Reparo ósseo alveolar após implante de osso bovino misto

Reparo ósseo alveolar após implante de osso bovino misto:
avaliação histológica em ratos
Alveolar bone repair after implantation of mixed bovine bone: histological evaluation in rats
Rodrigo Cardoso de OLIVEIRA1, Mileni da Silva FERNANDES2, Fabio Henrique Gelonese de OLIVEIRA3, Tânia Mary CESTARI4,
Rumio TAGA5, Eulázio Mikio TAGA5, José Mauro GRANJEIRO6
Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade osteocondutora
do osso bovino misto (OBM) medular implantado em alvéolo
dental de rato após a extração do incisivo. Foram utilizados 5
grupos com ratos Wistar (n = 50), os quais tiveram o incisivo
superior direito extraído. Os animais foram eutanasiados 7, 14,
21, 28 e 42 dias após a extração e a região do alvéolo dental foi
coletada para a análise microscópica (hematoxilina e eosina).
Os resultados mostraram um processo de reparo ósseo normal
no grupo controle com o decorrer dos perídos experimentais,
apresentando inicialmente o coágulo sanguíneo (7 e 14 dias) e
sua posterior substituição por tecido conjuntivo de granulação
(14 e 21 dias) e tecido ósseo neoformado (28 e 42 dias). Em
contrapartida o grupo teste (implante de OBM) mostrou atraso
no processo de reparo ósseo, apresentando áreas de necrose
nos períodos iniciais (7, 14 e 21 dias) e lenta formação de tecido
conjuntivo de granulação (28 e 42 dias) e neoformação óssea
em contato com as partículas de OBM implantadas (42 dias).
Os resultados obtidos no presente estudo permitem concluir
que o OBM demonstrou discreta capacidade osteocondutora,
concorrendo para o atraso do reparo alveolar. Possivelmente a
compactação do material dificultou a formação adequada do
coágulo sanguíneo.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the osteoconductive
capacity of mixed medullary bovine bone (OBM) implanted on
alveoli dental after extraction of the incisor of rats. We used five
groups of Wistar rats (n = 50), which had the right upper incisor
extracted. The animals were euthanized 7, 14, 21, 28 and 42 days
after the extraction, and region of alveoli dental were collected for
microscopic analysis (Hematoxylin and Eosin). The results showed
a normal process of bone repair in the control group over the
course of experimental periods, initially presenting the blood clot (7
and 14 days) and its subsequent replacement by granulation tissue
(14 and 21 days) and new bone (28 and 42 days). In contrast, the
test group (implantation of OBM) showed delayed bone healing
process, with areas of necrosis in the initial periods (7, 14 and 21
days) and slow formation of granulation tissue (28 and 42 days)
and bone formation in contact with particles of OBM implanted
(42 days). The results obtained in this study demonstrate that the
OBM presented discrete osteoconductive capacity, contributing to
delay on alveolar repair. Possibly the compaction of the material
hindered the proper blood clot formation.
Key words: Bioprosthesis. Bone regeneration. Bone and bones
Palavras-chave: Bioprótese. Regeneração óssea. Osso e ossos.
Endereço para correspondência:
Rodrigo Cardoso de Oliveira
Faculdade de Odontologia de Bauru – USP
Depto. de Ciências Biológicas
Al. Octávio Pinheiro Brisolla, 9-75
17012-101 – Bauru – São Paulo – Brasil
E-mail: [email protected]
Recebido: 30/11/2011
Aceito: 13/03/2012
1. Professor Doutor do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
2 Doutoranda do Curso de Genética Evolutiva, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP, Brasil.
3 Cirugião-dentista, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
4. Doutora em Biologia Oral, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
5. Professor Titular do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
6. Pesquisador Sênior, Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, Duque de Caxias, RJ, Brasil. Professor Adjunto do Núcleo de Terapia Celular, Hospital
Universitário Antônio Pedro, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil.
