Programa de Pós-Graduação em Ciências UNIVERSIDADE DE

Transcrição

UNIVERSIDADE DE FRANCA
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Avaliação da Atividade do Ácido Pimaradienóico
na Sinalização de Mastócitos.
Anderson Roberto de Souza
Dissertação apresentada à Universidade de Franca
como exigência parcial para a obtenção do título de
Mestre em Ciências
Área de concentração: Química Biológica
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Ricardo
Co-orientador: Profa. Dra. Constance Oliver
Núcleo de Pesquisas em Ciências
Exatas e Tecnológicas
Av. Dr. Armando Salles de Oliveira, 201
Parque Universitário - Bloco Bege
CEP 14404-600 Franca - SP
Contato:
Fone: 0800 34 1212 / 0800 709 9911
Fax: (16) 3711-8966
e-mail: [email protected]
FRANCA - SP
2013
ANDERSON ROBERTO DE SOUZA
Avaliação da Atividade do Ácido Pimaradienóico na Sinalização
de Mastócitos
Dissertação apresentada à Universidade
de Franca, como exigência parcial para a
obtenção do título de Mestre em
Ciências
Área de
Biológica
concentração:
Química
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Ricardo
Ambrósio
Co-orientador: Profa. Dra. Constance
Oliver
FRANCA-SP
2013
Avaliação da Atividade do Ácido Pimaradienóico na Sinalização
de Mastócitos
COMISSÃO JULGADORA DO PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIAS
DA UNIVERSIDADE DE FRANCA
Presidente:_____________________________________________________________
Prof. Dr. Sérgio Ricardo Ambrósio
Universidade de Franca
Titular
1:__________________________________________________________________
Profa. Dra. Patrícia Andressa de Almeida Buranello
Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Titular
2:__________________________________________________________________
Profa. Dra.Lizandra Guidi Magalhães
Universidade de Franca
Franca, 13 de Maio de 2013
Talento é dom, é graça. E sucesso nada tem haver com sorte, mas com
determinação e trabalho.
DEDICO este trabalho primeiramente a Deus, pela sua graça e por toda
a sua bondade, por todas as pessoas que colocou no meu caminho e a todas
as oportunidades que o meu Deus me proporcionou. Ao meu Deus, meu
muito obrigado.
DEDICO este trabalho as minhas princesas Tania e Tainá, meus
amores todo esse trabalho é por vocês e pra vocês. Amor eterno.
Agradecimentos
Aos meus pais, João de Souza e Maria Teresa, por todos os esforços em
proporcionar educação, caráter, e incentivo para meu crescimento como homem, pai de
família e cidadão e ao meus irmãos João Carlos e Pedroca, pela nossa história de
amizade e convívio. Valeu minha família.
A toda a minha família, em especial ao nosso patriarca Vô Pedro, pelo seu
exemplo e retidão. Aos primos e primas, tios e tias pelos momentos agradáveis nos
momento de reunião de família.
Ao meu grande orientador Sérgio Ricardo Ambrósio “ Serjão”, pela
oportunidade, orientação e dedicação. Grande pesquisador e inovador. Mais uma vez,
obrigado pelo crédito.
As Doutoras Maria Célia Jamur e Constance Oliver, pela oportunidade
proporcionada e orientação não somente neste trabalho, mas na minha vida profissional
no dia a dia. Obrigado minhas chefes.
À Prof. Dra. Maria Cristina Roque Antunes Barreira, pela oportunidade em
me proporcionar a possibilidade de executar este trabalho.
Ao grande parceiro de mestrado Miller Santos Ferreira, pelos momentos de
parceria nas disciplinas.
Aos professores do programa de pós em ciências da Universidade de Franca.
Rodrigo, Miller, Ana Helena, Denise, Nassar, Emerson Kátia, Lizandra, Lucas Márcio
Patrícia, Calefi, Raquel, Vlad. e Wilson. Pela dedicação, arte e carinho em ensinar.
Aos alunos do laboratório de Biologia Celular e Molecular das Células
Secretoras: Devandir Antônio, Antônio, Valéria, Vivian, Elaine, Vanina, Carolina,
Clarissa, Claudia, Will, Gabriel e o novato Edi. E a todos que aqui passaram: Lorena,
Maria Rita, Path, Dri, Celiana, Raquel, Michel..........minhas sinceras considerações e
respeito, Pois tenho certeza os ótimos profissionais que aqui se formaram e aos que
estão sendo contruídos. Tenho orgulho em trabalhar com vocês. “Pode até não parecer
mas eu gosto de vocês, kkkkkkkkkkkk”.
Às Doutoras Lizandra Guidi Magalhães e Raquel Alves dos Santos pelas
preciosas dicas na confecção da dissertação.
Ao Antônio Carlos Borges, pela grande ajuda e dica na confecção deste
trabalho.
À Patrícia Andressa, pela preciosa ajuda e dicas na parte experimental.
Aos colegas e funcionários do departamento de Biologia Celular Molecular e
Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, por todo apoio e
auxílio.
Ao Thércius e Adriana, da secretaria da pós-graduação pela dedicação e
carinho.
Ao pessoal da equipe Marcos Ruivo de Brazilian Jiu Jitsu : ao nosso Grande
Mestre Marcos Ruivo, Gustavo, Batata, Leonardo, Pezão, Murilão, Vitão, Ronk,
Baiano, Rodrigo, Raul. Valeu galera, só quem pratica, sabe o bem que faz um rola bem
dado nos momentos de stress.
A Universidade de São Paulo em especial à “Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto”, “Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto” e aos
“Institutos de Física e Química de São Carlos”. Instituições que motivaram mudanças
essenciais na minha vida profissional, proporcionando a possibilidade de realizar e
alcançar meus objetivos.
A todos os meus colegas e amigos.
E mais uma vez, DEUS MUITO OBRIGADO.
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO............................................................................
23
1.1
1.2
1.3
1.4
Bioprospecção vegetal, desenvolvimento de medicamentos e
biodiversidade brasileira..................................................................
Diterpenos: aspectos químicos e propriedade anti-inflamatória......
Processo inflamatório......................................................................
Mastócitos e o processo inflamatório..............................................
23
24
29
31
2
OBJETIVOS...................................................................................
37
2.1
2.2
Objetivos gerais...............................................................................
Objetivos específicos.......................................................................
37
37
3
MATERIAL E MÉTODOS..........................................................
38
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
Procedimentos químicos................................................................
Material vegetal...............................................................................
Partição com solventes orgânicos....................................................
Fracionamento da fase H.................................................................
Re-isolamento do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico (AP)....
38
38
38
38
39
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.2.6
3.2.7
Procedimentos biológicos in vitro.................................................
Linhagens celular e condições de cultivo.......................................
Estudo da viabilidade celular
Ensaio para ativação dos mastócitos pela via FcεRI.......................
Ensaio de liberação de β-Hexosaminidase......................................
Ensaio de bloqueio de liberação de β-Hexosaminidase...................
Ensaio de ativação dos fatores de transcrição NFAT......................
Ensaio de ativação dos fatores de transcrição NFκB.......................
40
40
41
42
42
43
44
45
3.3
3.3.1
3.3.2
Procedimentos biológicos in vivo..................................................
Animais............................................................................................
Ensaio de permeabilidade vascular em camundongos.....................
45
45
46
3.4
Análises estatísticas........................................................................
47
4
RESULTADOS E DISCUSSÕES................................................
48
4.1
Procedimentos químicos...............................................................
48
4.1.1
Elucidação estrutural do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico (AP)..
48
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
51
51
53
4.2.4
Procedimentos biológicos...........................................................
Estudo da viabilidade celular frente ao AP..................................
Efeito do AP na desgranulação dos mastócitos...........................
Investigação do efeito do AP na ativação dos fatores de
transcrição.................................................................................
Efeito do AP sobre a permeabilidade vascular em camundongos
5
5.1
5.2
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS.............................................
Elucidação estrutural do AP...........................................................
Ensaios biológicos..........................................................................
62
61
62
6
CONCLUSÃO................................................................................
68
7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
69
55
59
Lista de Símbolos e Abreviaturas
AA
Ácido araquidônico
AcOEt
Acetato de Etila
AP
Ácido Pimaradienóico
AzT
Azul de Toluidina
BSA
Albumina Bovina
CCDC
Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
CLV
Cromatografia Líquida à Vácuo
CO2
Dióxido de Carbono
COX
Ciclooxigenase
COX-2:
Cicloxigenase 2
CVAM
Molécula de adesão da célula vascular
δ
Deslocamento químico
d
Dubleto
DMEM
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco modified Eagle
médium)
DMSO
Dimetilsulfóxido
DNA
Acido Desoxirribonucléico
DNP-HSA
Dinitrofenol conjugado a soro de albumina humana
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
FcεRI
high affinity IgE receptor
FDA
Food and Drugs Administration
GFP
Proteína Fluorescente Verde
GGPP
Geranilgeranila
GM-CSF
Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor
Hex
Hexano
IL
Interleucina
IgE
Imunoglobulina E
IP
Iodeto de Propídeo
IP3
Inositol Trifosfato
IKBs
Inibidores de NF – kB
ITAM
Molécula se adesão intercellular
J
Constante de acoplamento
LOX
Lipoxigenase
LPS
Lipopolissacarídeo
LTs
Leucotrienos
MAPK
Proteína quinase ativada por mitógeno (Mitogen-activated protein
kinase)
MeOH
Metanol
mg
miligrama
mg/kg
miligrama por quilo
NAG
p-Nitrophenyl-N-Acetyl-D-Glucosaminide
NFAT
Fator nuclear de células T ativadas
NF-kB
Fator nuclear kappa B
NO
Óxido Nítrico
PAF
Fator de Agregação Plaquetária
PBS
Salina tamponada com fosfato
PGs
Prostaglandinas
PGI
Prostaglandina I2
2
PGH
Prostaglandina H2
PGF
Prostaglandina F2 alfa
2
2α
PGE
2
Prostaglandina E2
PGD
Prostaglandina D2
PKA
Proteinocinases A
PKC
Proteinocinases C
PLA
Fosfolipase A2
RMN 13C
Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
RMN 1H
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
SCF
Stem Cell Factor
TNF
Fator de necrose tumoral
2
2
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Principais tipos estruturais de diterpenos associados ao seu 26
número de ciclos
Figura 2
Estrutura química do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19- 28
óico(AP).
