1 Instruções de Uso 1. Nome Comercial e marca da família de

Instruções de Uso
1. Nome Comercial e marca da família de produtos
FAMÍLIA DE KITS LABSCREEN PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS HLA USANDO A
TECNOLOGIA DE CITOMETRIA DE FLUXO
Marca: One Lambda
2. Formas de apresentação do produto e composição
2.1 Descrição de cada item que constitui a família
Número de catálogo
Descrição
LS1PRA
Kit Detec. Ac. Classe I Especificidades
LS2PRA
Kit Detec. Ac. Classe II Especificidades
LSM12
LS1A04
LS2A01
LS-AB2
LS-NC
LSMICA001
LSMUTR
Kit Detec. Simultânea Ac. Classe I e II - Mistura de
Pérolas Classe I e Classe II
Kit Detec. Ac. Classe I Especificidades - Antígenos
Únicos HLA Classe I Combi - Grupo 4
Teste LabScreen de Detecção de Anticorpos de
Antígenos Únicos HLA de Classe II – Grupo 1
Conjugado PE de cabra, anti-humano IgG para uso
em conjunto com kit LabScreen - LS-AB2
Soro controle Negativo para uso em conjunto com
kit LabScreen
Teste LabScreen de Detecção de Anticorpos de
MICA Antígenos Únicos e Especificidades
LABScreen Multi HLA Classe I e II e HNA - LSMUTR
3. Descrição da finalidade ou uso do produto
Produtos LabScreen são fabricados para serem utilizados na detecção de
anticorpo HLA através da tecnologia de citometria de fluxo.
4. Princípio de ação e reação do produto: base científica, explicação da
metodologia, técnicas e reações envolvidas
Os produtos LabScreen utilizam micropérolas revestidas com antígenos HLA de
classe I e de classe II e reagentes pré-otimizados para a detecção de anticorpos HLA
de classe I e de classe II em soro humano. Os produtos LabScreen utilizam o Sistema
de Ensaio Lambda Multi-Analítico de Pérolas (LABMAS – Lambda Array Beads MultiAnalyte System), o qual caracteriza o analisador de fluxo LABScan 100, para
aquisição de dados e análise.
O teste Mixed (misturado) detecta a presença de anticorpo para antígenos
HLA de classe I e/ou de classe II.
1
O teste PRA pode detectar anticorpos e suas especificidades contra antígenos
HLA em cada painel LABScreen.
O ensaio de Antígenos Únicos (Single Antigen) permite a confirmação da
especificidade específica sugerida por um teste de PRA anteriormente realizado.
O soro de controle negativo é usado para estabelecer o valor de background
para cada pérola (bead) em uma bateria de testes.
Princípio
Os produtos LabScreen são utilizados em testes de detecção de anticorpo que
utiliza um painel de pérolas codificadas por cor, as quais são revestidas com
antígenos HLA purificados. Até 100 diferentes pérolas podem ser combinadas em uma
suspensão para um único teste.
O soro teste é primeiramente incubado com pérolas LabScreen. Qualquer
anticorpo HLA presente no soro teste ligasse aos antígenos e então são marcados com
R-Ficoeritrina (PE)-conjugado de cabra anti-humano IgG. O Analisador de fluxo
LabScan 100 detecta a emissão fluorescente de PE de cada pérola, permitindo quase
uma aquisição de dados em tempo real. O padrão de reação do soro teste é
comparado à planilha de leitura lote-específico definindo a série de antígenos para
determinar o PRA e a especificidade HLA.
5. Componentes fornecidos com o produto: especificações ou características
qualitativas ou quantitativas
Número de
Descrição
Componentes do produto
catálogo
Mistura de Pérolas classe I LabScreen:
LS1PRA
Kit Detec. Ac. Classe I
1 X 125 uL / Tampão de lavagem
Especificidades
LabScreen: 1 X 13 mL
Mistura de Pérolas classe I LabScreen:
LS2PRA
Kit Detec. Ac. Classe II
1 X 125 uL / Tampão de lavagem
Especificidades
LabScreen: 1 X 13 mL
• Mistura de pérolas de classe I e de
Kit Detec. Simultânea Ac.
