universidade federal de minas gerais
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE LEVEDURAS ISOLADAS DE MADEIRA EM DECOMPOSIÇÃO DO ARQUIPÉLAGO DAS ILHAS GALÁPAGOS (EQUADOR) María Cristina Guamán Burneo Belo Horizonte 2013 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE LEVEDURAS ISOLADAS DE MADEIRA EM DECOMPOSIÇÃO DO ARQUIPÉLAGO DAS ILHAS GALÁPAGOS (EQUADOR) María Cristina Guamán Burneo Belo Horizonte 2013 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 2 María Cristina Guamán Burneo PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE LEVEDURAS ISOLADAS DE MADEIRA EM DECOMPOSIÇÃO DO ARQUIPÉLAGO DAS ILHAS GALÁPAGOS (EQUADOR) Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia. Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais Coorientadores: Prof. Dr. Silvio Silvério da Silva Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – Lorena Prof. Dr. Javier Carvajal Barriga Pontificia Universidad Católica del Ecuador Belo Horizonte 2013 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG iii 043 Burneo, María Cristina Guamán. Produção de xilitol a partir de leveduras isoladas de madeira em decomposição do arquipélago das Ilhas Galápagos (Equador) [manuscrito] / María Cristina Guamán Burneo. – 2013. 124 f.: il. ; 29,5 cm. Orientador: Carlos Augusto Rosa. Co-orientadores: Silvio Silvério da Silva, Javier Carvajal Barriga. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas. 1. Xilitol – Teses. 2. Levedos – Teses. 3. Bagaço da cana – Teses. 4. Hidrolisado hemicelulósico. 5. Microbiologia – Teses. 6. Galápagos, Ilhas Programa de- Pós-graduação emCarlos Microbiologia da UFMG (Equador) Teses. I. Rosa, Augusto. II. Silva, Silvio Silvério da. III. ii Barriga, Javier Carvajal. IV. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. V. Título. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG iii A mi querida familia, por ser mi guía, mi apoyo, mi fuerza y mi ejemplo de lucha y amor constante Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG iv AGRADECIMENTOS Façamos da interrupção um caminho novo. Da queda um passo de dança, do medo uma escada, do sonho uma ponte, da procura um encontro! Fernando Sabino Ao meu Senhor, pelo dom da vida, pelas oportunidades e pelas pessoas que tenho encontrado nesta minha caminhada. Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia da UFMG, pela oportunidade da realização do mestrado. Ao meu orientador, Carlos Rosa, pela paciência, pelos conselhos e pelo apoio. Além das orientações científicas, ele me ensinou, com seu exemplo, virtudes que serão sempre valiosas na minha vida profissional e pessoal. À Escola de Engenharia de Lorena/ USP, pela oportunidade de aprender e poder realizar parte dos experimentos no Laboratório de Microbiologia Aplicada e Biotecnologia. Ao meu coorientador, professor Silvio Silvério, pela confiança, pelas sugestões, pela amizade e pelo incentivo no desenvolvimento do mestrado. Ao professor e amigo Javier Carvajal, pelo estímulo e torcida durante minha vida acadêmica, pelos ensinamentos, pela força e pelo carinho durante estes anos. À minha família, pelo amor de sempre. Apesar da distância, sempre pude contar com seu apoio, sua confiança, seus conselhos e sua força, o que me ajudou a continuar nos momentos difíceis, assim como seu carinho fez o meu caminho mais leve. À Tássia (Fofis!), pelo grande apoio e pela amizade. Mais que minha colega de apartamento, tornou-se minha irmã, aquela pessoa que compartilha minhas alegrias, e com paciência e carinho me ajuda “arrumar minhas bagunças”. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG v Ao pessoal do Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e Biotecnologia de Fungos, pelo agradável convívio dentro e fora do laboratório, pela amizade e pelo incentivo durante todo este tempo. Em especial a minhas “curicas” Bárbara, Sil, MariZé, Mona, Larissa (Té), Camila (s), Rê, Fran e Iara. Obrigada à Adri, Fer Piló, Laurinha, Carla, Luiz e Lú, pela amizade e pelos conselhos. Às minhas irmãs Mari Rocha, pela força, pela meiguice e pelo carinho. E a minha querida hermanita del alma, Raquel, por ser meu anjo protetor, porque apesar da distância nunca deixou de me aconselhar, de dar animo e ajudar no que fosse preciso, não tenho palavras para agradecer todo o que recebi de vocês neste tempo. A Karine e Elisa, que acompanharam meu caminho e sempre me incentivaram a continuar. Ao pessoal da dança, pela companhia, pela amizade, pelo apoio e pela alegria; vocês complementaram minha vida e fizeram-na mais feliz. Obrigada aos salseiros, em especial ao Clarindo, Stephie, Andréa, Agnaldo, Zé Marcos, Alessandra, Creuzinha, Ana Paula e Fernando, por terem se tornado minha família durante esta caminhada, por serem meus anjos, meus grandes amigos. Ao pessoal da EEL/Lorena, em especial à Kelly, pelas dicas, pela paciência e, sobretudo, pela amizade. Ao meu grande amigo Paulo, pela acolhida, pelos conselhos, pelo apoio e pelo carinho. A Adriana, Ellen, Samira (s), Bruna, Otavio, Larissa e Jú, pelo agradável convívio durante minha estadia no laboratório. Aos amigos “lorenenses” Isabela, Dayelle, Babi, Mayara, Bela, Fernanda, Felipe e Priscila Arruda, pelos conselhos e pela amizade. Aos intercambistas, pelas experiências compartilhadas, pela força e pelos momentos agradáveis, em especial a José Luis, Paola, Germana, Winnie e Sam. Às amigas de sempre, Yani, Mapri, Nory e Dianita, e às minhas primas que tanto amo, MaGus e Anita, obrigada por fazerem da distância só um pretexto para encontrar novos jeitos de conversar, de nos apoiar e de expressar o carinho que temos entre nós. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG vi Ao SENESCYT (Secretaria Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación del Ecuador), pelo financiamento do meu mestrado. A todos aqueles que fizeram possível a realização deste trabalho, por me ensinar que os sonhos são simplesmente as pontes para a felicidade. O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis e pessoas incomparáveis. Fernando Pessoa Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG vii SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... XI LISTA DE SÍMBOLOS ............................................................................................. XIII LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... XIV LISTA DE TABELAS ................................................................................................ XV LISTA DE APÊNDICES ........................................................................................... XVI LISTA DE ANEXOS ............................................................................................... XVII RESUMO ….. ........................................................................................................ XVIII 1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ..................................................................... 1 2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 3 2.1 Propriedades físico químicas do xilitol ................................................... 3 2.2 Aplicações do xilitol ................................................................................ 4 2.2.1 Uso como adoçante e propriedades anticariogênicas ................ 4 2.2.2 Metabolismo insulina-independente ............................................ 4 2.2.3 Outros usos potenciais................................................................ 5 2.3 Tolerância e toxicidade do xilitol ............................................................ 6 2.4 Ocorrência e obtenção do xilitol ............................................................. 7 2.6 Produção Biotecnológica...................................................................... 10 2.6.1 Resíduos lignocelulósicos como material para obtenção de soluções de D-xilose ............................................................................ 10 2.6.2 Bagaço de cana-de-açúcar como substrato para obtenção de soluções contendo D-xilose ................................................................. 12 2.6.3 Processo de hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos ........ 13 2.6.4 Bioconversão de D-xilose em xilitol por micro-organismos ....... 16 3 OBJETIVOS.................................................................................................... 19 3.1 Objetivo geral ....................................................................................... 19 3.2 Objetivos específicos ........................................................................... 19 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG viii 4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 20 4.1 Seleção de micro-organismos .............................................................. 20 4.1.1 Áreas de coleta ......................................................................... 20 4.1.2 Coleta, processamento e preservação dos micro-organismos . 21 4.2 Identificação das leveduras por análises fisiológicas e moleculares .... 22 4.2.1 Extração de DNA ...................................................................... 22 4.2.2 Agrupamento das leveduras por PCR-Fingerprinting ............... 23 4.2.3 Amplificação do domínio D1/D2 da subunidade maior do gene do rRNA ............................................................................................... 23 4.2.4 Amplificação da região ITS (Espaçador Interno Transcrito) ...... 24 4.2.4 Purificação dos produtos de PCR e reação de sequenciamento25 4.3 Seleção de leveduras para produção de xilitol a partir de D-xilose ...... 26 4.3.1 Avaliação das leveduras assimiladoras de D-xilose ................ 26 4.3.2 Seleção das leveduras produtoras de xilitol .............................. 26 4.4 Ensaios de fermentação em meio semi-sintético com D-xilose e em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar ................... 26 4.4.1 Determinação do inóculo inicial ................................................ 27 4.4.2 Fermentação em meio semi-sintético contendo D-xilose .......... 28 4.4.3 Preparo do bagaço de cana-de-açúcar para a hidrólise ........... 28 4.4.4 Obtenção e caracterização do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar................................................................... 29 4.4.5 Detoxificação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de canade-açúcar ............................................................................................. 29 4.4.6. Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de canade-açúcar em escala de bancada ........................................................ 30 4.4.7 Fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar em biorreator .............................................................. 30 4.5 Métodos analíticos ............................................................................... 31 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG ix 4.5.1 Determinação de carboidratos, ácidos orgânicos, furfural e 5hidroximetilfurfural ................................................................................ 31 4.5.2 Determinação dos parâmetros cinéticos fermentativos............. 32 4.5.3 Determinação do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio ................................................................................................ 34 4.5.4 Análises estatísticas.................................................................. 34 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 36 5.1 Identificação das leveduras e seleção de micro-organismos assimiladores de D-xilose .................................................................... 36 5.2 Seleção de leveduras para produção de xilitol a partir de D-xilose ...... 45 5.2.1 Avaliação das leveduras assimiladoras de D-xilose e seleção das leveduras produtoras de xilitol .............................................................. 45 5.3 Ensaios de fermentação em meio com D-xilose e em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar ..................................... 49 5.3.1 Fermentação em meio semi-sintético contendo D-xilose ............ 49 5.3.2 Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de canade-açúcar em escala de bancada ........................................................ 53 5.3.3 Compostos tóxicos liberados no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar................................................................... 60 5.3.4 Fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar em biorreator .............................................................. 63 6 CONCLUSÕES ............................................................................................... 71 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 73 APÊNDICES.............................................................................................................. 85 ANEXOS …………………….……………………………………………………………. 98 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG x LISTA DE ABREVIATURAS ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATP Adenosina trifosfato CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLQCA Colección de Levaduras Quito Católica CMC Carboximetilcelulose DNA Ácido desoxirribonucleico DO Densidade Óptica FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA Food and Drug Administration GRAS Generally Regarded As Safe HMF 5-hidroximetil-2-furaldeido kg h-1 Quilograma por hora KM Constante de Michaelis M Concentração molar MSP-PCR Micro/Minisatellite-Primed PCR NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo-Fosfato nm nanômetro PCR Reação em cadeia da polimerase PUCE Pontificia Universidad Católica del Ecuador SENESCYT Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación (Equador) Qp Produtividade volumétrica vvm Volume de ar/volume de meio/minuto XDH Xilitol desidrogenase XI D-xilose isomerase XK D-xiluloquinase XR D-xilose (aldose) redutase WHO World Health Organization YNB Yeast Nitrogen Base Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xi YM Yeast extract - Malt extract medium Yp/s Fator de conversão de xilose em xilitol Yx/s Fator de conversão de substrato em biomassa UNESCO Organização das Nações Unidas para a Educação, a Ciência e a Cultura m micrômetro Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xii LISTA DE SÍMBOLOS ® marca registrada ™ marca comercial Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xiii LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Fluxogramas das tecnologias disponíveis para produção de xilitol a partir de hidrólise ácida do material lignocelulósico.............................................................. 8 Figura 2 – Esquema do fracionamento dos principais componentes dos materiais lignocelulósicos após procedimento de hidrólise....................................................... 11 Figura 3 – Reações e produtos formados durante o processo de hidrólise de materiais lignocelulósicos. ......................................................................................... 14 Figura 4 – Vias metabólicas da glicose e xilose em leveduras. ................................ 17 Figura 5 - Distribuição do número de espécies de leveduras nos locais de coleta. .. 37 Figura 6 - Impressão digital do DNA utilizando o iniciador EI-1 para discriminação dos isolados das espécies Pichia manshurica, Candida (Yamadazyma) trypodendroni e Galactomyces geotrichum. .............................................................. 43 Figura 7 - Impressão digital do DNA utilizando o iniciador EI-1 para discriminação dos isolados de leveduras das espécies Candida (Kurtzmaniella) natalensis, Zygowilliopsis californica e Candida (Saturnispora) silvae. ....................................... 43 Figura 8 - Impressão digital do DNA utilizando o iniciador EI-1 para discriminação dos isolados das espécies Candida (Lodderomyces/Spathaspora) tropicalis, Candida sinolaborantium, Torulaspora delbrueckii, Debaryomyces nepalensis e Issatchenkia terricola...................................................................................................................... 44 Figura 9 – Concentração de xilose (-- --), glicose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- --), glicerol (-- --) e xilitol (-- --) em g.L-1 por Candida tropicalis CLQCA24F-125 em biorreator. .............................................................................................. 65 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xiv LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Matérias-primas para produção de xilitol e linhagens de leveduras utilizadas para produção deste poliálcool .................................................................. 12 Tabela 2 - Identificação das espécies, código dos isolados e assimilação de D-xilose pelas leveduras obtidas neste trabalho a partir de amostras de madeira em decomposição coletadas no arquipélago de Galápagos, Equador............................ 38 Tabela 3 - Produção (mM) e concentração (g.L-1) de xilitol e etanol no ensaio de fermentação de D-xilose em tubos com meio YPX ................................................... 47 Tabela 4 - Produção de xilitol [Yp/s (g.g-1)], rendimento de xilitol [Qp (g.L-1.h-1)], produtividade de xilitol [Yx/s (g.g-1)], conversão de substrato em biomassa [ (%)], eficiência de conversão e consumo de D-xilose (%), produção de biomassa, etanol e xilitol (g.L-1) e tempo de fermentação (h) em experimentos de fermentações em meio semi-sintético com D-xilose para as leveduras testadas. .......................................... 50 Tabela 5 - Produção de xilitol [Yp/s (g.g-1)], rendimento de xilitol [Qp (g.L-1.h-1)], produtividade de xilitol [Yx/s (g.g-1)], conversão de substrato em biomassa [ (%)], eficiência de conversão e consumo de D-xilose (%), produção de biomassa, etanol e xilitol (g.L-1) e tempo de fermentação (h), em fermentações em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar pelas leveduras testadas.................. 55 Tabela 6 - Composição dos hidrolisados antes e após os procedimentos de concentração e destoxificação por alteração de pH combinado à absorção em carvão vegetal ativado................................................................................................61 Tabela 7 - Parâmetros fermentativos obtidos para Candida tropicalis CLQC-24F-125 durante experimentos de fermentação com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar em biorreator....................................................................................65 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xv LISTA DE APÊNDICES Apêndice 1 – Identificação das espécies, código das amostras, meio de cultura para isolamento e número de amostra das leveduras isoladas do Arquipélago de Galápagos, Equador...................................................................................................85 Apêndice 2 – Sequências dos domínios D1/D2 e região ITS do isolado Lindnera sp. CLQCA-24SC-025......................................................................................................89 Apêndice 3 - Concentração de xilose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- -) e xilitol (-- --) em g.L-1 ao longo do ensaio de fermentação em meio semi-sintético com D-xilose como fonte de carbono.........................................................................90 Apêndice 4 - Concentração de xilose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- -) e xilitol (-- --) em g.L-1 ao longo do ensaio de fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar...........................................................91 Apêndice 5 - Parâmetros fermentativos de produção de xilitol em fermentações feitas em frascos Erlenmeyer com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar, de acordo com os tempos de amostragem do ensaio, para as leveduras testadas......................................................................................................................92 Apêndice 6 – Análise estatísticas para as variáveis de produção de xilitol, etanol e consumo de xilose e para os fatores de fermentação Yp/s e eficiência obtidas da fermentação das espécies testadas em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar...........................................................................................................93 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xvi LISTA DE ANEXOS Anexo 1 – Pontos de coleta das amostras de madeira em decomposição no Arquipélago das Ilhas Galápagos...............................................................................98 Anexo 2 – Certificado Zoosanitario para la exportación do Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca do Equador, e autorização do Ministerio del Ambiente para exportação das amostras de leveduras.............................................99 Anexo 3 – Ilustração do sistema do fermentador de 2,4 L empregado nas fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por Candida (Lodderomyces/ Spathapora) tropicalis e Lindnera sp..............................101 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xvii RESUMO O xilitol é um poliálcool de alto valor agregado devido ao poder adoçante semelhante ao da sacarose. Apresenta propriedades anticariogênicas e metabolismo insulina-independente, o que garante sua aplicação nas indústrias alimentícia e farmacêutica. Além disso, o xilitol é utilizado na área clínica, principalmente no tratamento da osteoporose e de doenças respiratórias. A obtenção do xilitol por via biotecnológica utilizando resíduos agroindustriais é uma alternativa sustentável e economicamente viável, comparada com o processo químico tradicionalmente utilizado. Sendo assim, a extração por via biotecnológica se baseia na utilização de micro-organismos e, ou, enzimas que permitam a liberação da D-xilose a partir de hidrolisados hemicelulósicos. Um dos principais materiais lignocelulósicos que geram produtos de valor agregado, como o xilitol, é o bagaço de cana-de-açúcar, matéria-prima disponível em abundância no Brasil e em outros países. A bioconversão da D-xilose nesse poliálcool mediante o emprego de leveduras é possível, uma vez que o xilitol é um produto intermediário da via metabólica da D-xilose. O presente trabalho teve como objetivo a prospecção e a seleção de espécies de leveduras produtoras de xilitol para serem utilizadas em processos fermentativos, empregando hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar como substrato. Foram testadas 140 leveduras provenientes de 35 amostras de madeira em decomposição coletadas nas ilhas Florena, Santa Cruz e Isabela, pertencentes ao arquipélago das Ilhas Galápagos, Equador. Os meios de cultura utilizados para o isolamento dessas leveduras foram Yeast Nitrogen Base (YNB)-D-xilose, carboximetilcelulose e YNB-xilana. As espécies do gênero Candida (incluindo isolados relacionados aos clados Yamadazyma, Kazachstania, Kurtzmaniella, Lodderomyces/Spathaspora, Metschnikowia e Saturnispora) foram as mais frequentemente isoladas neste estudo. Candida (Lodderomyces/Spathaspora) tropicalis foi identificada como a espécie predominante, seguida