Descrição

Subprojeto 11
1. Identificação:
Título do subprojeto: Avaliação do potencial angiogênico e elucidação das interações moleculares de
células-tronco mesenquimais e células endoteliais em sistemas de co-cultivo in vitro e in vivo.
País:Brasil
Área do conhecimento, segundo tabela do CNPq http://www.cnpq.br/areasconhecimento
Área:Hematologia
Código:4.01.01.05-3
2. Dados do coordenador do subprojeto
Nome completo: Aparecida Maria Fontes
Data de nascimento: 26/11/1966
Sexo:
Masculino
Feminino
Nacionalidade:Brasileira
Endereço eletrônico: [email protected]
3. Dados da instituição do coordenador do subprojeto
Instituição (universidade, centro, empresa, etc): Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto
Sigla:FUNDHERP
Órgão (instituto, faculdade, etc): Centro Regional de Hemoterapia
Unidade (departamento, laboratório, etc): Laboratório de Transferência Gênica
Cargo/função: Pesquisadora
4. Resumo do subprojeto
Resumir em, no máximo 1 página, o resumo do subprojeto.
A formação de vasos sangüíneos ocorre em resposta a fatores angiogênicos por duas vias:
vasculogênese e angiogênese. A vasculogênese refere-se a formação de vasos sangüíneos a partir de
células progenitoras endoteliais (angioblastos), enquanto a angiogênese refere-se ao processo de
formação de novos vasos por brotamento a partir de vasos pré-existentes. A princípio acreditava-se que a
formação de vasos na fase adulta ocorria exclusivamente a partir de células endoteliais maduras as quais
teriam o potencial de recrutar pericitos durante esse processo. Estudos recentes conduzidos por nosso
grupo levou-nos a hipótese de que as células-tronco mesenquimais poderiam consistir células-tronco mais
primitivas que estariam presentes nas paredes dos capilares sangüíneos dos diferentes tecidos e que
seriam responsáveis pelo processo de neovascularização durante o mecanismo de reparo tecidual (Covas
et al., 2008). Em paralelo, desenvolvemos protocolos in vitro de diferenciação de células endoteliais a
partir de células progenitoras endoteliais (AC133) da medula óssea (BM-CE) e do sangue do cordão
umbilical (UC-CE). As células progenitoras endoteliais e as células endoteliais diferenciadas (BM-CEd e
UC-CEd) foram caracterizadas quanto: a) morfologia; b) perfil f fenotípico; c) perfil de expressão gênica, d)
potencial de uptake de AcLDL e e) potencial vasculogênico in vitro de formação de estruturas tubulares em
matrigel. Em conjunto, esses estudos permitiram avaliar in vitro o potencial vasculogênico das BM-CE e
UC-CE, elucidar modificações fenotípicas ao longo do processo de diferenciação endotelial e mapear
genes e fatores de transcrição envolvidos no processo de vasculogênese (Covas, com. pessoal).
Dando continuidade a esses estudos a proposta do presente projeto consiste investigar as interações
entre as células-tronco mesenquimais da medula óssea (BM-MSC) e veia umbilical (UV-MSC) e pericitos
cerebrais (B-Per) com as células endoteliais da veia do cordão (HUVEC), bem como, com as células
endoteliais diferenciadas in vitro (BM-CE ou UC-CE).
Serão desenvolvidos três modelos: 1) in vitro em ensaios de co-cultivo com e sem contato com diferentes
proporções dos tipos celulares: a) BM-MSC:HUVEC; b) UV -MSC:HUVEC; c) pericito:HUVEC; d) BMMSC:BM-CEd; e) BM-MSC:UC-CEd; f) UV-MSC:BM-CEd; g) UV-MSC:UC-CEd; h) pericito:BM-CEd e i)
pericito:UC-CEd e 2) in vivo em modelos de formação de vasos em matrigel após implantes sub-cutâneos
em camundongos imunodeficientes e 3) modelo de avaliação do potencial vasculogênico das células
endoteliais geradas em cultura após a indução da insuficiência arterial periférica por ligação da artéria
femoral.
No modelo in vitro será realizada a caracterização de ambos tipos celulares antes e após diferentes e em
tempos de co-cultivo utilizando seis parâmetros: a) morfologia; b) perfil fenotípico; c) perfil de expressão
gênica, d) potencial de “uptake” de AcLDL; e) potencial vasculogênico in vitro de formação de estruturas
tubulares em matrigel e f) caracterização histológica por microscopia confocal nas estruturas neoformadas
em matrigel utilizando marcadores mesenquimais e endoteliais.
