux. Mandacaru presented better in vitro multiplication
when cultivated in MS supplemented with 1.0 mg L-1 2-iP.
For rooting, the use of MS 25% plus 2.0 mg L-1 IBA presented
the best results.
Termos para indexação: Cactaceae, micropropagação,
reguladores de crescimento, Cereus jamacaru.
e cerrado. O Brasil possui 37 gêneros nativos (30% do
ABSTRACT
Two experiments were carried out with the objective
to determine a methodology for multiplication and in vitro
rooting of Mandacaru. For multiplication, shoots with an
average length of 1.0 cm, removed from settled in vitro plants
were inoculated in MS medium with different concentrations
of BAP and 2-iP (0.5; 1.0 and 2.0 mg L-1 ). After 60 days of
culture, the number of shoots, height, and the fresh and dry
Index terms: Cactaceae, micropropagation, growth regulators,
Cereus jamacaru.
A família das Cactáceas possui 113 gêneros, com
2.260 taxa aceitos, distribuídos pelas Américas. As
cactáceas se distribuem desde o sul do Canadá até a
Patagônia, sendo mais freqüentes em zonas quentes.
Ocorrem em caatinga, campos rupestres, mata atlântica
total de cactos), dos quais 28 (75%) são encontrados
no Leste do país. Das 128 espécies nativas do leste
brasileiro, 87 são endêmicas dessa região que é
considerada o terceiro maior centro de diversidade em
cactáceas (ASSIS, 2005).
O mandacaru (Cereus jamacaru P. DC.) é uma
cactácea de grande importância para a sustentabilidade e
(Recebido em 03 de setembro de 2007 e aprovado em 29 de maio de 2008)
Multiplicação e enraizamento in vitro do Mandacaru...
conservação da biodiversidade do bioma caatinga. Seus
frutos são alimentos para pássaros e animais silvestres.
Em períodos de seca, essa cactácea é largamente utilizada
pelos agricultores para alimentação dos animais
(CAVALCANTE & RESENDE, 2006). Silva et al. (2005)
ressaltam que o mandacaru, entre outras cactáceas nativas
da caatinga, tem sido utilizado nos períodos de seca
prolongada, como um dos principais suportes forrageiros
dos ruminantes.
A produção de mudas é uma das etapas mais
importantes do sistema produtivo, uma vez que delas
depende o desempenho final das plantas. Chaves et al.
(2005) reportam que, por meio da micropropagação, é
possível propagar espécies de difícil multiplicação, e ainda,
obter mudas sadias, livres de vírus, bactérias e fungos,
produzindo assim, um material de alta qualidade genéticosanitária.
O tipo de citocinina e sua concentração são os
principais fatores que influenciam o sucesso da
multiplicação in vitro. Testes de diversas combinações
com outros reguladores de crescimento são muito comuns
para o ajustamento dos meios de cultura (GRATTAPAGLIA
& MACHADO, 1998). O BAP (6-benzilaminopurina) tem
sido muito eficiente na multiplicação de partes aéreas e
indução de gemas adventícias em diversas espécies (HU
& WANG, 1983), e é a citocinina mais utilizada, seguida
pela cinetina e 2-iP (N,6-isopenteniladenina). Para
multiplicação em meio de cultura, em geral, suas
concentrações variam de 0,1 a 5,0 mg L-1 (TOMBOLATO
& COSTA, 1998).
As diversas aplicações da cultura de tecidos
utilizam como meio básico o MS (MURASHIGE & SKOOG,
1962), sendo o mais comumente utilizado para propagação
da maioria das espécies vegetais. No entanto, a
concentração de seus nutrientes tem sido identificada como
elevada (PIERIK, 1987). Altas concentrações de sais,
mesmo na presença de auxinas, podem inibir as fases de
enraizamento, mais particularmente a de crescimento de
raízes (GRATTAPAGLIA& MACHADO, 1990). De acordo
com Zimmermann & Broome (1979); Ferreira et al. (1996);
49
embora as variações sejam inúmeras, conforme a espécie e
os sistemas de enraizamento, diluições na concentração
dos sais do meio MS são freqüentes nessa fase.
Segundo Anderson (1984) e Hasegawa (1980) e as
plantas herbáceas enraízam na presença de níveis muito
reduzidos de auxina ou em meio básico sem regulador. Para
Caldas et al. (1998), diversas auxinas isoladamente ou em
combinação podem ser usadas no enraizamento da maioria
das espécies, e as mais utilizadas são o ácido
naftalenoacético (ANA), o ácido indolacético (AIA) e o
ácido indolbutírico (AIB) que é freqüentemente, a melhor
auxina para indução de raízes in vitro.
Objetivou-se, no presente trabalho, determinar uma
metodologia para a multiplicação e o enraizamento in vitro
do mandacaru para produção de mudas.
Foram conduzidos dois experimentos no
Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas do
Departamento de Fitotecnia da UFC, Fortaleza-CE. O
material vegetal utilizado nos experimentos foi proveniente
de brotações de mandacaru retiradas de plantas préestabelecidas in vitro, originadas de sementes germinadas,
multiplicadas e mantidas em meio MS com 0,5 mg L-1
de BAP.
