information sheet 6 - Conidia Bioscience

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TEXTO INFORMATIVO 6
QUE “ATIVIDADE” É ESTA QUE VOCÊS MEDEM? COMO SE PODE MEDI-LA
EM MICROGRAMAS? E COMO ELA SE RELACIONA COM O QUE ESTÁ
ACONTECENDO NO INTERIOR DOS NOSSOS TANQUES?
O Que Ela Não É
Em primeiro lugar, deixe-nos confirmar para vocês o que esta Atividade
definitivamente não é – ela não é o peso do Hormoconis resinae na amostra. A
Atividade que nós medimos é, de fato, o peso de um composto que se encontra no
fungo quando cultivado em combustível, como explicaremos a seguir.
Atividade
Identificamos e isolamos anticorpos para um composto em particular (nós o
chamamos apenas de “Composto”) que aparece naturalmente em pequenas
quantidades no H. resinae, não importando onde ele cresça. Quando o H. resinae
cresce em combustível, no entanto, ele produz grandes quantidades deste
“Composto”. A quantidade de “Composto” que é produzida depende do nível de
crescimento do fungo – daí, a medição da Atividade. O “Composto” é liberado tanto
na fase do combustível, quanto na fase da água.
Para ilustrar isto, apresentamos várias fotos obtidas através de um microscópio
eletrônico, que nos foram tiradas por uma importante universidade no Reino Unido.
Para mostrar a Atividade, a Universidade adicionou etiquetas douradas aos nossos
anticorpos (simplesmente para que eles pudessem ser vistos pela câmara) e os
introduziu no fungo. Quando os anticorpos entram em contato com o “Composto” se
fixam a ele e podem ser observados como pequenos pontos pretos nas fotos. Todos
os anticorpos não anexados foram descartados antes que as fotos fossem tiradas .
Como se pode observar pela posição dos diferentes pontos, o “Composto” está
presente não só nas paredes das células, com também dentro da célula e nos
arredores. (Veja a foto 1).
Também fica claro na foto 2 que ainda que o “Composto” esteja presente em ambas
amostras de H. resinae, ele está como pano de fundo no fungo cultivado. Porém, ele
está bem mais visível na amostra que foi cultivada em combustível.
Foto 1 – Micrografias eletrônicas de H. resinae desenvolvido em combustível.
Diluição do anticorpo de 1:1000 (5.4µg/ml), mostrando uma alta densidade de
partículas douradas através da extensão completa do fungo. A área expandida
mostra detalhes da etiquetagem da parede e do citoplasma.
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Foto 2 – Micrografias eletrônicas de H. resinae cultivado em laboratório.
Amostra de cultura etiquetada com uma diluição de 1:100.000 de anticorpo policlonal de H. resinae e
anticorpo dourado antiovelha-10nm, mostrando a etiquetagem através das paredes da célula da hifa,
assim como um certo grau de mancha citoplasmática.
O aspecto importante que deve ser observado é que o “Composto” se espalha por
toda a parede celular, pelo citoplasma e pelos arredores, quando se desenvolve em
combustível. Normalmente, neste tipo de teste de imunoanálise o anticorpo busca
um componente químico em particular na parte externa da parede da célula
(chamado Epitopo) ao qual se fixará. Se o nosso teste fizesse isto, correríamos o
risco de detectar H. resinae ainda que se fosse apenas viável (ou seja, sem estar
em crescimento), ou que estivesse morto (um erro comum neste tipo de teste) ou
mesmo que tivesse crescido fora do combustível (e trazido para dentro por ação do
vento). PORÉM, como o “Composto” se encontra presente na totalidade do fungo e
nos seus arredores, (água e/ou combustível) podemos detectá-lo testando uma
amostra de combustível extraída de um tanque. Ele também se degrada
rapidamente e por conseguinte, se for detectado deve ser proveniente de um
organismo vivo, em desenvolvimento.
Peso
Nós provamos por meio de análise que um determinado nível de atividade de
crescimento tem como resultado a produção de una certa quantidade de
“Composto”. Em poucas palavras, os microgramas (µg) de “Composto” se
relacionam diretamente a um nível de “Atividade” de crescimento.
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Para ilustrar esta idéia, nós preparamos várias amostras de combustível e nelas
adicionamos determinadas doses de “Atividade”, conforme a medição do ELISA
(teste de imunoanálise enzimático), que nos deu uma curva de calibragem. O
próximo passo foi pegar uma grande quantidade de amostras reais de combustível
contaminado e compará-las à tabela de calibragem.
