caracterização do biofilme perifítico e seu papel no ciclo do mercúrio

Transcrição

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA - UNIR
Núcleo de Ciências Exatas e da Terra
Departamento de Biologia
CARACTERIZAÇÃO DO BIOFILME PERIFÍTICO E SEU PAPEL NO
CICLO DO MERCÚRIO
ANDRESSA DE JESUS FRANÇA
Porto Velho (RO)
2014
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA - UNIR
Núcleo de Ciências Exatas e da Terra
Departamento de Biologia
CICLO DO MERCÚRIO
Orientador: Dr. Marcio Rodrigues Miranda
Monografia
apresentada
ao
Departamento de Biologia da
Fundação Universidade Federal de
Rondônia – UNIR, como parte dos
requisitos para obtenção do grau de
Bacharel em Ciências Biológicas.
Porto Velho (RO)
2014
3
4
CICLO DO MERCÚRIO
Comissão Examinadora
Dr. Marcio Rodrigues Miranda (Orientador)
Dr. Wanderley Rodrigues Bastos
Msc. Roberto Keidi Miyai
Porto Velho, ______ de __________________________ de _______.
Resultado______________________________________________________________
5
Dedico esta monografia aos meus familiares e
amigos, que sempre estiveram ao meu lado.
6
AGRADECIMENTOS
Primeiramente sou grata a Deus por tudo de bom que proporcionou em minha vida e
por ter me guiado até aqui. Sem a ajuda Dele provavelmente eu não teria chegado até onde
cheguei. Talvez para alguns não faça sentido, mas eu realmente SEI
que Ele vive, que é
meu Pai e que cuida de mim.
Também sou muito grata aos meus familiares (pai, mãe, tio João, primo Célio e
irmãos) e amigos (Ozita, José Maurício Filho, Otávio, Olívia, Jéssica Rocha, Edna, Marcio
Rocha, Jéssica Costa...) que sempre estiveram ao meu lado.
Sou grata ao Luiz Alberto L. de Matos e a Maria Angélica, amigos da família que me
ajudaram muito durante esses 4 anos.
Também tenho muito a agradecer pela atenção, paciência e ajuda do meu orientador
Marcio R. Miranda. Ele me ajudou MUITO, me ensinou muita coisa que talvez nem tenha se
dado conta.
Também serei sempre grata ao prof. Wanderley R. Bastos pela oportunidade de fazer
parte de seu grupo de pesquisa, pelo apoio e ajuda no meu trabalhos, bem como pelos
ensinamentos e momentos de descontração.
Também sou muito grata ao professor Gil, a quem eu recorri várias vezes solicitando
ajuda.
Agradeço a todos da equipe (Marília, Leidiane, Roberta, Igor, Melissa, Deborah,
Célia, Walkimar, Ronaldinho, Dario, Denilça, Eduardo, Cleber, Charlliene) do Laboratório de
Biogeoquímica Ambiental Wolfgang C. Pfeiffer, que direta ou indiretamente contribuíram
para meu aprendizado e realização desta monografia.
Sou e sempre serei muito agradecida ao seu Antônio, que foi muito importante para o
andamento das atividades realizadas, me ajudou muito nas atividades de campo, sem ajuda
dele nem sei como teria realizados as amostragens de campo. MUITO OBRIGADA!
Não posso me esquecer de agradecer pela amizade e bons momentos que minhas
amigas (Bruna Soares, Amanda Nonato, Vanessa Cristine, Alyne Cunha, Najila, Débora
Cristina, Aline Souza, Grazi...) que fiz ao longo desses 4 anos me proporcionaram.
7
RESUMO
O biofilme perifítico é uma comunidade de micro-organismos que vive aderida a substratos
submersos e possui grande importância nos processos biológicos de acumulação de mercúrio
(Hg) e formação de metilmercúrio (MeHg). A fim de avaliar suas características e seu papel
no ciclo do mercúrio este estudo foi conduzido em um igarapé impactado localizado dentro da
Universidade Federal de Rondônia, no Campus de Porto Velho. O fluxo do igarapé foi
barrado pela construção de uma estrada e o mesmo possui uma grande área alagada em
comparação ao seu curso anterior. Na primeira parte do estudo o objetivo foi avaliar a
toxicidade aguda (24 h), acumulação de Hg e formação do MeHg no biofilme perifítico. Para
o estudo foram utilizadas lâminas de vidro como substrato para colonização perifítica, e após
20 dias de colonização foi realizado um mesocosmo com dois tratamentos: T Controle e T
Contaminado (1600 µg HgCl2/L). Na segunda parte do estudo foram avaliadas a variação da
biomassa, acúmulo de Hg e formação do MeHg no biofilme perifítico ao longo do tempo (70
dias), bem como a inter-relação destas variáveis. A retirada das lâminas foi realizada em dois
períodos: águas altas/vazante (28/03 a 06/06/2013) e águas baixas (08/08 a 17/10/13) em
intervalos regulares de 4, 7, 14, 22, 56 e 70 dias após imersão das lâminas. Os resultados
obtidos por meio do mesocosmo foram: i) redução significativa da clorofila α no T Contaminado
(p<0,05), evidenciando o caráter tóxico do Hg; ii) o peso seco e o peso seco livre de cinzas
não foram afetados negativamente pela contaminação aguda pelo Hg; iii) acúmulo de cerca
de 53% do Hg adicionado; iv) aumento na concentração de MeHg em relação ao TControle. Por
meio da colonização perifítica ao longo do tempo observou-se que a concentração de HgT não
variou com o aumento da biomassa perifítica em ambos períodos avaliados. Entretanto, a
concentração de MeHg e a razão MeHg/HgT aumentou ao longo do tempo no período de
águas baixas. Os valores de clorofila, peso seco e peso seco livre de cinzas apresentaram
correlação positiva com o tempo de colonização (r>0,8; p<0,05) em ambos os períodos de
amostragem. Com base no Índice de Lakatos e Índice Autotrófico o perifíton foi classificado
como predominantemente inorgânico e heterotrófico. A concentração de MeHg foi
correlacionada positivamente com a matéria orgânica (r=0,0965; p=0,0127) e com o tempo
(r=0,08542; p=0,0303) no período de águas baixas, provavelmente devido a afinidade do Hg
com a matéria orgânica e a importância dessa para a produção de MeHg. No presente trabalho
foi possível observar que o biofilme perifítico tem alta capacidade para acumular o mercúrio e
produzir o metilmercúrio.
Palavras-chave: perifíton, mercúrio, metilação, ambiente aquático, toxicidade.
8
ABSTRACT
The periphytic biofilm is a microbial community that live attached to submerged substrates
and have important role in biological processes of accumulation of mercury (Hg) and
formation of methylmercury (MeHg). In order to evaluate their characteristics and their role
in the mercury cycle this study was conducted in an impacted stream located in the Federal
University of Rondônia (Porto Velho). The stream flow was slowed by road construction
resulting in a flooded area larger than compared to its previous course. In the first part of the
study the objective was to evaluate the acute toxicity (24 h), and formation of Hg
accumulation in periphytic biofilm. Glass slides were used as substrates for periphyton
colonization, and after 20 days of colonization a mesocosm was performed with two
treatments: TControl and TContaminated (1600 µg HgCl2/L). In the second part of the study we
evaluated the variation in biomass accumulation and formation of Hg in periphytic biofilms
over time (70 days). Periphyton sampling was carried out in two periods:
high
water/descending (28/03 to 06/06/2013) and low water (08/08 to 17/10/13) at regular intervals
of 4, 7, 14, 22, 56 and 70 days after glass slides submersion. The main results are: i)
significant reduction of chlorophyll α in TContaminated (p<0.05); ii) dry weight and ash free dry
weight were not affected by acute Hg contamination; iii) accumulation of about 53% of the
added Hg; iv) increased concentration of MeHg relative to TControl. Mercury concentration
does not vary with increasing periphyton biomass in both periods. However, the concentration
of MeHg and MeHg/Hg ratio increased over time at low water period. The values of
chlorophyll, dry weight and ash free dry weight showed positive correlation with the
colonization time (r> 0.8, p <0.05) in both sampling periods. Based on Lakatos and
Autotrophic Index, periphyton was rated as predominantly inorganic and heterotrophic.
Methylmercury concentration was positively correlated with organic matter (r = 0.0965, p =
0.0127) and time (r = 0.08542, p = 0.0303) at low water period. In the present study it was
observed that the periphytic biofilm has high ability to accumulate mercury and produce
methylmercury.
Key words: periphyton, mercury, metilation,aquatic environment,toxicity.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema da organização do biofilme perifítico ...................................................................... 13
Figura 2 Substratos colonizados pelo biofilme perifítico ...................................................................... 13
Figura 3 Área de estudo, igarapé localizado no Campus de Porto Velho da UNIR .............................. 17
Figura 4 Preparo do experimento de mesocosmo ................................................................................. 20
Figura 5 Precipitação diária no meses amostrados no ano de 2013 ...................................................... 21
Figura 6 Metodologia simplificada da análise de HgT na e no biofilme perifítico ............................... 25
Figura 7 Metodologia simplificada das etapas para análise de MeHg no biofilme perifítico ............... 26
Figura 8 Esquema da destilação para quantificação de MeHg em água ............................................... 27
Figura 9 Etapas do preparo para analise no CG-AFS ........................................................................... 28
Figura 10 Concentração média, mínima e máxima de clorofila α no biofilme perifítico. .................... 30
Figura 11 Concentração média, mínima e máxima do peso seco no biofilme perifítico. ..................... 30
Figura 12 Concentração média, mínima e máxima do peso seco livre de cinzas no biofilme perifítico31
Figura 13 Esquema do balanço de massa de Hg no biofilme perifítico e na água do aquário .............. 33
Figura 14 Colonização perifítica nos períodos avaliados ..................................................................... 34
Figura 15 Concentração média, mínima e máxima de clorofila α no biofilme perifítico em diferentes
tempos de exposição em águas altas/vazante. ....................................................................................... 36
Figura 16 Concentração média, mínima e máxima de clorofila α no biofilme perifítico em tempos de
exposição em águas baixas.................................................................................................................... 36
Figura 17 Concentração média, mínima e máxima de peso seco no biofilme perifítico em diferentes
tempos de exposição no período de águas altas/vazante. ...................................................................... 38
tempos de exposição no período de águas baixas.
