A IL-33 induz migração de neutrófilos em modelo de - EAIC
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A IL-33 induz migração de neutrófilos em modelo de - EAIC
INDUÇÃO DA MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS EM MODELO DE ARTRITE PELA IL-33 Thacyana Teixeira de Carvalho (PIBIC/CNPQ-UEL), Iain McInnes (Pesquisador), Foo Yoo Liew (Pesquisador), Sergio Henrique Ferreira (Pesquisador), Fernando de Queroz Cunha (Pesquisador). Waldiceu Aparecido Verri Junior (Orientador), e-mail: [email protected] . Universidade Estadual de Londrina/ Centro de Ciências Biológicas/ Departamento de Ciências Patológicas/ Universidade de Glasgow, Escócia/ Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo Palavras-chave: Interleucina 33, migração de neutrófilos, inflamação, artrite Resumo: A IL-33 é uma citocina da família da IL-1 descoberta recentemente, além de ser o agonista do receptor ST2. Nesse trabalho investigamos a participação da IL-33 em uma resposta Th1, a migração de neutrófilos em modelo de artrite em camundongos que foram imunizados contra mBSA e desafiados pela administração de salina (controle), mBSA ou IL-33 na articulação fêmurtibial. A migração de neutrófilos foi induzida nos animais controle positivo e o tratamento com ST2 solúvel reduziu tal resposta, demonstrando que a IL-33 medeia a migração de neutrófilos em modelo de artrite. Introdução Recentemente foi descrita a Interleucina 33. Trata-se de uma citocina da família da IL-1. A IL-33 é expressa em diferentes tecidos como estômago, pulmão, medula espinal, cérebro e pele; e tipos celulares como células dendríticas e macrófagos em situações basais em roedores e após estímulo com TNF-α e IL-1β em humanos (Schmitz et al., 2005). As evidências recentes sobre a IL-33 demonstram a sua participação fisiopatológica na maturação de mastócitos (Allakhverdi et al., 2007), sobrevida, adesão e produção de citocinas por mastócitos (Iikura et al., 2007), e regulando a produção de citocinas por esplenócitos em modelo de asma em camundongos (Hayakawa et al., 2007). Os resultados quanto à biologia da IL-33 descritos até o momento sugerem que seja uma citocina Th2. Porém, existem dados descrevendo que o tratamento com ST2 solúvel (sST2) inibe a severidade da artrite neste mesmo modelo (Leung et al., 2004). É sugerido que a IL-33 atuando em seus receptores ST2L medeia a inflamação em modelo de artrite reumatóide e o tratamento com sST2 seqüestraria a IL-33 impedindo sua atividade pró-inflamatória. Corroborando com essa hipótese, Carriere et al.( 2007) detectou a expressão de RNA mensageiro para IL-33 em amostras de tecido sinovial de pacientes com artrite reumatóide. Dessa forma, existem evidências de que a IL-33 possa também mediar respostas Th1. Porém, falta demonstração contundente nesse sentido, ou seja, Anais do XVIII EAIC – 30 de setembro a 2 de outubro de 2009 demonstrando que a IL-33 medeia atividades características de respostas inflamatórias Th1 como a migração de neutrófilos. A participação do ST2L e sST2 na regulação de respostas inflamatórias tem sido investigada nos últimos anos, principalmente utilizando-se anticorpo anti-ST2L, sST2 e animais deficientes para ST2 (tanto ST2L quanto sST2). Materiais e Métodos Animais Experimentais Foram utilizados camundongos da linhagem Balb/c, criados no biotério Central da Universidade de São Paulo, Departamento de Genética (Campus de Ribeirão Preto) pesando 20-25g. Os camundongos foram mantidos no Biotério do Departamento de Farmacologia pelo menos 24 h antes dos experimentos utilizando ciclo de claro/escuro (12/12 h) com livre acesso a água e ração. Recrutamento de neutrófilos para a cavidade articular O recrutamento leucocitário foi avaliado após a administração na articulação fêmur-tibial de salina (NaCl 0.9%) ou estímulo inflamatório (mBSA ou IL-33). As células foram retiradas pela lavagem da cavidade com PBS acrescido de EDTA e posteriormente colocadas em solução de Turk (para que ocorresse a lise das hemácias) e sua contagem total foi realizada em câmara de Neubauer. A contagem diferencial foi realizada pelo preparo de esfregaços em citocentrífuga (Cytospin® 3; Shandon Lipshaw Inc; Pittsburgh, Pennsylvania, EUA), os quais foram corados pelo método de Rosenfeld (1947) e as