Figura 3
Resposta inflamatória e as células envolvidas na via vascular e 30
celular.
Figura 4
Mediadores inflamatórios e suas respectivas origens.
Figura 5
Ativação do mastócito e pelo intercruzamento do FcεRI e 32
31
ativação intracelular da cascata de sinalização. Com o
intercruzamento do receptor FcεRI, ocorre a fosforilação dos
domínios ITAMs do receptor pela quinase Lyn, ocorre o
recrutamento e ativação da tirosina quinase Syk que fosforila a
LAT, a PLCγ ativada catalisa (IP3) e (DAG), que levará ao
aumento do cálcio intracelular e ativação da PKC levando à
desgranulação dos mastócitos
Figura 6
Ativação de mastócitos e liberação de mediadores químicos. 33
Grânulos (G). Matriz granular (MG)
Figura 7
Vias de sinalização dos fatores de transcrição NFAT
34
Figura 8
Ativação do fator de transcrição NF-kB
35
Figura 9.
Estrutura química do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico 48
(AP).
Figura 10
Espectro de RMN 1H do AP (400 MHz, CDCl3)
49
Figura 11
Espectro de RMN 1H do AP (100 MHz, CDCl3)
50
Figura 12
Efeito do ácido pimaradienóico (AP) na viabilidade celular em 52
linhagens RBL-2H3. (A) Citometria de fluxo. As células foram
marcadas com iodeto de propídeo; (B) Células incubadas com
azul de tripan. As células foram tratadas por 1 hora com AP.
nas concentrações de (1, 10, 100, 500 µM). Como controle
negativo as células foram incubadas com DMEM completo, o
controle do solvente as células foram incubadas com DMEM
completo + 5% de DMSO. Asterisco indica a diferença
estatisticamente significante entre controle negativo ( p< 0,05).
Figura 13
Viabilidade celular em linhagens RBL-2H3. (A) Microscopia 53
de contraste de fase mostra as células RBL-2H3 sensibilizadas
com IgE-anti TNP; (B) Células da linhagem RBL-2H3
sensibilizadas com IgE- anti TNP e incubadas com 5% DMSO;
(C, D, E e F) Células da linhagem RBL-2H3 sensibilizadas com
IgE-anti TNP e incubadas com ácido pimaradienôico na
concentração (1, 10, 100 e 500 µM) respectivamente.
Figura 14
Efeito do AP sobre a desgranulação dos mastócitos. Células da 54
linhagem RBL-2H3 foram sensibilizadas com IgE anti-TNP,
incubados com 45 min com AP nas concentrações de 1, 10,
100. µM . No controle positivo as células foram incubadas com
DNP-HSA. A atividade de β-hexosaminidase liberada foi
determina pela mensuração do produto da reação a 405 nm.
Asterisco indica a diferença estatisticamente significante entre
os demais grupos ( p< 0,05).
Figura 15
Efeito do AP sobre a inibição da liberação da enzima β- 55
hexosaminidase.
Células
da
linhagem
RBL-2H3
foram
sensibilizadas com IgE anti TNP e incubadas por 45 minuntos
com o AP nas concentrações de 1, 10, 100 µM. A seguir, as
células foram incubadas com DNP-HSA. A atividade de βhexosaminidase liberada foi determina pela mensuração do
produto da reação a 405 nm. Asterisco indica a diferença
estatisticamente significante entre os demais grupos ( p< 0,05).
Figura 16
Efeito do AP sobre o fator de transcrição NF-kB. Os resultados 56
da citometria de fluxo mostram que o AP não ativa o fator de
transcrição NF-kB. Asterisco indica a diferença estatisticamente
significante entre os demais grupos ( p< 0,05).
Figura 17
Microscopia de fluorescência mostra as células NFkB2 57
sensibilizadas com IgE-anti TNP + (DNP-HSA); (B) Células da
linhagem
NFkB2;
(C)
Células
da
linhagem
NFkB2
sensibilizadas com IgE- anti TNP; (E) Células da linhagem
NFkB2 incubadas com AP concentração 100 µM (E) Células
da linhagem NFkB2 sensibilizadas com IgE-anti TNP e
incubadas com AP concentração 100 µM. Somente a imagem
A, apresentou expressão de GFP+.
Figura 18
Efeito do AP sobre o fator de transcrição NFAT. Os resultados 58
de citometria de fluxo mostram que o AP não ativa o fator de
transcrição NFAT. Asterisco indica a diferença estatisticamente
significante entre os demais grupos ( p< 0,05).
Figura 19
Microscopia
de
fluorescência
mostra
as
células
V9 59
sensibilizadas com IgE-anti TNP + (DNP-HSA); (B) Células da
linhagem V9; (C) Células da linhagem V9 sensibilizadas com
IgE- anti TNP; (E) Células da linhagem V9 incubadas com AP
concentração 100 µM (E)
Células da linhagem V9
sensibilizadas com IgE-anti TNP e incubadas com AP
concentração 100 µM. Somente a imagem A, apresentou
expressão de GFP+.
Figura 20
Efeito da administração via IP. do AP (50 mg/kg) sobre a 60
permeabilidade vascular. Como controle foi utilizado soro
fisiológico. A administração da carragenina e pirilamidina foi
realizada por via IP nas concentrações de 300 µg/ml e 20
mg/kg, respectivamente. Observa-se que no grupo tratado com
AP ocorreu efeito anti-inflamatório. Asterisco indica a
diferença estatisticamente significante entre os grupos (p<
0,05).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Esquema de eluição utilizado no fracionamento da fase H
39
Tabela 2
Frações obtidas com a cromatografia clássica e suas
respectivas massas
40
Tabela 3
Dados de RMN 1H do AP (400 MHz, CDCl3,
multiplicidade)
61
Tabela 4
Dados de RMN 13C do AP (100 MHz, CDCl3)
62
RESUMO
Avaliação da Atividade do Ácido Pimaradienóico na Sinalização de
Mastócitos
Souza, Anderson Roberto. Avaliação da atividade de diterpenos pimaranos
na sinalização de mastócitos. 2013. Dissertação de mestrado- Universidade de Franca,
Franca-SP.
A estimulação dos mastócitos via receptor de alta afinidade FcεRI, desencadeia
uma cascata de sinalização que leva a secreção de mediadores estocados em seus
grânulos, que desempenham um papel fundamental no processo inflamatório e
consequentemente na resposta a um alergêneo. Assim, a não desgranulação dos
mastócitos é um efeito desejado quando um antiinflamatório é utilizado em uma
determinada terapia. Dessa forma, o estudo dos mastócitos representa um importante
caminho para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de diversas
patologias. Portanto, este trabalho procurou contribuir com a análise do comportamento
do mastócito quando incubado com o diterpeno ácido pimaradienóico (AP). Eventos de
sinalização em mastócitos mediados por IgE levam ao aumento da concentração de Ca2+
intracelular, provocando a ativação e desgranulação dessas células. Este trabalho teve
como objetivo avaliar o papel do (AP) sobre a ativação dos mastócitos e
consequentemente a liberação dos fatores pré-formados os quais estão estocados nos
grânulos secretórios dos mastócitos. Avaliamos também o efeito do AP sobre a via de
transcrição NFAT e NFkB em células RBL-2H3NFAT-GFP e RBL-2H3NFkB-GFP. NFAT e
NFkB atuam na síntese dos fatores neo-sintetizados dos mastócitos. Os resultados
demonstraram que o AP não ativou mastócitos via o receptor FcεRI a partir da
incubação com células da linhagem NFkB2 e V9 e que não ocorre ativação dos fatores
de transcrição NFAT e NF-kB. Concluímos assim que o AP pode ser considerado como
um possível protótipo para um futuro fármaco utilizado para auxiliar no tratamento de
patologias que envolvam a ativação das vias inflamatórias.
Palavras-chave: Ácido Pimaradienôico; Mastócitos; Inflamação; Desgranulação;
Sinalização dos mastócitos.
ABSTRACT
Evaluation of the activity of pimaradienoic acid signaling in mast cells
Souza, Anderson Roberto. Evaluation of the activity of diterpenes pimaranos
signaling in mast cells. 2013. Universidade de Franca, Franca-SP.
Activation of mast cells via high affinity receptor FcεRI initiates a cascade of
signaling events, in its turn, leads to secretion of mediators from granules of mast cells.
These mediators play a key role in the inflammatory process and consequently in
response to allergens. Thus, the non-activation of mast cells is an intended effect when
an anti-inflammatory drug is used in a specific therapy. Thereby, studying mast cells
represent an important way for development of new drugs for the treatment of several
pathologies. Therefore, this study aimed to analyze the behavior of mast cells when
incubated in the presence of diterpene acid pimaradienóico (AP). Signaling events
mediated by IgE on mast cells lead to the increase of intracellular Ca2+ concentration,
which causes the activation of these cells. This study aimed to evaluate the role of (AP)
on the activation of mast cells which release preformed factors and are present in the
secretory granules of mast cells. We also evaluated the effect of AP on transcription via
of both NFAT and NFkB in RBL-2H3NFAT-GFP and RBL-2H3NFkB-GFP cells. NFAT and
NFkB acts on the synthesis of the mast cells neo-synthesized factors. Results
demonstrated that AP did not activate mast cells via receptor FcεRI from the incubation
with cell lineage NFkB2 and V9 and does not occurs activation of the transcription
factors NFAT and NF-kB. We conclude that the AP can be regarded as a possible
prototype for a future drug used to aid in the treatment of pathologies which involving
the activation of inflammatory pathways.
Keywords: Pimaradienoic acid; Mast cells; Inflammation; Desgranulation;
signaling of mast cells
1. INTRODUÇÃO
1.1. Bioprospecção vegetal, desenvolvimento de medicamentos e biodiversidade
brasileira
Dentre todos os reinos da natureza, o vegetal tem contribuído de forma bastante
significativa, fornecendo substâncias aplicáveis na profilaxia e tratamento de doenças
que acometem os seres humanos (Newman & Cragg, 2012). A variedade e
complexidade dos metabólitos secundários biossintetizados por plantas têm atraído
grandes investimentos em pesquisas de bioprospecção, com o objetivo de obter novas
entidades químicas farmacologicamente ativas (Montanari & Bolzani, 2001; Newman
& Cragg, 2012).