No primeiro experimento foram utilizados
segmentos de plantas de mandacaru com comprimento
médio de 1,0 cm e inoculados em tubos de ensaio contendo
10 mL do meio MS acrescido de diferentes concentrações
de 6-benzilaminopurina (BAP), constituindo os seguintes
tratamentos: 1. Testemunha (sem citocinina); 2, 3 e 4 com
BAP nas concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 mg L -1 ,
respectivamente; e 5, 6 e 7 com 2-isopenteniladenina (2-iP)
nas concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 mg L-1, respectivamente.
Aos 60 dias de cultivo foram determinados: número de
brotações por explante contando-se as brotações com
comprimento igual ou superior a 0,5 cm em cada explante;
altura da parte aérea obtida com o auxílio de uma régua
graduada; biomassa fresca da parte aérea dos explantes
os explantes foram retirados do meio de cultura e
imediatamente pesados em balança digital de precisão de
quatro casas decimais; biomassa seca da parte aérea dos
50
OLIVEIRA, A. B. de et al.
explantes realizada após a secagem do material em estufa
a 80oC até peso constante.
No segundo experimento, segmentos nodais com
comprimento médio de 1,0 cm foram inoculados em tubos
de ensaio contendo 10 mL do meio MS com diferentes
concentrações dos sais macronutrientes (25, 50 e 100%)
em combinação com diferentes níveis de AIB (0,0; 1,0 e 2,0
mg L-1). Aos 30 dias de cultivo foram avaliados o número
médio de raízes por explante, comprimento médio das raízes,
biomassa fresca e seca das raízes por explante.
Em ambos os experimentos, o meio de cultura foi
suplementado com 3% de sacarose, o pH foi ajustado para
5,7 µ 0,1 após a adição dos reguladores de crescimento e
solidificado com 0,4% de ágar, sendo realizada
posteriormente a esterilização em autoclave (121oC durante
15 minutos). Após a inoculação, os explantes foram
mantidos em sala de crescimento com temperatura média
de 26o C, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa
em torno de 2000 lux fornecida por lâmpada do tipo
fluorescente branca fria.
No experimento de multiplicação, utilizou-se o
delineamento inteiramente casualizado, com quatro
repetições de quatro explantes. Para o enraizamento in vitro
foi usado um arranjo fatorial 3x3 (três concentrações de
macronutrientes x três níveis de AIB), disposto no
delineamento inteiramente casualizado, com seis repetições
de cinco explantes. A comparação das médias de ambos os
ensaios foi realizada por intermédio do teste de Duncan e
de Tukey, a 5% de probabilidade, respectivamente.
O número médio de gemas por explante não foi
significativo pelo teste F, porém quando aplicado o teste
de Duncan para comparação das médias, apresentou
diferença significativa entre os tratamentos (Tabela 1).
Apesar de não ter havido diferença significativa,
entre os tratamentos suplementados com reguladores de
crescimento, no meio com 2-iP, a qualidade das brotações
emitidas tinham aspecto normal, enquanto que com BAP,
as brotações apresentavam-se pequenas, grossas e mal
formadas. De acordo com Hu e Wang (1983), o 2-iP permite
o desenvolvimento normal dos propágulos sem apresentar
brotações múltiplas. Jaakola et al. (2001) verificaram a
eficiência do 2-iP na multiplicação in vitro de Vaccinium
myrtillus L. e Vaccinium vitis-idaea L.
Para a altura média dos explantes houve diferença
entre os tratamentos (Tabela 1). Quando o meio foi
suplementado com 2-iP e no tratamento sem regulador de
crescimento verificou-se que as brotações apresentaram
maior crescimento em relação aos tratamentos que
continham BAP. Normalmente, o BAP inibe o alongamento
das brotações, mostrando efeito negativo na multiplicação
in vitro de Cereus jamacaru. Trabalhando com Heliconia
stricta Huber, Diniz et al. (2004) também obtiveram maior
comprimento médio de gemas em explantes cultivados na
ausência de BAP.
TABELA 1 Número médio de brotações emitidas por explante e altura média dos explantes de mandacaru (Cereus
jamacaru P. DC.) aos 60 dias de cultivo in vitro, em meio MS acrescido de diferentes concentrações de BAP e de 2-iP.
Tratamentos
Testemunha
Brotações/explante
Altura (cm)
1b
2,2 a
-1
5a
2,0 ab
-1
2 ab
1,0 b
-1
BAP (2,0 mg L )
4 ab
1,6 ab
2-iP (0,5 mg L-1)
3 ab
2,2 a
2-iP (1,0 mg L-1)
5a
2,6 a
3 ab
2,5 a
BAP (0,5 mg L )
BAP (1,0 mg L )
-1
2-iP (2,0 mg L )
Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem entre si pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade.