células diferenciadas em microscópio óptico através da objetiva de imersão em óleo (aumento de 1000x) como previamente descrito (DAL Secco et al., 2003). Modelo de imunização e desafio com mBSA (metil éster da albumina do soro bovino) Camundongos foram imunizados pela administração subcutânea de 500μg de mBSA diluído em CFA e emulsificado com salina (1:1), foi aplicado reforço após 7 dias com a mesma concentração de mBSA. Após 21 dias os animais receberam uma injeção intra-articular (fêmur-tibial - joelho) de mBSA ou IL-33 e conseqüente avaliação do recrutamento celular. Os grupos controle falso-imunizados receberam injeção da emulsão de CFA+salina (1:1) sem mBSA. Resultados e Discussão A IL-33 medeia migração de neutrófilos induzida por mBSA para a articulação do joelho. O desafio intra-articular com mBSA induziu uma migração de neutrófilos de maneira dose- (Fig. 1A) e de tempo-dependentes (Fig. 1B) para a articulação do joelho, a qual culminou com 10 µg de mBSA / joelho até 24 h após o desafio. Esta dose e tempo foram utilizados em todos os experimentos posteriores. Para demonstrar que a IL-33 medeia a Anais do XVIII EAIC – 30 de setembro a 2 de outubro de 2009 migração de neutrófilos na AIA, foi utilizado o pré-tratamento com o receptor solúvel para IL-33 (sST2). O pré-tratamento com sST2 por via sistêmica (intraperitoneal) ou local (intra-articular, co-injeção) inibiram significativamente a migração de neutrófilos na AIA (Fig. 2A, 2B, respectivamente). Esses resultados demonstram que a IL-33 poderia desempenhar um papel importante no recrutamento de neutrófilos neste modelo de doença inflamatória. Em seguida, investigamos se a IL-33 poderia induzir a migração de neutrófilos in vivo. Os camundongos foram desafiados com IL-33 recombinante no joelho e o número de neutrófilos nas articulações determinado. A IL-33 induziu um significativo influxo local de neutrófilos de maneira dose-dependentes (Fig. 3A) e tempo-dependentes (Fig. 3B). Além disso, a indução do influxo de neutrófilos pela IL-33 foi marcadamente inibida pelo tratamento com sST2, demonstrando a especificidade da indução da migração celular pela IL-33 e que o tratamento com sST2 está inibindo a atividade da IL-33 (Fig. 3C). Figura 1 - O desafio com mBSA em camundongos imunizados induz o recrutamento de neutrófilos para a cavidade articular. Figura 2 - O recrutamento de neutrófilos induzido pelo desafio com mBSA foi inibido pelo tratamento com o receptor solúvel da IL-33 (sST2). Anais do XVIII EAIC – 30 de setembro a 2 de outubro de 2009 Figura 3 - O desafio intra-articular com IL-33 induz recrutamento de neutrófilos de maneira dose- e tempodependentes inibido pelo tratamento com sST2. Conclusão No presente trabalho, demonstramos que a IL-33 medeia uma resposta em modelo de inflamação Th1, a migração de neutrófilos em modelo de artrite. Assim, o tratamento com sST2 ou anticorpos anti-IL-33 seriam abordagens terapêuticas a serem avaliadas na clínica. Todavia, mais estudos são necessários para determinar os mecanismos ativados pela IL-33. Agradecimentos Agradecemos o apoio financeiro da FAPESP, CNPq, CAPES e Fundação Araucária. Também agradecemos o apoio técnico dos técnicos Ieda R. S. Schivo e Sérgio R. Rosa (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo). Referências Z. ALLAKHVERDI; D. E. SMITH, M. R. COMEAU, G. DELESPESSE. Cutting Edge: The ST2 ligand IL-33 potently activates and drives maturation of human mast cells. J. Immunol. 2007, 179(4), 2051-2054. V. CARRIERE et al. IL-33, the IL-1-like cytokine ligand for ST2 receptor, is a chromatin-associated nuclear factor in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007, 104, 282-287. H. HAYAKAWA; M. HAYAKAWA HIROKO; A. KUME , S. I. TOMINAGA. Soluble ST2 Blocks Interleukin-33 Signaling in Allergic Airway Inflammation. J. Biol. Chem. 2007, 282(36), 26369-26380. M. IIKURA; H. SUTO; N. KAJIWARA; K. OBOKI; T. OHNO; Y. OKAYAMA; H. SAITO; S. J. GALLI; S. NAKAE. IL-33 can promote survival, adhesion and cytokine production in human mast cells. Laboratory Investigation. 2007, 87(10), 971-978. B. P. LEUNG; D. XU; S. CULSHAW; I. B. MCINNES; F. Y. LIEW. Novel Therapy of Murine Collagen-Induced Arthritis with Soluble T1/ST2. J. 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