TCC14 - Faculdade de Biomedicina

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
NATIELLE FERREIRA RABELO
ELETROFISIOLOGIA BÁSICA DA ATIVIDADE EPILEPTIFORME
INDUZIDA PELO CUNANIOL
BELÉM
2011
NATIELLE FERREIRA RABELO
ELETROFISIOLOGIA BÁSICA DA ATIVIDADE EPILEPTIFORME
INDUZIDA PELO CUNANIOL
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado à Faculdade de Biomedicina
da Universidade Federal do Pará, como
requisito parcial para a obtenção do grau
de Bacharel em Biomedicina
Orientador: Prof. Dr. Manoel da Silva
Filho
BELÉM
2011
NATIELLE FERREIRA RABELO
ELETROFISIOLOGIA BÁSICA DA ATIVIDADE EPILEPTIFORME
INDUZIDA PELO CUNANIOL
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso
apresentado à Faculdade de Biomedicina da
Universidade
Federal
do
Pará,
como
requisito parcial para a obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina, aprovado com o
conceito _____________________.
Belém – PA, 14 de dezembro de 2011
Banca examinadora:
_________________________
Prof. Dr. Manoel da Silva Filho
ICB – UFPA
Orientador
_________________________
Prof. Msc. Moysés Hamoy
ICB – UFPA
_________________________
Prof. Dr. Anderson Raiol Rodrigues
ICS – UFPA
_________________________
Profª Drª Silene Lima
ICB – UFPA
i
Dubium sapientiae initium
A dúvida é o início do conhecimento
René Descartes
ii
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer ao Professor Manoel da Silva Filho, pelos
ensinamentos, pela paciência e por nos ajudar a enxergar todos os dias os desafios
e a satisfação de fazer ciência. Por ser mais que nosso mestre, ser nosso amigo,
nosso exemplo de profissional.
Aos meus colegas do Laboratório de Biofísica Celular, em especial ao
Daniel Valle Vasconcelos Santos, pela ajuda na organização deste trabalho, pelas
críticas sempre construtivas e pelos momentos de alegria que são sempre
importantes.
Ao Laboratório de Neuroquímica, em especial aos professores Moysés
Hamoy e José Luiz Martins do Nascimento, por gentilmente ceder parte do
material que foi usado nos experimentos e pelas sugestões.
A todos que ajudaram por meio de sugestões e críticas a progressão deste
trabalho.
Ao programa PIBIC/CNPq e a PROEX/UFPA, pelo apoio financeiro que
recebi durante a graduação.
Às minhas amigas Ellen, Lays e Isadora, pela convivência, por tantas
alegrias e pelo apoio durante o curso. Nossos dias ficarão guardados para sempre!
Aos meus amigos Pedro e Silvana, pelo incentivo e paciência, incondicionais.
À minha querida avó Cleide, que com seu apoio surpreendente e seus
conselhos, me ajudou a ficar firme durante os obstáculos que enfrentei nos últimos
anos da graduação.
Agradeço a minha mãe Josicleide Ferreira Rabelo, que do seu modo me
incentivou, me apoiou e me ensinou muito.