classe II LabScreen: 1 X 500 uL /
LSM12
Classe I e II - Mistura de
Tampão de Lavagem LabScreen: 2 X 26
Pérolas Classe I e Classe II
mL
Kit Detec. Ac. Classe I
• Pérolas antígenos únicos de classe I
Especificidades - Antígenos
LabScreen – Grupo 4: 1 X 125uL /
LS1A04
Únicos HLA Classe I Combi - Tampão de lavagem LabScreen: 1 X 13
Grupo 4
mL
Teste LabScreen de
• Pérolas antígenos únicos de classe II
Detecção de Anticorpos de
LabScreen - Grupo 1: 1 X 125 uL /
LS2A01
Antígenos Únicos HLA de
Tampão de lavagem LabScreen: 1 X 13
Classe II – Grupo 1
mL
Conjugado PE de cabra,
anti-humano IgG para uso
LS-AB2
1 X 1 mL (liof.)
em conjunto com kit
LabScreen - LS-AB2
2
LS-NC
LSMICA001
LSMUTR
Soro controle Negativo para
uso em conjunto com kit
Soro controle Negativo – 1 x 400uL
LabScreen
Teste LabScreen de
• Pérolas antígenos únicos de MICA Detecção de Anticorpos de
Grupo 1: 1 X 125 uL / Tampão de
MICA Antígenos Únicos e
lavagem LabScreen: 1 X 13 mL
Especificidades
• Mistura de pérolas de classe I e II e
LABScreen Multi HLA Classe
HNA LabScreen: 1 X 500 uL / Tampão
I e II e HNA - LSMUTR
de Lavagem LabScreen: 1 x 52 mL
6. Relação de todos os materiais, artigos, acessórios, insumos ou
equipamentos necessários e não fornecidos, para uso com o produto,
indicando as formas e condições de aquisição
5.1.
Instrumentos Requeridos, mas não fornecidos
• Analisador Luminex (sua calibração deverá seguir as instruções do
fabricante Luminex)
• Plataforma Luminex XY (acessório opcional para leitura automatizada
de 96 amostras no analisador de fluxo LabScan 200).
• Centrífuga (para placa PCR de 96 poços – 200ul cada poço)
• Minicentrífuga para tubo de 1,5mL
• Agitador tipo Vortex
• Agitador de placa ou plataforma de rotação
Para opção de trabalho com placa-filtro:
• Manifold para vácuo
• Placa com filtro
• Bomba a vácuo com pressão inferior a 100mmHg
• Agitador de placa ou plataforma de rotação
5.2.
Materiais requeridos, mas não fornecidos
• Conjugado-PE de cabra anti-humano IgG (cat # LS-AB2 – da One
Lambda)
• PBS (filtrado)
• Tubo de 1,5mL
• Ponteira para micropipetas
• Se o teste é realizado em placa de 96 poços:
- Microplaca de 96 poços – 250uL
- Selo para vedar a placa acima
• Soro de controle negativo (cat # LS-NC da One Lambda – ou outro
equivalente – não contendo anticorpo HLA quando testado pelo método
LabScreen)
• Placa filtro
3
7. Condições de armazenamento, transporte, limites de temperatura,
umidade ou proteção à luz
Código do produto
Informações sobre transporte
Toda a família
Os produtos devem ser transportados
acondicionados com gelo seco.
Temperatura de
armazenamento
Abaixo de -65°C
a. Uma vez descongeladas, as esferas não podem mais ser recongeladas,
devendo ser conservadas entre 2 e 8°C por até 3 meses.
b. Após a primeira utilização, conservar o Tampão de Lavagem entre 2 e 8°C
por até 3 meses.
8. Precauções e esclarecimentos sobre riscos com o uso do produto
a. Para uso em diagnóstico in vitro.
b. Referir-se à folha de dados de segurança para informação detalhada.
c. CUIDADO: Os reagentes de teste do LabScreen PRA contêm Azida sódica a
0,1% (NaN3), como preservativo. Sob condições ácidas, Azida sódica libera
Ácido hidrazóico, um componente extremamente tóxico Reagentes
contendo Azida sódica devem ser diluídos em água corrente antes de
serem descartados. Estas condições são recomendadas para evitar
depósitos em encanamentos onde condições explosivas podem ser
desenvolvidas.
d. CUIDADO: todos os produtos de sangue devem ser tratados como
potencialmente infecciosos. A fonte do material do qual se originou este
produto foi dado como negativo quando testado de acordo com os atuais
requerimentos de testes do FDA. Nenhum método de teste conhecido pode
oferecer segurança que produtos derivados de sangue humano não
transmitirão agente infeccioso.
9. Orientação sobre os cuidados com a amostra biológica objeto do
diagnóstico
Por estar sendo trabalhado com soro humano, recomenda-se o uso de EPI
adequados para um laboratório clínico, bem como se deve tomar todos os cuidados
para trabalho com sangue humano.