Quanto à biomassa fresca e seca da parte aérea dos
explantes, verificou-se uma tendência quadrática com o
aumento da concentração dos reguladores. (Figuras 1A e
1B). Com o 2-iP houve uma distribuição mais uniforme e a
concentração de 1,0 mg L-1 favoreceu o maior aumento de
biomassa fresca e seca das brotações. Com base nesses
dados, pode-se sugerir que concentrações acima de 2,0
mg L-1, para ambas as citocininas, não favorecem o aumento
de biomasssa em explantes de mandacaru. De acordo com
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1990) o excessivo de
citocinina causa intumescimento e falta de alongamento
das culturas, redução do tamanho das folhas, encurtamento
dos entrenós, engrossamento excessivo dos caules e
vitrificação generalizada da cultura, além da redução do
número de brotos induzidos.
Experimento 2 Enraizamento in vitro
O
comprimento
médio
das
raízes
foi
significativamente diferente nas diferentes concentrações
do meio MS e de AIB, enquanto que para o número médio
de raízes por explante houve diferença significativa para a
interação entre as proporções do meio MS x concentrações
de AIB.
Conforme os resultados apresentados na figura 2A,
o número médio de raízes emitidas por brotação aumentou
significativamente com o acréscimo de AIB ao meio de
51
cultivo. Resultados semelhantes foram obtidos por Diniz
et al. (2006) em explantes de guaco (Mikania glomerata
Spreng). Porém com 2,0 mg L-1 de AIB e 100% dos sais MS
houve uma redução no número médio de raízes emitidas
por explante. O efeito negativo sobre a formação de raízes
em brotações inoculadas em meio MS e AIB nas
concentrações mais altas pode ser devido ao excesso de
sais, pois, de acordo com Pierik (1987), esse meio (MS)
possui elevada concentração de nutrientes.
Quanto ao comprimento médio das raízes, os
melhores resultados foram encontrados no meio com 100%
dos sais nas diferentes concentrações de AIB (Figura 2B).
Telles & Biasi (2005), trabalhando com diferentes
concentrações de AIB no enraizamento in vitro de
caquizeiro (Diospyrus kaky L.f.), também não observaram
diferenças entre as concentrações testadas. Centellas et
al. (1999) obtiveram melhores resultados para o
enraizamento in vitro de macieira utilizando metade da
concentração dos sais do meio MS, independente das
auxinas utilizadas e de suas respectivas concentrações.
Na figura 3, verifica-se que o aumento da
concentração de AIB favoreceu o aumento na produção
de biomassa fresca e seca das raízes. Esses resultados
estão de acordo com os obtidos por Castro et al. (2005), os
quais obtiveram maior produção de massa fresca de raízes
em explantes de mandacaru enraizados em meio de cultivo
B
A
Biomassa (g)
2ip
80
1,2
0,9
0,6
2
2
BAP: y = -0,3424x + 0,9604x + 0,5163 R = 0,538
0,3
0
0,5
1
1,5
-1
Concentração (mg L )
2
2ip
60
40
2
20
2
BAP: y = -29,993x + 74,038x + 17,243 R = 0,6966
2
2
2
2ip: y = -0,5016x + 1,3649x + 0,3929 R = 0,9996
0
Biomassa (mg)
BAP
1,5
BAP
2ip: y = -31,975x + 83,91x + 11,969
0
0
0,5
1
1,5
2
R = 0,9954
2
-1
Concentração (mg L )
FIGURA 1 Biomassa fresca (A) e seca (B) da parte aérea das brotações de mandacaru (Cereus jamacaru P. DC.) aos
60 dias de cultivo in vitro, em meio MS acrescido de diferentes concentrações de BAP e de 2-iP.
52
MS 25%
A
MS 50%
MS 100%
aA aA
Raízes/explante
4,0
aB aB aA
3,0
aC aC
2,0
3,0
Comprimento das
raízes (cm)
5,0
bA
aA
1,0
0,0
0
bA
aA
bB
2,0
1,0
0,0
2
1
B
MS 50% MS 100%
aA
abA
aA
abA
bA
bB
MS 25%
0
-1
AIB (mg L )
2
1
-1
AIB (mg L )
FIGURA 2 Número médio de raízes emitidas por brotação (A) e comprimento médio das raízes (B) de mandacaru
(Cereus jamacaru P. DC.) aos 30 dias de cultivo in vitro, em diferentes concentrações do meio MS e de AIB.
Mesma letra minúscula ou maiúscula na coluna, para as concentrações do meio MS ou do AIB, respectivamente, não
diferem entre si pelo teste de Tukey, a 1% de probabilidade.
A
Biomassa (mg)
MS 50%
MS 100%
120
100
80
60
2
MS 50%: y = 15x + 75,111
R = 0,8557
2
MS 25%: y = 35,167x + 52,278 R = 0,9342
2
2
MS 100%: y = -12,5x + 22,166x + 63,667 R = 1
40
20
0
0
1
2
-1
AIB (mg L )
Biomassa (mg)
MS 25%
140
B
MS 25%
8
7
6
5
4
3
2
1
0
MS 50%
MS 100%
2
MS 25%: y = 2,3333x + 2,8 R = 0,9849
2
MS 50%: y = 1,45x + 4,1944 R = 1
2
2
MS 100%: y = -1,5x + 2,7667x + 4,1 R = 1
0
1
2
-1
AIB (mg L )
FIGURA 3 Biomassa fresca (A) e seca (B) das raízes por brotação de mandacaru (Cereus jamacaru P. DC.) aos 30 dias
de cultivo in vitro, em diferentes concentrações do meio MS e de AIB.
com alta concentração de AIB. Entretanto, neste trabalho,
a maior biomassa fresca e seca das raízes observada na
presença de AIB só ocorreu em meio de cultura com
menores concentrações de nutrientes. A redução à metade
ou a 3/4 da concentração de sais no meio é relatada,
favorecendo o enraizamento in vitro (PEREIRA et al., 2000).