As pesquisas em desenvolvimento e o uso de produtos naturais como agentes
terapêuticos e profiláticos, especialmente aqueles obtidos de plantas superiores, têm
aumentado muito nos últimos anos (Rates, 2001; Newman & Cragg, 2012). Apesar das
plantas serem uma fonte importante de novos compostos ativos, somente uma pequena
porcentagem delas tem sido fitoquimicamente investigada e avaliada com relação ao seu
potencial farmacológico (Fabricant & Farnsworth, 2001; Ambrosio et al., 2006). Uma
tendência multidisciplinar para o desenvolvimento de novas drogas envolvendo o
descobrimento de novos protótipos naturais, combinado com metodologias sintéticas,
biotecnológicas e métodos computacionais tem demonstrado uma grande perspectiva
para descobrir compostos farmacologicamente ativos (Vuorela et al., 2004; Tirapelli et
al., 2008).
Dentre todos os países, o Brasil possui a maior biodiversidade genética vegetal
do mundo, sendo composta por aproximadamente 20% do número total de espécies do
globo terrestre e contando com mais de 55 mil espécies vegetais catalogadas de um total
estimado entre 350.000 e 550.000 ( Tirapelli et al., 2008). Esse enorme patrimônio
23
genético tem, atualmente, um valor agregado inestimável, sendo que é no campo do
desenvolvimento de novos medicamentos sua maior potencialidade (Rates, 2001;
Newman & Cragg, 2012).
Os modernos tratamentos, compostos por medicamentos com ações específicas
sobre os receptores, as enzimas e os canais iônicos, não teriam sido desenvolvidos sem
a contribuição dos produtos naturais, principalmente aqueles obtidos das plantas
superiores, das toxinas animais ou dos microrganismos (Rates, 2001; Newman &
Cragg, 2012). Atualmente, o mercado mundial desse grupo de fármacos atinge vários
bilhões de dólares, onde se calcula que 40% dos medicamentos disponíveis na
terapêutica atual foram desenvolvidos de fontes naturais: 25% de plantas, 13% de
microrganismos e 2% de animais (Calixto, 2003; Newman & Cragg, 2012). Somente no
período entre 1983-1994, das 520 novas drogas aprovadas pela agência americana de
controle de medicamentos e alimentos (Food and Drugs Administration – FDA), 220
delas (39%) foram desenvolvidas a partir de produtos de origem natural (Cragg, 1997).
Isto denota a grande necessidade de conhecer o potencial químico, biológico, medicinal
e do metabolismo secundário das plantas brasileiras.
1.2. Diterpenos: aspectos químicos e propriedade antiinflamatória
Os diterpenos são uma ampla e diversificada classe de produtos naturais
biossintetizados a partir do ácido mevalônico, através do pirofosfato de 2E, 6E, 10Egeranilgeranila (GGPP) (Dewick, 2002). De acordo com o número de anéis e o padrão
de ciclização de suas estruturas químicas, estes metabólitos podem ser divididos em
acíclicos, bicíclicos, tricíclicos, tetracíclicos, macrocíclicos e mistos (Garcia et al, 2007;
Hanson, 2004).
24
Invariavelmente, um novo diterpeno pode ser nomeado com base em sua fonte
biológica. Entretanto é desejável que, sempre que possível sejam utilizados nomes semisistemáticos baseados em um número menor de estruturas aparentadas (Dev & Misra,
1985). Usualmente, categorias mais gerais baseadas no número de anéis do esqueleto
diterpênico são subdivididas em várias outras, de acordo com vários tipos de esqueletos
(Hanson, 2004). A Figura 1 apresenta os principais tipos de diterpenos associados ao
seu número de ciclos.
25
Diterpenos acíclicos e monocíclicos
Fitano
Retinano
Cembrano
Bicíclicos
H
H
H
Labdano
Clerodano
Chetafanano
Tricíclicos
H
H
H
H
H
H
H
Latirano
Fujinano
Pimarano
Rosano
H
H
H
H
Abietano
H
H
Cassano
Totarano
Taxano
Tetracíclicos e pentacíclicos
H
H
H
H
H
H
H
Tiglano
Giberelano
Andromedano
Caurano
Traquilobano
Acanano
H
H
Beierano
Atisano
Figura 1. Principais tipos estruturais de diterpenos associados ao seu número de ciclos,
conforme descrito por Dev & Misra (1985).
26
Paralelamente aos seus aspectos químicos, os diterpenóides destacam-se por
apresentarem uma vasta gama de atividades biológicas, tais como antiparasitária (Da
Costa et al., 1996; Ghisalberti et al., 1997; Batista et al., 2007), hipotensora (Lahlou et
al., 2007; Tirapelli et al., 2008), antimicrobiana (Porto et al., 2009) antifúngica (Boeck
et al., 2005), relaxante da musculatura lisa vascular (Ambrosio et al., 2002; Tirapelli et
al., 2010; Ambrosio et al., 2006), entre outras.
Os diterpenos, principalmente da classe dos pimaranos e cauranos, apresentam
significante propriedade anti-inflamatória. Suh et al. (2004) sintetizaram uma série de
novos derivados do ácido acantóico (diterpeno do tipo ent-pimarano), onde a maioria
destes metabólitos foram capazes de inibir eficientemente in vitro a ação de dois fatores
pró-inflamatórios; enzima ciclooxigenase do tipo 2 e a produção de óxido nítrico.
Constantino et al. (2009) investigaram o potencial anti-inflamatório in vivo de um
diterpeno do tipo pimarano obtido da esponja marinha Tedania ignis. Neste trabalho, a
administração intraperitonial (1 mg/Kg) reduziu significantemente as fases agudas e
subcrônicas do processo inflamatório induzido por carragenina. Recentemente, nosso
grupo de pesquisa demonstrou que o ácido ent-caur-16-en-19-óico (ácido caurenóico)
apresenta efeito antinoceptivo (in vivo) frente a diversos modelos de dor provocada por
processos inflamatórios (Mizokami et al., 2012). Foi destacado também neste trabalho
que tal atividade é promovida em função da inibição da produção de citocinas próhiperalgésicas (TNF-α e IL-1β), da inibição da enzima ciclooxigenase do tipo 2, da
redução da hiperalgesia produzida pela ação de mediadores diretos, bem como pela
ativação da via de sinalização de canais de potássio NO-GMP cíclico-PKG-ATPsensíveis, sendo destacado a importância deste metabólito secundário, amplamente
isolado de diversas fontes botânicas, para futuros investigações pré-clinica.
27
Além dos metabólitos acima citados, Kang et al. (2008) investigaram o efeito do
principal diterpeno encontrado nas raízes de Aralia cordata (ácido ent-pimara-8(14),15dien-19-óico, AP, Figura 2), uma planta amplamente utilizada na medicina oriental
para o tratamento de artrite, frente a inibição dos
mediadores pró-inflamatórios
produzidos por macrófagos.
H
COOH
Figura 2. Estrutura química do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico (AP).
No trabalho acima citado foi demonstrado que o AP inibe significativamente a
produção de óxido nítrico (NO) induzido por lipopolisacarídeos, prostaglandina E2 e
interleucina-6, bem como a expressão das enzimas NO sintetase e ciclooxigenase do
tipo 2 (COX-2) em macrófagos. De acordo com os resultados obtidos, os autores (Kang
et al., 2008) consideram o AP como um protótipo natural promissor para o
desenvolvimento de novos fármacos com aplicações em doenças inflamatórias, tais
como bronquite, gastrite, entre outras.
Diante do potencial que o AP demonstrou na inibição dos mediadores e enzimas
pró-inflamatórias produzidas por macrófagos, e com base nos resultados obtidos por
(Galli & Tsai, 2010) onde relatam que os mastócitos são responsáveis pelo
armazenamento de potentes mediadores químicos da inflamação, nosso grupo de
28
pesquisa decidiu
ampliar o
conhecimento
anti-inflamatório
deste diterpeno,
promovendo assim, neste estudo a investigação do AP frente às células dos mastócitos.
1.3. Processo inflamatório
Diante de uma lesão tissular ou infecção, pode ocorrer uma inflamação que é
uma resposta orgânica envolvendo uma ação coordenada entre o sistema imunológico e
o tecido no qual ocorreu à lesão (Cotran et al., 2006). Os processos de reparação, como
a cicatrização e a regeneração do tecido afetado devem ser encarados como um processo
de defesa do organismo (Tizard, 2002). O termo inflamação é utilizado para conceituar
alterações nos tecidos vascularizados em respostas a danos teciduais, infecções ou
reações imunológicas (Spinosa et al., 2006).
O processo inflamatório compreende as fases agudas e crônicas, onde a fase
aguda é caracterizada pelos eventos vasculares: vasodilatação local e o aumento da
permeabilidade vascular; migração celular, com a infiltração de leucócitos e células
fagocitárias podendo ocorrer degeneração tecidual e fibrose (Lees et al., 2004).
Na fase aguda, a inflamação é de curta duração e apresenta os sinais cardiais: a
dor, o calor, o rubor, o tumor e a perda da função. A fase crônica perdura por um
período indeterminado, variando de acordo com os tipos de mediadores celulares e
humorais envolvidos. O intumescimento tecidual por conta do extravasamento de
proteínas plasmáticas e a saída de água para o tecido e consequente penetração das
células inflamatórias com o objetivo de diluir e neutralizar o agente nocivo são em
decorrência da liberação de mediadores químicos (Gilman et al., 2006).
O mecanismo principal de defesa do organismo contra agentes lesivos e de
reparo de tecidos é o da resposta inflamatória celular. Como observado na Figura 3,
dentre as células envolvidas, algumas estão presentes normalmente nos tecidos
29
(mastócitos, macrófagos), enquanto outras (plaquetas e leucócitos) têm acesso à área da
inflamação a partir do sangue (Rang et al., 2007).
Figura 3. Resposta inflamatória e as células envolvidas na via vascular e celular
(Kumar et al., 2010).