Agradeço ao meu pai Antonio Evani Rabelo, pelo exemplo, pelos valores
que hoje me orgulho de seguir, por sempre me ajudar e por ficar ao meu lado
mesmo não concordando ou entendendo meus motivos e escolhas e à minha irmã
Michaelle, luz da minha alegria, minha cúmplice. A distância e a saudade nunca vão
ser maiores que o meu amor por vocês.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................iv
LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................v
RESUMO............................................................................................................vi
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................1
1.1. OBJETIVO GERAL...................................................................................2
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.....................................................................2
2. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................3
2.1. ANIMAIS...................................................................................................3
2.2. CIRURGIA PARA IMPLANTAÇÃO DOS ELETRODOS...........................3
2.3. DROGAS..................................................................................................4
2.4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL........................................................4
2.5. ANÁLISE DOS REGISTROS ELETROFISIOLÓGICOS OBTIDOS.........5
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................6
3.1 ELETROFISIOLOGIA....................................................................................6
3.2. SISTEMA DE PRÉ-AMPLIFICAÇÃO COM GANHO VARIÁVEL................11
4. CONCLUSÃO................................................................................................13
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................14
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cirurgia para a implantação de eletrodos subdurais ....................................4
Figura 2. Ilustração diagramática do sistema para a aquisição de dados...................5
Figura 3. Registro eletrofisiológico onde é possível observar a alteração de
amplitude dos potenciais de ação (B), (escala em microvolts), em função do tempo
(A), (escala em milisegundos) durante a atividade epileptiforme.................................6
Figura 4. Gráfico demonstrando a variação de amplitude dos disparos durante um
registro eletrofisiológico com duração de aproximadamente 1 hora. As setas indicam
a ocorrências das salvas de potenciais........................................................................7
Figura 5. A contagem do número de impulsos durante um registro eletrofisiológico
após
a
aplicação
do
cunaniol
com
duração
de
aproximadamente
1
hora..............................................................................................................................8
Figura 6. Gráfico demonstrando freqüência média em Hertz dos impulsos durante
seis ciclos diferentes de salvas observados em um registro eletrofisiológico após a
aplicação do cunaniol...................................................................................................9
Figura 7. Gráfico demonstrando a freqüência do ECG em dois momentos do registro
eletrofisiológico após a aplicação de cunaniol. (A) Freqüência em um intervalo sem a
presença de salvas. (B) Freqüência em um intervalo com a presença de
salvas.........................................................................................................................10
Figura 8. Desenho esquemático do sistema experimental de registro no hipocampo.
(1) Vista frontal. (2) Vista lateral. 2A – Amplificador de instrumentação (INA 333); 2B
– Conectores; 2C – Pino de referência; 2D – Parafuso de fixação; 2E – Passa fio; 2F
– Blindagem. 3) Circuito impresso do amplificador. 4) Circuito impresso de conexão
dos eletrodos..............................................................................................................11
v
LISTA DE ABREVIATURAS
µV - microvolts
ECG - Eletrocardiograma
EEG - Eletro encefalograma
ELT - Epilepsia do Lobo Temporal
g - grama
GABA – Ácido Gama Amino Butírico
Hz - hertz
Kg – kilograma
mg - miligrama
ml – mililitro
mm - milímetro
ms - milissegundo
PTZ - Pentilenotetrazol
s- segundo
SNC – Sistema Nervoso Central
1
1. INTRODUÇÃO
A epilepsia é uma das principais desordens neurológicas, com ampla
distribuição, chegando a afetar cerca 1-2 % da população mundial, estimando-se
que mais de 50 milhões de pessoas no mundo apresentem algum tipo desse
transtorno (Browne & Holmes, 2001).
As epilepsias caracterizam-se por alterações crônicas, recorrentes e
paroxísticas na função das áreas corticais e subcorticais envolvidas (Costa et al.,
1992). O evento mais dramático de alguns quadros de epilepsia é a crise epiléptica,
estando associada à atividade hipersincrônica e repetitiva de um grupamento
neuronal do córtex cerebral e estruturas hipocampais, cuja distribuição anatômica e
duração de sua atividade determinam a natureza da crise (Avanzini & Franceschetti,
2003).
O estudo das bases eletrofisiológicas e moleculares dos processos
associados à gênese da atividade bioelétrica anormal no tecido humano epiléptico é
um dos grandes avanços científicos na epileptologia moderna (Sanabria et al.,
2000).
Em geral, crises epilépticas podem ser geradas por um desequilíbrio entre a
excitação e a inibição neuronal, onde glutamato e GABA assumem um papel
importante. Neste contexto, há a hipótese de que pode haver um aumento na
ativação da via que utiliza o glutamato e/ou uma diminuição na via que utiliza o
GABA como neurotransmissor (Morimoto et al., 2004). Posteriormente, foi verificado
que os padrões de descargas elétricas aconteciam em “surtos” ou “salvas” (bursts) e
que esse fenômeno estava presente no neocórtex epileptogênico humano (Wyler et
al., 1982).