Figura 19 Concentração média, mínima e máxima de peso seco livre de cinzas no biofilme perifítico
em diferentes tempos de exposição no período de águas altas/vazante. ............................................... 39
Figura 20 Concentração média, mínima e máxima de peso seco livre de cinzas no biofilme perifítico
em diferentes tempos de exposição no período de águas baixas. .......................................................... 39
Figura 21 Concentrações, médias, mínimas e máximas de HgT no biofilme perifíticos em diferentes
tempos de exposição no período de águas altas/vazante. ..................................................................... 42
Figura 22 Concentrações médias, mínimas e máximas de HgT no biofilme perifíticos em diferentes
tempos de exposição no período de águas baixas. ............................................................................... 42
Figura 23 Concentrações médias, mínimas e máximas de MeHg no biofilme em diferentes tempos de
exposição no período de águas altas/vazante. ....................................................................................... 43
Figura 24 Concentrações médias, mínimas e máximas de MeHg no biofilme perifíticos em diferentes
tempos de exposição no período de águas baixas. ............................................................................... 43
Figura 25 Concentrações médias, mínimas e máximas da razão MeHg/HgT no biofilme perifíticos em
diferentes tempos de exposição no período de águas altas/vazante. .................................................... 44
Figura 26 Concentrações médias, mínimas e máximas da razão MeHg/HgT no biofilme perifíticos em
diferentes tempos de exposição no período de águas baixas................................................................ 44
Figura 27 Concentração de HgT na água do igarapé em ambos os períodos avaliados. ....................... 45
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Classificação do biofilme perifítico segundo variações em massa (LAKATOS, 1989). ....... 24
Tabela 2 Estatística descritiva das variáveis bióticas do biofilme perifítico no T Controle e T Contaminado. . 29
Tabela 3 Classificação do biofilme perifítico dos diferentes tratamentos utilizados no mesocosmo
segundo o peso seco e o conteúdo percentual de cinzas. ...................................................................... 32
Tabela 4 Estatísticas descritiva das concentrações de mercúrio total, metilmercúrio do biofilme
perifítico nos tratamentos utilizados. .................................................................................................... 32
Tabela 5 Estatísticas descritiva das concentrações de mercúrio total, metilmercúrio e porcentagem de
MeHg em relação ao HgT da água dos aquários dos tratamentos utilizados. ....................................... 32
Tabela 6 Valores médios e desvio padrão das variáveis bióticas do biofilme perifítico ao longo de 70
dias de colonização em dois períodos de amostragem. ......................................................................... 35
Tabela 7 Classificação do biofilme perifítico de acordo com o índice de Lakatos (1989) para ambos os
períodos amostrados. ............................................................................................................................. 40
Tabela 8 Estatísticas descritiva das concentrações de mercúrio total, metilmercúrio e porcentagem de
MeHg em relação ao HgT do biofilme perifítico dos dois períodos amostrados. ................................. 41
Tabela 9 Matriz de correlação entre as variáveis bióticas do biofilme perifítico e as espécies de
mercúrio analisadas na amostragem de AA/V. Os resultados em negrito são aqueles que apresentaram
correlação significativa (p <0,05).......................................................................................................... 46
Tabela 10 Matriz de correlação entre as variáveis bióticas do biofilme perifítico e as espécies de
mercúrio analisadas na amostragem de AB. Os resultados em negrito são aqueles que apresentaram
correlação significativa (p < 0,05)......................................................................................................... 47
Tabela 11 Conteúdos máximos e médios (*) de clorofila e peso seco em substrato exposto a
colonização do biofilme perifítico em alguns ecossistemas aquáticos brasileiros. ............................... 48
11
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................................................................7
ABSTRACT ........................................................................................................................................................... 8
INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................... 12
1. OBJETIVOS..................................................................................................................................................16
1.1. OBJETIVO GERAL ..................................................................................................................................... 16
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................................ 16
2. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................................................... 16
2.1. DESCRIÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO ...................................................................................................... 16
2.2. DELINEAMENTO AMOSTRAL ................................................................................................................ 18
2.2.1.
Tipo de Substrato ............................................................................................................................... 18
2.2.2.
Experimento com mesocosmo ........................................................................................................... 19
2.2.3.
Colonização Perifítica ........................................................................................................................ 20
2.3. PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS .................................................................................................. 282
2.3.1.
Variáveis Bióticas e Índices do Biofilme Perifítico .......................................................................... 22
2.3.1.1. Clorofila α ............................................................................................................................................ 22
2.3.1.2. Peso Seco e Peso Seco Livre de Cinzas ............................................................................................... 22
2.3.1.3. Índice Autotrófico ................................................................................................................................ 22
2.3.1.4. Índice de Lakatos ................................................................................................................................. 22
2.3.2.
Mercúrio Total (Hg-T) e Metilmercúrio (MeHg) ............................................................................ 24
2.3.2.1. Biofilme Perifítico ............................................................................................................................... 24
2.3.2.2. Água ................................................................................................................................................... 246
2.4. TRATAMENTO DOS DADOS ................................................................................................................... 28
3.
RESULTADOS.............................................................................................................................................29
3.1. EXPERIMENTO COM MESOCOSMO.......................................................................................................29
3.1.1.
Variáveis Bióticas e Índices do Biofilme Perifítico...........................................................................29
3.1.1.1.
Clorofila α.................................................................................................................. ...........................29
3.1.1.2. Peso Seco...............................................................................................................................................30
3.1.1.3. Peso Seco Livre de Cinzas................................................................................................... .................31
3.1.1.4. Porcentagem de Matéria Orgânica e Inorgânica...................................................................................31
3.1.1.5.
Índice Autotrófico e Índice de Lakatos.................................................................................................31
3.1.2.
Mercúrio Total e Metilmercúrio........................................................................................................32
3.2.
COLONIZAÇÃO PERIFÍTICA...........................................................................................................33
3.2.1.
Variáveis Bióticas e Índices do Biofilme Perifítico...........................................................................34
3.2.1.1.
Clorofila α............................................................................................................................................. 35
3.2.1.2. Peso Seco e Peso Seco Livre de Cinzas................................................................................................37
3.2.1.3. Porcentagem de Matéria Orgânica........................................................................................................39
3.2.1.4.
Índice Autotrófico e Índice de Lakatos.................................................................................................40
3.2.2.
Mercúrio Total e Metilmercúrio........................................................................................................41
3.2.3.
Correlação das Variáveis....................................................................................................................45
4.
DISCUSSÃO.......................................................................................................................... .......................47
4.1. BIOMASSA PERIFÍTICA NO PROCESSO DE COLONIZAÇÃO PERIFÍTICA ..................................... 47
4.2. DISTRIBUIÇÃO E ACÚMULO DO HG NO EXPERIMENTO COM MESOCOSMO ............................ 52
4.3. DISTRIBUIÇÃO E ACÚMULO DO HG NO PROCESSO DE COLONIZAÇÃO DO BIOFILME
PERIFÍTICO . .........................................................................................................................................................54
CONCLUSÕES.....................................................................................................................................................56
CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................................................................................57
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................................. 58
12
INTRODUÇÃO
No ambiente, a maioria das bactérias se desenvolve em biofilmes (COSTERTON et
al., 1994; COSTERTON et al., 1995; NIKOLAEV & PLAKUNOV, 2007) que funcionam
como microhabitats, apresentando-se em condições diferentes das do ambiente a sua volta,
possibilitando as células microbianas exercerem funções que não poderiam ser realizadas fora
do biofilme (MORRIS & MONIER, 2003). A matriz polissacarídica fornece diversas
vantagens para os micro-organismos agindo como proteção contra o estresse ambiental,
sistema de captura e retenção de carbono orgânico dissolvido, como via para o transporte
intercelular e como um meio em que as exoenzimas ficariam mais próximas as células
microbianas facilitando a degradação de moléculas de alto peso molecular e sua absorção
(FREEMAN & LOCK, 1993).
O biofilme perifítico ou perifíton (Figura 1) é uma comunidade microbiana que, além
de colonizado por bactérias, também é composto por outros micro-organismos tais como as
algas, fungos, e protozoários, e detritos orgânicos e inorgânicos, que crescem aderidos a um
substrato submerso orgânico ou inorgânico, vivo ou morto (WETZEL, 1983). O biofilme
perifítico varia em espessura e se desenvolve na superfície de rochas e vegetação submersa de
macrófitas, na parte externa de barcos, em outras superfícies naturais e artificiais de rios,
riachos, igarapés, represas, lagos, áreas alagadas e estuários (TUNDISI & MATSUMURATUNDISI, 2008; ESTEVES, 2011; ŽIŽEK et al, 2011), como pode ser visto na figura 2.
As algas constituem a maior parte do biofilme perifítico e são um dos componentes
mais estudados (MOSCHINI-CARLOS, 1999; ESTEVES, 2011). A composição de espécies é
dependente da trofia da água, da velocidade da correnteza, e da natureza e qualidade do
substrato, como por exemplo, composição química e rugosidade (MOSCHINI-CARLOS,
1999). As algas possuem um ciclo de vida curto, respondendo rapidamente às mudanças
ambientais, como por exemplo, estresse ambiental, mas também são as primeiras a se
recuperarem desse distúrbio (CETTO et al, 2004; FERREIRA et al, 2006; CASTRO et al,
2008).
13
Figura 2 Esquema da organização do biofilme perifítico (MIRANDA, 2005).
Figura 3 Substratos colonizados pelo biofilme perifítico. Foto: Andressa de J. França
As algas do perifíton são consideradas grandes produtoras primárias, contribuindo
consideravelmente para a produção de matéria orgânica e fluxo de energia de alguns
ecossistemas aquáticos tropicais, principalmente em ambientes rasos, como córregos, riachos
14
e lagoas costeiras, podendo contribuir com até cerca de 70 a 85% da produtividade primária
total (MOSCHINI-CARLOS, 1999; GOMES, 2000; VERCELLINO & BICUDO, 2006;
ŽIŽEK et al., 2007; TUNDISI & MATSUMURA-TUNDISI, 2008; ESTEVES, 2011). As
taxas de produção primária das algas vão depender, por exemplo, da área do substrato
disponível para a colonização, das características dos substratos, das condições físicas e
químicas da água e da morfometria dos sistemas aquáticos (MOSCHINI-CARLOS, 1999;
TUNDISI & MATSUMURA-TUNDISI, 2008). Desse modo, o biofilme perifítico tem uma
grande importância para a base alimentar das cadeias tróficas (GOMES, 2000). Rico em
proteínas, vitaminas e minerais constitui em importante alimento para muitos organismos
aquáticos, como inúmeros invertebrados e peixes (DOS SANTOS & DE FREITAS, 1986;
MOSCHINI-CARLOS, 1999; ŽIŽEK et al., 2007; ESTEVES, 2011).
Existe uma carência de informações a respeito do biofilme perifítico (BICUDO, 1990;
GOMES, 2000; ESTEVES, 2011). Os estudos dessa complexa comunidade começaram mais
tarde que os estudos do fitoplâncton (CASTRO et al, 2008; TUNDISI & MATSUMURATUNDISI, 2008), sendo negligenciado por muitos anos (ESTEVES, 2011). Ainda são poucos
os trabalhos desenvolvidos nesta área, muito embora a atenção de vários pesquisadores tenha
se voltado para essa comunidade nos últimos anos (ESTEVES, 2011). Ainda mais escassos
são os estudos que relacionam a dinâmica da comunidade perifítica e a influência de
xenobióticos (MIRANDA et al., 2007).
O mercúrio é um contaminante global e extremamente tóxico aos organismos
(MIRANDA et al, 2007). As comunidades microbianas são as primeiras a sofrerem quando
ocorre qualquer alteração no ecossistema, e.g., a entrada de um contaminante como o
mercúrio (MIRANDA et al, 2007). O mercúrio (Hg) é um elemento traço ou metal pesado
com elevada toxicidade (BASTOS & LACERDA, 2004). Não possui nenhuma função
fisiológica benéfica para o organismo humano, uma vez que em qualquer uma das formas que
se apresenta é tóxico para os seres vivos e para o meio ambiente (OPAS, 2011). Alguns
trabalhos experimentais tem revelado o efeito tóxico do mercúrio sobre comunidades
microbianas tais como a diminuição do crescimento e da produção primária, letalidade
dependendo da dose e da forma química do elemento (PÉRÈS, 1997; LEFEBVRE, KELLY&
BUDD, 2007).
O mercúrio ocorre naturalmente e é disperso no ambiente por processos naturais e
antrópicos, sendo encontrado em diferentes formas orgânicas (e.g., metilmercúrio) e
inorgânicas (e.g., mercúrio iônico). As espécies químicas naturais de mercúrio mais comuns
que são encontradas no meio ambiente são o mercúrio metálico (Hg0), sulfeto de mercúrio
15
(HgS), cloreto de mercúrio (HgCl2) e metilmercúrio (CH3Hg) (OPAS, 2011). Em comparação
ao mercúrio inorgânico, a formação do composto orgânico metilmercúrio aumenta a sua
mobilidade e dispersão no sistema aquático (OPAS, 2011). O metilmercúrio é uma espécie
química com reduzida afinidade com as superfícies minerais do sedimento. Assim, o
metilmercúrio (MeHg) produzido é liberado para a coluna d’água e pode entrar na cadeia
trófica por rápida difusão sendo rapidamente acumulado e biomagnificado, atingindo altas
concentrações nos tecidos dos peixes de topo de cadeia (NRIAGU et al, 1992).