Para que ocorra este processo, vários são os mediadores químicos envolvidos,
que podem ser de origem tissular, como as aminas vasoativas, fator de ativação
plaquetária (PAF), eicosanóides, citocinas, radicais livres superóxidos, óxido nítrico
(NO) e neuropeptídeos; ou de origem plasmática, como os sistemas de coagulação, do
complemento, das cininas e fibrinolítica (Rang et al., 2007).
Os mediadores inflamatórios participam de todos os passos do processo
inflamatório. As células que originam estes mediadores são normalmente as plaquetas,
os neutrófilos, os monócitos, os macrófagos e mastócitos, porém as células
30
mesenquimais (endotélio, musculo liso, fibroblastos) e epiteliais podem também ser
induzidas a gerar esses mediadores. Os principais mediadores de ação farmacológica
são: histamina, serotonina, bradicinina, neuropeptídios, como por exemplo, a substância
P, eicosanoides, óxido nítrico e citocinas (Rang et al., 2007). Na Figura 4 destacamos
os principais mediadores inflamatórios e suas origens.
Figura 4. Mediadores inflamatórios e suas respectivas origens (Kumar et al. 2010).
1.4. Mastócitos e o processo inflamatório
Os mastócitos são células do tecido conjuntivo conhecidos pelo seu papel nas
reações
alérgicas
responsáveis
pela
sensibilização
de
certas
respostas
de
hipersensibilidade de contato cutânea e levando a processos inflamatórios (Galli & Tsai,
2010).
Como podemos observar na Figura 5, os mastócitos possuem receptores de alta
afinidade para a imumoglobulina E (FcεRI). Quando as imunoglobulinas E (IgEs) estão
31
ligadas ao receptor elas podem ser interligadas por antígenos multivalentes que levam
ao intercruzamento dos receptores e a ativação de uma cascata intracelular de
sinalização (Metzger, 1991). Estes eventos bioquímicos resultam na liberação de uma
gama de mediadores biologicamente ativos que participam da fase precoce da
inflamação, por serem capazes de aumentar a permeabilidade vascular, induzir a
expressão de moléculas de adesão e recrutar leucócitos circulantes e macrófagos dos
tecidos (Metzger, 1991).
Figura 5. Ativação do mastócito e pelo intercruzamento do FcεRI e ativação
intracelular da cascata de sinalização. Com o intercruzamento do receptor FcεRI, ocorre
a fosforilação dos domínios ITAMs do receptor pela quinase Lyn, ocorre o
recrutamento e ativação da tirosina quinase Syk que fosforila a LAT, a PLCγ ativada
catalisa (IP3) e (DAG), que levará ao aumento do cálcio intracelular e ativação da PKC
levando à desgranulação dos mastócitos (Gilfillan & Beaven, 2011).
32
A ativaçãos dos mastócitos resulta na liberação de três tipos de mediadores, que
são conhecidos como pré-formados (histamina, serotonina, proteinases, proteoglicanos e
enzimas como a β-hexosaminidase, entre outros), neoformados (fator ativador de
plaquetas - PAF e derivados do ácido araquidônico, como os leucotrienos e as
prostaglandinas) e neosintetizados (interleucinas IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-16 e
fatores de crescimento, como, fator de crescimento de fibroblastos, TNF-α - Tumor
Necrosis Factor, GM-CSF - Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor e
SCF - Stem Cell Factor) (Jamur, 2005).
Figura 6. Ativação de mastócitos e liberação de mediadores químicos. Grânulos (G).
Matriz granular (MG) (Jamur, 2005).
Os mediadores pré-formados são liberados durante a desgranulação dos
mastócitos, e de uma maneira geral promovem o aumento da permeabilidade vascular e
contração da musculatura lisa dos órgãos expostos ao alérgeno, atuando assim, de forma
33
ativa em processos inflamatórios (Tanifuji et al., 2010; Huber et al., 2012). Algumas
horas após a sua ativação, os mastócitos também liberam as citocinas neosintetizadas.
Os eventos bioquímicos que ocorrem durante a ativação dos mastócitos resultam em um
aumento de cálcio intracelular, o qual tem um papel fundamental na sinalização “de
novo” de síntese de citocinas (Siraganian, 2003). A serina-fosfatase calcineurina é
ativada em função do aumento do cálcio intracelular, promovendo a desfosforilação do
fator nuclear de células T ativadas (NFAT) e expondo o sinal de localização para
promover o deslocamento para o núcleo. O domínio de homologia REL de NFAT ligase a sequências específicas de DNA e com outros fatores transcricionais induzem a
expressão de citocinas como TNF-α e a IL-3 (Hogan et al., 2003).
Figura 7. Vias de sinalização dos fatores de transcrição NFAT (Mácian, 2005).
34
A ativação do NF-kB (nuclear fator kB) outro fator de transcrição, também está
associada à ativação dos mastócitos e a produção de citocinas inflamatórias. Os
inibidores de NF-kB (IkBs) impedem que este se transloque para o núcleo da célula e
consequentemente ocorra a ligação com o DNA. Com a ativação dos mastócitos via
FcεRI os membros da família da proteína quinase C degradam os IkBs permitindo o
translocamento do NFkB para o núcleo. O NFkB se liga à regiões regulatórias de genes
envolvidos com produção de citocinas relacionadas com a inflamação (Basu & Fenton,
2004).
Figura 8. Ativação do fator de transcrição NF-kB (System Biosciences)
Além da ativação celular através dos FcεRIs, os mastócitos podem ser ativados
diretamente através do contato com diversas substâncias biológicas (compostos
polibásicos, peptídeos, quimiocinas e anafilotoxinas derivadas do complemento).
Compostos como o mastoporam, 48/80 e a polimixina B são capazes de estimular a
35
exocitose dos mastócitos, causando assim, a sua desgranulação de modo não citotóxico.
A ativação dos mastócitos pelo composto 48/80 e pelo mastoporam envolve a ativação
direta de proteínas P envolvidas na ativação dos mastócitos. Compostos originados do
metabolismo do ácido araquidônico e citocinas parecem ser produzidos a partir da
ativação dos mastócitos pelo composto 48/80. Peptideos e neuropeptídeos como
substância P, somatostatina, polipeptídeo vasoativo intestinal, e neurotensina também
causam liberação de histamina pela via direta. Fragmentos do complemento C3a, C4a e
C5a levam à ativação dos mastócitos e consequentemente à sua desgranulação via
receptores específicos (Jamur, 2005).
36
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar o efeito do AP (Figura 2)
na sinalização intracelular dos mastócitos (in vitro) e seu efeito anti-inflamatório em
camundongos (in vivo).
2.2. Objetivos específicos
a) Re-isolar e identificar o ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico (AP; Figura
2) do extrato em diclorometano das raízes de Viguera arenaria;
b) Determinar a citotoxicidade do AP frente às células de mastócitos da
linhagem RBL-2H3;
c) Investigar o efeito do AP na desgranulação dos mastócitos da linhagem RBL2H3 pela via FcεRI;
d) Investigar o efeito do AP sobre a liberação da enzima β-hexosaminidase, e
consequentemente na liberação dos fatores pré-formados dos grânulos dos mastócitos
da linhagem RBL-2H3;
e) Investigar o efeito do AP sobre a ativação dos fatores de transcrição NFAT e
NFκB em mastócitos da linhagem RBL-2H3;
f) Investigar in vivo o efeito do AP sobre a permeabilidade vascular utilizando-se
camundongos.
37
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Procedimentos químicos
3.1.1. Material vegetal
O ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico (AP) foi re-isolado das raízes de
Viguiera arenaria Baker de acordo com a metodologia descrita por Ambrosio et al.
(2004). Neste procedimento, utilizou-se 100,0 gramas de extrato já previamente
preparado em nosso laboratório.
3.1.2. Partição com solventes orgânicos
O extrato bruto em diclorometano (100,0 g) foi inicialmente submetido a uma
partição dissolvendo-se o extrato em 500 mL de uma solução de metanol-água 9:1 (v/v).
Durante esta etapa, não houve uma completa solubilização do extrato, de forma que o
material não solubilizado originou um precipitado (23,0 g). Com a parte solubilizada,
foram então realizadas partições, utilizando-se primeiramente 4 porções de n-hexano de
500 mL cada, seguindo o procedimento com a utilização de 5 porções de diclorometano
com também 500 mL cada. As frações originadas foram concentradas em evaporador
rotativo sob pressão reduzida dando origem à fase hexânica e à fase diclorometânica,
que foram denominadas respectivamente de fase H (34,7 g) e fase D (22,4 g).
3.1.3. Fracionamento da fase H
Como descrito por Ambrósio et al. (2004), o AP foi isolado da fase H, de modo
que, nossos procedimentos fitoquímicos foram realizados com a fração hexânica. Com a
finalidade de confirmar a presença destes metabólitos nesta fase, realizou-se
inicialmente uma cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), utilizando-se
38
padrão autêntico deste diterpeno, o que permitiu confirmar este metabólito como
majoritário na fase H.
Com a fase H (34,7 g), foi feito uma cromatografia líquida à vácuo (CLV Pelletier et al., 1986), utilizando-se para isso uma coluna de vidro de 18 cm de diâmetro
por 25 cm de altura contendo uma placa sinterizada. Foram utilizados 700 g de sílica gel
do tipo 60H (Merck, código 1.07736) com empacotamento sob vácuo, utilizando-se
como solvente o n-hexano.
Foram coletadas 6 frações e o esquema de eluição (gradiente crescente de
polaridade) utilizado foi o seguinte:
Tabela 1. Esquema de eluição utilizado no fracionamento da fase H.
Solvente Utilizado
Volume
Fração
Massa obtida (g)
Utilizado (L)
Hex
2
H1
1,2
Hex/AcOEt 9:1
2
H2
11,3
Hex/AcOEt 4:1
2
H3
7,1
Hex/AcOEt 1:1
2
H4
4,3
AcOEt
2
H5
6,2
MeOH
2
H6
1,1
Análise destas frações por CCDC permitiu observar que o AP era o constituintes
principal da fração H2.