A pesquisa das epilepsias, por motivos éticos, depende da utilização de
modelos animais (Carvalho, 2007). Para melhor entender os mecanismos envolvidos
no início de uma crise epileptiforme, na epileptogênese e nas crises recorrentes
espontâneas; e, ainda, para investigar novas opções de tratamentos, diversos
modelos experimentais que mimetizam diferentes aspectos dos processos
epilépticos têm sido desenvolvidos (França et al., 2010).
Cada modelo apresenta características próprias quanto à expressão motora,
eletroencefalografia e resposta a diferentes agentes antiepilépticos. (Carvalho,
2007). Muitos desses modelos já são bem caracterizados e estudados, como o
2
modelo do eletrochoque máximo (Merrit & Putnam, 1938), o modelo do
pentilenotetrazol – PTZ (Prupura & Monteagudo, 1960), o modelo induzido pela
picrotoxina (Turski et al., 1985), o modelo induzido pela pilocarpina (Turski et al,
1983), pelo ácido caínico (Cavalheiro et al., 1982; Fisher & Alger, 1984) e o uso de
modelos genéticos de epilepsias, como nas crises audiogênicas em camundongos
(Loscher & Schmidt, 1988).
O acetato de cunaniol e o cunaniol são substâncias extraídas das folhas de
Clibadium sylvestre, que possuem atividade no sistema nervoso central (SNC)
promovendo excitabilidade em vários graus (Hamoy, 2011), sendo capaz de
desencadear status epilepticus em ratos albinos wistar, quando administrado por via
intraperitoneal (Hamoy, 2002).
Nesse sentido, a utilização do modelo de epilepsia generalizada induzida
pelo cunaniol, também conhecida popularmente como cunambi, e a avaliação da
atividade eletrofisiológica traz uma nova ferramenta para a possível elucidação dos
seus mecanismos de ação e futuras comparações com os modelos experimentais
existentes.
1.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade epileptiforme produzida pela administração de cunaniol
através do registro eletrofisiológico cortical.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Registrar a atividade eletrofisiológica cortical subseqüente à indução química;
• Verificar possíveis alterações da frequência da atividade elétrica.
• Propor um novo sistema para o registro in vivo de atividades epileptiformes.
3
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 ANIMAIS
Foram utilizados 10 ratos da raça Wistar, machos e fêmeas, pesando entre
200 a 290 g, provenientes do Biotério da Universidade Federal do Pará, com acesso
à água e alimentação ad libitum. Durante a realização dos experimentos, cada
animal, foi inicialmente controle de si mesmo. Os experimentos realizados neste
trabalho fazem parte de um projeto submetido e aprovado pelo comitê de ética sob o
parecer: BIO024-10.
2.2. CIRURGIA PARA IMPLANTAÇÃO DOS ELETRODOS
Os animais foram submetidos à cirurgia para a implantação de eletrodos
subdurais (Figura 1). Para isso, os mesmos foram profundamente anestesiados com
uma solução de 10% de cloridrato de cetamina na dose de 50 mg/Kg (5 mg/100 g de
peso vivo) e 2% de cloridrato de xilazina na dose de 5 mg/Kg via intraperitoneal.
Em seguida, os animais foram presos em um segurador de cabeça (Model
900, David Kopf Instruments, Elmo Street Tujunga, California 91042, USA) para o
ato cirúrgico de exposição do crânio. Os eletrodos construídos em aço inoxidável
foram implantados através de furos feitos com auxílio de uma broca odontológica
(141RF-HP025, Meisinger, South Tucson Way, Suite 130 Centennial, Colorado
80112, USA) presa a uma furadeira (Model 1474 High Speed Stereotaxic Drill, David
Kopf Instrumnts, Elmo Street Tujunga, California 91042, USA). A posição dos
eletrodos: Bregma 0,96 mm, latero-lateral ± 2 mm, correspondentes ao córtex motor
do rato, foi dada com o auxílio de um atlas neuroanatômico (Paxinos & Watson,
1998) e alcançada com o auxílio dos eixos de coordenadas do aparelho
estereotáxico.
