universidade federal de santa catarina centro tecnológico programa

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO TECNOLÓGICO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE
ALIMENTOS
BEATRIZ DE CÁSSIA MARTINS SALOMÃO
DETECÇÃO DE PATULINA E DESINFECÇÃO DE MAÇÃS
DESTINADAS À PRODUÇÃO DE SUCO
Florianópolis,
maio de 2009
BEATRIZ DE CÁSSIA MARTINS SALOMÃO
DETECÇÃO DE PATULINA E DESINFECÇÃO DE MAÇÃS
DESTINADAS À PRODUÇÃO DE SUCO
Tese submetida ao Curso de Pós-Graduação
em Engenharia de Alimentos como requisito
parcial para obtenção do Grau de Doutor em
Engenharia
de
Alimentos.
Área
de
Concentração: Desenvolvimento de Processos
da Indústria de Alimentos
Orientadora: Profa. Dra. Gláucia M. F. Aragão
Co-orientador: Prof. Dr. Randy W. Worobo
Co-orientadora: Profa. Dra. Pilar Rodriguez de
Massaguer
Florianópolis,
maio de 2009
“Quanto mais o indivíduo aprende, tanto
mais útil se torna para si e para a
sociedade”
(José Ingenieros)
“Nem que seja para fazer alfinetes, o
entusiasmo é indispensável para sermos bons
no nosso ofício”
(Denis Diderot)
“Transportai um punhado de terra todos os
dias e fareis uma montanha”
(Confúcio)
Dedico todo o esforço empregado na
execução deste trabalho ao meu pai Issa
Miguel, à minha mãe Ana Maria e à minha
tia Zélia que sempre apoiaram meus estudos,
pois acreditaram que este seria o caminho
para o meu sucesso
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todas aquelas pessoas que direta ou indiretamente me
ajudaram na execução deste trabalho:
À minha amiga e orientadora Gláucia que não só me incentivou na
execução deste trabalho, mas que também me ensinou a sempre enfrentar
as dificuldades com otimismo. Seu companheirismo incondicional foi
fundamental para que eu pudesse atingir meus objetivos.
À minha co-orientadora Pilar que dividiu comigo seu vasto
conhecimento e muito me ensinou.
Ao meu co-orientador Randy que me abriu as portas da
Universidade de Cornell e me deu a oportunidade de conhecer um mundo
novo e realizar um grande sonho, além de ter acreditato no meu potencial.
Ao John que é, sem dúvida, uma das pessoas mais generosas que já
conheci e que me acolheu com amizade e carinho, além de ter me
ensinado muito.
À minha amiga e companheira Chalana que esteve comigo durante
três anos na execução deste trabalho sempre agindo com total
responsabilidade, dedicação, inteligência e entusiasmo.
À Juliana que diretamente me ajudou na execução deste trabalho.
Aos professores membros da banca examinadora (João, Nélio,
Maria Antônia e Cleide) que se dispuseram a me ajudar na avaliação e
correção deste trabalho.
Aos meus irmãos Laila e Luiz que sempre me ajudaram e torceram
pelo meu sucesso.
Ao meu marido Renato que me ajudou na elaboração deste trabalho
e me acompanhou durante meu estágio nos Estados Unidos.
À professora Olga que se interessou pelo meu trabalho e me
apoiou.
Aos colegas pelo apoio, carinho e amizade: Denise, Mônica,
Jaciane, Morgana, Suzane, Daniele, Márcia, Andréia, Andréia P., Beatriz,
Jorge, Kelin, Manuela, Gisanara, Andréia Tremarin, Luiza, Américo,
Sabrina, Felipe, Ricardo, Siannah, Francieli, Bruna, Rose Marie,
Franciny, Francielo, Carmen, Bruno, Vanessa, Anderson e Adriana.
Ao Hudson que foi fundamental para que este trabalho se
concretizasse.
A todos os meus colegas do laboratório da Universidade de Cornell
que me ajudaram a enfrentar as dificuldades e com os quais dividi grande
amizade: David, Guoping, Hyungjae e Dulce Maria.
À Capes pelo apoio financeiro que foi fundamental para a execução
deste trabalho.
À Universidade de Cornell e à Estação Experimental de Agricultura
do Estado de Nova York por terem me recebido.
Ao CNPq pela bolsa de iniciação científica oferecida à Chalana.
Muito Obrigada!
Beatriz
RESUMO
Quase a totalidade do suco de maçã concentrado produzido no Brasil
(>90%) é destinado à exportação. As maçãs não qualificadas para o
consumo in natura são utilizadas para a produção de suco. Assim sendo,
a boa qualidade da matéria-prima deve ser garantida de forma a se obter
um produto que atenda aos rígidos padrões internacionais. Bactérias e
fungos podem ser potenciais contaminantes do suco de maçã. Os fungos
termorresistentes, como Byssochlamys spp., estão entre os microorganismos relevantes para os sucos de fruta termoprocessados devido à
sua capacidade deteriorante associada à produção de toxinas. As
bactérias termoacidofílicas do gênero Alicyclobacillus podem produzir
substâncias, como o guaiacol, que são responsáveis pela produção de
odores “medicinais” ou “antissépticos” nos sucos de frutas embalados.
Penicillium expansum é o mais importante contaminante das maçãs e é
também o responsável por causar “podridão azul” nestas frutas. Patulina
(PAT) é uma micotoxina termoestável, produzida principalmente por
este fungo e também por Byssochlamys spp. Estudos apontam que esta
toxina pode causar severos efeitos crônicos e agudos em humanos. As
agências regulatórias internacionais recomendam um nível máximo de
50 µg/L (ppb) para suco de maçã. Assim sendo, o objetivo geral deste
trabalho foi a detectação da patulina em maçãs e avaliação do processo
de lavagem/desinfecção das frutas destinadas à produção de suco. O
levantamento inicial mostrou que P. expansum, Byssochlamys fulva e
Alicyclobacillus acidoterrestris são os micro-organismos de maior
relevância no processo produtivo. Os testes de desinfecção mostraram
que o sanitizante clorado dicloroisocianurato de sódio foi mais efetivo
que ácido peracético contra P. expansum. Porém, nenhum dos
sanitizantes foi eficiente contra os esporos de A. acidoterrestris e
B. fulva. Quando hipoclorito de sódio foi testado na redução de esporos
de P. expansum, a eficácia aumentou com o decréscimo do pH. Os
modelos de Bigelow e de Weibull foram os mais adequados em
descrever a inativação de P. expansum pelo calor e por cloro,
respectivamente. Todas as variedades de maçãs inoculadas com
P. expansum desenvolveram deterioração sob 11°C e 20,5°C, exceto
Red Delicious e Empire. Os maiores níves de PAT ocorreram nas
variedades Golden Supreme e McIntosh. Verificou-se que PAT não está
presente nas frutas durante o período da safra. Entretanto, 86% dos lotes
avaliados na entressafra apresentaram níveis de PAT superiores a
50 ppb. O plano de amostragem para a avaliação das frutas durante o
recebimento sugeriu a retirada de uma amostra de 50 maçãs por lote,
sendo estabelecido o critério de rejeição quando mais que 8 maçãs
podres forem encontradas. São consideradas podres as frutas que
apresentarem podridão característica de tamanho superior a 4 cm ou
com visível desenvolvimento do “fungo azul” (P. expansum). A etapa
de lavagem das frutas com água sob alta pressão reduziu os níveis de
PAT em 64 a 100%, entretanto, transferiu a toxina para a água. Os
tratamentos com dicloroisocianurato de sódio provaram ser eficientes
para reduzir 100% da PAT em solução aquosa. Pode-se concluir que
este sanitizante, mesmo quando usado em baixas concentrações
(25 ppm), foi eficiente tanto para reduzir PAT, quanto esporos de
P. expansum, sendo recomendado para as operações de manejo e
lavagem das frutas. Os resultados deste estudo podem causar impacto
direto na redução de PAT no suco de maçã, diminuindo assim os riscos
à saúde do consumidor e trazendo muitos benefícios para a indústria
processadora, além de torná-la mais competitiva no mercado
internacional.
Palavras-chave: Patulina; PAT; Desinfecção de maçãs; Indústria de
alimentos.
ABSTRACT
The majority of concentrated apple juice produced in Brazil (>90%) is
destined for exportation. Apples rejected for the fresh fruit consumption
market are used for juice processing. The quality of this raw material
should be attained in order to obtain a juice under the rigid international
standards. Heat resistant molds and the thermoacidophilic bacterium
from Alicyclobacillus genus are among the microorganisms of
importance for heat-processed fruit juices, such as apple juice. Some
species of heat resistant molds, such as Byssochlamys spp., are able both
to deteriorate packaged fruit juice and to produce mycotoxins.
Alicyclobacillus causes medicinal off-flavors in packaged fruit juices.
Penicillium expansum is the most important contaminant in apples and
is responsible for “blue mold rot” in those fruits. Patulin (PAT) is a
thermal stable mycotoxin produced primarily by this mold and also by
Byssochlamys spp. PAT has been shown to exhibit severe chronic and
acute effects in humans. The regulatory agencies have recommended a
PAT maximum level of 50 µg/L (ppb) for apple juice. Then, the aim of
this study was to detect PAT in apples and to assess the
washing/sanitizing treatments for apples destined for juice. In the initial
survey, P. expansum, Byssochlamys fulva and Alicyclobacillus
acidoterrestris was the most import microorganisms in the process. In
the disinfection test, the chlorine-based sanitizer sodium
dichloroisocyanurate was more efficient than peracetic acid against
P. expansum spores. None of those sanitizers were efficient against
A. acidoterrestris and B. fulva spores. When sodium hypochlorite was
tested against P.expansum, the efficacy of chlorine solutions was
enhanced by decreasing the pH. For the modeling investigation, the
results showed that Bigelow and Weibull were the best models to
describe P. expansum thermal and sanitizer inactivation, respectivelly.
All P. expansum inoculated apple varieties incubated under 11°C and
20.5°C showed mold spoilage at both temperatures, except Red
Delicious and Empire. The highest PAT productions occurred in Golden
Supreme and McIntosh varieties. Findings showed that PAT was not
detected throughout the harvest season. However, 86% of lots from offseason yielded more than 50 ppb of PAT. The sampling plan developed
to evaluate the apples during the receiving step suggested to reject the
lot when more than 8 rotten fruits were found in a total of 50 apples,
because the risk of > 50 ppb of PAT in the final product. Rotten fruits
are those with size lesion > 4 cm or with visible “blue mold”
development. Wash treatments using high-pressured water reduced PAT
levels by 64 to 100%, but the toxin was transferred to the water.
Treatments using sodium dichloroisocyanurate proved to be efficient in
reducing 100% of PAT in aqueous solution. In conclusion, this sanitizer,
even at low concentration (25 ppm), is efficient to reduce both PAT and
P. expansum spores and should be recommended for apple handling and
washing treatments. This investigation provides direct impact in the
PAT levels for the final product which reduce the risk for healthy
consumers and help in the development of industry international
competitiveness.
Keywords: Patulin; PAT; Sanitizing for apples; Food industry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 - Fluxograma do processo de produção de suco de maçã .... 25
Figura 2.2 - Colheita da maçã ............................................................... 26
Figura 2.3 - Resfriador por circulação de água gelada (Hydrocooler) .. 27
Figura 2.4 - Etapas realizadas dentro das áreas de armazenamento das
frutas (packing houses): (a) Descarregamento das frutas
(dentro dos bins) nos tanques de água. (b) Condução das
frutas pelas calhas de água até as mesas de seleção. ......... 28
Figura 2.5 - Descarregamento das frutas industriais destinadas à
fabricação de suco. ............................................................ 29
Figura 2.6 - Etapa de lavagem das frutas destinadas à fabricação de
suco. .................................................................................. 30
Figura 2.7 - Equipamento de ultra-filtração do suco de maçã
concentrado ....................................................................... 31
Figura 2.8 - (a) Deterioração característica causada por
Penicillium expansum; (b) internalização do fungo; (c)
podridão característica do tecido da fruta.......................... 34
Figura 2.9 - Estrutura química da patulina ............................................ 41
Figura 3.1 - Sequência de análise: (a) secagem da fruta lavada, (b)
inoculação da suspensão do micro-organismo, (c) aplicação
a da solução sanitizante e (d) massageamento................... 64
Figura 3.2 - Variedades de maçãs: (a) Red Delicious, (b) Golden
Supreme, (c) Empire, (d) McIntosh, (e) Fuji e (f) Gala..... 66
Figura 3.3 - Preparação das amostras para as análises de patulina.