por Kazachstania unispora, Candida (Kurtzmaniella) natalensis, Zygowilliopsis californica e Candida sinolaborantium. Em testes de fermentação utilizando meio semi-sintético com Dxilose (50 g.L-1), C. tropicalis CLQCA-24SC-125 foi a linhagem com maior produção de xilitol, com fator de rendimento (Yp/s) de 0,67 g.g-1 e produtividade (Qp) de 0,34 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xviii g.L-1.h-1. Em fermentações com hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar como substrato, essa levedura apresentou também a maior produção de xilitol, com o mesmo fator de rendimento de 0,67 g.g-1 e produtividade de 0,38 g.L-1.h-1. Uma nova espécie de Lindnera, representada pela linhagem CLQCA-24SC-025, foi a segunda com melhores resultados para produção de xilitol em hidrolisado de cana-de-açúcar, com Yp/s de 0,64 g.g-1 e Qp de 0,33 g.L-1.h-1. Em fermentador de 2,4 L, utilizando hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar suplementado, C. tropicalis CLQCA-24SC-125 apresentou os melhores resultados, com produção de 37,2 g.L-1 de xilitol em 96 horas de fermentação, com um Yp/s de 0,83 g.g-1, Qp de 0,39 g.L-1.h-1, eficiência total do 90,9% e Yp/x de 12,53 U.g-1 de células. Esse resultado indicou que as condições empregadas de disponibilidade de oxigênio e agitação foram as melhores para essa levedura. Os resultados do presente estudo apontam o potencial biotecnológico das leveduras isoladas a partir de madeira em decomposição do arquipélago de Galápagos para produção de xilitol a partir de cultivos realizados em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xix ABSTRACT Xylitol is a polyol with high added value due to the sweeteness similar to sucrose with anticariogenic properties and insulin metabolism independent that guarantee its application in food and pharmaceutical industries. In addition, it is mainly used in clinic treatment of osteoporoses and respiratory diseases. It is currently produced by chemical catalysis of the xylose from lignocellulosic residues. However, this process needs expensive purification steps to obtain pure xylitol. Alternatively, it can be produced by biotechnological methods, using micro-organisms or enzymes, which allowing the release of D-xylose from hemicellulosic hydrolysates. A major lignocellulosic material that generates value-added products, such as xylitol, is the sugarcane bagasse, raw material available in abundance in Brazil and other countries. Bioconversion of D-xylose in this polyalcohol by the use of yeasts is possible, since the xylitol is an intermediate product of the metabolic pathway of Dxylose. In this context, the present study aimed the screening and selection of yeast species to fermentation processes using sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysates for xylitol production. A total of 140 yeast strains were isolated from 35 rotting wood samples collected in the islands Florena, Santa Cruz and Isabela, belonging to the Galápagos Archipelago, Equador. These samples were cultured in Yeast Nitrogen Base (YNB)-D-xilose, carboxymethyl cellulose and YNB-xylan media. Species of the genus Candida (including isolates related to the clades Yamadazyma, Kazachstania, Kurtzmaniella, Lodderomyces/Spathaspora, Metschnikowia and Saturnispora) were predominant in this study. Candida (Lodderomyces/Spathaspora) tropicalis followed by Kazachstania unispora, Candida (Kurtzmaniella) natalensis, Zygowilliopsis californica and Candida sinolaborantium were the most frequently isolated yeasts. In semi-synthetic fermentation assays using D-xylose (50 g.L-1) culture medium, C. tropicalis CLQCA-24SC-125 show the highest xylitol production yield (Yp/s: 0.67 g.g-1) and a productivity (Qp: 0.34 g.L-1.h-1). Furthermore, in fermentations with sugarcane bagasse hydrolysates as a substrate, this yeast showed the highest production of xylitol with the same yield of 0.67 g.g-1 and a productivity of 0.38 g.L-1.h-1. Whereas, the second species had better results for xylitol production in sugarcane hydrolysates it was a new Lindnera species, Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xx represented by strain CLQCA-24SC-025, with Yp/s of 0.64 g.g-1 and Qp 0.33 g.L-1.h-1. In 2.4 L bioreactor using sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysates, C. tropicalis CLQCA-24SC-125 showed the best results, with a production of 37.15 g.L-1 in xylitol in 96 h of fermentation, with an Yp/s of 0.83 g.g-1, Qp of 0.39 g.L-1.h-1, total efficiency of 90.9% and Yp/x of 12,53 U.g-1 cells. This study demonstrates the biotechnological potential of yeasts isolated from decaying wood of the Galapagos Archipelago for xylitol production using sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysates. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG xxi 1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA Nos últimos anos, a biotecnologia tem dado enfoque à obtenção de produtos de importância comercial a partir de biomassa agroindustrial residual, devido ao seu baixo custo. Um dos principais produtos obtidos a partir desses substratos é o xilitol, um poliálcool com características importantes, como alto poder adoçante, propriedades anticariogênicas e metabolismo insulina-independente, o que permite sua aplicação nas indústrias alimentícia e farmacêutica. O xilitol encontra-se amplamente distribuído na natureza, porém em baixas concentrações em plantas e frutas, o que torna sua extração a partir desses substratos inviável economicamente. O interesse na obtenção desse poliálcool a partir de resíduos agroindustriais tem aumentado nos últimos anos, uma vez que esses resíduos representam fontes abundantes e não dispendiosas de carboidratos (celulose e hemicelulose), com potencial aplicação em processos de conversão química ou microbiana em produtos de interesse comercial. O bagaço de cana-de-açúcar é um dos principais resíduos de materiais agroindustriais utilizados para geração de vapor e calor nas indústrias, além de ser usado nas indústrias de açúcar e álcool. O Brasil é o maior produtor de cana no mundo, seguido pela Índia e pela China. Considerando que cada tonelada de cana processada gera 140 kg de bagaço seco de cana, pode-se estimar, dependendo da safra, que sejam produzidas mais de 80 milhões de toneladas anuais de bagaço com potencial de serem utilizadas em inúmeros processos industriais. Em grande escala, o xilitol é produzido mediante processos químicos por hidrogenação catalítica da xilose presente nos hidrolisados, mas essa metodologia demanda processos caros para purificação da solução de xilose requerida para a catálise, bem como para remoção do catalisador metálico e purificação do xilitol, o que torna o procedimento dispendioso e, em alguns casos, de baixo rendimento. Neste sentido, a conversão por via biotecnológica da D-xilose presente em hidrolisados lignocelulósicos mediante o uso de micro-organismos e, ou, enzimas é possível, por ser o xilitol um produto intermediário da via metabólica da D-xilose nas leveduras, representando, assim, uma alternativa promissora para Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 1 obtenção desse poliol, com a vantagem adicional de não serem necessárias as etapas de purificação inicial desse açúcar, como as requeridas no processo químico. Vários pesquisadores têm estudado o aproveitamento de resíduos agroindustriais e desenvolvido estratégias de processamento eficiente para utilização dessa biomassa, o que resulta em baixo impacto ambiental e em alta rentabilidade econômica. O processo de fracionamento do material lignocelulósico para aproveitamento por micro-organismos, a determinação das melhores condições dos processos fermentativos e avaliação dos procedimentos de recuperação do xilitol do meio fermentado têm sido estudados para obter soluções que possam ser utilizadas na bioconversão de resíduos lignocelulósicos em produtos de valor comercial. Entretanto, um dos principais problemas da bioconversão da xilose presente no hidrolisado dos materiais lignocelulósicos, após processos fermentativos, é a presença de compostos tóxicos aos micro-organismos, os quais podem ser removidos, por exemplo, por tratamentos de alteração de pH, adsorção em carvão ativo, utilização de resinas de troca iônica, polímeros vegetais, entre outros. Um grande desafio no desenvolvimento da tecnologia de produção de xilitol por via biotecnológica é a busca de micro-organismos assimiladores de D-xilose que produzam esse poliálcool. As linhagens existentes ainda apresentam algumas limitações em fermentações de hidrolisados ácidos de resíduos lignocelulósicos e baixa tolerância aos compostos tóxicos presentes nesse tipo de substrato. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi a prospecção e a seleção de espécies de leveduras com capacidade de fermentar D-xilose produzindo xilitol, para serem avaliadas em processos fermentativos em escala de bancada e em biorreator, utilizando o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar como substrato. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 2 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Propriedades físico químicas do xilitol O xilitol é um poliálcool que apresenta várias aplicações clínicas, farmacêuticas e alimentícias, com poder adoçante semelhante ao da sacarose e superior ao de polióis comuns, além de ter valor calórico reduzido de 2,4 kcal g-1. O metabolismo do xilitol é insulina independente, podendo ser tolerado por diabéticos. Representa um composto cariostático, por não ser metabolizado por microorganismos da microbiota bucal, razão pela qual é usado na fabricação de doces e enxagues bucais. Clinicamente pode ser usado para prevenção da otite média aguda, pois inibe o crescimento e a adesão de Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae em células da nasofaringe, entre outras aplicações (SAMPAIO, 2001; GRANSTRÖM, 2002; MUSSATTO & ROBERTO 2002; OOI; MARKUSZEWSKI, 2002; LIMA, 2006; JUCOSKI et al., 2007). A fórmula molecular do xilitol é C5H12O5 e a massa molecular é 152,15 g.mol-1. Trata-se de um pó branco, cristalino, sem odor, altamente solúvel em água (64,2 g 100 mL-1), com ponto de fusão na faixa de 93,4 a 94,7 °C e ponto de ebulição de 216 °C (TAMANINI & OLIVEIRA, 2004; FREITAS, 2010). Esse poliol é 2,4 vezes mais doce que o manitol e duas vezes mais doce que o sorbitol (SILVA et al., 1994; TAMANINI & OLIVEIRA, 2004). O calor de solução endotérmico é elevado (34,8 cal.g-1), o que produz um agradável efeito refrescante na boca, quando entra em contato com a saliva (MUSSATTO & ROBERTO, 2002; MICKENAUTSCH & KUZMANOVA, 2007). Uma das principais vantagens do xilitol sobre a sacarose é sua elevada estabilidade química e microbiológica, podendo atuar em baixas concentrações como conservante de produtos alimentícios, oferecendo resistência ao crescimento de micro-organismos (MUSSATTO & ROBERTO, 2002). Outra característica do xilitol é que, devido à ausência de grupos aldeídos ou cetônicos na molécula, este poliálcool não participa de reações com aminoácidos, conhecidas como reações de Maillard. Sendo assim, não sofre escurecimento nos alimentos nem diminuição do valor nutricional das proteínas, o que possibilita seu uso na indústria alimentícia no Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 3 processamento de produtos em que essas reações são indesejáveis (MUSSATTO & ROBERTO, 2002; TAMANINI & OLIVEIRA, 2004). 2.2 Aplicações do xilitol 2.2.1 Uso como adoçante e propriedades anticariogênicas O xilitol tem atividade cariostática ao inibir o crescimento de bactérias orais como Streptococcus mutans. A ação desse poliálcool consiste na redução de formação de placas bacterianas e, consequentemente, das cáries. As bactérias, em condições ácidas, produzem uma grande quantidade de ácido lático e sintetizam polissacarídeos extracelulares, que aumentam a adesão da placa bacteriana na superfície dos dentes (MÄKINEN, 1979; KANDELMAN, 1997; SOUZA, 2007). Outra função do xilitol é que este estimula a salivação, produzindo aumento da concentração dos íons de cálcio e fosfato, importantes na remineralização dos dentes e reversão de cáries em estágio inicial (MUSSATTO & ROBERTO, 2002; BONFADA & LORA, 2010). Devido a essas características, o xilitol é muito usado na indústria para fabricação de doces, e como aditivo nos enxagues bucais, pois ajuda a estimular o fluxo da saliva e eleva o pH da placa bucal, portanto neutraliza os ácidos produzidos por alimentos fermentescíveis, melhorando a capacidade de tamponamento e a atividade bacteriostática da saliva (KANDELMAN, 1997). 2.2.2 Metabolismo insulina-independente O controle da taxa de glicose no sangue em indivíduos com Diabetes mellitus tipo I ou II é de grande importância. Em comparação com outros açúcares, o xilitol é tolerado por diabéticos, pois não dependente de insulina para ser metabolizado (BARBOSA, 2009). Nenhuma das duas principais vias de absorção do xilitol (absorção direta pelo fígado e metabolismo indireto por bactérias da microbiota intestinal) é mediada pela insulina. Toda glicose proveniente do metabolismo do xilitol é inicialmente estocada como glicogênio no fígado, que depois é liberado gradualmente. Desse modo, sua Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 4 concentração não sofre alterações bruscas causadas pela sacarose e pela glicose, o que faz desse açúcar apropriado para diabéticos (MUSSATTO & ROBERTO, 2002). 2.2.3 Outros usos potenciais O xilitol, além de poder ser utilizado como ingrediente alimentar, possui várias aplicações clínicas, sendo indicado para tratar diabetes, anemia hemolítica, desordem no metabolismo de lipídeos e lesões renais e parenterais, bem como para prevenir otite, infecções pulmonares e osteoporose. Apesar de alguns desses estudos ainda estarem em andamento, os resultados obtidos já permitem uma análise global dos possíveis benefícios da administração de xilitol em pacientes com diversos tipos de patologias (MUSSATTO & ROBERTO, 2002). Pacientes com anemia hemolítica apresentam deficiência da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH), o que causa produção anormal do cofator NADPH. Essa deficiência afeta a forma celular dos eritrócitos pela redução da glutationa, componente dos glóbulos vermelhos. O xilitol ajuda conservar a integridade dos glóbulos vermelhos porque supre as células de NADPH, mediante a oxidação da xilulose, o que mantém a glutationa reduzida (YLIKAHRI, 1979; LIMA & BERLINCK, 2003). Os efeitos do xilitol no tratamento e, ou, na prevenção da osteoporose foram comprovados por Mattila e colaboradores (2005), em pesquisas com animais. Os autores constataram que o xilitol estimula a absorção de cálcio pelo intestino, o que facilita sua passagem do sangue para os ossos. Por outro lado, o aumento de NADH durante o metabolismo desse poliol intensifica o transporte de íons de cálcio através da membrana celular, ativando o processo de calcificação dos ossos e da cartilagem e aumentando a síntese de colágeno (MATTILA et al., 2005). O xilitol também pode ser usado no controle de infecções respiratórias. A superfície interna dos pulmões contém uma fina camada de líquido com substâncias antimicrobianas que atuam como defesa, prevenindo assim as infecções. Segundo Zabner e colaboradores (2000), o xilitol, por ter baixa permeabilidade transepitelial, é pouco metabolizado pelas bactérias e pode diminuir a concentração de sais, o que permite o aumento da atividade antibiótica natural dos pulmões. Por outro lado, o Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 5 xilitol diminui a aderência e o crescimento das bactérias, como Streptococcus pneumoniae, nas células epiteliais, reduzindo a incidência de processos infecciosos como sinusite e outras infecções pulmonares (TAPIAINEN et al., 2000). 2.3 Tolerância e toxicidade do xilitol Atualmente, é expressivo o aumento no número de pessoas que, por motivos diversos, necessitam diminuir ou cessar o consumo diário de sacarose. Portanto, muitos estudos estão sendo feitos a fim de desenvolver produtos que possam atuar como substitutos de açúcares. De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), por meio da RDC no 18, de 3 de dezembro de 1999, o xilitol passou a ser considerado alimento funcional. Um alimento funcional é definido como aquele que, além das funções nutricionais básicas, quando consumido como parte da dieta usual produz efeitos metabólicos, fisiológicos ou efeitos benéficos à saúde, devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica (BRASIL, 1999). Desde 2008, a ANVISA reavaliou as alegações admitidas de alimento funcional com base em evidências científicas, e não foram aprovadas alegações para ingredientes ou componentes dos alimentos, e sim para o produto final que tenha esses ingredientes ou componentes, conforme o item 3.3 da Resolução n o 18/1999. Para o xilitol, o manitol e o sorbitol, a alegação foi aprovada somente para o uso em gomas de mascar sem açúcar. Sendo o xilitol uma substância atóxica, classificada pela Food and Drug Administration (FDA, USA) como um aditivo do tipo GRAS (Generally Regarded As Safe), a incorporação em alimentos é legalmente permitida. A ingestão diária aceitável recomendada pela FAO/WHO (Food and Agriculture Organization / World Health Organization) baseia-se na estimativa de uma quantidade de um aditivo em alimento ou bebida, expressa em miligrama por quilograma de peso corpóreo, que possa ser ingerida sem provocar nenhum risco para a saúde (BARBOSA, 2009). O xilitol é extremamente bem tolerado desde que a quantidade consumida por dia não ultrapasse 60 g, uma vez que a ingestão de doses mais elevadas produz efeito laxativo. O xilitol in vivo não leva à alteração na concentração de triglicerídeos e de colesterol, sendo a diarréia osmótica um dos poucos efeitos colaterais. Por outro lado, a infusão de grandes quantidades de xilitol por meio de dietas parenterais pode Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 6 levar à acidose lática e à formação de cristais de oxalato de cálcio. Assim, a infusão segura é de no máximo 0,25 mg kg-1 h-1 (PARAJÓ, 1998; SAMPAIO, 2001). No entanto, a Organização Mundial da Saúde (OMS) não estabelece limite para ingestão diária aceitável desse edulcorante e a FDA indica que o consumo é permitido na quantidade necessária para atingir o adoçamento desejado (MUSSATTO & ROBERTO, 2002). 2.4 Ocorrência e obtenção do xilitol O xilitol pode ser encontrado na natureza em frutas, legumes, liquens, algas e cogumelos (p. ex., Psalliota campestris); no entanto, sua extração direta não é viável pelas baixas quantidades presentes nesses materiais (900 mg 100 g-1), o que torna o processo de obtenção economicamente inviável. Em mamíferos, o xilitol é um produto intermediário do metabolismo de carboidratos. Um humano adulto pode produzir de 5 a 15 gramas de xilitol por dia em condições metabólicas normais, e a concentração dessa substância no sangue varia de 0,03 a 0,06 mg 100 mL-1 (PARAJÓ et al.,1998; SAMPAIO, 2001; MUSSATTO & ROBERTO, 2002; ARRUDA, 2006). Outra alternativa de extração desse poliálcool é pela hidrogenação da Dxilose presente na biomassa vegetal, seja por via química de hidrolisados de resíduos lignocelulósicos ou por via biotecnológica, por meio de reações enzimáticas ou de fermentações microbianas (Figura 1). O xilitol tem sido identificado como um dos 12 melhores produtos químicos que podem ser produzidos a partir de biomassa agroresidual por via biológica ou química. Esses derivados podem ser transformados em numerosos materiais ou químicos de alto valor (WERPEY & PETERSEN, 2004). A produção de xilitol por processo químico iniciou-se na Finlândia em 1977, por Melaja e Hämäläinen, com a patente no 4008285. O processo para recuperação de xilitol a partir de pentoses liberadas de xilana presente em matérias-primas inclui hidrólise ácida seguida de purificação do hidrolisado por exclusão de íons e de fracionamento cromatográfico, Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 7 Figura 1 – Fluxogramas das tecnologias disponíveis para produção de xilitol a partir de hidrólise ácida do material lignocelulósico. Fonte: adaptada de Mussatto & Roberto (2002). para obter uma solução concentrada de xilose. A solução é hidrogenada utilizando níquel como catalisador, e o xilitol é recuperado por fracionamento cromatográfico utilizando resinas de troca iônica (MELAJA & HÄMÄLÄINEN, 1977). O rendimento do processo químico e a qualidade do xilitol dependem da pureza inicial da solução inicial de D-xilose, uma vez que a presença de impurezas interfere na reação catalítica. Os processos de purificação incluem troca iônica, descoloração ou fracionamento cromatográfico, para remover os subprodutos indesejáveis e obter uma solução de xilose de elevada pureza. Por outro lado, são necessárias várias etapas para remoção de catalisador metálico, que é tóxico para a saúde humana. Após a remoção, a solução de xilitol é concentrada, fracionada por cromatografia e cristalizada para obtenção do produto puro. Desta forma, o custo da produção do xilitol por via química é cerca de dez vezes superior ao da sacarose ou Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 8 do sorbitol (MELAJA & HÄMÄLÄINEN, 1977; PARAJÓ et al.,1998; TAMANINI & HAULY, 2004). Diante desse problema, a conversão biotecnológica de soluções contendo xilose por bactérias, fungos filamentosos, leveduras ou enzimas purificadas capazes de reduzir a D-xilose em xilitol é uma alternativa promissora ao método convencional. A produção microbiológica do xilitol é mais econômica e aplicável para fins industriais, porque a produção microbiana pode ser alcançada sem necessidade de alta pressão, temperatura ou purificação inicial da D-xilose (convertida em xilitol no próprio hidrolisado), além disso, o processo facilita a separação do produto, pois não precisa usar um catalisador metálico (MUSSATTO & ROBERTO, 2002; SAMPAIO et al., 2005; GUO et al., 2006). No entanto, para tornar o processo viável em nível industrial, a bioconversão deve ser rápida, oferecer rendimento elevado e empregar meios de cultura alternativos e baratos que permitam obter resultados comparáveis aos da tecnologia atual. Seja por via química ou biotecnológica, um dos mais complexos passos é a etapa de recuperação do xilitol produzido. Sendo assim, é preciso estabelecer técnicas eficientes e competitivas para tornar o processo biotecnológico economicamente viável. As técnicas mais utilizadas são a cristalização ou precipitação, o uso de membranas e a extração com fluidos supercríticos Esta última técnica (CO2 como solvente adicionado etanol como co-solvente) é um procedimento ambientalmente limpo que tem mostrado grande potencial para extração e purificação de compostos orgânicos. O fluido supercrítico apresenta propriedades físico-químicas intermediárias entre líquido e gás, e sua densidade próxima à dos líquidos aumenta seu poder de solvente; sua elevada difusividade e sua baixa viscosidade acelera a transferência de massa (TRESINARI et al., 2011), permitindo a fácil solubilização do xilitol, tornando-se um processo rápido e eficiente para exclusão da xilose e retenção do xilitol. 