10. Descrição do Processo de Medição
9.1. Coleta da amostra e preparação
a) O soro teste pode ser fresco (de sangue mantido à temperatura ambiente
por menos de 24 horas) ou o soro separado deverá estar congelado a -20°C
ou abaixo desta temperatura, e descongelado imediatamente antes do
ensaio. Entretanto, grumos deverão ser separados do soro teste através de
centrifugação (8.000 – 10.000 g por 10 min) ou por filtração (0.2um) antes
do teste. Qualquer grumo/precipitado ou contaminação no soro poderá
gerar resultados inválidos.
4
b) O soro teste não poderá ser aquecido inativado, pois pode dar um alto
background no teste.
c) Soro não diluído é geralmente usado para o teste. Entretanto, se uma
amostra de alto background é diluída para este ensaio, o soro de controle
negativo deverá ser testado na mesma diluição.
9.2. Procedimento do Teste
a) Para efetuar o teste em tubo de microcentrifugação de 1,5mL:
Obs.: Para efetuar o teste em placa, referir-se abaixo ao item “b”.
1. As pérolas Labscreen devem ser bem misturadas através de Vortex leve ou
pipetagem repetitiva por diversas vezes antes de ser usado.
2. Incubar 5uL das pérolas LabScreen com 20uL do soro teste em tubos
separados de 1,5mL no escuro por 30 min a 20-25°C com suave agitação.
3. Para cada bateria de teste, um soro controle negativo deve ser testado
(código da One Lambda LS-NC) para estabelecer valores de background
4. Diluir tampão de lavagem 10X em água destilada para fazer uma solução
1X.
5. Adicione 1mL de tampão de lavagem 1X a cada tubo com solução
pérola/soro e agite em Vortex. Centrifugue a 9300g por 2 minutos. Aspire
e descarte o sobrenadante.
6. Repetir a etapa 5 duas vezes.
7. Diluir 1uL do conjugado PE anti-humano IgG 100X (código da One Lambda
LS-AB2) com 99uL de tampão de lavagem 1X para fazer uma solução 1X.
8. Adicione 100uL de conjugado PE anti-humano IgG a cada tubo. Agite em
Vortex e incube no escuro por 30 minutos a 20-25°C com agitação suave.
9. Repetir a etapa 5 duas vezes
10. Adicionar 80uL de PBS a cada tubo. A amostra está pronta para a aquisição
de dados e análises, ou pode ser armazenada a 2-5°C no escuro por até 24
horas antes da análise.
b) Para efetuar o teste em placa de 96 poços:
Cuidado: o fechamento da placa de 96 poços deve ser feito com todo cuidado
e completamente para prevenir a contaminação da amostra poço-a-poço.
Feche a placa com selo adesivo pressionando-o contra cada anel dos 96 poços.
Não reutilize os selos das placas. Utilize um selo fresco para cada etapa que
requeira a aplicação do selo adesivo na placa.
1. As pérolas LabScreen devem ser bem misturadas por suave agitação em
Vortex ou pipetagem repetitiva por diversas vezes antes do uso.
2. Incubar 5uL das pérolas LabScreen com 20uL do soro teste em cada poço
da placa de 96 poços no escuro por 30 minutos a 20 – 25°C com agitação
suave.
3. Para cada bateria de teste, um controle um soro controle negativo deve
ser testado (código da One Lambda LS-NC) para estabelecer valores de
background
4. Diluir tampão de lavagem 10X em água destilada para fazer uma solução
1X.
5
5. Depois da incubação, adicione 150uL de tampão de lavagem 1X a cada
poço da placa. Cobrir com o selo da placa (código da One Lambda #
SSPSEA300) e agite em Vortex. Centrifugue a 1300g por 5 minutos. Aspire
e descarte o sobrenadante.
6. Remover o tampão de lavagem dos poços da placa por aspiração a vácuo
ou por agitação (to flick).
7. Adicionar 200uL de tampão de lavagem 1X a cada poço da placa. Cobri-la
com um novo selo e agitar em Vortex. Centrifugar a 1300g por 5 minutos.
8. Remover o tampão de lavagem dos poços da placa por aspiração a vácuo
ou agitação (to flick).
9. Repetir as etapas 7 e 8.
10. Diluir 1uL do conjugado PE anti-humano IgG 100X por teste (código da One
Lambda LS-AB2) com 99uL de tampão de lavagem 1X para fazer uma
solução 1X.
