Dessulfurização Bacteriana de Combustíveis Fósseis

Biotecnologia Ambiental
Dessulfurização Bacteriana de Combustíveis Fósseis
milhões de barris de petróleo por dia,
com uma percentagem de enxofre
superior a 1,1.
Luís Alves, Elsa Mesquita, Francisco M. Gírio
INETI, Departamento de Biotecnologia,
Unidade de Microbiologia Industrial e Bioprocessos (UMIB),
Estrada do Paço do Lumiar, 22, 1649-038 LISBOA,
Tel. 01-7165141; Fax. 01-7163636;
E-mail: [email protected]
1. Introdução
O petróleo e o carvão são
importantes combustíveis fósseis com
uma composição complexa em que se
podem considerar quatro famílias de
compostos: hidrocarbonetos alifáticos,
cíclicos, aromáticos e moléculas
contendo átomos de azoto, enxofre ou
oxigénio na sua estrutura (Tabela 1).
Os compostos orgânicos contendo
enxofre (S) constituem uma pequena
mas importante fracção desses
combustíveis e devido à sua difícil
biodegrabilidade são considerados
compostos recalcitrantes. O petróleo
bruto convencional contem entre 0,04
a 5% (p/p) e em termos gerais,
petróleos de densidade mais elevadas
possuem teores de S superiores
(Kropp et al, 1997). A presença deste
elemento é indesejável não só por
contribuir para a corrosão do
equipamento da refinaria mas também
porque, aquando da combustão desses
produtos, se libertar dióxido de
enxofre (SO2 ) (Denome et al, 1993),
um
dos
principais
poluentes
atmosféricos e responsável pelas
chuvas ácidas. Além disso, quando
presente em concentrações superiores
a 100 ppm, o SO2 é nocivo ao homem,
provocando irritações nas mucosas
(Schmidt et al, 1973). Exposições
breves a concentrações na ordem dos
400-500 ppm são letais, já que
provoca a dilatação das membranas
mucosas e espasmos dos músculos dos
brônquios. A combinação de poeiras
com o SO2 agrava os efeitos nocivos
sobre o homem, e na presença de
nevoeiro essa conjugação torna-se
mais perniciosa. Também o Reino
vegetal é bastante sensível ao SO2 .
No entanto prevê-se que em 2010 a
produção ultrapasse os 83 milhões
aumentando também o enxofre
contido no petróleo para 1,27 %.
Plantas expostas a concentrações de
apenas 1-2 ppm sofrem graves danos
em poucas horas (Schmidt et al,
1973).
Tendo em conta a utilização
crescente destes combustíveis fósseis,
devida
em
larga
medida
às
necessidades
dos
países
industrializados, a emissão de enxofre
para a atmosfera constitui, assim, um
dos
problemas
ambientais
da
actualidade. Este problema poderá
agravar-se ainda, se não forem
tomadas as devidas precauções, tendo
em conta a diminuição das reservas
em combustíveis fósseis com baixo
teor de enxofre (Konishi, 1997).
Segundo Monticello (1998), em 1990
eram produzidos a nível mundial 70
Os efeitos nefastos causados pelo
SO2 presente na atmosfera levou
vários países e a União Europeia a
restringir as suas emissões de SO2
(Tabela 2). Uma das estratégias para
diminuir os níveis de emissão de SO2
para a atmosfera, consiste na remoção
do enxofre do carvão, do petróleo e
seus derivados antes da sua
combustão.
Actualmente
são
utilizados nas refinarias processos
físicos
e
químicos
(hidrodessulfurização) para a remoção
do S inorgânico. Esses tratamentos
tem
custos
muitos
elevados,
envolvendo catalisadores químicos
sob condições extremas: elevadas
temperaturas (200 a 425 ºC) e altas
pressões (150 a 250 psi) (Izumi et al,
1994). Além disso, o S associado a
Tabela 1 – Compostos representativos de hidrocarbonetos
presentes nos combustíveis fósseis
ALIFÁTICOS
n-Hexadecano
CH3 - (CH2) 14 - CH3
2-metiltetradecano
CH3 - (CH2) 11 - CH- (CH3) 2
CH3
CICLICOS
1 – metilciclopentano
Ciclohexano
AROMATICOS
CH3
Tolueno
Fenantreno
“NSO” *
Piridina
N
Dibenzotiofeno
S
* Hidrocarbonetos que têm na sua estrutura azoto, enxofre ou oxigénio.