A tarefa final do laboratório foi então contrastá-las com os níveis Moderados e Altos
de contaminação que são aceitos pelas linhas aéreas, e ajustar os nossos
Dispositivos Laterais de Fluxo (DLF) para estes níveis. No primeiro momento, nós
ajustamos os níveis dos DLFs de acordo com nossa calibragem. No entanto, o
feedback dos nossos primeiros clientes sugeria que o DLF Alto estava ajustado
num ponto alto, mas que nós o tínhamos baixado. Isto permite aos engenheiros
detectar maiores contaminações bem mais cedo.
Um problema que nós tivemos com o processo de calibragem foi entre a medição
do peso µg à contagem UFC. O nosso problema foi que o sistema UFC é
inerentemente impreciso, quando se tem que determinar a quantidade de fungos
filamentosos. O problema advém do fato de os métodos tradicionais de cultivo
precisam capturar um elemento vivo e em crescimento do organismo presente na
amostra e depois coloca-lo em cultura. Se você capturar uma parte da hifa (a
raiz/haste do fungo) e as condições forem favoráveis, você irá criar uma colônia. Se,
no entanto, você capturar um corpo germinante (a conidia) então você irá criar 20,
30 ou talvez mais colônias – uma de cada semente – e todas da mesma e única
espécie de fungo.
Para ilustrar este fato, nós incluímos no Anexo A um teste real IP 385, realizado por
nossos laboratórios credenciados pela ISO 17025 e pela UKAS em CAB
Internacional aqui em Egham. Os testes foram realizados em gasóleo marinho, ao
invés de querosene puro de avião . Os tanques de combustível marinho são mais
suscetíveis a contaminantes dispersos. Porém, o princípio se aplica ao dois tipos de
combustível. Neste teste, houve três amostras separadas, providenciadas pelo
cliente (mais um frasco de amostra Fuelstat usado). Cada amostra foi testada em
duplicidade, (nós as chamamos de i. e de ii. para facilitar a consulta). Ambas
amostras duplicadas foram testadas ao mês mo tempo, usando-se o método
tradicional IP385. O resultado para a primeira duplicidade foi NDPC no fungo
(Numeroso Demais Para ser Contado) – que significa um alto nível de
contaminação. O resultado para a outra duplicidade foi 1380 ufc/l, o que representa
um resultado insignificante de contaminação. Qual dos dois resultados é correto,
ninguém sabe! Uma porção da amostra, enquanto isso, foi injetada num frasco
contendo combustível esterilizado e deixado em incubação por 10 dias. No final de
10 dias a amostra foi examinada no microscópio. O resultado foi que nenhum
crescimento bacteriano ou fúngico era evidente. Disto, pode-se ver que o
crescimento fúngico encontrado no teste IP 385 era de fungos que não podiam se
desenvolver de forma alguma em combustível – eles tinham que esperar até que
eles fossem retirados do combustível (para o meio de crescimento IP 385) até que
eles pudessem se tornar ativos. O que isto significa para o cliente? Bem, se o
cliente tivesse aberto os tanques da aeronave, seguindo a orientação dos resultados
da subamostra 1, eles não teriam encontrado nada lá! Nenhuma contaminação!
Uma perda de tempo e de dinheiro!
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Como se relacionam os dois limites com o que está acontecendo nos nossos
tanques?
Tendo alcançado nossos níveis para as Linhas de Teste dos nossos DFLs Baixo e
Alto, foi um exercício matemático razoavelmente simples poder relacionar isto aos
Níveis de Atividade tanto na fase da água quanto do combustível de uma amostra,
baseados no peso e não na contagem de UFC. O fato mais importante aqui,
todavia, é lembrar que os limites determinados são baseados nos anos de
experiência acumulados pela OEM e pelos engenheiros das linhas aéreas, com
relação a este problema. Os limites de medição de Atividade do Fuelstat são
gráficos matemáticos precisos, conforme as Normas IATA. Mas, para todos os
efeitos práticos, eles devem ser considerados como tendo sido o fruto da
experiência de vários engenheiros de linhas aéreas.
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Anexo A para o Texto Informativo 7
EIB/23100 página 1 de 5
Ref. EIB/23100
Conidia Bioscience
Bakeham Lane,
Egham
Surrey TW20 9TY
Attn: Sr. George Tippett
1 de Dezembro de 2003
Relatório Confidencial
Sobre o Contrato EIB/23100
Data do Recebimento: 14/11/03
Conclusão: 01/12/03
Data do Início: 14/11/03
Data
da
1. Introdução
Quatro amostras foram recebidas para se isolar contaminantes fúngicos e
bacterianos. Testes Fuelstat foram realizados em três dentre elas.