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artigos ORIGINAIS
Oliveira RC de, Fernandes M da S, Oliveira FHG de, Cestari TM, Taga R, Taga EM, Granjeiro JM
INTRODUÇÃO
bovino misto (OBM) medular em partículas foi processado e esterilizado
previamente por radiação gama (25 KGy) como descrito previamente27.
A regeneração ou reposição de tecidos/órgãos que tenham sido perdidos é um obstáculo para diversos profissionais da área da saúde (médicos,
cirurgiões-dentistas, veterinários entre outros), além do próprio paciente10.
Dentre os diversos tecidos que compõe os vertebrados, o tecido ósseo é o
que possui uma destacada capacidade de regeneração14,18. No entanto, em
casos de lesões ósseas extensas (traumas, remoção de tecido por causa de
tumor etc.)14 ou fraturas instáveis que não ocorre a regeneração e patologias
como a pseudoartrose podem advir.
Ao longo de toda a história humana, mas particularmente nas últimas
décadas, biomateriais vêm sendo desenvolvidos no sentido de auxiliar
o processo de regeneração do tecido ósseo10,18,23. Para essa função, os
biomateriais devem apresentar, entre outras características, biocompatibilidade, previsibilidade, fácil manuseio e segurança8,18. No contexto
atual da medicina regenerativa devem, ainda, serem absorvíveis e capazes de funcionar como carreadores de células para a engenharia de
tecidos8,15. Entre os diversos biomateriais estudados, os de origem xenogénica (bovina) vem sendo largamente empregados como enxertos ósseos7,11,30. Entre eles estão o colágeno do tipo I, hidroxiapatita, proteínas
morfogenéticas ósseas (BMPs)15, osso cortical e osso medular, todos de
origem bovina7,25. Dentre as vantagens dos xenoenxertos destacam-se a
fonte abundante, baixo custo e semelhança estrutural/bioquímica com
o tecido hospedeiro5,25,29.
Trabalhos da literatura tem mostrado o uso do osso bovino como biomaterial para regeneração óssea há mais de 60 anos24. Estudos in vitro27 e in
vivo23, anteriores, mostram que o osso bovino desmineralizado ou desproteinizado é biocompatível2,25 e apresenta capacidade osteocondutora23,30.
Uma possível rota de processamento do osso bovino, visando a preservação da porção inorgânica de hidroxiapatita e a porção orgânica de colágeno,
denominada osso bovino misto (OBM), permitiria a obtenção de um biomaterial alternativo com composição mais próxima do osso natural, maior
resistência mecânica que o colágeno isolado e biodegradabilidade, diversamente dos biomateriais cerâmicos naturais ou sintéticos. De fato, estudo
prévios em sítios subcutâneos7,11 e intraósseos30 confirmaram a biocompatibilidade, a capacidade osteocondutora e a bioabsorção30. Entretanto, até
o presente momento, não foi determinada a sua eficiência em promover o
reparo ósseo em condições específicas para a odontologia (implantodontia
e periodontia), como é o caso de defeitos ósseos na região do osso alveolar.
Nesse sentido o objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade osteocondutora do osso bovino misto (OBM) medular implantado em alvéolo dental
de rato após a extração do incisivo.
MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL OBM
Ossos bovinos foram obtidos de um frigorífico, em seguida esses foram
submetidos à limpeza mecânica e tratamento químico com peróxidos e
agentes caotrópicos, neutralizado em tampão fosfato e liofilizado27. O osso
ANIMAIS UTILIZADOS
Foram utilizados 50 ratos machos (Rattus norvegicus) da espécie Wistar
com 300 g cada, procedentes do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Bauru – FOB-USP. Os animais foram divididos em 5 grupos experimentais de acordo com os períodos de 7, 14, 21, 28 e 42 dias após a
cirurgia, (10 animais/período). Por todo o tempo experimental os animais
foram mantidos em gaiolas com boas condições de alimentação, ração e
água ad libitum.
A pesquisa foi realizada segundo as normas recomendadas pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), após a aprovação pelo Conselho Comitê de Ética em pesquisa animal da Faculdade de Odontologia de
Bauru – Universidade de São Paulo.
PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
Realizou-se a exodontia do incisivo superior direito com os animais sob
anestesia geral obtida por meio da administração de Dopalen (cloridato de
quetamina; Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia – SP) e Anasedan (cloridato
de xilazina; Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia – SP) na proporção de 0,14
mL/100g de peso do animal, por via intramuscular17.
Após a exodontia, o alvéolo foi preenchido com coágulo sanguíneo do
próprio animal (grupo controle) ou com OBM (partículas de 200-400 µm)
misturado em solução salina estéril 0,9%, que foi introduzido com o auxílio
de porta-amálgama modificado/adaptado e condensado com um condensador para amálgama de Ward nº1. Inseriu-se aproximadamente 12 mg do
material. Assim os animais foram divididos em dois grupos:
Grupo I (controle): Preenchimento do alvéolo com coágulo sanguíneo.
Grupo II (material teste): Preenchimento do alvéolo com OBM misturado
em solução salina estéril 0,9%.
COLETA DAS PEÇAS
Decorrido os períodos experimentais (7, 14, 21, 28 e 42 dias) os animais
foram eutanasiados de acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). As maxilas foram removidas e fixadas, por uma
semana, em formol 10% tamponado.
PROCESSAMENTO HISTOTÉCNICO
As peças foram imersas em solução de EDTA (0,5 M em pH 7,4), que foi
renovada semanalmente até a sua desmineralização. Em seguida, as peças
foram lavadas em água destilada por 24 horas, receberam processamento
histotécnico padrão para cortes semi-seriados no sentido longitudinal de
5µm de espessura e foram coradas com hematoxilina e eosina padrão18.
ANÁLISE HISTOLÓGICA
Em seguida, os cortes histológicos foram analisados ao microscópio óptico para determinação da resposta tecidual e descrição dos eventos presentes nos grupos controle e teste nos diferentes períodos experimentais. Foi
feita a avaliação da presença de: coágulo sanguíneo, tecido de granulação,
tecido ósseo neoformado, tecido fibrótico e material implantado.
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RESULTADOS
ANÁLISE HISTOLÓGICA
Período de 7 dias: No grupo controle observou-se uma intensa migração
e proliferação de células semelhantes à fibroblastos. O alveólo era preenchido ora por coágulo sanguíneo ora por tecido conjuntivo de granulação
(Figura 1A), sugerindo a regressão do coágulo e substituição pelo tecido
conjuntivo. No grupo preenchido com OBM notaram-se áreas necróticas
próximas ao material implantado, além de neoformação óssea entre as
paredes do alveólo e o material implantado (Figura 1B). Também foi registrado, em alguns animais do grupo teste, regiões de reabsorção das paredes
ósseas do alveólo.
Período de 14 dias: Na região apical do alvéolo, no grupo controle, notou-se intensa neoformação óssea a partir da borda óssea e resquicíos do
coágulo sanguíneo (Figura 1C). Em algumas áreas, especialmente na região
cervical, havia tecido conjuntivo presente, no grupo controle. Notaram-se,
no grupo teste, as partículas de OBM circundandas por tecido conjuntivo
de granulação, enquanto havia neoformação óssea próxima às paredes do
alveólo dental (Figura 1D). Áreas necróticas próximas às partículas foram
observadas nesse período.
Período de 21 dias: Neste período houve intensa neoformação óssea e
reabsoção do coágulo sanguíeno no grupo controle (Figura 2A). Enquanto o grupo teste apresentava as partículas do material em praticamente
toda a extensão do alveólo. Áreas necróticas próximas às partículas de
OBM, em algumas regiões, eram visíveis neste período (Figura 2B). As
regiões de neoformação óssea eram restritas as áreas adjacentes ao osso
da parede alveolar.
Período de 28 dias: As características histológicas nesse período não diferiram do período anterior (21 dias) para ambos os grupos avaliados. Em um
dos animais do grupo teste registrou-se partículas do material no interior
das fossas nasais.