Abril 1999 - Boletim de Biotecnologia nº 62
3
Biotecnologia Ambiental
compostos orgânicos é bastante difícil
de ser removido, por esses processos,
já
que
se
encontra
ligado
covalentemente a matrizes complexas
(Denome et al, 1994).
A alternativa a este tratamento
químico passa pelo recurso a
processos biológicos mais eficazes
para
a
dessulfurização
dos
combustíveis
fósseis
(biodessulfurização), nomeadamente ao nível
da remoção do enxofre ligado
covalentemente a matrizes orgânicas.
2. Biodessulfurização:
bactérias que removem o
enxofre dos combustíveis
fósseis
Os estudos de biodessulfurização
tiveram ínicio nas décadas de 50 e 60,
no
entanto
sem
resultados
significativos. Só na última década é
que esta área sofreu desenvolvimentos
significativos. Foram seleccionadas
bactérias com a capacidade de utilizar
Tabela 2 – Regulações internacionais para emissões de enxofre
actuais e previstas. (Monticello, 1998)
País
Produto
União Europeia
União Europeia
Coreia do Sul
Tailândia
Estados Unidos
União Europeia
União Europeia
Petróleo
Petróleo bruto
Gasóleo
Gasóleo
Gasolina
Gasóleo
Gasóleo
o enxofre presente em hidrocarbonetos
poliaromáticos
pertencentes
a
diferentes géneros. Brevibacterium sp.
(Van Afferden et al, 1990),
Corynebacterium sp. (Omori et al,
1992), Rhodococcus sp. (Izumi et al,
1994), Sulfolobus sp. (Kargi, 1987),
Pseudomonas sp. (De Fatima, et al,
1996), Agrobacterium sp. (Constanti,
1994), Arthrobacter sp. (Lee et al,
1995), Acinetobacter sp. (Malik,
1978), Rhizobium sp. (Malik, 1978),
Desulfovibrio sp. (Kim et al, 1990),
Gordona sp. (Rhee et al, 1998),
Beijerinckia sp. (Laborde & Gibson,
1977), Xanthomonas sp. (Constanti,
A
B
Figura 1 – Vias degradativas do dibenzotiofeno. A – Via de Kodama; o átomo de enxofre não é
removido, havendo ruptura de ligações C-C. B – Via de Van Afferden; o enxofre é removido na
forma de ião sulfito ocorrendo ruptura da estrutura carbonada.
4
Concentração
actual (ppm)
3500
33000
2000
5000
400
500
350
Boletim de Biotecnologia nº 62 - Abril 1999
Concentração
alvo (ppm)
1000
10000
500
500
50-100
200
< 100
Ano
1999
1999
2000
2000
2000
2000
2005
1994) e Bacillus sp. (Alves et al, em
preparação).
Na
maioria
dos
trabalhos
publicados sobre biodessulfurização, o
dibenzotiofeno (DBT) e outros
compostos análogos com substituintes
alquilo são utilizados quer como fonte
de carbono e energia principal ou
secundária (co-substrato), por serem
considerados representativos dos
compostos
organosulfurados
recalcitrantes
presentes
nos
combustíveis fósseis (Monticello,
1985). O DBT é, no entanto,
geralmente designado como composto
modelo. No entanto há que salientar a
existência de numerosos estudos
efectuados com outros compostos
orgânicos contendo enxofre (Kayser et
al,1993; Eaton & Nitterauer, 1994;
Kropp et al,1994; Constanti et al,
1996), misturas de DBT com alcanos
(Ohshiro et al,1995; Setti et al,1993) e
até mesmo com amostras de carvão
(Dahlberg et al, 1993) ou petróleo
(Van Afferden et al,1993).
O petróleo e o carvão são
substratos complexos e o facto de um
microrganismo
ser
capaz
de
metabolizar o DBT em condições
laboratoriais
não
implica
necessariamente que consiga remover
o enxofre orgânico presente nesses
combustíveis fósseis. Há que ter em
conta, por um lado, o problema da
acessibilidade dos microrganismos aos
compostos que contêm enxofre, e por
outro, mesmo que essa acessibilidade
exista, à existência de impedimentos
estéricos associados à estrutura desses
mesmos compostos, que dificultam a
actuação dos sistemas enzimáticos
microbianos. Alternativamente ao uso
de células intactas, a utilização de
Biotecnologia Ambiental
enzimas livres ou imobilizadas tem
sido objecto de patentes para aplicação
em processos de biodessulfurização
(Kilbane et al, 1994, Kern et al, 1989).
