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Scientia Chromatographica 2014; 6(3):205-211
Instituto Internacional de Cromatografia
http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.006
ISSN 1984-4433
MULTIDIMENSIONAL
Cromatografia em fluxo turbulento (TFC)
Turbulent flow chromatography (TFC)
Fernando M. Lanças*
Universidade de São Paulo
Instituto de Química de São Carlos
13560-970 São Carlos (SP) – Brasil
*[email protected]
Recebido: 30/11/2014
Aceito: 30/12/2014
Resumo
A cromatografia é uma técnica de separação baseada na partição dos analitos
entre duas fases: uma fase que permanence estanque durante o processo (fase
estacionária) e outra que percola através dela (fase móvel). Dependendo do
estado físico da fase móvel a técnica tem sido classificada em cromatografia gasosa
(GC), cromatografia líquida (LC) ou cromatografia com fluido supercrítico (SFC).
Entretanto, esta classificação tem sido ampliada mais recentemente para incluir subdivisões. Assim, a cromatografia líquida possui hoje várias sub-divisões, incluindo:
cromatografia líquida em pressões ultra-elevadas (U-HPLC); cromatografia líquida
com fluidez aumentada (EFLC); cromatografia de transição de fase; cromatografia
em fluxo turbulento (TFC) e outras. Esta última, TFC, baseia-se no uso de fluxos
ou vazões elevadas (tipicamente 4 a 6 mL/min) em colunas contendo partículas
de diâmetro considerado grande para os padrões atuais da LC (30-60 µm). Nestas
condições, a fase móvel não apresenta um fluxo laminar como usualmente em LC mas
sim um fluxo turbulento o qual leva a formação de uma turbulência na coluna com a
consequente transferência de massa através dos canais e a difusão dos analitos nos
poros das partículas da fase estacionária. Esta condição tem se mostrado bastante
eficiente no preparo de amostras, especialmente na área de bioanálises. A TFC tem
sido utilizada com sucesso em um arranjo bidimensional no qual a primeira coluna,
operando em fluxo turbulento, é empregada para a etapa de preparo de amostras,
enquanto que a segunda é empregada como coluna analítica e recebe a amostra
tratada na primeira coluna através de uma válvula de comutação de colunas. Este
trabalho apresenta uma descrição das principais características da Cromatografia em
Fluxo Turbulento (TFC), a instrumentação típica utilizada na mesma e uma relação
dos trabalhos publicados nos últimos 10 anos na área para o leitor interessado em
mais informações a respeito da técnica.
Palavras-chave: fluxo turbulento; cromatografia líquida, HPLC, multidimensional.
Abstract
Chromatography is a separation technique based on the partition of the analytes
into two phases: one phase remains still during the process (stationary phase) while
the other phase percolate through it transporting the compounds under analyzes.
Depending upon the physical state of the mobile phase the technique has presented
the following classification: gas chromatography (GC); liquid chromatography
(LC); and supercritical fluid chromatography (SFC). In fact, this classical procedure
has been recently modified to include several sub-divisions. In the case of liquid
chromatography, as an example, the sub-divisions includes terms such as ultra high
pressure liquid chromatography (U-HPLC); enhanced-fluidity liquid chromatography
(EFLC); transition phase chromatography; turbulent flow chromatography (TFC),
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Lanças FM
Cromatografia em fluxo turbulento
among others. In the late case, TFC, the technique is based upon the utilization of high flow rates (typically 4-6mL/min) and columns
packed with particles considered large (30-60 µm) for the present LC standards. Under these conditions, the mobile phase does not
exhibit a laminar flow as in standard LC but instead a turbulent flow that leads to the formation of eddies thus promoting cross-channel
mass transfer and the diffusion of the analytes into the stationary phase particle pores. These conditions have shown to be efficient for
sample preparation, particularly in the bioanalysis arena. TFC has been successfully employed in a bi-dimensional set-up in which the first
columns operating under turbulent flow conditions is employed for sample preparation and the second (analytical column) receives the
treated sample coming from the first column through a switching valve. In the present work a description of the main characteristics of
the turbulent flow chromatography (TFC) is presented, followed by the presentation of the typical instrumentation utilized and a list of the
papers published in the last 10 years employing this technique.
Keywords: turbulent flow; liquid chromatography; HPLC; multidimensional.
1. Introdução
A cromatografia líquida moderna (HPLC) é
uma técnica analítica madura e que encontra aplicações
analíticas em vários setores da sociedade, especialmente
na análise de amostras biológicas (tais como plasma,
urina, sangue, dentre outras); alimentos de origem
animal e vegetal; e meio ambiente [1]. Apresenta várias
classificações, de acordo com as dimensões da coluna
(capilar, preparativa, analítica), forma de colocação da
fase no interior do tubo (empacotada, tubular aberta ou
monolítica), pressão (LC, HPLC, U-HPLC) e outros [2-4].
