Padronização de informações sobre metodologias analíticas para a

Padronização de informações sobre metodologias analíticas para a determinação dos
níveis de álcool (etanol) em diferentes amostras biológicas
Alessandra Cristina Santos Akkari1, Elizabete Campos de Lima1
1
Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André, R. Sta. Adélia, 166 Bl. B, LAb. 204,
Bairro Bangú, CEP 09210-170, Santo André, SP, Brasil
Inicialmente foi feita uma introdução abordando o uso abusivo de álcool como um dos maiores problemas de saúde
pública no mundo. Foi mostrada a farmacocinética do etanol e as principais conseqüências que o abuso etílico provoca
sobre a saúde humana. São descritas as formas de detecção de etanol assim como as vantagens e desvantagens do uso da
medida direta deste álcool em relação ao uso de marcadores biológicos do alcoolismo para verificação do uso abusivo. Há
um tópico tratando dos aspectos analíticos para a detecção de etanol em diferentes espécimes biológicos. Diferentes
fontes bibliográficas de dados foram consultadas e os resultados foram documentados em forma de tabela.
Palavras-chave - Determinação de Etanol, Farmacocinética do etanol, Marcadores biológicos, Metodologias analíticas.
I. INTRODUÇÃO
O etanol é o constituinte essencial de bebidas alcoólicas e,
certamente, é a droga de abuso mais antiga dentre as
conhecidas hoje. Atualmente, o consumo abusivo de álcool se
configura como um dos maiores problemas de saúde pública
no mundo.
Em 2004, o álcool foi responsável por 4,6% da carga
global de doenças e injúrias no mundo, sendo que a maioria
ocorreu em indivíduos entre 15-29 anos [1]. No Brasil, de
acordo com a Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para
Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico (VIGITEL), o
percentual de consumo abusivo de etanol foi de 19% em
2008, contra 17,5%, em 2007. A pesquisa mostrou também
um aumento no número de mulheres dependentes de álcool.
Segundo um estudo do Ministério Público, a taxa de
mortalidade por doenças associadas ao etanol também
cresceu entre 2000 e 2006, correspondendo a uma média de
57 mortes por dia [2]. O alcoolismo, que pode ser definido
como uma síndrome multifatorial, com comprometimento
físico, social e mental, também é um problema de saúde
ocupacional, sendo responsável por 15 a 30% dos acidentes
de trabalho, e uma das maiores causas de acidentes fatais de
trânsito [3].
Em face ao exposto, a detecção e quantificação do etanol
são de grande importância tanto para pesquisas como para a
prática clínica, âmbito forense, monitorização do uso de
álcool no ambiente ocupacional e em outras situações onde o
consumo de álcool é inadequado (gravidez, crianças e
adolescentes expostos, etc.). O presente trabalho teve como
objetivo verificar na literatura, compreendida entre 1990 a
2009, quais os métodos de análise química mais utilizados
para a determinação dos níveis de etanol em espécimes
biológicos.
II. ETANOL: FARMACOCINÉTICA E TOXICOLOGIA
O etanol é absorvido, principalmente por difusão simples,
pelas mucosas do estômago (20%) e do intestino delgado
(80%) e seus picos de concentração sanguínea são atingidos
entre 30 a 90 minutos após a ingestão da bebida alcoólica [4].
Entre 2 a 10% de todo álcool etílico consumido é
eliminado de forma inalterada na urina, suor, saliva e ar
exalado. Cerca de 90% é oxidado no fígado por três vias
diferentes: Álcool Desidrogenase (ADH), Sistema
Microssomal de Oxidação do Etanol (SMOE) e Catalase. O
primeiro passo de seu metabolismo é comum para as três vias
e leva à produção do acetaldeído. Quando a ingestão de
bebida alcoólica é pequena, a ADH catalisa a conversão de
etanol em acetaldeído. Nos casos em que o consumo de
álcool se faz de forma abusiva ou crônica, o SMOE participa
ativamente, aumentando o catabolismo do etanol de 4 a 10
vezes. Embora o SMOE seja mais eficiente se comparado à
ADH e à catalase, ele gera superóxidos e radicais livres que
podem causar danos como mutações, comprometimento de
funções ou, até mesmo, morte celular. O álcool etílico
também pode ser biotransformado de forma não oxidativa por
outras vias [5].
O etanol tem efeitos sobre o sistema nervoso central
(SNC), alterando a função de proteínas ligadas às membranas
neurais,
que
participam da
sinalização,
e
de
neurotransmissores. Embora inicialmente ocorra euforia e
excitação devido à liberação de endorfina, o álcool é
considerado um depressor do SNC, devido sua ação sobre os
neurotransmissores, e o consumo de altas doses e por um
longo período causa déficits neurológicos, desorganização
mental e descontrole da função motora.
