REPRODUÇÃO DE ESPÉCIES DE PIRACEMA

CEMIG
Companhia Energética de Minas Gerais
REPRODUÇÃO DE ESPÉCIES
DE PIRACEMA
PIRACEMA
Pira=Peixe
Cema=Canto
Redução dos Estoques de Peixes
1. Pesca Predatória: desenvolvimento da industria
pesqueira;
2. Extração de Recursos: desmatamento, mineração;
3. Poluição;
4. Perdas de água e inundações;
5. Construção de barragens;
6. Variações climáticas;
Represa de Camargos
Represa de Jaguara
Sistema de Transposição
Escadas e elevadores
ajudam na desova dos
peixes de piracema
Época de reprodução de algumas espécies de peixes de
água doce
•ESPÉCIE
•Meses do ano
•J •F •M •A •M •J •J •A •S •O •N •D
•Piracanjuba
• (Brycon orbignyanus)
•♦
•♦
•Curimba
• ( Prochilodus scrofa)
•♦ •♦
•♦
•Dourado
•(Salminus maxillosus)
•♦
•Pintado
•(Pseudoplatystoma curuscans)
•♦ •♦ •♦
•♦ •♦
•Piapara
• (Leporinus elongatus)
•♦
•♦
•Piau (Leporinus friderici)
•♦
•♦ •♦ •♦
Murgas et al 2003
Espécies de peixes, dose e intervalo utilizado na
hipofisação
1ª dose
mg/kg
Intervalo
horas
2ª dose
mg/kg
Dose
única
macho
(mg/kg)
Horas grau
para extrusão
Temp.
da água
(ºC)
Nº médio
ovócitos/g
Curimba
0,5
8 - 12
5,0
1,0 – 2,0
308
25
1100
Piau
0,5
10 – 12
5,0
0,5 – 3,0
196
24
2000
Piapara
0,5-0,8
12
5,0
0,4 – 4,0
199
24
2000
Dourado
0,5-1,0
8 – 12
5,0
1,0 – 2,0
140 - 160
24
2200
Pintado
0,5-0,7
10 – 12
5,0-7,0
1,0 – 2,0
306
24
2200
Piracanjuba
0,5-0,8
12
5,0
0,4 – 4,0
196
24
1600
Matrinxã
0,5
8 -12
5,0
0,5 – 1,0
140 - 160
24
1200
Pacu
0,5
10 – 12
5,0-7,0
1,0 – 2,0
240 - 320
25
1200
0,5-0,8
12
5,0
2,5
290
27
1338
Espécie
Tambaqui
Utilización de diferentes concentraciones de
metanol y dimetilsulfóxido em la
crioconservación del semen de curimba
(Prochilodus lineatus)
Prof. Luis David Solis Murgas – DMV/UFLA
Prof. Antonio Ilson Gomes de Oliveira
Profa. Priscila Vieira Rosa Logato – DZO/UFLA
Aléssio Batista Miliorini-DMV-UFLA
DEPARTAMENTO
DE ZOOTECNIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Introdução
Criopreservação seminal X Economia/Ecologia
Vantagens da criopreservação:
Î melhoria genética
Î “quebra” da assincronia
Î transporte
Î redução de custos
Objetivos
Protocolo de criopreservação do sêmen:
A) avaliação de toxicidade: metanol e DMSO
B) efeito sobre o congelamento
C) efeito sobre a capacidade fertilizante
Revisão de Literatura
Por que a
Curimba?
⇧ importância comercial (Maia et al.
1999)
Modelo experimental (Murgas et al.
2003)
Qualidade espermática
motilidade (Godinho, 2000)
análise morfológica (Moraes et al., 2004)
fertilidade (Ciereszko & Dabrowski, 1984)
Soluções Crioprotetoras
TABELA 1. Classificação dos crioprotetores quanto à permeabilidade à
membrana celular.