Dessa forma, os maiores valores de biomassa fresca e seca
por brotação foram observadas nos meios de cultura com
maior concentração de AIB, com 25% e 50% dos sais do
meio MS, havendo uma redução no tratamento com 2,0 mg
L-1 de AIB e 100% dos sais. Nesse tratamento foram
observados os menores valores de biomassa fresca e seca,
e que foram similares aos obtidos nesse mesmo meio de
cultivo, na ausência de AIB.
O maior comprimento das raízes foi verificado com
100% dos sais do meio MS nas diferentes concentrações
de AIB. Porém, com 100% dos sais e 2,0 mg L-1 de AIB
houve redução no número médio de raízes emitidas por
brotação, bem como nas biomassas fresca e seca das raízes.
Portanto, a concentração de 25% dos sais macronutrientes
do meio MS com 2,0 mg L-1 de AIB permite um bom
desenvolvimento in vitro de raízes em explantes de
mandacaru quanto ao tamanho, número e produção de
biomassa o que irá favorecer a fase seguinte de
aclimatização.
Na multiplicação in vitro de mandacaru, o meio MS
com 1,0 mg L-1 de 2-iP, favorece a emissão de brotações
com bom desenvolvimento quanto ao número, altura e
biomassa fresca e seca das brotações.
Para o enraizamento, pode ser utilizado o meio MS
com 25% dos sais macronutrientes, combinado com 2,0
mg L-1 de AIB.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq, pela bolsa concedida ao primeiro autor e
ao Banco do Nordeste do Brasil, pelo auxílio financeiro.
ANDERSON, W. C. A revised tissue culture medium for
shoot multiplication of Rhododendron. Journal of the
American Society for Horticultural Science, Iowa, v. 109,
p. 343-347, 1984.
ASSIS, J. G. A. Potencial das cactáceas nativas do leste do
Brasil como plantas ornamentais. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE FLORICULTURA E PLANTAS
ORNAMENTAIS, 15, 2005, Fortaleza. Anais...,
Horticultura brasileira, Brasília, v. 23, p. 664, 2005.
CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios
nutritivos. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A.
(Eds.). Cultura de tecidos e transformação genética de
plantas. Brasília, DF: EMBRAPA, 1998, v. 1, p. 87-132.
CASTRO, P. G.; SANTOS, M. R. A. dos; SOARES, D. L.;
SOUZA FILHO, J. O. A.; MORAIS, J. P. S. de; COELHO,
P. J. de A.; CARVALHO, A. C. P. P. de. Efeitos do AIB
sobre o desenvolvimento in vitro de mandacaru (Cereus
jamacaru). In: CONGRESSO BRASILEIRO DE
FLORICULTURA E PLANTAS ORNAMENTAIS, 15,
2005, Fortaleza. Anais..., Horticultura brasileira, v.23,
p. 658, 2005.
CAVALCANTI, N. B.; RESENDE, G. M. Efeito de diferentes
substratos no desenvolvimento de mandacaru (Cereus
jamacaru P. DC.), facheiro (Pilosocereus pachycladus
Ritter), Xiquexique (Pilosocereus gounellei (A. Weber ex
K. Schum.) Bly. Ex Rowl.) e coroa-de-frade (Melocactus
53
bahiensis Britton. Revista Caatinga, v. 20, n. 1, 2006.
Disponível em: <http://periódicos.ufersa.edu.br/index.php/
sistema/article/view/108/79> Acesso em 10 fev. 2007.
CENTELLAS, A. Q.; FORTES, G. R. de L.; MÜLLER, N. T.
G.; ZANOL, G. C.; FLORES, R.; GOTTINARI, R. A. Efeito
de auxinas sintéticas no enraizamento in vitro da macieira.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 34, n. 2, p.
181-186, 1999.
CHAVES, A.C.; SCHUF, M.W.; ERIG, A.C. Estabelecimento
e multiplicação in vitro de Physalis peruviana L. Revista
Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 29, n.6, p. 12811287, 2005.
DINIZ, J. D. N.; GOMES, S. O.; INNECCO, R.; ALMEIDA,
J. L.; COSTA, J. T. A. Avaliação dos efeitos da quebra da
dominância apical e do BAP na multiplicação in vitro de
Heliconia stricta Huber. Revista Ciência Agronômica,
Fortaleza, v. 35, p. 232-237, 2004. Edição especial.
DINIZ, J.D.N.; MAGALH‹ES, J.R.; INNECCO, R.;
ALMEIDA, J.L.; PINHO, J.L.N. Multiplicação e
enraizamento in vitro do guaco. Revista Ciência
Agronômica, Fortaleza, v. 37, n. 1, p. 59-64, 2006.