Procedimento descrito no item 3.6.5. (a; b) suco sendo
submetido ao tratamento enzimático; (c; d) filtragem do
suco ................................................................................... 77
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO......................................................... 19
CAPÍTULO 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................. 22
2.1 Maçã .................................................................................. 22
2.2 Suco de maçã ...................................................................... 23
2.3 Microbiologia das maçãs e do suco de maçã ............................. 32
2.3.1 Penicillium expansum em maçãs .......................................... 33
2.3.2 Fungos termoresistentes...................................................... 35
2.3.3 Alicyclobacillus ................................................................. 38
2.4 Patulina .............................................................................. 41
2.5 Desinfecção de maçãs ........................................................... 48
2.5.1 Agentes sanitizantes ........................................................... 49
2.6 Uso de modelos matemáticos para descrever a inativação de
esporos .............................................................................. 51
CAPÍTULO 3 MATERIAL E MÉTODOS...................................... 55
3.1 Metodologia utilizada no Artigo 1:Survey of molds and
Alicyclobacillus from a concentrated apple juice productive
process in Brazil .................................................................. 55
3.1.1 Amostragem ..................................................................... 55
3.1.2 Detecção e enumeração de bolores e leveduras ....................... 56
3.1.3 Detecção e enumeração de fungos filamentosos
termorresistentes .............................................................. 56
3.1.4 Enumeração e detecção de Alicyclobacillus spp. (ATSB) ......... 57
3.1.5 Estocagem das culturas ....................................................... 58
3.1.6 Identificação das cepas de fungos filamentosos isolados .......... 59
3.2 Metodologia utilizada no Artigo 2: Aplicação de dicloroisocianurato
de sódio e ácido peracético para redução de esporos de Penicillium
expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris na
superfície de maçãs e em soluções aquosas .............................. 60
3.2.1 Micro-organismos e preparo da suspensão de esporos.............. 60
3.2.2 Teste de ativação para os esporos de B. fulva CCT 0056 .......... 61
3.2.3 Determinação do tempo de subida da temperatura ................... 61
3.2.4 Preparo das soluções sanitizantes ......................................... 61
3.2.5 Teste sobre a superfície das maçãs........................................ 62
3.2.6 Teste em soluções aquosas .................................................. 64
3.2.7 Análise estatística dos dados................................................ 65
3.3 Metodologia utilizada no artigo 3: Efficacy of sanitizing
treatments against Penicillium expansum inoculated on six
varieties of apples ................................................................65
3.3.1 Preparação da suspensão de esporos de Pencillium expansum
CCT4680 .........................................................................65
3.3.2 Frutas ...............................................................................65
3.3.3 Inoculação na superfície das maçãs .......................................66
3.3.4 Preparo das soluções sanitizantes ..........................................66
3.3.5 Tratamento das maçãs .........................................................67
3.3.6 Análises estatísticas ............................................................67
3.4 Metodologia utilizada nos artigo 4: Modeling Penicillium expansum
resistance to thermal and chlorine treatments ............................68
3.4.1 Preparação da suspensão dos esporos de P. expansum
CCT 4680 ........................................................................68
3.4.2 Preparo das soluções sanitizantes à base cloro .........................68
3.4.3 Teste em soluções aquosas ...................................................68
3.4.4 Resistência térmica .............................................................68
3.4.5 Modelagem da inativação de P. expansum ..............................69
3.4.6 Comparação estatística dos modelos ......................................70
3.5 Metodologia utilizada nos artigo 5: Influence of storage
temperature and apple variety on patulin production by
Penicillium expansum ...........................................................71
3.5.1 Preparação da cultura de Pencillium expansum CCT4680 .........71
3.5.2 Frutas ...............................................................................71
3.5.3 Inoculação da suspensão nas frutas........................................71
3.5.4 Extração do suco das maçãs .................................................72
3.5.5 Análise de Patulina .............................................................72
3.5.6 Fermentação do suco de maçã ..............................................72
3.6 Metodologia utilizada nos artigo 6: Development of a sampling
plan at apple receiving step for patulin control in concentrated
apple juice ..........................................................................73
3.6.1 Estudo da seleção dos lotes (Etapa de recebimento das frutas) ...73
3.6.2 Estudo dos lotes hipotéticos (Etapa de recebimento das frutas) ..73
3.6.3 Estudo de lavagem e sanitização (Etapa de lavagem das frutas) .74
3.6.4 Análise do suco de maçã após prensagem (Etapa da prensagem) 75
3.6.5 Preparação das amostras para as analises de patulina ................76
3.6.6 Análises de patulina ............................................................76
3.6.7 Preparação das soluções estoque de patulina ...........................76
CAPÍTULO 4 RESULTADOS ......................................................... 78
4.1 Survey of molds and Alicyclobacillus from a concentrated apple
juice productive process in Brazil........................................... 79
4.2 Aplicação de dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético para
redução de esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e
Alicyclobacillus acidoterrestris na superfície de maçãs e em
soluções aquosas ............................................................... 101
4.3 Efficacy of sanitizing treatments against Penicillium expansum
inoculated on six varieties of apples ..................................... 127
4.4 Modeling Penicillium expansum resistance to thermal and chlorine
treatments ........................................................................ 137
4.5 Influence of storage temperature and apple variety on patulin
production by Penicillium expansum .................................... 152
4.6. Development of a sampling plan at apple receiving step for patulin
control in concentrated apple juice ....................................... 169
CAPÍTULO 5 CONCLUSÕES ....................................................... 192
CAPÍTULO 6 REFERÊNCIAS ...................................................... 194
ANEXO I ............................................................................... 224
1. Imagens de Penicillium expansum CCT 7549 nos meios de
identificação .................................................................. 224
2. Imagens da deterioração das maçãs causada pelo “fungo azul”
(P. expansum) ................................................................ 224
3. Imagem de esporos de A. acidoterrestris CCT 7548 .................. 225
4. Laudo de identificação das cepas de P. expansum e A. acidoterrestris
isolados do processo produtivo de suco de maçã concentrado 226
ANEXO II 1. Curva de ativação dos esporos de
Byssochlamys fulva CCT 0056............................................. 232
ANEXO III ............................................................................ 233
1. Meios de Cultura e reagentes utilizados ................................... 233
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
A cultura da maçã no Brasil é concentrada na Região Sul, sendo o
estado de Santa Catarina o maior produtor nacional da fruta (CEPA,
2008). No Brasil, quase toda a produção se concentra em duas
cultivares, a Gala e a Fuji (TODA FRUTA, 2003a). Diferentemente, os
Estados Unidos cultivam um maior número de variedades de maçã,
sendo que as principais são: Red Delicious, Empire, Fuji, Gala, Golden
Delicious, McIntosh, Granny Smith, Rome Beauty, Crispin, Jonagold e
Cortland (USA APPLE ASSOCIATION, 2005).
O Brasil não possui lavouras exclusivas destinadas à produção de
maçãs para o processo industrial, sendo que parte das frutas
desqualificadas para comercio in natura (15 a 30% de das maçãs
produzidas) é destinada ao processamento, principalmente de suco de
maçã. Em torno de 90% do suco de maçã produzido no país é
concentrado e destinado à exportação. O maior importador do suco de
maçã concentrado produzido no país são os Estados Unidos, que
destinam este produto à elaboração de suco reconstituído e produtos
infantis (NOGUEIRA et al., 2007).
Devido às características próprias da maçã, esta fruta apresenta
susceptibilidade à contaminação por alguns micro-organismos. Dentre
estes, o fungo P. expansum é reconhecido como o maior causador da
“podridão azul” que é a mais destrutiva de todas as podridões que
afetam as maçãs, principalmente durante a estocagem (JANISIEWICZL;
KORSTEN, 2002). Além disso, este é capaz de produzir nas frutas a
micotoxina patulina que representa um perigo potencial à saúde humana
por seus efeitos agudos e crônicos (HASAN, 2000).
Os problemas decorrentes da contaminação do suco de maçã
estão diretamente relacionados aos micro-organismos resistentes ao
calor, pois estes sobrevivem aos regimes usuais de pasteurização. Os
fungos termorresistentes são frequentemente implicados na deterioração
de produtos termoprocessados de frutas. Dentre os mais reportados pela
literatura, estão as espécies pertencentes aos gêneros Byssochlamys,
Neosartorya, Talaromyces e Eupenicillium (PITT; HOCKING, 1999;
SALOMÃO et al., 2008b). Além da sua capacidade deteriorante, estes
fungos ainda podem produzir micotoxinas. Dentre estas, destaca-se a
patulina que pode ser produzida por Byssochlamys fulva e
Byssochlamys nivea (TOURNAS, 1994; SANTÀNA, 2007). Durante
muito tempo, acreditou-se que os esporos de bactérias não teriam
20
habilidade para se desenvolver em alimentos ácidos, como os sucos de
frutas (SPLITTSTOESSER et al., 1994). Entretanto, em 1982, na
Alemanha, durante uma estação muito quente e prolongada, ocorreu
deterioração em suco de maçã durante sua distribuição e estocagem. O
suco apresentou um odor desagradável causado pela bactéria
identificada como Alicyclobacillus (CERNY et al., 1984; WISOTSKEY
et al., 1992). Espécies do gênero Alicyclobacillus são organismos
termoacidofílicos produtores de esporos extremamente termorresistentes
que, ao se desenvolverem dentro das embalagens de sucos podem causar
uma desagradável alteração no seu sabor e odor (cheiro “medicinal” e
“antisséptico”) (YOKOTA et al., 2007).
A garantia da qualidade do suco de maçã se dará principalmente
pelo controle destes micro-organismos e de seus metabólitos. Para tanto,
medidas devem ser implantadas desde as etapas inciais de obtenção da
matéria-prima até a industrialização final do produto. Uma importante
forma de eliminação destes micro-organismos envolve a
descontaminação das frutas a serem processadas (SAPERS et al., 2006).
Os produtos clorados estão entre os mais amplamente utilizados na
sanitização de frutas. O ácido peracético vem assumindo o papel de
substituto para compostos clorados e, portanto, também está sendo
utilizado nos processos de desinfecção de alimentos (ORR; BEUCHAT,
2000).
A produção de patulina gera grande preocupação pois esta
apresenta um amplo espectro de toxicidade (WHO, 1998), além de ser
relativamente estável ao processo de fabricação do suco de maçã. Os
Estados Unidos e a União Européia estipularam o limite máximo de
50 µg/L (ppb) de patulina no suco de maçã (CODEX, 2003a; FDA,
2001b). O Brasil não possui uma legislação vigente para regulamentar
esta toxina em alimentos, entretanto, considerando que quase a
totalidade da produção de suco concentrado de maçã é exportada, as
indústrias processadoras brasileiras necessitam pesquisar a qualidade
micotoxicológica de seus produtos a fim de se tornarem competitivas no
mercado internacional no fornecimento de alimentos seguros.
A eliminação de patulina das maçãs se faz principalmente pelo
controle do desenvolvimento de P. expansum durante a estocagem
destas frutas e nas etapas iniciais do processamento (JANISIEWICZL;
KORSTEN, 2002; FAO, 2003). Este fungo pode crescer e produzir
patulina em condições de refrigeração, o que salienta a importância no
cuidado do manejo das frutas a serem estocadas durante o período da
entressafra (SANHUEZA, 1996). Na indústria, o controle da qualidade
das frutas deve ser iniciado na recepção sendo também consideradas
21
medidas de controle do fungo as etapas posteriores de lavagem e seleção
das frutas (ACAR et al., 1998; SYDENHAM et al., 1995).
O objetivo geral deste trabalho foi a detectação da patulina em
maçãs e avaliação do processo de lavagem/desinfecção das frutas
destinadas à produção de suco. Para se atingir este objetivo geral, foram
estabelecidos os seguintes objetivos específicos:
• Realização do levantamento da microbiota do suco de maçã em
diferentes etapas do processamento e identificação dos microorganismos mais relevantes;
• Estudo a eficácia do dicloroisocianurato de sódio e ácido
peracético, visando a redução de micro-organismos alvo
encontrados no levantamento inicial tanto na fruta como em
solução aquosa;
• Desinfecção de seis diferentes variedades de maçã usando
hipoclorito de sódio acidificado e não acidificado e ácido
peracético, visando a redução de esporos de P. expansum;
• Avaliação da habilidade dos modelos de Weibull e Bifásico em
descrever a inativação dos esporos de P. expansum pela ação de
compostos clorados e a habilidade dos modelos de Bigelow e
Weibull em descrever a inativação térmica de P. expansum;
• Avaliação da influência da temperatura de estocagem na
produção de patulina produzida por P. expansum em seis
diferentes variedades de maçã;
• Levantamento da produção de patulina em maçãs no período da
safra e entressafra;
• Elaboração de um plano de amostragem para a seleção de lotes
de maçãs durante o recebimento de forma a garantir a produção
de suco dentro do nível máximo de 50 ppb;
• Avaliação da redução dos níveis de patulina durante os
processos de lavagem e sanitização da fruta.
CAPÍTULO 2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Maçã
A maçã (Malus domestica, Borkh.) é pertencente da família
Rosaceae, teve sua origem na Europa e Ásia e seu cultivo exige clima
temperado (TODA FRUTA, 2006). Considera-se que a maçã é a mais
importante fruta de clima temperado comercializada como fruta fresca,
tanto no contexto internacional quanto no nacional (MELLO, 2004). Em
virtude da sua composição nutricional, a maçã demonstra ser,
mundialmente, uma das frutas preferidas para o consumo sendo indicada
para a manutenção da saúde (STEINMETZ; POTTER, 1996;
SCIENCEDAILY, 2007).
As macieiras são cultivadas em todo o mundo, mas estão
especialmente concentradas no hemisfério norte. O fator determinante
no plantio das macieiras numa região depende do período de baixa
temperatura que é necessário para o repouso vegetativo e quebra de
dormência (BARRET et al., 2005).
Até a década de 60 a cultura das macieiras não teve expressão
econômica no Brasil. Entretanto, com o incentivo do Governo Federal
deu-se o surgimento dos primeiros pomares comerciais que se iniciaram
na região de Fraiburgo - SC e posteriormente no Paraná e Rio Grande do
Sul (TODA FRUTA, 2003c). O Brasil começou a aparecer nas
estatísticas internacionais na década de 1980, sendo que em 2001 atingiu
a auto-suficiência (TODA FRUTA, 2003b). Santa Catarina permanece
na liderança do ranking nacional, sendo responsável, de acordo com os
dados de 2007/2008, por aproximadamente 51,3% da produção total,
seguido por Rio Grande do Sul, com 44,8% (CEPA, 2008). Nestes
estados, a produção centraliza-se ao redor dos municípios de Fraiburgo e
São Joaquim em Santa Catarina e do município gaúcho de Vacaria.