DIBENZOTIOFENO
NADH + O2 + H
3. Vias Metabólicas
Degradativas do DBT
Em 1973 Kodama e seus
colaboradores,
estudando
duas
espécies de Pseudomonas spp.
constataram que o DBT era
parcialmente degradado através de
sucessivas
oxidações
por
um
mecanismo
semelhante
ao
da
degradação do naftaleno (Denome et
al, 1993) (Fig. 1-A). A dihidroxilação
de um dos anéis aromáticos do DBT
conduz à destruição desse anel,
obtendo-se como produto final o 3hidroxi-2-formilo-benzotiofeno
no
qual persiste o núcleo tiofénico. Esta é
a via utilizada pela maioria das
bactérias estudadas que atacam o DBT
(Kilbane & Jackowsky, 1992). Na via
de Kodama, o ataque ao anel
benzénico ocorre nas posições 2 e 3 do
DBT (Gallagher et al, 1993). Como
geralmente os compostos análogos ao
DBT presentes nos combustíveis
fósseis, têm substituintes alquilo ou
arilo nessas posições, esses compostos
não poderão ser degradados por esta
via. Por outro lado, o produto final da
degradação parcial do DBT ainda
contém o átomo de enxofre,
apresentando níveis de toxicidade
biológica semelhantes ao substrato
inicial (Gallagher et al, 1993).
Em 1990 Van Afferden propõe
uma via metabólica diferente em
Brevibacterium sp., na qual o DBT é
convertido,
em
quantidades
estequiométricas, a benzoato e sulfito
que por sua vez é oxidado a sulfato,
por oxidação abiótica (Fig. 1-B) (Van
Afferden et al, 1990). O benzoato é,
por sua vez, totalmente mineralizado a
CO2 e H2 O. Deste modo, o DBT é
usado como nutriente pela bactéria no
papel duplo de fonte de carbono e
enxofre. Esta via de degradação do
DBT não tem grande interesse em
termos
de
processos
de
biodessulfurização de combustíveis
+
DBT monooxigenase
+
H2O + NAD
5-ÓXIDO DE DIBENZOTIOFENO
+
NADH + O 2 + H
DBT monooxigenase
+
H2O + NAD
5,5-DIÓXIDO DE DIBENZOTIOFENO
1
NADH + /2 O2
DBT-5,5-dioxido monooxigenase
+
NAD
2’-HIDROXIBIFENILO-2-SULFINATO
H2O
-
2’-hidroxibifenilo-2-sulfinate sulfinoliase
HSO3
2-HIDROXIBIFENILO
2-
SO4
VIA ASSIMILATÓRIA DO ENXOFRE
Figura 2 – Via “4S”; o enxofre é removido na forma de sulfito, permanecendo intacta a estrutura
carbonada.
fósseis, já que a mineralização
completa da estrutura carbonada
implicará
necessariamente
uma
diminuição na energia química
potencial dos combustíveis. Porém, as
bactérias utilizadoras desta via
metabólica são potencialmente úteis
na
formulação
de
inóculos
microbianos mistos para processos de
bioremediação de hidrocarbonetos
poliaromáticos
contendo
enxofre
libertados no ambiente.
Uma terceira via metabólica
descrita é a via sulfóxido-sulfonasulfonato-sulfato,
normalmente
denominada “4S”. Trata-se de uma via
específica para a remoção do átomo de
enxofre presente no DBT em que o
grupo tiofénico sofre um ataque
oxidativo progressivo. Actualmente
sabe-se, a partir de estudos em
Rhodococcus sp. IGTS8, que esta via
envolve um sistema multienzimático
com três actividades diferentes (Fig. 2)
(Gray et al, 1996). A primeira enzima
é uma monoxigenase do DBT, que
oxida o DBT a 5,5’-dióxido de DBT
em dois passos; a segunda enzima é
igualmente uma monoxigenase que
converte o 5,5’-dióxido de DBT a 2’hidroxibifenilo-2-sulfinato
e
finalmente uma liase que catalisa a
quebra da ligação C-S transformando
o 2’-hidroxibifenilo-2-sulfinato em
dois produtos finais, 2-hidroxibifenilo
(HBP) e sulfato.