11. Adicione 100uL de conjugado PE anti-humano IgG a cada poço. Cobrir a
placa com o selo. Agite em Vortex e incube no escuro por 30 minutos a 2025°C com agitação suave.
12. Centrifugar a 1300g por 5 minutos.
13. Remover o conjugado PE anti-humano IgG 1X de cada poço da placa
através de aspiração a vácuo ou agitação (to flick).
14. Repetir as etapas 7 e 8 duas vezes
15. Adicionar 80uL de PBS a cada poço. Cobrir com um novo selo e agitar em
vortex. A amostra está pronta para a aquisição de dados e análises, ou
pode ser armazenada a 2-5°C no escuro por até 24 horas antes da análise.
c) Para efetuar o teste em uma placa filtro de 96 poços:
1. Diluir tampão de lavagem 10X (código da One Lambda LSPWABUF) em água
destilada
para
fazer
uma
solução
1X
(aproximadamente
3,2mL/placa/lavagem).
2. Tampar qualquer poço da placa que não vá ser utilizado, o qual
permanecerá não utilizado durante o teste, com o selo de placa para
assegurar que os poços não utilizados permanecem secos. Pré-umedeça os
filtros na placa filtro dispensando 300ul de tampão de lavagem dentro de
somente aqueles poços que serão utilizados para o ensaio.
3. Incubar a placa por 10 minutos em agitador de placa a baixa temperatura.
4. Adicione 5uL de pérolas LabScreen com 20uL de soro teste por poço teste
da placa.
a. Agite em Vortex ou gentilmente agite com pipetagem para misturar
bem as pérolas LabScreen antes de usar.
b. Para cada bateria de teste, um soro controle negativo (código da
One Lambda LS-NC) deverá ser testado para estabelecer valores de
background
c. Durante as etapas de dispensação de pérolas e amostra, pressione
gentilmente as ponteiras contra a placa filtro para evitar ruptura
dos filtros.
5. Incubar no escuro por 30 minutos a 20-25°C com agitação suave.
6. Adicione 275uL de tampão de lavagem por poço (menos pode ser requerido
baseado no volume da amostra e pérola já presentes no poço.)
6
7. Ligue a bomba de vácuo. Não exceda a pressão de vácuo em 100mmHg!
Pressione a placa firmemente no manifold a vácuo. Certifique-se de que o
líquido drena vagarosamente. Um rápido vácuo causará perda das pérolas
devido à aderência nos poros do papel de filtro. Certifique-se que todos
líquido foi drenado dos poços antes de proceder à próxima etapa de
lavagem.
8. Repetir etapas 6-7 acima por mais 4 vezes.
9. Adicione 100uL de 1 do PE conjugado anti-humano IgG 1X a cada poço.
10. Incubar no escuro por 30 minutos a 20-25°C com agitação suave.
11. Repetir etapas 6-7 cinco vezes.
12. Adicione 80uL de PBS 1X em cada poço.
13. Leia a amostra na máquina LabScan 100, ajustando a altura da sonda caso
seja necessário.
OBS.: qualquer um dos protocolos acima pode ser usado para um teste
combinado:
1. Para o teste Combinado de classe I e de classe II (OLI cat. # LS12PRA)
use 5uL de cada suspensão de pérolas com 40uL do soro teste.
2. Os produtos cat.# LS1A03 e LS2A01 não podem ser combinados com
outros produtos.
3. Volumes iguais de pérolas de classe I e de classe II ou pérolas de
antígenos únicos grupo 1 e 2 podem ser misturadas primeiro. Então use
10uL da mistura de pérolas por teste.
9.3 RESULTADOS
a) Aquisição de dados:
1. Prepare a máquina LabScan 100 para aquisição de amostra e calibração
de acordo com o Manual do Usuário da Luminex.
2. Escolha um Template (gabarito) de acordo com a identificação de
catálogo do kit e número de lote.
I.Os templates de aquisição estão disponíveis através do Cd da One
Lambda ou poderão ser baixados da internet através do web site de
download da One Lambda (http://download.onelambda.com)
II.Para criar seu próprio template de aquisição, seguintes instruções que
se encontram no capítulo de Aquisição do Manual do Usuário da
Luminex.
3. Crie um nome de arquivo para as amostras que serão adquiridas.
4. Certifique-se de que todos os ajustes do template estão corretos. As
especificações do template são:
I. Volume da amostra: 50 ml.
II. Time-out da amostra: 80 segundos
III. Doublet Discriminator Gate: 8000 (low limit) e 16000 (high limit)
IV. Número e ID das da beads (pérolas) selecionadas de acordo com a
worksheet fornecida com o produto.