2.5 Potencial econômico do xilitol Atualmente, o principal fabricante de xilitol no mundo é a empresa Danisco, da Dinamarca, seguida de empresas chinesas (FRANCESCGIN et al., 2011). O preço desse açúcar-álcool pode custar na faixa de R$200 por 1 kg, se o produto for Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 9 100% puro. Os principais países consumidores de xilitol são os Estados Unidos, o Canadá, a Alemanha, a França e o Japão (GARCÍA, 2005). No Brasil, o xilitol está na fase de introdução e é aprovado como produto dietético pela ANVISA. Em outros países industrializados como Finlândia, Suíça, Alemanha, Canadá, China, França, Estados Unidos, Inglaterra, Japão e México, este é permitido e produzido para uso nas indústrias alimentícia, farmacêutica e de cosmetologia. Em países em desenvolvimento como Equador, poucos registros da importação do xilitol são relatados, e atualmente não existem registros de pesquisas envolvendo o desenvolvimento de tecnologias para obtenção desse produto no país. 2.6 Produção Biotecnológica 2.6.1 Resíduos lignocelulósicos como material para obtenção de soluções de D-xilose A lignocelulose é a biomassa orgânica mais abundante na biosfera, com produção de 10 até 50 x 109 toneladas por ano (CHANDEL et al., 2010). Vários pesquisadores têm direcionado esforços no sentido de desenvolver estratégias para processar essa biomassa com baixo impacto ambiental e que sejam economicamente viáveis, utilizando procedimentos fermentativos ou enzimáticos. As substâncias de interesse industrial produzidas por essas tecnologias incluem combustíveis e solventes (etanol, butanol, 2,3-butanodiol, acetona e 2-propanol), alditóis (xilitol e glicerol) e ácidos orgânicos (ácido lático, acético e butírico) (LEE et al., 1995; ROBERTO et al., 2002; OOI et al., 2002; LIMA, 2006; JUCOSKI et al., 2007). Os processos biotecnológicos, utilizando materiais lignocelulósicos, na maioria dos casos requerem etapas preliminares de preparação do material, como hidrólise química ou enzimática, a fim de liberar os componentes de celulose e as frações de hemicelulose (FONSECA et al., 2011). O maior componente dos materiais lignocelulósicos é a celulose (35-50%), seguida pela hemicelulose (20-35%) e lignina (10-25%); no entanto a concentração desses componentes varia de acordo com o tipo de madeira ou resíduo agroindustrial (SAHA, 2003). Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 10 A celulose é o principal constituinte das paredes celulares das plantas e é encontrada em uma estrutura fibrosa organizada. Esse polímero linear consiste de subunidades de D-glicose ligadas entre si por ligações glicosídicas β (1,4), que fazem dela uma estrutura altamente cristalina e compacta. Essa conformação estrutural, assim como sua estreita associação à lignina, à hemicelulose, ao amido, às proteínas e aos minerais, torna a celulose resistente à hidrólise e ao ataque biológico (GRAY et al., 2006; KUMAR et al., 2009). A hemicelulose, segundo componente principal da lignocelulose, é um heteropolímero complexo e ramificado presente na parede celular e na lamela média das células vegetais (COLLINS et al., 2005). Em virtude da natureza amorfa e ramificada, ao contrário da celulose, a hemicelulose possui subunidades de monossacarídeos diferentes, que podem ser extraídos com diversas concentrações de ácido, álcali e outras substâncias químicas (XU et al., 2012). A lignina, componente presente em menor proporção em material vegetal, é um polímero aromático que contém resíduos fenólicos que são inibidores microbianos. Além disso, a lignina pode estar covalentemente ligada à hemicelulose via ligações éster, o que confere à estrutura da parede celular vegetal maior solidez e resistência (GRAY et al., 2006; XU et al., 2012). Figura 2 – Esquema do fracionamento dos principais componentes dos materiais lignocelulósicos após procedimento de hidrólise. Fonte: HSU et al. (1980), adaptada por KUMAR et al. (2009). Para fracionar os componentes dos materiais lignocelulósicos é preciso ocorrer a deslignificação para liberar a celulose e a hemicelulose do complexo da lignina. Subsequentemente é necessária a despolimerização dos polímeros de Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 11 carboidratos (celulose e hemicelulose) para produzir açúcares livres, e finalmente a fermentação para produzir xilitol ou etanol. A celulose pode ser hidrolisada em unidades de glicose pela ação das celulases. A xilana, componente principal da hemicelulose e segundo componente mais abundante desses materiais, pode ser hidrolisada por enzimas xilanolíticas, para liberar xilose, que pode ser convertida em xilitol por fermentação (ARRIZON et al., 2012). Substratos ricos em xilana representam 11 a 35% de peso seco em materiais lignocelulósicos, por exemplo, madeiras e resíduos agrícolas, como o bagaço de cana-de-açúcar (GURGEL et al., 1998; JUCOKSKI et al., 2007), a palha de arroz (SILVA & ROBERTO, 2001) e a casca de soja (SCHMIRMER, 2007; RIBEIRO, 2010). Esses resíduos têm sido satisfatoriamente utilizados como alternativa para produção de xilitol por meio de diferentes tratamentos (ALVES et al., 1998), utilizando distintos micro-organismos, como mostrado na Tabela 1. Tabela 1 – Matérias-primas para produção de xilitol e linhagens de leveduras utilizadas para produção deste poliálcool (GRANSTRÖM, 2002; GONZÁLEZ-HERNÁNDEZ et al., 2011) Material Linhagem Eucalyptus spp. Yp/s Qp g.L .h Debaryomyces hansenii Candida parapsilopsis 0,57 0,72 0,40 - Diaz et al. (2002) Mayerhoff et al. (1997) Palha de arroz Pichia capsulata Pachysolen tannophilus D.hansenii 0,68 0,49 0,55 0,49 0,02 Converti et al. (1999) Caroço de milho C. magnoliae 0,74 002 Tada et al. (2004) Palha de trigo C. guilliermondii 0,59 0,42 Canilha et al. (2008) Bagaço de cana C. guilliermondii 0,79 0,47 Alves et al.(1998) Bagaço de cana C. guilliermondii 0,54 0,44 Carvalho et al. (2003) Madeira de Eucalyptus C. guilliermondii 0,26 0,09 Villareal et al. (2006) Palha de arroz C. guilliermondii 0,72 0,61 Mussato et al. (2001) Palha de trigo C. guilliermondii 0,90 0,50 Dominguez et al.(2004) g.g -1 -1 -1 Referência -1 -1 -1 Yp/s (g.g ) – grama de xilitol produzida por grama de xilose consumida; Qp (g.L .h ) – produtividade -1 de xilitol; e concentração de xilitol produzido (g.L ) por hora (h). 2.6.2 Bagaço de cana-de-açúcar como substrato para obtenção de soluções contendo D-xilose Um dos principais resíduos lignocelulósicos produzidos no mundo é o bagaço de cana-de-açúcar, fonte de celulose que pode ser usada nas indústrias de papel e Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 12 na alimentação bovina. A Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura relata o crescimento do consumo mundial a uma taxa anual de 2% ao longo das últimas décadas, o que significa cerca de 3 milhões de toneladas a mais na demanda a cada ano (BIOETANOL, 2008). Tendo em vista que cada tonelada de cana-de-açúcar processada gera 140 kg de bagaço de cana seco (CENBIO, 2012), embora o bagaço gerado durante a produção de açúcar e álcool seja utilizado em grande parte pela própria indústria sucroalcooleira como fonte energética, existe ainda um excedente de 10-20% que pode ser utilizado em muitos processos industriais (ARRUDA, 2011). Os principais fatores que impulsionaram o aproveitamento do bagaço de cana-de-açúcar em diferentes processos de bioconversão para obtenção de produtos de interesse industrial, como o xilitol, são: a elevada concentração de xilose na fração hemicelulósica, que corresponde até 80% do total de açúcar (RODRIGUES et al., 2001), e a capacidade de assimilação dessa pentose por várias espécies de leveduras (SAHA, 2003). 2.6.3 Processo de hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos O xilitol tem sido produzido de resíduos lignocelulósicos por microorganismos, utilizando diferentes sistemas de fermentação, a partir de hidrolisados de fontes agrícolas, obtidos por hidrólises térmica ou química (ARRIZON, 2011). De acordo com Sun e Cheng (2002), há dois tipos de tratamentos, um com alta e outro com baixa temperatura (maior e menor que 160 °C, respectivamente). Nos tratamentos em baixas temperaturas, a hidrólise ácida é um método comumente utilizado porque há maior conversão de xilanas em xilose, pelo rompimento das ligações glicosídicas. No entanto, nesse processo é necessário fazer a destoxificação subsequente, a fim de eliminar inibidores de fermentação liberados durante o processo de hidrólise química, como ácido acético, liberado da estrutura da hemicelulose, furfural, HMF (5- hidroximetil-2-furaldeido) e compostos fenólicos formados durante a ruptura parcial da lignina (PALMQVIST & HÄHN-HÄGERDAL, 2000; SENE et al., 2011). Esses compostos tóxicos são inibidores potenciais do metabolismo microbiano, limitam o consumo da fonte de carbono e interferem no crescimento celular, diminuindo assim a atividade enzimática e as funções celulares microbianas (FONSECA et al., 2011). Os compostos tóxicos formados após a hidrólise ácida podem ser reduzidos por métodos físicos e químicos, que incluem Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 13 destoxificação por alterações do pH do meio com adição de ácidos e bases e utilização de compostos como carvão ativado, resina de troca iônica, solventes orgânicos e supercalagem (PALMQVIST & HÄHN-HÄGERDAL, 2000; MUSSATTO & ROBERTO, 2003; TAMANINI & OLIVEIRA, 2004; FONSECA et al., 2011). Na Figura 3 tem-se o esquema das reações que ocorrem após a hidrólise ácida dos materiais lignocelulósicos e a liberação de açúcares e compostos tóxicos. Biomassa Vegetal Hemicelulose Celulose Lignina Ácido acético Compostos fenólicos Xilose Furfural Manose Ácido fórmico Galactose Glicose Hidroximetilfurfural Ácido levulínico Figura 3 – Reações e produtos formados durante o processo de hidrólise de materiais lignocelulósicos. Fonte: Palmqvist & Hähn-Hägerdal (2000). A destoxificação dos hidrolisados hemicelulósicos com o emprego de microorganismos vivos ou enzimas que assimilem ou degradem ácidos alifáticos e compostos aromáticos é um procedimento que merece destaque, porque não gera resíduos tóxicos no ambiente e principalmente não causa diminuição nas concentrações de açúcar ou perda de volume (FONSECA et al., 2011). O ácido acético originado da hidrólise ácida de material lignocelulósico é aceito em concentrações de 0,2 - 0,6 g.L-1 em processos fermentativos (SOUZA et al., 2012), enquanto concentrações superiores a 3,0 g.L -1 interfere na liberação de produtos da fermentação ao inibir a capacidade das leveduras de converter a xilose em xilitol (FELIPE et al., 1995). Quando o pH extracelular é menor do que o pH intracelular, Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 14 ocorre uma acidificação intracelular e a acumulação desste ácido em forma dissociada afeta o metabolismo celular (SILVA et al., 1998; BELLISSIMI et al., 2009; SOUZA et al., 2012). Outro dos efeitos deste ácido no metabolismo celular é a indução da morte celular programada. Ludovico e colaboradores (2002) demonstraram que o ácido acético em concentrações de 20 e 120 mM induz exponencialmente o crescimento até a morte celular programada exibindo condensação da cromatina e fragmentação do DNA. Durante a hidrólise ácida, altos níveis de furfural e 5-hidrometilfurfural são liberados. Estes compostos inibem a multiplicação celular afetando a taxa de crescimento e a atividade enzimática celular (FONSECA et al., 2011). O HMF (hidroximetilfurfural) reduz a permeabilidade da membrana, o que resulta em uma fase de adaptação maior. Quanto à ação exercida pelos compostos fenólicos, estes rompem as membranas biológicas, causando a perda da função de barreira seletiva e de matriz de enzimas, perdendo assim a integridade celular (PALMQVIST & HÄHN-HÄGERDAL, 2000). As células podem induzir uma série de alterações funcionais em resposta aos níveis de estresse causados pelos compostos tóxicos liberados na hidrólise ácida. Estas alterações incluem a redução de atividades ligadas à proliferação celular, síntese de proteínas e outros processos associados ao consumo de energia. Por outro lado, incrementam os mecanismos de proteção e reparo de danos de diferentes moléculas (DNA, proteínas e lípidos) e estruturas celulares (SOUZA et al., 2012). A escolha do cultivo e, ou, sistema de conversão é outro ponto crucial para o sucesso desse bioprocesso. Diferentes sistemas de cultivo em escala de bancada são utilizados, como batelada, semibatelada e processos contínuos (SAMPAIO et al., 2005). A eficiência da bioconversão da D-xilose até xilitol pode ser aumentada por alterações nas condições do processo, como o pH (CONVERTI & DOMINGUEZ, 2001; CHENG et al. 2009); a concentração de açúcar inicial (GRANSTRÖM et al., 2001), a idade e concentração do inóculo (FELIPE et al., 1997; SILVA et al., 1998), a temperatura (PARAJÓ & DOMINGUEZ, 1998; CONVERTI & DOMINGUEZ, 2001); a repressão catabólica exercida pela glicose no meio de fermentação (OOI et al., 2002; DA SILVA et al., 2007), o nível de ar (WALTHER et al., 2001); e a relação glicose:xilose (SILVA & FELIPE, 2006), fatores que uma vez estabelecidos como ideais para cada espécie permitem obter maior produção de xilitol. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 15 2.6.4 Bioconversão de D-xilose em xilitol por micro-organismos A obtenção de micro-organismos capazes de fermentar pentoses presentes na biomassa celulósica pode ser muito vantajosa para fabricação de produtos secundários em processos industriais. Os micro-organismos naturalmente fermentadores considerados como os mais eficazes incluem as leveduras e as bactérias. As bactérias são de fácil cultivo, têm alta capacidade de produção de xilitol e toleram compostos tóxicos e condições de estresse (GUO et al., 2006). As leveduras apresentam vantagens em relação às bactérias em processos de fermentação comercial por ter melhor crescimento em pH ácido, requerimento nutricional menos rigoroso e maior resistência a contaminações (JEFFRIES, 2006). As linhagens mais estudadas, por serem consideradas as melhores fermentadoras de xilose, incluem espécies dos gêneros Candida, principalmente C. tropicalis e C. guilliermondii (SENE et al., 2011), e Pichia, e as espécies Debaryomyces hansenii e Pachysolen tannophilus (MEINANDER e HAHN-HÄGERDAL, 1997; AFFLECK, 2000; LIMA et al., 2003; JUCOSKI et al., 2007; CHANDEL, 2010), por liberarem o xilitol como subproduto metabólico. O primeiro passo no metabolismo da D-xilose é o transporte do açúcar através da membrana celular. Uma vez no interior da célula, a D-xilose é reduzida a xilitol pela xilose redutase NADPH-dependente. O xilitol por, sua vez, é oxidado para xilulose pela xilose desidrogenase NAD-dependente. Essas duas reações iniciais são consideradas limitantes na fermentação da D-xilose. A regeneração do NADPH ocorre na via da pentose fosfato e a regeneração do NAD+ ocorre somente na cadeia respiratória, com o oxigênio como aceptor final de elétrons (WINKELHAUSEN & KUZMANOVA, 1998). Estudos da via catabólica da xilose nas leveduras têm indicado a importância do balanço redox intracelular na absorção da xilose e no seu consumo, indicando que a regeneração do cofator NADPH para a atividade da xilose redutase (XR) pode ser um passo limitante na produção do xilitol (GRANSTRÖM, 2002; HUANG et al., 2011). Silva e colaboradores (1996) sugerem que microorganismos que apresentam a enzima XR dependente de NADH são melhores produtores de etanol, ao contrário daqueles que apresentam a XR dependente de NADPH, já que acumulam xilitol. A regeneração de cofatores encontra-se fortemente ligada à disponibilidade de oxigênio, e pode causar o desbalanço redox, que interfere na produção de xilitol e dos subprodutos do metabolismo. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 16 Em condições aeróbias, as leveduras com atividade XR necessitam dos cofatores NADH e NADPH (por exemplo, em Scheffersomyces stipitis) e podem regenerar o NAD+ consumido no segundo passo do metabolismo da xilose. Nesse caso, o principal produto da reação é o etanol. Em condições limitadas de oxigênio, leveduras como D. hansenii consomem a xilose por atividade da XR-dependente de NAD (com ausência completa de NADH ligado à XR), o que permite a acumulação de xilitol (LEE et al.,1995; PARAJÓ et al., 1998; OOI et al., 2002; ARRUDA, 2006; LIMA, 2006). Porém, quando submetido ao fornecimento limitado de oxigênio, não ocorre a completa reoxidação de cofator, levando ao desequilíbrio redox (TAMANINI & OLIVEIRA, 2004). Portanto, o alto grau de aeração favorece o crescimento celular, prejudicando o acúmulo de xilitol. Glicose Xilose Via pentose fosfato Xilitol Xilitol O2 Fructose 6-fosfato Cadéia respiratória H2O Xilulose 5-fosfato Xilulose Gliceraldeido 3-fosfato Glicerol Piruvato Ácido acético Etanol Figura 4 – Vias metabólicas da glicose e xilose em leveduras. Fonte: adaptada de Granström, 2002. O presente trabalho poderá ser de grande importância, tanto ecológica como biotecnológica, pois representa o primeiro estudo de identificação de leveduras isoladas de madeira em decomposição das ilhas Galápagos, Equador, com enfoque na seleção de espécies capazes de fermentar D-xilose que sejam potencialmente produtoras de xilitol em hidrolisados de resíduos lignocelulósicos. As ilhas Galápagos são reconhecidas como únicas no mundo por serem um centro de Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 17 endemismo, apresentando uma variabilidade de uma ilha para outra muito forte, contendo assim populações, raças e até mesmas espécies geneticamente distintas, características que inspiraram a Charles Darwin no desenvolvimento da teoria da evolução. Em 1979, a UNESCO declarou este arquipélago de origem vulcânico como Patrimônio Natural da Humanidade; em 1985 foram declaradas Reserva da Biosfera; e, em 2001, a Reserva Marinha de Galápagos foi incluída na lista de Patrimônio Natural da Humanidade. O estudo das espécies de leveduras isoladas em madeira em decomposição será de grande contribuição para identificação da riqueza microbiológica dessas ilhas, ainda desconhecida pela ciência. Alem disto, poderá permitir a avaliação do potencial biotecnológico desses micro-organismos na produção de xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos de biomassa agroindustrial. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 18 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Identificar, caracterizar e selecionar leveduras isoladas de madeiras em decomposição do arquipélago das ilhas Galápagos com capacidade de produzir xilitol. 3.2 Objetivos específicos 1. Identificar leveduras associadas à madeira em decomposição coletadas nas ilhas Galápagos por métodos fisiológicos e moleculares. 2. Selecionar leveduras com capacidade de produzir xilitol. 3. Testar a capacidade de produção de xilitol em meio semi-sintético e em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar em escala de bancada, pelas leveduras selecionadas. 4. Avaliar em biorreator contendo hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar as linhagens mais promissoras quanto à produção de xilitol. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 19 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Seleção de micro-organismos 4.1.1 Áreas de coleta As espécies utilizadas neste trabalho foram coletadas no arquipélago das ilhas Galápagos (0° 40’ 0” S, 90° 33’ 0” W), Equador. O arquipélago localiza-se a cerca de 1.000 km da costa continental e apresenta elevada biodiversidade, sendo o habitat de uma fauna e flora peculiar, que inclui muitas espécies endêmicas. A vegetação é árida nas áreas baixas das ilhas, com espécies de “palo santo” (Bursera graveolens, Burseraceae), “arrayancillo” (Maytenus octogona, Celastraceae) e cactos, como Jasminocereus thouarsii e Opuntia echios (Cactaceae) (van der WERFF, 1978). Nas partes altas das ilhas encontram-se bosques úmidos, caracterizados pelo clima subtropical. As ladeiras vulcânicas se distinguem pela presença de “cacaotillo” (Miconia sp.) e “lechoso” (Scalesia sp.), cobertas de briófitas epifíticas (NEILL e JORGENSEN, 2012). A temperatura varia de 17 a 25 °C durante todo o ano. Os padrões de precipitação e distribuição de chuvas são influenciados pelas correntes marítimas do oceano Pacífico. A estação chuvosa vai de dezembro a maio e a estação seca vai de maio a dezembro. A precipitação média anual é de 350 mm ao longo das costas das ilhas, enquanto na zona montanhosa do arquipélago a média de precipitação chega, em algumas áreas, a 1.100 mm por ano (NEILL e JORGENSEN, 2012; PARQUE NACIONAL GALÁPAGOS, 2012). As coletas foram realizadas em outubro de 2009, de acordo com um projeto de cooperação científica que envolveu pesquisadores do Brasil e do Equador (PROSUL/CNPq: projeto número: 490430/2008-2, coordenado por Carlos A. RosaUFMG). Neste trabalho, as leveduras foram processadas, purificadas e enviadas pela CLQCA (Colección de Levaduras Quito Católica da Pontificia Universidad Católica del Ecuador) para a Coleção de Micro-organismos e Células da UFMG, a partir do certificado Zoosanitario para la exportación No. 02199 do Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca do Equador, e a autorização do Ministerio del Ambiente baixo a Autorización de Exportación Científica pelo código 006-EXP-CIEN-FAN-DPAP/MA (Anexo 2). Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 20 Das coletas realizadas nas ilhas Galápagos foram isoladas cerca de 800 leveduras proveniente de amostras de madeira em decomposição, flores, frutos, cascas de árvores e insetos. No presente estudo foram selecionados os isolados provenientes de 35 amostras de madeira em decomposição. Da ilha Floreana (1° 17′ 51″ S 90° 26′ 03″ O), na Estação de Proteção para Tartarugas, foram coletadas 12 amostras. O segundo ponto de coleta foi na ilha Isabela (1° 17′ 51″ S 90° 26′ 03″ O) obtendo-se quatro amostras no entorno do vulcão “Sierra Negra”. Na ilha Santa Cruz (0° 37′ 48″ S, 90° 21′ 36″ W) foram coletadas 19 amostras procedentes das crateras “Los Gemelos” e da localidade “Media Luna”, caracterizada por ser um dos pontos mais altos da ilha; o último ponto de coleta foi em “Puerto Ayora” (Anexo 1). 