O problema da contaminação por mercúrio (Hg) tornou-se expressivo em áreas de
garimpagem a partir da corrida do ouro na região amazônica (MALM et al, 1990). No
entanto, os solos amazônicos constituem reservatórios importantes de Hg (ROULET &
LUCOTTE, 1995; FOSTIER et al, 1999; FADINI & JARDIM, 2001), e uma parcela
importante da contaminação mercurial dos ecossistemas aquáticos seria causada pela erosão
destes solos após o desmatamento para fins agropecuários (ROULET et al, 1999; FARELLA
et al, 2001).
É extremamente importante conhecer o ciclo biogeoquímico do mercúrio no ambiente
para o entendimento do grau de toxicidade de seus compostos. Apesar de haver diversos
trabalhos na literatura centralizados na dinâmica de produção e consumo do MeHg em vários
tipos de matrizes ambientais (GUIMARÃES et al, 2000; MAURO et al, 2002; BISOTINI E
JARDIM, 2004; GUIMARÃES et al, 2006; COSSA, AVERTY & PIRRONE, 2009), ainda
não está completamente esclarecida a dinâmica do metilmercúrio no ambiente.
Vários trabalhados têm relatado a importância e eficácia do biofilme perifítico na
acumulação do mercúrio e sua transformação para metilmercúrio, bem como seu papel na
transferência do MeHg para organismos superiores da cadeia trófica (DESROSIERS,
PLANAS & MUCCI, 2006; MOLINA et al., 2010). Segundo Bell e Scudder (2007) ainda não
está estabelecido pela comunidade científica se o biofilme perifítico assimila passivamente,
ativamente, ou adsorve o Hg na superfície de suas células.
A fim de entender qual o papel desempenhado por essa comunidade no ciclo do
mercúrio, foram determinadas no presente estudo as características bióticas do biofilme
perifítico (clorofila α, peso seco e peso seco livre de cinzas) e averiguados as suas interações
com o mercúrio.
16
1.
OBJETIVOS
1.1. OBJETIVO GERAL
Caracterizar o biofilme perifítico, segundo suas variáveis biológicas (clorofila α, peso
seco e peso seco livre de cinzas) e avaliar seu papel no ciclo do mercúrio em um igarapé da
região amazônica, Porto Velho, Rondônia.
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I.
Determinar a distribuição do mercúrio e do metilmercúrio ao longo de um
processo de colonização da comunidade perifítica.
II.
Investigar as possíveis relações entre as variáveis bióticas (clorofila α, peso seco
e peso seco livre de cinzas) do biofilme perifítico com as concentrações de
mercúrio.
III.
Investigar a distribuição, acumulação e metilação de mercúrio no biofilme
perifítico.
IV.
2.
Investigar o efeito tóxico agudo do mercúrio sobre a biomassa perifítica.
MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. DESCRIÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO
Segundo SEDAM e COGEO (2012) no Estado de Rondônia “o clima predominante,
durante todo o ano, é o tropical úmido e quente, com insignificante amplitude térmica anual e
notável amplitude térmica diurna, especialmente no inverno”.
De acordo com a classificação de Köppen, o clima predominante no Estado é do tipo
Aw - Clima Tropical Chuvoso. A média anual da precipitação pluviométrica varia entre 1.400
a 2.600 mm/ano, com precipitação inferior a 20 mm nos meses de junho, julho e agosto,
enquanto a média anual da temperatura do ar varia entre 24 a 26 °C (SEDAM e COGEO,
2012).
A área de estudo consiste em um igarapé que está localizado no Campus José Ribeiro
Filho, situado na BR 364, km 9,5 sentido Rio Branco – AC, da Universidade Federal de
Rondônia (UNIR), Porto Velho, Rondônia (Figura 3). O igarapé tem sua nascente próxima ao
Aterro Sanitário Municipal, antigo Lixão, que está a 1 km da UNIR (MARTINS, 2006). O
solo da região é predominantemente da classe dos Latossolos Amarelos, Gleyssolos e
17
Latossolos Vermelhos Amarelos geralmente encontrados em relevo predominantemente plano
e suave ondulado (DOS SANTOS, 2007).
O igarapé é um ambiente impactado tanto pelo Lixão quanto por uma estrada
construída para o acesso ao canteiro de obras da Usina Hidrelétrica de Santo Antônio no Rio
Madeira (Figura 3). Devido a barragem pela estrada, na parte situada dentro da UNIR, o
igarapé foi alterado de um ambiente lótico para um ambiente lêntico. Em função dessa
alteração o local de estudo apresenta vasta quantidade de vegetação morta submersa e maior
entrada de radiação solar do que anteriormente, o que permite a alta proliferação de biofilme
perifítico. Provavelmente a decomposição bacteriana é intensa quando comparada a igarapés
prístinos. Desse modo, o ambiente estudado possui características semelhantes a um
reservatório formado por ocasião da construção de uma usina hidrelétrica e que não teve sua
vegetação retirada. Portanto é um ambiente propício para a produção de metilmercúrio
(HUGUET et al., 2010).
Figura 4 Área de estudo, igarapé localizado no Campus de Porto Velho da UNIR; evidenciando o ponto
amostrado e a estrada que barrou o igarapé.
Mapa elaborado com base na imagem de alta definição
do Google Earth, por Andressa de J. França e MSc Igor
Bruno Barboza de Holanda do Laboratório de
Biogeoquímica Ambiental Wolfgang C. Pfeiffer
18
2.2. DELINEAMENTO AMOSTRAL
2.2.1.
Tipo de Substrato
A maioria dos trabalhos desenvolvidos com essas comunidades é direcionada ao
estudo da estrutura, taxonomia (RODRIGUES, JATI & PEREIRA, 2000; RODRIGUES et al.,
2001; FONSENCA & RODRIGUES, 2005; RODRIGUES et al., 2005; TANIGUCHI,
BICUDO & SENNA, 2005; VERCELLINO & BICUDO, 2006; ROFRIGUES et al., 2008;
ESTEVES, 2011), dinâmica e importância no metabolismo dos ecossistemas aquáticos do
qual fazem parte (MOSCHINI-CARLOS, 1999).
Como o biofilme perifítico se caracteriza por colonizar a superfície de objetos
submersos (FERREIRA et al, 2006), o estudo desta comunidade pode ser feito por meio da
sua remoção de substratos naturais como rochas, folhas, caules ou raízes de plantas
submersas. Substratos artificiais, tais como cerâmica, vidro, acrílico, acetato de celulose,
plástico e outros, têm sido intensamente utilizados para determinar a taxa de crescimento do
perifíton, da sucessão das comunidades e da concentração de biomassa (BICUDO, 1990;
SCHWARZBOLD, 1990; MOSCHINI-CARLOS, 1999; TUNDISI & MATSUMURATUNDISI, 2008;). A amostragem pode ser feita pela retirada do material de uma área do
substrato artificial; da análise do peso seco, do peso úmido, da concentração de clorofila; e
contagem de células (SCHWARZBOLD, 1990; TUNDISI & MATSUMURA-TUNDISI,
2008).
A comunidade perifítica é muito heterogênea, o que dificulta a separação de seus
constituintes (MOSCHINI-CARLOS, 1999; ESTEVES, 2011). Logo, as medidas de biomassa
e produção são relativas a comunidade como um todo (MOSCHINI-CARLOS, 1999). Neste
estudo optou-se pela utilização de lâminas de vidro de microscopia como substrato artificial
para colonização pelo biofilme perifítico (APHA, 1971), devido ao baixo custo financeiro,
facilidade de coleta em campo e manuseio em laboratório. Elas também possuem outras
vantagens como: 1) superfície uniforme, 2) fácil determinação da área colonizável, 3)
conhecimento do tempo de colonização da comunidade perifítica (MOSCHINI-CARLOS,
1999; VERCELLINO, 2007; MADIGAN et al. 2010; FELISBERTO & RODRIGUES, 2012;
TORGAN et al., 2013).
As lâminas foram descontaminadas com extran, seguido de banho ácido (ácido nítrico
5%), enxágue com água deionizada e secagem em estufa a cerca de 50ºC. A área colonizável
total de cada uma das lâminas foi de 34,57 cm2 ou 0,003457 m2. As lâminas foram coladas em
19
posição vertical em espumas de polietileno – fixadas a suportes de madeira. Os suportes
contendo as lâminas foram submersos no igarapé por meio de estacas.
2.2.2.
Experimento com mesocosmo
Inicialmente foi realizada em Setembro de 2011 uma amostragem prévia ao
experimento com mesocosmo. O substrato artificial foi imerso no igarapé por 14 dias. Foi
uma etapa importante que permitiu: 1) padronizar técnicas de análise de mercúrio total (HgT)
e metilmercúrio; 2) estabelecer quantidade de massa necessária para medir o mercúrio e
algumas variáveis bióticas (clorofila α, peso seco e peso seco livre de cinzas) do biofilme
perifítico; 3) determinar a concentração de Hg total para posterior delineamento experimental.
Para avaliar os efeitos do mercúrio no biofilme perifítico, bem como investigar o
possível papel deste no ciclo do mercúrio, foi realizado um experimento de mesocosmo
(Figura 4) no igarapé de estudo, no período de 30 de Novembro a 21 de Dezembro de 2012.
No experimento, foram utilizadas 600 lâminas de vidro (medidas: 26,0 x 76,0 mm.
Espessura ~ 1 a 1,2 mm) e 6 aquários de vidro retangulares com tampa (medidas: 11,3 x 23,8
x 10,5 cm), cada um com capacidade para 2 litros (Figura 4.A). Foram delineados dois
tratamentos, cada qual com três réplicas, denominados T
contaminado,
controle,
sem adição de mercúrio e T
com a adição de cloreto de mercúrio (HgCl2) na concentração de 1600 µg/L. Tal
concentração foi estabelecida com a finalidade de provocar um efeito tóxico agudo sobre o
biofilme perifítico (KERRISON et al., 1988; LEFEBVRE, KELLY & BUDD, 2007).
O experimento foi iniciado após 20 dias de submersão das lâminas no igarapé. As
lâminas colonizadas pelo biofilme perifítico foram transferidas para os aquários (Figura 4.B) e
posteriormente foram adicionados cerca de 2 L de água do igarapé (Figura 4.C), previamente
filtrada com papel filtro qualitativo Nalgon com 3 µm de porosidade dois dias antes do
experimento em campo. A água do tratamento contaminado havia sido contaminada
previamente com o 1600 µg/L de HgCl2 em laboratório. Cada aquário continha
aproximadamente de 75 a 95 lâminas.
20
Figura 5 Preparo do experimento de mesocosmo. 4.A Suporte com aquários. 4.B Transferência das lâminas para
os aquários. 4.C Água sendo colocada nos aquários. 4.D Mesocosmo pronto. Foto: Andressa de J. França.
Após 24 h, as lâminas dos tratamentos controle e contaminado foram coletadas. A
água do igarapé e a utilizada no experimento também foram coletadas para avaliar as
concentrações de mercúrio total e metilmercúrio. A água do igarapé foi coletada da superfície
com garrafa âmbar de 500 mL. A água presente nos T controle e T contaminado também foi coletada
com garrafa âmbar de 500 mL, sendo uma garrafa para cada aquário. As lâminas presentes
nos aquários foram coletadas e distribuídas em tubos porta lâminas para análises de biomassa,
clorofila α, e em sacos de polietileno para análises de mercúrio. Após a coleta, as amostras
foram levadas para o laboratório de Biogeoquímica Ambiental Wolfgang Christian Pfeiffer
(UNIR) e mantidas refrigeradas ou congeladas até a sua análise.