No modelo in vivo, primeiramente será realizada a modificação gênica das células-tronco mesenquimais e
pericitos com marcadores fluorescentes e bioluminescentes (DsRed e Luciferase) que permitirá a
avaliação dos capilares neoformados por microscopia confocal e utilizando o sistema IVIS nas estruturas
formadas em matrigel.
No modelo de avaliação de insuficiência arterial periférica por ligação e remoção da artéria femoral em um
dos membros inferiores, em camundongos NODSCID, células endoteliais geradas em culturas com e sem
1
co-cultivo das células-tronco mesenquimais e pericitos serão infundidas nos camundongos e as análises
histológicas processadas entre 5 e 10 dias após o procedimento cirúrgico.
A compreensão dessas interações fornecerão subsídios relevantes para a elucidação dos mecanismos de
angiogênese e vasculogênese em diferentes situações clínicas.
Em colaboração com o grupo da Profa Dra Maria Angélica Miglino o presente projeto objetiva também
isolar células-tronco mesenquimais e endoteliais do saco vitelínico de cães, por consistir o sítio original de
formação dos vasos sangüíneos durante o desenvolvimento embrionário. Estudos recentes realizados por
Maria Angélica permitiram mapear os sítios preferenciais do saco vitelínico, onde se situam as células
endoteliais (SV-CE) e células-tronco mesenquimais (SV-CTM) (Miglino et al 2008). Assim, após o
isolamento desses dois tipos celulares serão realizados ensaios de co-cultivo in vitro com e sem contato
para a compreensão das interações moleculares entre SV-CTM e SV-CE utilizando os parâmetros acima
descritos. O potencial vasculogênico também será avaliado em modelo de formação de vasos em matrigel
após implantes sub-cutâneos de células-tronco mesenquimais com células endoteliais, em camundongos
imunodeficientes.
5. Objetivos
Listar os objetivos gerais e específicos do subprojeto.
Objetivos Gerais:
Contribuir para a formação de recursos humanos, nucleação de pessoal e integração com equipes
multidisciplinares para a consolidação da linha de pesquisa em células-tronco com desenvolvimento de
modelos in vitro e pré-clínicos que permitem avaliações mais adequadas sobre o potencial terapêutico das
mesmas.
Elucidar as interações moleculares do “cross-talk” entre populações celulares selecionadas por “sorting”
para um dos marcadores de células-tronco mesenquimais (CTM) ou pericitos com células endoteliais em
sistemas de co-cutivo in vitro e avaliação do potencial vasculogênico in vivo em modelos de co-infusão em
matrigel, seguida da infusão sub-cutânea em camundongos imunodeficientes.
Objetivos Específicos:
1- Isolar e caracterizar de populações celulares da medula óssea, veia do cordão e capilares
cerebrais humanas no que diz respeito ao nível de expressão dos marcadores CD271, CD140B,
3G5, NG2, Stro-1 e CD146 para selecionar o marcador mais apropriado para realizar a clonagem
celular;
2- Clonagem celular por “sorting” de populações celulares da medula óssea, veia do cordão e
capilares cerebrais utilizando um dos marcadores previamente caracterizados;
3- Caracterização morfológica e imunofenotípica de populações celulares isoladas por “sorting”;
4- Isolar e caracterizar células-tronco mesenquimais do saco vitelínico canino (cSV-CTM);
5- Potencial de diferenciação das populações celulares humanas selecionadas por “sorting” e das
CTM caninas em adipócito, osteócito e condrócito
6- Modificação Gênica de células-tronco humanas isoladas por “sorting” e das CTM caninas com
luciferase/DsRed e seleção das células positivas para DsRed por citometria de fluxo;
7- Isolamento e cultivo de células endoteliais humanas e caninas positivas para CD31 obtidas da veia
do cordão humano (HUVEC) e do saco vitelínico canino (cSV-CE), após a seleção por citometria
de fluxo;
8- Geração ex-vivo de células endoteliais humanas a partir de células progenitoras endoteliais
AC133+ isoladas da medula óssea e sangue do cordão umbilical;
+
9- Caracterização morfológica e fenotípica de células endoteliais/CD31 obtidas de tecidos humanos
e caninos e humanas diferenciadas ex-vivo;
10- Co-cultivo com contato e sem contato de populações celulares humanas isoladas por “sorting” e
CTM caninas com células endoteliais;
11- Análise morfológica, imunofenotípica e de expressão gênica das populações celulares antes e
após o co-cultivo com células endoteliais;
12- Avaliação do potencial angiogênico “in vivo” de populações celulares isoladas por “sorting”, antes
e após o co-cultivo com células endoteliais em modelos de implantes de matrigel em
camundongos NOD/SCID utilizando métodos não invasivos (Sistema IVIS);
13- Caracterização dos capilares dos implantes por microscopia confocal;
14- Avaliação do potencial angiogênico “in vivo” das células endoteliais após a indução da isquemia de
membros inferiores, em camundongos NODSCID,
15- Análise histológica dos vasos neo-formados 5 a 10 dias após a infusão das células endoteliais por
microscopia confocal.