FERREIRA, A. F.; FARIAS, A. X.; SILVA, E. S. B. da A.;
FORTES, G. R. de L. Enraizamento de duas cultivares de
morangueiro (Fragaria x ananassa Duch.) em diferentes
concentrações de sais do meio MS. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 14, 1996, Curitiba.
Resumos... Curitiba: Sociedade Brasileira de Fruticultura,
1996. p. 351.
G RAT TA PA G L I A , D . ; MA CH A D O , M . A .
Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.
Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas.
Brasília, DF: ABCTP/EMBRAPA-CNPH, 1990. p. 99169.
GRATTAPAGLIA,
D.;
MACHADO,
M.A.
Micropropagação. In: TORRES, A. L.; CALDAS, L. S.;
BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação
genética de plantas. Brasília, DF: Embrapa, 1998. v. 1, p.
183-260.
HASEGAWA, P.M. Factors affecting shoot and root
initiation from cultured rose shoot tips. Journal of the
American Society for Horticultural Science, Iwoa, v. 105,
p. 216-220, 1980.
54
HU, C. Y.; WANG, P. J. Meristem, shoot tip and bud culture.
In: EVANS, D. A.; SHARP, W. R.; AMMIRATO, P. V.;
YAMADA, Y. (Eds.). Handbook of plant cell culture:
techniques for propagation and breeding. New York:
Macmillan, 1983. p. 177-227.
JAAKOLA, L.; TOLVANEN, A.; LAINE, K.; HOHTOLA,
A. Effect of N6-isopentenyladenine concentration on
growth initiation in vitro and rooting of bilberry and
lingonberry microshoots. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, Hague, v. 66, p. 73-77, 2001.
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p. 473-497, 1962.
PEREIRA, A. M. S.; BERTTONI, B. W.; MORAES, R. M.;
FRANÇA, S. C. Micropropagation of Salix humboldtiana
Hild. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu,
v. 2, n. 2, p. 17-21, 2000.
PIERIK, R. L. M. In vitro culture of higher plants.
Netherlands: M. Nihoff Puhers, 1987. 344p.
SILVA, J. G. M.; SILVA, D. S.; FERREIRA, M. A.; LIMA, G. F.
C.; MELO, A.A.S.; DINIZ, M.C.N.M. Xiquexique
(Pilosocereus gounellei (A. Weber ex K. Schum.) Bly. Ex
Rowl.) em substituicão à silagem de sorgo (Sorghum bicolor
L. Moench) na alimentação de vacas leiteiras. Revista
Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v. 34, n. 4, p. 1408-1417, 2005.
TELLES, C.A.; BIASI, L.A. Enraizamento in vitro e
aclimatização em casa-de-vegetação do caquizeiro
(Diospyrus kaki L.). Revista Ciência e Agrotecnologia,
Lavras, v. 29, n. 2, p. 481-484, 2005.
TOMBOLATO,
A.F.C.;
COSTA,
A.M.M.
Micropropagação de plantas ornamentais. Boletim
Técnico do Instituto Agronômico, Campinas, v. 174, p.5862, 1998.
ZIMMERMAN, P. M.; BROOME, G. U. The physiology on
in vitro assexual embryogenesis. Horticultural Rewiew,
v. 2, p. 268-310, 1979.
NORMAS PARA PUBLICAÇ‹O DE ARTIGOS E COMUNICAÇ›ES CIENT¸FICAS
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation
é editada semestralmente pela Editora da Universidade
Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos
científicos e comunicações científicas da área de cultura
de tecidos de plantas, elaborados por membros da
comunidade científica nacional e internacional. Não é
cobrada taxa para publicação de trabalhos, desde que um
dos autores seja sócio e esteja em dia com a ABCTP
(Associação de Cultura de Cultura de Tecidos de Plantas).
É condição fundamental que os artigos/comunicações
submetidos à apreciação da revista Plant Cell Culture &
Micropropagation não foram e nem serão publicados
simultaneamente em outro lugar. Com a aceitação do artigo
para publicação, os editores adquirem amplos e exclusivos
direitos sobre o artigo para todas as línguas e países. A
publicação de artigos/comunicações dependerá da
observância das Normas Editoriais, dos pareceres do Corpo
Editorial e da Comissão ad hoc. Todos os pareceres têm
caráter sigiloso e imparcial, e tanto os autores quanto os
membros do Corpo Editorial e/ou Comissão ad hoc não
obtêm informações identificadoras entre si.
Os conceitos e afirmações contidos nos artigos e
comunicações serão de inteira responsabilidade do(s)
autor(es).
1. SUBMISS‹O:
Cada trabalho deverá ter no máximo 14 páginas e
junto do mesmo deverá ser encaminhado ofício dirigido ao
Editor Chefe da revista, solicitando a publicação do artigo.