4.1.2 Coleta, processamento e preservação dos micro-organismos As amostras de madeiras em decomposição foram coletadas com auxílio de espátulas e pinças desinfetadas. As amostras foram armazenadas em sacolas plásticas estéreis e transportadas em isopor contendo gelo até o processamento. Cada amostra foi colocada separadamente em tubos Falcon de 50 mL, com 20 mL de diferentes meios de cultura: YNB-D-xilose (Yeast Nitrogen Base- YNB 0,67%, xilose 2% e cloranfenicol 0,01%), YNB-xilana (YNB 0,67%, xilana 2% e cloranfenicol 0,01%) e carboximetilcelulose (CMC) (carboximetilcelulose 1%, celobiose 0,05% e cloranfenicol 0,01%). As amostras foram incubadas a 25 °C em agitação a 150 rpm, por 3 a 15 dias. Após a detecção de crescimento celular, 100 μL de cada meio foram transferidos para placas contendo ágar extrato de malte-extrato de levedura (YM) (glicose 1%, extrato de levedura 0,3%, extrato de malte 0,3%, peptona bacteriológica 0,5%, ágar 2%) e incubadas a 25 °C, até obtenção do crescimento de colônias. Os diferentes morfotipos foram purificados e preservados em meio GYMP modificado (glicose 2%, extrato de levedura 0,5%, extrato de malte 1%, fosfato de sódio monobásico 0,02% e 200 μL de glicerol) em ultrafreezer a -80 °C. As leveduras foram preservadas na Colección de Levaduras Quito-Católica e posteriormente enviadas e depositadas na Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 21 4.2 Identificação das leveduras por análises fisiológicas e moleculares As leveduras foram agrupadas de acordo com a similaridade dos perfis morfológicos e fisiológicos, seguindo as chaves taxonômicas e os protocolos descritos por Kurtzman e colaboradores (2011). Cada levedura foi inoculada em tubos com água destilada esterilizada, onde a concentração celular foi medida pelo cartão de Wickerham (grau +2). Uma alíquota de 400 L de cada levedura foi colocada individualmente em poços de um replicador, que foi utilizado para inocular as leveduras em placas com diferentes fontes de açúcar. As placas foram incubadas por 21 dias e as leituras dos crescimentos das leveduras foram registradas com 7, 14 e 21 dias, em uma escala que variou de negativo (–) até 3 (positivo), de acordo com o crescimento (-,1,2,3). As leveduras com perfis fisiológicos idênticos foram submetidas à análise molecular, por meio de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), utilizando-se o iniciador EI1 para realização do agrupamento em perfis moleculares distintos. 4.2.1 Extração de DNA Para extração do DNA total das leveduras, os isolados foram colocados para crescer em ágar extrato de malte e extrato de levedura (glicose 1 %, extrato de levedura 0,3 %, extrato de malte 0,3 %, peptona bacteriológica 0,5 %, ágar 2 %) a 25 °C, por 24 horas. Após o crescimento, as colônias foram ressuspendidas em 100 L de tampão de lise (Tris, EDTA 0,5 M, NaCl 5M, SDS 10%) e incubadas a 65 ºC, por 30 minutos. Decorrida essa etapa do processo, adicionou-se um volume de 200 L de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) aos tubos, que foram vedados com parafilme, homogeneizados por inversão e centrifugados a 3.000 x g, durante 15 minutos. O sobrenadante foi transferido com auxílio de uma pipeta e transferido para outro tubo, ao qual foi adicionado 100 μL (v/v) de isopropanol. Os tubos foram incubados à temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitação do DNA. Após essa etapa, os tubos foram centrifugados a 3.000 x g, por 10 minutos, e o sobrenadante foi descartado por inversão. Foram adicionados 200 L de etanol 70% gelado ao pellet residual e os tubos foram homogeneizados por inversão. Efetuouse novamente uma centrifugação a 3.000 x g, por 10 minutos. Na última etapa do processo, o sobrenadante foi descartado com auxílio de pipeta, e os tubos Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 22 incubados overnight à temperatura ambiente, para total evaporação do álcool. Após essa etapa, o DNA foi ressuspendido em 100 L de tampão Tris EDTA 0,1 M (TE), pH 8, e estocado a -20 ºC. 4.2.2 Agrupamento das leveduras por PCR-Fingerprinting Cada grupo de leveduras formado com base nas características fisiológicas foi submetido à técnica de PCR- Fingerprinting, utilizando-se o iniciador EI1 (CTGGCTTGGTGTATGT), segundo De Barros Lopes e colaboradores (1996), para comprovação da similaridade dos perfis obtidos. A reação de PCR foi realizada em um volume final de 25 L, contendo 2,5 L de tampão de PCR-Fermentans 10X, 1,5 L de MgCl2 1,5M, 1 L de dNTP 0,05 mM, 2 L do iniciador EI1 a 10 pmol L-1, de 1 a 2 L de DNA, 0,2 L de Taq DNA Polimerase 1,25 U L-1 (Taq DNA Polymerase Fermentans) e água destilada e deionizada (Depc) até completar 25 L. A reação de PCR foi realizada utilizando-se o termociclador PCR Express (Eppendorf). O programa de amplificação consistiu na desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos, seguida por 40 ciclos de 45 segundos de desnaturação a 93ºC, 1 minuto de anelamento do iniciador a 50 ºC e 1 minuto de extensão a 72 ºC, e uma extensão final por 6 minutos a 72 ºC. Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, em tampão TBE 0,5X (54 g de tris base, 27,5 g de ácido bórico, 20 mL de EDTA 0,5M, pH 8,0), eluídos durante aproximadamente 90 minutos a 80 V. As bandas foram coradas com solução de Gel-Red, e os géis foram visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de fotodocumentação de gel (Vilber Lourmat, França). 4.2.3 Amplificação do domínio D1/D2 da subunidade maior do gene do rRNA Foi selecionado um exemplar de cada grupo de leveduras com perfis moleculares similares a partir da PCR com o iniciador EI1, para análise da sequência dos domínios D1/D2 da subunidade maior do gene do rRNA, utilizando-se os iniciadores NL-1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL-4 (5’GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) (LACHANCE et al., 1999). Linhagens fisiológicamente distintas com padrões de banda únicos também foram selecionadas para identificação direta pelo sequenciamento da região D1/D2 do gene do rRNA. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 23 A reação de PCR foi realizada em um volume final de 50 L, contendo 5 L de tampão de PCR (Fermentans) 10X, 2 L de MgSO4 1,5M, 2 L de dNTP 0,05 mM, 1 L dos iniciadores NL-1 e NL-4 a 10 pmol L-1 (MWG Biotech), 1 a 2 L de DNA, 0,2 L de Taq DNA Polimerase 1,25 U L-1 (Fermentans) e água Dpec até completar 50 L. As reações de PCR foram realizadas utilizando-se o termociclador PCR Express (Esplendor). O programa de ciclagem consistiu na desnaturação inicial a 95 ºC por 2 minutos, durante um ciclo, seguido por 35 ciclos de 15 segundos de desnaturação a 95 ºC, 25 segundos de anelamento do iniciador a 54 ºC e 20 segundos de extensão a 72 ºC, e uma extensão final por 10 minutos a 72 ºC. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5X (54 g de Tris base, 27,5 g de ácido bórico, 20 mL de EDTA 0,5M, pH 8,0), eluídos durante aproximadamente 20 minutos a 120 V. As bandas foram coradas com solução de Gel-Red, e os géis foram visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de fotodocumentação de gel (Vilber Lourmat, França). 4.2.4 Amplificação da região ITS (Espaçador Interno Transcrito) Para as leveduras cuja identificação não foi possível pelo sequenciamento do domínio D1/D2, foi sequenciado a região ITS do gene do rDNA, utilizando-se os iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC), conforme descrito por White e colaboradores (1990). A PCR foi realizada em um volume final de 50 L, contendo 5 L de tampão de PCR 5X (Fermentas), 2 L de MgCl2 25mM, 2 L de dNTP 10 mM, 1 L de cada iniciador ITS1 e ITS4 10 mol-1 (MWG Biotech), 0,2 L de Taq DNA Polimerase 1,25 U L-1 e água Dpec até completar 50 L. As reações de PCR foram realizadas em termociclador PCR Express. O programa consistiu na desnaturação inicial a 94 ºC por 5 minutos, seguida por 35 ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94 ºC, 1 minuto de anelamento a 55 ºC e 1 minuto de extensão a 72 ºC, e uma extensão final por 5 minutos a 72 ºC. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5X, eluídos durante aproximadamente 30 minutos a 120 V. As bandas foram coradas com solução de GelRed, e os géis visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de fotodocumentação de gel (Vilber Lourmat). Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 24 4.2.4 Purificação dos produtos de PCR e reação de sequenciamento Os amplicons gerados pela reação de PCR com os iniciadores NL-1/NL-4 e ITS1/ITS4 foram purificados pela adição de 11,25 L de EDTA 125 mM e 135 L de etanol absoluto. A reação foi incubada por 15 minutos à temperatura ambiente e os tubos foram centrifugados a 3.000 x g, por 25 minutos. O sobrenadante foi retirado e descartado com auxílio de pipeta. Em seguida, foram adicionados 120 L de etanol a 70% gelado aos tubos, que foram, então, homogeneizados por inversão. Posteriormente, foram centrifugados a 3.000 x g por 10 minutos e o etanol foi retirado com auxílio da pipeta. Este último passo de lavagem dos amplicons com etanol foi realizado duas vezes. Os tubos foram deixados overnight à temperatura ambiente, para total evaporação do etanol. Decorrida essa etapa, as amostras foram ressuspendidas com 10 L de água Dpec e armazenadas a -20 °C. Os produtos purificados foram dosados em NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies). As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando-se o Kit DYEnamicTM (Amersham Biosciences, EUA), em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado MegaBACETM 1000, no Núcleo de Análise de Genoma e Expressão Gênica (NAGE) do Departamento de Bioquímica e Imunologia – ICB/UFMG. Para as espécies novas ou de linhagens de interesse biotecnológico, as amostras foram confirmadas por sequenciamento por eletroforese capilar em aparelho ABI3130, utilizando polímero POP7 e BigDye v3.1 (Valid Biotechnology), no Laboratório de Genética da Faculdade de Veterinária-UFMG. As sequências de DNA foram analisadas pelo programa BLAST (Basic Local Alignment Serch Tool - versão 2.215 do BLAST 2.0), disponível no portal NCBI desenvolvido pelo National Center For Biothecnology (USA). As sequências obtidas foram comparadas com as sequências já depositadas no GenBank, e as sequências similares foram alinhadas pelo programa DNA Baser v3.5.3. Isolados apresentando similaridade na sequência analisada de 99 % ou mais em relação a outro já depositado no GenBank foram considerados como pertencentes àquela espécie conhecida. Os isolados que apresentaram três ou mais diferenças nucleotídicas não contíguas quando comparados às espécies mais proximamente relacionadas foram considerados potenciais novas espécies (KURTZMAN et al., 2011). Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 25 4.3 Seleção de leveduras para produção de xilitol a partir de D-xilose 4.3.1 Avaliação das leveduras assimiladoras de D-xilose Com base nos resultados dos perfis fisiológicos obtidos para cada levedura (item 4.2), foram selecionadas as leveduras que apresentaram capacidade de crescer em meio contendo D-xilose como única fonte de carbono. Uma placa de YNB contendo 0,5 g de glicose (controle positivo para o crescimento das leveduras) e placas contendo somente YNB (controle negativo para crescimento das leveduras) foram incluídas. 4.3.2 Seleção das leveduras produtoras de xilitol As leveduras com crescimento positivo em D-xilose, segundo os testes utilizados em perfis fisiológicos indicados no item 4.3.1, foram diluídas em água destilada esterilizada até o número 2 do cartão de Wickerham, e 200 L dessa solução foram inoculados em tubos contendo 2 mL do meio YPX (extrato de levedura 1%, peptona 2%, xilose 3%), posteriormente incubado a 25 °C, a 200 rpm, durante 48 horas. A quantidade de xilitol produzida foi determinada por CLAE (Cromatografía Líquida de Alta Eficiência), utilizando-se a versão do programa 1.21 do Lc-Solution, Detector SPD-M20A; um detector de índice de refração (RI); e a coluna Supelco SUPELCOGEL™ C-610H HPLC Column (59320-U) (SigmaAldrich®) (300x 7,8 mm), nas seguintes condições: H2SO4 5mM como eluente; 1.0 ml.min-1 fluxo; temperatura da coluna 65˚C; detector da atenuação 16x; e volume de injeção da amostra 25 l. 4.4 Ensaios de fermentação em meio semi-sintético com D-xilose e em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar As espécies que apresentaram a mais alta produção de xilitol nos ensaios de seleção de bancada em meio YPX foram submetidas a ensaios fermentativos em escala de bancada, em meio semi-sintético contendo D-xilose como única fonte de carbono. A partir dos resultados encontrados neste meio, foram selecionadas as leveduras que apresentaram maior produtividade e rendimento de xilitol para serem testadas em ensaios fermentativos, utilizando o hidrolisado hemicelulósico de Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 26 bagaço de cana-de-açúcar. Dos resultados obtidos em escala de bancada com este substrato, foram selecionadas duas linhagens que apresentaram resultados promissores para produção de xilitol em biorreator. Os ensaios fermentativos foram realizados no Laboratório de Microbiologia Aplicada e Biotecnologia do Departamento de Biotecnologia (DEBIQ) da Escola de Engenharia de Lorena (EEL) da Universidade de São Paulo (USP), sob orientação do Prof. Dr. Silvio Silvério da Silva, durante os meses de junho a agosto, e de novembro a dezembro de 2012. 4.4.1 Determinação do inóculo inicial A concentração celular foi determinada a 600 nm, utilizando um espectrofotômetro Beckman DU 640 B, onde a concentração de células em g.L-1 foi calculada, utilizando uma curva-padrão que correlaciona a absorbância medida a 600 nm ao peso seco das células. O inóculo inicial foi feito em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do meio de cultivo contendo D-xilose (30 g.L-1), extrato de farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0,1 g.L-1). Os frascos foram incubados a 30 °C por 24 horas em um agitador rotatório a 200 rpm (ARRUDA, 2011). As soluções de sulfato de amônio e cloreto de cálcio dihidratado foram preparadas separadamente nas concentrações de 200 e 10 g.L-1, respectivamente, e esterilizadas em autoclave a 1 atm por 20 minutos. Para utilização do extrato de farelo de arroz como nutriente, foram empregados 200 g de farelo para 1 litro de água destilada, e autoclavados por 15 minutos a 0,5 atm. Após o resfriamento a solução foi centrifugada a 2.000 x g por 30 minutos, em condições assépticas. A fração líquida (extrato de farelo de arroz) foi transferida para um frasco previamente esterilizado e estocado na geladeira até a sua utilização (ARRUDA, 2011). Após 24 horas, as leveduras foram recuperadas por centrifugação a 3.000 x g durante 15 minutos, o sobrenadante foi retirado e as células foram lavadas com a mesma quantidade original de água destilada estéril. As amostras foram homogeneizadas em vórtex e centrifugadas a 3.000 x g, por 15 minutos. O sobrenadante foi retirado, e ao pellet adicionou-se água destilada esterilizada, seguido de homogeneização em vórtex. Três mililitros da solução foram retirados e colocados em cadinhos previamente secos em estufa, dessecados e pesados, em Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 27 triplicata. Os recipientes foram colocados na estufa a 100 °C, por 24 horas, e no desumidificador por 1 hora; posteriormente cada cadinho foi pesado até não se observar variação significativa do peso. As medições foram feitas por um período de até 96 horas. 4.4.2 Fermentação em meio semi-sintético contendo D-xilose As leveduras foram previamente cultivadas em frascos com 100 mL de meio contendo D-xilose (30 g.L-1), extrato de farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0,1 g.L-1), e incubadas em agitador horizontal (Quimis Q816M20) a 200 rpm, a 30 ºC, por 24 horas. Para obtenção do inóculo, as células foram recuperadas por centrifugação a 2.000 x g, durante 20 minutos, o pellet formado foi lavado duas vezes com água destilada esterilizada e ressuspendido diretamente em 10 % (v/v) do meio de fermentação, com a concentração celular em densidade ótica igual a 1 (DO, 600 nm), que corresponde a aproximadamente 0,5-1,0 g.L-1 de células (em peso seco). As células foram ressuspendidas diretamente em 10% (v/v) do meio de fermentação, com a concentração celular em densidade ótica igual a 1 (DO, 600 nm), que corresponde a aproximadamente 0,5-1,0 g.L-1 de células (em peso seco). As fermentações foram conduzidas em triplicata, em frascos de 250 mL contendo 100 mL de meio com D-xilose (50 g.L-1), extrato de farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0.1 g.L-1), pH 5,5. Os frascos foram incubados a 30 °C sob agitação de 200 rpm, por 72 horas. Alíquotas de 1,5 mL foram retiradas com 0, 12, 24, 48 e 72 horas de incubação, para serem avaliadas quanto à concentração celular a 600 nm. As amostras foram centrifugadas a 3.000 x g, durante 15 minutos, e filtradas para determinação das concentrações de açúcares (xilose, arabinose e glicose), ácido acético, glicerol, xilitol e etanol, por CLAE (ARRUDA, 2011). As linhagens que apresentaram produção de xilitol mais elevada e maior consumo de D-xilose foram escolhidas para serem testadas em ensaios de fermentação em meio hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar. 4.4.3 Preparo do bagaço de cana-de-açúcar para a hidrólise O bagaço de cana-de-açúcar utilizado nos experimentos foi fornecido pela Usina de Açúcar e Álcool Costa Pinto do Grupo COSAN, localizada em Santa Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 28 Terezinha, na cidade de Piracicaba, São Paulo. O bagaço foi submetido à tripla lavagem, para remoção de qualquer resíduo de açúcar. Após lavagem, o bagaço foi seco ao sol por aproximadamente 72 horas, até atingir 10% de umidade, sendo esta medida obtida por secagem em estufa até que o peso alcançasse um valor constante (JUCOSKI et al., 2007; ARRUDA, 2011). 4.4.4 Obtenção e caracterização do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar Os processos de hidrólises ácida para rompimento da estrutura lignocelulósica foram feitos em um reator de aço inoxidável AISI 316 com capacidade volumétrica de 350 L. O reator foi operado em regime descontínuo a 121 °C, por 20 minutos, utilizando 100 mg de ácido sulfúrico (98%) para 1 g de bagaço (matéria seca), em uma relação de sólido-líquido de 1:10. O hidrolisado resultante após este procedimento foi filtrado para remoção da massa residual de sólidos (celulignina). Posteriormente, o hidrolisado foi caracterizado quanto ao pH e quanto aos teores de glicose, xilose e arabinose. Também foi caracterizado quanto à concentração dos compostos tóxicos, como furfural, 5-hidroximetil-furfural e ácido acético (ALVES, 2006). Após a caracterização, o hidrolisado foi concentrado a vácuo, utilizando um sistema de condensação à temperatura de 70 ± 5 °C, com a finalidade de aumentar o teor inicial de xilose (ALVES, 2006; ARRUDA, 2011). 4.4.5 Detoxificação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar O hidrolisado foi detoxificado pela alteração de pH, combinada à adsorção de carvão ativo. O pH ácido do hidrolisado, inferior a 2, foi elevado a 7,0 com adição de CaO, e posteriormente reduzido até 5,5 com H3PO4, seguido pela adição de carvão ativado (2,5% m/v) (pó refinado), a 30 °C, agitação de 200 rpm durante 60 minutos. Após cada tratamento, o hidrolisado foi filtrado em papel-filtro, sob vácuo, para remoção dos precipitados formados. O hidrolisado destoxificado foi autoclavado a 111 °C durante, 15 minutos (ALVES et al., 1998; DA SILVA et al., 2007; SENE et al., 2011). Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 29 4.4.6. Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar em escala de bancada As leveduras selecionadas no item 4.4.2 foram inoculadas em triplicata, em frascos de 250 mL contendo 100 mL de D-xilose (30 g.L-1), extrato de farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0,1 g.L-1), e incubadas em agitador rotatório a 200 rpm, a 30°C, por 24 horas. Para obtenção do inóculo as células foram recuperadas por centrifugação a 2.000 x g por 20 minutos, o pellet formado foi lavado duas vezes com água destilada esterilizada e ressuspendido diretamente em 10 % (v/v) do meio de fermentação, com a concentração celular em densidade ótica igual a 1 (DO, 600 nm), que corresponde a aproximadamente 0,5-1,0 g.L-1 de células (em peso seco). Os experimentos utilizando-se o meio hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar destoxificado e suplementado com extrato de farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0.1 g.L-1), a pH 5.5, foram realizados em triplicata para cada isolado. As leveduras foram incubadas sob agitação a 200 rpm, a 30 °C, durante 120 horas. Alíquotas de 1,5 mL foram retiradas às 0, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação, para serem avaliadas quanto à concentração celular a 600 nm. As amostras foram centrifugadas a 2.000 x g, por 15 minutos, e filtradas para determinação das concentrações dos açúcares (xilose, arabinose e glicose), ácido acético, glicerol, etanol e xilitol, feitas por CLAE (FELIPE et al., 1997; DA SILVA et al., 2007; HUANG et al., 2011; SENE et al., 2011). As linhagens com o melhor consumo de D-xilose e maior rendimento e produtividade em xilitol foram escolhidas para serem testadas em biorreator agitado-STR, com volume nominal de 2,4 L. 4.4.7 Fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar em biorreator Os inóculos das leveduras selecionadas foram preparados em frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo D-xilose (30 g.L-1) suplementado com extrato de farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0,1 g.L-1), em um agitador rotatório a 200 rpm, a 30°C, por 24 horas. Após este período as células foram recuperadas por centrifugação a 3.000 x g por 20 minutos, o pellet formado foi Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 30 lavado duas vezes com água destilada esterilizada e ressuspendido diretamente em 10 % (v/v) do meio de fermentação, com a concentração celular em densidade ótica igual a 0,5 (DO, 600 nm), que corresponde a aproximadamente 0,2-0,5 g.L-1 de células (em peso seco). Os ensaios de fermentação foram realizados no biorreator STR, com volume nominal de 2,4 L (Anexo 3), contendo 1,5 L de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar concentrado, destoxificado e suplementado com extrato de farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0.1 g.L-1). A agitação foi de 450 rpm e a aeração de 0,70 vvm. As fermentações foram conduzidas a 30 °C, por 96 horas, e o KLa (coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio) foi de 7 h-1 . Os ensaios foram feitos em duplicata. As amostras foram coletadas nos tempos 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 e 96 horas, para determinação das concentrações dos açúcares (xilose, arabinose e glicose), xilitol, glicerol, ácido acético e etanol, utilizando CLAE. 4.5 Métodos analíticos 4.5.1 Determinação de carboidratos, ácidos orgânicos, furfural e 5- hidroximetilfurfural Cada amostra foi previamente filtrada com filtros Sep pak C18 (Waters, USA) e as diluições apropriadas foram feitas com água milli-Q. As análises quantitativas das concentrações de glicose, xilose, arabinose, xilitol e glicerol foram feitas por CLAE (Agilent Technologies 1200 Series) (HUANG et al., 2011), usando um detector de índice de refração (RI), detector Bio-Rad Aminex HPX-87H, coluna HPX-87-H (300x 7,8 mm) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), mantida nas seguintes condições: 0,01 N H2SO4 5 mM como eluente; 0,6 ml min-1 fluxo; temperatura da coluna 45 ˚C; e volume de injeção 20 µL (FELIPE et al., 1997; SENE et al., 2011). Para determinação das concentrações de furfural e hidroximetilfurfural, as amostras foram previamente filtradas em membrana Minisart 0,22 μm (Millipore). A determinação foi feita por CLAE, nas seguintes condições: Coluna Hewlett-Packard RP18 mantida a 25 °C, detector de ultravioleta (SPD-10A UV-VIS), solução de acetonitrila /H2O (1:8) com 1% de ácido acético como eluente, fluxo de 0,8 mL min -1 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 31 e um volume de injeção de 20 μL (ARRUDA, 2011; SENE et al., 2011). A concentração celular dos inóculos foi determinada comparando-se a densidade ótica da suspensão celular com a curva-padrão (absorbância a 600 nm x peso seco da célula) (FELIPE et al., 2007). 