Os eletrodos foram fixados com resina acrílica composta de líquido acrílico
(monômero de metil metacrilato, um produto composto de acetona, ácido cianídrico
e álcool metílico) e pó de acrílico (polímero de metilacrilato). Os dois devem ser
misturados em proporções apropriadas para se obter a viscosidade desejada para
implante. Estes foram soldados em um conector, que também foi fixado pelo mesmo
4
processo. Também foram inseridos micro parafusos no crânio para evitar que a
resina soltasse. Após, foi feita assepsia e aplicação de antiinflamatório flunixin
meglumine (Banamine®) e antibiótico enrofloxacina (Flotril® 2,5%) no local da
incisão.
A
B
C
Figura 1 Cirurgia para implantação de eletrodos subdurais. (A) Incisão para exposição
do crânio. (B) Limpeza e retirada da gordura. (C) Fixação dos parafusos no crânio
(seta branca). Adaptado de Cota, 2007.
2.3. DROGAS
Para indução das convulsões foi utilizado o extrato hexânico das folhas de
Clibadium sylvestre nas concentrações de 10 mg/ml de acetato de cunaniol e
cunaniol isolado na concentração de 5 mg/ml. O extrato foi, então, dissolvido em
0,1% de Tween 20 (Sigma-Aldrich Brasil Ltda. São Paulo, SP, Brasil) e solução
salina a 0,9%. Os compostos foram cedidos pelo Laboratório de Neuroquímica da
UFPA.
2.4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Após 72 horas da cirurgia, os animais foram anestesiados com éter dietílico
(Sigma-Aldrich Brasil Ltda. São Paulo, SP, Brasil) e submetidos ao processo de
traqueostomia, sendo o tubo traqueal previamente lubrificado com o anestésico
Cloridrato de Lidocaína (Xylocaína®), em seguida foi aplicado o miorrelaxante
Galamina (Flaxedil®), para que o animal permanecesse imóvel. Foi mantida a
ventilação mecânica durante o experimento. Após esse procedimento foram
5
aplicadas doses intraperitoneais do extrato (2,92 mg/Kg). Segundo Hamoy (2002),
esta foi a dose-resposta efetiva mediana para o cunaniol, em ratos.
Para a aquisição dos registros foi utilizado um amplificador diferencial com
alta impedância de entrada (ISO-80, WPI, World Precision Instruments Germany,
Berlin, Germany), conectado a um condicionador de sinais (CyberAmp 320, Axon
Instruments, Molecular Devices, Av. Marquês de São Vicente, 121 Barra Funda São
Paulo, SP,
Brazil), e um digitalizador (Digidata 1200, Axon Instruments). Foi
utilizado um software especializado para a digitalização e armazenamento dos
dados em disco rígido (Clampex 8, Axon Instruments).
Conversor A/D
B
A
C
Figura 2. Procedimento para a aquisição dos dados. A) Rato posicionado
no estereotáxico com o implante (notar que à fotografia foi adicionado o
desenho do implante); B) Sistema de registro e conversão; C) Sistema de
armazenagem e análise dos dados.
2.5. ANÁLISE DOS REGISTROS ELETROFISIOLÓGICOS OBTIDOS
Os dados foram posteriormente analisados utilizando o software pClamp 10,
através do aplicativo Clampfit 10 (Molecular Devices, USA) que possibilitou a
caracterização do domínio da freqüência das ondas cerebrais e a inspeção visual
dos padrões ondulatórios.