3.1.4. Re-isolamento do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico (AP)
O re-isolamento do AP foi realizado a partir da fração H2. Com parte desta
fração (1,3 g) foi feita uma cromatografia clássica, utilizando-se uma coluna com 2 cm
de diâmetro, 60,0 g de sílica gel 60 (0,040-0,063 mm, código-1.09385) e como fase
móvel uma mistura de Hex/AcOEt 4:1 acrescida de 1% de ácido acético.
39
O empacotamento foi feito com a própria fase móvel, sendo coletadas 40 frações
com 10 ml cada. Posteriormente, estas frações foram analisadas por CCDC permitindose assim reagrupá-las de acordo com seus perfis cromatográficos, como pode ser
observado na Tabela 2.
Tabela 2. Frações obtidas com a cromatografia clássica e suas respectivas massas.
Frações reunidas
Fração obtida
Massa obtida (mg)
1-7
H2.1
68,0
8-17
H2.2
470,0
18-32
H2.3
617,0
33-40
H2.4
197,0
A análise dessas frações por CCDC permitiu concluir que o ácido ent-pimara8(14),15-dien-19-óico (AP) foi isolado e encontrava-se na fração H2.2. Este metabólito
foi então submetido às análises espectroscópicas de RMN 1H e
13
C, o que permitiu
confirmar a sua estrutura química.
3.2. Procedimentos biológicos in vitro
3.2.1. Linhagens celulares e condições de cultivo
As linhagens celulares utilizadas nos experimentos foram as células RBL-2H3,
NFkB2 e V9 mantidas no laboratório de Biologia Celular e Molecular de Mastócitos do
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da FMRP,
USP. As células VB9 e NFkB2 são derivadas das células RBL-2H3 e são linhagens
repórter para ativação do fator de transcrição NFAT e NFkB, respectivamente. A
linhagem VB9 possui três sítios de ligação para NFAT, em tandem, fusionados a GFP.
Por sua vez, a linhagem NFkB2 apresenta um vetor repórter transcricional com quatro
40
cópias do sítio de ligação para NFkB localizado upstream do promotor mCMV que
regula a expressão de GFP dependente da ativação de NFkB (Grodzki et al., 2009).
Todas as linhagens utilizadas foram mantidas em meio Dulbeco’s mínimo de
Eagle (DMEM) (Invitrogen Life Technologies, Carisbad, CA), suplementado com 15%
soro fetal bovino (Sigma- Aldrich), glutamina, anfotericina B, penicilina e
estreptomicina (Invitrogen) como descrito por Basciano et al. (1986). As células foram
incubadas a 37° C em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 e monitoradas com auxílio
de microscópio invertido DIAVERT (Leitz). Ao ser identificada a confluência da
linhagem, as mesmas foram removidas do frasco de cultura sendo então incubadas com
Tripsina-EDTA por 15 minutos a 37° C em atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após
a remoção do frasco, as células foram centrifugadas a 106 x g por 5 minutos e após o
descarte do sobrenadante foram ressuspendidas com meio de cultura citado acima e
após a quantificação, incubadas seguindo os procedimentos estabelecidos em protocolos
do laboratório de Biologia Celular e Molecular das Células secretoras da FMRP-USP.
3.2.2. Estudo da viabilidade celular
Células RBL-2H3 (2x105 células/poço) foram incubadas em placas de cultivo de
24 poços (Costar-Corning) como descrito no item 3.2.1. Foram mantidas por 18 horas a
37 °C em atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após este período as células foram
incubadas por 1 hora com o AP diluído em DMSO e adicionado à DMEM completo,
nas concentrações de 1, 10, 100 e 500 µM. Após o tempo de incubação as células foram
lavadas com Hank’s Balanced Salt Solution e removidas do frasco de cultura, sendo
então incubadas em Tripsina-EDTA por 15 minutos a 37°C em atmosfera úmida
contendo 5% de CO2. Após a remoção do frasco, as células foram centrifugadas a 242 x
g por 5 minutos e após o descarte do sobrenadante estas foram lavadas com PBS,
41
coradas com azul de tripan por 5 minutos e contadas em hemocitômetro. Parte das
células foram ressuspendidas em 1 ml de PBS contendo 5 µg/ml de iodeto de propídeo
e, a seguir, foram fixadas com paraformoldeído a 4% durante 15 minutos e
centrifugadas 54 x g. O sobrenadante foi descartado e o sedimento celular foi lavado 3
vezes com PBS por centrifugação. A análise da viabilidade celular foi realizada por
citometria de fluxo no sistema Guava EasyCyte Mini System utilizando o programa
Cytosoft Blue ( Guava Technologies, Inc. – Hayaward, CA) com excitação do laser a
480 nm.
3.2.3. Ensaio para ativação dos mastócitos pela via FcεRI
Para estes experimentos as células foram estimuladas através do receptor de alta
afinidade para IgE (FcεRI). As células foram sensibilizadas com IgE (Biosource
International, Camarillo, CA, EUA) na concentração de 0,37 µg/ml, por 16 horas e
estímuladas com 50 ng/ml de dinitrofenol conjugado a soro albumina humana (DNPHSA) (Sigma-Aldrich).
3.2.4. Ensaio de liberação de β-Hexosaminidase
Para os ensaios de liberação de β-hexosaminidase as células RBL-2H3 (3 x 104)
foram cultivadas em placa de cultivo de 96 poços (Costar-Corning). As células foram
sensibilizadas pela adição ao meio de cultura de 1:2500 de IgE anti-TNP (gentilmente
cedida pelo Dr. Reuben Siraganian, do National Institutes of Health, Bethesda, MD,
EUA). As células foram cultivadas por 24 horas a 37º C em atmosfera úmida contendo
5% de CO2. A seguir as células foram tratadas por 45 minutos com o AP nas
concentrações de 1, 10 e 100 µM. Após as células serem sensibilizadas ou não com IgE
e incubadas com AP o meio de cultura foi removido e as células foram lavadas duas
42
vezes com 100 µL de tampão de Tyrodes (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 12 mM
NaHCO3; 0,37 mM NaH2PO4; 0,1 mM MgCl2; 1,3 mM CaCl2 e 10 mM Hepes, pH 7,3)
suplementado com 0,1% de BSA e 0,01% de gelatina de suíno (Sigma-Aldrich), e
estimuladas ou não via FcεRI com 50 ng/mL de DNP48-HSA (Sigma-Aldrich). O
estímulo foi preparado no mesmo tampão de lavagem (tampão de Tyrodes
suplementado com 0,1% de BSA e 0,01% de gelatina).
Após 1 hora, os sobrenadantes foram transferidos para poços da outra placa. As
células aderidas foram solubilizadas em 1% de Triton X-100 diluído em tampão de
lavagem. O solubilizado também foi transferido para outra placa. Para cada 25µL do
solubilizado de células e 25µL do sobrenadante, adicionou-se um volume igual de 8
mM do substrato da enzima NAG (p-Nitrophenyl-N-Acetyl-D-Glucosaminide, SigmaAldrich) previamente preparado em tampão citrato-ácido cítrico 0,1M, pH 4,5. As
amostras foram incubadas por 30 minutos a 37o C. A reação foi inibida pela adição de
50 µL da solução de glicina 0,2 M, NaCl 0,2 M, NaOH 0,2 M, pH 10,0. O teor de βhexosaminidase foi determinado pela mensuração do produto da reação a 405 nm
utilizando-se o leitor de placas Elisa Power Wave X Plate Reader (Bio-Tek Instrument,
Winooski, VT, EUA). O valor total (100%) de atividade de β-hexosaminidase de cada
poço foi determinado pela soma das leituras do sobrenadante mais o solubilizado em
1% de Triton X-100. Baseando-se no valor total, calculou-se a porcentagem de
atividade de β-hexosaminidase liberada a partir da leitura de seu respectivo
sobrenadante.
3.2.5. Ensaio de bloqueio de liberação de β-Hexosaminidase
Para os ensaios de bloqueio da liberação de β- hexosaminidase o AP foi utilizado
nas concentrações de 1, 10 e 100 µM, sendo adicionado às células antes ou após o
43
estímulo ou à sensibilização. Após a incubação por 45 minutos com AP, as células
foram estimuladas com DNP48-HSA para avaliar o potencial inibitório deste diterpeno
na ativação dos mastócitos e a seguir foram realizadas as etapas que constam no item
3.2.4
3.2.6. Ensaio de ativação dos fatores de transcrição NFAT
Para investigar se o AP atua na ativação do fator de transcrição de NFAT, foi
utilizada a linhagem celular repórter VB9. As células (1 x 105 células/poço) foram
cultivadas em placas de 24 poços, contendo ou não lamínulas de vidro com 13 mm de
diâmetro. As células foram sensibilizadas ou não pela adição de IgE anti-TNP e, a
seguir incubadas com 1, 10 e 100 µM de AP, sendo então estimuladas ou não via FCεRI
com 50 ng/ml de DNP48-HSA (Sigma- Aldrich) por um período de 16 – 20 horas, a 37°
C. As células foram fixadas em 2% de formaldeído (EM Sciences) em PBS por um
período de 20 minutos. Após este período de tempo as células foram lavadas em água
milli-Q por aproximadamente 5 segundos e montadas com meio de montagem
Fluoromount G (EM Sciences). Para analisar a expressão da GFP em resposta da
ativação de NFAT as células foram observadas em microscópio de fluorescência
Olimpus BX 50F4 (Olympus Optical CO. LTDA). As células repórter também foram
analisadas por citômetro de fluxo. Para tal, as células foram tripsinizadas por 10
minutos a 37°C, colocadas em tubo contendo meio DMEM completo, centrifugadas a
106 x g por 5 minutos, lavadas com PBS e fixadas por 20 minutos com 2 % de pformaldeído (EM Sciences) e lavadas em PBS. Em seguida as células foram
ressuspendidas em PBS e analisadas no citômetro de fluxo – Guava EasyCite Mini
System com auxílio do programa Cytosoft Blue ( Guava Technologies, Inc. – Hayward,
CA).