V. Número de eventos mínimo: 100 por bead
7
VI. Flow nate: Fast.
5. Entre com o nome das amostras (cuidado: se a mesma amostra é
testada marque uma vez, um nome diferente deverá ser determinado).
6. A placa agora até pronta para ser lida
7. Coloque a placa dentro da plataforma xy e inclua o reservatório com
sheat fluid (líquido circulante).
8. Clique no botão START para iniciar a aquisição desta seção. Depois que
as amostras terminaram de correr, os dados deverão ser salvos (clique
na tecla SAVE) como arquivo do tipo CSV.
9. Lave a máquina 2 vezes com sleat fluid ao final de cada seção.
b) Análise de Dados:
1. Cada reatividade de soro pode ser calculada pelo sinal mediano
fluorescente de cada perda revestida HLA depois correção para ligação
não específica à pérola controle negativo (NC#001). Todos os dados são
normalizados aos resultados obtidos usando um soro de controle
negativo (catálogo da OL1#LS-NC)
2. A reatividade da amostra testes é calculada baseada nos valores
medianos fluorescentes, os quais podem ser obtidos do arquivo – CSV.
3. Para o LabScreen PRA ou LabScreen Single Antigen, a medicina
normalizada para cada pérola revestida HLA equivale os valores
medianos de cada pérola dividida pelo valor mediano de cada pérola do
controle negativo (NC).
a) Para o LabScreen Mixed, a mediana normalizada equivale ao
valor mediano das pérolas revestidas de Classe I ou Classe II
menos o valor mediano da pérola do controle negativo.
4. Os valores medianos background para cada pérola HLA e a pérola NC
são obtidos usando um soro controle negativo.
5. A força da reatividade anti-HLA é calculada pela razão de
background normalizado (NBG ratio).
11. Procedimentos de calibração do processo de medição
Logo após a instalação ou revisão/manutenção técnica e durante
procedimentos de rotina, a calibração do Analisador Luminex deverá ser efetuada. A
calibração deverá ser feita diariamente, como parte da rotina de inicialização da
máquina e sempre que a temperatura d Cal Temp mostrada no monitor do sistema
indicar uma mudança de mais de 3 graus Celsius (°C). Os calibradores são
microesferas com propriedades de dispersão de luz conhecida e também com
intensidades conhecidas de fluorescência nas faixas dos comprimentos de onda de
Reporter (relator RP1), Classification 1 (classificação CL1), e Classification 2
(classificação CL2). O processo de calibração utiliza essas microesferas para ajustar
classe de voltagem para ótima e classificação consistente de microesfera e leituras
8
de relator (reporter). Os ajustes da última calibração realizada aplicam-se
automaticamente a qualquer nova sessão.
Aparência da Tela principal no Computador após ter sido ligado:
Para calibrar o instrumento:
1. Ligue o Analisador Luminex. Clique em Warmup na tela principal, e então
clique em OK na caixa de diálogo que aparecerá. Depois de 30 minutos de
aquecimento (warmup), vá para a próxima etapa.
2. Clique em Prime na tela principal. Clique OK quando você quiser começar o
ciclo de prime (onde é deixado entrar o fluído de circulação (sheath fluid) na
máquina, para a retirada de bolhas maiores.
3. Remova as microesferas calibradoras (Classification CAL1 e Reporter CAL2) de
seu local de estoque, ou seja, das temperaturas de 2-8°C. Agite os frascos com
as microesferas em Vortex na posição horizontal.
4. Dispense 5 gotas (aprox. 200ul) da microesfera de calibração Classification
(CAL1) em um tubo identificado de 1,5ml, e dispense 5 gotas (aprox. 200ul) da
microesfera de calibração Reporter (CAL2) em outro tubo identificado de
1,5ml.
5. Envolva os tubos contendo as microesferas com papel alumínio para protegêlas da luz. Permita às microesferas que sua temperatura chegue à temperatura
ambiente.
6. Clique em Alcohol Flush na tela principal. Utilize 1,2mL de isopropanol a 70%
ou etanol a 70% para o fluxo com álcool. Este fluxo remove qualquer pequena
bolha de ar que esteja presente no interior do sistema. Clique OK quando
estiver pronto para iniciar com o fluxo de álcool.