A lesão do fígado é uma das conseqüências mais sérias do
consumo de etanol a longo prazo, podendo desencadear
hepatite, cirrose e necrose e fibrose hepática. O estresse
oxidativo advindo de seu metabolismo pode ainda atingir
células acinares do pâncreas [6].
Efeitos sobre o sistema cardiovascular também são
observados com o consumo prolongado de álcool, levando à
miocardiopatia dilatada e diminuição do poder contrátil do
miocárdio.
A ingestão de álcool etílico durante os primeiros seis
meses de gravidez aumenta a incidência de aborto espontâneo
e pode causar a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF),
caracterizada por dimorfismos faciais, retardo do crescimento
e anomalias do SNC.
O uso crônico de álcool tem se mostrado, também, um
fator de risco para o desenvolvimento de câncer da laringe,
fígado, estômago e esôfago. O etanol pode ocasionar tumores,
devido ao acetaldeído, e promover a carcinogênese ao
estimular o citocromo P450 que está associado com o
aumento da produção de elementos instáveis pelo SMOE [7].
III. MARCADORES BIOLÓGICOS DO ETANOL
Marcadores biológicos são substâncias ou seus produtos de
biotransformação, ou, ainda, alterações bioquímicas cuja
determinação em fluídos biológicos e em tecidos permite
avaliar a intensidade de exposição a determinado fármaco.
Entre os biomarcadores do etanol pode-se citar : [9, 10]
- Gama-glutamil transpeptidase (GGT): Apresenta alta
sensibilidade para um consumo excessivo de álcool. Contudo,
para bebedores “pesados” a sensibilidade cai para 70%.
-Alanina
aminotransferase
(ALT),
Aspartato
aminotranferase (AST): A ALT e AST apresentam
sensibilidade entre 65% a 85% para o alcoolismo e uma única
exposição excessiva ao etanol não é suficiente para o
aumento do nível destas transaminases.
- Transferrina Deficiente em Carboidrato (CDT):
Isoformas da CDT estão presentes em maior quantidade na
vigência de alcoolismo. Apresenta sensibilidade entre 50% e
80% e especificidade entre 80% e 100%
- Etilglicuronídeo (EtG): Metabólito direto do etanol,
possui tempo de meia vida maior que a deste álcool e
apresenta alta sensibilidade.
- Ésteres de Ácidos Graxos (FAEEs): Trata-se de um
biomarcador de consumo recente de álcool etílico.
- Etilsulfato (EtS): Via metabólica menor na eliminação
de etanol e pode ser identificado na urina após o consumo de
álcool .
IV. ASPECTOS ANALÍTICOS DA DETECÇÃO DE
ETANOL EM ESPÉCIMES BIOLÓGICOS
Os primeiros métodos para a detecção e quantificação do
nível de etanol no sangue e em outros tecidos foram
desenvolvidos em 1906 por Maurice Nicloux e em 1914 por
Widmark. Dependendo da finalidade da análise, diversas
matrizes biológicas podem ser empregadas.
A medida direta de etanol é o meio mais comum utilizado
para medir-se o consumo recente de álcool. Há diversas
vantagens em medir-se o álcool diretamente. A primeira delas
é que o etanol é o agente responsável pela intoxicação e,
portanto, é cabível que se meça sua concentração
diretamente. A segunda vantagem é que métodos analíticos
para sua medida direta não são tão custosos. Finalmente, o
etanol se distribui rapidamente pelo corpo e pode ser
quantificado a partir de muitos fluidos biológicos.
Entretanto, a medida direta deste álcool apresenta algumas
desvantagens como, por exemplo, o fato do etanol ter um
curto tempo de meia-vida no organismo torna sua medida
direta útil apenas para determinar o consumo recente de
álcool. Outra desvantagem é que a concentração de etanol
determinada simultaneamente em diferentes áreas corporais
varia e, portanto, a concentração de álcool encontrada no
sangue ou na expiração pode ser diferente daquela encontrada
nos tecidos. Finalmente, a estabilidade do etanol durante o
armazenamento pode ser um problema de modo que o
congelamento das amostras e o uso de conservantes são
medidas adequadas para manter a concentração de álcool
etílico inalterada nas amostras [9, 11].
A detecção de etanol em fluídos biológicos é comumente
feita através de análises cromatográficas. A cromatografia em
fase gasosa utilizando a técnica de separação por headspace
(GC-HS) é muito utilizada na análise de compostos voláteis.
A análise de álcool no sangue, realizada por esta técnica, é
um exame comum no âmbito de toxicologia forense [5].
Quando a detecção de etanol não é mais possível, a
quantificação de seus biomarcadores, como CDT, EtG,
FAEEs e EtS, é uma grande alternativa.
Atualmente, em relação à determinação de EtG na urina, a
técnica mais empregada é a cromatografia líquida associada à
espectrometria de massas (LC-MS). Trata-se de uma técnica
rápida, sensível e que não precisa da fase de derivação.