2.2.3.
Colonização Perifítica
Esta amostragem foi realizada a fim de caracterizar as variáveis bióticas (peso seco,
peso seco livre de cinzas e clorofila α) e a distribuição das concentrações de mercúrio total e
metilmercúrio do biofilme perifítico ao longo de 70 dias de colonização, bem como avaliar a
formação de MeHg. Além disso, foi avaliado se as concentrações das espécies de mercúrio e
metilmercúrio variam ao longo do tempo de colonização e se estão relacionadas a alguma das
variáveis biológicas do biofilme perifítico.
21
As amostragens foram realizadas nos períodos 28 de Março a 06 de Junho (águas
altas/vazante) e 08 de Agosto a 17 de Outubro (águas baixas) do ano de 2013. Ao longo de 70
dias as lâminas de vidro foram coletadas em intervalos regulares de 4, 7, 14, 22, 56 e 70 dias
após a imersão dos substratos artificiais no igarapé. É importante relatar que no primeiro
período de amostragem a quantidade de precipitação ainda estava muito alta (Figura 5),
principalmente no início da colonização dos substratos artificiais pelo biofilme perifítico, de
modo que em algumas coletas a água do igarapé tinha aspecto bem turvo.
Figura 6 Precipitação diária no meses amostrados no ano de 2013. Dados obtidos pela a estação de
monitoramento na usina Santo Antônio, Porto Velho Rondônia (SEDAM).
100
90
Precipitação diária (mm)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
março-13
abril-13
maio-13
junho-13
Meses
julho-13
agosto-13
setembro-13
outubro-13
22
O preparo dos substratos artificiais seguiu o mesmo método descrito anteriormente.
Para cada amostragem foram utilizadas cerca de 1500 lâminas. Os suportes contendo as
lâminas foram submersos no igarapé por meio de estacas em três pontos, distantes
aproximadamente 1,5 m. Cada ponto continha cerca de 500 lâminas.
As lâminas colonizadas pelo biofilme perifítico foram coletadas de acordo com o
intervalo estabelecido e descrito anteriormente e armazenadas em sacos de polietileno para as
análises de mercúrio total (HgT) e metilmercúrio (MeHg), em tubos de polipropileno de 50
mL para as análises de peso seco e peso seco livre de cinzas ou em potes de poplipropileno
para as análises de clorofila α. A água do igarapé também foi coletada, como descrito acima,
para avaliar as concentrações de HgT. Após a coleta, as amostras foram levadas para o
laboratório e mantidas refrigeradas ou congeladas até o início dos procedimentos
laboratoriais.
2.3. PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
2.3.1.
2.3.1.1.
Variáveis Bióticas e Índices do Biofilme Perifítico
Clorofila α
A análise de clorofila α é uma medida indireta da biomassa de algas presentes no
biofilme perifítico (APHA, 1971; SCHWARZBOLD, 1990; RODRIGUES et al., 2008). O
método para análise de clorofila α e posterior equação foi adaptado de APHA (1971). Para a
extração de clorofila α, foi adicionado álcool 96% a subamostra. Em seguida a subamostra foi
refrigerada a 18ºC negativos por cerca de 24 h para posterior leitura em espectrofotômetro UV
visível (SHIMADZU – modelo 2450).
Ao fim do período de imersão em álcool, as amostras foram raspadas das lâminas e o
conteúdo (perifíton e álcool) foi transferido para tubos de polipropileno de 50 mL.
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 3000 RPM por 5 minutos. Após a
centrifugação, 3 mL do sobrenadante foi transferido para uma cubeta de quartzo para leitura
em espectrofotômetro UV visível, nos comprimentos de onda 663 e 750 nm. Após a primeira
leitura, a amostra foi acidificada com a adição de 100 µL de ácido clorídrico (HCl) 4 N. Após
90 segundos, a amostra foi novamente submetida à leitura nos comprimentos de onda 663 e
750 nm .
23
2.3.1.2.
Peso Seco e Peso Seco Livre de Cinzas
No presente estudo, o peso seco é o total de massa perifítica que foi removida do
substrato e submetida à desidratação. O peso seco livre de cinzas representa o teor de matéria
orgânica do biofilme perifítico e é obtido por combustão a elevadas temperaturas até que toda
a matéria orgânica seja queimada e eliminada, restando apenas o material inorgânico ou as
cinzas, que incluem também o material de origem alóctone aderido ou depositado com silte e
argilas (SCHWARZBOLD, 1990). Posteriormente calcula-se a diferença entre peso inicial
(peso seco) e o peso final após a combustão.
As medidas de biomassa por peso seco (PS) e peso seco livre de cinzas (PSLC) foram
realizadas como descrito a seguir (adaptado de SCHWARZBOLD, 1990). As amostras foram
raspadas das lâminas com auxílio de bisturi e água ultra-pura (Milli-Q) e transferidas para
beckers de 80 mL, previamente pesados em balança analítica. Posteriormente, as amostras
foram colocadas em estufa a 40⁰C por mais de 24 horas até secarem e atingirem peso
constante.
Após o resfriamento, as amostras foram pesadas e calcinadas em forno mufla a 450ºC
por aproximadamente 4 horas. Após o resfriamento, as amostras foram novamente pesadas e
suas massas anotadas. Os resultados foram normalizados pela área de colonização e expressos
em g/m2.
2.3.1.3.
Índice Autotrófico (IA)
A fim de determinar a natureza trófica do biofilme perifítico foi calculado o índice
autotrófico, proposto por APHA (1971). O IA é obtido pelo quociente entre os valores de
peso seco livre de cinzas e de clorofila α. Valores inferiores a 200 indicam um estado
autotrófico enquanto que valores superiores indicam um estado heterótrofo. Esse índice
permite determinar a característica dos organismos que compõe a comunidade perifítica.
2.3.1.4.
Índice de Lakatos
A partir do peso seco, percentual de cinzas e clorofila α, Lakatos (1989) propôs alguns
índices para classificação do biofilme perifítico (Tabela 1). Para este trabalho só serão
utilizados os índices baseados no percentual de cinzas e no peso seco.
24
Tabela 1
Classificação do biofilme perifítico segundo variações em massa (LAKATOS, 1989).
Tipo
I
II
III
I
II
III
IV
2.3.2.
Peso seco
Perifíton com massa elevada
Perifíton com massa média
Perifíton com massa baixa
Conteúdo de cinzas
Perifíton tipo inorgânico
Perifíton tipo inorgânico./orgânico
Perifíton tipo orgânico./inorgânico
Perifíton tipo orgânico
g/m2
> 40
20 – 40
< 20
%
> 75
50 – 75
25 – 50
< 25
Mercúrio Total (Hg-T) e Metilmercúrio (MeHg)
Para garantir o controle de qualidade analítico as amostras foram analisadas em
duplicata e foram usados brancos nos processos de extração química e análises. Além de
spikes para a análise das amostras de água e amostras certificadas (e.g., com concentração de
mercúrio conhecida), TORT 2, BCR 463 (TUNA FISH), IAEA 140, DOLT 2, NIST 2876,
para análise das amostras de biofilme perifítico.
2.3.2.1.
Biofilme Perifítico
As subamostras destinadas as análises de mercúrio total e metilmercúrio foram
raspadas das lâminas com auxílio de bisturi e água ultra-pura (Milli-Q). Em alguns casos as
lâminas foram colocadas em lavadora ultrassônica (UNIQUE) por no mínimo 3 ciclos de
trinta minutos para a desorção do biofilme perifítico das lâminas. O material perifítico ainda
aderido foi raspado com bisturi. Posteriormente estas amostras foram liofilizadas.
Para a análise de mercúrio total (Figura 6) foi pesada uma massa de aproximadamente
20-200 mg em tubos de ensaio de 25 mL, de acordo com o tamanho da amostra. Para as
amostras do T
contaminado
foi pesada uma massa menor, devido o alto teor de mercúrio. A
abertura química seguiu as seguintes etapas: (1) adição de 1 mL de peróxido de hidrogênio
(H2O2) concentrado; (2) adição de 3 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado; (3)
aquecimento no bloco digestor a temperatura de 80° C por 1 hora e 30 minutos; (4)
posteriormente adição de 3 mL de ácido nítrico (HNO3) concentrado; (5) aquecimento no
bloco digestor a 80°C por 1 hora e 30 minutos; (6) resfriamento das amostras à temperatura
ambiente; (7) adição de 5 mL de permanganato de potássio (KMnO4) 5 %; (8) aquecimento
no bloco digestor a 80°C por 15 minutos. (9) Após resfriamento, as amostras permaneceram
25
em “overnigth” por 12 h. (10) Após esse período, foi adicionado 1 mL de cloridrato de
hidroxilamina a 12% (NH2OH.HCl) e aferido o volume final a 13 mL.
A determinação do mercúrio total foi realizada por espectrofotometria de absorção
atômica por geração de vapor frio (FIMS-400 Perkin Elmer), equipado com um sistema de
injeção de fluxo (FIAS) com amostrador automático utilizando “Software” (Winlab-Perkin
Elmer). A metodologia empregada foi adaptada dos métodos desenvolvidos por BASTOS et
al. (1998).
Figura 7 Metodologia simplificada da análise de HgT na e no biofilme perifítico.
Para a análise de metilmercúrio foi pesada uma massa de aproximadamente 20-80 mg
em tubos de polipropileno de 14 mL (Figura 7). As amostras sofreram extração alcalina
fechada em estufa de metal a 68ºC com 3 mL KOH/Metanol 25% por cerca de 6 horas, sendo
que a cada 2 horas as amostras eram agitadas para maior eficiência da reação. Posteriormente
as amostras foram armazenadas no escuro para evitar degradação do metilmercúrio pela luz
por 48 horas, tempo necessário para a completa reação e estabilização das amostras. Após as
48 h seguiu-se a etapa de etilação aquosa com adição de 300 µL de solução tampão acetato de
sódio (pH ~ 4,9) para manter o pH da solução adequado para a reação de etilação após a
adição de 50 µL de tetra-etil-borato de sódio 1% (NATEB). É importante detalhar que
somente uma alíquota de 30 µL da amostra é etilada em frasco âmbar de 40 mL contendo
água ultra-pura (Milli-Q). As amostras foram analisadas por cromatógrafo gasoso acoplado
ao espectrofotômetro de fluorescência atômica (CG-AFS) (MERX™ Automated Methyl
Mercury Analytical System – Brooks Rand). Os protocolos de análise das amostras foram
baseados em EPA (2001) e Pichet (1999).
26
Figura 8 Metodologia simplificada das etapas para análise de MeHg no biofilme perifítico.
2.3.2.2.
Água
Para a quantificação de HgT na água foram pesados 25g da amostra em frascos de 40
mL. Depois foram adicionados as amostras 100 μL de monocloreto de bromo. Após 40
minutos, foram adicionados 100 μL de cloridrato de hidroxilamina 30 %. Posteriormente as
amostras foram homogeneizadas e foram adicionados 100 μL de cloreto estanoso 20 %. Após
10 minutos foi realizada a leitura das amostras no CG - AFS. O protocolo de análise foi
baseado no método 1631 da EPA (2002).
A quantificação de MeHg na água foi obtida após as etapas de destilação (Figura 8),
etilação aquosa (Figura 9), purge and trap e cromatografia gasosa acoplado a espectrometria
de Fluorescência Atômica - GC-AFS (Sistema MERX da Brooks Rand Labs) a partir do
método 1630 da EPA (2001).
27
Figura 9 Esquema da destilação para quantificação de MeHg em água (adaptado de Machado, 2011).
28
Figura 10 Etapas do preparo para analise no CG-AFS (adaptado de Machado, 2011).