(TOGNON; CABRAL, 2008).
A macieira é uma das árvores frutíferas que dispõe de um maior
número de variedades. Atualmente, são descritas em torno de 7.500
variedades, porém comercialmente poucas são utilizadas. No Brasil,
quase toda a produção se concentra em duas cultivares, a Gala e a Fuji
que representam em torno de 90% da área plantada (TODA FRUTA,
2003a). A cultivar Gala é a primeira a ser colhida, em fevereiro e a
colheita da Fuji se inicia em março (NOGUEIRA et al., 2004).
Diferentemente, os Estados Unidos cultivam um maior número de
23
variedades de maçã, sendo que as principais são: Red Delicious, Empire,
Fuji, Gala, Golden Delicious, Granny Smith, McIntosh, Rome Beauty,
Crispin, Jonagold e Cortland (USA APPLE ASSOCIATION, 2005).
De acordo com a FAO (2008), a produção mundial de maçã em
2007 foi de 64,2 milhões de toneladas de maçã. O Brasil ocupou o
décimo primeiro lugar na produção mundial, com 1,1 milhão de
toneladas, o que representa 1,7% da produção total. A China é a maior
produtor mundial, sendo que seus pomares produziram, em 2007, 27,5
milhões de toneladas, representando 42,8% de toda a produção. Os
Estados Unidos são o segundo maior produtor e colheram, em 2007, 4,2
milhões de toneladas ou 6,6 % do total.
As maçãs podem ser classificadas em comerciais ou industriais,
de acordo com a finalidade. As maçãs comerciais são consumidas
frescas (in natura) e, portanto, devem atender a padrões rígidos de
qualidade. Os Estados Unidos são um dos poucos países produtores de
maçã onde existem algumas lavouras específicas para frutas industriais
(THE WORLD APPLE REPORT, 2008). No Brasil, os pomares não
produzem frutas exclusivas para diferentes classes de maçãs. Assim, as
frutas chamadas industriais são resultantes de um processo de seleção e
classificação das frutas comerciais. Na comercialização das maçãs, a
etapa de classificação gera um descarte de 15 a 30% de frutas que não
alcançaram o padrão exigido para o consumo, apresentando algum
defeito de ordem física, fisiológica ou fitopatológica (NOGUEIRA et
al., 2007). Essas frutas fora do padrão comercial são direcionadas à
industrialização, para a elaboração, principalmente, de sucos que são
exportados na forma de concentrado (SEBRAE, 2008; NOGUEIRA et
al., 2007). O percentual de industrialização de maçãs no país tende a
aumentar, devido à demanda crescente pelo suco pronto para consumo
no mercado interno (SEBRAE, 2008). As maçãs industriais também são
usadas na fabricação de sidra, vinagre, purê, geléias, alimentos infantis e
demais produtos (SANTOS et al., 2005, NOGUEIRA et al., 2004). Nos
Estados Unidos, em torno de 40% toda maçã produzida é processada,
sendo que mais da metade é destinada à produção de suco (THE
WORLD APPLE REPORT, 2008).
2.2 Suco de maçã
O suco de maçã é definido como uma bebida não fermentada e
não diluída, obtida da parte comestível da maçã, através de processo
tecnológico adequado. A bebida deve possuir cor branca a translúcida,
24
sabor e aroma próprios, sólidos solúveis (20ºC) mínimo de 10,5ºBrix;
acidez total expressa em ácido málico mínima de 0,15 g/100 g; açúcares
totais naturais da maçã máximo de 13,5 g/100 g e acidez volátil em
ácido acético máxima de 0,04 g/100 g (BRASIL, 2000).
Existem basicamente dois tipos de suco de maçã, o clarificado e o
polposo (não clarificado ou turvo), sendo que ambos podem ser
fabricados concentrados (70ºBrix) ou não concentrados (BARRET et al.,
2005). Entretanto, é importante ressaltar que os sucos de frutas em geral
são principalmente comercializados no mercado global na forma
concentrada, pela facilidade de transporte e longa conservação (ROSA
et al., 2006). Outra bebida fabricada a partir da maçã é o chamado apple
cider. Este é produzido pela direta prensagem de frutas, não sendo
filtrado ou adoçado e permanecendo turvo, devido às finas partículas de
maçã em suspensão (BARRET et al., 2005). O apple cider pode tanto
ser consumido fresco, pasteurizado ou fermentado. Nos Estados Unidos,
este produto é principalmente consumido não fermentado (VALOIS et
al., 2006; DOWNING, 1989), sendo que o processo de pasteurização
pode tanto ocorrer por troca de calor (71°C/6-15 s) (FDA, 2004;
BARRET et al., 2005), como por aplicação de radiação ultravioleta UV
(14 mJ/cm2) (FDA, 2000).
No Brasil, o suco de maçã é pouco comercializado em função da
falta de hábito do consumidor brasileiro, bem como pela escassa
disponibilidade de produtos no mercado (ROSA et al., 2006). Cerca de
90% desse suco é concentrado para exportação, principalmente para os
Estados Unidos, que o destina à elaboração de suco de maçã (através da
reconstituição) e produtos infantis, uma vez que a matéria-prima se
constitui de variedades de mesa com baixos teores de ácidos e taninos e
elevados teores de açúcares, permitindo a elaboração de produtos
encorpados e de boa aceitação sensorial (NOGUEIRA et al., 2007).
No mercado internacional, o suco de maçã é o segundo mais
consumido (ROSA et al., 2006). Devido à alta demanda de consumo, os
Estados Unidos são o maior importador mundial de suco concentrado de
maçã. Sendo que neste país, as crianças são consideradas os maiores
consumidores (ABSOLUTEASTRONOMY, 2009). A China é o maior
produtor que conta com mais da metade de todo o suco de maçã
fabricado no mundo, além de garantir o título de maior exportador
mundial, atingindo, em 2008, aproximadamente 80% da exportação
global (USDA/FAS, 2009). Além da China, a Argentina e o Chile são
países com tradição no processamento de maçãs e grandes produtores
mundiais de suco além de concorrentes com o Brasil na exportação do
25
suco concentrado de maçã, principalmente para os Estados Unidos (THE
WORLD APPLE REPORT, 2008).
A produção do suco de maçã ocorre a partir do processamento
direto das frutas ou pela reconstituição do suco concentrado até o teor de
sólidos solúveis estipulado (BARRET et al., 2005). A Figura 2.1
apresenta um fluxograma geral do processo de fabricação do suco de
maçã concentrado clarificado (70ºBrix) e também do suco de maçã
clarificado produzido diretamente sem reconstituição (11,5ºBrix). A
seguir será feita uma descrição breve do processo que pode variar
dependendo da indústria.
Campo
Recepção no packing housea
Resfriamento das frutas em água geladab
Armazenamento 0ºC em ACc
Safrad
Transporte para a Fábrica
Recepção na Fábrica
Lavagem
Estocagem da fruta na Fábricae
Seleção
Moagem
Prensagem/ Extração do suco
Clarificação/Filtragem
Formulação
Pasteurização
Pasteurização
Concentração
Envase
Resfriamento 0ºC
Suco de maçã (11,5ºBrix)
Suco concentrado de maçã
(70ºBrix)
a
packing house é o nome dado aos armazéns onde as maçãs são estocadas durante os meses da
entressafra;
b
O resfriamento em água gelada circulante se dá no hydrocooler;
c
Muitas câmaras-frias possuem o sistema de atmosfera controlada (AC);
d
No período da safra, as frutas são encaminhadas diretamente para a fábrica e não vão para os
packing houses;
e
Em algumas indústrias ocorre a estocagem das frutas lavadas antes destas seguirem para as
etapas posteriores, porém, em outras indústrias essa estocagem não ocorre.
Figura 2.1 - Fluxograma do processo de produção de suco de maçã
26
As frutas são colhidas geralmente pelo método manual (Fig. 2.2)
para evitar danos mecânicos. As frutas caídas no chão, não devem ser
colocadas junto com as colhidas na planta. A colheita é realizada
utilizando sacolas de fundo falso, sendo as frutas depositadas em bins,
que são caixas feitas geralmente de madeira com capacidade para
comportar aproximadamente 350 a 400 kg. (TODA FRUTA, 2009).
Fonte: TRICITYHERALD, 2009.
Figura 2.2 - Colheita da maçã
Após a colheita, as frutas que não são qualificadas para a
utilização in natura são classificadas como frutas industriais. As demais
frutas são enviadas para beneficiamento e estocagem em áreas de
armazenamento (packing houses) (NOGUEIRA et al., 2007). O
fluxograma completo do processo do suco está esquematizado na
Fig. 2.1. e inclui tanto as etapas que envolvem o armazenamento das
frutas nos packing houses, como o processo de elaboração do suco na
fábrica. Todas as etapas serão detalhadas a seguir, sendo estas
destacadas pelas palavras em negrito.
Manejo das frutas no packing house: Durante a recepção no packing
house, as caixas contendo as frutas (bins) são descarregadas e levadas
para resfriamento no hydrocooler, que é um resfriador que trabalha por
circulação de água gelada a 0ºC (Fig. 2.3). Este resfriamento ocorre com
o objetivo de diminuir a temperatura das frutas que chegam do campo e
27
colocá-las em temperaturas próximas à de estocagem (BARRET et al.,
2005). Os bins contendo as frutas são levados ao hydrocooler onde
recebem um banho com água gelada durante aproximadamente 2030 min, causando assim o abaixamento da temperatura das frutas de
aproximadamente 25ºC para 3ºC (BRACKMANN et al., 1996). A água
do resfriador geralmente é clorada com hipoclorito de sódio em
concentração máxima de 25 ppm. Porém, cabe ressaltar que o circuito é
fechado e a água é trocada em torno de 2 vezes por turno, indicando que
o nível de cloro livre pode diminuir devido à inativação pela matéria
orgânica.
Fonte: Fischer S/A, 2006
Figura 2.3 - Resfriador por circulação de água gelada (Hydrocooler)
Após o pré-resfriamento, os bins contendo as frutas são levados
para o armazenamento a 0ºC em um prazo máximo de até 18 h após a
colheita (CODEX, 2003). As maçãs apresentam atividade metabólica
depois de colhidas o que reduz sua vida útil durante o armazenamento.
Portanto, o armazenamento das frutas ocorre sob refrigeração e, muitas
vezes, em atmosfera controlada de forma a diminuir a taxa de respiração
das maçãs e retardar seu metabolismo, amadurecimento e deterioração
(BRACKMANN et al., 2005). A estocagem é realizada geralmente à
temperatura de 0ºC, podendo variar de -0,5ºC até 2ºC, dependendo da
variedade. A atmosfera das câmaras pode ser normal ou controlada
(AC). Dependendo dos padrões de armazenagem exigida para cada
28
variedade, o teor de oxigênio pode ser reduzido para a faixa de 1,0 a
2,5% e o teor de gás carbônico elevado para 0,5 a 4,5% (GIRARDI;
BENDER, 2003; SANTÀNA et al. 2008). Para atingir estes níveis, é
preciso injetar nitrogênio na forma gasosa dentro da câmara, o qual
ocupa o lugar do oxigênio e fica desta maneira, inerte. A umidade
relativa (UR) é controlada entre 92 e 96%. (GIRARDI; BENDER,
2003). A atmosfera controlada fornece vantagens ao prolongar em 50 a
80% o período de conservação da fruta, mantendo sua qualidade através
do retardamento do amadurecimento. As variedades Gala e Fuji podem
ser estocada em AC por até 8 a 12 meses, respectivamente (GIRARDI,
BENDER, 2003).
Após o período de estocagem refrigerada, as frutas são levadas à
classificação que determinará seu tipo de comercialização. O
procedimento se inicia pela retirada das frutas de dentro dos bins. Para
tanto, os bins são descarregados em tanques de água, promovendo assim
a flutuação das frutas, que são conduzidas pela água dentro de calhas até
as mesas selecionadoras (Fig. 2.4).
a
b
Figura 2.4 - Etapas realizadas dentro das áreas de armazenamento das frutas
(packing houses): (a) Descarregamento das frutas (dentro dos bins) nos tanques
de água. (b) Condução das frutas pelas calhas de água até as mesas de seleção.
A água destes tanques é clorada com hipoclorito de sódio (2025 ppm). Porém, como o circuito é fechado, esta concentração não é
constante. No processo de seleção, as maçãs são separadas pelos
defeitos em diferentes categorias. As frutas desqualificadas para a
comercialização in natura serão consideradas frutas industriais
(GIRARDI; BENDER, 2003). Essas frutas de categoria industrial são
recolhidas e transportadas para a fábrica após serem reunidas em
quantidade suficiente para encher os caminhões. Geralmente, as frutas
b
29
permanecem nos packing houses em torno de 3 a 4 dias antes de serem
transportadas para a indústria. Entretanto, neste caso, estas maçãs são,
em sua maioria, estocadas à temperatura ambiente durante este período.
O transporte para a fábrica processadora de suco ocorre dentro de
caminhões.
Processamento das frutas na fábrica produtora de suco: A recepção
na fábrica ocorre em plataformas onde os caminhões descarregam as
maçãs dentro dos “silos” (Fig. 2.5).
Figura 2.5 - Descarregamento das frutas industriais destinadas à
fabricação de suco.
Ao entrarem no silo, as frutas recebem o primeiro contato com
água proveniente das etapas posteriores de fabricação que é chamada de
“água de transporte” que tem como função a retirada das sujidades
grosseiras. No processo de lavagem, as frutas deslizam por esteiras
abrasivas e recebem jatos de água sob pressão através de bicos
aspersores com a finalidade de remover sujidades mais aderidas e
também retirar as partes apodrecidas da fruta (BARRET et al., 2005;
SHIRMER; MARCINKOWSKI, 2003). Geralmente, podem ocorrer
duas etapas de lavagem usando bicos aspersores (Fig 2.6). Neste caso, a
água utilizada na última etapa é reutilizada na etapa anterior e fica
armazenada em um reservatório para a circulação em circuito fechado.
