apoptose e proliferação celular em conceptos bovinos

IV Simpósio de Ciências da UNESP – Dracena
V Encontro de Zootecnia – Unesp Dracena
Dracena, 09 a 11 de setembro de 2008.
APOPTOSE E PROLIFERAÇÃO CELULAR EM COCEPTOS BOVIOS
CLOADOS QUE EXPRESSAM A PROTEÍA FLUORESCETE VERDE (GFP)
Pereira, F.T.V.1; Meirelles, F.V.2; Marques, R.S.1; Marcolino, S.1; Barreto, R.S..1;
Bressan, F2; Miranda, M.2; De Bem, T2; Monteiro, J.M.3; Bosch, R.V.3; Tarouco,
A.K.2; Fantinato eto, P.2; Pimentel, J.R.V.2; Bertan, C.1; Assis eto, A.C. 1; Kfoury
Jr, J.R.3; Smith, L.4; Miglino, M.A.3
1
UNESP-DRACENA, 17900-000, Dracena-SP, Brasil, ²ZAB-FZEA-USP, Pirassununga-SP, Brasil, 3VCI-AnatomiaFMVZ-USP, São Paulo, SP, Brasil, 4Centre de Recherche en Reproduction Animale-Université de Montréal, SaintHyacinthe, QC, Canadá, [email protected]
RESUMO
Este trabalho foi conduzido com a finalidade de analisar a correlação da apoptose e
proliferação celular nas gestações de conceptos clonados, utilizando-se a proteína fluorescente
verde (GFP) no estudo de animais manipulados em laboratório, e gestações naturais de
bovinos como controle. Para tanto, fibroblastos fetais que expressavam o gene da GFP foram
utilizados como doadores de núcleo para a clonagem por transferência de núcleo de célula
somática (SCNT) e, como controle, gestações naturais por inseminação artificial. As técnicas
de Histologia e Imunohistoquímica (TUNEL-apoptose e PCNA-proliferação) foram
realizadas em placentônios e úteros de 5 clones (3 com 60dg e 2 com 90dg) e 10 controles (5
com 60dg e 5 com 90dg). A classificação qualitativa foi a mesma utilizada por ARTONI et al
(2007). Os tecidos foram congelados em nitrogênio líquido ou fixados em formalina. Os
resultados parciais, em ambos grupos e idades gestacionais das reações de TUNEL e PCNA
apresentaram co-localização no epitélio trofoblástico, células gigantes trofoblásticas (TGC) e
no epitélio glandular do endométrio. A reação de PCNA marcou tanto as células endoteliais,
quanto o mesênquima, enquanto que o estroma endometrial mostrou sinais fracos. Entretanto,
as marcações de TUNEL e PCNA foram positivas nos placentônios de SCNT e gestações
controle, e foram mais fortes nos clones, causando um desbalanço na correlação entre
apoptose X proliferação. Mediante a metodologia utilizada, pôde-se concluir que, a apoptose
e a proliferação celular no estroma endometrial e no mesênquima fetal, desempenham um
papel importante na placentação bovina e podem estar envolvidas na regulação da
proliferação e diferenciação do epitélio uterino e trofoblástico.
Palavras-Chave: Apoptose; proliferação celular, placenta; bovinos clonados; GFP.
ABSTRACT
This first report was conducted in order to analyze the correlation of apoptosis and cell
proliferation in the gestation of cloned conceptuses, using the green fluorescent protein (GFP)
in laboratory manipulated animals study and natural bovine pregnancies as control. Fetal
fibroblasts expressing the GFP gene were used as nuclei donors for cloning by somatic cell
nuclear transfer (SCNT) and as a control, by artificial inseminations. Histology and
immunohistochemical staining (TUNEL-apoptosis and PCNA-proliferation) were performed
on placentomes and uteri from 5 cloned (3 from 60 days of gestation and 2 from 90 days of
gestation) and 10 controls (5 from 60 days of gestation and 5 from 90 days of gestation), the
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qualitative classification was the same utilized by ARTONI et al (2007). The tissues were
snap-frozen or formalin fixed. The parcial results in both grups and gestacional ages in the
TUNEL reaction and PCNA showed co-localization in trophoblast epithelium, trophoblast
giant cell (TGC) and glandular epithelium of the endometrium. In addition, PCNA stained
was in endothelial cells and mesenchyme also, while the endometrial stroma showed weak
signals. However, staining for TUNEL and PCNA were positive in placentomes from SCNT
and control pregnancies, and stronger in the clones, causing an imbalance in the correlation
between apoptosis X proliferation. We conclude that apoptosis and cell proliferation in
maternal stroma and fetal mesenchyme plays an important role in the bovine placentation and
may be involved in the regulation of the proliferation and differentiation of uterine epithelium
and trophoblast.
Key Words: Apoptosis; cell proliferation; placenta; cloned cattle; GFP.
ITRODUÇÃO
A apoptose é definida morfologicamente como morte celular fisiológica e ocorre
durante o desenvolvimento embrionário com homeostase normal do tecido; ocorre também na
oncogênese, e, em conseqüência de insultos tóxicos.