2.4. TRATAMENTO DOS DADOS
Inicialmente foi feita uma análise descritiva dos dados. Posteriormente foi utilizada
uma matriz de correlação para medir o grau de correlação entre: (1) o tempo de colonização e
as variáveis biológicas (clorofila α, peso seco e peso seco livre de cinzas) do biofilme
perifítico; (2) das variáveis biológicas (clorofila α, peso seco e peso seco livre de cinzas do
biofilme perifítico entre si; (3) das variáveis biológicas (clorofila α, peso seco e peso seco
livre de cinzas) do biofilme perifítico com as concentrações de mercúrio total e
29
metilmercúrio; (4) o tempo de colonização e as espécies de mercúrio analisadas; e (5) do
mercúrio total com o metilmercúrio. O teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas
utilizando o procedimento de Dunn foi utilizado para verificar as diferenças entre as médias
ao longo do tempo de colonização para todas as variáveis medidas. Foi utilizado o teste t para
comparar os resultados obtidos das amostras dos tratamentos do experimento de mesocosmo.
O intervalo de confiança utilizado para os testes foi de 0,05. Foram utilizados o software
Microsoft Office Excel versão 2007 para preparo das figuras e o programa Bioestat versão 5.3
para os tratamentos estatísticos.
3.
RESULTADOS
3.1. EXPERIMENTO COM MESOCOSMO
3.1.1.
Os dados descritivos dos parâmetros biológicos do biofilme perifítico do experimento
com mesocosmo, assim como o Índice Autotrófico estão exibidos na tabela 2.
Tabela 2
Estatística descritiva das variáveis bióticas do biofilme perifítico no T
Variáveis
T controle
n
Clorofila α (mg/m2)
Peso Seco (g/m2)
Peso Seco Livre De Cinzas (g/m2)
Matéria Orgânica (%)
Matéria Inorgânica (%)
Índice Autotrófico
3.1.1.1.
6
5
5
5
5
5
Média
0,64
21,08
4,94
23,55
76,45
8895,52
DP
0,21
2,59
0,57
0,69
0,69
2252,54
CV
32,83
12,31
11,47
2,92
0,90
25,32
n
3
3
3
3
3
3
Controle
e T Contaminado.
T contaminado
Média
DP
0,16
28,82
6,31
21,64
78,36
39597,86
0,01
4,50
1,18
0,46
0,46
8611,03
CV
8,19
15,61
18,69
2,11
0,58
21,75
Clorofila α
Foi encontrada diferença significativa (p=0,0013) quando comparadas as médias do T
Controle e
do T Contaminado, evidenciando a redução da clorofila com a exposição ao contaminante,
na concentração e tempo estabelecidos neste estudo. A média da clorofila α do controle foi 4
vezes maior que a média do contaminado (Figura 10).
30
Figura 11 Concentração média, mínima e máxima de clorofila α no biofilme perifítico.
1.00
0.90
Chl a (mg/m2)
0.80
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
Controle
Contaminado
Tratamento
3.1.1.2.
Peso Seco
A média do peso seco (PS) do T Controle foi menor que o do T Contaminado (p = 0,0097).
Figura 12 Concentração média, mínima e máxima do peso seco no biofilme perifítico.
40.00
35.00
PS (g/m2)
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
Controle
Contaminado
Tratamento
31
3.1.1.3.
Peso Seco Livre de Cinzas
A média do peso seco livre de cinzas (PSLC) do T
Contaminado
Controle
foi menor que o do T
(p=0,0313).
Figura 13 Concentração média, mínima e máxima do peso seco livre de cinzas no biofilme perifítico.
9.00
8.00
PSLC (g/m2)
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
Controle
Contaminado
Tratamento
3.1.1.4.
Porcentagem de matéria orgânica e inorgânica
A diferença observada entre os tratamentos foi significativa (p=0,0027). Portanto, a %
de MO foi maior no T Controle do que no T Contaminado e para a % de MI ocorreu o inverso, isto é,
foi maior no T Contaminado do que no T Controle.
3.1.1.5.
Índice Autotrófico e Índice de Lakatos
O índice autotrófico (IA) (APHA 1971) baseado no quociente entre PSLC e a Chl α,
indicou um biofilme perifítico predominantemente heterotrófico (e.g., IA > 200) em ambos os
tipos de tratamentos (Tabela 2).
De acordo com o índice de Lakatos (1989) o biofilme perifítico foi classificado como
tipo II ou com massa média em relação ao peso seco, e tipo I ou inorgânico em relação ao
percentual de cinzas. Isto ocorreu para os dois tratamentos (Tabela 3).
32
Tabela 3
Classificação do biofilme perifítico dos diferentes tratamentos utilizados no mesocosmo segundo o peso seco e o
conteúdo percentual de cinzas.
Tratamentos
T Controle
T Contaminado
3.1.2.
Peso seco
II – massa média
II – massa média
% cinzas
I – inorgânico
I – inorgânico
Mercúrio Total e Metilmercúrio
As concentrações de HgT e o MeHg foram respectivamente 734 vezes e 100 vezes
maior no biofilme perifítico do T Contaminado do que no do T Controle (Tabela 4). Isso evidencia
que o biofilme perifítico acumulou o mercúrio adicionado no tratamento contaminado e que
provavelmente ocorreu metilação na comunidade perifítica.
Tabela 4
Estatísticas descritiva das concentrações de mercúrio total, metilmercúrio do biofilme perifítico nos tratamentos
utilizados.
Tratamentos
n
Mercúrio total (µg/kg)
Média
DP
CV (%)
T Controle
3
3
184
62
134878 19283
T Contaminado
34
14
Metilmercúrio (µg/kg)
Média DP CV (%)
2
245
1
43
51
17
Na Tabela 5 estão descritos os resultados encontrados da análise de mercúrio total
metilmercúrio da água dos aquários dos dois tratamentos utilizados no mesocosmo. Após
fazer o balanço de massa (Figura 13), foi possível observar que dos 1600 µ HgCl2/L, que
equivale a 2364 µg Hg, adicionados no T Contaminado mais de 50% (1258,75 µg de Hg) de Hg foi
acumulado no biofilme perifítico e cerca de 10 % (233,20 µg de Hg) ficou na água. Houve
uma perda de cerca de 37 % (872,05 µg de Hg). A massa de MeHg do T
Contaminado
correspondeu a 2,28 µg no biofilme perifítico e 0,11 µg na água.
Tabela 5
Estatísticas descritiva das concentrações de mercúrio total, metilmercúrio e porcentagem de MeHg em relação ao
HgT da água dos aquários dos tratamentos utilizados.
Tratamentos
n
Mercúrio total (ng/L)
Média
DP
CV (%)
Metilmercúrio (ng/L)
Média DP
CV (%)
T Controle
3
2
44
26
116599 28850
0,08
56,37
T Contaminado
58
25
0,06
12,82
74,17
22,74
33
Figura 14 Esquema do balanço de massa de Hg no biofilme perifítico e na água do aquário.
3.2. COLONIZAÇÃO PERIFÍTICA
Na Figura 14 é possível observar o aumento da biomassa perifítica em função da
colonização perifítica nos substratos artificiais submersos no igarapé nos períodos de águas
altas/vazante e águas baixas no período de 70 dias.
34
Figura 15 Colonização perifítica nos períodos avaliados. 14.A. Após 4 dias no período AA/V. 14.B. Após 70
dias no período AA/V. 14.C. Após 4 dias no período AB. 14.D. Após 70 dias no período AB
3.2.1.
Na tabela a seguir (Tabela 6) estão expostos os valores médios e o desvio padrão dos
resultados obtidos das duas amostragens realizadas em diferentes períodos no ano de 2013.
35
Tabela 6
Valores médios e desvio padrão das variáveis bióticas do biofilme perifítico ao longo de 70 dias de colonização
em dois períodos de amostragem.
Tempo
(dias)
Chl α
(mg/m2)
PS (g/m2)
PSLC
(g/m2)
MO (%)
4
7
14
22
56
70
Período: 28 de Março a 06 de Junho
0,048±0,004 6,07±1,37
1,37±0,16
23
0,010±0,003 8,49±1,60
1,71±0,31
20
0,102±0,061 8,20±2,95
1,73±0,65
21
0,003±0,003 31,77±15,30 5,40±2,60
17
0,238±0,162 75,73±19,78 15,12±3,60
20
0,251±0,034 46,28±16,21 9,99±2,60
22
4
7
14
22
56
70
0,023±0,002
0,052±0,005
0,087±0,011
0,127±0,012
0,130±0,026
0,159±0,044
3.2.1.1.
Período: 08 de Agosto a 17 de Outubro
0,91±0,13 0,30±0,009
32
1,35±0,25
0,43±0,08
32
2,03±0,34
0,67±0,08
33
4,41±0,96
1,49±0,25
34
5,87±0,34
2,74±0,13
47
9,60±2,70
3,26±0,95
34
MI (%)
IA
77
80
79
83
80
78
28673
170822
17047
2162260
63570
39800
68
68
67
66
53
66
12709
8276
7665
11783
21013
20455
Clorofila α
A concentração de clorofila α aumentou ao longo do tempo de colonização para ambos
os períodos de amostragem (Figuras 15 e 16)De acordo com o teste de Kruskal-Wallis e Dunn
só houve diferença significativa entre os dias 22 e 70 (p=0,0096) na amostragem de 28 de
Março a 06 de Junho, e entre os dias 4 e 70 (p=0,011) na amostragem de 08 de Agosto a 17 de
Outubro. Os maiores valores de Chl α foram registrados quando o biofilme perifítico estava
com 70 dias de colonização no igarapé, para ambas as amostragens (Figuras 15 e 16).
36
Figura 16 Concentração média, mínima e máxima de clorofila α no biofilme perifítico em diferentes tempos de
exposição em águas altas/vazante.
0.450
0.400
r = 0,8584
Chl a (mg/m2)
0.350
0.300
y = 0,0457x - 0,0516
R² = 0,5923
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
4
7
14
22
56
70
Dias
Ocorreu maior flutuação nos valores de clorofila α do primeiro período de amostragem
(Figura 15) do que do segundo, neste último a produção de clorofila α ao longo do tempo foi
mais linear. Aparentemente a concentração média de clorofila α foi maior no primeiro período
de coleta (águas altas/vazante), contudo devido ao baixo n amostral não é possível inferir o
efeito sazonal nas concentrações de clorofila α.
Figura 17 Concentração média, mínima e máxima de clorofila α no biofilme perifítico em tempos de exposição
em águas baixas.
0.450
0.400
Chl a (mg/m2)
0.350
0.300
r = 0,9644
0.250
y = 0,0272x + 0,0013
R² = 0,9692
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
4
7
14
22
Dias
56
70
37
3.2.1.2.
Peso Seco (PS) e Peso Seco Livre de Cinzas (PSLC)
As concentrações do PS (Figuras 17 e 18) e do PSLC (Figuras 19 e 20) aumentaram ao
longo do tempo para ambos os períodos de amostragem. Houve uma correlação positiva e
significativa com o tempo de exposição das lâminas. Na amostragem de 28 de Março a 06 de
Junho (AA/V) foi observada diferença significativa entre os dias 4 e 56 tanto para os valores
de peso seco (p=0,0103) e peso seco livre de cinzas (p=0,0112), com declínio na biomassa
perifítica no dia 70. Com relação ao período de 08 de Agosto a 17 de Outubro (AB) foram
observadas diferenças significativas entre os dias 4 (p=0,0054) e 70 (p=0,0069).
38
Figura 18 Concentração média, mínima e máxima de peso seco no biofilme perifítico em diferentes tempos de
exposição no período de águas altas/vazante.