30
Em muitos casos, não é comum a utilização de sanitizantes neste
processo. O tempo total de lavagem desde o primeiro contato com a
água de transporte e as subsequentes etapas de lavagem com os bicos
aspersores dura em média 2,5 min, sendo que as etapas de contato direto
da fruta com os bicos aspersores pode durar em torno de 30 segundos.
Dependendo da logística, algumas indústrias realizam ainda uma breve
estocagem das frutas na fábrica, até que possam ser processadas. Esta
estocagem deve ser realizada em temperaturas inferiores a 10ºC ou,
quando não há controle de temperatura, o tempo máximo (temperatura
ambiente) deve ser de 48 h (FAO, 2003).
Figura 2.6 - Etapa de lavagem das frutas destinadas à fabricação de suco.
Na etapa de seleção, as frutas lesionadas ou apodrecidas podem
ser inteiramente descartadas ou então ter aproveitamento parcial, através
do corte das porções comprometidas (BARRET et al. 2005). As frutas
selecionadas seguem para a etapa da moagem onde são trituradas em
moinhos especiais, transformando-se em polpa (purê). Este purê sofre
prensagem para permitir a máxima extração do suco (FISCHER,
2006). A clarificação inclui o tratamento enzimático de despectinização
e adição de carvão ativado para propiciar a retirada dos compostos que
deixariam turvo o produto final (DOWNING, 1989). A clarificação é
finalizada pela filtração, feita com o auxílio de agentes filtrantes, como
31
terra diatomácea ou pelo uso da ultrafiltração (Figura 2.7) (BARRET et
al., 2005).
Figura 2.7 - Equipamento de ultra-filtração do suco de maçã concentrado
Seguindo o fluxograma de fabricação do suco concentrado
(Fig. 2.1), após a filtração, ocorre a pasteurização a temperaturas entre
(118ºC e 120ºC) por um tempo de retenção de aproximadamente 30 s.
Na mesma temperatura em que o suco sai da etapa de pasteurização, este
segue para o processo de concentração por evaporação, preferivelmente
até 70ºBrix (DOWNING, 1989). Devido à sua sensibilidade ao calor,
evaporadores de múltiplo-efeito, com recuperação do aroma, são os
mais comumente usatilizados. Visando a manutenção da qualidade, o
suco segue para o resfriamento a 0ºC que é mantido durante a
estocagem e comercialização do suco concentrado de maçã a 70ºBrix
(DOWNING, 1989).
O suco de maçã pronto para beber (11,5ºBrix) pode ser feito tanto
a partir do suco recém extraído quanto do suco concentrado (BARRET
et al., 2005). Para tanto, na etapa onde ocorre a formulação, utilizam-se
antioxidantes, como ácido ascórbico e acidulantes, como ácido cítrico
(BRASIL, 1988; IHA, 2006).
A pasteurização do suco (11,5ºBrix) ocorre geralmente em
temperaturas entre 90-95ºC por 15-30 s, o que permite posteriormente
sua estocagem à temperatura ambiente (BAHÇECI; ACAR, 2007).
32
Após o tratamento térmico, o envase do suco pasteurizado pode
tanto ser a quente, em um processo chamado de hot fill, ou ser
submetido ao envase asséptico. No processo hot fill, o suco pasteurizado
é envasado ainda a quente (82ºC-85ºC) e mantido nesta temperatura por
2-3 min com o objetivo de descontaminar as embalagens. O
resfriamento do suco dentro da embalagem ocorre geralmente em túneis
por aspersão de água gelada (FREITAS et al., 2006; BAHÇECI; ACAR,
2007). No envase asséptico, o suco pasteurizado é primeiramente
resfriado até a temperatura ambiente e então envasado em embalagens
cartonadas previamente esterilizadas com água oxigenada, sendo
mantida também a assepsia do ambiente de envase (FREITAS et al.,
2006).
Existe ainda um outro regime de pasteurização mais branda que é
utilizado para o suco de maçã que deve ser mantido refrigerado durante
a comercialização. Este é um produto muito requisitado nos Estados
Unidos, principalmente por ter sido submetido a processos térmicos
mais amenos, o que altera menos suas características sensoriais e
nutricionais (BARRET et al., 2005). O FDA (Food and Drug
Administration) recomenda o binômio de 71ºC/6 s para a pasteurização
destes sucos que devem ser imediatamente resfriados e mantidos sob
refrigeração durante sua vida de prateleira (FDA, 2004).
2.3 Microbiologia das maçãs e do suco de maçã
As maçãs são produtos altamente perecíveis e susceptíveis à ação
de micro-organismos, que são responsáveis por perdas consideráveis
nestes produtos. Dentre estes, os bolores e leveduras os constituem
agentes de maior impacto em frutas armazenadas causando perdas
substanciais (KHURDIYA, 1995; HUSSEIN; BRASEL, 2001; CHAN;
TIAN, 2005). Maçãs sadias carregam uma carga de bolores da ordem de
103 a 105 organismos por fruta, sendo Penicillium, Aspergillus, Mucor
spp. as espécieis mais comuns (DOORES, 1983).
As podridões de maçã são causadas principalmente por
Penicillium expansum, ocasionalmente por Alternaria alternata e por
Botrytis cinera. Estes fungos ocorrem na maior parte dos países
produtores de pomáceas (SANHUEZA, 1996). A espécie
Penicillium expansum, além de colonizar o fruto e causar dano à polpa,
é capaz de produzir patulina (PAT) que é uma micotoxina considerada
potencialmente teratogênica e cancerígena (LIU et al., 2003; PRIETA et
al., 1994).
33
Devido à natureza ácida dos sucos de fruta industrializados e ao
processamento térmico a que são submetidos, acreditou-se que estes
fossem seguros do ponto de vista microbiológico. Entretanto, microorganismos como os fungos termorresistentes e, mais recentemente,
bactérias esporuladas do genero Alicyclobacillus encontraram condições
de desenvolvimento nestes produtos (SPLITTSTOESSER et al., 1994;
TOURNAS, 1994). Assim, a grande preocupação na indústria de sucos
está principalmente relacionada aos micro-organismos capazes de
sobreviver às condições de pasteurização. Desta forma, a investigação
da microbiologia dos sucos engloba o desafio de avaliar a capacidade de
sobrevivência e multiplicação de micro-organismos resistentes ao calor.
Foi verificada ainda a ocorrência de surtos associados aos sucos de
frutas com patógenos como Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7
ou parasitas como Cryptosporidium parvum que ajudaram a dar um
novo enfoque e um maior impulso ao estudo da microbiologia dos sucos
de fruta (SIVAPALASINGAM et al., 2004).
A microbiota presente no suco de maçã será determinada pelo
tipo e quantidade de micro-organismos presentes nas frutas, associada à
higiene do ambiente de fabricação e dos equipamentos (DOORES,
1983).
2.3.1 Penicillium expansum em maçãs
As maçãs são susceptíveis a algumas desordens e injúrias que
tornam o fruto mais susceptível ao ataque de fungos. Dentre as doenças
associadas à maçã, a “podridão azul” (“blue rot”) (Fig. 2.8; imagem 2
do anexo I), causada por P.expansum, é a mais comum e destrutiva de
todas as podridões que afetam as maçãs, principalmente durante a
estocagem (JANISIEWICZL; KORSTEN, 2002). Entretanto, essa
doença não é importante como uma doença de pomar, uma vez que a
podridão azul é raramente encontrada nas frutas enquanto estas ainda
não foram colhidas, a não ser em casos de injúria causada por insetos,
granizo ou outros agentes. Em condições de alta umidade, a doença
normalmente ocorre em frutas caídas no solo (TREE FRUIT
PRODUCTION GUIDE, 2008). O inóculo inicial do patógeno pode
encontrar-se na população superficial da maçã e/ou das folhas que
ocasionalmente acompanham as frutas na colheita (SANHUEZA, 1996).
34
a
b
c
Figura 2.8 - (a) Deterioração característica causada por Penicillium expansum;
(b) internalização do fungo; (c) podridão característica do tecido da fruta.
As frutas infectadas têm odor e gosto característicos de mofo,
desenvolvendo massas verde-azuladas de esporos que aparecem na
superfície das frutas (Fig. 2.8 a). O apodrecimento se caracteriza por
áreas moles, amarronzadas e úmidas (Fig. 2.8 b, c) que se iniciam ao
redor das injúrias da fruta (TREE FRUIT PRODUCTION GUIDE,
2008). Devido à sua estrutura, a maçã permite a internalização de microorganismos (BARTS, 2005) através das aberturas do calix e da
pedúnculo (Fig 2.8 b).
Os esporos do fungo P. expansum disseminam a doença pois
podem sobreviver e contaminar o ambiente onde as frutas são
manipuladas, como a superfície de equipamentos, as caixas que
comportam as frutas (bins), a água que entra em contato com as maçãs
ou até mesmo as câmaras-frias de armazenamento (SANHUEZA, 1996).
No solo, encontra-se o principal reservatório de esporos deste fungo,
onde este pode sobreviver entre as estações. As injúrias causadas nas
frutas, especialmente durante as operações de colheita e manejo,
auxiliam a manutenção do ciclo da doença (SANHUEZA, 1996;
TRAVIS; RYTTER, 2003). O controle da podridão azul das maçãs tem
sido a preocupação de produtores ao redor de todo o mundo. Medidas
como a colheita das frutas nas condições ótimas de maturação, o
adequado manejo e resfriamento, a sanitização dos bins e das câmaras
frigoríficas, bem como a lavagem e sanitização das frutas, são medidas
35
para o controle da disseminação dos esporos de P. expansum e da
podridão azul (TRAVIS; RYTTER, 2003).
2.3.2 Fungos termoresistentes
Os fungos termoresistentes pertencem à classe dos ascosmicetos e
produzem esporos resistentes (ascósporos) que os permitem sobreviver à
exposição das usuais temperaturas utilizadas durante o processo de
pasteurização de sucos de frutas (TOURNAS, 1994; PIECKOVÁ et al.,
1994). Muitos relatos mostram que estes fungos são capazes de
sobreviver a temperaturas superiores a 90ºC por muitos minutos,
dependendo da espécie ou do meio de aquecimento (PIECKOVÁ;
SAMSON, 2000).
Na literatura, o primeiro caso de deterioração de alimentos
associados a bolores termoresistentes ocorreu na Inglaterra na década de
30, cujo agente causador foi B. fulva (TOURNAS, 1994). Depois disso,
muitas outras ocorrências foram evidenciadas, sendo que, além do
gênero Byssochlamys, são reportados na literatura casos de deterioração
de produtos de frutas associados às espécies pertencentes aos gêneros
Neosartorya, Talaromyces, Eupenicillium (PITT; HOCKING, 1999).
Entre as menos comumente relatadas podem ser citadas as espécies
pertencentes ao gênero Eurotium, que também produz ascósporos e
devem ser adicionadas à lista dos fungos termorresistentes (EICHER;
LUDWIG, 2002; SPLITTSTOESSER et al., 1989).
Os ascomicetos apresentam fases do ciclo de vida em que se
reproduzem sexuadamente e assexuadamente. Os estágios do ciclo de
vida sexuados são denominados de teleomorfos e os assexuados são os
anamorfos. Frequentemente, anamorfos (ou imperfeitos) e teleomorfos
(ou perfeitos) são descritos como entidades taxonomicamente distintas,
ou seja, em gêneros e espécies diferentes (PITT; HOCKING, 1999).
Estes fungos possuem estruturas chamadas ascos que são
similares a sacos, dentro dos quais é produzido um grupo de oito
ascósporos (PITT; HOCKING, 1999). A forma, tamanho e
ornamentação dos ascósporos podem variar com o gênero, espécie, cepa
do fungo e condições ambientais de formação dos esporos (TOURNAS,
1994). Os ascos da maioria das espécies formam-se dentro de corpos
frutíferos conhecidos como ascocarpos. Estes corpos podem ser
chamados de cleistotécios quando são estruturas grandes com paredes
sólidas ou ainda gimnotécios quando os ascos são circundados por hifas
finas e entrelaçadas. Os ascos das espécies de Byssochlamys nascem
36
separadamente e livres destes corpos de frutificação (PITT; HOCKING,
1999).
A deterioração por bolores termoresistentes geralmente
caracteriza-se pelo crescimento visível do fungo, produção de odor
desagradável, sabor ácido, formação de gás, desintegração das frutas e
solubilização da pectina por enzimas pectinolíticas, gerando a separação
de fases em sucos (SPLITTSTOESSER, 1991; SALOMÃO, 2002). Os
fungos termoresistentes têm como habitat natural o solo (PITT,
HOCKING, 1999). Nas frutas e seus produtos, estes fungos apresentam
baixa incidência com, no máximo, 10ºesporos/100 g (SANTÀNA,
2007; BEUCHAT; PITT, 1992; WOROBO; SPLITTSTOESSER, 2005).
Os ascósporos destes fungos apresentam-se em um estado de
dormência e necessitam ser ativados para germinarem. A ativação dos
ascósporos dormentes se dá pela aplicação de um choque térmico
(TOURNAS, 1994). Assim sendo, durante a pasteurização dos sucos de
frutas, os ascósporos destes fungos são ativados em um meio repleto de
nutrientes, o que leva à sua germinação com consequente crescimento e
deterioração dos produtos durante a estocagem (HOCKING; PITT,
1984).