7. Clique em Calibrate na tela principal. A seguinte caixa de diálogo aparecerá:
9
8. Coloque o nome da pessoa que estiver efetuando a calibração no campo
solicitado
9. Selecione Product/Lot Number para as microesferas de calibração
Classification e na sequência para Reporter.
10. Clique OK. A caixa de diálogo abaixo aparecerá:
10
11. Coloque o tubo contendo a microesfera de calibração Classification no suporte
para amostra localizado na frente do aparelho.
12. Certifique-se de que Classification está selecionado, e
então clique Start.
A barra de progresso lhe mostrará o progresso da
calibração. A calibração deverá levar menos que dois
minutos. Se a posição no monitor do sistema mudar para
“Sample Empty” antes da calibração se completar, a
mensagem “Calibration Failed” aparecerá. Click OK e
comece o processo novamente. Quando a calibração
acabar para as microesferas de classificação, a
mensagem “Calibration Succeeded” aparecerá. Os
ajustes e qualquer comentário que for inserido serão
incluídos no relatório de calibração.
13. Clique OK.
14. Coloque o tubo com as microesferas de calibração
reporter (CAL2) no suporte de amostras.
15. Selecione Reporter e clique em Start.
A barra de progresso lhe mostrará o progresso da calibração. A calibração
deverá levar menos que dois minutos. Se a posição no monitor do sistema
mudar para “Sample Empty” antes da calibração se completar, a mensagem
“Calibration Failed” aparecerá. Click OK e comece o processo novamente.
Quando a calibração acabar para as microesferas de classificação, a mensagem
“Calibration Succeeded” aparecerá. Os ajustes e qualquer comentário que for
inserido será incluído no relatório de calibração.
16. Clique OK.
Obs.: as microesferas de calibração são muito concentradas. Cada vez que o
instrumento for calibrado, ele deverá ser lavado com 4 ciclos de WASH utilizando o
fluído de circulação (Sheath Fluid). Notar que entre as microesferas de calibração,
deverá ser feita a lavagem por 3 vezes com o fluído de circulação.
12. Procedimentos de cálculos e obtenção dos resultados da medição
11.1. Cálculos
1. As abreviações utilizadas nesta seção estão definidas abaixo:
NBG ratio => Razão background normalizado usando para determinar a força
de cada reação anti-HLA.
S#N => Valor fluorescente mediano amostra-específico para pérola #N.
SNC Bead => Valor fluorescente mediano amostra-específico para pérola
controle negativo.
BG#N => Valor fluorescente mediano background do soro NC para pérola #N.
BGNC Bead => Valor fluorescente mediano do background do soro NC para
pérola do controle negativo.
11
NC Serum => Soro controle negativo (catálogo da One Lambda # LS-NC)
validade para um dado lote de pérola LabScreen.
Para LabScreen PRA ou LabScreen Single Antigen.
NBG Ratio =
S#N / SNC Bead
BG#N / BGNC Bead
2. Para LabSreen Mixed:
NBG Ratio
=
S#N / SNC Bead
BG#N / BGNC Bead
11.2. Determinação do valor de Cut-off Positivo / Negativo
3. Para LabSreen PRA e LabSreen Mixed:
a) Selecione a razão NBG que dá um significante “Shith Over” valor de
Background fluorescente quando o valor de Background é obtido usando um
soro controle negativo em 3.5 testes, replicados. Se preferir, testes 5-10
amostras de doadores do sexo masculino não-transplantados e que não
tenham passado por transfusão para obter um valor médio de background.
b) Valide o valor de cut-off usando de 5-10 amostras de alo-soro referência com
especificidade de anti-corpo HLA definidos. Os valores da razão NGB para as
reações de antígenos positivos esperados deverão estar acima do valor de cutoff.
c) Reações adicionais positivo / negativo podem ser observadas. Se necessário,
ajuste o cut-off do ensaio LabScreen para combinar com a sensibilidade de
ensaio de detecção de anticorpo aceita anteriormente.
4. Para LabScreen Single Antigen:
a) Teste o soro controle negativo ou diversas amostras de soro negativo usando o
(1.a) acima.
b) Defina a faixa de trabalho:
- Working Range = NBG Ratio Maximum – NBG Ratio Minimum.
c) Defina os pontos de cut-off dentro de faixa de trabalho:
- Relative NBG Ratio cut-off = X% (Working Range) + NBG Ratio Minimum onde X%
= porcentagem definida pelo usuário do ponto de cut-off dentro da faixa de
trabalho positivo / negativo (1), área cinza (2), positivo fraco (4) e positivo forte
(8).
d) Ajuste o critério para definir reações positiva us. negativa, por exemplo:
(1) Se [ NBG Ratio max/ NBG Ratio min ] > 8, então aplique o cálculo em 2C.