As duas primeiras enzimas da via
requerem oxigénio molecular, NADH
Abril 1999 - Boletim de Biotecnologia nº 62
5
Biotecnologia Ambiental
e FMN como cofactores. Uma terceira
enzima foi recentemente descrita em
Rhodococcus sp., uma reductase de
FMN endógena responsável pelo
fornecimento da flavina reduzida às
monooxigenases (Gray et al, 1996).
Este novo sistema multienzimático
pressupõe
a
existência
de
monoxigenases que utilizem flavina
livre como substrato e a consequente
existência de um complexo enzimático
entre as oxigenases e a reductase de
flavina. Os microrganismos que
utilizam esta via para metabolizar o
DBT conseguem assim que o átomo
potencialmente tóxico seja retirado do
composto tiofénico, sob a forma de
um composto tratável (sulfato) apenas
com uma ligeira perda do seu valor
energético (Wang & Krawiec, 1994).
Deste modo, as estirpes utilizadoras da
via “4S” poderão constituir uma
“ferramenta” biológica fundamental
no tratamento em larga escala dos
combustíveis
fósseis,
caso
se
consigam obter biocatalisadores de
elevada estabilidade em ambiente
industrial (Wang & Krawiec, 1994).
4. Estudos de Biologia
Molecular
Estudos
recentes
de
biologia
molecular com uma das melhores
estirpes dessulfurizadoras conhecidas,
Rhodococcus sp. IGTS8 permitiram
conhecer a sequenciação de um
fragmento de 4 kb de ADN que
continha os genes da via “4S” da
dessulfurização (Denome et al, 1994).
Este fragmento contem 3 genes,
denominados soxA, soxB e soxC (sox
de “sulfur oxidation”).
Estes 3 genes foram subclonados
independentemente em Escherichia
coli MZ1 e identificaram-se as
respectivas
proteínas
expressas.
Verificou-se que soxC origina uma
proteína de aproximadamente 45 kDa
responsável pela oxidação do DBT a
5,5´-dióxido de DBT. O produto de
soxA é uma proteína com uma massa
molecular de 50 kDa sendo
responsável pela oxidação do 5,5dioxido de DBT a 2-hidroxibifenilo-2sulfinato. A proteína expressa por
soxB tem 40 kDa e cataliza a formação
do 2-hidroxibifenilo, produto final da
via “4S”. Estudos realizados com
Pseudomonas sp. C18 indicaram a
existência de um único controlo ao
nível
genético
para
as
vias
degradativas
do
dibenzotiofeno,
naftaleno e fenantreno (Denome et al,
1993). No entanto este tipo de estudos
tem recaído apenas nestes dois géneros
bacterianos, havendo necessidade de
alargar no futuro o conhecimento dos
mecanismos regulatórios a nível
genético
para
outros
géneros
bacterianos.
5. Aplicação Biotecnológica
A aplicação da biodessulfurização
em larga escala ainda se encontra
apenas ao nível do estudo em
instalações piloto. Um desses estudos
está a ser feito pela companhia
americana
“Energy
BioSystems
Corporation”, que desenvolveu uma
instalação piloto onde se podem
dessulfurizar até 5 barris de petróleo
por dia (Fig. 3). O biocatalizador
(células bacterianas) e o combustível
fóssil são misturados num biorreactor
de
150
L
onde
ocorre
a
dessulfurização biológica. Após a
remoção do enxofre, a mistura
reaccional é enviada para uma
centrífuga para separação das fases
orgânica e aquosa. O produto
petrolífero já dessulfurizado é enviado
para um precipitador electrostático
para remoção da água residual,
passando por uma série de três filtros
para recolha do biocatalisador
existente na mistura reaccional.
Finalmente, à solução aquosa é
Condensador
Ar
Biocatalisador
Produto dessulfurizado
Água
Unidade de
separação
Controlo de pH
Adição de reagentes
Combustível com alto
teor de enxofre
Bioreactor
Fase aquosa
Unidade de separação
Biocatalisador e água
reciclados
Agente neutralizante
Sulfato
Figura 3 – Esquema de um possível processo de biodessulfurização. Adaptado de Monticello, 1998.
6
Boletim de Biotecnologia nº 62 - Abril 1999
Biotecnologia Ambiental
encontram-se presentemente em curso
no INETI. No futuro, iniciar-se-ão
estudos de biologia molecular que
serão mais facilitados no caso em
análise devido aos conhecimentos de
transformação genética disponíveis no
género Bacillus sp. e que não se
comparam ao conhecimento existente
nos restantes géneros conhecidos e
descritos como dessulfurizadores de
DBT.