Além da sua capacidade deteriorante, muitas espécies
pertencentes a estes gêneros são capazes de produzir micotoxinas, como
patulina, ácido bissoclâmico, bissotoxina A, assimetrina, variotina,
fumitremorginas A e C, verrucológeno, fischerina, talaromicina e
eupenifeldina (TOURNAS, 1994).
Uma breve descrição das espécies de fungos termorresistentes é
feita a seguir.
Byssochlamys: Dentre as espécies de Byssochlamys já isoladas, B. fulva
e B. nivea são as mais significantes na deterioração de produtos de
frutas. Este gênero é caracterizado pela ausência de cleistotécio,
gimnotécio ou quaisquer estruturas de proteção de seus ascos durante o
desenvolvimento e maturação. Os ascos livres deste gênero são
produzidos em cachos irregulares e abertos. O estágio imperfeito
(anamorfo) deste gênero é conhecido como Paecilomyces, sendo
Paecilomyces fulvus e Paecilomyces niveus as fases imperfeitas do
B. fulva e B. nivea, respectivamente. Para a distinção das duas espécies,
existem características que podem ser verificadas. B. nivea geralmente
forma colônias brancas em Ágar Extrato de Malte (MEA) ou Ágar
Czapeck Extrato de Levedura (CYA), sendo seus ascos de dimensões
menores que de B. fulva. As colônias deste último, por sua vez,
37
apresentam coloração marrom oliva nestes mesmos meios, podendo
apresentar filamentos brancos no meio CYA (PITT; HOCKING, 1999).
Neosartorya fischeri: Os ascos desta espécie estão recobertos por
cleistotécios, causando uma aparência granular às colônias. Estes ascos
podem sofrer ruptura instantânea de modo que só os ascósporos livres
sejam observados. A única espécie deterioradora conhecida é N. fischeri,
que possui diferentes variedades, sendo cada uma distinta na
ornamentação de seus ascósporos (NIELSEN, 1991; UGWUANYI;
OBETA, 1991). Os ascósporos, extremamente resistentes, são
biconvexos com divisão equatorial. As colônias em (MEA) são brancascreme, e sua fase anamorfa é conhecida por Aspergillus fischeri (PITT;
HOCKING, 1999).
Talaromyces spp.: O nome Talaromyces vem da palavra em grego, que
significa “cesta” de forma a descrever o corpo de frutificação
(gimnotécio) no qual o fungo no seu estado teleomorfo produz os seus
ascos. Assim, a característica principal deste gênero é a produção de
gimnotécios amarelos (menos comumente brancos) em associação com
um estado anamorfo característico de Penicillium, Paeciloyces ou
Geosmithia. O gimnotécio é formado por hifas finas entrelaçadas
resultando em uma estrutura de tamanho mais ou menos indeterminado.
Os ascósporos podem ser elipsoidais ou esféricos e possuem, algumas
vezes, paredes rugosas. Talaromyces é o gênero de aproximadamente 25
espécies e a maioria habita o solo (PITT; HOCKING, 1999; ENIGL et
al., 1993).
Eupenicillium spp.: Produz cleistotécio que, em muitos casos, torna-se
extremamente rígido e pode permanecer por semanas ou meses até
finalmente amadurecer para assim produzir numerosos ascos com oitos
ascósporos em seu interior. Devido à sua tardia maturação, sua
taxonomia é muito difícil se baseada na morfologia de seus ascósporos
maduros. Os ascósporos são elipsoidais possuindo uma leve ruga
longitudinal além de apresentar superfície áspera. Estes fungos são
habitantes do solo cuja sobrevivência ocorre em processos térmicos.
Foram identificadas 37 espécies de Eupenicillim, sendo que as mais
comumente
isoladas
de
alimentos
são:
E. brefeldianum,
E. cinnamopurpureum, E. hirayamae e E. javanicum. A fase anamorfa
deste gênero é o Penicillium (PITT; HOCKING, 1999).
38
Eurotium spp.: Este gênero é caracterizado pela formação de cleistotécio
amarelo. O estado anamorfo é representado por Aspergillus cujas
cabeças produzem somente fiálides. Todas as espécies de Eurotium são
xerofílicas. No estudo de sua indentificação, é necessário incorporar
20% de sacarose no meio CYA para diminuir a atividade de água e
permitir seu desenvolvimento. Seus ascósporos geralmente possuem
dois sulcos longitudinais ou apenas um. Existem em torno de 20
espécies de Eurotium conhecidas (PITT; HOCKING, 1999).
Além das espécies de fungos citadas, também foi verificado que
alguns fungos anamorfos como Paecilomyces variotti e algumas cepas
de Fusarium spp. podem causar deterioração em alimentos após
pasteurização. Estas cepas mostraram ser capazes de sobreviver a
tratamentos de 95ºC por 10-20 s, provavelmente devido à existência de
estruturas de resistência (SANSOM et al., 1996). Cepas de
Paecilomyces variotti isoladas de alimentos deteriorados sobreviveram
ao aquecimento a 96ºC por 10 min em suco de laranja (PIECKOVÁ;
SAMSON, 2000).
2.3.3 Alicyclobacillus
Durante muito tempo, acreditou-se que os esporos de bactérias
não teriam habilidade para germinar e reproduzir suas células
vegetativas em alimentos ácidos, como os sucos de frutas
(SPLITTSTOESSER et al., 1994). Entretanto, nos anos 80, na
Alemanha, uma bactéria foi isolada do suco de maçã e identificada
como uma nova espécie deteriorante (CERNY et al., 1984).
Originalmente denominada de Bacillus acidoterrestris (DEINHARD et
al., 1987), esta bactéria foi mais tarde realocada em um novo gênero
chamado Alicyclobacillus baseado na presença exclusiva dos ácidos
graxos
ω-alicíclicos ( ω-ciclohexano; ω-cicloheptano) na sua
membrana celular e também devido aos resultados de análises
comparativa da sequência do RNA ribossomal 16S (rRNA)
(WISOTSKEY et al., 1992).
Em 1990 e 1995 na Austrália, foi detectado um odor
desagradável em 40% das amostras de suco de maçã analisadas, o qual
foi considerado fruto de alguma contaminação microbiológica
(EGUCHI et al., 1999).
Splittstoesser et al. (1994) reportaram que a cepa acidentalmente
isolada em 1990 a partir de suco de maçã, produzido por hot fill, com
odor desagradável tratava-se de Alicyclobacillus. Esta foi considerada a
39
primeira detecção de Alicyclobacillus nos Estados Unidos em produtos
de fruta.
Na Europa, em um verão atípico (1994) foi verificado que
algumas embalagens de sucos e néctares de fruta produzidos por hot fill
desenvolveram sabores e odores poucos dias depois de embalados. Esta
deterioração foi reconhecida posteriormente como causada por
Alicyclobacillus (EGUCHI et al., 1999).
Estudos realizados no Brasil, descreveram o isolamento de
Alicyclobacillus spp. a partir de vários substratos e etapas do
processamento industrial de suco de laranja no estado de São Paulo
(ABREU FILHO, 2005). Além disso, foi constatada a presença de
bacterias termoacidófilas em suco de maracujá comercial procedente do
estado de São Paulo (McKNIGHT, 2003).
A ocorrência desta bactéria em produtos processados a base de
frutas vem sendo reportada frequentemente (YAMAZAKI et al., 1996;
JENSEN, 2000; WALLS; CHUYATE, 2000; MATSUBARA et al.,
2002; GROENEWALD et al., 2009).
Atualmente, são reconhecidas 17 espécies de Alicyclobacillus,
sendo que as três reportadas em produtos de frutas são
Alicyclobacillus acidoterrestris,
Alicyclobacillus acidocaldarius
e
Alicyclobacillus pomorum (GOTO et al., 2003; JENSEN; WHITFIELD,
2003; GROENEWALD et al., 2009). Algumas abreviações são usadas
para descrever estas bactérias. ATSB é uma abreviação que significa
“bactéria termoacidofílica formadora de esporos”. TAB também é uma
abreviação bastante utilizada no Japão que significa “Bactéria
termoacidofílica”. Estas abreviações são usadas para designar as
bactérias pertencentes ao gênero Alicyclobacillus e são aceitas como
sinônimo destas bactérias (YOKOTA et al., 2007).
O termo “aliciclo” se refere ao ácido graxo circular (ω-alicíclico)
cuja presença é majoritária na membrana celular destas bactérias. São
organismos acidofílicos obrigatórios que crescerem na faixa de pH entre
2,5 e 6,0 (ótimo pH entre 3,5 e 4,0). A faixa de temperatura de
crescimento destas bactérias fica em torno de 40 a 65°C, sendo o
crescimento ótimo entre 42-50ºC. (YOKOTA et al., 2007). Apresentamse em forma de bastonetes e são aeróbios ou anaeróbios facultativos,
Gram positivos ou Gram variáveis. Seus esporos são formados sob
condições ambientais e nutricionais adversas (WISOTZKEY et al.,
1992).
Os produtos geralmente associados à deterioração por esporos de
Alicyclobacillus são alimentos e bebidas ácidas como sucos e néctares
de fruta, processados termicamente (EIROA et al., 1999). Por serem
40
termofílicas, estas bactérias não crescem em temperaturas menores que
20°C. A estocagem comercial de sucos de fruta pasteurizados à
temperaturas inferiores a 20°C é adequada para prevenir a germinação
dos esporos e pode ser uma medida de controle para a indústria.
Entretanto, sucos de fruta pasteurizados são principalmente distribuídos
à temperatura ambiente, pois seu resfriamento significaria um fator
adicional de custo (CHANG; KANG, 2004).
Dentre as características de deterioração causadas por
Alicyclobacillus destaca-se a alteração no sabor e odor (cheiro
“medicinal”, “antisséptico” ou similar a desinfetante). Não é
evidenciada a formação de gás e existe pouca ou nenhuma mudança no
pH. Ocasionalmente pode ser verificada turbidez e/ou formação de
sedimentos brancos no fundo da embalagem. Desta forma, sua
deterioração é somente detectada no momento do consumo. Uma das
principais causas das alterações no sabor e odor se deve à formação de
traços de 2-6 di-bromofenol, 2-6 di-cromofenóis (halofenóis) e 2metoxifenol (guaiacol) em suco de fruta e bebidas (BORLINGHAUS;
ENGEL, 1997; ORR et al., 2000). Resultados mostraram que a alteração
sensorial nos produtos foi detectada quando níveis de Alicyclobacillus
estavam em torno de 103 UFC/mL (EGUCHI et al., 1999).
Alguns dados de resistência térmica apontam que os esporos
deste gênero apresentaram valores de D (tempo para causar uma redução
decimal) entre 16-23 min a 90ºC e 2,4-2,8 min a 95ºC
(SPLITTSTOESSER et al. 1994). Estes dados sugerem que os
tratamentos de pasteurização dos sucos a 90-95ºC/15-30 s não
suficientes para reduzir a população de esporos. A ótima ativação dos
esporos destas bactérias geralmente ocorre a 80ºC/10 min (MURRAY et
al., 2007; PEÑA; MASSAGUER, 2006; SILVA; GIBBS, 2001;
GROENNEWALD et al., 2009; WALLS; CHUYATE, 2000; ORR;
BEUCHAT, 2000). Considerando estes dados, pode-se afirmar que o
envase a quente (hot fill) significa um risco do desenvolvimento destas
bactérias, pois ocorre a manutenção de temperaturas (82-85ºC) que
podem propiciar a ativação dos esporos, permitindo assim a germinação
e crescimento de células vegetativas (FREITAS et al., 2006). Spinelli
(2006) verificou que o processo hot fill do suco de laranja seguido de
manutenção a 85ºC/2,5 min permitiu a sobrevivência de
A. acidoterrestris, e causou menos de 0,5 redução decimal na sua
população.
41
2.4 Patulina
Patulina (PAT) é uma micotoxina produzida por algumas
espécies de fungos. As primeiras pesquisas sobre PAT se iniciaram na
década de 40 quando esta toxina foi investigada como um antibiótico.
Entretanto, posteriormente vários estudos sugeriram que a PAT tratavase, na realidade, de um composto tóxico (MOAKE et al., 2005). Esta
toxina tem sido detectada em algumas frutas, sucos, vegetais e outros
alimentos (LARSEN et al., 1998; DELAGE et al., 2003; DRUSCH;
RAGAB, 2003; ANDERSEN et al., 2004). Entretanto, a maior fonte de
contaminação por PAT são maçãs e seus derivados (CODEX, 2003b).
PAT é uma lactona que apresenta fórmula molecular C7H6O4 e
estrutura química {4-hidroxi-4H-furo[3,2-c]piran-2(6H)-ona}. Sua
forma estrutural molecular está representada pela Figura 2.9 (MOAKE
et al., 2005). Esta toxina forma cristais incolores e possui máxima
absorção no UV a 276 nm. Além disso, apresenta ponto de fusão de
111ºC e peso molecular é 150,12 g/mol. É solúvel em água, etanol,
acetona, acetato etílico, éter e clorofórmio.
Figura 2.9 - Estrutura química da patulina
PAT não é destruída pelo calor e é estável em pH ácido.
Entretanto, pode ser reduzida por estocagem prolongada, pela ação de
sulfito, ácido ascórbico, fermentação alcoólica e pelo tratamento com
carvão ativado. A patulina perde sua atividade biológica em meio
alcalino e na presença de moléculas abrangendo os sulfidrila (ASKAR,
1999).
O efeito do pH na destruição térmica da PAT foi investigado
através de testes realizados em soluções aquosas a pH 3,5; 4,5 e 5,5
contendo a toxina. Estas soluções foram submetidas às temperaturas de
105, 110, 115, 120, 125ºC. Os dados mostraram que a destruição da
micotoxina em todas as temperaturas foi sempre maior em pH 5,5 do
que em pH 3,3, indicando que a PAT é mais estável em solução ácida.