Intracelulares
(solúveis)
Extracelulares
(não solúveis)
Dimetilsulfóxido (DMSO)
Glicose
Glicerol
Sacarose
Metanol
Gema de ovo
Etilenoglicol
Leite desnatado
Propilenoglicol
Soro
Propanodiol
Água de coco
Fonte: Cruz (2001)
Soluções Ativadoras
Água destilada e água de tanque
NaHCO3 (Miliorini et al., 2005)
NaCl (Murgas et al., 2005)
KCl (Ravinder et al., 1997)
Uréia (Carolsfeld et al., 2003)
Congelamento
Î Vapor + N2(l) a -196°C
Î Huso huso: ≈ qualidade 5 anos (Mins et al, 2000)
Fertilização
⇧ influenciada por fatores externos (Miliorini et al., 2005)
- Qualidade do sêmen
- Temperatura ambiente
- Ambiente de incubação
Confirmação na qualidade (Rana & MacAndrew, 1989)
Nunca isolada!!
Material e Métodos
Período, Animais e Ensaios
Î Piracema (nov/2005 - jan/2006)
Î 10 machos de P. lineatus
Análise de toxicidade
Congelamento
Fertilização
FIGURA 1. Laboratório de piscicultura
da EAI-CEMIG/Itutinga-MG
(visão externa).
FIGURA 2. Laboratório de
piscicultura da EAI-CEMIG,
em Itutinga-MG.
FIGURA 3. Captura e indução hormonal.
FIGURA 4. Coleta e avaliação do
sêmen in natura.
FIGURA 5. Material
utilizado e diluição do
sêmen in natura.
TABELA 2. Soluções crioprotetoras - tratamentos.
Tratamento
BTS
(% p:v)
Crioprotetor
Concentração
(% v:v)
A1
5,0
Metanol
05,0
A2
5,0
Metanol
07,5
A3
5,0
Metanol
10,0
A4
5,0
Metanol
12,5
B1
5,0
DMSO
05,0
B2
5,0
DMSO
07,5
B3
5,0
DMSO
10,0
B4
5,0
DMSO
12,5
FIGURA 6. Material utilizado
no para congelamento.
FIGURA 7. Raques e sua disposição em
botijão de vapor de N2 (Taylor-Wharton,
modelo CP 300, dry shipper).
FIGURA 8. Botijão de N2 (l)
(Cryometal, modelo DS-18) e
descongelamento do sêmen.
Após o congelamento...
a) Motilidade (% ; segundos) Î água destilada e NaHCO3 1%
b) Alterações morfológicas (%) dos espermatozóides
c) Fertilização (%) Î água destilada e NaHCO3 1%
A
B
C
E
D
FIGURA 9. Biopsia ovariana (A), preparo (B e C) e avaliação oocitária (D e E)
ao microscópio esteroscópico binocular (Olympus, modelo SZ-4).
FIGURA 10. Incubadoras experimentais montadas
no laboratório de piscicultura da EAI-CEMIG
(modelo utilizado por Maria, 2005).
FIGURA 11. Corte das palhetas e mistura do
sêmen descongelado aos oócitos recém-extruídos.
FIGURA 12. Amostra com embriões viáveis e inviáveis visíveis a olho nu.
Análise Estatística
SAS (1995) e SISVAR (Ferreira, 2004)
Toxicidade e Congelamento: DBC – Fatorial 2 x 4 x 2
Morfologia: DBC – Fatorial 2 x 4
Fertilização: DIC – Fatorial 2 x 4 x 2
Resíduos não normais Î transformação log10x
Regressão
Resultados e Discussão
I. Toxicidade das Soluções Crioprotetoras
Antes do Congelamento
TABELA 3. Motilidades médias (%) do sêmen de curimba (P. lineatus) antes do
congelamento.
Concentrações (% v:v) dos Criop.
Crioprotet.
Médias 1
Ativador
5,0
7,5
10,0
12,5
Água
86 (1,0)
93
90
81
88 (1,0)a
NaHCO3
82
82
86
74
81b
Água
87
87
88
76
85B
NaHCO3
89
93
88
92
90A
Médias dos
Ativadores
Água
87 (1,0)
90
89
78
86 (1,0)
NaHCO3
86
88
87
83
86
Médias dos
Criopotet.