44
3.2.7. Ensaio de ativação dos fatores de transcrição NFκB
A linhagem repórter NFkB2 foi cultivada (1 x 105 células/poço) em placas de 24
poços, contendo ou não lamínulas de vidro com 13 mm de diâmetro. As células foram
sensibilizadas ou não pela adição de IgE anti-TNP e, a seguir estimuladas ou não via
FCεRI com 50 ng/ml de DNP48-HSA (Sigma- Aldrich), sendo incubadas com 1, 10 e
100 µM de AP por um período de 16 – 20 horas, a 37°C. As células foram fixadas em
2% de formaldeído (EM Sciences) em PBS por 20 minutos, e após esse período de
tempo as células foram lavadas em água milli-Q por aproximadamente 5 segundos e
montadas com meio de montagem Fluoromount G ( EM Sciences). A expressão de GFP
em resposta da ativação de NFkB foi observada em microscópio de fluorescência
Olimpus BX 50F4 (Olympus Optical CO. LTDA).
As células repórter também foram analisadas por citômetro de fluxo. Para tal, as
células foram tripsinizadas por 10 minutos a 37°C, colocadas em tubo contendo meio
DMEM completo, centrifugadas a 106 x g por 5 minutos, lavadas com PBS e fixadas
por 20 minutos com 2 % de p-formaldeído (EM Sciences) e lavadas em PBS. Em
seguida as células foram ressuspendidas em PBS e analisadas no citômetro de fluxo –
Guava EasyCite Mini System com auxílio do programa Cytosoft Blue (Guava
Technologies, Inc. – Hayward, CA).
3.3. Procedimentos biológicos in vivo
3.3.1. Animais
Nos experimentos in vivo foram utilizados camundongos Balb-c machos,
pesando entre (20 e 30 g), provenientes do biotério central da prefeitura do Campus da
Universidade de São Paulo do Campus de Ribeirão Preto. Os mesmos foram mantidos
45
em sala climatizada com temperatura (23 +/- 2 °C) e umidade controlada (53 +/- 2%).
Água e comida à vontade.
3.3.2. Ensaio de permeabilidade vascular em camundongos
O método utilizado foi o descrito por Mustard et al. (1965) e Lykbe &
Cummings (1969) modificado, o qual consiste na determinação espectrofotométrica da
quantidade de azul de Evans (Evans blue, Nacalai Tec. Co, Kyoto, JP) extravasado para
o espaço intersticial por ação de um mediador inflamatório.
Foram utilizados camundongos neste experimento, em diferentes grupos de
animais (n=5). Para avaliar se o AP seria capaz de reduzir significativamente a
permeabilidade vascular, os animais foram tratados previamente com este metabólito e
o antagonista histamínico pirilaminina (Allergovet®) na concentração de 50 mg/kg e 10
mg/kg, respectivamente, os quais foram administrados por via intraperitonial no volume
de 200 µl. Após um período de 1 h foi administrado carragenina (Sigma. Iota).
Para avaliar o efeito do AP sobre a exsudação, os animais foram tratados com
solução corante de Azul de Evans (25 mg/kg, iv) até 1 hora antes da administração da
carragenina. Paralelamente, grupos tratados com solução salina estéril (NaCl 0,9%) e
com carragenina 300 µg/ml serviram como grupo controle negativo e positivo,
respectivamente. Após o tempo de tratamento com a carragenina, todos os grupos foram
eutanasiados e a cavidade abdominal foi exposta e lavada com 1 ml de PBS. A
quantidade de azul de Evans foi determinada por análise espectrofotométrica,
utilizando-se o leitor de placas Elisa Power Wave X Plate Reader (Bio-Tek Instrument,
Winooski, VT, EUA) no comprimento de onda de 620 nm. As concentrações do corante
foram obtidas a partir da densidade óptica (DO).
46
3.4. Análises estatísticas
A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism 5, pela
análise de uma variância ANOVA, pós-teste t-Tukey, considerando-se significante p<
0,05.
47
4. RESULTADOS
4.1. Procedimentos químicos
4.1.1. Elucidação estrutural do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico (AP)
A estrutura química do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico (Figura 9) foi
identificada através de dados espectroscópicos de RMN 1H (Figura 10) e
13
C (Figura
11).
17
15
12
20
1
2
10
3
9
5
4
18
11
H
13
16
14
8
7
6
COOH
19
Figura 9. Estrutura química do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico (AP).
48
SpinWorks 2.5:
SpinWorks 2.5:
17
15
12
20
1
2
10
3
9
5
4
18
11
H
13
16
14
8
7
6
COOH
19
PPM
5.80
5.70
5.60
5.50
5.40
5.30
file: C:\Users\SÉRGIO\UNIFRAN\ORIENTAÇOES\MILLER\Qualificação\RMN\ácido pimaradienóico\1\fid expt: <zg30>
transmitter freq.: 300.132191 MHz
time domain size: 32768 points
width: 4734.85 Hz = 15.775877 ppm = 0.144496 Hz/pt
number of scans: 16
PPM
5.2
4.8
4.4
4.0
3.6
file: C:\Users\SÉRGIO\UNIFRAN\ORIENTAÇOES\MILLER\Qualificação\RMN\ácido pimaradienóico\1\fid expt: <zg30>
width: 4734.85 Hz = 15.775877 ppm = 0.144496 Hz/pt
number of scans: 16
5.20
5.10
5.00
4.90
4.80
freq. of 0 ppm: 300.130006 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
3.2
2.8
2.4
2.0
1.6
1.2
0.8
LB: 0.000 GB: 0.0000
Figura 10. Espectro de RMN 1H do AP (400 MHz, CDCl3).
49
SpinWorks 2.5:
PPM
170.0
160.0
150.0
140.0
130.0
120.0
file: C:\Users\SÉRGIO\UNIFRAN\ORIENTAÇOES\MILLER\Qualificação\RMN\ácido pimaradienóico\15\fid expt: <zgpg30>
width: 18832.39 Hz = 249.514902 ppm = 0.574719 Hz/pt
number of scans: 3072
110.0
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
LB: 0.000 GB: 0.0000
Figura 11. Espectro de RMN 13C do AP (100 MHz, CDCl3).
50
4.2. Procedimentos biológicos
4.2.1. Estudo da viabilidade celular frente ao AP
Com o objetivo de investigar o efeito do AP na viabilidade de mastócitos as
células da linhagem celular RBL-2H3 foram incubadas por 18 horas a 37°C e 5% de
CO2. A viabilidade celular foi avaliada com iodeto de propídio (IP) e com azul de tripan
(AzT). A porcentagem de células viáveis foi determinada por citometria de fluxo e com
uso de hemocitômetro. Na quantificação utilizando o hemocitômetro, as células viáveis
foram determinadas com o auxílio de um contador de células, onde foram quantificadas
300 células por poço (entre vivas e mortas). A porcentagem de células vivas foi
calculada através dos valores obtidos nestas contagens.
Os resultados mostraram que pelos métodos acima descritos a incubação dos
mastócitos da linhagem RBL-2H3 com 500 µM de AP resultou em uma diminuição
acentuada da porcentagem de células viáveis. Porém, não se observa alterações
significativas na porcentagem de células viáveis com a incubação do AP nas
concentrações de 1, 10 e 100 µM, conforme pode ser observado nas Figuras 12 e 13.
51
A
IODETO DE PROPÍDIO
% de Células Viáveis
150
100
*
50
1
10
50
0
10
0
0
[ Ácido Pimaradienóico] µ M
B
AZUL DE TRIPAN
% de Células Viáveis
150
100
*
50
1
10
10
0
50
0
0
[ Ácido Pimaradienóico] µ M
Figura 12. Efeito do AP na viabilidade celular em linhagens RBL-2H3. (A) Citometria
de fluxo. As células foram marcadas com iodeto de propídio; (B) Células incubadas
com azul de tripan. As células foram tratadas por 1 hora com AP nas concentrações de
(1, 10, 100, 500 µM). Como controle negativo as células foram incubadas com DMEM
completo; como o controle do solvente, as células foram incubadas com DMEM
completo + 5% de DMSO (não demonstrou efeito citotóxico). Representa 3
experimentos independentes, * indica a diferença estatisticamente significante entre
controle negativo ( p< 0,05).
52
Figura 13. Viabilidade celular em linhagens RBL-2H3. (A) Microscopia de contraste
de fase mostra as células RBL-2H3 sensibilizadas com IgE-anti TNP; (B) Células da
linhagem RBL-2H3 sensibilizadas com IgE- anti TNP e incubadas com 5% DMSO; (C,
D, E e F) Células da linhagem RBL-2H3 sensibilizadas com IgE-anti TNP e incubadas
com AP nas concentrações de 1, 10, 100 e 500 µM, respectivamente.
4.2.2. Efeito do AP na desgranulação dos mastócitos
Os mastócitos possuem receptores de alta afinidade para IgE (FcεRI) na sua
superfície. Estes receptores são intercruzados quando um antígeno multivalente se liga
as IgEs que estão ligadas aos receptores FcεRIs . Isto resulta em uma cascata de eventos
intracelulares que culmina com a desgranulação dos mastócitos. Durante a
desgranulação os mastócitos liberam mediadores pré-formados como enzima βhexosaminidase.
53
Para avaliar o efeito do AP na desgranulação, as células RBL-2H3 foram
sensibilizadas com IgE anti-TNP e incubadas com o AP nas concentrações que não
demonstraram efeitos citotóxicos (1, 10 e 100 µM). A incubação da célula com o
antígeno DNP-HSA originou o controle positivo. Os resultados mostraram que o AP,
nas três concentrações avaliadas, não foi capaz de promover a desgranulação dos
mastócitos, uma vez que, não houve liberação da enzima β-hexosaminidase (Figura
50
*
40
30
20
10
A
P
1
uM
A
P
uM
10
10
0
uM
SA
PH
+
D
N
an
ti
T
an
ti
TN
P
E
Ig
E
Ig
A
P
0
N
P
% da atividade de B-hexosaminidase liberada
14).
Figura 14. Efeito do AP sobre a desgranulação dos mastócitos. Células da linhagem
RBL-2H3 foram sensibilizadas com IgE anti-TNP, incubados com AP por um período
de 45 minutos, nas concentrações de 1, 10 e 100 µM . No controle positivo as células
foram incubadas com DNP-HSA. A atividade de β-hexosaminidase liberada foi
determina pela mensuração do produto da reação a 405 nm. Representa 3 experimentos
independentes, * indica a diferença estatisticamente significante entre os demais grupos
( p< 0,05).