42
Desta forma, pode-se concluir que a PAT possui relativa estabilidade
aos tratamentos térmicos geralmente aplicados a alimentos ácidos
(LOVETT; PELLER, 1973).
PAT é produzida por algumas espécies de fungos dos gêneros
Penicillium, Aspergillus e Byssochlamys, destacando-se o P. expansum
como o principal produtor (SANTÀNA, 2007; BARKAI-GOLAN;
PASTER, 2008; CODEX, 2003b).
A produção de PAT por P. expansum pode ocorrer geralmente
entre 0º e 25ºC (BARKAI-GOLAN; PASTER, 2008). Assim, o
armazenamento de frutas à baixa temperatura não é suficiente nem para
inibir o crescimento deste fungo, tampouco para evitar produção de
toxina (WELKE et al., 2009). Altos níveis de PAT (538-1822 ppb)
foram detectados em apple cider inoculado com P. expansum
(105esporos/mL) depois de incubação por 14 dias de 25ºC. Mesmo
quando o mesmo produto foi incubado a 4ºC, níveis de PAT variando de
75 a 396 ppb foram detectados após 24 dias de incubação
(MAcCALLUM et al., 2002).
P. expansum é considerado o principal responsável pela produção
de PAT em maçãs e não no seu suco. Esta afirmação é baseada na baixa
resistência térmica de outras espécies de Penicillium já estudadas
(SHEARER et al., 2002). Entretanto, não existem na literatura
informações sobre a resistência térmica específica de P. expansum. De
acordo com a FAO (2003), o processo de pasteurização do suco de maçã
não deve ser considerado um ponto crítico de controle somente para
bactérias, mas também para a produção de PAT, pois o tratamento
térmico irá reduzir esporos de P. expansum o que irá prevenir seu
crescimento e a produção de PAT dentro da embalagem. Como os sucos
de maçã mantidos refrigerados recebem um tratamento térmico ameno
(71ºC/6 s), deveriam existir mais dados específicos de resistência para
este fungo.
B. fulva e B. nivea são considerados potenciais produtores de
PAT nos sucos pasteurizados devido à alta termorresistência de seus
esporos (SANTÀNA, 2007). O estudo realizado por SANTÀNA
(2007) mostrou que uma cepa de B. fulva (IOC 4518) apresentou valores
de D nas temperaturas de 85ºC, 90ºC, 92ºC e 95ºC iguais a 64,58; 16,68;
6,31 e 3,10 min, respectivamente.
Estudos mostraram que B. nivea foi capaz de produzir PAT em
suco de maçã a 20ºC, após 21 dias de incubação, sendo que a produção
da micotoxina também ocorreu a 12ºC (ROLAND; BEUCHAT, 1984).
Outro estudo comprovou que B. fulva produziu PAT em suco de maçã
mantido a 21ºC e 30ºC em embalagens cartonadas (SANTÀNA, 2007).
43
A biossíntese de patulina ocorre quando a taxa de crescimento do
fungo diminui em virtude das limitações do consumo de nitrogênio
(GROOTWASSINK; GAUCHER, 1980). A síntese desta toxina
envolve uma série de reações de condensação e de oxiredução que são
catalisadas por enzimas. Sua síntese é iniciada com uma unidade de
acetil-Coenzima A e três unidades de malonil-Coenzima A, sendo
condensados em ácido 6-metilsalicilico (6-MAS) pela ação da enzima
ácido 6-metilsalicilico sintetase (6-MAS sintetase). A etapa seguinte
envolve a conversão de 6-MAS em m-cresol pela atividade da 6-MAS
descarboxilase. O m-cresol é convertido em álcool m-hidroxibenzil
através da m-cresol hidrolase. O próximo passo é conversão do álcool
m-hidroxibenzil a gentisaldeido pela enzima álcool m-hidroxibenzil
desidrogenase, tendo como intermediário de reação o mhidroxibenzaldehido ou o álcool gentisil. Uma vez formado o
gentisaldeido, é convertido em isopoxidona, filostina, neopatilina, Eascladiol e, finalmente, em patulina (DEMAIN, 1986).
A avaliação da toxicidade da PAT é baseada em vários estudos.
Sua dose letal-DL50 (quantidade ingerida que provoca a morte de pelo
menos 50% da população em estudo) em ratos varia de 15 a 35 mg/kg,
dependendo do modo de administração. A PAT apresenta efeito
citotóxico que lhe confere propriedades antibiótica, antifúngica e
antiprotozoárica. Esta citotoxicidade é facilitada pelo aumento na
permeabilidade da membrana. A PAT desorganiza os microfilamentos
citoplasmáticos. Ela inibe in vitro várias enzimas incluindo a ácido
ribonucléico e a ácido desoxirribonucléico (DNA) polimerases. Isto
também afeta a transcrição e a tradução tendo um efeito direto no DNA
(MOAKE et al., 2005; WHO, 1998).
A Agência Internacional para Pesquisa de Câncer (IARC, 1986)
concluiu, em 1986, que não há evidências suficientes sobre a
carcinogenicidade da PAT em animais e que não se pode fazer
afirmação sobre sua carcinogenicidade em humanos. Entretanto, vários
estudos têm evidenciado a toxicidade desta micotoxina. Dentre estes,
alguns apontaram a PAT como causadora de efeitos crônicos
apresentando sintomas genotóxicos capazes de induzir aberrações
cromossômicas (PFEIFFER et al., 1998). Estudos de células mamárias
in vitro forneceram evidências de que a PAT exibe genotoxicidade e
possível atividade mutagênica (SCHUMACHER et al., 2005). Também
as investigações de Schumacher et al. (2005) evidenciaram a
mutagenicidade da PAT em culturas de células de hamster chinês. Foi
demonstrado ainda que PAT possui habilidade em causar dano oxidativo
ao DNA em células humanas, o que implica na capacidade de propiciar
44
metagêneses e o início de câncer (LIU et al., 2003). Além disso, outros
estudos evidenciaram que PAT pode causar também sintomas
neurotóxicos (HOPKINS, 1993), imunotóxicos, imunosupressivos
(WICHMANN et al., 2002) e teratogênicos (ROLL et al., 1990).
Vários sintomas agudos também estão associados à PAT,
incluindo úlceras e inflamação do estômago e intestino (MAHFOUD et
al., 2002). Além disso, podem ocorrer convulsões, agitação, congestão
pulmonar, edema, hiperemia e degenaração de células epiteliais
(ESCOULA et al., 1977; HAYES et al., 1979).
Devido às evidências de efeitos adversos da PAT, agências
regulamentadoras internacionais determinaram limites aceitáveis de
PAT nos produtos de maçã. O limite para esta toxina é baseado na
quantidade do alimento ingerida diariamente e no peso corpóreo do
indivíduo. A Organização Mundial de Saúde – OMS estabeleceu um
limite provisional máximo de tolerância para ingestão diária
(Provisional maximum tolerance daily intake - PMT-DI) de 0,4 µg/kg
de peso corpóreo (WHO, 1998; FDA, 2001b).
O nível máximo de PAT para sucos de maçã e produtos derivados
foi estabelecido em 50 µg/L (ppb) (CODEX, 2003a) (FDA, 2001b). Este
mesmo nível máximo foi também adotado pela União Européia para
sucos de maçã, porém também foi estipulado o nível de 25 µg/kg para
produtos sólidos de maçã e ainda o nível máximo de 10 µg/kg para
produtos de maçã destinados às crianças (Baby foods) (EUROPEAN
UNION, 2003).
De acordo com a FAO (2004), 44 países possuem
regulamentação para PAT. Nestes países foi estabelecido o nível
máximo de 50 µg/L. No entanto, na Armênia, Lituânia, República
Tcheca e China os limites são de 5 µg/L, 25 µg/L, 30 µg/L e 100 µg/L,
respectivamente.
O consumo de sucos prontos para beber no Brasil vem crescendo
bastante, sendo que, no ano de 2008, houve um aumento de 8% sobre o
ano anterior (SICONGEL, 2008). O consumo interno de suco de fruta
gira em torno de 5 a 7 litros anuais por habitante, o que é ainda inferior
ao observado na Europa e nos Estados Unidos onde o consumo de sucos
de fruta chega a 30 litros anuais por habitante, destacando-se o suco de
maçã que é muito popular (CELLI et al., 2009). Talvez por esta razão, o
Brasil ainda não possua uma legislação para regulamentar o nível
máximo e PAT em alimentos. Entretanto, muitos países têm adotado a
recomendação das agências internacionais e esse fato deve estimular
países exportadores, como o Brasil, a pesquisar a qualidade
micotoxicológica dos seus produtos, a fim de se tornarem competitivos
45
no mercado internacional no fornecimento de alimentos seguros
(NOGUEIRA et al., 2007).
Estudos sobre a incidência de PAT têm sido realizados em
diversos países como Itália (BERETTA et al., 2000; RITIENI, 2003;
PIEMONTESE et al., 2005), Reino Unido (MONTIMER et al., 1985),
Espanha (MURILLO-ARBIZU et al., 2009), Turquia (GÖKMEN;
ACAR, 1998; YURDUN et al., 2001), Brasil (SYLOS; RODRIGUEZAMAYA, 1999), África do Sul (LEGGOT; SHEPHARD, 2001),
Bélgica (TANGNI et al., 2003; BAERT et al., 2006), Iran
(CHERAGHALI, et al. 2005), Japão (WATANABE; SHIMIZU, 2005),
Argentina (FUNES; RESNIK, 2009), Estados Unidos (TRUCKSESS;
TANG, 1999) e Austrália (BURDA, 1992). Em todos os países foram
encontradas amostras contaminadas com PAT. Nestes estudos, o nível
máximo de contaminação dos produtos de maçã foi de 1150 µg/L. A
frequente incidência desta toxina nestes produtos mostra que, até certo
nível, a PAT é resistente aos processos de fabricação (LEGGOTT et al.,
2001).
Acredita-se que a eliminação da PAT não se dará somente por
uma medida isolada, mas por um conjunto de procedimentos que
envolvam a fabricação do suco desde a colheita da matéria-prima até a
obtenção do produto final (MOAKE et al., 2005).
Vários métodos são frequentemente utilizados na tentativa de
reduzir os níveis de PAT em sucos de maçã, dentre eles destaca-se o
tratamento com carvão ativado. Devido às suas propriedades
adsorventes, o carvão ativado foi usado para reduzir os níveis desta
toxina em suco de maçã. No entanto, verificou-se que a aparência e o
sabor do suco podem ser afetados pelo tratamento com esse composto
(LEGGOTT et al., 2001). O efeito da quantidade e do tempo de contato
do carvão ativado sobre a concentração de PAT em suco de maçã foi
estudado por Kadakal e Nas (2002). O melhor resultado foi obtido
quando utilizaram 3 gramas de carvão ativado por litro de suco com
tempo de contato de 5 minutos, obtendo redução na concentração da
micotoxina de 62,3 para 30,8 µg/kg.
PAT é instável ao processo de fermentação do suco. Estudos
mostraram que esta micotoxina tem sua concentração reduzida e
praticamente desaparece (redução de 99% da quantidade inicial), após
processo fermentativo (STINSON et al., 1978). Sucos fermentados
como a sidra, apresentam menor contaminação devido à degradação da
PAT pela levedura Saccharomyces cereviae (HARRISON, 1989;
MOSS; LONG, 2002). Da mesma forma, Celli (2006) verificou a
degradação da toxina em suco de maçã ao cultivar esta levedura em
46
meio contendo 7µg de PAT/mL. Neste estudo foi observado que nas
primeiras 19,5 h, não houve degradação. Entretanto, após esse período
ela passou a ser eliminada, com velocidade de 0,078 µg/mL.h.
Os tratamentos térmicos, por sua vez, aplicados aos produtos de
maçã pasteurizados contribuem muito pouco para a eliminação desta
toxina que é relativamente resitente ao calor. Uma investigação simulou
o efeito da aplicação de tratamentos de pasteurização na destruição de
PAT presente no suco de maçã. Verificou-se que o tratamento a
90ºC/10 s reduziu os níveis desta toxina em 19%, mostrando que o
equivalente processo industrial não assegura sua completa eliminação
(WHEELER et al., 1987).
Estudos demonstram que o nível de contaminação no produto
final depende diretamente da qualidade da matéria-prima e, portanto,
esforços devem ser realizados de forma a reduzir os níveis de PAT das
maçãs destinadas ao processamento industrial (JANISIEWICZL;
KORSTEN, 2002).
A recepção das frutas deve ser considerada a primeira medida de
controle da PAT aplicada efetivamente pela indústria processadora do
suco. A recepção dos lotes de frutas com a menor taxa possível de
podridão, é de extrema importância para se evitar a contaminação das
frutas sadias. Nesta etapa, lotes de maçãs, que apresentem elevada
proporção de frutas apodrecidas, não devem ser aceitos para o
processamento, já que seria muito difícil selecioná-los manualmente de
forma a reduzir o número de maçãs podres a um nível aceitável de PAT
no produto final (FAO, 2003).
As etapas de lavagem das frutas, bem como a seleção das mesmas
antes da sua moagem mostraram ser procedimentos baratos e eficazes na
redução de PAT, uma vez que a produção desta toxina é confirmada
primariamente nos tecidos infectados de maçãs podres (MOSS, 2002;
RYCHLIK; SCHIEBERLE, 2001).