2. Amostra
EIB Ref.
Ref. do Cliente/Descrição
23100/1
500ml Combustível gasóleo – [supressão
intencional] Filtro de Motor Port 13 de Novembro
2003 10:30.
intencional]
Filtro de Motor Starboard 13 de
Novembro 2003 10:30
intencional] Sistema de Transferência 13 de
Novembro 2003 10:30.
Amostra Fuelstat [supressão intencional] Res.
contendo 50ml de combustível.
Lote no. HR020-44103 Data de Expiração 27 de
Abril 2005
23100/2
23100/3
23100/4
3. Métodos
i.
Inspeção Visual
Em cada amostra foi verificado se havia sujeira e descoloração. Também
foi checado através de microscópio se havia fungos ou bactérias.
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ii.
Filtragem
Para as amostras 23100/1,2, e 3. quatro alíquotas de 50ml de cada
amostra foram filtradas, através de filtros de membrana pré-esterilizados
de poros tamanho 0.45 µm. Os filtros foram colocados diretamente em
duas lâminas de Agar com Extrato de Malte, contendo antibióticos (MA +
AB) e duas Agar Nutrientes (NA). As lâminas foram incubadas a 25˚C e
avaliadas em 3 e 7 dias.
iii.
Testes Fuelstat
Este teste foi realizado nas amostras 23100/1,2 e 3.
iv.
Teste na Vasilha de Combustível
Este teste foi realizado nas amostras 23100/1, 2 e 3. Para cada amostra, duas
vasilhas de boca larga com capacidade para 250ml foram cheias até
aproximadamente um terço da capacidade com uma solução Bushnell-Haas de
sais minerais e foram esterilizados em autoclave. 15ml da amostra foi adicionado
a cada uma das vasilhas. As vasilhas inoculadas foram incubadas à temperatura
de laboratório por 10 dias.
v.
Preparação Direta de Lâminas (23100/4)
Duas alíquotas de 0.1 ml da camada azul na base do frasco da Fuelstat
foram espalhados diretamente nas lâminas Agar com Extrato de Malte,
contendo antibióticos (MA + AB). As lâminas foram incubadas à 25˚ C e
avaliadas em 3 e 7 dias.
4. Resultados
i.
Inspeção Visual
23100/1 A amostra era cor-de-rosa com um ocasional pedacinho de
sujeira, visível a olho nu. Nenhum resíduo microbiano foi visto sob
ampliação.
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23100/2 A amostra era cor-de-rosa e clara, sem sujeira visivelmente
aparente a olho nu ou sob ampliação.
23100/3 A amostra era limpa, tinha um cor-de-rosa escuro e sem sujeira
visível a olho nu ou sob ampliação.
ii.
Filtragem
Amostra
Filtragem de ufc/50ml
23100/1
MA + AB
i
ii
NA
23100/2
MA + AB
NA
23100/3
MA + AB
i
ii
i
i
ii
i
ii
NA i
ii
Contagem de Colônia
ufc/l
NDPC*Colônias Fúngicas
5 Levedos
69 Colônias Fúngicas
2 Levedos
NDPC Colônias Fúngicas
100 Levedo
40 Levedo
>138 Colônias Fúngicas
40 Levedo
34 Levedo
800 Levedo
680 Levedo
NDPC* = Numeroso Demais Para ser Contado
O H. resinae não foi isolado de nenhuma das amostras.
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4. Resultados (continuação)
iii.
Testes Fuelstat
23100/1 Resultado Fuelstat = Negativo
iv.
Teste da Vasilha de Combustível
Após 10 dias, sob análise, nenhuma das vasilhas apresentou
qualquer descoloração da solução de sais minerais. Não houve
qualquer traço de crescimento bacteriano ou fúngico visível a olho nu
ou sob ampliação.
v.
Preparação Direta de Lâminas
23100/4 Nenhum organismo resistiu após 7 dias de incubação.
5. Commentários
Os resultados das amostras 1 e 2, usando-se os métodos “tradicionais” de
cultivo apresentariam motivos para preocupação. No entanto, como os
organismos eram incapazes de se desenvolver no combustível quando testados,
eles eram, na verdade, contaminantes dispersos e os resultados de Fuelstat
foram precisos.
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Relatório preparado por:
Transcrição
verificada
Debra Atkin
Autoridade Científica
Sharon Livingstone
Gerente de Qualidade
por:
Assinado (para CAB International) por
Dr. Joan Kelley
Chefe de Departamento, Biologia Ambiental & Industrial
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