54
Para avaliar o efeito do AP na inibição da liberação de β-hexosaminidase, as
células foram sensibilizadas com IgE-anti TNP e tratadas com o AP (1, 10, 100 µM) por
45 minutos e incubadas com DNP-HSA por mais 45 minutos. Após este período, a
atividade da enzima β-hexosaminidase liberada foi avaliada. Os resultados mostraram
que nas concentrações utilizadas o AP não tem a capacidade de inibir a desgranulação
% da atividade de B-hexosaminidase liberada
dos mastócitos via FcεRI (Figura 15).
50
40
30
20
10
*
A
P
uM
1
10
uM
A
P
A
P
uM
10
0
DN
+
TN
P
Ig
E
an
ti
Ig
E
an
ti
T
PH
SA
NP
0
Figura 15. Efeito do AP sobre a inibição da liberação da enzima β-hexosaminidase.
Células da linhagem RBL-2H3 foram sensibilizadas com IgE anti TNP e incubadas por
45 minuntos com o AP nas concentrações de 1, 10, 100 µM. A seguir, as células foram
incubadas com DNP-HSA. A atividade de β-hexosaminidase liberada foi determina pela
mensuração do produto da reação a 405 nm. Representa 3 experimentos
independentes,* indica a diferença estatisticamente significante entre os demais grupos
(p< 0,05).
55
4.2.3. Investigação do efeito do AP na ativação dos fatores de transcrição
Quando os mastócitos são ativados via FCεRI ocorre a ativação do fator de
transcrição NF-kB que está presente no citoplasma como um heterodímero ativo (p50,
p65 e subunidades IkBα). Com a ativação dos mastócitos via FcεRI os membros da
família da proteína quinase C degradam os IkBs, permitindo o translocamento do NFkB para o núcleo e sua ligação à regiões regulatórias de genes envolvidos com a síntese
de citocinas envolvidas em processos inflamatórios (Marquart & Walker, 2000). A
capacidade do AP em ativar o fator de transcrição NF-kB foi avaliada com a linhagem
celular GFP-repórter NFkB2. Os resultados obtidos com microscopia de fluorescência e
com citometria de fluxo mostraram que a exposição ao AP não foi capaz de induzir a
ativação do fator de transcrição NF-kB como mostram as Figuras 16 e 17.
Ativação de NF-Κ
ΚB
100
*
% GFP (+)
80
60
40
20
P-
10
0
H
µM
P
D
@
E
Ig
Ig
E
@
D
D
NP
N
P
+
+
A
P.
DN
@
E
Ig
P.
A
N
10
0µ
M
SO
M
D
+
M
ei
o
SA
0
Figura 16. Efeito do AP sobre o fator de transcrição NF-kB. Os resultados da
citometria de fluxo mostram que o AP não ativa o fator de transcrição NF-kB.
Representa 3 experimentos independentes,* indica a diferença estatisticamente
significante entre os demais grupos (p< 0,05).
56
IgE-anti TNP + (DNP-HSA)
Células NFKB2
AP 100 µM
IgE-anti TNP
IgE-anti TNP + AP 100 µM
Figura 17. (A) Microscopia de fluorescência mostra as células NFkB2 sensibilizadas
com IgE-anti TNP + (DNP-HSA); (B) Células da linhagem NFkB2; (C) Células da
linhagem NFkB2 sensibilizadas com IgE- anti TNP; (D) Células da linhagem NFkB2
incubadas com AP
concentração 100 µM (E)
Células da linhagem NFkB2
sensibilizadas com IgE-anti TNP e incubadas com AP na concentração de 100 µM.
Somente as células NFkB2 sensibilizadas com IgE-anti TNP + (DNP-HSA), apresentou
expressão de GFP+.
Quando os mastócitos são ativados via FCεRI também ocorre a ativação do fator
de transcrição de células T ativadas (NFAT) que está presente no citoplasma da célula.
A sinalização de cálcio é essencial para ativação do NFAT. A calcineurina desfosforila
uma região rica em serina no NFAT levando a uma sinalização que resulta na
translocalização do NFAT para o núcleo.
A linhagem celular GFP-repórter VB9 foi utilizada para avaliar se o AP é capaz
de levar a ativação do fator de transcrição NFAT. Os resultados de microscopia de
57
fluorescência e citometria de fluxo demonstram que o AP não promove a ativação do
fator de transcrição NFAT como mostrado nas Figuras 18 e 19.
Ativação de NFAT
50
*
% GFP (+)
40
30
20
10
A
P.
+
+
Ig
E
@
D
N
P
D
N
P
@
Ig
E
10
0µ
M
H
SA
D
N
P-
D
N
P
@
Ig
E
10
0µ
M
A
P.
M
ei
o
+
D
M
SO
0
Figura 18. Efeito do AP sobre o fator de transcrição NFAT. Os resultados de citometria
de fluxo mostram que o AP não ativa o fator de transcrição NFAT. Representa 3
experimentos independentes,* indica a diferença estatisticamente significante entre os
demais grupos ( p< 0,05).
58
IgE-anti TNP + (DNP-HSA)
Células V9
AP 100 µM
IgE-anti TNP
IgE-anti TNP + AP 100 µM
Figura 19. (A) Microscopia de fluorescência mostra as células V9 sensibilizadas com
IgE-anti TNP + (DNP-HSA); (B) Células da linhagem V9; (C) Células da linhagem V9
sensibilizadas com IgE- anti TNP; (D) Células da linhagem V9 incubadas com AP
concentração 100 µM (E) Células da linhagem V9 sensibilizadas com IgE-anti TNP e
incubadas com AP concentração 100 µM. Somente as células V9 sensibilizadas com
IgE-anti TNP + (DNP-HSA), apresentou expressão de GFP+..
4.2.4. Efeito do AP sobre a permeabilidade vascular em camundongos
Em estudos in-vivo a resposta inflamatória é acompanhada dos sinais clínicos de
vermelhidão, edema, hiperalgia e dor. A resposta inflamatória ocorre em diferentes
fases onde ocorre a vasodilatação e aumento da permeabilidade capilar e presença de
fagócitos e leucócitos no local lesionado.
Na inflamação, a vasodilatação e o aumento da permeabilidade vascular na
microcirculação conduzem a uma taxa acelerada de proteínas plasmáticas na direção do
tecido extravascular, definida como exsudação (Udaka et al., 1970). Esse processo
59
fisiológico é muito importante na limitação e contenção da agressão, pois dilui o agente
agressor, facilita a sua retirada do local e traz para o interstício imunoglobulinas,
complemento e outras macromoléculas envolvidas na inibição ou mesmo na destruição
de certos agressores, assim como na modulação da própria resposta inflamatória
(Montenegro & Fecchio, 1992).
A carragenina utilizada como controle positivo tem como característica, produzir
inflamação por liberação de prostaglandinas. Pelos nossos resultados (Figura 20) podese observar que a administração do AP na concentração de 50 mg/kg influencia
40
*
30
*
*
20
10
ie
nó
ic
o
Á
ci
do
Pi
m
Pi
ri
ar
ad
la
m
id
in
in
C
ar
ra
ge
n
tr
o
on
C
a
a
0
le
Corante Extravasado ( µ g/ml)
significantemente na diminuição do processo inflamatório in vivo.
Figura 20. Efeito da administração via IP do AP (50 mg/kg) sobre a permeabilidade
vascular. Como controle negativo foi utilizado soro fisiológico. A administração da
carragenina e pirilamidina foi realizada por via IP nas concentrações de 300 µg/ml e 20
mg/kg servindo como controle positivo e negativo respectivamente. Observa-se que no
grupo tratado com AP ocorreu efeito anti-inflamatório. Grupo de 5 animais por grupo, *
indica a diferença estatisticamente significante entre os grupos (p< 0,05).
60
5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
5.1. Elucidação estrutural do AP
No espectro de RMN 1H (Figura 10) é possível observar a presença de três
singletos em δ 0,65, 1,00 e 1,25 (3H cada) atribuídos respectivamente aos hidrogênios
das metilas H-20, H-17 e H-18. Pode-se observar também um singleto largo (1H) em δ
5,14 atribuído ao hidrogênio da dupla endocíclica (H-14), um duplo-dupleto (1H) em δ
5,70 atribuído ao H-15 (J15-16 cis = 10,2 Hz e J15-16 trans = 16,3 Hz) e dois outros duplodupletos integrados para 1H cada em δ 4,91 e 4,95 atribuídos aos hidrogênios H-16a e
H-16b da ligação dupla exocíclica (J16a-16b = 2,1Hz e J15-16 cis = 10,2 Hz e J15-16 trans =
16,3 Hz).
Por sua vez, no espectro de RMN 13C (Figura 11) observa-se a presença de 20
sinais, destacando-se o sinal do carbono C-19 (carbonila do grupamento ácido) em δ
184,7 e dos carbonos C-16, C-14, C-8 e C-15 respectivamente em δ 112,9, 127,9, 138,0
e 147,1. Os dados de RMN 1H e 13C foram comparados com os previamente publicados
em literatura (Tabelas 3 e 4 respectivamente), permitindo assim confirmar a estrutura
química do ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico.
Tabela 3. Dados de RMN 1H do AP (400 MHz, CDCl3, multiplicidade).
Hidrogênio
Shibata et al., 1967
AP
H-14
5,16 singleto
5,14 singleto largo
H-15
5,72 quintupleto
5,70 duplo-dubleto
H-16ª
4,81-5,00 multipleto
4,91 duplo-dubleto
H-16b
4,81-5,00 multipleto
4,95 duplo-dubleto
H-17
1,00 singleto
1,00 singleto
H-18
1,27 singleto
1,25 singleto
H-20
0,66 singleto
0,65 singleto
61
Tabela 4. Dados de RMN 13C do AP (100 MHz, CDCl3).