Uma redução significativa dos níveis de PAT foi obtida na etapa
de lavagem das maçãs (SYDENHAM et al., 1995). Neste estudo, o nível
médio da micotoxina foi reduzido de 920 ppb para 190 ppb após a
lavagem (redução de aproximadamente 80%). Outro estudo observou
que a quantidade de PAT nas frutas não processadas estocadas ao ar
livre atingiu 90 ppb, 395 ppb e 2245 ppb após 5, 15 e 33 dias, porém
diminuiu para valores de 75 ppb, 100 ppb e 695 ppb, respectivamente,
após a etapa de lavagem (SYDENHAM et al., 1997).
Investigações mostraram que o hipoclorito de sódio, ao ser usado
na lavagem de frutas, não permite a colonização de fungos, reduzindo
assim a produção de PAT (HASAN, 2000). Frutas lavadas em soluções
47
cloradas a 100 ppm e 200 ppm por 2 min tiveram os níveis de PAT
reduzidos entre 10% e 100%, dependendo da quantidade inicial da
micotoxina e das soluções utilizadas (JACKSON et al., 2003).
Okull e Laborde (2004) estudaram a contaminação cruzada de
esporos de P. expansum entre maçãs e verificaram que, quando as frutas
previamente “machucadas” foram submersas em água contendo em
torno de 106 esporos/mL, 100% destas desenvolveram apodrecimento
durante armazenamento. Porém, quando as frutas foram
subsequentemente tratadas por imersão em solução contendo 200 ppm
de hipoclorito de sódio acidificado/5 min, em torno de 16,7 a 43,4%
delas se mostraram infectadas durante estocagem. Tais resultados
demonstram a importância em se reduzir a contaminação por
P. expansum antes das frutas serem encaminhadas ao armazenamento
dentro dos packing houses ou dentro da indústria.
A lavagem das frutas na indústria de suco é comumente realizada
com água sob pressão. Foi verificado que a água aplicada em alta
pressão conseguiu retirar total ou parcialmente as partes podres das
frutas e reduziu os níveis de PAT no suco de maçã em até 54% (ACAR
et al., 1998). Desta forma, esta etapa pode ser considerada como uma
medida de controle da PAT. Entretanto, esta toxina e os esporos
fúngicos poderão ser introduzidos na água de limpeza e nos aerossóis, o
que pode causar o risco de proliferação dos fungos, caso as frutas sejam
estocadas depois da lavagem (FAO, 2003). Mesmo que ocorra a
remoção total das lesões da fruta através da lavagem com água sob
pressão, as maçãs ainda podem conter altos níveis de PAT, pois estudos
mostraram que esta toxina pode se difundir em 1 a 2 cm a partir da parte
lesionada em direção ao tecido sadio (TANIWAKI et al., 1992;
RYCHLIK; SCHIEBERLE, 2001). Celli (2006) quantificou a
concentração de patulina em podridões de maçã, bem como o tecido
sadio ao redor da lesão (1 cm). Encontrou patulina em todos os tecidos
deteriorados e sadios analisados, chegando a 115,65 e 5,02 µg de
PAT/g de tecido, respectivamente.
O processo de seleção das frutas dentro da planta processadora é
realizado em esteiras giratórias onde as frutas são inspecionadas
visualmente e, aquelas lesionadas são descartadas total ou parcialmente.
A quantidade de PAT nos sucos pode ser reduzida de uma concentração
média de 190 ppb (após a lavagem) para 55 ppb após a remoção das
frutas apodrecidas (SYDENHAM et al., 1995). Foi verificado que o
corte (trimming) das partes podres da fruta foi capaz de reduzir entre 93
a 99% do total da PAT presente nas maçãs (LOVETT et al., 1975).
48
O diâmetro das lesões pode afetar os níveis de PAT (MARIN et
al., 2006). Foi observada uma correlação direta entre a quantidade de
PAT e o tamanho das lesões (MARTINS et al., 2002). Investigações
mostraram que, em geral, a concentração de PAT nas amostras de suco
de maçã aumentou proporcionalmente com o uso de maçãs lesionadas.
Frutas sãs produziram suco de maçã com níveis inferiores a 50 ppb,
enquanto que o suco obtido a partir maçãs com 30, 60 e 100% de maçãs
lesionadas apresentou PAT superior a 50 ppb (KADAKAL; NAS,
2002).
Diferentes métodos vêm sendo desenvolvidos para a detecção e
quantificação de patulina em produtos de fruta (MOAKE et al., 2005).
Atualmente, os métodos mais utilizados para quantificar patulina são
baseados na separação da toxina por cromatografia líquida de alta
eficiência com detector UV (ultravioleta). Este é o método oficial
adotado pela AOAC para suco de maçã (método 995.10) (BRAUSE et
al., 1996; AOAC, 2000) com um limite de quantificação de 5 µg/L.
Neste método o suco é extraído 3 vezes com acetato de etila, seguido de
desidratação com sulfato de sódio. O solvente é evaporado sob fluxo de
nitrogênio gasoso a 40°C e o resíduo é dissolvido em acetonitrila:água
(10:90). A cromatografia líquida utiliza coluna C18 de fase reversa (5
µm, 250 x 4,6 mm) e detector UV fixado em 276 nm. O sistema é
isocrático, com fluxo de a 1 mL/min e fase móvel acetonitrila:água
(5:95).
2.5 Desinfecção de maçãs
Uma lavagem simples com água não pressurizada pode ter um
efeito mínimo na remoção dos micro-organismos da superfície de uma
fruta. O uso de sanitizantes melhora a eficiência do processo de limpeza.
Os grandes problemas associados a este uso estão relacionados à
associação negativa da aplicação de produtos químicos e ao custo de sua
utilização (KOZEMPEL et al., 2002). A escolha do agente de
desinfecção deve ser baseada no resultado efetivo a baixas
concentrações, baixo custo e baixo impacto ambiental. A eficácia do
método usado para reduzir a população microbiana é usualmente
dependente do tipo de tratamento, tipo e fisiologia do micro-organismo
alvo, características dos alimentos, e condições de aplicação dos
sanitizantes (tempo de exposição, concentração, pH e temperatura),
sendo que estes não devem alterar as características sensoriais dos
alimentos (PARISH et al., 2003).
49
Testes para determinar a eficiência destes agentes são necessários
para descobrir as concentrações a serem recomendadas para um
determinado tratamento (KELSEY, et al., 1974; COATES, 1996;
WINNICZUK; PARISH, 1997; VIJAYAKUMAR; WOLF-HALL,
2002). A necessidade de padronização de métodos para determinação da
eficácia de desinfetantes contra micro-organismos patogênicos em frutas
e vegetais tem sido destacada (BEUCHAT, 2002; SILVA et al., 2003).
2.5.1 Agentes sanitizantes
2.5.1.1 Compostos clorados
Compostos clorados são amplamente utilizados como agentes
sanitizantes, principalmente nas formas de hipoclorito de sódio (NaClO)
ou de cálcio Ca(ClO)2, dióxido de cloro (ClO2) e cloro gás (Cl2), que são
derivados clorados de origem inorgânica. Além destes, existem os
compostos clorados orgânicos, denominados “cloraminas orgânicas”,
cuja representação pode ser destacada pelo dicloisocianurato de sódio e
o ácido tricloro isocianúrico. Os derivados clorados orgânicos são
considerados mais estáveis que compostos inorgânicos (ANDRADE;
MACÊDO, 1996; MACÊDO, 2004; RUSSEL et al. 1992).
A hidrólise dos compostos clorados orgânicos e inorgânicos
libera cloro na forma de ácido hipocloroso (HClO), que é considerado a
substância germicida por possuir alta capacidade oxidante. O ácido
hipocloroso é um ácido fraco, que em solução aquosa se dissocia para
formar o íon hidrogênio e o íon hipoclorito (Equação 2.1).
HClO ↔ ClO- + H+
(Equação 2.1)
O pH da solução clorada é um fator muito importante porque
influencia sua ação germicida. No meio alcalino, este se dissocia
(Equação 2.1) e sua eficiência diminui. Já em meio ácido, o HClO não
está dissociado e é mais eficiente contra micro-organismos
(ANDRADE; MACÊDO, 1996). Com relação ao pH dos produtos
clorados encontrados no mercado, o hipoclorito de sódio/cálcio
apresenta pH entre 11,0 e 12,5, em solução a 1%; e o composto orgânico
dicloroisocianurato de sódio, na mesma concentração, apresenta pH
entre 6 e 8 (MACÊDO, 2004). Outro fator que aumenta a efetividade
das soluções cloradas é o aumento da temperatura. Entretanto, seu uso
em temperaturas muito altas não é aconselhável, pois este se volatiliza.
A exposição à luz, durante a estocagem, pode provocar decomposição
50
fotoquímica, o que evidencia a necessidade do armazenamento em
frascos opacos, ao abrigo da luz e do calor. A estabilidade de compostos
clorados, como o hipoclorito de sódio, durante a estocagem, é
assegurada por adição de hidróxido de sódio, que mantém o pH alto
durante o armazenamento. Porém, a solução clorada concentrada de
hipoclorito deve apresentar a capacidade de tamponamento quando
diluída, favorecendo o decaimento gradativo do valor de pH, tornando o
produto ativo na forma de ácido hipocloroso. Pode ainda ocorrer
decomposição catalítica na presença de íons, metais pesados, cobalto,
manganês, níquel e ferro, produzindo cloreto e oxigênio. Um fator
importante com relação ao ácido hipocloroso é o de ser fortemente
reativo com substâncias orgânicas, sendo que, para se atingir a
concentração de cloro residual livre desejada, é preciso primeiro oxidar
estes compostos e ultrapassar o “ponto de quebra”. A cloração acima
deste ponto consiste na adição de cloro suficiente para permitir a
destruição microbiana (RUSSEL et al. 1992; ANDRADE; MACÊDO,
1996).
Cloro líquido e hipocloritos são geralmente utilizados na
concentração de 50 a 200 ppm. Concentrações superiores a estas têm
sido investigadas para uso na desinfecção de sementes e brotos
(PARISH et al., 2003). Os limites máximos de solução sanitizante
permitidos para a lavagem direta de frutas é de 100 ppm de cloro livre
(quando se utiliza dicloroisocianurato de sódio) e 200 ppm de cloro livre
(quando se utiliza hipoclorito de sódio) (FDA, 1998; SAPERS, 2001).
Dentre as vantagens na sua utilização estão o baixo custo, a
rápida ação não afetada pela dureza da água, o espectro de ação contra
uma grande variedade de micro-organismos (bactérias Gram-positivas e
negativas, incluindo micobactérias, fungos, vírus lipofílicos e
hidrofílicos, e também esporos bacterianos, quando em altas
concentrações). Além disso, apresenta facilidade de preparo. Entretanto,
o cloro é corrosivo para equipamentos metálicos e irritante para a pele e
mucosas quando utilizado em concentrações elevadas. O mecanismo
mais provável de ação contra micro-organismos é atribuído à sua
combinação com proteínas da membrana celular, formando compostos
tóxicos e inibindo as reações enzimáticas essenciais, além da reação
com DNA, oxidação de bases purínicas e pirimidínicas e paralisação da
síntese protéica. Pode provocar ainda a descarboxilação oxidativa de
aminoácidos formando nitrilas e aldeídos; provocação de aberrações
cromossomáticas e inibição do consumo de oxigênio que afeta a
fosforilação oxidativa. Em relação aos esporos bacterianos, acredita-se
que sua cobertura o proteja da ação do cloro, servindo assim como
51
barreira à permeabilidade deste sanitizante, Entretanto, esta é a camada
onde ele inicia sua ação oxidante (ANDRADE; MACÊDO, 1996;
RUSSEL et al., 1992).
2.5.1.2 Ácido peracético
O ácido peracético (C2H4O3) é constituído por uma mistura
estabilizada de ácido peracético, peróxido de hidrogênio (H2O2), ácido
acético (CH3COOH) e um veículo estabilizante. O ácido peracético
possui alta capacidade de oxidação dos compostos celulares. Sua ação
sobre células vegetativas e também sobre esporos bacterianos, fungos,
leveduras e vírus também é devido ao teor de peróxido de hidrogênio
presente nas formulações comerciais. O produto tem como vantagem,
além da excelente ação sanitizante e atividade esporicida, o fato de agir
sob baixas temperaturas, possuir um baixo efeito residual e ter
concentração facilmente determinada. As soluções de ácido peracético
são mais eficientes em temperaturas abaixo de 35°C e pH entre 2 e 4.
Entretanto, pode ser irritante à pele, possui vapores irritantes o que
requer cuidados no manuseio. Além disso, é incompatível com o ferro,
cobre e alumínio, e possui baixa atividade à estocagem, devendo assim
ser mantido em local fresco e ventilado, afastado da luz direta do sol e
fontes de calor (ANDRADE; MACÊDO, 1996; RUSSEL et al. 1992).
De acordo com o FDA os limites máximos ácido peracético para a
lavagem direta de frutas é de no máximo 80 ppm (FDA, 1998).
2.6 Uso de modelos matemáticos para descrever a inativação de
esporos
A microbiologia preditiva utiliza modelos matemáticos derivados
de estudos quantitativos dos micro-organismos para prever o
comportamento microbiano nos alimentos em diferentes condições,
sendo que a necessidade de garantir a segurança microbiológica e a
qualidade dos alimentos tem sido o maior estímulo à sua aplicação. O
uso de modelos matemáticos na microbiologia de alimentos começou
em 1920, com desenvolvimento de métodos para calcular o tempo de
destruição térmica de micro-organismos (NAKASHIMA et al., 2000).