Metanol
84 (1,0)
87
88
78
84 (1,0)
DMSO
88
90
88
83
87
86 (1,0)
89
88
81
86 (1,0)
Metanol
DMSO
Médias das
Concentrações 2
1 Médias seguidas de letras distintas diferem entre si pelo teste F (P<0,01).
2 Efeito quadrático da concentração de crioprotetores (P<0,05).
Valores entre parênteses referem-se ao erro-padrão da média.
Regressão vs Concentrações
Motilidade (%)
90
y = 89,3%
89
88
87
86
85
84
83
82
81
80
5,0
y = 1,8277 + 0,0314 x - 0,0020 x2
R2 = 98,57%
x7,5= 7,84%
10,0
12,5
Concentração (% v:v) de crioprotetores
M édias observadas
M édias estimadas
FIGURA 14. Regressão das motilidades médias (%) do sêmen de curimba (P. lineatus)
em função das concentrações de crioprotetores, antes do congelamento..
TABELA 4. Duração Média da motilidade (segundos) do sêmen de curimba (P. lineatus)
antes do
congelamento.
Concentrações (% v:v) dos Criop.
Crioprotet.
Médias 1
Ativador
5,0
7,5
10,0
12,5
Água
48 (1,3)
45
43
36
43 (1,1)b
NaHCO3
111
123
96
80
101ª
Água
48
42
35
27
37B
NaHCO3
118
165
127
181
146A
Médias dos
Ativadores
Água
48 (1,2)
43
39
31
40 (1,1)
NaHCO3
115
143
110
121
122
Médias dos
Criopotet.
Metanol
73 (1,2)
75
64
54
66 (1,0)
DMSO
75
83
67
70
73
74 (1,1)
79
66
61
70 (1,1)
Metanol
DMSO
Médias das
Concentrações
1 Médias seguidas de letras distintas diferem entre si pelo teste F (P<0,01).
Valores entre parênteses referem-se ao erro-padrão da média.
Resultados e Discussão
II. Motilidade Espermática após o
Descongelamento
TABELA 5. Motilidades médias (%) do sêmen de curimba (P. lineatus) após o
descongelamento.
Concentrações (% v:v) dos Criop.
Crioprotet.
Médias 1
Ativador
5,0
7,5
10,0
12,5
Água
56 (5,4)
63
64
54
59 (2,7)
NaHCO3
70
77
84
79
78
Água
73
73
84
57
72
NaHCO3
78
83
86
82
82
Água
65 (3,8)
68
74
56
66 (1,9)b
NaHCO3
74
80
85
80
80a
Metanol
63 (3,8)
70
74
67
68 (1,9)B
DMSO
76
78
85
69
77A
69 (2,7)
74
80
68
73 (1,3)
Metanol
DMSO
Médias dos
Ativadores
Médias dos
Criopotet.
Médias das
Concentrações 2
1 Médias seguidas de letras distintas diferem entre si pelo teste F (P<0,01).
2 Efeito quadrático da concentração de crioprotetores (P<0,01).
Valores entre parênteses referem-se ao erro-padrão da média.
Regressão vs Concentrações
80
78
Motilidade (%)
y = 77,7%
76
74
72
y = 27,945 + 11,322 x - 0,644 x2
70
R2 = 79,51%
68
66
5,0
x = 8,79% 10,0
Concentração (% v:v) de crioprotetores
7,5
M édias observadas
12,5
M édias estimadas
FIGURA 15. Regressão das motilidades médias (%) do sêmen de curimba (P. lineatus)
em função das concentrações de crioprotetores, após o descongelamento.
TABELA 7. Motilidades médias (segundos) do sêmen de curimba (P. lineatus) após o
descongelamento.
Concentrações (% v:v) dos Criop.
Crioprotet.