2
6. Plano de trabalho
Não se aplica
7. Metodologia
Indicar a metodologia que será aplicada na pesquisa pretendida.
1. Isolamento, seleção e cultivo de células-tronco mesenquimais do sangue da medula óssea e da
veia umbilical humana e do saco vitelínico canino. Para o isolamento das CTM da medula óssea
será realizado o gradiente de ficoll para separação de células mononucleares, seguida do
protocolo de aderência ao plástico, cultivo e expansão para a seleção de um população
enriquecida em CTM. Para o isolamento de CTM da veia umbilical e saco vitelínico canino será
utilizado o protocolo clássico de digestão por colagenase, seguida da aderência ao plástico.
2. Isolamento e cultivo de pericitos cerebrais. Será realizado o gradiente de dextran para a
separação dos capilares sangüíneos, seguida da digestão com colagenase para a obtenção das
células dos capilares;
3. Clonagem celular: as culturas de CTM dos diferentes tecidos serão submetidas a marcação com
diferentes marcadores de CTM e pericitos para a seleção do marcador mais apropriado para a
realização da clonagem celular por citometria de fluxo;
4. Modificação Gênica de MSC e pericitos com luciferase e DsRed: Após a clonagem celular, as
linhagens celulares serão modificadas geneticametne com o gene da luciferase utilizando o
sistema transposional que permite a inserção dos mesmos no genoma das MSC e pericitos. Após
a expansão será realizada a seleção de células positivas para DsRed por citometria de fluxo;
5. Isolamento, seleção e cultivo de células endoteliais maduras. Será realizado o despreendimento
das células da parede da veia umbilical e do saco vitelínico após o tratamento com colagenase.
Em seguida, será realizada a seleção com anti-CD31 por citometria de fluxo. Células positivas
para CD31 serão submetidas ao protocolo de aderência ao plástico, em meio específico, para a
seleção de uma população homogênea de células endoteliais;
6. Geração ex-vivo de células endoteliais: Células mononucleares da medula óssea e sangue do
cordão umbilical serão submetidas a seleção por anti-CD133, seguida do cultivo com um coquetel
específico de citocinas para a obtenção de uma população de células endoteliais maduras
portadoras de CD31;
7. Análise Morfológica: será realizada por microscopia de contraste de fase e microscopia
convencional após a coloração por Leishman;
8. Co-Cultivo das CTM e pericitos com células endoteliais: será realizado o co-cultivo com e sem
contato dos dois tipos celulares em placas de 6 poços. As células serão colocadas a princípio na
proporção 1:1 e a análise realizada após diferentes tempos de co-cultivo (5, 10, 15 e 20 dias).
Periodicamente, as células serão caracterizadas quanto o imunofenótipo e o perfil de expressão
gênica para marcadores de MSC, pericitos e endoteliais;
9. Ensaios in vivo da avaliação do potencial angiogênico em camundongos NOD/SCID: MSC ou
pericitos serão ressuspendidos em matrigel na presença de células endoteliais e infundidos, via
sub-cutânea, em camundongos NOD/SCID;
10. Avaliação dos animais utilizando sistema IVIS: Diferentes tempos após a infusão método não
invasivo de obtenção de imagens será utilizado;
11. Avaliação histológica por HE: diferentes tempos após a infusão, os animais serão sacrificados e o
matrigel submetido ao procedimentro histológico, seguida da coloração por HE
12. Caracterização das estruturas histológicas por imuno-histoquímica: os tecidos serão fixados,
submetidos a cortes de 8 µm e em seguida será realizada a caracterização imuno-histoquímica
por microscopia confocal;
13. Lesão isquêmica seguida da infusão das células progenitoras endoteliais e endoteliais geradas exvivo: será realizada a ligação e remoção da artéria femoral em um dos membros inferiores do
camundongo seguida da infusão das células endoteliais. Entre 10 a 20 dias após o procedimento
cirúrgico os tecidos serão processados para histologia para a caracterização dos vasos
neoformados por microscopia confocal.
8. Equipe Executora - Atividades dos pesquisadores que integram o subprojeto
3
Descrição detalhada do grupo proponente explicitando a qualificação dos pesquisadores.
Especificar as atividades a serem desempenhadas pelos membros da equipe, informando as experiências
anteriores dos mesmos em atividades de pesquisa e desenvolvimento.