100.00
90.00
80.00
PS (g/m2)
70.00
r= 0,8903
60.00
y = 12,181x - 13,211
R² = 0,6713
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
4
7
14
22
56
70
Dias
100.00
90.00
80.00
PS (g/m2)
70.00
60.00
50.00
r= 0,9914
40.00
30.00
y = 1,6962x - 1,9095
R² = 0,9086
20.00
10.00
0.00
4
7
14
22
Dias
56
70
39
Figura 20 Concentração média, mínima e máxima de peso seco livre de cinzas no biofilme perifítico em
diferentes tempos de exposição no período de águas altas/vazante.
20.00
18.00
PSLC (g/m2)
16.00
14.00
r= 0,9023
12.00
y = 2,4853x - 2,809
R² = 0,6866
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
4
7
14
22
56
70
Dias
Figura 21 Concentração média, mínima e máxima de peso seco livre de cinzas no biofilme perifítico em
diferentes tempos de exposição no período de águas baixas.
20.00
18.00
PSLC (g/m2)
16.00
14.00
12.00
10.00
8.00
r= 0,8554
6.00
y = 0,6441x - 0,7729
R² = 0,9194
4.00
2.00
0.00
4
7
14
22
56
70
Dias
3.2.1.3.
Porcentagem de matéria orgânica
Não houve grandes alterações nas porcentagens de matéria orgânica e inorgânica ao
longo do tempo para ambos os períodos analisados. Todavia de acordo com o teste de
Kruskal-Wallis e Dunn houve uma diferença significativa entre os dias 4 e 22 (p=0,0362) para
o período de AA/V, enquanto que para o período de AB não houve diferença significativa
(p=0,1198) ao longo dos 70 dias de colonização pelo biofilme perifítico.
40
3.2.1.4.
Índice Autotrófico (IA) e Índice de Lakatos
De acordo com o IA (APHA, 1971) o biofilme perifítico teve natureza heterotrófica
(IA > 200) ao longo dos 70 dias de colonização e em ambas as épocas de amostragem. Com
base no índice de Lakatos (1989) o biofilme perifítico foi classificado como tipo I
(inorgânico) segundo o percentual de cinzas em todo o período de AA/V enquanto que em
todo o período de AB foi classificado como tipo II (inorgânico/orgânico). Em relação ao peso
seco o biofilme perifítico amostrado no período de AA/V foi classificado como tipo III
(massa baixa) no inicio da colonização e até o dia 14. O biofilme perifítico do dia 22 foi
classificado como tipo II (massa média) e o dos dias 56 e 70 como tipo I (massa elevada). Já
em todo o período de AB o biofilme perifítico foi classificado como tipo III.
Tabela 7
Classificação do biofilme perifítico de acordo com o índice de Lakatos (1989) para ambos os períodos
amostrados.
Tempo (dias)
Peso seco
% cinzas
4
7
14
22
56
70
III – massa baixa
I – inorgânico
III – massa baixa
I – inorgânico
III – massa baixa
I – inorgânico
II – massa média
I – inorgânico
I – massa elevada
I – inorgânico
I – massa elevada
I – inorgânico
4
7
14
22
56
70
III – massa baixa
II – inorg./orgânico
III – massa baixa
III – massa baixa
III – massa baixa
III – massa baixa
III – massa baixa
41
3.2.2.
Mercúrio Total e Metilmercúrio
A estatística descritiva referente aos teores de mercúrio total, metilmercúrio e
porcentagem de MeHg no biofilme perifítico está exposta na tabela 8. Não houve diferença
significativa na concentração de HgT (p=0,1337) do biofilme perifítico ao longo do tempo de
colonização no período de águas altas/vazante (Figura 21). Entretanto, no período de águas
baixas foi observada uma diferença significativa (p=0,0134) na concentração de HgT entre os
dias 4 e 22 (Figura 22).
Tabela 8
Estatísticas descritiva das concentrações de mercúrio total, metilmercúrio e porcentagem de MeHg em relação ao
HgT do biofilme perifítico dos dois períodos amostrados.
Tempo (dias)
n
Mercúrio total (µg/kg)
Média
DP
CV
Metilmercúrio (µg/kg)
Média
DP
MeHg/HgT
CV
Média
DP
CV
4
3
176,93
3,72
2,10
0,73
0,21
29,07
0,41
0,12
29,17
7
3
183,84
3,64
1,93
0,36
0,14
37,37
0,19
0,08
38,82
14
3
177,71
13,07
7,35
0,59
0,25
41,76
0,33
0,15
44,64
22
3
190,32
15,50
8,14
0,64
0,25
38,09
0,33
0,11
31,51
56
3
168,33
10,61
6,30
2,48
0,30
11,90
1,49
0,28
18,91
70
3
191,95
10,14
5,29
0,50
0,16
32,61
0,26
0,10
37,09
4
3
128,81
11,26
8,74
0,40
0,05
11,46
0,31
0,06
18,15
7
3
141,58
8,59
6,07
0,61
0,05
7,51
0,43
0,06
12,71
14
3
161,27
10,66
6,61
1,12
0,24
21,37
0,69
0,10
15,01
22
3
179,92
8,86
4,92
2,32
2,01
86,86
1,30
1,14
87,73
56
3
143,72
4,45
3,10
6,92
5,64
81,41
4,74
3,74
78,88
70
3
157,79
8,73
5,53
3,97
0,75
18,82
2,54
0,59
23,26
42
Figura 22 Concentrações, médias, mínimas e máximas de HgT no biofilme perifíticos em diferentes tempos de
exposição no período de águas altas/vazante.
200.00
HgT (µg/kg)
180.00
160.00
r = 0,0164
140.00
y = 0,7475x + 179,73
R² = 0,022
120.00
100.00
4
7
14
22
56
70
Dias
HgT (µg/kg)
Figura 23 Concentrações médias, mínimas e máximas de HgT no biofilme perifíticos em diferentes tempos de
exposição no período de águas baixas.
200.00
r= 0,1975
180.00
y = 4,8574x + 135,18
R² = 0,2559
160.00
140.00
120.00
100.00
4
7
14
22
56
70
Dias
No período de amostragem compreendido entre 28 de Março a 06 de Junho foi
observada diferença significativa entre os dias 7 e 56 na concentração de MeHg (p=0,0427;
Figura 23) e na razão MeHg/HgT (p= 0,045; Figura 25). No período de 08 de Agosto a 17 de
Outubro foi observada diferença significativa entre os dias 4 e 56 na concentração de MeHg
(p=0,0115; Figura 24) e na razão MeHg/HgT (p=0,0116; Figura 26). Em ambos os períodos
de amostragem, os maiores valores na concentração de MeHg e razão MeHg/HgT foram
registrados no 56º dia seguido de um declínio no 70º dia.
43
Figura 24 Concentrações médias, mínimas e máximas de MeHg no biofilme em diferentes tempos de exposição
no período de águas altas/vazante.
14.00
MeHg (µg/kg)
12.00
10.00
8.00
r= 0,4433
6.00
y = 0,1501x + 0,3567
R² = 0,1251
4.00
2.00
0.00
4
7
14
22
56
70
Dias
Figura 25 Concentrações médias, mínimas e máximas de MeHg no biofilme perifíticos em diferentes tempos de
exposição no período de águas baixas.
14.00
MeHg (µg/kg)
12.00
10.00
8.00
r= 0,8542
6.00
y = 1,0858x - 1,2422
R² = 0,6523
4.00
2.00
0.00
4
7
14
22
Dias
56
70
44
Figura 26 Concentrações médias, mínimas e máximas da razão MeHg/HgT no biofilme perifíticos em diferentes
tempos de exposição no período de águas altas/vazante.
10.00
9.00
8.00
% MeHg
7.00
6.00
5.00
r=0,4433
4.00
3.00
y = 0,0893x + 0,1896
R² = 0,1173
2.00
1.00
0.00
4
7
14
22
56
70
Dias
Figura 27 Concentrações médias, mínimas e máximas da razão MeHg/HgT no biofilme perifíticos em diferentes
10.00
9.00
8.00
% MeHg
7.00
6.00
5.00
r=0,8542
4.00
y = 0,7042x - 0,7958
R² = 0,5921
3.00
2.00
1.00
0.00
4
7
14
22
56
70
Dias
A concentração de HgT na água do igarapé não foi variou muito em ambos os
períodos de amostragem (Figura 27). A média da concentração de HgT na água do igarapé ao
longo do período de AA/V amostrado foi 3,34 ± 0,43 µg HgT/kg. O coeficiente de variação
foi 12,91%. Enquanto que no período de AB a média foi 1,86 ± 0,27 µg HgT/kg, com 14,51
% de coeficiente de variação.
45
Figura 28 Concentração de HgT na água do igarapé em ambos os períodos avaliados.
4.00
3.50
µg HgT/kg
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
4
7
14
22
56
70
Dias
Águas altas/vazante
3.2.3.
Águas baixas
Correlação das Variáveis
Ao analisar a matriz de correlação (Tabela 9 e Tabela 10) de ambos os períodos
amostrados é possível observar que a maioria das correlações significativas (p < 0,05) entre as
variáveis foi positiva.
No período de AA/V o tempo de colonização (em dias) correlacionou positivamente
com o PS, PSLC e Chl α. O PS também foi correlacionado com o PSLC (r=0,9953), e este
com a Chl α (r=0,8168). A concentração de HgT no biofilme perifítico não correlacionou-se
com nenhuma das outras variáveis analisadas. O MeHg do biofilme perifítico só
correlacionou-se com a razão MeHg/HgT (r=0,9999). Algumas variáveis apresentaram
correlação positiva, mas não significativa (tabela 9).
46
Tabela 9
Matriz de correlação entre as variáveis bióticas do biofilme perifítico e as espécies de mercúrio analisadas na
amostragem de AA/V. Os resultados em negrito são aqueles que apresentaram correlação significativa (p <0,05).
Tempo (dias)
HgT
MeHg
MeHg/HgT
PS
PSLC
Chl α
1
---
---
---
---
---
---
0,0164
1
---
---
---
---
---
0,4433
-0,7831
1
---
---
---
---
0,4391
-0,7894
0,9999
1
---
---
---
0,8584
-0,2894
0,7931
0,7876
1
---
---
0,8903
-0,2921
0,7793
0,7748
0,9953
1
---
0,9023
-0,3102
0,5505
0,552
0,7621
0,8168
1
Variáveis
Tempo (dias)
HgT
MeHg
MeHg/HgT
PS
PSLC
Chl α
O período de AB apresentou padrão semelhante ao período de AA/V diferindo nas
seguintes correlações: i) o PS foi correlacionado positivamente com a Chl α (r=0,9023;
p=0,0138); ii) tanto a concentração de MeHg como a razão MeHg/HgT
foram
correlacionadas positivamente entre si (r=0,9964; p< 0,0001), com o tempo de colonização
(r=0,8542 e p=0,0303; r=0,8286 e p=0,0415, respectivamente), com o PSLC (r=0,8708 e
p=0,0239; r=0,8388 e p=0,0368, respectivamente) e com a % de MO (r=0,9065 e p=0,0127;
r=0,9296 e p=0,0072, respectivamente), e foram negativamente correlacionadas com a % de
MI (r= -0,9065 e p=0,0127; r= -0,9296 e p=0,0072, respectivamente). Algumas variáveis
apresentaram correlação positiva, mas não significativa, como por exemplo, a Chl α com a
concentração do MeHg (r=0,7323; p=0,0978) e com a razão MeHg/HgT
p=0,1402).
(r=0,6762;
47
Tabela 10
Matriz de correlação entre as variáveis bióticas do biofilme perifítico e as espécies de mercúrio analisadas na
amostragem de AB. Os resultados em negrito são aqueles que apresentaram correlação significativa (p < 0,05).
Variáveis
Dias
HgT
MeHg
MeHg/HgT
PS
PSLC
Chl α
MO % MI %
1
----------------Dias
HgT
MeHg
MeHg/HgT
PS
PSLC
Chl α
MO %
MI %
4.