Como nos demais modos cromatográficos, o
fluxo (vazão) da fase móvel é um importante parâmetro
que comanda a eficiência e o tempo de separação em
HPLC. Apesar de que nas condições usuais em que a fase
móvel é empregada em HPLC – tipicamente ao redor de
1 mL/min – o perfil do fluxo é laminar, em fluxos mais
elevados - como 4 a 5 mL/min - empregando partículas
de diâmetros maiores – tais como 40 a 60 mícrons - na
fase estacionária, o fluxo se torna turbulento (Figura 1).
A modalidade cromatográfica que emprega fluxos
turbulentos como fase móvel, tem sido denominada
cromatografia em fluxo turbulento (TFC).
Os primeiros registros sobre a definição de
fluxo turbulento são atribuidos a Reynolds [5], o qual
propos que o fluxo de um fluido através de um tubo
torna-se turbulento quando o momento (quantidade de
206
movimento) do fluido excede sua resistência em fluir por
um fator entre 2.000 e 3.000.
O número de Reynolds, Re, o qual relaciona essas
grandezas é dado por (Eq.1):
Re =
onde:
υ ρ D f η
(Eq.1)
u = momento (massa/velocidade);
r = densidade do fluido;
Df = diâmetro do tubo;
h = viscosidade do fluido.
No caso de uma coluna cromatográfica
empacotada com partículas da fase estacionária, o
tamanho das partículas também precisa ser considerado.
Uma vez que os espaços existentes entre as partículas
é proporcional ao tamanho médio das mesmas (dp)
as colunas empacotadas com partículas maiores irão
reter uma quantidade de fase móvel maior do que
partículas menores. O número de Reynolds para colunas
empacotadas, levando em consideração a porosidade
externa das partículas (e0 ) é dado por (Eq.2):
,
Re =
Vp d p
η ε0
(Eq. 2)
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Cromatografia em fluxo turbulento
Lanças FM
(a)
(b)
Figura 1. Perfil de um fluxo laminar versus o de um fluxo turbulento.
De acordo com esta equação, a turbulência em
cromatografia é favorecida com o uso de partículas
maiores (maior dp). Atualmente, na cromatografia em
fluxo turbulento (TFC) as partículas típicas apresentam
diâmetro médio entre 30 a 60 um, ao invés de 3 a 5 µm
como as utilizadas em HPLC ou inferiors a 2 um utilizadas
em U-HPLC [3,4]. Pelo fato de empregarem partículas
menores, as colunas utilizadas na cromatografia em
fluxo turbulento (TFC) apresentam menor eficiência (N,
número de pratos) do que as empregadas em HPLC e
U-HPLC, servindo em um método analítico mais como
uma etapa de preparo de amostras do que propriamente
para o isolamento e quantificação do analito de interesse
presente em amostras complexas.
2. Instrumentação
Apesar de fluxos turbulentos terem sido
empregados inicialmente em cromatografia gasosa, e
existirem algumas aplicações na cromatografia com
fluido supercrítico, atualmente a grande maioria das
publicações estão no nicho da cromatografia líquida.
Considerando a menor eficiência das colunas
TFC em relação às de HPLC e U-HPLC, apesar desta
técnica poder ser empregada com apenas uma coluna
o enfoque mais usual atualmente é o emprego de uma
coluna TFC em linha com uma de HPLC, em um
arranjo do tipo bi-dimensional (2D) (Figura 2). Na
maioria das aplicações da TFC amostras biológicas são
injetadas diretamente, sem prévia extração ou outro prétratamento, em uma coluna empacotada com partículas
de tamanho maior – tipicamente entre 30 e 60 um – as
quais operam em fluxos (vazões) superiors a 2 mL/min,
gerando fluxos turbulentos. Como no caso de amostras
biológicas a fase móvel, nesta etapa, é constituida de
tampões aquosos, as moléculas dos analitos pequenos
são retidas através de processos de difusão nos poros
da fase estacionária, enquanto que o material proteico é
removido e direcionada para o descarte (Fig. 2a). Após
a remoção dos compostos de interesse da matriz para a
coluna TFC eles são eluidos dela para a coluna analítica
com um volume de solvente armazenado em uma alça
(“loop”) instalada na primeira válvula (a da esquerda na
Fig. 2), com auxílio de uma bomba operando em fluxos
bastante inferiores aos empregados anteriormente. De
forma a evitar alargamento da banda, os analitos são
agora focalizados na forma de uma banda estreita na
cabeça da coluna de HPLC (Fig.2b). Concluida esta
etapa de focalização, através de um giro de válvula as
colunas são isoladas e a coluna turbo é lavada e a alça
preparada para a próxima etapa; enquanto isso a análise
na segunda coluna é realizada usualmente com detecção
por espectrometria de massas (MS).
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Cromatografia em fluxo turbulento
analitos presentes em baixas concentrações em um meio
complexo.
Atualmente a técnica que emprega uma coluna
de fluxo turbulento acoplada em linha com HPLC para
a separação dos componentes de interesse e a análise
qualitativa e quantitiva dos mesmos por espectrometria
de massas em tandem, tem sido referida na literatura de
forma simplificada como TFC-MS/MS.