Nome
CPF
Objetivo/Justificativa Função
no Experiências
Titulação
da atividade
projeto
anteriores
(pesquisador
ou
responsável
pelo
Laboratório
Dimas Tadeu
Avaliação semanal do Coordenador
MD, PhD
Covas
andamento do projeto
com a equipe do
Hemocentro Ribeirão
Preto
Aparecida
13113802806 Responsável
pela Pesquisadora Pós-doc
em PhD
Maria Fontes
elaboração
do
terapia gênica
protocolo
experimental
Ricardo
B.
Executará os ensaios bolsista
Execução dos
Bacharel
Silva
de expressão gênica
ensaios pilotos
dos ensaios de coem
cultivo, seguida da
camundongos
caracterização
em
modelo animal
Danilo
Responsável
pelos bolsista
Cultura
e Mestrando
Almeida
ensaios de co-infusão
expansão
de
em matrigel
CTM
e
com
ensaios animais
Maristela
Responsável
pelo Responsável
Isolamento
e Mestre
Delgado
isolamento e cultivo pelo
cultivo de MSC e
Orellana
das MSC, pericitos e laboratório de endoteliais
endoteliais
cultura celular humanas
Estudante DTI
Auxiliará nos ensaios
de lesão isquêmica
Patrícia
VB
Responsável
pelo Responsável
Análise
Bióloga
Palma
“sorting” por citometria pelo
imunofenotípica
laboratório de por Citometria de
citometria de Fluxo
fluxo
Virgínia
Auxiliará
nas Bolsista pós- Modificação
PhD
Picançodiscussões
dos doc
Gênica célulasCastro
resultados
tronco
Danielle AR
Auxiliará nas análises Tec.
Pesq. Análise
de PhD
Magalhães
de expressão gênica Lab.
Transf. expressão
e modificação gênica Gênica
gênica
em
microarray
Angélica
Avaliação semanal do Coordenadora Coordenadoras
Profa. Titular
Miglino
andamento do projeto do projeto com de
Projeto do
com a equipe da Fac. a equipe da temático,
Departamento
Medicina Veterinária Fac. Medicina auxílios
à de Cirurgia
e Zootecnia da USP
Veterinária e pesquisa
e
Zootecnia da auxílios viagens
USP
Irina Kerkis
Responsável
pela Pesquisador
Pesquisadora
Profa.
Dra.
elaboração
do
com mestrado e Pesquisador
protocolo
doutorado
na PcQ IV do
experimental com a
Rússia,
Instituto
equipe
da
Fac.
desenvolveu no Butantan
Brasil a patente
Medicina Veterinária
4
e Zootecnia da USP
Daniele
Santos
Martins
dos 29422652804
Responsável
caracterização
células tronco
pela Pesquisadora
das
Responsável
pelo Pesquisador
isolamento e cultivo
das CTM e endoteliais
Carlos
Eduardo
Ambrosio
Flávia Thomaz 191.637.838- Obtenção das células Pós-doc
do
Verechia
27
bovinas GFP+
LMMD, FZEAPereira
USP,
Pirassununga
e responsável
pelo L@mpe,
Unesp
Dracena
da extração das
células de polpa
de dente
Células-tronco
germinativas de
origem
fetal
canina
Pesquisador
com experiência
na
área
de
placentação em
carnívoros
e
cultivo celular
Desenvolvimento
da
gestação
conceptos
bovinos
clonados
e
transgênicos
GFP+
PhD
Jovem
Pesquisador
da Faculdade
de Medicina
Veterinária e
Zootecnia
Profa. Dra. da
Faculdade
Estadual
Paulista
–
unidade
Dracena/SP
9. Fontes de financiamento
Relação dos projetos financiados nos últimos 5 anos (vigentes ou encerrados)
Fonte
Financiamento
de
Título
Vigência
Valor
Relação com
solicitação
a presente
10. Contrapartida das instituições participantes
Detalhar, em moeda corrente nacional, a contrapartida das instituições brasileiras e francesas
participantes do subprojeto temático, na forma de: infra-estrutura, recursos financeiros, recursos humanos
(horas de trabalho), materiais de consumo e diárias e passagens.
Não se aplica
11. Orçamento justificado e adequado com a proposta
Formulário anexo
12. Bolsas
Esses recursos não poderão ultrapassar 15% do valor total solicitado para o projeto
Modalidade de bolsa: (IC, ITI, DTI, AT, PDJ, BEV)
Modalidade
Duração
Quantidade
DTI
36 meses
1
13. Implantação de cursos ou disciplinas de pós-graduação:
Detalhar treinamento tecnológico de alto nível ou implantação de metodologias laboratoriais inovadoras –
5
indicar horas/aula e o programa. Indicar classificação CAPES
6