Médias 1
Ativador
5,0
7,5
10,0
12,5
Água
28 (1,2)
27
29
31
29 (1,1)b
NaHCO3
57
70
74
90
72a
Água
25
28
36
16
25B
NaHCO3
90
104
107
94
99A
Água
26 (1,1)
27
32
22
27 (1,1)
NaHCO3
72
85
89
92
84
Metanol
40 (1,1)
43
47
53
45 (1,0)
DMSO
48
54
62
38
50
43 (1,1)
48
54
45
48 (1,0)
Metanol
DMSO
Médias dos
Ativadores
Médias dos
Criopotet.
Médias das
Concentrações 2
1 Médias seguidas de letras distintas diferem entre si pelo teste F (P<0,01).
2 Efeito linear da concentração de metanol (P<0,05) e quadrático da concentração de DMSO (P<0,01).
Valores entre parênteses referem-se ao erro-padrão da média.
Regressão vs METANOL
60
Duração (s)
50
40
30
y = 32,6588 + 1,4555 x
20
r2 = 98,40%
10
0
5,0
7,5
10,0
12,5
Concentração (% v:v) de METANOL
M édias observadas
M édias estimadas
FIGURA 17. Regressão das motilidades médias (segundos) do sêmen de curimba (P. lineatus)
em função das concentrações de METANOL, após o descongelamento.
Regressão vs DMSO
70
Duração (s)
y = 60,960s
50
40
30
y = 1,0494 + 0,1757 x - 0,0105 x2
20
R2 = 83,78%
10
0
5,0
7,5
x = 8,37%
10,0
12,5
Concentração (% v:v) de DMSO
M édias observadas
M édias estimadas
FIGURA 18. Regressão das motilidades médias (segundos) do sêmen de curimba (P. lineatus)
em função das concentrações de DMSO, após o descongelamento.
Resultados e Discussão
III. Morfologia Espermática após o
Descongelamento
Cabeça
1µm
Peça intermediária
Colo ou peça de
conexão
Peça principal
Peça terminal
FIGURA 19. Espermatozóide
de P. lineatus. (1000 X)
TABELA 8. Patologias médias (%) do sêmen de P. lineatus após o descongelamento.
Alterações Morfológicas
Concentração
(% v:v)
Maiores 1
Menores NS
Totais
5,0
37,8 (3,8)
3,6 (0,6)
41,3 (3,8)
7,5
28,1
2,3
30,4
10,0
24,0
1,5
25,6
12,5
27,0
3,2
30,2
5,0
28,7
2,6
31,2
7,5
24,6
2,4
27,0
10,0
24,8
1,3
26,1
12,5
23,2
1,1
24,3
Médias do sêmen descongelado
27,3
2,3
29,5
Médias do sêmen in natura
1,8 (0,4)
1,2 (0,4)
3,0 (0,8)
Maiores
Menores
Totais 2
Metanol
27,0 (3,8)
2,7 (0,3)
31,9 (1,9)
DMSO
23,2
1,9
27,2
Criop.
Metanol
DMSO
Médias dos Crioprotetores
NS
Efeito não significativo das concentrações de crioprotetores (P>0,05).
não significativo entre as concentrações de crioprotetores (P>0,05), mas significativo sobre as
patologias de cauda fortemente enrolada e degenerada (P<0,05).
2 Efeito linear da concentração de crioprotetores (P<0,05).
Valores entre parênteses referem-se ao erro-padrão da média.
1 Efeito
Regressão vs Crioprotetores
Valores em %
40
30
20
y = 39,989 - 1,195 x
r2 = 68,80%
10
0
5,0
7,5
10,0
12,5
Concentração (% v:v) de crioprotetores
M édias observadas
M édias estimadas
FIGURA 20. Regressão das patologias médias (%) do sêmen de curimba (P. lineatus)
em função das concentrações de crioprotetores, após o descongelamento.
TABELA 9. Patologias médias (%) significativas do sêmen descongelado de
curimba (P. lineatus) acrescido de soluções contendo diferentes
crioprotetores.