12
(2) Se [ NBG Ratio max/ NBG Ratio min ] < 8, e:
i – NBG Ratio max > 5, então razão NBG min deverá ser ajustada para a metade
do NBG Ratio max e o cut-off relativo da razão NBG deverá ser re-computada
(com em 2C) baseado no NBG Ratio min ajustado. As reações são então
classificados conforme o escore acima.
ii – NGB Ratio max < 5 então a reação do soro teste com aquela bead (pérola) é
negativa. Determina o escore de “1”.
e) Teste diferentes alosoros referência como no (1b) acima, usando a razão NBG
relativa para validar o cut-off.
(1) Estabeleça um cut-off de reatividade forte e fraca baseado na performance
do alosoro referência, relativo a um ensaio estabelecido.
(2) Pode ser útil colocar os valores da razão no histograma para a visualização do
padrão de reatividade HLA de cada soro.
(3) Sensitividades maiores ou menores podem ser obtidos pelo ajuste do cut-off.
11.3. Valores Esperados
A. LabScreen PRA Classe I ou Classe II.
1. A força de reatividade do soro teste de cada pérola pode ser comparada para
distinguir reações forte positivas, fracas positivas e negativas. Reações de
reatividade podem ser classificada dentro de diferentes faixas, se um sistema
de escova é desejado.
2. Nossos dados mostram que razões de NBG > 1.5 no teste LabScreen PRA
correlaciona bem com reações positivas pelo número de reações válidas para
aquele soro teste.
3. Para determinar a especificidade do anticorpo HLA entre com o escove de
reação dentro da planilha de leitura lote-específica para analisar o padrão de
reação.
B. LabSreen Mixed:
1. Faça a escove das reações HLA de Classe I e Classe II separadamente, de
acordo com a força de reatividade do soro para cada conjunto de pérolas.
2. Se qualquer uma das pérolas no ensaio das misturas, é positivo, então o
resultado deverá ser determinado como positivo.
13
3. Nossos dados mostram que razões de NBG > 2.2 no teste LabScreen mixed
correlaciona bem com reações positivas no LAT mixed.
C. LabSreen Single Antigen
1. Alororo pode produzir razões de Sinal / Background que são maiores que
aquelas abtidas no ensaio PRA estabelecendo o cut-off do ensaio usando uma
razão realtiva do NBG (conforme em resultados, seção D-2C) é uma maneira
de normalizar dos dados.
2. Nossos dados mostram que um cut-off positivo / negativo ou razão NBG
calculada para cada soro teste dará resultados comparáveis ao ensaio
LabScreen PRA.
D. Orientações Gerais:
1. Cada contagem de beads deverá estar acima de 50. Uma contagem menor de
pérolas pode ser devido à pérola de amostra durante as etapas de lavagens.
Também pode ser devido à imprópria calibração ou entupimento no LabScan
100. Baixa contagem de beads pode também ser causada por pérolas photobleached que pulam para fora da região mapeada.
2. Valores do sinal são as médias de cada conjunto de pérolas vs. o soro teste.
Um soro controle negativo deveria ser testado com a mesma bateria de
amostras para estabelecer o valor (ou valores) do background para aquela
corrida de teste.
3. Soro controle negativa (Lat # LS-NC da One Lambda ou outro equivalente) é
recomendado. Usando qualquer outro soro controle negativo pode requerer
ajuste nos valores de cut-off.
4. Pérolas de controle negativo (Ag ID = NC) não são revestidos com antígenos
HLA. O valor médio pode variar junto com diferentes amostras de soros com
alto background. Isto deve ser sempre menor que 1500 e menor ou igual que a
metade do valor do PC (controle positivo).
5. Pérolas de controle positivo (Ag ID = PC) são beads (pérolas) revestidas com
IgG humano purificado. Ela deve se ligar ao anticorpo secundário para
produzir um sinal positivo. O valor do PC deverá estar acima de 500 e pelo
menos duas vezes o valor do NC.
E. Validação do Ensaio:
1. O valor de cut-off do sinal para background deve ser validado se um novo soro
controle negativo é usado.
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2. Para um dado soro, o valor do PC/NC deve ser maior que 2. Um valor de
background da pérola NC para o soro teste, um sinal alto para a pérola HLA
para o controle NS, ou um sinal baixo do anticorpo secundário ou o Sistema
LabScan 100. Neste caso, os dados devem ser confirmados.