Esse ofício deverá conter o pedido de apreciação
na revista ao editor chefe, a declaração de ser um trabalho
original e não ter sido submetido a nenhuma outra revista,
ser assinado por todos os autores, constar o endereço
completo, telefone e e-mail de todos. Qualquer inclusão,
exclusão ou alteração na ordem dos autores, deverá ser
notificada mediante ofício assinado por todos os autores
(inclusive do autor excluído).
Originais: quatro vias impressas e uma via em CDR, com
texto e ilustrações e gráficos. Das 4 vias impressas apenas
1 deve conter os nomes completos dos autores e rodapé
na primeira página.
Processador de texto: Word for Windows (version 98, 2000,
XP ou 2003)
Redigido em português, inglês ou espanhol
Espaçamento do texto: Duplo. Margens: esquerda (3cm),
direita (2cm), inferior e superiores (2,5cm). Cabeçalho e
Rodapé (2,5cm).
Papel: formato A4
Fonte: Times New Roman, tamanho 12
Número de páginas: até 14 páginas, numeradas
consecutivamente, incluindo as ilustrações
Tabelas: devem fazer parte do corpo do artigo e ser
apresentadas no módulo tabela do Word. O título deve
ficar acima.
Gráficos, Figuras e Fotografias: devem ser apresentados
em preto e branco, nítidos e com contraste, escaneados,
inseridos no texto após a citação dos mesmos e também
em um arquivo à parte, salvos em extensão tif ou jpg ,
com resolução de 300 dpi. Os gráficos devem vir também
em excel, com letra Times New Roman, tamanho 10, sem
negrito, sem caixa de textos e agrupados, em arquivo à
parte.
Símbolos e Fórmulas Químicas: deverão ser feitos em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker, sem perda de suas formas originais.
2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇ‹O
2.1. O artigo científico deve ser apresentado na seguinte
seqüência:
T¸TULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfulas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação instituição a que o autor
está filiado endereço da instituição CEP cidade, estado
endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista Plant Cell Culture & Micropropagation para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
INTRODUÇ‹O
Deve apresentar uma visão concisa do estado atual
do conhecimento sobre o assunto, que o manuscrito
aborda e enfatizar a relevância do estudo, sem constituirse em extensa revisão e, na parte final, os objetivos da
pesquisa. Deve incluir a revisão de literatura.
MATERIAL E MÉTODOS
Esta seção pode ser dividida em subtítulos,
indicados em negrito.
Podem ser divididas em subseções, com subtítulos
concisos e descritivos, e conter tabelas e figuras.
CONCLUS›ES
Finalizar com os resultados de acordo com os
objetivos do trabalho
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos
Devem seguir as normas para citação no texto e na
seção própria.
2.2. A comunicação científica deve ser apresentada na
seguinte seqüência:
T¸TULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfluas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação instituição a que o autor
está filiado endereço da instituição CEP cidade, estado
endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista Plant Cell Culture & Micropropagation para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
Texto: sem subdivisão, porém com introdução, material e
métodos, resultados e discussão (podendo conter tabelas
e gráficos e conclusão subentendidas.
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos.
Devem seguir as normas para citação no texto e na seção
própria.
3. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS,
GR˘FICOS, FIGURAS, S¸MBOLOS E FŁRMULAS,
ESSAS DEVER‹O OBEDECER ¤S SEGUINTES
NORMAS:
3.1. Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão TIFF ou JPEG com resolução de 300 dpi.
3.2. Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão TIFF ou JPEG com resolução de 300 dpi.
As figuras deverão ser elaboradas com letra Times New
Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e
agrupadas.
3.3. Gráficos deverão ser inseridos após citação dos
mesmos, dentro do próprio texto, elaborado
preferencialmente em Excel, com letra Times New Roman,
tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas.
3.4. Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker (ex: MathType, Equation), sem perda de suas
formas originais.
OBS: A formatação correta é parte imprescindível para que
o trabalho seja devidamente protocolado. Caso este não
esteja nas normas, o mesmo será recusado.
4. REFER¯NCIAS BIBLIOGR˘FICAS: as referências
bibliográficas devem ser citadas conforme a NBR6023/2002
da ABNT.
A exatidão das referências constantes da listagem e a
correta citação no texto são de responsabilidade do(s)
autor(es) do artigo.
4.1. Orientações gerais:
- Deve-se apresentar todos os autores do documento
científico (fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não
deve ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de
publicação (cidade), a ser descrito no lugar adequado para
cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
4.2. Exemplificação (tipos mais comuns):
ARTIGO DE PERIŁDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de
ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas
Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p. 7480, jan./mar. 2000.
LIVRO:
a) livro no todo:
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and
procedures of statistics. New York: McGraw-Hill Book,
l960. 481 p.
b) Parte de livro com autoria específica:
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos
da automação sobre a organização da produção de trabalho.
In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília: IPEA/
IPLAN, 1980. p. 149-159.
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em
confinamento. In: ______. Confinamento de bovino de
corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.
DISSERTAÇ‹O E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica
de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de Rhyzopertha
dominica (F.) durante o armazenamento em atmosfera
controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f. Dissertação (Mestrado
em Ciência dos Alimentos) Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 1997.
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas
mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p.
Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
Nota: A folha é composta de duas páginas: anverso e
verso. Alguns trabalhos, como teses e dissertações são
impressos apenas no anverso e, neste caso, indica-se f.
(ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de
madeira em floresta densa de terra firme da Amazônia
brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, 6.,
1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão: SBS/
SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRłNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme
normas específicas para cada tipo de documento
(monografia no todo e em parte, trabalho apresentado em
evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.),
acrescidas de informações sobre o endereço eletrônico
apresentado entre braquetes (< >), precedido da expressão
Disponível em: e da data de acesso ao documento,
precedida da expressão Acesso em: .
Nota: Não se recomenda referenciar material eletrônico de
curta duração nas redes (ABNT, NBR6023/2000, p. 4).
Segundo padrões internacionais, a divisão de endereço
eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
Monografia (acesso online):
a) livro no todo
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília:
Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: <http//
www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In:
______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde.
Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível
em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de
institutos de pesquisa tecnológica: a experiência de
projeto excelência na pesquisa tecnológica. In:
CONGRESSO ABIPTI, 2000, Fortaleza. Gestão de
institutos de pesquisa tecnológica. Fortaleza: Nutec, 2000.
Disponível em: <http://www.abipti.org.br>. Acesso em:
01 dez. 2000.
d) Tese
SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua brasileira
de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação (Mestrado
em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua) - Pontifícia
Universidade Católica de São Paulo, São Paulo, 1997.
Disponível em: <http://www.terra.com.br/virtualbooks/
freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em: 28 nov. 2000.
O INFORMAR˘ SOBRE SUA PUBLICAÇ‹O. OS
ARTIGOS QUE NECESSITAREM DE MODIFICAÇ›ES
SER‹O DEVOLVIDOS AO AUTOR PARAA DEVIDA
REVIS‹O.
Artigo de periódico (acesso online):
7. OS ARTIGOS SER‹O PUBLICADOS EM ORDEM
DEAPROVAÇ‹O.
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um
conceito contemporâneo. Informação e Sociedade, Recife,
v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível em: <http://
www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em: 30 nov.
2000.
CITAÇ‹O: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTORDATA) (conforme ABNT, NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE,
1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al.,
1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma
obra deve-se separá-los pelo sinal & (comercial).
5. O EDITOR CHEFE NOTIFICAR˘ O AUTOR DO
RECEBIMENTO DO ORIGINAL E, POSTERIORMENTE,
6. OS ARTIGOS N‹O APROVADOS SER‹O
DEVOLVIDOS.
8. O N‹O-CUMPRIMENTO DESSAS NORMAS
IMPLICAR˘ NA DEVOLUÇ‹O DO ARTIGO AO
AUTOR.
9. OS CASOS OMISSOS SER‹O RESOLVIDOS PELA
COMISS‹O EDITORIAL.
10. OARTIGO DEVER˘ SER ENVIADO PARA:
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia/Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
CEP 37200-000
Lavras MG
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
Plant Cell Culture & Micropropagation , a
semestral journal edited by Editora UFLA of the
Universidade Federal de Lavras, publishes scientific
articles and communications in the area of plant tissue
culture, elaborated by researchers of the national and
international scientific community. One of the authors must
be associated and have paid all charges required by the
ABCTP (Plant Tissue Culture Association) in order to be
tax free for publication in Plant Cell Culture &
Micropropagation. Submission of a manuscript implies that
it is neither under consideration for publication elsewhere
nor has appeared previously in part or in whole. On
acceptance for publication, authors assign to the Editors
full copyright of the manuscript in all languages and
countries. Publications will depend on editorial rules and
on the review of experts and ad hoc commission. Reviewer
and editorial opinions will be anonymously communicated
to authors.
Concepts and affirmations included in articles and
communications are of the entire responsibility of the
authors.
1. SUBMISSION
The manuscript must present a maximum of 14
pages. At the time of submission, a cover letter must be
sent with the manuscript copies to the Editor requesting
publication of the article. This cover letter must be signed
by all authors and also contain the full address,
telephone number and e-mail of the authors. Any
inclusion, exclusion or alteration in the authors order must
be notified and signed by all authors including the one
excluded.
Original: Four copies and CD with text and illustrations.
Only one of the 4 printed copies must contain the full
names of the authors and footnote in the first page.
Format: Word for Windows (version 98, 2000, XP ou 2003)
Spacing of the text: Double. Margin on the left hand side
and 2.0 cm margin on the right hand side, 2.5 cm upper and
lower margin, 2.5 cm for the heading and 2.,5 cm for the
footnote
Paper: A4 format
Source: Times New Roman, size 12
Number of pages: up to 14 pages, including the illustrations
Tables: Tables should be part of the body of the paper and
they must be presented in Word or Excel. The title should
be above and be presented in the language in which the
article was written and in English. The vertical lines
separating the columns should not appear.
Graphs/Figures/Photographs: must be presented in black
and white, clear and with contrast, scanned, inserted in
the text after citation and also in a separate file (on the
same diskette as the article) saved in extension tif or
jpg , with resolution of 300 dpi. The title should be below
and presented in the language in which the article was
written and in English.