Período de 42 dias: O alveólo dentário foi preenchido por tecido ósseo no
grupo contole (Figura 2C), indicando o reparo completo dessa região. O quadro histológico exibido no grupo teste era de reparo alveolar incompleto,
com formação de tecido ósseo ao redor das partículas de OBM e presença de
tecido conjuntivo fibroso sem presença de células inflamatórias (Figura 2D).
.
Figura 1 - Fotomicrografia dos períodos de 7 (A e B) e 14 (C e D) dias:
A) Grupo controle. Pode se notar a formação de tecido conjuntivo de
granulação próximo a parede óssea do alveólo e presença do coágulo
sanguíneo. B) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo entre o osso alveolar e as partículas de OBM. Conteúdo necrótico pode
ser visto. C) Grupo controle. Neoformação óssea avançada pode ser
notada, além de pequenas áreas com coágulo sanguíneo. D) Grupo
teste. Observa-se a formação de tecido ósseo entre o osso alveolar e as
partículas de OBM e presença de conteúdo necrótico. Coloração H&E.
Magnificação de 10x. Siglas: CO-coágulo sanguíneo; NE-conteúdo
necrótico; OBM-osso bovino misto; ON-osso neoformado; OS-osso;
TC-tecido conjuntivo.
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da área do alveólo pode ser notada, além de pequenas áreas com
coágulo sanguíneo B) Grupo teste. Área de necrose próxima ao OBM
C) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo próximo ao
osso alveolar. Também são visíveis as partículas de OBM e conteúdo
necrótico na região mais interna do alveólo. D) Grupo controle. Osso
neoformado ocupando a região do alveólo. O coágulo sanguíneo não
foi registrado nesse grupo. E) Grupo teste. Observa-se a formação de
tecido ósseo circundando as partículas de OBM, além de presença de
tecido conjuntivo. Coloração H&E. Magnificação de 10x (A, B e C) e 40x
(D e E). Siglas: CO-coágulo sanguíneo; NE-conteúdo necrótico; OBMosso bovino misto; ON-osso neoformado; OS-osso.
DISCUSSÃO
Figura 2 - Fotomicrografia dos períodos de 21 (A, B e C) e 42 (D e E)
dias. A) Grupo controle. Neoformação óssea ocupando grande parte
Estudos histológicos têm mostrado que o processo de reparo alveolar em
ratos é similar aos humanos, porém mais rápido1,17. Em adição, alguns trabalhos
demonstram que a utilização de alguns biomateriais atrasa o processo de reparo ósseo, uma vez que necessitam de um tempo maior para ser reabsorvido4,21.
Esses relatos foram confirmados pelos resultados apresentados neste estudo,
onde o OBM promoveu o atraso do processo de reparo quando comparado ao
alvéolo preenchido apenas pelo coágulo sanguíneo.
Trabalhos anteriores20,21 que estudaram a resposta celular frente à implantação de hidroxiapatita em alvéolos de ratos e humanos indicam que
o reparo alveolar é prejudicado pela presença de materiais, ainda que reconhecidamente biocompatíveis, como a hidroxiapatita (HA). No presente
trabalho, no grupo teste, além do atraso no processo de reparo alveolar notou-se persistência de focos de necrose até 28 dias, sendo que tais eventos
podem ter decorrido pelo excesso de material implantado e compactado.
Tal condição dificultou a formação e organização do coágulo sanguíneo no
interior da massa de material implantada, impedindo, assim, que neutrófilos e macrófagos, células responsáveis pelo início da reação inflamatória
que precede o reparo, chegassem até o centro da lesão e ao material. Posto
que a formação e organização do coágulo sanguíneo são fundamentais para
assegurar/ordenar o reparo do alvéolo e a angiogênese1, sua ausência, além
de atraso no reparo, pode ter favorecido a necrose pela ausência de nutrientes e da capacidade homeostásica do sangue.
É sabido também que a HA tem a capacidade de adsorver proteínas22.
