INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E pH NA EXTRAÇÃO
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INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E pH NA EXTRAÇÃO
INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E pH NA EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS DE MICÉLIO DE Trichoderma atroviride Cantuária, A. L. A.*; Ribeiro, D. P.*; Pedrollo, D. G.**; Castro-Gómez, R. J. H.**; Ueno, C. T.* *COALM/UTFPR – Londrina, Brasil **DCTA/UEL, Londrina, Brasil e-mail: [email protected] que micélios de Trichoderma spp resistentes Resumo/Abstract podem ser utilizados em conjunto com The antimicrobial properties of Trichoderma atroviride metabolites have shown satisfactory results in agriculture application. The mycelia residue can also provide economic interesting biomolecules, reducing its ambient pollution. This research aimed to study the effects of pH and temperature on T. atroviride mycelium autolysis as a process for soluble proteins extraction. Soluble proteins determination was performed using Lowry technique and the effects of pH and temperature were studied applying a factorial design 22. The amount of soluble proteins was not significatively affected (p<0.05) by this parameters. The best results were obtained 40 °C and pH 6.5. Keywords: Trichoderma. Soluble proteins. Autolysis. fungicidas para tratamento de sementes, pulverizações foliares ou aplicações no solo, uma vez que este fungo apresenta um comportamento variável em relação aos fungicidas. O estudo das proteínas presentes pode auxiliar no entendimento dos possíveis mecanismos de antagonismo deste fungo, bem como as possibilidades de descobrir biomoléculas de interesse biotecnológico. A extração protéica do micélio pode ser realizada pela autólise, onde em condições adversas de temperatura e pH ocorre uma desordem no sistema enzimático levando ao Introdução ataque indiscriminado das enzimas degradativas, resultando na alteração da O Trichoderma atroviride é um fungo com integridade da parede celular, permitindo a propriedades antimicrobianas muito utilizadas solubilização e liberação dos componentes em pesquisas nesta área. Pode ser utilizado intracelulares ao meio externo [3]. como antagonista de alguns fitopatógenos de importância econômica, na melhoria A utilização do pH ácido ou alcalino para da acelerar processos de autólise de micélios de germinação de sementes e no aumento do fungos é estudada há décadas, com o objetivo crescimento de plantas [1]. Papavizas [2] relata de 1/5 obter biomoléculas, principalmente aminoácidos, porém alguns processos de quitina e outros do inoculo de Trichoderma atroviride – A partir de tubo de ensaio com autólise requerem tempo [4] [5]. A Preparo polissacarídeos meio Agar Dextrose Batata (ABD) com T. representam 90% da parede celular em fungos atroviride, filamentosos, contra inoculados com alça de platina no centro de fatores ambientais, dissecação e pressão placas de Petri contendo ABD estéril. O fungo osmótica [6]. Entre esses polissacarídeos está foi incubado por quatro dias a 25 °C em estufa a β-glucana que tem sido utilizada nas tipo B.O.D. Após crescimento, os fungos foram indústrias de alimentos como estabilizante de armazenados a 5 °C por 4 dias até momento de espumas [7]. Estudos mais recentes têm uso. conferindo proteção pequenos fragmentos foram utilizado enzimas para a autólise, porém ainda Produção de micélios – A produção de de custo relativamente elevado [8]. Desta forma, o presente trabalho teve como micélios foi realizada segundo metodologia efeitos de pH e de Bonnarme et al. [9] modificada, para tal, o temperatura na autólise do micélio de T. meio foi constituído por solução de sais atroviride para extração