0,1975
1
---
---
---
---
---
---
---
0,8542
0,0993
1
---
---
---
---
---
---
0,8286
0,0236
0,9964
1
---
---
---
---
---
0,9644
0,3657
0,732
0,6873
1
---
---
---
---
0,9914
0,274
0,8708
0,8388
0,9719
1
---
---
---
0,8554
0,6703
0,7323
0,6762
0,9023
0,8909
1
---
---
0,5657
-0,1015
0,9065
0,9296
0,3767
0,5829
0,4318
1
---
-0,5657
0,1015
-0,9065
-0,9296
-0,3767
-0,5829
-0,4318
-1
1
DISCUSSÃO
4.1. BIOMASSA PERIFÍTICA
A colonização de superfícies submersas pelo biofilme perifítico ocorre rapidamente,
conforme observado neste estudo. Os pioneiros na colonização são bactérias e fungos,
principalmente em ambientes ricos em matéria orgânica (SCHWARZBOLD, 1990;
MOSCHINI-CARLOS, 1999). Alguns dias ou mesmo horas são suficientes para colonização
bacteriana; depois as algas também aderem a bioderme perifítica (SCHWARZBOLD, 1990;
MOSCHINI-CARLOS, 1999). Após formada uma rica camada de bactérias e algas, o
ambiente está propício para o aparecimento de vários grupos de protozoários (MOSCHINICARLOS, 1999).
O padrão de colonização pelo biofilme perifítico foi diferente entre as duas
amostragens. Isso pode estar relacionado com as mudanças naturais no ambiente aquático
causadas pela sazonalidade tais como a temperatura, disponibilidade de luz e nutrientes,
turbidez e hidrodinâmica do igarapé.
Comparando os resultados obtidos neste trabalho com os de outros autores (Tabela 11)
existe uma grande diferença, que pode estar associada ao tipo de amostragem que os autores
executaram em termos de tipo substrato, tempo de colonização e frequência de coletas, bem
como pela área de estudo.
48
Os valores de clorofila α encontrados no presente trabalho estão abaixo dos
encontrados pelos outros autores nas diferentes localidades. Isto já era esperado, pois o
igarapé é um ecossistema de baixa produção primária (ANJOS 2005).
Tabela 11
Conteúdos máximos e médios (*) de clorofila e peso seco em substrato exposto a colonização do biofilme
perifítico em alguns ecossistemas aquáticos brasileiros.
Frequência
Clorofila
Peso
Local
Substrato
Duração
de coletas
α
seco
Observações Referência
(amostragem) (mg/m2)
(g/m2)
Repressa da
UHE Carlos
31-32
Chamixaes
Placas de vidro
Semanal
6,1
Verão
Botelho
dias
(1991)
(Lobo/Broa)
-antes do
reservatório
9,8
Inverno
(jusante)
-depois do
reservatório
2,2
Verão
(montante)
Córrego
3,4
Verão
Itaqueri
2,0
Inverno
Córrego
2,0
Verão
Perdizes
2,0
Inverno
Lagoa
Costeira de
Typha
20-28
Verão de
Fernandes
Semanal
4,2
Jacarepaguá
dominguensis
dias
1990
(1993)
(2 locais)
Península
Rocha
Placas de vidro
70 dias
Semanal
11,8
0,10 m
Lago Norte
(1979)
Lagoa
Placas de vidro
70 dias
Semanal
89,0
0,34 m
Paranoá
Reservatório
da UHE
Pontederia
Soares
Carlos
42 dias
Semanal
55,5
1,3
cordata
(1981)
Botelho
(Lobo/Broa)
Rio Santa
Maria da
Brachiaria
Martins
Vitória, ES
6,7
35,0
Julho/2005
mutica
(2016)
– área
preservada
Rio Santa
Maria da
Vitória, ES
2,1
51,0
Janeiro/2005
– área de
influência
antrópica
Rio
Felisberto
Parapanema
Vegetação
Estação
e
50.600*
-reservatório
fanerógama
chuvosa
Rodrigues
Capivara
(2005)
49
cont.Tabela 11
Conteúdos máximos e médios (*) de clorofila α e peso seco em substrato exposto a
colonização do biofilme perifítico em alguns ecossistemas aquáticos brasileiros.
Local
Substrato
Rio Parapanema
-reservatório
Taquaraçu
Rio Parapanema
-reservatório
Salto Grande
Eichhornia
azurea
Kunth
Eichhornia
azurea
Kunth
Rio Jaú, MA
Estuários dos
rios Paripe –
jusante
Folhas de
árvores
Lâminas
de Vidro
Duração
Frequência
de coletas
(amostragem)
Clorofila
α
(mg/m2)
Peso
seco
(g/m2)
Observações
-
-
13.900*
-
Estação
Seca
-
-
1.400*
-
Estação chuvosa
-
-
1.900*
-
Estação
Seca
-
-
61,1
-
Cheia/1995
28-33
Ao fim do
experimento
Estuários dos
rios Paripe –
desembocadura
Estuários dos
rios Igarassu –
desembocadura
Igarapé da UNIR
Lâminas
de vidro
20
Ao fim do
experimento
4
-
7
14
22
56
70
-
60,8
40,8
Cheia/1996
Cheia/1997
1,2
-
Agosto/89,
Fevereiro e
Março/90
18,8
-
Novembro/1989
27
-
Agosto/1989
0,6*
21,1*
0,2*
28,8*
0,05
0,01
0,17
0,01
0,40
0,28
7,1
9,6
10,8
49,4
98,6
60,9
Dezembro/
Enchente Tratamento
controle
Tratamento
contaminado
Março-Junho/
Águas
altas/vazante
Referência
Díaz
Castro et
al (2008)
Moura,
Passavante
& Feitosa
(1995)
Este
trabalho
Agosto-Outubro/
0,025
0,99
Águas baixas
7
0,057
1,54
14
0,095
2,32
22
0,137
5,21
56
0,160
6,26
70
0,192
12,68
Fonte: Adaptado de Bicudo et al. (1995) Apud Tundisi & Matsumura-Tundisi (2008).
4
-
Tanto na amostragem de AA/V como na de AB houve um aumento nas concentrações
de clorofila α no decorrer do período de colonização estudado, porém no período de AA/V
algumas flutuações ocorreram nos dias 7 e 22. Provavelmente esses resultados acompanharam
a precipitação e dinâmica do igarapé estudado. Nos dias 56 e 70 foram registrados os maiores
50
valores de clorofila α para ambos os períodos de amostragem, provavelmente devido a maior
biomassa de algas que devem ter colonizado o biofilme perifítico com o decorrer do tempo, e
particularmente no período de AA/V devido a estabilidade do igarapé na época dessas coletas,
o volume de precipitação já havia diminuído, colaborando para uma maior transparência da
água do igarapé e consequentemente maior incidência de luz sobre o mesmo, favorecendo a
atividade fotossintética.
A intensidade luminosa também é um fator limitante para a produção primária das
algas perifíticas (ANJOS 2005).
Quando a carga de material em suspensão é alta, a
penetração da luz no corpo d’água é limitada (ANJOS 2005, DÍAZ CASTRO et al 2008). Isso
também poderia explicar os baixos teores de clorofila α obtidos no início do período de
AA/V, visto que nos dias que sucederam grandes precipitações a água do igarapé ficou com
alta carga de material particulado em suspensão, como observado em campo. Cetto et al
(2004) atribuíram a diminuição na riquezas de espécies de algas perifíticas a grande
quantidade de material em suspensão na coluna de água que pode
ter provocado o
sombreamento e, consequentemente, afetado o metabolismo celular das algas, devido à
diminuição da intensidade luminosa e da temperatura. A comunidade perifítica é sensível as
alterações na qualidade e também hidrodinâmica da água.
A quantidade de luz que incide sobre o igarapé, também é influenciada pela abertura
do dossel (DÍAZ CASTRO et al 2008).
Aparentemente os valores de clorofila α foram maiores no período de AA/V do que
no período de AB, embora a intensidade de luz e transparência da água fossem maiores. Outro
fator como, por exemplo, a disponibilidade de nutrientes, também influencia na biomassa
perifítica (KAHLERT, 2001; LEANDRINI et al., 2002; LEANDRINI & RODRIGUES, 2008;
FERRAGUT, RODELLO & BICUDO, 2010). Existe a possibilidade de ter ocorrido uma
maior entrada de nutrientes no igarapé por ocasião da chuva no período de AA/V. Em estudos
realizados por França, Lopes & Ferragut (2009 e por) Ferragut, Rodello & Bicudo (2010) foi
observado que a sazonalidade influenciou o estado nutricional e a biomassa do perifíton.
As medidas de peso seco e peso livre de cinzas também foram úteis para demonstrar o
aumento progressivo do biofilme perifítico ao longo do tempo, com um significativo
decréscimo da biomassa perifítica após um período prolongado de exposição das lâminas, no
período de AA/V, que é um evento que pode ocorrer naturalmente no biofilme perifítico a
medida que o perifíton se torna mais maduro, ou por predação dos organismos que se
alimentam da comunidade perifítica, ou ainda por desprendimento do material frouxamente
aderido na matriz perifítica.
51
Os valores de peso seco estão de acordo com os encontrados por outros autores
(Tabela 11), e em alguns casos até maiores, por exemplo, Rocha obteve valores máximos de
peso seco igual a 11,8 e 89,0 g/m2 ao longo do período de exposição placas de vidro por 70
dias na Península Lago Norte e Lagoa Paranoá, respectivamente. Enquanto que neste estudo
foram encontrados valores superiores com um tempo de exposição menor ou igual (e.g., 22
dias = 49,4 g PS/m2, 56 dias = 98,6 g PS/m2, e 70 dias = 60,9 g PS/m2). Semelhantemente os
resultados obtidos em ambas as amostragens foram maiores que os resultados obtidos por
França, Lopes & Ferragut (2009) no Lago Viveiro (Acre) em diferentes períodos sazonais. Os
autores também utilizaram lâminas de vidro como substrato artificial e o tempo de exposição
variou de 4 a 35 dias.
Os valores de peso seco livre de cinzas obtidos na amostragem de AB no presente
estudo estão de acordo com os obtidos por outros autores ao comparar o tempo de exposição
(BORDUQUI, FERRAGUT & BICUDO 2008; FRANÇA, LOPES & FERRAGUT 2009;
FERRAGUT, RODELLO & BICUDO 2010). Entretanto, os valores obtidos na amostragem
de AA/V foram mais elevados quando comparado com esses diferentes autores.
Estudando a comunidade perifítica em reservatórios em cascata do Rio Paranapanema
Felisberto e Rodrigues (2005) encontram maiores valores de matéria inorgânica durante o
período chuvoso, o que foi atribuído a alta precipitação característica da estação em que o
estudo foi realizado, que transportou sedimento para os reservatórios, incrementando este
material a massa perifítica. No presente trabalho o biofilme perifítico do período de AA/V
teve alto teor inorgânico, enquanto que no período de AB o biofilme perifítico foi classificado
como inorgânico/orgânico. No período de águas altas/vazante havia alta carga de material
particulado em suspensão em consequência da elevada precipitação ocorrida que
consequentemente leva a resuspensão do sedimento e maior entrada de material particulado
para o igarapé. Esse material particulado pode ter depositado nas lâminas e ter sido
incorporado a biomassa perifítica.
O caráter mais heterotrófico do biofilme perifítico pode estar associado a vários
fatores, tais como: maior densidade de bactérias e/ou fungos, que são organismos
caracteristicamente pioneiros, baixa densidade de organismos nas primeiras fases da
colonização, afrouxamento dos organismos perifíticas em fase final e armazenamento de
material inorgânico nos substratos (FERNANDES & ESTEVES 2003).