A partir de amostras de solos
contaminados com hidrocarbonetos,
recolhidas nos terrenos da ex-refinaria
de Lisboa, local da Expo-98, foi
isolada e seleccionada na Unidade de
Microbiologia
Industrial
e
Bioprocessos (UMIB) do INETI-DB
uma bactéria capaz de utilizar o DBT
como única fonte de enxofre. Ensaios
de taxonomia realizados com o
sistema BIOLOG e galerias API
permitiram a identificação da estirpe
1B como pertencendo ao genéro
Bacillus sp. No entanto, os resultados
não foram conclusivos quanto à
espécie, apresentando apenas 36,6 %
de homologia com o Bacillus brevis.
Na Fig. 4 está representado o perfil
degradativo do DBT desta estirpe
quando cultivada em glucose (1 %) e
DBT (0,5 mM). Como produto da
dessulfurização
do
DBT
foi
identificado o 2-hidroxibifenilo, que é
o composto final da via metabólica
“4S” o que torna este Bacillus sp. 1B
interessante
em
termos
de
biodessulfurização uma vez que o
enxofre é removido sem haver
diminuição do valor calórico do DBT.
A utilização do DBT ocorre logo após
a inoculação, verificando-se a
acumulação
do
produto
da
dessulfurização (HBP) após um dia de
tempo de cultivo. Todo o DBT
disponível foi consumido após 9 dias
de cultivo, formando-se no final do
crescimento
uma
quantidade
aproximadamente estequiométrica de
2-hidroxibifenilo
(1:1).
Estudos
fisiológicos de optimização das
condições de cultivo para melhorar a
sua
capacidade
dessulfurizante
ln DO430 nm ; pH
6. A contribuição do
Bacillus sp. 1B
do seu valor calórico como é o caso do
Bacillus sp. isolado no INETI, e que o
façam com taxas de dessulfurização o
mais elevadas possíveis. Esses
biocatalizadores, células inteiras ou
enzimas isolados terão que possuir
elevada estabilidade em ambiente
industrial.
A
possibilidade
de
clonagem da via catabólica “4S” em
hospedeiros geralmente já utilizados
em bioprocessos industriais encontra-
8
300
6
250
200
4
150
2
100
0
50
-2
0
0
5
10
DBT ( µ M); HBP (µ M)
adicionado NaOH (ou amónia) para a
sua neutralização, resultando sulfato
de sódio (ou sulfato de amónio). O
sulfato de sódio é facilmente
eliminado numa estação de tratamento
de águas residuais, enquanto o sulfato
de amónio poderá ser utilizado
directamente
como
fertilizante
agrícola.
15
Tempo (dias)
lnDO430nm
pH
[DBT]
[HBP]
Figura 4 - Dessulfurização do DBT pelo Bacillus sp. 1B. A estirpe foi cultivada com 0.2 mM de DBT
como fonte de enxofre e 0.5% de glucose como fonte de carbono.
7. As perspectivas
A biodessulfurização é uma área
de estudos relativamente “jovem” pois
apenas na última década se verificou
um aumento do interesse da
comunidade científica. Apesar dos
resultados promissores já obtidos, a
obtenção de um processo de
dessulfurização viável em termos
industriais baseado numa fábrica
celular requer ainda uma acção
conjugada de estudos de fisiologia
microbiana, biologia molecular e
engenharia bioquímica para que a
introdução deste tipo de bioprocesso
se faça numa área economicamente
sensível, como é a dos combustíveis
fósseis. Continua a ser importante a
selecção de novas estirpes microbianas
com a capacidade de dessulfurizar
combustíveis fósseis sem diminuição
se a ser feita e o próximo passo será a
implementação de estratégias de
tecnologia de DNA recombinante com
vista ao aumento da capacidade
dessulfurizante através nomeadamente
do aumento da expressão dos genes da
via “4S”.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Prof.
Belarmino Barata (FC-UL) pela
cedência das amostras de solo
contaminado que permitiram o
isolamento da bactéria Bacillus sp. 1B.
Este
trabalho
é
parcialmente
financiado pelos seguintes contratos:
INCO–COPERNICUS–Nº IC15-CT
96-0716 e PRAXIS/2/2.1/BIO/05/94.
Abril 1999 - Boletim de Biotecnologia nº 62
7
Biotecnologia Ambiental
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