6
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. ELETROFISIOLOGIA
Figura 3. Alteração de amplitude dos potenciais de ação (B), em função do
tempo (A), demonstrando a atividade epileptiforme durante uma crise. O
destaque (retângulo vermeho) mostra uma descarga de disparos em salvas de
potenciais. A seta em vermelho indica o início das alterações.
A aplicação de cunaniol na dose de 2,92 mg/Kg via intraperitoneal é capaz de
causar alterações nos traçados registrados no córtex motor de ratos, com aumento
da amplitude e freqüência no registro, com curto período de latência para o
aparecimentos das alterações (Hamoy, 2011). Nos experimentos a aplicação
ocorreu 10 minutos antes do início do registro (Figura 3).
Os registros nos animais variaram de 1 a 4 horas e em todos foi possível
observar as alterações no eletroencefalograma - EEG. Visualmente as alterações
obedeciam a padrões cíclicos com descargas em salvas.
7
Na variação de amplitude dos registros obtidos, observou-se a presença de
um padrão temporal entre os intervalos. Entre períodos de aproximadamente 7
minutos havia atividade neuronal com pequenas alterações de freqüência e
amplitude, seguidos por grandes alterações (presença de salvas) desses dois
parâmetros (Figura 4). Esses intervalos de aumento abrupto na atividade
epileptiforme podem ser considerados como cíclicos.
Figura 4. A variação de amplitude dos disparos durante um registro
eletrofisiológico com duração de aproximadamente 1 hora. As setas
indicam a ocorrências dos bursts, que ocorreram com intervalos de
aproximadamente 7 minutos entre eles.
8
Figura 5. A contagem do número de impulsos durante um registro eletrofisiológico
após a aplicação do cunaniol com duração de aproximadamente 1 hora. Notar a
elevação do número de contagens após o primeiro ciclo, justificado pelo aumento
na frequência.
9
Figura 6. A freqüência média em Hertz dos impulsos durante seis ciclos
diferentes de bursts observados em um registro eletrofisiológico após a
aplicação do cunaniol. Notar que após o primeiro ciclo há um aumento
significativo da frequência dos bursts.
No modelo convulsivante induzido pelo cunaniol podem ser observados cinco
padrões seqüenciais de ondas no traçado do EEG. Os padrões variam de: I pequenas alterações, ainda próximas ao traçado basal, porém, com aumento de
amplitude; II - registros de alta freqüência, indicando elevada excitabilidade; III registros de baixa freqüência e amplitude elevada; IV – aumento da freqüência e
manutenção da amplitude; V – diminuição da freqüência e aumento gradativo da
amplitude. Os padrões confirmam que os registros de alta freqüência estão
intercalados com os de baixa freqüência. Os tempos de latência variam, sendo os
padrões I e II os que mais se repetem (Hamoy et al., 2009).
10
Figura 7. A freqüência do ECG em dois momentos do registro eletrofisiológico
após a aplicação de cunaniol. (A) Freqüência em um intervalo sem a presença
de bursts. (B) Freqüência em um intervalo com a presença de bursts. As barras
de erro representam desvio padrão.
Durante os experimentos, houve uma alteração visualmente perceptível nos
registros do eletrocardiograma – ECG que estava sendo simultaneamente obtidos
com o EEG. Observou-se a presença de bradicardia ao mesmo tempo em que
ocorriam as salvas. Essa alteração também obedeceu a um padrão cíclico, nos
intervalos entre as salvas de disparo, a freqüência cardíaca retornava ao valor basal.
Foi feita, então, uma comparação da freqüência do ECG em dois momentos:
durante a bradicardia (simultâneo a uma salva) e durante os intervalos sem
alteração. A análise das freqüências não mostrou diferenças significativas (p > 0,05),
apesar da clara identificação visual das alterações no registro.
Na literatura existem estudos relatando bradicardia como manifestação
epiléptica (Constantin et al,1990; Healy et al, 1995). Porém, a freqüência de arritmia
cardíaca como manifestação epiléptica não é bem determinada (Jorge et al, 2000).