52
4.2. DISTRIBUIÇÃO
E
ACÚMULO
DO
HG
NO
EXPERIMENTO
COM
MESOCOSMO
A contaminação por HgCl2 levou a uma redução no teor de clorofila α. Isto já era
esperado, pois os estudos têm revelado que os metais pesados levam a uma diminuição da
produção primária (HILL et al, 2010, DEVARS et at, 2000), incluindo a clorofila α. Hill et
al., (2000) observaram em seus estudos que a clorofila α foi significativa e negativamente
correlacionada com os metais Cd, Mn, Zn e Cu e relataram que seus resultados corroboram
com os de outros autores. Apesar da expressiva diminuição nas concentrações de clorofila, foi
observado um aumento na concentração de metilmercúrio no tratamento contaminado quando
comparado com o tratamento controle, evidenciando a metilação do mercúrio no biofilme
perifítico mesmo em altas concentrações de mercúrio inorgânico. Tal fato pode indicar que,
no caso da metilação ser de origem biótica, a presença de bactérias metiladoras resistentes ao
mercúrio e com seu metabolismo independente do metabolismo algal.
O PS e o PSLC não foram medidas sensíveis a contaminação pelo cloreto de mercúrio.
Provavelmente as medidas mais sensíveis a experimentos de contaminação são aquelas
relacionadas a atividades dos micro-organismos, tais como clorofila α, abundância de células,
atividade enzimática ou atividade bacteriana.
Este estudo, em especial o mesocosmo, confirma a eficiência do biofilme perifítico na
acumulação de mercúrio, pois o biofilme acumulou mais de 50% do mercúrio adicionado ao
tratamento contaminado. Žižek et al. (2007) também encontraram altas concentrações de HgT
e MeHg no biofilme perifítico de uma região na Eslovênia que recebeu durante muitos anos o
impacto de uma mineração de mercúrio.
Houve perda de cerca de 37% do Hg adicionado ao tratamento contaminado, o que
pode ser resultado da adsorção nas paredes dos aquários e materiais plásticos presentes nos
aquários para fixação das lâminas. Ao final do experimento foi observado uma perda de
material perifítico na manipulação das amostras, visto que uma parte do perifíton estava
fracamente aderida ao substrato, o que pode ser um indicativo de sua maturidade. Uma outra
via importante poderia ser volatilização do mercúrio mediada por alguns micro-organismos,
como algas e bactérias que transformam o Hg para uma forma volátil como estratégia de
reduzir os efeitos tóxicos do elemento. Entretanto, como a comunidade microbiana da
comunidade perifítica pode ser caracterizada como de baixa atividade biológica, tal via pode
não ter importância significativa na alta concentração utilizada no experimento. É importante
ressaltar que algumas transformações entre as espécies químicas do Hg também ocorrem por
53
outras vias que a não a biológica. Kerrison et al (1988) ao estudarem os efeitos de diferentes
concentrações de Hg e outros metais em fitoplâncton também observou consideráveis perdas
do Hg adicionado poucos dias após a adição do composto. Os autores associaram essas perdas
a adsorção do Hg ao material particulado em suspensão e/ou a agentes complexantes, ambos
presentes na água.
No presente estudo foi observada a formação de metilmercúrio no biofilme perifítico,
corroborando com o resultado de outros autores que afirmam a eficiência da comunidade
perifítica na produção de MeHg (COELHO-SOUZA et al, 2011; GUIMARÃES et al, 2006;
HUGUET et al., 2010; MAURO et al., 2002). No experimento com mesocosmo foi visto que
a concentração de MeHg nas amostras do T
comparada com as amostras do T
Controle (2
Contaminado
foi alta (245 µg MeHg/kg), quando
µg MeHg/kg). Contudo a quantidade de mercúrio
metilada em relação a concentração adicionada no biofilme perifítico foi baixa, o que pode ser
em função da elevada entrada de mercúrio no sistema em curto tempo ou pouco mercúrio
biodisponível. Na água do T
Contaminado foi
encontrada uma alta concentração de MeHg (56,08
µg MeHg/Kg), cerca de 704 vezes maior que na água do T
Controle.
Sabe-se que na água
também ocorre metilação do mercúrio, e que esta pode ser química ou fotoquímica. Além
disso, a alta concentração de MeHg observada na água também pode ser resultado da
liberação do MeHg produzido no biofilme perifítico naturalmente ou no ato de manipulação
das amostras. Mauro et al. (2002) obtiveram maiores taxas de metilação de Hg no biofilme
perifítico do que em outras matrizes como água e sedimento.
Guimarães et al., (2006) observaram a importância dos processos microbianos para a
metilação de mercúrio. Os autores realizaram ensaios de produção bacteriana e de metilação
do mercúrio com biofilme perifítico associado a raízes de 2 espécies macrófitas aquáticas e
detectaram ausência de produção de metilmercúrio para o biofilme perifítico da raiz de
Myriophyllum spicatum, onde a produção bacteriana era muito baixa. Já para Eichhornia
crassipes detectaram alta produção de metilmercúrio que foi associada com a alta atividade
bacteriana. Para esses autores os dois processos dependem de fatores como a composição das
bactérias ativas, a disponibilidade de substrato (por exemplo, enxofre oxidado por bactérias
redutoras de sulfato) e as condições físico-químicas, em particular os potenciais redox; fatores
que podem ser modificados pela incubação das amostras.
Em algumas situações a eficácia da metilação biótica do mercúrio vai depender mais
da atividade microbiana e da concentração de mercúrio biodisponível, do que da quantidade
total de mercúrio existente no ambiente (MIRANDA et al., 2007), e isso ficou claro na
54
amostragem experimental, pois uma grande quantidade de mercúrio foi adicionada, mas
somente uma pequena fração foi metilada.
4.3. DISTRIBUIÇÃO E ACÚMULO DO HG NO PROCESSO DE COLONIZAÇÃO DO
BIOFILME PERIFÍTICO
As concentrações de mercúrio total observadas neste trabalho estão de acordo com a
literatura enquanto que as concentrações de metilmercúrio e suas porcentagens estão abaixo
dos resultados encontrados por outros autores (DOMINIQUE, Y. et al., 2007; DESROSIERS,
PLANAS & MUCCI, 2006; COELHO-SOUZA et al, 2011; ŽIŽEK et al., 2011; MOLINA et
al., 2010; LEWIS & CHANCY, 2008; ).
De modo geral, não houve muita variação na concentração de HgT do biofilme
perifítico e da água do igarapé ao longo do processo de colonização em ambos os períodos
amostrados, o que pode indicar que não houve variação significativa na entrada de HgT nesse
ambiente aquático, seja por deposição atmosférica ou por lixiviação dos solos. A
concentração do HgT no biofilme perifítico não apresentou variação com o aumento da
biomassa perifítica. O que mostra que pelo menos para o ambiente estudado, o acúmulo de Hg
no biofilme perifítico não acompanha a maturidade da comunidade perifítica, o que pode ser
resultado da falta de variação nas concentrações de HgT no sistema. A capacidade de
acumular HgT no biofilme perifítico foi observada no experimento de mesocosmo,
evidenciando a sua resposta à entrada de mercúrio “novo” no sistema, acumulando-o em
quantidades consideráveis.
A concentração de MeHg e razão MeHg/HgT não seguiram o mesmo padrão
observado para a concentração de HgT. O MeHg tendeu a aumentar ao longo do tempo,
principalmente no período de AB. Tendo em vista a ampla literatura sobre o tema, é bastante
provável que o aumento de metilmercúrio no biofilme perifítico seja resultado da metilação
do Hg pelas bactérias perifíticas. Tal processo pode ter sido influenciado pelo aumento da
biomassa, em especial da matéria orgânica, visto que pelo menos no período de AB tanto a
concentração de MeHg como a razão MeHg/HgT teve correlação positiva com o tempo de
colonização, o PSLC e a % de MO do biofilme perifítico. Bell & Scudder (2007) também
encontraram resultados semelhantes. Enquanto que Desrosiers, Planas & Mucci (2006)
obtiveram correlação negativa das concentrações de MeHg com o PS, PSLC e Chl α, o que
eles associaram ao fator de biodiluição.
O HgT e o MeHg possuem afinidade com a matéria orgânica (DESROSIERS,
PLANAS & MUCCI, 2006). E este estudo corrobora com essa afirmação, pois no período de
55
AB a concentração e porcentagem de MeHg correlacionaram positiva e significativamente
com o PSLC e a % de MO.
Poucos trabalhos têm avaliado as relações entre as concentrações de Hg com as
variáveis biológicas do biofilme perifítico o que torna difícil a comparação e compreensão dos
resultados obtidos neste trabalho.
56
CONCLUSÕES
 Com relação ao experimento com mesocosmo, o biofilme perifítico possui grande
capacidade para acumular o mercúrio em suas diferentes formas químicas;
 Diante de uma entrada de Hg no sistema pode ocorrer metilação no biofilme perifítico;
 O Hg teve um efeito tóxico sobre a clorofila α, mostrando a sensibilidade desta
variável a ensaios de contaminação. Enquanto que o peso seco e peso seco livre de
cinzas não foram variáveis sensíveis a contaminação com o Hg;
 Com relação a colonização perifítica ao longo do tempo, o biofilme perifítico
colonizou rapidamente os objetos submersos em ambientes aquáticos;
 A biomassa perifítica aumentou ao longo do tempo de exposição dos substratos
artificiais, revelando que o tempo é uma variável importante no estudo da comunidade
perifítica;
 Os valores de clorofila α estão abaixo dos resultados obtidos por outros autores.
 O
biofilme
perifítico
do
igarapé
estudado
apresentou
uma
composição
majoritariamente inorgânica e natureza heterotrófica.
 A concentração de HgT não variou no biofilme perifítico com o aumento da biomassa.
 A concentração e a razão de metilmercúrio/mercúrio total aumentaram ao longo do
tempo, principalmente no período de águas baixas, indicando que pode ter ocorrido
metilação;
 No período de águas altas/vazante a concentração e razão de metilmercúrio foram
correlacionadas positivamente mas não significativamente com a clorofila α e com o
peso seco livre de cinzas.
 No período de águas baixas a concentração e razão de metilmercúrio foram
correlacionadas positivamente com a % de matéria orgânica e com o peso seco livre
de cinzas, e correlacionadas positivamente mas não de forma significativa com a
clorofila α.
 A clorofila α e a matéria orgânica foram correlacionadas positivamente com o peso
seco total do biofilme perifítico em ambos os períodos avaliados.
57
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste trabalho foi evidente a importância do biofilme perifítico para o ciclo do
mercúrio no ambiente aquático, em especial em ambientes que foram impactados
antropicamente. Ele acumulou consideravelmente parte do mercúrio adicionado no
experimento de mesocosmo e metilou uma pequena parte. Além disso, foi observada a sua
vulnerabilidade as altas concentrações de mercúrio inorgânico no sistema aquático.
Algumas variáveis biológicas são mais sensíveis a contaminação que outras, como
poder ser visto na diminuição das concentrações de clorofila α. Estudos dessa natureza
merecem mais atenção e esforço amostral, como por exemplo, medição de outras variáveis
biológicas como atividade bacteriana e/ou enzimática; identificação dos organismos presentes
no biofilme perifítico e de potenciais metiladores; ensaios experimentais em maior escala em
relação a tempo, ambiente e dosagens do contaminante; o estudo em outros igarapés
amazônicos, que são relativamente abundantes, porém, pouco estudados; transferência de Hg
para outros níveis tróficos a partir do biofilme perifítico; amostragens de outros períodos
sazonais. Outros fatores que também poderiam se estudados em conjunto com a comunidade
perifítica e o Hg seriam os parâmetros físico-químicos da água e a quantidade de luz que
incide sobre o igarapé. Pois essas variáveis direta ou indiretamente vão influenciar tanto nas
características estruturais e funcionais do biofilme perifítico quanto nas interações e
transformações do mercúrio no ambiente aquático.
58
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