Contudo, a cromatografia gasosa acoplada á espectroscopia
de massas (GC-MS) pode ser uma alternativa menos onerosa
para a detecção apenas do EtG urinário. Vale observar que,
além da urina e soro, o EtG tem sido detectado em amostras
de cabelo e tecido post-mortem empregando GC-MS a fim de
se verificar o uso abusivo de álcool [5].
A CDT é vista hoje como um potente biomarcador para a
detecção da ingestão crônica de etanol. Uma vantagem desta
glicoproteína está no fato de ela não ser tão influenciada por
uma variedade de condições, resultando em uma maior
especificidade entre os marcadores biológicos tradicionais
como GGT, por exemplo. Diferentes métodos analíticos para
a determinação de CDT em soro humano têm sido
desenvolvidos como focalização isoelétrica, cromatografia de
troca iônica, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
e eletroforese capilar de zona (CZE) [10].
Etil Ésteres de Ácidos Graxos é um metabólito resultante
da degradação não-oxidativa do etanol e tem sido utilizado
como biomarcador em diferentes espécimes biológicos. No
sangue, os FAEEs são utilizados como marcadores de
consumo recente de álcool por pelo menos 24 horas após a
ingestão de etanol e são detectados através de técnicas
cromatográficas [12].
No presente trabalho, foi feito um levantamento, a partir
da literatura, e um estudo detalhado de 75 artigos
compreendidos entre 1990 a 2009. A título de simplificação,
alguns trabalhos foram documentados em forma de tabela,
relacionando o espécime biológico, a técnica instrumental
química e o analito detectado (Tabela 1).
Tabela 1: Metodologias analíticas empregadas para detecção de
etanol
e de seus biomarcadores em espécimes biológicos
Matriz
Biológica
Sangue
Sangue
post-mortem
Urina
Urina
post-mortem
Soro
Analito
Técnica Analítica
Autor,
ano de publicação, ref.
CDT
Etanol
Etanol
CDT
CDT
Tagliaro et al.,1990, [10]
Bendetsen et al., 1999, [13]
Corrêa et al, 2000, [14]
Wuyts et al., 2001, [10]
Helander et al., 2001, [16]
Etanol
Etanol
CDT
CZE
GC-HS
GC-HS
CE
Imunoensaio e
HPLC
GC-HS
GC-HS
CZE e HPLC
Etanol
Etanol
EtG
EtG e EtS
EtG
GC-HS
GC-HS
LC-MS
LC-MS
LC-PED
Bendetsen et al., 1999, [13]
Corrêa et al., 2000, [14]
Marin, 2006, [5]
Helander et al., 2009, [15]
Kaushick et al., 2006, [22]
EtG
CDT
Etanol
LC-MS
HPLC
Teste enzimático
QEDTM
Nishikawa et al,1999, [23]
Helander et al., 2003, [17]
Bendetsen et al., 1999, [13]
Etanol
EtG
GC-HS
Gubala et al., 2003, [19]
MAE e
Alvarez et al., 2009, [20]
GC-MS
HS-SPME e
Pragst et al., 2001, [21]
GC-MS
GC-HS
Macchia et al., 1995, [9]
HPLC
Pellegrino et al., 1999, [4]
HS-SPME e GC-MS Hutson et al., 2009, [12]
Saliva
Cabelo
Cabelo
FAEEs
post-mortem
Fluidos
Etanol
Biológicos Etanol
Mecônio
FAEEs
Gubala et al., 2003, [19]
Ventorin, 2004, [4]
Rainio et al., 2008, [18]
HS= Técnica de separação por headspace; CE = Eletroforese capilar;
PED = Detecção eletroquímica pulsada; MAE = Extração assistida por
microondas; SPME = Microextração em fase sólida
V. CONCLUSÃO
Não existe metodologia padrão na legislação brasileira
para a verificação do nível de álcool em fluidos biológico.
Dos 75 artigos pesquisados, apenas 32% utilizaram a
detecção direta de etanol para verificação de uso abusivo de
álcool e em todos a técnica utilizada foi GC-HS. Dos artigos
cujo escopo era a detecção de EtG, 64% deles utilizaram LCMS, 27% GC-MS e apenas 9% usaram HPLC. Para a
detecção da CDT, 80% dos artigos fizeram uso de técnicas
eletroforéticas. Todos os artigos que se referiam à detecção
de FAEEs empregaram GC-MS. A literatura revista será
publicada na forma de artigo Review.
REFERÊNCIAS
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entre brasileiros”.
[3] A. D. Galassi, P. G. Alvarenga, A. G. Andrade, B. F. Couttolenc.
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de Piracicaba- Universidade Estadual de Campinas, 110 pp.
[5] A. V. F. Marin, “Verificação da janela de detecção de etilglicuronídeo
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cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas”. p. 4-27, 2006.
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[8]A. C. Romero, “Mensuração de Biomarcador de exposição às anflatoxinas
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