Carbono
Matsuo et al., 1976
AP
C-1
39,3
39,2
C-2
19,3
19,2
C-3
38,0
37,9
C-4
44,1
44,0
C-5
56,2
56,2
C-6
24,2
24,1
C-7
35,8
35,8
C-8
137,9
138,0
C-9
50,6
50,5
C-10
39,3
39,2
C-11
19,6
19,6
C-12
36,5
36,5
C-13
38,5
38,5
C-14
124,0
127,9
C-15
147,2
147,1
C-16
112,9
112,9
C-17
29,4
28,8
C-18
29,2
28,6
C-19
184,5
184,7
C-20
13,9
13,4
5.2. Ensaios biológicos
Durante as reações alérgicas ou processos inflamatórios os mastócitos são
ativados, o que leva à sua desgranulação (Benoist & Mathis, 2002). O cromoglicato de
sódio (Okayama et al., 1992), por exemplo, é utilizado como um estabilizador dos
mastócitos evitando a sua desgranulação. A ativação dos mastócitos humanos através do
62
receptor para IgE altera significativamente a expressão de mais de 2400 genes, sendo
muitos deles com funções inflamatórias (Masuda & Shimitz, 2008).
O uso de fármacos que antagonizam a produção ou ação de mediadores alérgicos
é uma estratégia muito comum nas terapias que tratam patologias desencadeadas pela
ativação dos mastócitos. Uma vez ativado, os mastócitos liberam vários mediadores
inflamatórios (Dvorak , 1997; Galli, 2005). Fatores pré-formados como histamina,
serotonina, TNF-α, e proteases ficam armazenadas nos grânulos dos mastócitos e são
liberadas logo após a ativação dessas células. Leucotrienos (LT), prostaglandinas e
fatores de ativação (PAF) são gerados logo após a ativação dos mastócitos originadas do
metabolismo do ácido araquidônico devido à ativação da fosfolipase A2. Várias
citocinas, como por exemplo a IL-1, 2, 5, 6, 8, 9, 13 e o TNF, denominados fatores neosintetizados são identificados 8 a 12 horas após a ativação dos mastócitos (Castells et
al., 2001). Portanto, encontrar entidades químicas que modulem o processo de
desgranulação de mastócitos poderá trazer benefícios tanto durante as alergias quanto
durante o processo inflamatório.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito biológico do AP em
mastócitos. A histamina é uma amina biogênica presente nos grânulos dos mastócitos,
dentre os efeitos da histamina destacam-se a vasodilatação e aumento da permeabilidade
vascular. Nos grânulos dos mastócitos, encontra-se a enzima lisossomal βhexosaminidase, onde a quantificação da atividade da β-hexosaminidase liberada é
frequentemente utilizada como metodologia para analisar e determinar a extensão da
desgranulação dos mastócitos (Lundequist & Pejler, 2011). Os resultados mostraram
que este metabólito AP. não causa a ativação dos mastócitos pelo intercruzamento dos
receptores de alta afinidade FcεRI, levando à desgranulação dos mastócitos, uma vez
que, pelo ensaio que quantificou a enzima β-hexasaminidase liberada dos grânulos dos
63
mastócitos e pelos dados obtidos não houve a liberação da enzima β-hexosaminidase.
Ainda, o AP não inibe a ativação dos mastócitos via FcεRI de acordo com os resultados
observados. É importante destacar que a desgranulação dos mastócitos leva a uma série
de eventos, tais como o aumento no cálcio intracelular que leva a desgranulação dos
mastócitos, liberando citocinas e interleucinas (Siraganian, 2003). Essas citocinas e
interleucinas desempenham papel fundamental na resposta inflamatória. As funções
efetoras dos mastócitos na sinóvia sugerem sua participação em diversas vias
inflamatórias da artrite, incluindo o recrutamento de leucócitos, ativação e hiperplasia
de fibroblastos, angiogênese e destruição da cartilagem e do osso (Nigrovic et al.,
2005). Com a ativação do mastócito, também resulta na ativação do NF-kB (nuclear
fator kB) um fator de transcrição que leva a produção de citocinas inflamatórias
(Marquardt & Walker, 2000). Muitos estímulos foram identificados capazes de ativar o
NF-kB incluindo agentes biológicos (vírus) e substâncias químicas (forbol) (Baeuerle
& Henkel.1994). Estes estímulos parecem agir diretamente ou indiretamente ativando
proteínas quinases que levam a fosforilação de IκB (Chen and Parent., 1996).
Os dados obtidos com esse trabalho sugerem que o AP também não interfere na
ligação dos antígenos à IgEs que estão ligadas ao receptor. Sendo assim o AP não leva a
ativação ou inibição dos mastócitos e a liberação das substâncias farmacologicamente
ativas contidas nos seus grânulos.
Com a ativação dos mastócitos via FcεRI os membros da família da proteína
quinase C degradam os IkBs permitindo o translocamento do NFkB para o núcleo e sua
ligação à regiões regulatórias de genes envolvidos com a produção de citocinas
envolvidas na inflamação (Basu & Fenton, 2004). Utilizamos células da linhagem
NFkB2, geradas a partir de células RBL-2H3 pela transfecção estável com plasmídeos
contendo o gene repórter GFP, cuja expressão depende da ativação de NF-kB. Os
64
resultados obtidos por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência mostram que
não houve a expressão de GFP e, portanto, não ocorreu a ativação do fator de
transcrição de NF-kB.
Com relação ao NFAT, utilizamos a linhagem VB9. Esta linhagem foi gerada a
partir de células RBL-2H3 através da transfecção estável com plasmídeos contendo o
gene repórter GFP, que é expresso quando a via NFAT é ativada (Grodzki et al., 2009).
Como a ativação dos mastócitos resulta no aumento do cálcio intracelular que ativa a
serina-fosfatase calcineurina e, por consequência, promove a desfosforilação do fator
nuclear de células T ativadas (NFAT), expondo o sinal de localização nuclear e
promovendo o deslocamento para o núcleo (Monticelli & Rao, 2002). O domínio de
homologia REL de NFAT liga-se a sequências específicas de DNA e com outros fatores
transcricionais que induzem a expressão de citocinas como TNF-α e a IL-3 (Hogan et
al., 2003). Quando a via NFAT é ativada em células da linhagem VB9, ocorre à
expressão do GFP (Grodzki et al, 2009). Os resultados obtidos por citometria de fluxo e
microscopia de fluorescência indicam que não houve a expressão de GFP, sendo assim
não causou a ativação do fator de transcrição de NFAT. Esses resultados sugerem que o
AP não promove a produção de fatores neo-sintetizados, como citocinas e interleucinas
( TNF-α e IL3) e ainda confirmam a não ativação do mastócito pela via FcεRI e também
não leva a ativação dos fatores de transcrição NF-kB e NFAT, sendo que podemos
concluir que não ocorre a produção dos fatores neo-sintetizados.
Com o objetivo de verificar o efeito biológico do AP no processo inflamatório
foi realizado o ensaio in-vivo de teste de permeabilidade vascular com azul de Evans em
camundongos em resposta a inflamação induzida pela carragenina. A amina vasoativa
histamina é importante para o início dos primeiros eventos da inflamação aguda, porque
medeia a resposta monofásica do aumento de permeabilidade. Para que tenha ação, a
65
histamina deve ligar-se aos receptores H1 presentes na célula endotelial. A ligação
destes receptores com histamina provoca contração das células endoteliais, produzindo
assim, espaços intercelulares por meio dos quais as proteínas plasmáticas atravessam
para o espaço intersticial (Trowbridge & Emling, 1996). Um dos mais específicos
antagonistas da histamina é a pirilamina (Bevan, 1979). Esta substância é um
antagonista H1 competitivo (não evita a liberação da histamina) causando inibição da
atividade constritora da histamina sobre a musculatura lisa não vascular, por
antagonismo competitivo e apresenta o maior grau de especificidade sobre receptores
H1 (Bonamim & Abel, 2002). Com a aplicação da pirilamina como antagonistas dos
receptores H1 e com o uso da carragenina como indutor de inflamação, foi possível
avaliar o potencial anti-inflamatório do AP. Com o grupo tratado com carragenina é
possível observar o aumento da permeabilidade vascular detectada pelo grande
extravasamento do azul de evans. Nos grupos tratados previamante com pirilamina e o
AP observou-se a diminuição estatisticamente significativa da permeabilidade vascular,
determinando a atividade anti-inflamatória do AP in vivo.
A carragenina é um complexo de polissacarídeos capaz de induzir uma resposta
inflamatória quando injetada por via subcutânea, envolvendo neste processo a presença
de
mediadores
químicos,
migração
de
células
de
defesa
(neutrófilos)
e
conseqüentemente o desenvolvimento da hipernocicepção (Morris, 2003; Cunha et
al.,2005). De uma maneira geral, o edema provocado por esta substância envolve a
presença de vários mediadores químicos que atuam em sequência para produzir uma
resposta que pode ser dividida basicamente em duas fases (Kumar et al. 2010).Em uma
primeira etapa ocorre o aumento da permeabilidade vascular em função da liberação de
histamina, serotonina e bradicinina (Kumar et al. 2010). A etapa subsequente deste
processo está associada ao aumento da produção de prostaglandinas (PGE), ativação da
66
ciclooxigentase-2 (COX-2) e com a liberação de óxido nítrico (NO). De acordo com os
nossos resultados é possível sugerir que o AP atua sobre o processo inflamatório
desencadeado por carragenina, demonstrando que a ação antiinflamatória está
relacionada aos processos mediados por produtos do metabolismo do ácido
araquidônico.
67
6. CONCLUSÕES
O presente trabalho investigou o efeito do ácido pimaradienôico sobre os
mastócitos, onde podemos concluir:
O AP foi re-isolado eficientemente do extrato em diclorometano das raízes de V.
arenaria;
A incubação do AP não promoveu a desgranulação dos mastócitos, e
consequentemente, a liberação dos mediadores contidos nos seus grânulos;
A incubação do AP não promoveu a ativação dos fatores de transcrição NFAT e
NF-kB em mastócitos.
No ensaio in-vitro avaliando o efeito do AP sobre a permeabilidade vascular de
camundongos, o AP apresentou diminuição significativa na permeabilidade vascular
sugerindo que apresenta atividade anti-inflamatória.
68
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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UNIFRAN - UNIVERSIDADE DE FRANCA
Núcleo de Pesquisas em Ciências Exatas e Tecnológicas
Av. Dr. Armando Salles de Oliveira, 201
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Contato:
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