11
3.2. SISTEMA PARA O REGISTRO IN VIVO DE ATIVIDADES EPILEPTIFORMES
Neste trabalho de conclusão de curso foi desenvolvido um sistema para
registrar a atividade elétrica durante as crises epileptiformes induzidas por
substâncias isoladas das folhas da planta Clibadium sylvestre no hipocampo de
ratos in vivo (Figura 8). O sistema prevê o implante de um amplificador de
instrumentação de alta impedância de entrada e baixo ruído elétrico na emergência
dos eletrodos. Além disso, novos eletrodos foram dimensionados para ter acesso
diretamente ao hipocampo com o mínimo de danos.
1
2
E
A
D
F
B
C
3
4
A
Figura 8. Desenho esquemático do sistema de registro. (1) Vista frontal. (2) Vista
lateral. 2A – Amplificador de instrumentação (INA 333); 2B – Conectores; 2C – Pino
de referência; 2D – Parafuso de fixação; 2E – Passa fio; 2F – Blindagem. 3) Circuito
impresso do amplificador. 4) Circuito impresso de conexão dos eletrodos.
12
A análise das propriedades in vivo do tecido epiléptico apresenta vantagens e
limitações. Em primeiro lugar, o registro da atividade eletrofisiológica do tecido
epiléptico conectado na complexa circuitaria do cérebro como um todo, permite-nos
ter indícios para definir se determinada área é realmente a zona epileptogênica ou
coincidentemente ictogênica. Da mesma maneira, nos auxilia na caracterização dos
padrões interictais ou ictais de determinados tipos de patologias ou de lesões
epileptogênicas (Sanabria et al, 2000 ).
Ao longo da história, os modelos experimentais permitiram um grande avanço
no conhecimento dos mecanismos básicos das epilepsias e muitas drogas
antiepilépticas foram desenvolvidas a partir de tais modelos (Silva & Cavalheiro,
2003).
Para que um modelo experimental seja classificado como um modelo de
epilepsia ele deve preencher os seguintes requisitos: demonstrar a presença de
atividade
epileptiforme
nos
registros
eletroencefalográficos
e
clinicamente
apresentar uma atividade semelhante àquelas observadas durante uma crise
epiléptica (Mello et al, 1986).
Estudos têm mostrado que a formação hipocampal participa ativamente na
gênese das descargas interictais e ictais atuando como foco epileptogênico na
epilepsia do lobo temporal - ELT (Kilpatrick et al, 1997). Esse tipo de epilepsia é o
mais freqüente, ocorrendo em aproximadamente 40-50% de todos os pacientes com
epilepsia (Costa et al, 1998), por isso o interesse e a necessidade de se aplicar e
estudar o comportamento dos modelos experimentais nessa região cerebral.
Na literatura é possível encontrar uma variedade de sistemas para o registro
eletrofisiológico no hipocampo, similares ao que foi mostrado nesse trabalho. Esses
sistemas permitem o estudo das propriedades eletrofisiológicas in vivo em regiões
mais profundas do cérebro. A contribuição do novo modelo proposto será a
minimização dos danos ao tecido e um aumento na resistência do sistema, visto que
em condições de crises epilépticas em que o animal não está anestesiado, o
implante pode ser danificado. A utilização desse sistema em trabalhos futuros
poderá permitir a correlação temporal das alterações comportamentais com as
eletrofisiológicas utilizando o cunaniol como modelo convulsivante.
13
4. CONCLUSÃO
•
O cunaniol é capaz de produzir atividades elétricas que se assemelham as
epileptiformes encontradas em outras substâncias que produzem convulsões;
•
Aparentemente as atividades apresentam certo grau de regularidades, porém
mais experimentos devem ser realizados para confirmar os achados
preliminares;
•
Observou-se concomitantemente às atividades epileptiformes, mudanças na
freqüência do ECG, indicando que o cunaniol também pode agir no sistema
de controle da atividade cardíaca.
14
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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