A despeito do coágulo não ter atingido toda a região enxertada, proteínas solúveis no líquido intersticial podem ter se adsorvido ao material
implantado. Isto, aliado a um excesso de OBM compactado, poderia
acentuar o edema local, o que concorreria para a exacerbação da resposta
inflamatória. Destaque-se que a formação óssea ocorreu somente após a
reabsorção do tecido necrótico e a partir da região apical, onde o existe
menor volume de material e menor condensação, lentamente avançando
para a área central do defeito. Aos 42 dias as células inflamatórias eram
ausentes e notava-se partículas de OBM ora envoltas por tecido conjuntivo, ora por tecido ósseo neoformado.
Não se pode descartar, contudo, que o material tenha induzido diretamente a diminuição significativa do número de células, das funções mitocondrial e a lisossomal, provavelmente pela presença de resíduos do processamento do material como demonstrado anteriormente26.
Uma vertente adicional, abordada por alguns estudos9,28, relatam
sobre a possibilidade da remoção e/ou desnaturação das chamadas
proteínas morfogenéticas ósseas (BMP’s) presentes nos enxertos ósseos
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preparados por meio do tratamento com uréia ou guanidina28. Ainda em
relação ao processamento do osso bovino, diversos trabalhos tem demonstrado que a esterelização do material por irradiação gama (25 KGy)
pode promover alterações importantes nas propriedades mecânicas e
biológicas destes. Entre elas a mudança na estrutura de colágeno presente no material e, secundariamente, na atividade biológica das BMPs,
além de redução na atividade de osteoclastos16. Como o OBM também
foi tratado com uréia e esterelizado por radiação gama (25KGy) não se
pode descartar a contribuição potencial destes fatores na morte celular
e atraso no reparo observados.
Em contrapartida, um estudo prévio em calvária de coelhos com Kiehl
bone12, biomaterial similar ao OBM, relatou-se a ossificação direta sobre
a superfície do material. Resultado este confirmados posteriormente
para o mesmo material usado no presente estudo30. Destaque-se, ainda,
que a bioaboserção do OBM anteriormente relatadas não foi confirmada
no presente trabalho, e a osteocondução foi observada discretamente
apenas no período de 42 dias. Esta discrepância pode ser devido aos diferentes sítios de implantação, pois no estudo anterior30 o OBM foi colocado na tíbia de rato, um sítio com turnover ósseo menor que o alvéolo
dentário; ainda, o biomaterial estava na forma de um pino, apresentando uma área de superfície muito menor que a existente nos grânulos do
material utilizado no presente estudo. A maior área de superfície promove uma interação mais intensa com o tecido, podendo ter ocasionado
a necrose observada.
Alguns autores tem considerado o tempo de reparo alveolar e reabsorção
do mateial mais lento como certa vantagem em aplicações específicas4,13.
Primeiramente, os biomateriais implantados em alvéolos onde foram extraídos dentes podem permitir um arcabouço para o crescimento tecidual
ósseo e impedir a invasão de tecidos competidores (tecido conjuntivo
gengival e epitélio) com o tecido ósseo19. A capacidade do biomaterial em
proporcionar um reparo tecidual ósseo ordenado é chamado de regeneração óssea guiada (RGO)6. Além disso, alguns estudos defendem a ideia de
ganho/manutenção do rebordo alveolar a longo prazo2,4, como também a
elevação de seio maxilar13,25. Foi implantada HA natural bovina em sítios
de extração dental em humanos promovendo significativa manutenção do
rebordo 9 meses após as extrações4. O mesmo grupo3, avaliou o uso de osso
bovino para aumento/reconstrução de cristal do rebordo alveolar e posterior suporte de implantes endosseos, confirmando o sucesso do protocolo
pela avaliação clínico-histológica 9 meses após a cirurgia.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente estudo permitem concluir que o OBM
demonstrou discreta capacidade osteocondutora, concorrendo para o atraso do reparo alveolar. Possivelmente a compactação do material dificultou
a formação adequada do coágulo sanguíneo.
18
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem os servidores da FOB-USP, Thelma L. Silva,
Luiz C. da Silva, Erasmo G. da Silva e Danielle S. Ceolin, pelo auxílio
técnico prestado. Este trabalho foi financiado pela FAPESP: Proc.
02/13867-8.
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