3. Cada usuário deve avaliar a performance do ensaio no seu laboratório para
validar os valores selecionados de cut-off.
13. Limitações do processo de medição (utilização de testes adicionais mais
específicos ou sensíveis, quando os resultados obtidos assim o sugerirem)
A. O soro que contém contaminantes ou agregados pode entupir o LabScan 100 e
gerar dados incorretos. Agregados no soro teste devem ser removidos por
centrifugação ou filtrando o soro antes de se fazer o teste.
B. Temperatura ambiente onde o LabScan 100 está localizado pode afetar a
calibração da máquina. Se a temperatura ambiente muda, pode ser que a
máquina precise ser re-calibrada. Consulte o manual do fabricante para
maiores informações.
C. Aquisição de dados precisa depende do desempenho apropriado do LabScan
100. A máquina deve ser calibrada e mantida de modo apropriado. No caso de
lavagem insuficiência do sistema, agregado da amostra podem causar
entupimento na máquina e gerar dados inválidos.
D. Determinação da especificidade do anticorpo até limitada aos antígenos HLA
presentes em cada painel de pérolas. (Veja a planilha de leitura loteespecífica).
14. Controle interno de qualidade a ser adotado pelo usuário para assegurar o
desempenho adequado do processo de medição
Recomenda-se que a cada novo lote, seja realizado testes utilizando-se
soros com anticorpos cuja reatividade já é previamente conhecida a fim de avaliar
a correta caracterização dos anticorpos, bem como a porcentagem do painel
reativo de anticorpo (PRA).
15. Valores de referência obtidos em populações sadias ou valores
demográficos, epidemiológicos, estatísticos, desejáveis, terapêuticos ou
tóxicos
Não existe este tipo de dado para a metodologia em questão.
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16. Características de desempenho do produto
Usando os valores de referencia de cut-off em “Expected Values”, os ensaios
LabScreen tem dado resultados comparáveis aos resultados do Flow PRA da One
Lambda e aos ensaios da Lambda Antigen Tray (cat).
Entretanto, os padrões de anticorpo HLA podem ser um pouco complexos. Uma dada
amostra teste pode conter diversas especificidades de anticorpos HLA de Classe I e
de Classe II, cada uma com diferente avidez; entretanto, nem todas especificidades
serão reconhecidas em ensaios com menor sensitividade. Portanto, cada laboratório
deverá estabelecer e validar os cut-off do ensaio para os seus próprios usos baseados
em suas perícias em reconhecer os padrões CREG HLA e um avaliação do desempenho
do ensaio usando alosoro HLA com especificidades definidas.
17. Referências Bibliográficas que comprovem ou fundamentem as informações
fornecidas
1. The Luminex 200 User’s Manual, Luminex Corporation, PN 89-00002-00-005
2. R Pei, J-H Lee, T Chen S Rojo, and PI Terasaki. Flow Cytometric Detection of
HLA Antibodies Using a Spectrum of Microbeads. Human Immunology 60, 12931302 (1999)
3. R Pei, G Wang, C Tarsitani, S Rojo, T Chen, S Takemura, A Liu, and J-H Lee.
Simultaneous HLA class I and Class II antibodies secrrening with Flow
cytometry. Human Immunology 59, 313-322 (1998)
4. RA Bray, DA Sinclair, L Wimoth-Hosey, C Lyons, P Chapman and J Holcomb.
Significance of the flow cytometric PRA in the evaluation of patients awaiting
renal transplantation. Department of Pathology, Emory University, Atlanta, GA.
ASHI Abstract, 1998.
18. Identificação do Distribuidor do produto
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba - PR
CEP: 82840-360
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
www.biometrix.com.br
CNPJ: 06.145.976/0001-39
19. Identificação do Fabricante do produto
País de Origem: Estados Unidos da América
Fabricante: One Lambda, Inc.
21001 Kittridge Street
Canoga Park – CA
EUA
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20. Registro ANVISA número
80298490004
21. Responsável Técnica
Ana Carolina Martins
CRF/PR: 12700
22. Revisões
Revisão
Descrição da Alteração
Data
00
Elaboração
11/2006
01
02
03
Revisão: Formação, layout, produtos
descontinuados, alteração nas condições de
armazenagem e transporte, inclusão das
denominações comerciais de cada item da
família, inclusão de número de registro e
alteração de Responsável Técnica.
Revisão: Alteração na apresentação comercial
da família.
Alteração do DDG.
02/2011
02/2011
09/2012
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