Green; Reed (1998) e Desagher; Martinou (2000), relatam que uma grande variedade
de eventos da apoptose estão localizados na mitocôndria, incluindo a liberação de ativadores
de caspases (como o citocromo c), mudanças no transporte de elétrons, perda do potencial de
transmembrana mitocondrial, oxidação-redução celular alterada, e participação da família de
proteínas pró- e anti-apoptóticas Bcl-2. Os diferentes sinais que convergem na mitocôndria
para acionar ou inibir estes eventos e seus efeitos, delineiam os maiores caminhos na morte na
morte celular fisiológica, sendo que depende do tipo da célula e da natureza do dano celular,
vários sinais moleculares que convergem na mitocôndria, onde são integrados pelas proteínas
da família do Bcl-2.
Pampfer et al. (1999) relatam que a apoptose é detectada na massa celular interna da
pré-implantação tardia de embriões tendo como resultado um processo eliminatório, que
mantém a linhagem das células embrionárias retirando o excedente de células com
disfunções. Esta também é encontrada no centro epiblástico dos embriões pós-implantados
prematuramente formando a cavidade pró-amniótica. As células da massa celular interna
(MCI) aparecem menos resistentes para o rompimento do que as células trofoectodérmicas, e
as decorridas observações sugerem que uma estimulação excessiva da apoptose seja
provavelmente um dos mecanismos que levam à depleção seletiva da MCI no estágio de
blastocisto (PAMPFER, 2000).
Muitas células em processo de morte celular, muito possivelmente por apoptose
foram encontradas no epitélio uterino dos búfalos, mas nenhum indício de formação de
sincício foi observado segundo as observações encontradas nos trabalhos de Carvalho et al.,
(2005) e Pereira et al. (2008).
Em relação à proliferação celular, Yamauchi et al. (2003) consideram que a
atividade proliferativa das células do estroma na região caruncular (CAR) aumenta
rapidamente durante a implantação. Fatores responsáveis pela indução desta rápida
proliferação da CAR talvez derivem do concepto, já que a proliferação celular não ocorre em
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úteros não gestantes de vacas, mas pouco se sabe sobre o potencial proliferativo dessas
células no endométrio bovino. Sabe-se bem que a proliferação da célula progride através das
moléculas regulatórias do ciclo celular, ciclinas e quinases ciclina-dependentes (CDKS).
Ciclinas e CDKs tem formas complexas de associações com seu parceiro correspondente, e a
forma ativada destas moléculas tem um papel crítico na progressão do ciclo celular,
resultando na proliferação celular. Ciclinas-G1 tal como a D1 e E-ciclinas são essencialmente
importantes para a progressão de G1/S no ritmo proliferativo normal do endométrio e no
desenvolvimento da placenta humana. As moléculas regulatórias do ciclo celular estão
potencialmente envolvidas no rápido desenvolvimento da CAR depois da implantação em
ruminantes.
Sendo assim, nossa finalidade foi analisar a correlação da apoptose e proliferação
celular nas gestações de conceptos clonados, utilizando-se a proteína fluorescente verde
(GFP) no estudo de animais manipulados em laboratório, e gestações naturais de bovinos
como controle.
MATERIAL E MÉTODOS
Fibroblastos fetais que expressavam o gene da GFP foram utilizados como doadores
de núcleo para a clonagem por transferência de núcleo de célula somática (SCNT) e, como
controle, gestações naturais por inseminação artificial. As técnicas de Histologia e
Imunohistoquímica (TUNEL-apoptose e PCNA-proliferação) foram realizadas em
placentônios e úteros de 5 clones (3 com 60dg e 2 com 90dg) e 10 controles (5 com 60dg e 5
com 90dg). A classificação qualitativa foi a mesma utilizada por Artoni et al (2007). Os
tecidos foram congelados em nitrogênio líquido ou fixados em formalina.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em ambos os grupos e idades gestacionais das reações de TUNEL e PCNA
apresentaram co-localização no epitélio trofoblástico, células gigantes trofoblásticas (TGC) e
no epitélio glandular do endométrio. A reação de PCNA marcou tanto as células endoteliais,
quanto o mesênquima, enquanto que o estroma endometrial mostrou sinais fracos. Entretanto,
as marcações de TUNEL e PCNA foram positivas nos placentônios de SCNT e gestações
controle, e foram mais fortes nos clones, causando um desbalanço na correlação entre
apoptose X proliferação, o que corrobora com Yamauchi et al. (2003) e Pereira et al. (2008).
COCLUSÃO
Mediante a metodologia utilizada, pôde-se concluir que, a apoptose e a proliferação
celular no estroma endometrial e no mesênquima fetal, desempenham um papel importante na
placentação bovina e podem estar envolvidas na regulação da proliferação e diferenciação do
epitélio uterino e trofoblástico.
REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARTONI, L.P. et al. Fator de crescimento fibroblástico básico e seus receptores em relação à
atividade proliferativa na placenta bubalina em diferentes fases da gestação. Arquivo
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Uteroferrin and erythrophagocytosis (enviado para publicação). Journal of Morphology,
2008 (submitted).
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