Symbols and Chemical Formula: must be presented using
a word processor that permits a format Page Maker.
2. STRUCTURE AND ORGANIZATION
2.1. The article should be presented in the following
sequence:
TITLE
In English language, containing no more than 15 words in
capital letters and bold.
AUTHORS
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies. :
Footnote: titulation name of the institution to which the
authors belong address of institution ZIP CODE city,
state mail address.
ABSTRACT
should be informative and condensed and should
explain the objectives, material and methods, results and
conclusion of the work in a maximum of 250 words all written
in one paragraph.
For articles written in English the abstract should also be
presented in Portuguese.
Key words: minimum of three and maximum of five. They
should not repeat words that are already in the title. These
may include phrases as well as individual words and should
be separate by commas.
For articles written in English the key-words should also
be presented in Portuguese.
INTRODUCTION
Should present a concise vision of the current level of
knowledge that has been achieved within the subject area
that the paper will discuss. It should neither give an
extensive review nor should it include details about the
results and discussion. It should clearly indicate the
objectives of the research that was carried out.
MATERIALAND METHODS
This section can contain subdivisions, with subtitles in
bold print.
RESULTSAND DISCUSSION
This section can have subsection which begins with
concise, descriptive titles in bold print.
CONCLUSIONS
Finishing agree of objectives of work
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
2.2 The Communication should be presented in the
following sequence
TITLE
Sufficiently clear, conspicuous and complete, without
superfluous words. It is recommended to initiate with the
term that represent the most important aspect, with other
terms in decreasing of importance
TITLE IN PORTUGUESE;
FULL NAME(S) OF THEAUTHOR(S)
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies.
Footnote: titulation name of the institution to which the
authors belong address of institution ZIP CODE city,
state mail address.
ABSTRACT
Written continuously without paragraph. It must
not exceed 250 words. Index terms must be enclosed after
the abstract using terms different from those used in the
title and separated by comma.
Index terms: (3 to 5) must be described in capital and small
letters, and express the content of the article
ABSTRACT AND INDEX TERMS IN PORTUGUESE
Text: with no division but must include introduction,
material and methods, results and discussion and
conclusion (it may include tables and figures)
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
3. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS
OR FORMULACONTAINED INTHEARTICLE SHOULD
OBEY THE FOLLOWING RULES:
3.1. Photographs must be presented in black and white,
clear and with contrast, inserted in the text after their citation
and also in a separate file (on the same diskette as the
article) saved in extension TIFF or JPEG with
resolution of 300 dpi.
3.2. Figures must be presented in black and white, clear
and with contrast, inserted in the text after their citation and
also in a separate file (on the same diskette as the article)
saved in extension TIFF or JPEG with resolution of
300 dpi. They must be elaborated using Times New Roman
font, size 10, without bold, without text box and arranged.
3.3. Graphs must be inserted in the text after their citation,
elaborated preferentially in Excel, using Times New Roman
font, size 10, without bold.
3.4. Symbols and Chemical Formula must be presented
using a word processor that permits a format for Page Maker
(ex: MathType, Equation) without loss of its original form.
4. REFERENCES: references must be cited according to
NBR6023/2002 of ABNT. All references and their correct
citation in the text are of the entire responsibility of the
author(s).
5.THE BRAZILIANASSOCIATION OF PLANTTISSUE
CULTURE (ABCTP)WILL INFORMTHEAUTHORTHE
RECEIPT OF THE ORIGINAL MANUSCRIPT AND
EVENTUALLY ITWILLALSO SEND INFORMATION
REGARDING ITS PUBLICATION. MANUSCRIPTS
THAT REQUIRE MODIFICATIONS WILL BE
RETURNEDTOTHEAUTHOR FORTHE RESPECTIVE
REVISIONANDCORRECTIONS.
6. MANUSCRIPTS NOT APPROVED WON T BE
RETURNEDTOTHEAUTHOR.
7.ARTICLES WILL BE PUBLISHEDACCORDINGTO
THE ORDER OF RECEIPTANDAPPROVAL.
8. IFANY OFTHESE RULESARE NOTATTENDEDTHE
MANUSCRIPTWILLBE RETURNEDTOTHEAUTHOR.
9. THE NEGLECTFUL CASES WILL BE SOLVED BY
THE EDITORIAL COMMITTEE.
10. MANUSCRIPTS SHOULD BE SENT TO THE
FOLLOWINGADDRESS:
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
Depto. de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
37200-000 Lavras MG BRAZIL

Volume 4 Número 1 - abctp

Transcrição

Documentos relacionados

Influência de ambientes e concentrações de sacarose na

ministério da educação universidade federal de lavras

Internet e Inseminação artificial

-Folha de São Paulo - Folha e Equilíbrio 07 de Março de 2002

Crescimento in vitro de Alcantarea imperialis (Carrière)

102 Micropropagação: cultivo in vitro de calos de cenoura PDF

BAP E AIB NO CULTIVO in vitro DE Epidendrum ibaguense KUNTH

Analise da proporcao sexual de embrioes bovinos

BULA SOLUÇÃO HEMOLISANTE

Volume 9 - Número 1-2