de proteína solúveis, e adicionada de glucose e extrato de levedura, posteriormente verificar possíveis aplicações. conforme tabela 1. Material e Métodos Tabela 1: Meio de cultura para produção de micélios Glicose 30,0g.L-1 NaNO3 0,6g.L-1 KH2PO4 1,0g.L-1 KCl 0,5g.L-1 MgSO4.7H2O 0,5g.L-1 CaCl2.6H2O 0,008g.L-1 ZnSO4.7H2O 0,001g.L-1 FeSO4.7H2O 0,01g.L-1 Peptona bacteriológica 2,0g.L-1 Extrato de Levedura 1,0g.L-1 Fonte: Bonnarme et al. (2007). objetivo verificar os Microrganismos – O fungo T. atroviride, cepa IMI 206040, foi gentilmente cedido pelo Dr. Enrique Biotecnologia Galindo da do Instituto Universidade de Nacional Autônoma de México. O fungo foi armazenado em meio de cultura ágar batata dextrose (ABD) até momento de uso. O meio foi ajustado a pH 6,0 (HCl/ NaOH). Meios de cultura – Agar Dextrose Batata (ABD) esterilizado em autoclave 121 ºC /15min. e vertidos a quente em placas de Petri de 10 cm de diâmetro, para obtenção de micélio para extração proteica. Posteriormente, alíquotas foram transferidas para recipientes onde ocorreu a incubação para produção de micélios, respeitando a relação volume total do recipiente/volume de trabalho de 1:2. Seguiu- se com autoclavagem por 15 min a 121 °C e 1 atm. A cada 100 mL de 2/5 meio estéril foram inoculados células não rompidas. Em seguida, no aproximadamente 15 fragmentos de dimensões sobrenadante, foi determinado o teor de 0,5 cm x 0,5 cm de meio ABD contendo proteínas solúveis de acordo com o método de micélios de T. atroviride, sem presença de Lowry esporos, sendo em seguida incubados por 72 espectrofotométrica a 660nm, contra um horas a 25 °C e agitação a 100 rpm. branco de reagentes. O valor protéico foi et al. [10], com leitura Após o período de incubação, o meio determinado por meio da relação entre a contendo micélios foi filtrado sob vácuo leitura obtida com a equação da reta utilizando kitassato e funil de büchner com desenvolvida com a proteína padrão de papel de filtro comum. O micélio extraído foi albumina bovina. Os resultados obtidos foram utilizado para determinação de proteínas transformados e apresentados em µg de solúveis. proteínas solúveis por mL. Determinação de proteínas solúveis – Os Resultados micélios de T. atroviride utilizados foram secos em estufa a 80 °C com circulação de ar, A quantidade de proteína solúvel nos para determinação de proteínas solúveis em extratos líquidos dos autolisados em 48 horas é base seca. apresentada na Tabela 2. Para determinar a melhor condição de autólise e produção de proteínas solúveis, foi Tabela 2. Produção de proteínas solúveis/mL realizado experimento fatorial 22. Os fatores e Níveis Temperatura (+1) seus níveis utilizados foram: pH 4,5 (-1) e 6,5 Corrida pH (-1) (+1) e temperatura 30 °C (-1) e 40 °C (+1). 1 4,5 30 °C Proteínas/mL (µg/ml) 1245,788 2 6,5 30 °C 1330,788 3 4,5 40 °C 1895,788 4 6,5 40 °C 2763,288 Cada corrida foi composta de erlenmeyer com 2,5 g de micélio de T. atroviride adicionados de 8 mL de água destilada estéril com pH correspondente. Os recipientes foram O experimento mostrou que na corrida 4 a às temperatura e pH elevados foram fatores temperaturas determinadas por 48 horas. importantes para uma maior eficiência em Posteriormente os valores obtidos foram extração de proteínas solúveis. armazenados em estufas reguladas Por outro lado, é observado na equação (1) transformados em base seca. A amostra autolisada foi vertida em tubos que o coeficiente da temperatura (520,62) é de Falcon e centrifugadas a 10000 rpm/7min. a mais que duas vezes maior que o do pH 25 °C, objetivando separação das paredes e/ou (238,12) e da interação deles (195). 