3. Aplicações
Figura 2. Posição das válvulas de comutação emu ma montage
típica empregada para Cromatografia em Fluxo Turbulento (TFC)
bidimensional. A figura superior ilustra o arranjo das válvulas quando
a amostra está no modo carga, enquanto que a figura inferior mostra
o arranjo no modo transferência.
As primeiras colunas comercializadas para TFC
apresentavam tamanho médio de particulas ao redor de
40 a 60 um, empacotadas em tubos de 5cm x 1 mm, e
operavam em fluxos ao redor de 4 mL/min. A tendência
atual consiste na diminuição do diâmetro interno da coluna
para 0,5 mm, possibilitando atingir-se fluxos turbulentos
operando a fase móvel ao redor de 1,5 mL/min. Um
grande número de fases estacionárias para TFC, tanto
baseadas em sílica quanto em polímeros sintéticos, é
atualmente disponível comercialmente, possibilitando
uma ampla seleção em função dos analitos de interesse.
Apesar de que em princípio qualquer detector de
cromatografia liquida pode ser usado com a técnica, a
escolha tem recaido quase que exclusivamente sobre a
espectrometria de massas (MS ou MS/MS), devido à
complexidade das amostras analisadas pela técnica e a
necessidade de informações qualitativas a respeito de
208
Apesar do fluxo turbulento ser conhecido e
estudado há mais de 100 anos [5] e haver sido discutido
por vários pesquisadores na segunda metade do século
XX [6-13], especialmente em seus aspectos teóricos, a
técnica começou a despertar maior atenção como uma
ferramente analítica prática somente após o trabalho de
Quinn e colaboradores [14,15] envolvendo o acoplamento
em linha entre a cromatografia em fluxo turbulento
e a espectrometria de massas. Esses pesquisadores
observaram que seriam capazes de separar moléculas
pequenas de macromoléculas empregando uma coluna
com tamanho de partículas e diâmetro interno apropriados,
operando em fluxos elevados. As moléculas menores
eram retidas na fase estacionária devido a seu coeficiente
de transferência de massa elevado, e as macromoléculas
não conseguiriam difundir dentro dos poros da fase
estacionária devido ao elevado fluxo, sendo eliminadas
para o descarte. No caso de amostras biológicas, onde
a principal fonte de interferentes da matriz é a grande
quantidade de proteinas, sua eliminação da presença
dos analitos de interesse é uma das principais etapas de
métodos analíticos “on-line”.
Os principais trabalhos referentes ao uso
de cromatografia em fluxo turbulento publicados
nos últimos 10 anos (2005-2014), encontra-se nas
referencias 16 a 79. Grande parte destas aplicações
encontra-se nas áreas de fluidos biológicos, resíduos de
pesticidas e medicamentos veterinários em alimentos, e
contaminantes em amostras ambientais.
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4. Conclusões
A cromatografia em fluxo turbulento (TFC) é uma
variante das várias técnicas existentes com o objetivo de
empregar duas dimensões acopladas em linha (on-line),
também denominadas de cromatografia bi-dimensional
(2D) ou, frequentemente, multidimensional. Neste
caso, na primeira dimensão procura-se efetuar o que
tradicionalmente é denominado genericamente de
preparo da amostra: eliminação dos interferentes da
matriz, concentração dos analitos de interesse e operações
similares. Para tal pode-se empregar uma pequena coluna
de HPLC com diferentes fases e mecanismos (RAM,
MIP, NP, SEC,…), uma micro-técnica de preparo de
amostra como SPME, SBSE, MEPS, e outras, ou uma
coluna normal de HPLC, formando com a segunda
dimensão um sistema LC-LC ou LCxLC, dependendo
da montagem e operação da instrumentação. Na presente
mini revisão discutiu-se o emprego de uma coluna
operando em fluxo turbulento, como primeira dimensão.
Na segunda dimensão, geralmente emprega-se uma
coluna analítica padrão, contendo fase estacionária que
permite a separação do analito de interesse transferido
Lanças FM
da primeira para a segunda dimensão, através de uma
válvula (por isso às vezes este enfoque é também
denominado de “column switching”, além de 2D).
O uso deste arranjo, com uma coluna operando
em fluxo turbulento na primeira dimensão, apresenta
características importantes cujas vantagens podem
ser exploradas a favor do analista. Uma das principais
vantagens é o fato de permitir a eliminação do sistema de
“clean up” das amostras, usualmente demorado, tedioso,
sujeito a erros, e caro. Permite ainda um aumento
da produtividade, através da automatização, e uma
redução no uso de solventes sem perda da sensibilidade
analítica. Frequentemente, também permite uma redução
considerável no volume de amostra, e uma diminuição na
degradação dos analitos de interesse pelo menor tempo
de permanência dos mesmos no sistema.
Considerando os fatores a favor e contra, a TFC
apresenta-se como uma alternativa bastante interessante
e viável para a automatização de análises em matrizes
complexas, como as de natureza biológica, sem
necessidade de etapas prévias de tratamento da amostra.
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