Alterações Morfológicas 1
Crioprotetor
Cauda fortemente
enrolada
Cauda degenerada
Metanol
7,2 (1,1) b
1,2 (1,0) b
DMSO
4,7 a
1,0 a
1 Médias
seguidas de letras distintas, nas colunas, diferem entre si pelo teste F (P<0,05).
Valores entre parênteses referem-se ao erro-padrão da média.
A
B
C
D
E
F
FIGURA 21. Patologias espermáticas maiores. A. Cabeça degenerada e
outra com contorno anormal; B. Cabeças degeneradas e cauda fortemente
dobrada; C. Cabeça e peça intermediária degeneradas; D. Cauda fraturada;
E. Cauda degenerada; F. Cauda fortemente enrolada.
G
H
I
J
K
L
FIGURA 22. (continuação). Patologias espermáticas maiores. G. Cabeça
com contorno anormal e peça intermediária degenerada; H. Cabeça isolada
com contorno anormal; I e J. Peças intermediárias degeneradas; K. Cauda
degenerada; L. Cauda enrolada.
A
B
C
D
E
F
FIGURA 23. Patologias espermáticas menores. A. Cabeça isolada e com
contorno normal; B. Gota citoplasmática proximal; C e D. Gotas
citoplasmáticas distais; E. Caudas dobradas; F. Cauda enrolada distalmente.
Resultados e Discussão
IV. Capacidade de Fertilização do sêmen
Descongelado
TABELA 10. Fertilizações médias (%) do sêmen de curimba (P. lineatus) após o
descongelamento.
Concentrações (% v:v) dos Criop.
Crioprotet.
Ativador
Médias 1
5,0
7,5
10,0
12,5
Água
37 (15)
41 (10)
49 (10)
46 (10)
43 (6)
NaHCO3
37
15
22
20
23
Água
31 (10)
11 (10)
22 (12)
5 (15)
17
NaHCO3
14
23
9
10
14
Água
34 (9)
26 (7)
35 (8)
25 (9)
30 (4)a
NaHCO3
26
19
16
15
19a
Metanol
37 (10)
28 (7)
35 (7)
33 (7)
33 (4)A
DMSO
22 (7)
17 (7)
16 (9)
7 (11)
16B
30 (7)
22 (5)
25 (6)
20 (7)
26 (21)
Metanol
DMSO
Médias dos
Ativadores
Médias dos
Criopotet.
Médias das
Concentrações
1 Médias seguidas de letras distintas diferem entre si pelo teste F (P<0,05).
Valores entre parênteses referem-se ao erro-padrão da média.
Fertilização vs METANOL
FIGURA 24. Motilidade espermática (%) e fertilização (%) do sêmen de curimba
(P. lineatus) antes e após o congelamento, e acrescido de concentrações crescentes
de METANOL. Os traçados referem-se ao erro-padrão da média.
Conclusões
O DMSO, nas concentrações estimadas,
proporciona:
PROTEÇÃO ADEQUADA AOS
ESPERMATOZÓIDES DE P. lineatus
O NaHCO3 1% é o ativador de escolha!!
Fertilização Î Muito Variável!!
Produtos que podem ser utilizados na indução da ovulação em peixes
Nome comercial
Principio ativo
Ação
Dose
Hipófise
GnRH e outros compostos
indução de ovulação
5 mg
Clomid
Citrato de clomifeno
composto antiestrogênio
3mg
Serofene
Citrato de clomifeno
composto antiestrogênio
3mg
LHRHa
D-Ala-6, des-Gly-10
etilamida
análago GnRH
10mcg
Zoladex
Goserelina
análago GnRH
10mcg
Neodecapeptyl
Triptorelina
análago GnRH
10mcg
Pregnyl
hCG
indução de ovulação
500UI
Profasi
hCG
indução de ovulação
500UI
Motilium
Domperidona
Antidopamínico
variável
Pleaidon
Domperidona
Antidopamínico
variável
Kubitza 2004 modificado