4.5.2 Determinação dos parâmetros cinéticos fermentativos Fator de conversão de D-xilose em xilitol (Yp/s) O fator de conversão ou fator de rendimento é aquele que expressa a massa de xilitol produzido por massa de xilose consumido, em gramas, e foi calculado pela equação 1: (1) em que Si e Sf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilose (g.L-1); e Pi e Pf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilitol (g.L-1). Fator de conversão de substrato em biomassa (Yx/s) O fator de conversão de D-xilose em biomassa é aquele que expressa a massa celular produzida por grama de açúcar consumido, e foi calculado segundo a equação 2: (2) em que Xi e Xf correspondem às concentrações iniciais e finais de biomassa celular (g.L-1); e Si e Sf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilose (g.L-1). Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 32 Produtividade volumétrica de xilitol (Qp) A produtividade volumétrica de xilitol expressa a concentração de xilitol produzido (g.L-1) por tempo (h), e foi calculada de acordo com a equação 3: (3) em que Pi e Pf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilitol (g.L-1); e Ti e Tf correspondem aos tempos iniciais e finais de fermentação (h). Eficiência de conversão () Este parâmetro fermentativo, expresso em porcentagem, representa a razão entre o fator de rendimento (Yp/s) obtido experimentalmente e o fator de rendimento teórico de 0,917 grama de xilitol/gramas de xilose. O parâmetro foi calculado de acordo com a equação 4 (BARBOSA et al., 1988): = (Pf – Pi * 100) (4) (Sf - Si)* 0,917 em que Pi e Pf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilitol (g.L-1); e Si e Sf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilose (g.L-1). Fator de rendimento produto por biomassa (Yp/x) Este fator expressa a conversão de massa celular em produto em U.g -1, e foi calculado pela equação 5: Yp/x = P X = (Pf – Pi) (5) (Xf - Xi) Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 33 em que Pf e Pi correspondem às concentrações iniciais e finais de xilitol; e Xf e Xi correspondem às concentrações iniciais e finais de biomassa celular. 4.5.3 Determinação do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio O coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio foi determinada pela metodologia de “gassing-out”, segundo Pirt (1975). O meio de cultivo sem células foi aerado com nitrogênio para reduzir o nível de oxigênio dissolvido no meio. O biorreator foi agitado nas condições desejadas para à fermentação, monitoreando-se o aumento da concentração do oxigênio dissolvido em função do tempo (cada 5 seg). Foi integrada a Equação 6 baseada no balanço de oxigênio no meio líquido e posteriormente foi calculada a relação pela Equação 7. dC dT = KLa c* - c (6) Assim teremos: ln 1- c -KLa * t c* = (7) Onde: c : corresponde a leitura do eletrodo (fração da concentração de oxigênio c* dissolvido em relação à concentração de saturação). O gráfico do logaritmo de 1- c em função do tempo permite a determinação do c* valor de KLa em h-1. 4.5.4 Análises estatísticas As diferenças estatísticas entre os resultados obtidos para produção de xilitol, etanol e consumo de D-xilose foram determinadas por meio do teste de análise de variância (ANOVA) de um fator em DCA (Desenho Experimental Aleatório), levando em consideração análise do intervalo de confiança para as médias dos tratamentos, utilizando-se probabilidade máxima de erro de 5% (α=0,05). Os efeitos cujo valor foi menor que 0,05 foram considerados significativos. Para os tratamentos que Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 34 apresentaram diferenças significativas, foi realizado o agrupamento e a comparação de cada variável em faixas homogêneas pela prova de Tukey, com probabilidade máxima de erro de 5%. As análises foram feitas pelo programa SPSS, versão 13.0 (SÁNCHEZ, 2006). Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 35 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Identificação das leveduras e seleção de micro-organismos assimiladores de D-xilose Um total de 140 isolados de leveduras foi obtido a partir de 35 amostras de madeira em decomposição, coletadas no arquipélago das ilhas Galápagos. Na ilha Floreana foram obtidos 89 isolados a partir de 12 amostras, na ilha Santa Cruz 45 isolados de 19 amostras e na ilha Isabela seis isolados de quatro amostras. Dos isolados obtidos, foram identificados 15 gêneros e 35 espécies de leveduras. Bhadra e colaboradores (2008) isolaram 239 leveduras pertencentes a 18 gêneros, a partir de 52 amostras de cascas de árvores da Índia cultivadas em ágar extrato de malte e extrato de levedura (YMA). O número de isolados do presente estudo (140) foi menor que os obtidos pelos autores citados, no entanto o número de gêneros foi similar (15); em ambos os trabalhos foram identificadas espécies pertencentes aos gêneros Pichia, Debaryomyces e Issatchenkia. Cadete e colaboradores (2012) coletaram madeira em decomposição em duas localidades da Floresta Amazônica Brasileira e isolaram 224 leveduras, pertencentes a 33 espécies. Apesar das leveduras estudadas no presente trabalho terem sido coletadas em um ambiente com condições naturais diferentes do anterior, por ser um arquipélago do oceano Pacífico, o número de espécies (35 espécies a partir de 140 isolados) identificadas foi similar. Entretanto, cinco novas espécies de leveduras foram isoladas por Cadete e colaboradores, enquanto no presente estudo foi obtida apenas uma nova espécie. Espécies dos gêneros Candida, Cryptococcus, Debaromyces, Scheffersomyces e Trichosporon coincidiram nos dois estudos. Dentre as leveduras encontradas no presente estudo, 99 isolados assimilaram D-xilose (70,7 % do total de isolados). Este resultado foi maior que o obtido por Rao e colaboradores (2008) no qual foram isoladas 374 leveduras de cascas de árvore e frutos em decomposição. Destas, somente 27 foram capazes de assimilar xilose (11,3% do total dos isolados). Várias espécies foram encontradas em ambos os trabalhos, principalmente as dos gêneros Pichia, Candida, Debaryomyces, Cryptococcus e Issatchenkia. Na Tabela 2 e no Apêndice 1 são mostrados a Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 36 identificação das espécies, o número de isolados, o meio de isolamento, o número da amostra em que cada isolado foi obtido e a capacidade de assimilação de Dxilose pelas leveduras testadas. Em um estudo similar, Guo e colaboradores (2006) isolaram 274 leveduras em meio YPX (extrato de levedura, peptona e xilose), dos quais somente 45 apresentaram crescimento positivo em D-xilose como única fonte de carbono, correspondendo a 16,4% dos isolados. No presente estudo, das 100 leveduras isoladas em meio YNB-D-xilose, 63 apresentaram crescimento positivo para esta fonte de carbono, representando 63% dos isolados. Do total de isolados obtidos nos três meios de cultura utilizados no presente trabalho, 99 apresentaram resultados positivos para a assimilação de D-xilose. Os gêneros de leveduras assimiladoras que tiveram resultados positivos em ambos os estudos correspondem a Candida, Trichosporon, Geotrichum e Pichia. Das 35 espécies de leveduras identificadas, algumas foram restritas a pelo menos uma das ilhas e outras foram encontradas em mais de uma localidade. Vinte e quatro espécies foram identificadas na Ilha Floreana, 20 na ilha Santa Cruz e três na ilha Isabela. A distribuição das espécies encontradas nessas localidades está representada na Figura 5. Figura 5 - Distribuição do número de espécies de leveduras nos locais de coleta. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 37 Tabela 2 - Identificação das espécies, código dos isolados e assimilação de D-xilose pelas leveduras obtidas neste trabalho a partir de amostras de madeira em decomposição coletadas no arquipélago de Galápagos, Equador Espécie 1 Candida (Lodderomyces) albicans C. (Yamadazyma) amphixiae C. (Yamadazyma) dendronema C.(Kazachstania) humilis C. (Metschnikowia) intermedia C. naeodendra Assimilação de Dxilose Código 2 3 CLQCA -24 F -067, F-157, F-161b, F-163 + F-171 + F-137, F-177 4 + CLQCA-24SC -121 - F-150, SC-315 + F-110 + F-011, F-041, F-065, C. (Kurtzmaniella) natalensis F-101, F-105, F-134, F-136, F-146, F-149, ± F-169 C. (Lodderomyces) parapsilosis C. (Metschnikowia) pseudointermedia SC-266 + F-005, F-035, F-113, SC-240 + F-127, SC-027, SC-087, C. sinolaborantium SC-144, SC-207, SC-262, + SC-331 C. (Saturnispora) silvae F-047, F-063, F-096, F-111, F-130, F-156 - F-042, F-052, F-066, F-081, F-084, F-087, F-092, F-109, F-112, C.(Lodderomyces/Spathaspora) tropicalis F-115, F-119, F-123, F-125, F-126, F-151, + F-167, SC-0111, SC-122, SC-209, SC-239, SC-246, SC-322 C. (Yamadazyma) trypodendroni SC-018, SC-019, SC-023, SC-024, SC-118, SC-325 + F-143, 1 2 5 CLQCA -24 I -099 + Cr. (Bulleromyces) humicola SC-133 + Cr. (Bulleromyces) laurentii I-130, I-161, SC-043 + SC-244 + Cryptococcus (Bulleromyces) flavescens Debaryomyces hansenii D. nepalensis Galactomyces geotrichum F-128, SC-223, SC-232, SC-305 F-020, F-133, SC-070, SC-114 + + Continua… Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 38 Tabela 2, Cont. Espécie Geotrichum silvicola Issatchenkia terricola Kazachstania exigua Código Assimilação de Dxilose SC-132 + F-034, F-068, F-161a, F-174 SC-173 ± + F-069, F-070, F-071, F-072, F-073, F-076, K. unispora F-077, F-080, F-086, - F-104, F-164, F-165, F-166, SC-045, SC-185 Lindnera saturnus SC-206 - Lindnera sp. SC-025 + Pichia manshurica Scheffersomyces stipitis Torulaspora delbrueckii Trichosporon coremiiforme F-039, F-061, F-079, F-082, F-083, F-154 SC-320, SC-321 F-040, F-064, F-074, F-075, F-078, F-093 + - F-095 + Tr. jirovecii F-006, F-145, SC-217 + Tr. laibachii F-094b + Tr. multisporon F-094a + F-118, F-178 + F-129, I-107, I-154, I-194 + Wickerhamomyces anomalus Yamadazyma (Pichia) mexicana F-097, F-144, F-152, Zygowilliopsis californica SC-131, SC-143, SC-164, + SC-196, SC-306, SC-314 1 CLQCA = Coleção de Leveduras Quito - Católica. 24 = Número designado para a província das ilhas do arquipélago de Galápagos segundo a base de dados da CLQCA. 3 F = Leveduras coletadas na ilha Floreana. 4 SC = Leveduras coletadas na ilha Santa Cruz. 5 I = Leveduras coletadas na ilha Isabela. 2 As espécies isoladas na ilha Floreana que também foram encontradas na ilha Santa Cruz foram Candida intermedia, C. pseudointermedia, C. sinolaborantium, C. tropicalis, Debaryomyces nepalensis, Galactomyces geotrichum, Kazachstania unispora, Trichosporon jirovecii e Zygowilliopsis californica. Na ilha Isabela foram obtidos poucos isolados de leveduras, sendo três de Yamadazyma mexicana e um de Cryptococcus flavescens, espécies também encontradas na ilha Floreana, e dois de Cr. laurentii, espécie também presente na Ilha Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 39 O baixo número de isolados coletados na ilha Isabela pode estar relacionado às condições climáticas desfavoráveis da ilha, caracterizadas pelo clima muito seco e subtropical nas partes baixas do vulcão “Sierra Negra” (PARQUE NACIONAL GALÁPAGOS, 2012). Esse é considerado um dos dez vulcões mais perigosos do mundo, pela constante atividade. Nos últimos 200 anos foram registradas mais de 60 erupções, sendo a última em 2005 (DIARIO EL HOY, 2005; PLANETA AZUL, 2011). Desta forma, essas condições climáticas podem fazer do ambiente um local hostil e inóspito para a sobrevivência de muitos micro-organismos. As espécies Candida albicans, C. amphixiae, C. dendronema, C. naeodendra, C. natalensis, C. silvae, Issatchenkia terricola, Pichia manshurica, Torulaspora delbrueckii, Trichosporon coremiiforme, Tr. laibachii, Tr. multisporon e Wickerhamomyces anomalus foram isoladas somente na ilha Floreana. As espécies C. humilis, C. parapsilosis, C. trypodendroni, Cr. humicola, Debaryomyces hansenii, Geotrichum silvicola, Kazachstania exigua, Scheffersomyces stipitis, Lindnera (Williopsis) saturnus e Lindnera sp. foram encontradas somente na ilha de Santa Cruz. A partir das amostras de madeira em decomposição, o meio de cultivo para isolamento das leveduras em que se observou maior crescimento foi em D-xilose, com 100 isolados, seguido do meio CMC, com 23 isolados. No meio xilana cresceram o menor número de isolados, obtendo-se 17 leveduras (Apêndice 1). Em relação à assimilação de D-xilose, todas as leveduras isoladas em xilana foram capazes de assimilar essa pentose. Dos isolados crescidos em CMC, 19 foram capazes de assimilar D-xilose (82,6%) e quatro isolados foram negativos (17,4%). Em relação às leveduras isoladas em D-xilose, 63 (o que corresponde a 63%) apresentaram assimilação positiva e 37 (37%) não foram capazes de assimilar Dxilose como única fonte de carbono. O crescimento destas leveduras pode ter sido devido a presença de nutrientes originários da madeira inoculada nos meios de cultura. Estas podem conter outros açúcares que tenham favorecido o crescimento de leveduras não assimiladores de D-xilose (CARVALHO et al., 2009). Os isolados negativos para a assimilação de D-xilose como única fonte de carbono, obtidos no presente estudo, pertencem às espécies C. humilis, C. natalensis, C. silvae, I. terricola, K. unispora, P. manshurica, T. delbrueckii e L. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 40 saturnus. Os isolados pertencentes ao clado Lodderomyces/Spathaspora, Kurtzmaniella e Yamadazyma representados pelas espécies Candida tropicalis, C. natalensis e C. trypodendroni foram identificados como predominantes no presente estudo. As espécies do clado Lodderomyces/Spathaspora têm sido caracterizadas por abrigar os isolados de leveduras melhores produtores de xilitol (FELIPE et al., 1993; WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998; JUCOSKY et al., 2007). Pessoa (1997) avaliou 22 espécies diferentes de leveduras em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar e constatou que as espécies de Candida foram as que melhor cresceram nesse meio de cultivo. As espécies mais estudadas dentro desse gênero, pela alta produtividade e rendimento de xilitol, são C. tropicalis (PESSOA, 1997; CHOI et al., 2000, RAO et al., 2006; CHENG et al., 2009; MISRA et al., 2011), C. guilliermondii (BARBOSA et al., 1988; ROBERTO et al., 1995; LEE et al., 1996; FELIPE et al., 1997; ALVES et al., 1998; OOI et al., 2002; DA SILVA et al.,2007; JUCOSKI et al., 2007; SENE et al., 2011), C. parapsilosis (PREZIOSI-BELLOY et al., 1997; DEOK-KUN, 1998), C. boidinii (VANDESKA et al., 1995) e C. peltata (SAHA e BOTHAST, 1999). A espécie C. tropicalis, com maior número de isolados no presente estudo (22), já foi reportada como associada a amostras de árvores, frutas, flores, cactos, solo, água e espécimes clínicos. As aplicações biotecnológicas dessa levedura têm sido registradas, por causa de sua habilidade de degradação de hidrocarbonos e biotransformação de lipídeos, e nos processos de tratamento biológico aeróbio para degradação de polifenóis em águas residuais (ETTAYEBI et al., 2003; KURTZMAN et al., 2011). Desde a década de 1970, essa espécie vem sendo estudada pela capacidade de fermentar resíduos agroindustriais, produzindo xilitol (BARBOSA et al., 1988; WALTHER et al.,2001; GRANSTRÖM, 2002; LIMA et al., 2003; LIMA, 2006; JUCOSKY et al., 2007; SCHIRMER, 2007). Na Tabela 2 e Apêndice 2 são mostrados os resultados de identificação das leveduras segundo as análises das sequências dos domínios D1/D2 e da região ITS. O poder discriminatório das sequências da região D1/D2 é, na maioria dos casos, considerado suficiente para descrever novas espécies de leveduras. Isolados da mesma espécie apresentam no máximo de duas a três bases diferentes não contíguas em uma região de cerca de 600 nucleotídeos (KURTZMAN e FELL, 2006). Com base nesse conceito, o isolado CLQCA-24SC-025 representa uma nova Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 41 espécie, pertencente ao gênero Lindnera. Essa espécie difere em 34 substituições e seis gaps na região D1/D2 da espécie mais próxima, Lindnera saturnus. Em relação ao sequenciamento da região ITS, a nova espécie apresentou 28 substituições e dez gaps, comparada com L. saturnus (Apêndice 2). Especies do gênero Lindnera geralmente estão associadas a insetos, frutas ou solo (KURTZMAN et al., 2011). O agrupamento por métodos moleculares utilizando o iniciador EI1 foi importante para discriminação das espécies de leveduras isoladas. Algumas espécies apresentaram elevado grau de polimorfismo, principalmente C. tropicalis, K. unispora e C. natalensis, possivelmente por ser esse iniciador complementar a uma região muito conservada do genoma das leveduras. A eficácia do iniciador EI1 na discriminação de diferentes espécies de leveduras tem sido reportada por vários autores. De Barros Lopes e colaboradores (1996) relataram que o método baseado em PCR com este iniciador tem sido eficaz para diferenciar linhagens de leveduras presentes em vinhos, com a vantagem de poder analisar várias amostras em pouco tempo. Outros autores também consideram essa metodologia uma excelente ferramenta para detectar polimorfismos entre linhagens contaminantes de processos de fermentação (PATARO et al., 2000; GUERRA et al., 2001, COSTA-SILVA et al., 2010). As Figuras 6, 7 e 8 exibem a impressão digital do DNA para discriminação dos isolados de leveduras com a utilização desse iniciador. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 42 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 2072 1500 600 400 200 100 Figura 6 - Impressão digital do DNA utilizando o iniciador EI-1 para discriminação dos isolados de leveduras. M, marcador de pesos moleculares de 100 bp (Invitrogen DNA Ladder); canaletas de 1 a 5, amplificação de isolados de Pichia manshurica; canaletas de 6 a 11, isolados de Candida (Yamadazyma) trypodendroni; e canaletas de 12 a 14, isolados de Galactomyces geotrichum. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 2072 1500 600 400 200 100 Figura 7 - Impressão digital do DNA utilizando o iniciador EI-1 para discriminação dos isolados de leveduras. M, marcador de pesos moleculares de 100 bp (Invitrogen DNA Ladder); canaletas de 1 a 10, amplificação de isolados de Candida (Kurtzmaniella) natalensis; canaletas de 11 a 16, isolados de Zygowilliopsis californica; e canaletas 17 e 18, isolados de Candida (Saturnispora) silvae. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 43 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2072 1500 600 400 200 100 A M 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 2072 1500 600 400 200 100 B Figura 8 - Impressão digital do DNA utilizando o iniciador EI-1 para discriminação dos isolados de leveduras. A. M, marcador de pesos moleculares de 100 bp (Invitrogen DNA Ladder); e canaletas de 1 a 19, amplificação de isolados de Candida (Lodderomyces/Spathaspora) tropicalis. B. M, marcador de pesos moleculares de 100 bp; canaletas de 20 a 24 isolados de Candida sinolaborantium; canaletas de 25 a 30, isolados de Torulaspora delbrueckii; canaletas de 31 a 34, isolados de Debaryomyces nepalensis; e canaletas de 35 a 38 representam o perfil molecular de isolados de Issatchenkia terricola. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 44 5.2 Seleção de leveduras para produção de xilitol a partir de D-xilose 5.2.1 Avaliação das leveduras assimiladoras de D-xilose e seleção das leveduras produtoras de xilitol Dos 140 isolados testados, 99 foram capazes de assimilar D-xilose como fonte de carbono. Dentre os isolados positivos para assimilação da D-xilose, 50 produziram xilitol (50,5%). Os exemplares que apresentaram valores acima de 12 g.L-1 em 48 horas, para produção de xilitol no ensaio em tubos contendo o meio YPX, foram testados nas fermentações posteriores. As leveduras selecionadas foram C. pseudointermedia CLCQA-24F-113, C. sinolaborantium CLCQA-24F-127, C. sinolaborantium CLCQA-24SC-027, C. tropicalis CLCQA-24F-125, S. stipitis CLCQA-24SC-321, Lindnera sp. CLCQA-24SC-025 e Zygowilliopsis californica CLQCA-24SC-143 (Tabela 3) por ter produzido as maiores quantidades de xilitol nas condições testadas. O potencial fermentativo destas espécies são avaliadas no seguinte item. No metabolismo da D-xilose nas leveduras, esta pentose é reduzida a xilitol pela xilose redutase NADPH-dependente e o xilitol é oxidado para xilulose pela xilose desidrogenase NAD-dependente. A regeneração dos cofatores encontra-se fortemente ligada à disponibilidade de oxigênio, e pode causar o desbalanço redox, que interfere na produção de xilitol e dos subprodutos do metabolismo (GRANSTRÖM, 2002). A regeneração do cofator NADPH para a atividade da xilose redutase (XR) ocorre na via da pentose fosfato e a regeneração do NAD + ocorre somente na cadeia respiratória, com o oxigênio como aceptor final de elétrons (WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998). Desta forma, em condições limitadas de oxigênio observa-se aumento de NADH, que não pode ser oxidado a NAD, evitandose assim a oxidação do xilitol à xilulose, o que permite a acumulação do xilitol no meio (SENE et al., 2000). Portanto, a disponibilidade de oxigênio desempenha papel importante na produção de xilitol; a maioria das leveduras produz xilitol, principalmente sob condições microaeróbicas. Os resultados mostrados na Tabela 3, referentes à capacidade de diferentes espécies produzir xilitol, variam segundo o isolado testado. As espécies pertencentes aos clados Lodderomyces/Spathaspora são consideradas um conjunto de micro-organismos modelo para o estudo da produção de xilitol por ter bem desenvolvido a via da pentose fosfato e poder crescer Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 45 em xilose como única fonte de carbono e energia (GRANSTRÖM, 2002). Neste grupo, C. tropicalis tem sido registrada por vários autores como produtora de xilitol utilizando-se meio sintético e hidrolisado hemicelulósico de materiais lignocelulósicos. Da Silva e Afschar (1994), Choi e colaboradores (2000), e Arrizon e colaboradores (2010) verificaram a produção de xilitol dessa espécie a partir da conversão da D-xilose em meio sintético, utilizando condições de microaerofilia. Os autores sugerem a utilização dessa levedura para produção biológica de xilitol pela eficiência da conversão da D-xilose, melhor produção de xilitol em comparação a outros micro-organismos, além dos custos benéficos em comparação com o processo químico. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 46 Tabela 3 - Produção (mM) e concentração (g.L-1) de xilitol e etanol no ensaio de fermentação de D-xilose em tubos com meio YPX Código Espécie Xilitol (mM) Xilitol -1 (g.L ) Etanol (mM) Etanol -1 (g.L ) CLCQA-24F-171 Candida amphixiae 7,56 3,83 3,61 0,55 CLCQA-24F-150 C. intermedia 8,58 4,35 - - CLCQA-24F-110 C. naeodendra 6,77 3,43 1,94 0,3 CLCQA-24F-113 C. pseudointermedia 12,94 6,55 28,35 4,35 CLCQA-24F-127 C. sinolaborantium 15,42 7,81 27,78 4,26 CLQCA-24SC-027 C. sinolaborantium 15,39 7,8 15,76 2,42 CLCQA-24SC-207 C.sinolaborantium 12,08 6,12 -0,4 -0,06 CLCQA-24SC-331 C. sinolaborantium 12 6,08 29,43 4,52 CLCQA-24SC-144 C. sinolaborantium 11,92 6,04 -0,4 -0,06 CLQCA-24SC-262 C. sinolaboratium 11,63 5,89 -0,45 -0,07 CLCQA-24SC-087 C. sinolaborantium 9,53 4,83 - - CLCQA-24F-125 C. tropicalis 13,38 6,78 23,43 3,59 CLCQA-24F-151 C. tropicalis 11,14 5,64 24,76 3,8 CLCQA-24SC-111 C. tropicalis 10,77 5,46 -0,51 -0,08 CLCQA-24SC-122 C. tropicalis 9,92 5,03 4,6 0,71 CLCQA-24SC-209 C. tropicalis 9,44 4,78 5,52 0,85 CLCQA-24F-119 C. tropicalis 8,52 4,32 - - CLCQA-24SC-239 C. tropicalis 8,47 4,29 - - CLCQA-24SC-322 C. tropicalis 8,15 4,13 5,55 0,85 CLCQA-24F-109 C. tropicalis 7,75 3,93 - - CLCQA-24F-123 C. tropicalis 7,45 3,78 - - CLCQA-24F-084 C. tropicalis 7,42 3,76 - - CLCQA-24F-087 C. tropicalis 7,24 3,67 - - CLCQA-24F-081 C. tropicalis 7,17 3,63 - - CLCQA-24F-042 C. tropicalis 7,04 3,57 - - CLCQA-24F-115 C. tropicalis 7,04 3,57 - - CLCQA-24F-052 C. tropicalis 7 3,55 - - CLCQA-24F-066 C. tropicalis 6,93 3,51 - - CLCQA-24F-167 C. tropicalis 6,57 3,33 3,93 0,6 CLCQA-24F-092 C. tropicalis 6,38 3,23 - - CLCQA-24F-126 C. tropicalis 6,31 3,2 3,44 0,53 CLCQA-24SC-246 C. tropicalis 6,28 3,18 - - CLCQA-24SC-232 Debaryomyces nepalensis 9,64 4,88 -0,45 -0,07 CLCQA-24SC-070 Galactomyces geotrichum 10,94 5,54 5,1 0,78 CLCQA-24SC-025 Lindnera sp. 12,22 6,19 -0,51 -0,08 CLCQA-24SC-321 Scheffersomyces stipitis 15,24 7,72 24,82 3,81 CLCQA-24SC-320 S. stipitis 7,36 3,73 2,35 0,36 CLCQA-24F-095 Trichosporon coremiiforme 7,46 3,78 - - CLCQA-24F-094b Tr. laibachii 5,76 2,92 - - Continua… Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 47 Tabela 3, Cont. Código Espécie Xilitol (mM) Xilitol -1 (g.L ) Etanol (mM) Etanol -1 (g.L ) CLCQA-24F-118 Wickerhamomyces anomalus 8,45 4,28 - - CLCQA-24SC-143 Zygowilliopsis californica 15,18 7,69 29,24 4,49 CLCQA-24I-194 Yamadazyma mexicana 11,48 5,82 -0,47 -0,07 CLQCA-24I-107 Y. mexicana 11,3 5,73 - - CLQCA-24I-154 Y. mexicana 11,01 5,58 -0,34 -0,05 CLCQA-24SC-164 Z. californica 11,35 5,75 -0,33 -0,05 CLCQA-24SC-196 Z. californica 10,85 5,5 -0,42 -0,06 CLQCA-24SC-306 Z. californica 8,5 4,31 4,69 0,72 CLCQA-24F-097 Z. californica 8,04 4,07 4,18 0,64 CLCQA-24F-144 Z. californica 7,4 3,75 3,47 0,53 CLCQA-24F-152 Z. californica 7,39 3,74 4,26 0,65 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 48 5.3 Ensaios de fermentação em meio com D-xilose e em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 5.3.1 Fermentação em meio semi-sintético contendo D-xilose Com base nos ensaios de triagem realizados previamente (item 5.2), foram selecionadas as leveduras C. pseudointermedia CLCQA-24F-113, C. tropicalis CLCQA-24F-125, C. sinolaborantium CLCQA-24F-127 e CLCQA-24SC-027, Lindnera sp. CLCQA-24SC-025, Z. californica CLQCA-24SC-143 e S. stipitis CLCQA-24SC-321 para serem testadas em ensaios de fermentação em meio com D-xilose (50 g.L-1). Em relação à concentração de D-xilose inicial utilizada, Silva e Afschar (1994) observaram que altas concentrações de xilose (próximas a 200 g.L -1) inibem o crescimento de C. tropicalis e que a produtividade específica máxima para essa espécie foi alcançada em concentração inicial de xilose de 50 g.L -1, concentração esta que foi utilizada no presente estudo. Além disto, os autores mostraram uma conversão de D-xilose em xilitol muito mais rápida nessa concentração de açúcar do que em outras concentrações testadas. Esses dados foram corroborados por estudos feitos por Felipe e colaboradores (1997), com C. guilliermondii. Sendo assim, uma concentração inicial de xilose de 50 g.L -1 pode ser considerada ideal para o favorecimento da produção de xilitol em processos fermentativos para essas espécies de leveduras. Os resultados dos parâmetros de fermentação, [Yp/s (g.g-1); rendimento de xilitol, Qp (g.L-1.h-1); produtividade do xilitol, Yx/s (g.g-1); conversão de substrato em biomassa, (%); eficiência de conversão; e consumo de D-xilose (%)] estão resumidos na Tabela 4. Esses resultados foram obtidos segundo o tempo de produção máxima de xilitol para cada levedura. Todas as espécies testadas demonstraram capacidade de consumir D-xilose como fonte de carbono, tendo este consumo variado de 42,18 a 99,22%. As espécies que apresentaram maior consumo desta pentose foram as linhagens de C. tropicalis CLQCA-24F-125 (99,22%), C. pseudointermedia CLQCA-24F-113 (87,51%) e Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 (85,54%), após 72 horas de fermentação. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 49 Tabela 4 - Produção de xilitol [Yp/s (g.g-1)], rendimento de xilitol [Qp (g.L-1.h-1)], produtividade de xilitol [Yx/s (g.g-1)], conversão de substrato em biomassa [ (%)], eficiência de conversão e consumo de D-xilose (%), produção de biomassa, etanol e xilitol (g.L-1) e tempo de fermentação (h) em experimentos de fermentações em meio semi-sintético com D-xilose para as leveduras testadas. Espécies e Linhagens Candida pseudointermedia CLQCA-24F-113 C. sinolaborantium CLQCA-24F-127 C. sinolaborantium CLQCA-24SC-027 C. tropicalis CLQCA-24F-125 Scheffersomyces stipitis CLQCA-24SC-321 Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 Zygowilliopsis californica CLQCA-24SC-143 Consumo de D-xilose (%) 1 Células -1 Yx/s -1 2 Yp/x -1 3 Qp -1 -1 4 Etanol 5 -1 (g.L ) Yp/s Xilitol -1 6 (g.g ) -1 (g.L ) Tempo de Fermentação (g.L ) (g.g ) (U.g ) (g.L .h ) (%) 87,51 4,99 0,14 2,89 0,27 43,06 5,36 0,39 13,90 48 55,50 7,61 0,30 0,83 0,08 27,21 0,75 0,25 5,86 72 42,18 6,23 0,33 0,77 0,06 27,85 0,13 0,25 4,41 72 99,22 6,85 0,17 3,96 0,34 73,66 0,02 0,67 25,63 72 52,87 8,53 0,36 0,05 0,005 1,87 3,81 0,02 0,36 72 85,54 5,22 0,14 3,50 0,23 55,47 0,92 0,50 17,01 72 46,94 5,83 0,26 0,32 0,02 9,32 0.,61 0,09 1,86 72 (h) 7 1 Consumo de D-xilose (%) – porcentagem de D-xilose inicial consumida. -1 Yx/s (g.g )- rendimento de células por grama de massa celular produzida, por grama de xilose consumida. 3 -1 Yp/x (U.g )- rendimento de produto (mgxil) por massa celular (gcél) 4 -1 -1 -1 Qp (g.L .h )- produtividade de xilitol: concentração de xilitol produzido (g.L ) por tempo (h). 2 5 6 (%)- eficiência de conversão: razão entre o fator de rendimento (YP/S) obtido e o fator de rendimento teórico (0,917 grama de xilitol/gramas de xilose). -1 Yp/s(g.g )- rendimento de xilitol: xilitol produzido (P) por massa de xilose consumida (S). 7 -1 Tempo no qual foi obtida a máxima produção de xilitol (g.L ). Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 50 De maneira geral, a linhagem C. tropicalis CLQCA-24F-125 apresentou resultados promissores para a produção de xilitol de acordo com as condições testadas, com uma concentração deste poliálcool de 25,6 g.L-1, rendimento de 0,67 g.g-1, eficiência de fermentação de 73,7% e produtividade em xilitol de 0,34 g.L-1.h-1. Resultados semelhantes foram obtidos por Cadete e colaboradores (2012) onde relataram a espécie Candida amazonensis como a maior produtora de xilitol em meio contendo D-xilose (50 g.L-1) suplementado com extrato de levedura e peptona. A espécie apresentou valores máximos de produção de xilitol de 27,8 g.L-1 e um rendimento de 0,67 g.g-1 após 48 horas de fermentação. Vários autores já têm utilizado C. tropicalis como produtora de xilitol. De Mello (2009) obteve uma produção de xilitol de 32,9 g.L-1 a partir de uma linhagem desta espécie em meio com 50 g.L-1 de D-xilose suplementado com uréia e peptona, após 72 horas de fermentação. Os parâmetros fermentativos alcançaram um rendimento de 0,65 g.g-1, produtividade de 0,35 g.L-1.h-1 e eficiência de 61%. Para a linhagem de C. tropicalis testada no presente trabalho, foram obtidos parâmetros de fermentação como rendimento e produtividade similares, além de uma maior eficiência de conversão da D-xilose em xilitol (73,7%). A segunda espécie com os valores de parâmetros fermentativos maiores para produção de xilitol foi a nova espécie Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 apresentando um rendimento (0,5 g.g-1) e eficiência de fermentação (55,5%). A produtividade em xilitol atingida por esta levedura (0,23 g.L1 .h-1) foi menor que a obtida por C. pseudointermedia CLQCA-24F-113 (Qp 0,27 g.L- 1 .h-1), embora para esta espécie o rendimento (0,39 g.g-1) e a eficiência foram menores (43%) que os parâmetros obtidos para Lindnera sp. Para a levedura C. pseudointermedia CLQCA-24F-113 pode se observar no Apêndice 3 (Figura 3.1) uma diminuição na concentração de xilitol a partir de 48 h, indicando um provável direcionamento deste produto para a produção de etanol e/ou uso pela levedura como fonte de carbono em consequência do gasto da xilose a partir do meio (CADETE et al., 2012). Esta diminuição da produção de xilitol coincide com a maior produção de etanol obtido pelas leveduras testadas neste ensaio. Por outro lado, observa-se no Apêndice 3 (Figura 3.4) uma escassa produção de xilitol nas primeiras horas de fermentação pela espécie Lindnera sp., sugerindo que a levedura pode ter precisado de maior tempo de adaptação ao meio até conseguir a máxima produção de xilitol. A última espécie selecionada para ser testada em meio contendo hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar foi C. sinolaborantium CLQCA-24F-127. Em comparação com linhagem C. sinolaborantium CLQCA-24SCPrograma de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 51 027, esta levedura apresentou maior consumo de D-xilose, produção de xilitol e produtividade. Esta espécie tem sido isolada de intestino de besouros e de larva de Cerambycidae, sendo este o primeiro relato do isolamento desta levedura de madeira em decomposição. Possivelmente, os insetos associados a madeira em decomposição seriam os vetores desta levedura. As aplicações biotecnológicas, alimentícias e importância clínica desta espécie de levedura ainda são desconhecidas (KURTZMAN et al., 2011). Por este motivo, esta levedura foi selecionada para o estudo sobre a produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico. Relatos de estudos de fermentação em meio contendo D-xilose suplementado para as espécies Candida pseudointermedia, C. sinolaborantium e Zygowilliopsis californica são desconhecidos. A espécie Scheffersomyces stipitis tem sido estudada para produção de etanol e xilitol em meio sintético. Esta espécie é considerada uma espécie fermentadora de D-xilose, produtora de etanol lignocelulósico, com baixa produção de xilitol (AGBOGBO et al., 2008; CADETE et al., 2012). Agbogbo e Wenger (2007) mostraram um consumo de xilose acima de 85 % em 48 h por S. stipitis CBS 6054 em meio sintético contendo aproximadamente 20 g.L-1 de xilose, 5 g.L-1 de glicose suplementado com nutrientes. Estudos realizados por Cadete e colaboradores (2012) utilizando D-xilose em meio sintético, obtiveram uma eficiência de consumo de 69,5% de xilose em 24 horas encontrada para a levedura S. stipitis em meio contendo xilose 50 g.L-1, extrato de levedura 10 g.L-1 e peptona 20 g.L-1, obtendo uma concentração máxima de 15 g.L-1 de etanol e 1,3 g.L-1 de xilitol. No presente estudo, a linhagem de S. stipitis obteve a produção mais baixa de xilitol dentre as leveduras testadas (0,36 g.L-1), enquanto alcançou uma concentração de 3,81 g.L-1 de etanol (Tabela 4), consumindo a metade da D-xilose disponível no meio. Estes resultados contrastam com os obtidos por outros autores, como Ferreira e colaboradores (2011), onde o consumo deste açúcar por S. stipitis foi de 93,3%, com uma produção de etanol de 6,4 g.L-1 em meio com 30 g.L-1 de xilose suplementada com extrato de levedura. Ferreira e colaboradores (2011) sugerem que a formação de baixas quantidades de co-produtos é importante para elevar a formação dos produtos principais da fermentação como o etanol. A produção de etanol foi observada por todas as leveduras testadas confirmando a habilidade de fermentar xilose a etanol. Os maiores valores de concentração de etanol foram produzidos pelas linhagens C. pseudointermedia CLQCA-24F-113, atingindo a maior Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 52 produção de 6,2 g.L-1 com 72 horas de fermentação (Tabela 4). Z. californica CLQCA-24SC-143 produziu 2,7 g.L-1 de etanol após 24 horas de fermentação. A linhagem de S. stipitis CLQCA-24SC-321 atingiu uma concentração de etanol de 4 g.L-1 com 48 horas de fermentação (Apêndice 3). 5.3.2 Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar em escala de bancada Candida tropicalis CLQCA-24F-125 apresentou a maior produção de xilitol, tanto no meio contendo D-xilose como única fonte de carbono quanto no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Observando a Tabela 5 verifica-se que os melhores resultados de produtividade e rendimento em xilitol foram obtidos no meio com hidrolisado hemicelulósico suplementado, que alcançou rendimento de 0,67 g.g-1 e produtividade de 0,38 g.L-1.h-1. Arrizon e colaboradores (2011) obtiveram uma linhagem de C. tropicalis produtora de xilitol em hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar, com rendimento máximo de 0,4 g.g-1 e produtividade de 0,15 g.L1 .h-1. Pessoa (1997) e Rao e colaboradores (2006), trabalhando com essa espécie, também obtiveram rendimentos máximos de 0,50 g.g-1 e 0,43 g.g-1, respectivamente. Esses autores encontraram valores inferiores aos obtidos no presente trabalho para produção de xilitol. A segunda espécie com maior produção de xilitol foi Lindnera sp., que produziu 23,9 g.L-1 após 72 horas. Segundo Kurtzman e colaboradores (2011), Lindnera saturnus, é conhecida pela capacidade de assimilar xilose. Kamat e colaboradores (2012) relataram essa espécie como produtora de xilitol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Os autores obtiveram rendimento de 0,51 g.g-1 após 72 horas, com consumo de 3,74 g.L-1 de xilose, sendo a concentração inicial de 20 g.L-1. Comparando com os resultados obtidos no presente estudo para Lindnera sp. CLQCA-24SC-025, pode-se observar maior rendimento (0,64 g.g-1) no mesmo tempo de fermentação, com consumo de 2,68 g.L1 de xilose, pela nova espécie de levedura. Rao e colaboradores (2007) ressaltam que isolados com produção acima de 0,5 g.g-1 são considerados produtores de elevadas concentrações de xilitol; aqueles que produzem entre 0,25 e 0,5 g.g-1 são produtores médios; e os isolados que produzem menos de 0,25 g.g-1 são referidos como produtores de baixas concentrações de xilitol. Pelos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se recomendar as espécies C. tropicalis CLQCA-24F-125 e Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 53 Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 como produtoras de altas concentrações de xilitol em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar como meio de fermentação. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 54 Tabela 5 - Produção de xilitol [Yp/s (g.g-1)], rendimento de xilitol [Qp (g.L-1.h-1)], produtividade de xilitol [Yx/s (g.g-1)], conversão de substrato em biomassa [ (%)], eficiência de conversão e consumo de D-xilose (%), produção de biomassa, etanol e xilitol (g.L-1) e tempo de fermentação (h), em fermentações em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar pelas leveduras testadas. Consumo de Espécies D-xilose (%) 1 Células -1 Yx/s Yp/x -1 2 (g.L ) (g.g ) 99,19 11,99 95,71 -1 3 Qp -1 -1 4 (U.g ) (g.L .h ) 0,26 1,48 0,13 11,17 0,27 1,83 99,08 11,07 0,26 93,23 5,96 0,15 (%) Etanol 5 -1 xy Yp/s -1 6 Xilitol -1 Tempo de Fermentação 7 (g.L ) (g.g ) (g.L ) (h) 42,94 4,05 0,39 15,55 120 0,16 53,8 4,08 0,49 19,48 120 2,63 0,38 73,50 2,50 0,67 27,12 72 4,32 0,33 70,58 3,36 0,64 23,98 72 Candida pseudointermedia CLQCA-24F-113 C.sinolaborantium CLQCA-24F-127 C. tropicalis CLQCA-24F-125 Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 1 Consumo de D-xilose (%) – porcentagem de D-xilose inicial consumida. -1 Yx/s (g.g )- rendimento de células por grama de massa celular produzida, por grama de xilose consumida. 3 -1 Yp/x (U.g )- rendimento de produto (mgxil) por massa celular (gcél) 4 -1 -1 -1 Qp (g.L .h )- produtividade de xilitol: concentração de xilitol produzido (g.L ) por tempo (h). 5 (%)- eficiência de conversão: razão entre o fator de rendimento (YP/S) obtido e o fator de rendimento teórico ( 0,917 grama de xilitol/gramas de xilose). 6 -1 Yp/s(g.g ) - rendimento de xilitol: xilitol produzido (P) por massa de xilose consumida (S). 7 -1 Tempo no qual foi obtida a máxima produção de xilitol (g.L ). 2 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 55 Trabalhos realizados utilizando-se a levedura C. guilliermondii têm sido reportados com maior rendimento e produtividade em xilitol do que fermentações conduzidas com C. tropicalis. Alves e colaboradores (1998) obtiveram 0,79 g.g-1 de xilitol em experimentos com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar fermentado por C. guilliermondii. Resultados similares foram verificados por Arruda (2011), trabalhando com a mesma espécie, cujo rendimento foi de 0,78 g.g-1 de xilitol quando esse substrato foi utilizado para fermentação em escala de bancada. As espécies testadas no presente estudo apresentaram produtividade inferior à obtida para linhagens de C. guilliermondii, relatadas por outros autores. No entanto, C. tropicalis e Lindnera sp., testadas no presente estudo quanto à produção de xilitol (Tabela 5), quando comparadas com outras espécies, como Spathaspora spp., testadas por Cadete e colaboradores (2012), apresentaram rendimento maior. Dependendo do meio de cultivo, pode-se obter maior ou menor rendimento e produtividade de xilitol pelas leveduras. A adição de sulfato de amônio e farelo de arroz como suplementos tanto no meio contendo D-xilose como nas fermentações com hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar pode ter influenciado o crescimento das leveduras nos experimentos realizados no presente trabalho. Segundo Carvalho e colaboradores (2007), a adição de sulfato de amônio e farelo de arroz em experimentos feitos com C. guilliermondii FTI, em meios contendo D-xilose como principal fonte de carbono, resultou em melhor produção de xilitol que as fermentações feitas sem esses suplementos, ou fermentações nas quais foi adicionado cada suplemento em separado. Rodrigues e colaboradores (2011) verificaram que a adição do sulfato de amônio aumentou o crescimento celular e o rendimento na produção de xilitol com células de S. stipitis, independentemente do ácido empregado para neutralização do hidrolisado utilizado como meio de cultura. Carvalho e colaboradores (2007) obtiveram 48,7 g.L-1 de xilitol, produtividade de 0,5 g.L-1.h-1 e rendimento de 0,55 g.g-1 para C. guilliermondii FTI20037, com a adição de suplemento. Quando não houve adição do suplemento, os autores obtiveram somente uma concentração de xilitol de 12,1 g.L-1 de xilitol, produtividade de 0,13 g.L-1.h-1 e um rendimento menor do que 0,3 g.g-1. No presente trabalho, a fermentação realizada com C. tropicalis CLQCA-24SC-125, utilizando os mesmos suplementos e o cloreto de cálcio, resultou em menor produção (27,1 g.L-1) de xilitol Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 56 e em produtividade de 0,38 g.L-1.h-1. No entanto, o rendimento em xilitol foi maior (0,67 g.g-1), o que indica que essa levedura obteve maior produção de xilitol por cada grama de xilose presente no hidrolisado. No presente estudo, a maior produção de xilitol foi alcançada no hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, com valores maiores que os verificados no meio contendo D-xilose como fonte de carbono. Esses resultados são semelhantes aos obtidos por Cadete et al. (2012), que constataram que as linhagens de Spathaspora spp. também atingiram concentração maior de xilitol no hidrolisado do que no meio com D-xilose. Isto pode ter ocorrido pelo fato do hidrolisado de bagaço de cana-deaçúcar conter açúcares como glicose, xilose e arabinose, além de compostos inorgânicos como manganês, ferro, magnésio, níquel, cálcio, sódio, potássio e cromo (ARRUDA, 2011), e vitaminas e aminoácidos; esses podem servir como macro e micronutrientes para as leveduras, contribuindo para maior produção de xilitol. A adição desses suplementos acelera o consumo de xilose e a produção de xilitol pelas células, por prover precursores essenciais, necessários para maximizar o rendimento (CARVALHO et al., 2007). Rao e colaboradores (2005) descrevem a bioconversão da D-xilose presente no hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar como um processo lento em comparação a fermentações realizadas em meio sintético. No entanto, espécies como C. tropicalis foi avaliada como tolerante aos diferentes inibidores metabólicos liberados como produto da hidrólise deste substrato, aludindo assim as vantagens da aplicação desta levedura e bioprocessos de conversão a xilitol. Candida tropicais CLQCA-24F-125 e Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 tiveram maior produção de xilitol, após 72 horas de fermentação (Apêndice 4). Depois desse período, a concentração de xilitol começou a diminuir, o que indica que o produto passou a ser utilizado como fonte de carbono pelas leveduras. Candida pseudointermedia CLQCA-24F-113 e C. sinolaborantium CLQCA-24F-127 atingiram maior produção de xilitol com 120 horas de fermentação, enquanto Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 obteve maior produção após 72 horas. No Apêndice 4 (Figura 4.3) constata-se que essa espécie precisa de um período de adaptação ao meio, uma vez que os resultados mostram que nas primeiras horas de fermentação essa Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 57 levedura não produz xilitol e apresentou pequeno consumo de xilose. Por outro lado, a levedura teve a capacidade de consumir 93,9% da fonte de carbono, produzindo xilitol em uma concentração de 23,98 g.L-1, produtividade de 0,33 g.L-1.h-1 e rendimento de 0,64 g.L-1, sem aumentar consideravelmente a densidade celular (Tabela 5), o que seria interessante nos processos de produção desse poliálcool em escala industrial. Uma relação aproximada de 1:10 da concentração de glicose inicial no hidrolisado hemicelulósico em relação à xilose foi obtida. Segundo Da Silva e colaboradores (2006), quando o hidrolisado se encontra em uma concentração 1:5 de glicose:xilose, as condições são favoráveis para aumentar o rendimento e a produtividade volumétrica em xilitol ao ser a glicose utilizada para o crescimento celular e conservação de energia, enquanto a xilose é utilizada para a formação de xilitol. A máxima produção de xilitol nesta relação glicose:xilose, segundo Da Silva e colaboradores (2006) pode ser devido à que altas concentrações de glicose permitem maior formação de NADPH, cofator requerido pela enzima xilose redutase, promovendo assim maior conversão de xilose em xilitol. Nas leveduras testadas no presente ensaio, a glicose e a xilose foram inicialmente metabolizadas ao mesmo tempo, mas a taxa de consumo de glicose foi mais rápida que a de xilose, uma vez que foi consumida nas primeiras 12 horas, à exceção de Lindnera sp. CLQCA-24SC025, que metabolizou esse açúcar após 48 horas. Depois do consumo da glicose, a xilose começou a ser assimilada mais rapidamente para todas as linhagens testadas (dados não mostrados). Segundo du Preez (1994), a preferência dos microorganismos pela utilização de açúcares em meios de cultura com mais de uma fonte de carbono é observada na seguinte ordem: D-glicose, D-manose, D-xilose, Dgalactose e D-frutose. As hexoses são utilizadas antes da xilose, e seu metabolismo não é afetado pela presença desse açúcar. No presente estudo observou-se o consumo simultâneo dos dois açúcares, comportamento esse que pode ser explicado pelo sistema de captação da levedura para a D-xilose. Segundo Lucas e van Uden (1986), quando Scheffersomyces shehatae foi cultivada em meio contendo glicose e xilose, a levedura produziu um sistema de difusão facilitada que pôde transportar glicose e xilose simultaneamente. Resultados obtidos por Da Silva e Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 58 colaboradores (2006) evidenciaram o consumo simultâneo da xilose na presença da glicose, o que corrobora os resultados obtidos no presente estudo. Quanto à assimilação da arabinose, observa-se que para C. pseudointermedia CLQCA-24F-113 o consumo foi lento, com máximo de 1 g.L-1 (66,9%) após 120 horas. Para C. tropicalis CLQCA-24F-125, o consumo total desse açúcar foi após 48 horas de fermentação. Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 assimilou a arabinose de forma mais lenta, alcançando consumo máximo de 0,4 g.L-1 (38,5%) após 96 horas de fermentação. No entanto, não foi encontrado um padrão de assimilação desse açúcar para C. sinolaborantium CLQCA-24F-127, pois a levedura não apresentou consumo regular. No presente estudo constatou-se que, apesar da presença de glicose e xilose no meio de cultivo, a arabinose foi consumida simultaneamente pelas leveduras testadas. Cadete e colaboradores (2012) não obteve consumo da arabinose, e considerou como possível explicação para esse comportamento à elevada disponibilidade de xilose, cujo consumo, após a glicose, foi priorizado em relação à arabinose. No entanto outros autores, como Arruda (2011), observaram que para C. guilliermondii a presença de glicose no hidrolisado proporcionou maior consumo da arabinose, que atingiu o máximo de 73% em experimentos de fermentação, resultado este similar aos obtidos para as espécies de Candida analisadas no presente estudo. Glicerol e etanol foram detectados como subprodutos do metabolismo dos açúcares pelas diferentes espécies de leveduras nas fermentações do hidrolisado. Para todas as leveduras houve formação de glicerol com concentrações máximas de 2, 85 g.L-1 após 72 horas de fermentação, exceto para C. sinolaborantium CLQCA24F-127, que apresentou menor produção desse composto, neste meio (0,53 g.L-1) (dados não mostrados). Para o etanol, a produção mais alta (6,6 g.L-1) foi obtida após 72 horas de fermentação utilizando C. pseudointermedia CLQCA-24F-113. Arruda e colaboradores (2011) constataram rápida formação de glicerol e etanol nas primeiras 24 horas de fermentação, com valores máximos de 1,32 e 3,2 g.L-1, respectivamente, que coincidiram com a completa utilização da glicose. Segundo Arruda e Felipe (2009), e pelos resultados obtidos no presente estudo, pode-se afirmar que a produção desses metabólitos é constante. Sendo assim, sua formação Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 59 não depende somente do consumo de glicose, mas também de outros açúcares como a xilose. A formação desses subprodutos reduz a disponibilidade de NADH, coenzima essencial para ação da xilose redutase que participa da conversão de xilose a xilitol em leveduras (SILVA et al., 2007). Dessa forma, a produção lenta e constante desses compostos não afeta a produção de xilitol, fato este observado nas fermentações realizadas no presente trabalho, nas quais Lindnera sp. CLQCA24SC-025 obteve máxima produção de glicerol (2,85 g.L-1), enquanto C. tropicalis, que alcançou maior produção de xilitol (27,1 g.L-1), produziu somente 1,07 g.L-1 de glicerol. O valor máximo alcançado na conversão de xilose em xilitol foi obtido por C. tropicalis CLQCA-24F-125, com elevado rendimento (Yp/s= 0,67 g.g-1) e produtividade (Qp= 0,38 g.L-1.h-1) em xilitol, obtidos na fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Os parâmetros fermentativos para C. pseudointermedia CLQCA-24F-113, C. tropicalis CLQCA-24F-125, Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 e C. sinolaborantium CLQCA-24F-127 no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana estão mostrados na Tabela 5. Os Apêndices 4 e 5 ilustram o consumo da xilose e a produção de xilitol, etanol e concentração celular para essas mesmas leveduras. 5.3.3 Compostos tóxicos liberados no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar O tratamento de hidrólise com ácido diluído em temperaturas menores que 160 ºC favorece a conversão de xilanas em xilose, segundo Sun e Cheng (2002). Ao utilizar o ácido sulfúrico como catalisador, prótons que atuam nas ligações glicosídicas entre os monômeros de açúcar nas cadeias poliméricas são liberados. O rompimento dessas ligações libera uma série de açúcares, como xilose, glicose e arabinose (AGUILAR et al., 2002), além de compostos tóxicos para as células. Os principais compostos tóxicos produzidos pela hidrólise ácida incluem o ácido acético (ácido orgânico originado da quebra da hemicelulose), furanos (furfural e 5-HMF), derivados das reações de degradação das pentoses e hexoses, respectivamente (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000). Os ácidos orgânicos por meio da inibição Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 60 das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase, causam danos ao metabolismo celular, como limitação do consumo da fonte de carbono e interferência na cinética de crescimento celular, que é dependente da concentração de açúcar, oxigênio dissolvido e pH do meio de cultivo (FELIPE et al., 1995; TAMANINI e OLIVEIRA, 2004). A ação destes ácidos orgânicos em pH ácido interfere em vários pontos do metabolismo da levedura, como o transporte de xilose através da membrana citoplasmática. Segundo Felipe e colaboradores (1997), fermentações com C. guilliermondii comprovaram que valores maiores que 3 g.L-1 de ácido acético inibem o metabolismo da xilose, afetando a produtividade e o rendimento em xilitol. Por outro lado, Carvalho e colaboradores (2005) constataram que o ácido acético em concentrações de 1 g.L-1 favoreceu a produção de xilitol nos meios em que a concentração inicial de D-xilose era de 50 g.L-1. Arruda (2011) obteve concentração de ácido acético de 2,31 g.L-1 e uma concentração de 2,66 g.L-1 foi obtida por Carvalho (2004). No presente estudo foi obtida uma concentração menor desse ácido (1,66 g.L-1) no hidrolisado concentrado (Tabela 6). Segundo Felipe e colaboradores (1997), o ácido acético pode se difundir até o citoplasma, afetando o pH intracelular, resultando em redução do crescimento celular. Tabela 6 - Composição dos hidrolisados antes e após os procedimentos de concentração e destoxificação por alteração de pH combinado à absorção em carvão vegetal ativado Compostos Hidrolisado Bruto Hidrolisado Concentrado Hidrolisado Concentrado e Detoxificado -1 Açúcares e Ácidos Orgânicos (g.L ) Glicose 0,842 5,76 4,81 Xilose 11.565 61,71 48,72 0,84 4,7 3,36 Ácido fórmico - - - Ácido acético 0,84 1,66 1,58 Arabinose -1 Furanos (g.L ) Furfural 0,282 0,168 * 5-Hidroximetilfurfural 0,015 0,036 * *: dosagem não realizada. Compostos como furfural e 5-HMF têm efeito inibidor na respiração e na fosforilação oxidativa das leveduras, dificultando a bioconversão dos açúcares nos produtos desejados (CANILHA et al., 2010). No presente trabalho, uma Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 61 concentração de 0,168 g.L-1 e de 0,036 g.L-1 para o furfural e hidroximetilfurfural após a etapa de concentração do hidrolisado foram observadas (Tabela 6). Observou-se uma diminuição de furfural de 0,11 g L -1 após a etapa de concentração, o que corresponde à redução de 40,4%. Em relação ao hidroximetilfurfural, houve aumento de 2,4 vezes desse inibidor após a etapa de concentração. Arruda (2011), seguindo a mesma metodologia para concentração do hidrolisado de bagaço de cana, obteve diminuição de furfural de 0,106 g L -1 (56,4%), no entanto constatou também aumento de três vezes na concentração de HMF em relação à concentração inicial. Parajó e colaboradores (1998) relataram que a taxa máxima de crescimento das leveduras foi reduzida em uma concentração de 0,35 g.L-1 de furfural e que esta é completamente inibida com uma concentração de 1,75 g.L-1 deste composto. Concentrações similares de furfural (1,0 - 1,5 g.L-1) que inibem o metabolismo das leveduras foram também sugeridas por outros autores (SANCHES e BAUTISTA, 1988; FELIPE et al.,1995). O efeito prejudicial do furfural afeta na taxa de crescimento, e sua acumulação na célula causa a inibição das enzimas envolvidas no metabolismo central do carbono, alterando o equilíbrio da energia celular. Além disso, o furfural causa danos nas membranas vacuolares e mitocondriais, e a acumulação de espécies reativas de oxigênio, por sua vez, pode causar a morte celular (SÁRVÁRI et al., 2003; HEER e SAUER, 2008). Entretanto, durante a fermentação, o furfural e o 5-hidroximetilfurfural são reduzidos aos seus álcoois correspondentes, que são compostos menos tóxicos para a célula (PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000; HEER e SAUER, 2008). No presente estudo, as concentrações destes compostos parecem que não interferiram no crescimento das leveduras nos experimentos de produção de xilitol a partir do hidrolisado do bagaço de cana de açúcar. Segundo as análises estatísticas da produção de xilitol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar do presente trabalho, houve diferenças altamente significativas entre as linhagens de leveduras (diferenças p<0,05), sendo que a linhagem de C. tropicalis CLQCA-24F-125 apresentou valores mais elevados para produção de xilitol. Quando as outras três linhagens foram comparadas, contatou-se que não houve diferenças significativas. Segundo a variável do tempo para produção de xilitol, a maior eficiência foi atingida após 72 horas, porém a partir Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 62 das 96 horas a produção começou a diminuir. A variável da interação horas por linhagem apresenta diferenças altamente significativas, o que significa que o alcance da produção máxima de xilitol de cada isolado é dependente do tempo. Por exemplo, C. sinolaborantium CLQCA-24F-127 demorou mais tempo para produzir xilitol, pois atingiu a produção máxima em 120 horas (Apêndice 6). Em relação aos resultados da variável para produção de etanol, foram constatadas diferenças significativas entre as linhagens e diferenças altamente significativas para a variável hora. Os isolados com maior produção de etanol corresponderam a C. pseudointermedia CLQCA-24F-113 e C. sinolaborantium CLQCA-24F-127. A produção de etanol ocorreu entre 48 e 120 horas, no entanto as leveduras atingiram rendimento máximo após 96 horas. Segundo a variável que correlaciona cada linhagem com a hora, não houve diferenças significativas para produção de etanol (Apêndice 6). Para o consumo da D-xilose, observaram-se diferenças altamente significativas entre linhagens e entre o tempo de fermentação, assim como para a interação desses dois fatores. A linhagem com maior consumo de xilose foi C. tropicalis CLQCA-24F-125 (Apêndice 6). 5.3.4 Fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar em biorreator No presente estudo, a influência de fatores como pH, temperatura, agitação e aeração foi estudada utilizando ensaios em biorreator para avaliação do metabolismo de duas linhagens que apresentaram os melhores resultados de produção de xilitol em escala de bancada. Essas leveduras foram C. tropicalis CLQCA-24F-125 e Lindnera sp. CLQCA-24SC-025, uma nova espécie isolada no presente trabalho. Os resultados dos parâmetros fermentativos Yp/s (g.g-1, fator de conversão de xilose em xilitol), Qp (g.L-1.h-1, produtividade em xilitol), Yx/s (g.g-1, conversão de substrato em biomassa), (% eficiência de conversão) e consumo de D-xilose (%), produção de células (g.L-1), concentração de etanol e xilitol (g.L-1) e Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 63 tempo de fermentação (h) para C. tropicalis CLQCA-24F-125 em biorreator estão mostrados na Tabela 7. O consumo de xilose, a produção de células e a produção de etanol e xilitol ao longo da fermentação encontram-se representados na Figura 9. Constatou-se que o consumo da xilose ocorre simultaneamente e de forma gradual ao consumo da glicose para C. tropicalis CLQCA-24F-125. Esta levedura consumiu totalmente a glicose após 60 horas da fermentação, enquanto a xilose demorou 96 horas para ser consumida o 95%. Segundo Parajó e colaboradores (1998), quando as hexoses, como a glicose, já foram parcialmente consumidas, a xilose pode ser assimilada, fato que confirma a existência de uma concentração limite para repressão do metabolismo de xilose por hexoses. Segundo Yahashi e colaboradores (1996), a adição de glicose no meio de cultura tem efeito benéfico na produção de xilitol pela espécie C. tropicalis. A conversão da xilose em xilitol foi realizada mais eficientemente na presença da glicose, além desta ser utilizada para o crescimento celular mais rapidamente do que a xilose, permitindo a regeneração do NADPH pelo metabolismo da via pentose fosfato. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 64 Tabela 7 - Parâmetros fermentativos obtidos para Candida tropicalis CLQC-24F-125 durante experimentos de fermentação com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar em biorreator Tempo (h) pH Ácido Acético -1 (g.L ) Consumo de 1 D-Xilose% Yp/s -1 2 (g.g ) Yx/s -1 3 (g.g ) Yp/x -1 4 (U.g ) Qp -1 -1 5 (g.L .h ) 6 (%) 0 4,99 1,76 0 0 0 0 0 0 12 5,00 1,58 12,67 0,19 0,21 0,90 0,10 20,96 24 5,16 1,55 24,09 0,74 0,14 5,40 0,35 81,12 36 5,44 0,81 42,91 0,75 0,10 7,24 0,43 82,88 48 5,89 0,93 63,11 0,76 0,07 11,09 0,48 83,78 60 6,33 1,03 78,67 0,73 0,06 12,89 0,46 80,49 72 5,88 1,38 88,67 0,78 0,06 13,70 0,46 85,84 96 5,40 1,98 94,42 0,83 0,07 12,53 0,39 90,86 1 Consumo de D-xilose (%) – porcentagem de D-xilose inicial consumida -1 Yp/s(g.g )- rendimento de xilitol: xilitol produzido (P) por massa de xilose consumida (S) 3 -1 Yx/s (g.g )- rendimento de células grama de massa celular produzida por grama de xilose consumida 4 -1 Yp/x (U.g )- rendimento de produto (mgxil) por massa celular (gcél) 5 -1 -1 -1 Qp (g.L .h )- produtividade de xilitol: concentração de xilitol produzido (g.L ) por tempo (h) 6 (%)- eficiência de conversão: razão entre o fator de rendimento (Y P/S) obtido e o fator de rendimento teórico (0,917 grama de xilitol/gramas de xilose). 2 40 -1 Glicose, Xilose (g L ) 30 25 20 20 15 10 5 0 -1 0 Xilitol, Etanol, Glicerol e Células (g L ) 35 40 -5 0 20 40 60 80 100 Tempo (horas) Figura 9 – Concentração de xilose (-- --), glicose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- --), glicerol (-- --) e xilitol (-- --) em g.L-1 por Candida tropicalis CLQCA24F-125 em biorreator. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 65 Os resultados obtidos em frascos Erlenmeyer, no caso da C. tropicalis CLQCA-24F-125, confirmam que 99% da xilose foi consumida após 48 horas de fermentação, enquanto no biorreator o consumo da xilose ocorreu de forma mais gradual. Em ambos os casos a presença da glicose não afetou o consumo da xilose, o que sugere que essa levedura tem um sistema de transporte de xilose que não é afetado pela repressão da glicose, como relatado por Da Silva e colaboradores (2006). O consumo da arabinose foi de 1,4 g.L-1 a partir de 3,4 g.L-1 após 60 horas de fermentação, o que corresponde ao consumo de 60%, mostrando uma eficiência menor do que nos ensaios feitos em frascos Erlenmeyer, onde essa levedura conseguiu consumir totalmente a arabinose após 48 horas de fermentação. Da Silva e colaboradores (2006), utilizando o mesmo tipo de hidrolisado em experimento em biorreator de 1,6 L, obtiveram um consumo da glicose nas primeiras 12 horas de fermentação. No presente estudo, a glicose foi assimilada nas primeiras 12 horas até 0,12 g.L-1 alcançando o consumo total após as 60 horas de fermentação. Enquanto à produção de metabolitos, além de xilitol, o etanol e o glicerol foram produzidos durante a fermentação de xilose por essa levedura. A maior produção de etanol foi obtida depois de 48 horas de fermentação, alcançando a concentração de 4,8 g.L-1; para o glicerol foram obtidos 1,22 g.L-1 com 24 horas de fermentação. Comparando esses dados com a produção de etanol e glicerol obtida em frascos Erlenmeyer (2,6 g.L-1 às 48 horas e 1,72 g.L-1 após 120 horas, respectivamente), observa-se uma produção duas vezes maior de etanol em biorreator, no mesmo tempo de fermentação. A produção de biomassa em escala de bancada variou de 0,74 até uma concentração de 15,9 g.L-1 após 96 h de fermentação sendo maior do aquela obtida no biorreator que variou de 0,26 até 3,22 g.L-1 no mesmo tempo de fermentação. Os parâmetros fermentativos de produção de xilitol para C. tropicalis CLQCA24F-125 apresentaram valores maiores no ensaio no qual utilizou-se biorreator do que aqueles realizados em escala de bancada. A produtividade nos ensaios de fermentação no biorreator foi maior que a constatada por Arruda (2011), sendo de 0,48 g.L-1.h-1 após 48 horas no presente trabalho e de 0,27 g.L-1.h-1 após 132 horas obtido por aquele autor. A concentração de xilitol verificada no presente estudo foi maior que a obtida por Da Silva e colaboradores (2006), utilizando condições Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 66 experimentais semelhantes, cuja concentração máxima foi de 27,8 g.L-1, rendimento de 0,59 g.g−1 e produtividade de 0,53 g.L-1.h-1, após 48 horas de fermentação. No presente trabalho, a concentração de xilitol atingiu valores de 37,2 g.L-1 e rendimento de 0,83 g.g−1 após 96 horas de fermentação, com menor produtividade (0,39 g.L-1.h1 ) nesse tempo. Outro fator importante a ser considerado é a eficiência total de conversão para cada fermentação. Assim, em escala de bancada foi obtida eficiência de 68,9%, enquanto no biorreator a eficiência foi de 90,5% para esta linhagem de levedura. Considerando todos os parâmetros de fermentação obtidos para C. tropicalis CLQCA-24F-125, esta linhagem pode ser caracterizada como uma levedura promissora para produção de xilitol a partir de D-xilose, quando comparada com outras espécies ou linhagens testadas em estudos de fermentação de hidrolisados hemicelulósicos. Os valores máximos de formação de glicerol e etanol foram obtidos após 24 horas (1,22 g.L-1) e 48 horas (4,8 g.L-1) (Figura 9). Resultados similares para esta mesma espécie foram verificados nos ensaios em frascos Erlenmeyer com uma produção de glicerol de 1,72 g.L-1 e etanol de 4,4 g.L-1 após 120 horas de fermentação. Segundo Nevoigt e Stahl (1997), o aumento da concentração intracelular de glicerol pode ser devido a uma resposta ao estresse osmótico pela levedura. Os autores demonstraram que S. cerevisiae, quando exposta a um meio de alta osmolaridade, acumula glicerol na membrana plasmática para neutralizar a desidratação celular. Ao comparar os resultados obtidos para produção de glicerol por C. tropicalis CLQCA-24F-125, observou-se que esse composto foi produzido na concentração máxima de 1,22 g.L-1, após 24 horas. A quantidade diminuiu a partir de 36 horas de fermentação, o que indica que a osmolaridade do hidrolisado não afetou de maneira drástica a formação de subprodutos do metabolismo dessa levedura, uma vez que tanto a formação de glicerol quanto de etanol permitiu a manutenção do equilíbrio redox. A importância do balanço redox no metabolismo das leveduras tem sido evidenciada (VANDESKA et al., 1995), de onde se conclui que o fuxo glicolítico é controlado pela reoxidação do NADH pela piruvato decarboxilase. Segundo Granström (2001), a limitação de oxigênio resulta em aumento da concentração intracelular de NADH, o que leva ao aumento da taxa de acúmulo de xilitol por Candida guilliermondii. Bruinenberg e colaboradores (1984), utilizando C. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 67 tropicalis, em condições limitadas de oxigênio e altas concentrações de xilose, verificaram que a levedura consome a D-xilose pela atividade da XR dependente somente de NADPH (com completa ausência de XR ligada a NADH) e a XDH ligada a NAD+, permitindo a acumulação de xilitol. De acordo com Parajó e colaboradores (1998), quando se utiliza leveduras XR dependentes de NADPH, o NADH não pode ser oxidado a NAD+. Isto leva a um aumento na taxa do sistema redox NADH/NAD+ e à subseqüente inibição da enzima XDH ligada a NAD+, permitindo maior consumo da D-xilose e acumulação de xilitol (GRANSTRÖM, 2001). A espécie Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 submetida a ensaio em biorreator com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar não produziu xilitol nas condições testadas. Fatores como concentração inicial do substrato e do inóculo, agitação e nível de oxigênio podem ter afetado diretamente a conversão da xilose a xilitol por essa levedura. Para utilização de uma espécie em escala de produção e obtenção de altas concentrações de produto desejado, devem ser estabelecidos os melhores parâmetros e condições de fermentação, e a composição mais adequada do meio de fermentação. As habilidades nutricionais variam muito de acordo com o gênero e a espécie de micro-organismo utilizado, e mesmo entre linhagens do mesmo gênero (FERREIRA et al., 2011), portanto, as condições para produção de xilitol para esta linhagem de levedura não foram as ideais. A baixa concentração celular observada no biorreator está de acordo com o baixo consumo da glicose e xilose (10 e 7,5%). Em ensaio de bancada, a glicose foi 100% consumida após 72 horas e a xilose foi consumida em 97,7% após 120 horas de fermentação. Quando compara-se as duas linhagens testadas no biorreator, constata-se que a concentração celular para Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 aumentou o triplo em relação ao inóculo inicial até 96 horas (de 0,21 para 0,61 g.L-1), enquanto para a linhagem de C. tropicalis CLQCA-24F-125 a biomassa cresceu 12 vezes até 72 horas de fermentação (de 0,26 para 3,22 g.L-1). O consumo da glicose foi similar para as duas leveduras testadas, sendo consumida a partir da concentração inicial 4,5 g.L-1 para aproximadamente 0,5 g.L-1 no final da fermentação. Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 consumiu 7,5% da xilose após 72 horas de fermentação, enquanto C. tropicalis CLQCA-24F-125 consumiu 94,9% Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 68 dessa pentose após 96 horas. Analisando a produção de etanol, constata-se que C. tropicalis CLQCA-24F-125 teve o pico de produção deste composto após 48 horas, com 4,8 g.L-1, enquanto para Lindnera sp. CLQCA-24SC-025, a produção máxima foi de 2,5 g.L-1 após 72 horas. Este fato indica que possivelmente a disponibilidade de oxigênio dissolvido no meio foi muito baixa, uma vez que Lindnera sp. CLQCA24SC-025 apresentou taxa de multiplicação celular muito baixa em relação aos resultados observados em escala de bancada. Logo, pode-se constatar que houve preferência pela via fermentativa de produção de etanol, uma vez que esse fator determina a divisão do fluxo de carbono entre o crescimento do micro-organismo e a formação de produtos oriundos da fermentação (DU PREEZ, 1994). Tanto as respostas de crescimento como de consumo de açúcares e produção de xilitol e etanol indicam que os níveis de oxigênio utilizados no biorreator foram muito baixos para o metabolismo de Lindnera sp. CLQCA-24SC-025, já que a levedura não foi capaz de se multiplicar, nem de assimilar elevadas quantidades dos açúcares do meio. A formação de xilitol, segundo Ganström (2002), é favorecida em condições de limitação de oxigênio, uma vez que há acumulação de NADH e subsequente inibição da XDH-dependente de NAD, impedindo que o xilitol seja oxidado à xilulose. Os ensaios enzimáticos realizados com C. tropicalis indicam que esta levedura é NADPH-dependente, no metabolismo da xilose. Concentrações muito altas ou baixas de oxigênio podem inibir a fermentação pelas leveduras. Em estudos realizados por Parajó e colaboradores (1998), leveduras com atividade de XR ligadas a ambos cofatores NADH e NADPH (P. tannophilus, S. stipitis, S. shehatae) podem regenerar o NAD+ consumido na segunda etapa do metabolismo da xilose. Neste caso o principal produto da reação é o etanol, e não há ocorrência de acúmulo de xilitol. Esse fenômeno pode ter ocorrido para a nova espécie Lindnera sp., que produziu etanol no ensaio em biorreator, mas não xilitol. Deve-se levar em consideração que o ensaio realizado em biorreator foi um teste inicial de duas linhagens metabolicamente diferentes. As condições de cultura e os parâmetros para fermentação de cada uma dessas linhagens devem ser estudados para melhorar a bioconversão da D-xilose presente nos hidrolisados hemicelulósicos em xilitol. Pode-se constatar nos testes de screening realizados Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 69 tanto em meio sintético como em hidrolisado que mesmo pertencendo à mesma espécie, as linhagens podem ter mecanismos de resposta diferentes aos meios utilizados para o crescimento e ainda apresentar diferentes respostas de produção de metabólitos. Por isto, devem ser definidas condições que permitam maior produção de xilitol, incluindo pH, agitação, aeração, concentração inicial de nutrientes e de biomassa para cada linhagem a ser estudada. Embora tenha havido variações nas quantidades de xilitol produzidas, os isolados obtidos no arquipélago das ilhas Galápagos mostraram potencial para fermentação de hidrolisado hemicelulósico com a produção deste produto de alto valor econômico. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 70 6 CONCLUSÕES - O isolamento de espécies de leveduras assimiladoras de D-xilose capazes de produzir xilitol a partir de madeira em decomposição indica que este é um substrato promissor para a obtenção de linhagens de interesse para uso biotecnológico. - O uso do meio de cultura com xilana apresentou maior êxito no isolamento de leveduras assimiladoras de D-xilose, sugerindo a utilização deste meio de cultivo em futuras pesquisas voltadas para o isolamento de leveduras fermentadoras de pentoses. - Uma nova espécie de levedura pertencente ao gênero Lidnera, com um alto rendimento e produtividade de xilitol a partir de D-xilose, foi isolada das Ilhas Galápagos no Equador. O isolamento desta levedura comprova a importância de estudos em biomassa de ecossistemas considerados hot spots da biodiversidade mundial, como são aqueles encontrados nas Ilhas Galápagos. - Das leveduras obtidas 70% assimilaram D-xilose como única fonte de carbono, sendo que destas 50,5% produziram xilitol. Esses resultados demonstram o potencial biotecnológico das linhagens das Ilhas Galápagos para produção de xilitol e fomenta novos estudos de otimização dos fatores relacionados à fermentação a fim de melhorar a síntese de produtos de valor biotecnológico por estas leveduras. - Os isolados de leveduras testados em ensaios com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar apresentaram altas taxas de consumo de açúcares e produção de xilitol maiores que nos ensaios com meio semi-sintético. Isto indica uma boa adaptação das leveduras no hidrolisado hemicelulósico e a potencial utilização das mesmas em estudos futuros para a obtenção de xilitol. - As leveduras Candida tropicalis e Lindnera sp. foram as melhores produtoras de xilitol tanto em meio semi-sintético quanto em hidrolisado de bagaço de cana-deaçúcar. A produção de xilitol da linhagem de C. tropicalis já era esperada, uma vez que esta espécie já foi relatada como produtora deste poliálcool. No entanto, a Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 71 produção deste metabólito de importância clínica, farmacêutica e alimentícia pela nova espécie de Lindnera é um aporte ao conhecimento das propriedades fermentativas desta espécie incentivando futuros estudos de determinação de parâmetros fermentativos que permitam a maior produção de xilitol e o uso biotecnológico desta nova espécie. - Candida tropicalis CLQCA-24F-125 apresentou os melhores valores para conversão de substrato em xilitol, produtividade e rendimento do que as outras leveduras testadas, tanto em meio semi-sintético e hidrolisado de bagaço de canade-açúcar em escala de bancada como em biorreator. Essa levedura pode ser considerada promissora para produção biotecnológica de xilitol em grande escala utilizando hidrolisado hemicelulósico de resíduos lignocelulósicos. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 72 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AFFLECK, R. P. 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Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 84 APÊNDICES Apêndice 1 – Identificação das espécies, código das amostras, meio de cultura para isolamento e número de amostra das leveduras isoladas do Arquipélago de Galápagos, Equador Espécie Candida (Lodderomyces) albicans Candida (Yamadazyma) amphixiae Candida (Yamadazyma) dendronema Candida (Kazachstania) humilis Candida (Metschnikowia) intermedia Candida naeodendra Candida (Kurtzmaniella) natalensis Candida (Lodderomyces) parapsilosis Candida (Metschnikowia) pseudointermedia Meio de Cultura para Isolamento Amostra CLQCA-24F-067 Xilana 10 CLQCA-24F-157 Xilana 6 CLQCA-24F-161b D-xilose 5 CLQCA-24F-163 D-xilose 10 CLQCA-24F-171 CMC 3 Código CLQCA-24F-137 CLQCA-24F-177 CLQCA-24SC-121 CLQCA-24F-150 CMC D-xilose 10 39 CMC 3 D-xilose 31 CLQCA-24F-110 CMC 6 CLQCA-24F-011 Xilana 5 CLQCA-24F-041 CMC 5 CLQCA-24F-065 D-xilose 2 CLQCA-24F-101 D-xilose 5 CLQCA-24F-105 Xilana 5 CLQCA-24F-134 D-xilose 2 CLQCA-24F-136 D-xilose 5 CLQCA-24F-146 CMC 6 CLQCA-24F-149 Xilana 5 CLQCA-24F-169 D-xilose 5 CLQCA-24SC-266 D-xilose 38 CLQCA-24F-005 CMC 1 CLQCA-24F-035 CMC 12 CLQCA-24SC-315 CLQCA-24F-113 CLQCA-24SC-240 CMC 1 D-xilose 30 CLQCA-24F-127 Candida sinolaborantium 4 3 CLQCA-24SC-027 27 CLQCA-24SC-087 34 CLQCA-24SC-144 D-xilose 28 CLQCA-24SC-207 36 CLQCA-24SC-262 36 CLQCA-24SC-331 34 Continua... Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 85 Apêndice 1, Cont. Espécie Candida (Saturnispora) silvae Candida (Lodderomyces/Spathaspora) tropicalis Candida (Yamadazyma) trypodendroni Cryptococcus (Bulleromyces) flavescens Cryptococcus (Bulleromyces) humicola Meio de Cultura para Isolamento Amostra CLQCA-24F-047 CMC 5 CLQCA-24F-063 D-xilose 5 CLQCA-24F-096 D-xilose 5 CLQCA-24F-111 D-xilose 9 CLQCA-24F-130 CMC 8 CLQCA-24F-156 D-xilose 4 CLQCA-24F-042 D-xilose 8 CLQCA-24F-052 Xilana 11 CLQCA-24F-066 D-xilose 8 CLQCA-24F-081 D-xilose 4 CLQCA-24F-084 D-xilose 7 CLQCA-24F-087 D-xilose 7 CLQCA-24F-092 D-xilose 7 CLQCA-24F-109 D-xilose 7 CLQCA-24F-112 Xilana 7 CLQCA-24F-115 D-xilose 8 CLQCA-24F-119 D-xilose 10 CLQCA-24F-123 D-xilose 8 CLQCA-24F-125 D-xilose 2 CLQCA-24F-126 D-xilose 2 CLQCA-24F-151 D-xilose 10 CLQCA-24F-167 D-xilose 7 CLQCA-24SC-111 CMC 35 CLQCA-24SC-122 D-xilose 39 CLQCA-24SC-209 D-xilose 21 CLQCA-24SC-239 D-xilose 30 CLQCA-24SC-246 D-xilose 39 CLQCA-24SC-322 Xilana 29 CLQCA-24SC-018 D-xilose 23 CLQCA-24SC-019 D-xilose 24 CLQCA-24SC-023 D-xilose 26 CLQCA-24SC-024 D-xilose 26 CLQCA-24SC-118 D-xilose 24 CLQCA-24SC-325 CMC 32 CLQCA-24F-143 CMC 4 CLQCA-24I-099 D-xilose 85 CLQCA-24SC-133 D-xilose 39 Código Continua... Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 86 Apêndice 1, Cont. Espécie Cryptococcus (Bulleromyces) laurentii Debaryomyces hansenii Meio de Cultura para Isolamento Amostra CLQCA-24I-130 D-xilose 92 CLQCA-24I-161 Xilana 91 CLQCA-24SC-043 D-xilose 36 CLQCA-24SC-244 Xilana 40 Código CLQCA-24F-128 Debaryomyces nepalensis Galactomyces geotrichum Geotrichum silvicola Xilana 4 CLQCA-24SC-223 D-xilose 33 CLQCA-24SC-232 CMC 35 CLQCA-24SC-305 Xilana 40 CLQCA-24F-020 Xilana 10 CLQCA-24F-133 Xilana 2 CLQCA-24SC-070 D-xilose 33 CLQCA-24SC-114 CMC 35 CLQCA-24SC-132 D-xilose 39 CLQCA-24F-034 Issatchenkia terricola CLQCA-24F-068 CLQCA-24F-161a 3 D-xilose CLQCA-24F-174 Kazachstania exigua Kazachstania unispora CLQCA-24SC-173 10 5 5 D-xilose 30 CLQCA-24F-069 8 CLQCA-24F-070 8 CLQCA-24F-071 2 CLQCA-24F-072 8 CLQCA-24F-073 2 CLQCA-24F-076 6 CLQCA-24F-077 6 CLQCA-24F-080 D-xilose 4 CLQCA-24F-086 2 CLQCA-24F-104 8 CLQCA-24F-164 10 CLQCA-24F-165 3 CLQCA-24F-166 3 CLQCA-24SC-045 28 CLQCA-24SC-185 21 Lindnera saturnus CLQCA-24SC-206 CMC 36 Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 D-xilose 27 Continua... Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 87 Apêndice 1, Cont. Espécie Pichia manshurica Scheffersomyces stipitis Torulaspora delbrueckii Trichosporon coremiiforme Código Meio de Cultura para Isolamento Amostra CLQCA-24F-039 10 CLQCA-24F-061 4 CLQCA-24F-079 CLQCA-24F-082 D-xilose 10 4 CLQCA-24F-083 2 CLQCA-24F-154 4 CLQCA-24SC-320 CLQCA-24SC-321 D-xilose 28 28 CLQCA-24F-040 8 CLQCA-24F-064 2 CLQCA-24F-074 CLQCA-24F-075 D-xilose 2 6 CLQCA-24F-078 6 CLQCA-24F-093 8 CLQCA-24F-095 D-xilose 2 CLQCA-24F-006 D-xilose 8 CLQCA-24F-145 D-xilose 6 CLQCA-24SC-217 CMC 32 Trichosporon laibachii CLQCA-24F-094b CMC 2 Trichosporon multisporon CLQCA-24F-094a CMC 2 Trichosporon jirovecii Wickerhamomyces anomalus Yamadazyma mexicana Zygowilliopsis californica CLQCA-24F-118 CLQCA-24F-178 D-xilose 6 10 CLQCA-24F-129 CMC 10 CLQCA-24I-107 D-xilose 93 CLQCA-24I-154 D-xilose 93 CLQCA-24I-194 D-xilose 93 CLQCA-24F-097 Xilana 4 CLQCA-24F-144 CMC 4 CLQCA-24F-152 Xilana 10 CLQCA-24SC-131 D-xilose 37 CLQCA-24SC-143 D-xilose 22 CLQCA-24SC-164 D-xilose 28 CLQCA-24SC-196 D-xilose 22 CLQCA-24SC-306 Xilana 40 CLQCA-24SC-314 D-xilose 28 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 88 Apêndice 2 – Sequências dos domínios D1/D2 e região ITS do isolado Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 Domínios D1/D2 TGAAGATGGATTTCTGGAGTTGGCCCCTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTC ACAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGGCGGGGTGGTCCAGCTCCATGTAGATTTCC TTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGAGGTAAATTCCTT CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAG ATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGA AGGGTATTAGATCAGACTTGGTGTTTTGTGATTATCATTCCCTCGTGGGATGTGC ACTCGCATTGCGCTGGGCCAGCATCGGTTCGAGTGGCAAGATAATGACTTGGG AACGTGGCTCTGCTTCGGGAGAGTGTTATAGCCCACAGTTGATGTTGCCTACTT GGACCGAGGACTGCGG Região ITS GATCTCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGT GAATTGCAGGTTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACCCTCTGG CATTCCAGAGGGTATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAATCGTCAAGATTG GTATTGAGTGATACTCTGCTTGCAGTGTTAACTTGAAATAGTGTTTTTACGCGGA CTTGCTTTTTTGTGGCCGCTCTCTGTTTGAGATAATGTATTAGGTTCTACCAACT CGTTATAGCAGCATGAGTGTGACTAAGCTGGGCTGCCCGAACAACCTAACCTAA AGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTG Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 89 3.1 Candida pseudointermedia 3.2 Candida tropicalis 3.3 Candida sinolaborantium 3.4 Lindnera sp. CLQCA-24F-113 CLQCA-24F-125 CLQCA-24F-127 CLQCA-24SC-025 30 8 14 4 3 2 20 0 0 -1 8 20 6 4 2 0 0 0 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 -10 Tempo (h) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 -10 0 10 20 30 Tempo (h) 40 50 60 70 -1 1 10 -1 -1 0 14 12 Xilose (g L ) -1 -1 -1 Xilose (g L ) Xilose (g L ) 5 -1 2 0 10 5 16 Xilitol, Etanol, Células (g L ) 4 15 20 6 40 Xilitol, Etanol, Célular (gL ) 6 20 18 7 40 Xilitol, Etanol, Células (gL ) 8 20 Xilitol, Etanol, Células (gL ) 10 25 40 12 Xilose (g L ) 40 80 -2 -10 0 10 20 30 Tempo (h) 40 50 60 70 80 Tempo (h) 3.5 Candida sinolaborantium 3.6 Zygowilliopsis californica 3.7 Scheffersomyces stipitis CLQCA-24SC-027 CLQCA-24SC-143 CLQCA-24SC-321 7 10 6 6 2 -1 20 -1 0 20 5 -1 1 40 Xilose (g L ) -1 3 -1 1 Xilose (g L ) -1 Xilose (g L ) 2 4 0 0 20 -10 0 10 20 30 40 Tempo (h) 50 60 70 80 -10 0 10 20 30 40 Tempo (h) 50 60 70 80 Xilitol, Etanol, Células (gL ) 3 5 40 Xilitol, Etanol, Células (gL ) 4 Xilitol, Etanol, Células (gL ) 5 40 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Tempo (h) Apêndice 3 - Concentração de xilose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- --) e xilitol (-- --) em g.L-1 ao longo do ensaio de fermentação em meio semi-sintético com D-xilose como fonte de carbono. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 90 4.1 Candida pseudointermedia 4.2 Candida tropicalis CLQCA-24F-113 CLQCA-24F-125 30 16 14 20 6 4 15 20 10 5 -1 -1 2 0 20 -1 -1 Xilose (g L ) 8 Xilitol, Etanol, Células (gL ) 10 25 40 Xilitol, Etanol, Células (gL ) 12 Xilose (g L ) 40 0 0 0 -2 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 Tempo (h) 60 80 100 120 Tempo (h) 4.3 Lindnera sp. 4.4 Candida sinolaborantium CLQCA-24SC-025 CLQCA-24F-127 25 20 40 40 10 5 -1 20 10 5 -1 -1 0 Xilose (g L ) -1 Xilose (g L ) 20 15 0 0 0 0 20 40 60 80 100 120 Xilitol, Etanol, Células (gL ) 15 Xilitol, Etanol, Células (gL ) 20 0 20 40 Tempo (h) 60 80 100 120 Tempo (h) Apêndice 4 - Concentração de xilose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- -) e xilitol (-- --) em g.L-1 ao longo do ensaio de fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 91 Apêndice 5 - Parâmetros fermentativos de produção de xilitol em fermentações feitas em frascos Erlenmeyer com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, de acordo com os tempos de amostragem do ensaio, para as leveduras testadas. Parâmetro Fermentativo Linhagem 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 1 Candida pseudointermedia CLQCA-24F-113 0,08 0,31 0,43 0,34 0,29 0,39 -1 C.sinolaborantium CLQCA-24F-127 0,22 0,23 0,42 0,43 0,43 0,49 C.tropicalis CLQCA-24F-125 0,35 0,68 0,54 0,67 0,61 0,63 Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 0 0 0,73 0,64 0,54 0,46 Candida pseudointermedia CLQCA-24F-113 0,04 0,16 0,28 0,19 0,12 0,13 C.sinolaborantium CLQCA-24F-127 0,18 0,12 0,29 0,21 0,18 0,16 C. tropicalis CLQCA-24F-125 0,28 0,62 0,46 0,38 0,26 0,21 Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 0 0 0,18 0,33 0,22 0,15 Candida pseudointermedia CLQCA-24F-113 9,158 33,63 47,34 37,14 31,41 42,94 C.sinolaborantium CLQCA-24F-127 23,81 25,7 46,44 46,83 47,04 53,79 C. tropicalis CLQCA-24F-125 38,62 74,96 59,67 73,5 66,92 68,79 Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 0 0 80,68 70,58 59,19 50,34 Candida pseudointermedia CLQCA-24F-113 14,25 30,67 78,9 98,87 99,17 99,19 C.sinolaborantium CLQCA-24F-127 12,28 30,07 59,6 85,13 94,31 95,71 C. tropicalis CLQCA-24F-125 23,39 53,41 99,17 99,08 99,15 99,00 Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 6,39 12,79 29,88 93,88 98,96 97,68 Yp/s (g.g ) Qp 2 -1 -1 (g.L .h ) Consumo de D4 xilose % 1 Espécie -1 Yp/s(g.g )- rendimento de xilitol: xilitol produzido (P) por massa de xilose consumida (S). -1 -1 -1 Qp (g.L .h )- produtividade de xilitol: concentração de xilitol produzido (g.L ) por tempo (h). 3 (%)- eficiência de conversão: razão entre o fator de rendimento (YP/S) obtido e o fator de rendimento (Yp/s) obtido e o fator de rendimento teórico ( 0,917 grama de xilitol/gramas de xilose). 4 Consumo de D-xilose (%) – porcentagem de D-xilose inicial consumida. 2 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 92 Apêndice 6 – Análise estatísticas para as variáveis de produção de xilitol, etanol e consumo de xilose, e para os fatores de fermentação Yp/s e eficiência obtidas da fermentação das espécies testadas em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. ANOVA para produção de xilitol Origem Repetições Hipóteses Erro Suma dos cuadrados tipo III ,999 388,403 Cepas Hipóteses Erro Horas Linhagens Horas * gl 2 54 Media quadrática ,499 a 7,193 914,487 388,403 3 54 Hipóteses Erro 5573,488 388,403 Hipóteses Erro 664,513 388,403 F Sig. ,069 ,933 304,829 a 7,193 42,381 ,000 6 54 928,915 a 7,193 129,148 ,000 18 54 36,917 a 7,193 5,133 ,000 a. MS (Error) Medias marginais estimadas Media Erro típ. 11,196 ,293 Intervalo de confiança 95% Limite inferior Limite superior 10,609 11,783 Prova post hoc: DHS de Tukey Linhagens N F-113 21 F-127 21 9,4057 SC-025 21 10,2805 F-125 21 Sig. Subconjunto 1 2 8,3157 16,7824 ,094 1,000 Indicam-se as médias dos grupos de subconjuntos homogêneos. Baseando-se nas médias observadas, o término erro é a média quadrática= 7,193 a. Usa o tamanho das amostras da media armónica. Alfa= ,05. Suma de quadrados 449,979 14,475 Regressão Residual Total 464,454 ANOVA gl 2 4 Media quadrática 224,990 3,619 F Sig. 62,173 ,001 6 A variável independente é Horas. Horas Horas ** 2 (Constante) Coeficientes Coeficientes não Coeficientes padronizados padronizados B Erro típico Beta ,413 ,065 2,104 -,002 ,001 -1,218 -1,862 1,486 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG t Sig. 6,321 -3,659 -1,253 ,003 ,022 ,278 93 ANOVA para produção de Etanol Origem Repetições Hipóteses Erro Suma de quadrados tipo III 1,887 138,554 Linhagens Hipóteses Erro Horas Linhagens Horas * gl 2 54 Media quadrática ,943 a 2,566 30,375 138,554 3 54 Hipóteses Erro 142,877 138,554 Hipóteses Erro 62,531 138,554 F Sig. ,368 ,694 10,125 a 2,566 3,946 ,013 6 54 23,813 a 2,566 9,281 ,000 18 54 3,474 a 2,566 1,354 ,194 a. MS(Error) Medias marginais estimadas Media Erro típ. 2,803 ,175 Intervalo de confiança 95% Limite inferior Limite superior 2,453 3,154 Prova post hoc: DHS de Tukey Linhagens N SC-025 21 Subconjunto 1 2 2,2424 F-125 21 2,3124 F-127 F-113 21 21 2,9190 2,9190 3,7400 ,524 ,354 Sig. O término erro é a media quadrática (erro)= 2,566. a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica = 21,000. b. Alfa = ,05. a,b DHS de Tukey Horas d i m e n s i o n 1 N Subconjunto 2 0 12 1 ,8383 12 12 1,4058 1,4058 24 12 1,8892 1,8892 48 12 120 12 3,9125 72 12 4,1125 96 12 4,2733 Sig. 3,1925 ,678 ,110 3 3,1925 ,649 Indicam se as medias dos grupos de subconjuntos homogêneos baseadas nas medias observadas. O término erro é a media quadrática (erro)= 2,566. a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica= 12,000. b. Alfa = ,05. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 94 ANOVA para consumo de D-xilose Origem Repeticiones Hipóteses Erro Suma de quadrados tipo III 4,655 275,766 Cepas Hipóteses Erro Horas Cepas * Horas gl 2 54 Media quadrática 2,327 a 5,107 764,798 275,766 3 54 Hipóteses Erro 20206,962 275,766 Hipóteses Erro 1282,913 275,766 F Sig. ,456 ,636 254,933 a 5,107 49,920 ,000 6 54 3367,827 a 5,107 659,482 ,000 18 54 71,273 a 5,107 13,957 ,000 a. MS(Error) Medias marginais estimadas Media Erro típ. Intervalo de confiança 95% Limite inferior Limite superior 16,668 17,657 17,162 ,247 Linhagens Media F-113 F-125 SC-025 F-127 Erro típ. 15,752 13,021 20,905 18,971 Intervalo de confiança 95% Limite inferior Limite superior 14,763 16,741 12,032 14,010 19,916 21,893 17,983 19,960 ,493 ,493 ,493 ,493 Prova post hoc: DHS de Tukey Linhagens N F-125 21 F-113 21 F-127 21 SC-025 21 Sig. 1 13,02 10 Subconjunto 2 3 4 15,7519 18,97 14 20,9048 1,000 1,000 1,000 1,000 Indicam se as medias dos grupos de subconjuntos homogêneos baseadas nas medias observadas. O término erro é a media quadrática (erro)= 5,107. a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 21,000. b. Alfa = ,05. Horas N Subconjunto 1 2 3 4 5 120 12 ,8617 d i m e n s i o n 1 96 12 ,8667 72 12 2,4225 48 12 24 12 12 12 0 12 Sig. 13,4225 28,9217 34,5575 39,0833 ,624 1,000 1,000 1,000 1,000 Indicam se as medias dos grupos de subconjuntos homogêneos baseadas nas medias observadas. O término erro é a media quadrática (erro)= 5,107. a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica = 12,000. b. Alfa = ,05. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 95 Análises de varianza univariante para Yp/s Origem Repeticiones Hipóteses Erro Suma de quadrados tipo III ,485 13,169 gl 2 54 Media quadrática ,243 a ,244 Cepas Hipóteses Erro ,944 13,169 3 54 Horas Hipóteses Erro 2,700 13,169 Cepas * Horas Hipóteses Erro 5,781 13,169 F Sig. ,995 ,377 ,315 a ,244 1,290 ,287 6 54 ,450 a ,244 1,845 ,108 18 54 ,321 a ,244 1,317 ,215 a. MS(Error) Media Erro típ. ,407 Intervalo de confiança 95% Limite inferior Limite superior ,299 ,515 ,054 ANOVA para Fator Eficiência de fermentação Origem 2 54 Media quadrática 20,252 a 111,313 7395,718 6010,884 3 54 Hipóteses Erro 36644,322 6010,884 Hipóteses Erro 12944,786 6010,884 Repeticiones Hipóteses Erro Cepas Hipóteses Erro Horas Cepas * Horas Suma de quadrados tipo III 40,505 6010,884 gl F Sig. ,182 ,834 2465,239 a 111,313 22,147 ,000 6 54 6107,387 a 111,313 54,867 ,000 18 54 719,155 a 111,313 6,461 ,000 a. MS(Error) Media Error típ. 39,307 1,151 Intervalo de confianza 95% Límite inferior Límite superior 36,999 41,615 Prova post hoc: DHS de Tukey Linhagens F-113 21 Subconjunto 1 2 29,4008 F-127 21 35,5618 SC-025 21 37,5642 F-125 21 Sig. N 54,7011 ,070 1,000 Indicam se as medias dos grupos de subconjuntos homogêneos baseadas nas medias observadas. O término erro é a media quadrática (erro)= 111,313. a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica = 21,000. b. Alfa = ,05. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 96 Horas d i m e n s i o n 1 N 1 ,0000 Subconjunto 2 3 4 0 12 12 12 24 12 96 12 51,3951 120 12 53,2577 72 12 57,2353 48 12 Sig. 18,5960 35,3172 59,3475 1,000 1,000 1,000 ,524 Indicam se as medias dos grupos de subconjuntos homogêneos baseadas nas medias observadas. O término erro é a media quadrática (erro)= 111,313. a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica = 12,000. b. Alfa = ,05. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 97 ANEXOS Isabela Sierra Negra Media Luna Los Gemelos Santa Cruz Puerto Ayora Floreana Estação para Tartarugas Anexo 1 – Pontos de coleta das amostras de madeira em decomposição no Arquipélago das Ilhas Galápagos. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 98 Anexo 2 – Certificado Zoosanitario para la exportación do Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca do Equador, e autorização do Ministerio del Ambiente para exportação das amostras de leveduras Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 99 Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 100 Anexo 3 – Ilustração do sistema do fermentador de 2,4 L empregado nas fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por Candida (Lodderomyces/ Spathapora) tropicalis e Lindnera sp. Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG 101