3/5 (Eq. 1): temperatura de 40ºC e pH de 6,5 . Em análises realizadas por Oliveira e Gómez [11], as Y=1808,91+238,12.XpH+520,62.XT+195.XpH.XT melhores condições para extração de proteínas Onde: Y = resposta em proteínas/mL; XpH = valor de pH; XT = valor de temperatura; XpH.XT = valor da interação solúveis da cerevisiae levedura apresentam Saccharomyces uma faixa de temperatura entre 49,0 e 51,0ºC e pH 3,8 a 5,0. É importante ressaltar que processos de Ou seja, a obtenção de proteínas/mL depende muito mais da temperatura que do pH otimização de autólise variam de acordo com a fonte de obtenção de proteínas. e da interação entre eles nas condições do experimento em questão, que pode ser observado na Figura 1, onde a região em vermelho representa o efeito intenso da temperatura sobre a extração de proteinas. Conclusão Estudos atuais mostram que tem crescido o interesse de Trichoderma atroviride como fonte de pesquisa por sua propriedade antogonista, bem como o estudo de obtenção de biomoléculas a partir de biomassa de fungos e leveduras. Contudo, o presente estudo constatou que há presença de proteínas solúveis no micélio de T. atroviride nas variáveis estudadas, demonstrando que é possível a obtenção de proteínas a partir do micélio de T. atroviride. A partir destes dados obtidos, pretende-se quantificar proteínas presentes, principalmente Figura 1. Efeito da temperatura e pH sobre o teor de proteínas solúveis, no extrato líquido com 48 horas de autólise. possuem grande importância comercial, bem como Discussão polissacarídeos que possam estar presentes em frações do micélio após autólise. De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, enzimas como quitinase e β-glucanases que verificou-se que as melhores condições para a extração de proteínas solúveis do micélio T. atroviride, foi em 4/5 Agradecimentos Agradecemos à Fundação Araucária – Programa Ações Afirmativas, pelo apoio sob a forma de bolsas. Referências [1] RESENDE, M.L.; OLIVEIRA, J.A.; GUIMARÃES, R.M.; PINHO, R.G.V.; VIEIRA, A.R. Inoculação de sementes de milho utilizando o Trichoderma harzianum como promotor de crescimento. Ciênc. agrotec., Lavras, v.28, n.4, p.793-798, 2004. [2] PAPAVIZAS, G. C. Survival of Trichoderma harzianumin soil and pea and bean rhizospheres. Phytopathology, Saint Paul, v. 72, n. 1, p. 121-125, Jan. 1982. [3] REED, G.; NAGODAWITHANA, T.W. Yeast technology. 2.ed. New York: Van Nostrand Reinhold. p.369-445, 1991. [4] LAHOZ, R..; REYES, F.; BELTRÁ, R.; GARCIA-TAPIA, C., (1967) The autolysis of Aspergillus terreus in a physiologically acid medium. J. Gen. Microbiol. v. 49 p. 239-265. [5] LAHOZ, R.; IBEAS, J., G., (1968) The autolysis of Aspergillus flavus in an alcaline medium. J. Gen. Microbiol., v. 53 p. 101-108. [6] LATGÉ, J.P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular microbiology, v.66, p.279-290, 2007. [7] BORGES, V.C. Alimentos funcionais: prebióticos, probióticos, fitoquímicos e simbióticos. In: WAITZBERG, D.L. Nutrição oral, enteral e parenteral na prática cllínica. São Paulo: Atheneu, cap.96, p.1495-1509, 2001. [8] KAWANG-SOO, S.; NAK-JUNG, K.; YOUNG, H., K.; HEE-SOO, P.; GI-SEOK, 5/5 K.; JAE-HYUK, Y., (2009) Differential roles of the ChinB chitnase in autolysis and cell death of Aspergillus nidulans. Eukaryotic cell, May, p. 738-746. [9] BONNARME, P.; DJIAN, A.; LATRASSE, A.; FÉRON, G.; GINIÈS, C.; DURAND, A.; LEQUÉRÉ, J.-L. Production of 6-pentyl--pyrone by Trichoderma sp. From vegetable oils. Journal of Biotechnology., v.56, p.143-150, 1997. [10] LOWRY, O.H.; ROSEMBROUGH, J.J.; FARR, A.L.; RANDALL, R.J. Protein measurement with the fenol reagent. J. Biol. Chem., v.193, p.265-275, 1951. [11] OLIVEIRA, A.M.; GÓMEZ, R.J.C. (2005) Otimização da extração de proteínas da levedura Saccharomyces cerevisiae. SEMINA. Universidade Estadual de Londrina. v.26, n. 4, p. 521-534.