Segundo Whiting e Buchanan (1993), os modelos matemáticos
podem ser classificados como modelos primários, secundários e
terciários. Os modelos primários são aqueles que descrevem as
52
mudanças de número de micro-organismos ou outra resposta microbiana
com o tempo. Os modelos secundários descrevem como as repostas de
parâmetros obtidos no modelo primário variam com as condições
ambientais como pH, temperatura, atividade de água ou concentração de
determinado sanitizante, por exemplo. Os modelos terciários combinam
o uso de modelos primários e secundários em um pacote de programas.
São rotinas de softwares que transformam modelos primários e
secundários em modelos na forma de aplicativos, que podem determinar
respostas microbianas em diferentes condições ou ainda comparar o
crescimento de diferentes micro-organismos.
Dentre os modelos primários utilizados para descrever a
inativação de micro-organismos, neste trabalho serão destacados:
Modelo de Bigelow; Modelo de Weibull e Modelo Bifásico.
O Modelo de Bigelow assume que todas as células ou esporos em
uma população tenham idêntica resistência para tratamentos letais e que
sua inativação é governada por uma equação cinética de primeira ordem
(Equação 2.2) (SCHAFFNER; LABUZA, 1997).
log
N
t
=−
No
D
Equação 2.2
Onde,
No = concentração da população inicial de células (UFC/mL);
N = concentração de sobreviventes depois de exposto a um tempo t
(UFC/mL);
D (tempo de redução decimal) =tempo para reduzir em 1 ciclo
logarítmico a concentração celular (min);
t =tempo (min).
Alguns micro-organismos apresentam uma inativação térmica
logarítmica, ou seja, quando se grafica o logaritmo do número ou
concentração de sobreviventes versus tempo de aquecimento, a uma
dada temperatura, obtém-se uma relação linear. Porém, comportamentos
não lineares de inativação são bastante comuns, sendo a inativação
linear considerada, na realidade, uma exceção (PELEG, 2006).
Numerosos micro-organismos apresentam curvas de inativação (Log
(N/No) vs time) não lineares, onde se observa um “ombro” no início,
seguido de uma fase línea de destruição (parte logarítmica da curva). À
medida que a temperatura de inativação aumenta, a fase “lag” ou
53
“ombro” vai diminuindo, levando ao aparecimento de uma reta
(SALOMÃO et al., 2007; FUJIKAWA et al., 2000). Pode ser ainda
observado um comportamento de inativação logarítmica no início
seguido de uma cauda (CERF, 1970).
O Modelo de Weibull assume que as células e os esporos em uma
população têm diferentes resistências e uma curva de sobreviventes é
apenas a forma acumulativa de uma distribuição de agentes letais (VAN
BOEKEL, 2002) Assumindo que o tempo de inativação t segue a
distribuição de Weibull, obtem-se a seguinte equação:
t p
 N 
Log 
 = −( )
δ
 No 
Equação 2.3
O fator p é o parâmetro de forma, sendo que distribuição de
Weibull corresponde a uma curva com concavidade voltada para cima se
p < 1 e concavidade voltada para baixo se p > 1 e linear se p = 1. O
parâmetro δ é o fator de escala e pode ser definido como o “tempo para
uma redução decimal”, se p = 1 (PELEG; COLE, 1998).
O modelo Bifásico (CERF, 1970) assume a existência de duas
sub-populações que são caracterizadas pela diferença nos seus níveis de
resistência aos tratamentos (Equação 2.4).
 N 
Log 
 = Log ( f × exp( − k max 1 × t ) + (1 − f ) × exp( − k max 2 × t )
 No 
A fração f é considerada a sub-população sensível ao tratamento e
(1-f) é a outra fração da população que é considerada resistente ao
tratamento. As taxas específicas de inativação das duas populações são
kmax1 (min-1) e kmax2 (min-1), respectivamente.
Os modelos secundários descrevem como as respostas de
parâmetros primários variam coma as mudanças de condições
ambientais. Alguns exemplos são modelos polinomiais ou metodologia
de superfície de resposta, equação de Arrhenius, modelo da raiz
quadrada ou de Ratkowsky (2002) entre outros (MCMEEKIN et al.,
2002; WHITING, 1995). Além destes modelos, Corradini e Peleg
(2005) têm demonstrado que modelos empíricos podem ser utilizados
para descrever a variação dos parâmetros dos modelos primários com a
temperatura e outros fatores como atividade de água, pH, concentração
de sanitizantes, dentre outros.
Equação 2
54
Um modelo secundário bastante utilizado é o que fornece o valor
Z, que significa os graus de temperatura necessários para ocasionar uma
variação em 10 vezes no valor de D, fazendo a regressão de (Log D)
versus Temperatura (°C). Cabe ressaltar que este modelo só poderá ser
utilizado quando a curva de destruição apresentar comportamento linear
e, portanto, for possível se calcular o valor de D.
55
CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Metodologia utilizada no Artigo 1: Survey of molds and
Alicyclobacillus from a concentrated apple juice productive
process in Brazil
3.1.1 Amostragem
Inicialmente, foi realizado um levantamento prévio da
contaminação presente nas diversas etapas do processamento de suco
concentrado de maçã. Foram utilizados métodos para “isolamento” e
“detecção” dos seguintes micro-organismos: bolores e leveduras, fungos
termorresistentes e Alicyclobacillus spp.
As amostras retiradas diretamente da planta de processamento no
período da safra de 2005 foram as seguintes: maçã sem lavagem prévia
(12-13°Brix), maçã após lavagem (12-13°Brix), água de lavagem, mosto
(14°Brix; pH 3,6), bagaço (12-13°Brix), produto antes da préconcentração (9,8°Brix; pH 3,6), produto depois da pré-concentração
(14°Brix; pH 3,8), produto durante tratamento enzimático (18,2°Brix;
pH 3,5), produto antes da ultra-filtração (17,2°Brix; pH 3,6), produto
depois da ultra-filtração (13,8°Brix; pH 3,7), produto antes da
concentração (17°Brix; pH 3,7), suco concentrado de maçã (68,2°Brix;
pH 3,5) e suco concentrado de maçã estocado (67,6°Brix; pH 3,5). A
quantidade de amostra coletada foi de aproximadamente 250 mL, sendo
mantida sob refrigeração até o momento da análise, que foi realizada em
até 24 horas. Amostras de maçã foram coletadas aleatoriamente para
representar o real estado das frutas. Durante as análises, pedaços de
diferentes maçãs foram misturados para manter a aleatoriedade dos
testes.
As codificações das amostras foram as seguintes: maçã sem
lavagem prévia (M), maçã após lavagem (ML), água de lavagem (H2O),
mosto (MO), bagaço (BA), produto antes da pré-concentração (APC),
produto depois da concentração (DPC), produto durante tratamento
enzimático (TE), produto antes da ultra-filtração (AUF), produto depois
da ultra-filtração (DUF), produto antes da concentração (AC), suco
concentrado de maçã (DC) e suco concentrado de maçã estocado (PF).
Foi realizada ainda uma análise adicional do produto final (PF)
somente para fungos termorresistentes, a partir de uma amostra retirada
56
posteriormente no período da safra. Uma amostra de maçã estocada
(entressafra) com características visíveis de “mofo azul” foi retirada
com o objetivo de realizar a identificação da espécie (Imagem 1; Anexo
I). A imagem 2 do anexo I mostra a característica das maçãs com visível
“mofo azul”.
Todos os meios de cultura e reagentes citados neste capítulo estão
descritos no Anexo III.
3.1.2 Detecção e enumeração de bolores e leveduras
Vinte e cinco gramas de amostra de maçã e do bagaço foram
adicionados a 225 mL de água peptonada estéril 0,1% e
homogeneizadas em stomacher (ITR, Modelo 1204), durante 2 minutos.
A partir das demais amostras, que eram líquidas, foram retiradas
alíquotas de 10 mL as quais foram diluídas em 90 mL de água
peptonada estéril. Subsequentemente foram realizadas as demais
diluições seriadas e o plaqueamento foi realizado por profundidade
usando ágar batata dextrose PDA (Biolife) acidificado com ácido
tartário 10% (pH final = 3,5). A incubação ocorreu a 25°C durante 3 a 5
dias sendo a contagem expressa em UFC/mL ou UFC/g (SILVA et al.,
1997).
3.1.3 Detecção
termorresistentes
e
enumeração
de
fungos
filamentosos
Foi utilizada a metodologia de detecção e enumeração de fungos
filamentosos termorresistentes descrita por Beuchat e Pitt (2001).
Cem gramas das amostras de maçã e do bagaço foram misturados
a 100 mL de água estéril, sendo a maçã previamente triturada em
liquidificador estéril. Após diluição, seguiram para o Stomacher onde
foram homogeneizadas durante 4 minutos. Então, duas porções de
50 mL foram transferidas para tubos estéreis com tampa rosqueável. As
amostras de suco concentrado de maçã foram submetidas a uma diluição
previa onde 50 mL da amostra foram adicionados assepticamente a
50 mL de água destilada estéril. A mistura obtida (100 mL) foi
homogeneizada, e a partir dela foram retiradas duas porções de 50 mL,
que foram transferidas para dois tubos com tampa rosqueável. As
demais amostras não necessitaram de nenhum pré-tratamento e duas
alíquotas de 50 mL foram colocadas diretamente em dois tubos com
57
tampa rosqueável. O choque térmico ocorreu em banho de água agitado
(Tecnal 184, precisão +/-0,1°C) mantido a uma temperatura de 80°C por
30 minutos. Terminado o tempo de choque térmico, os tubos foram
resfriados em banho de gelo durante, no máximo, um minuto. Para cada
uma das amostras, o conteúdo total dos dois tubos (100 mL) foi
transferido para um erlemeyer contendo 100 mL de PDA com
concentração dupla de ágar, previamente adicionado de 50 mg/L de rosa
de bengala e 4 g/L de cloranfenicol. O conteúdo resultante foi
acidificado com solução de ácido tartárico a 10% p/v (pH final = 3,5),
misturado adequadamente e distribuído em 8 placas de Petri
descartáveis de 90 mm de diâmetro. Após solidificação da mistura nas
placas, estas foram envolvidas em saco plástico e incubadas a 30ºC por
30 dias. Leituras preliminares da presença de fungos termorresistentes
foram realizadas periodicamente a cada 5 dias e o resultado foi expresso
em UFC/100mL para amostras líquidas e UFC/100g para as amostras da
fruta.
3.1.4 Enumeração e detecção de Alicyclobacillus spp. (ATSB)
Os ensaios realizados ocorreram de acordo com a metodologia
descrita por Eguchi et al. (1999), que contempla uma metodologia para a
enumeração e outra para a detecção de Alicyclobacillus spp.
Metodologia para enumeração: Para suco concentrado, foram
coletados 10 mL de amostra e colocadas em frasco estéril contendo
90 mL de água estéril (diluição 1:10). Para outras amostras líquidas, os
10 mL de amostra foram adicionados em 90 mL de caldo BAT (caldo
Bacillus acidoterrestris). Vinte e cinco mililitros das amostras de maçã
(triturada em liquidificador estéril) e de bagaço foram, cada qual,
adicionados a 225 mL de água destilada estéril, cuja mistura foi
homogeneizada em Stomacher, durante 2 minutos. Em seguida, as
amostras foram submetidas a um choque térmico de 80°C/10 minutos
em um banho de água agitado (Tecnal 184, precisão +/-0,1°C). Em
seguida, as amostras foram rapidamente resfriadas em banho de gelo, até
atingir temperatura ambiente. O plaqueamento ocorreu em ágar BAT e a
incubação a 50°C durante 4 dias, sendo monitorada até 10 dias.
Metodologia de detecção: A fim de recuperar os esporos
presentes, que poderiam estar em números bem reduzidos podendo não
ser verificados pelo método de enumeração, procedeu-se o
enriquecimento da amostra. Assim, as amostras preparadas como
descrito anteriormente foram incubadas a 50°C por 24 horas para
58
favorecer seu enriquecimento e promover, desta maneira, o crescimento
do micro-organismo, mesmo quando em número muito baixo. Após este
período, 1 mL de amostra foi adicionado ao meio de cultura (ágar BAT),
seguido de incubação a 50°C por 4 dias, sendo monitorado por 10 dias.
O resultado final foi expresso como presença ou ausência de
Alicyclobacillus (ATSB).
A partir das cepas detectadas foi realizada a caracterização
morfológica de Alicyclobacillus sp. (ATSB). As colônias que ocorreram
na superfície da placa foram espalhadas em placa contendo o mesmo
meio usado para o isolamento. As placas foram incubadas a 50°C por 48
a 72 horas e, após este período, as colônias foram caracterizadas em
relação à sua morfologia e presença de esporos característicos
(Imagem 3, anexo I). Para a confirmação das cepas caracterizadas
morfologicamente, estas foram também incubadas em ágar nutriente
(Biolife) a pH 7,0 e incubadas a 50°C. A ausência de crescimento nestas
condições confirmarou a natureza acidofílica dos isolados e descartou a
presença de bacilos ácido tolerantes.
As cepas isoladas foram enviadas para a Fundação André Tosello
(Campinas, SP) para a identificação e depósito na Coleção de Culturas
Tropical (CCT) (Anexo I).
3.1.5 Estocagem das culturas
A estocagem das cepas isoladas foi realizada de acordo com a
metodologia descrita por Muro e Luchi (1989).
Para estocagem, foram utilizados frascos do tipo penicilina
(10 mL), preenchidos até metade de seu volume com sílica gel,
tampados com algodão e previamente esterilizados em estufa por calor
seco durante 3 horas à temperatura de 180°C. As tampas de borracha
utilizadas no fechamento foram autoclavadas por 121°C durante
15 minutos.
As cepas de fungos foram cultivadas em meio PDA por 7 dias a
25°C e 30°C (fungos termorresistentes). As colônias de Alicyclobacillus
sp., cultivadas em meio BAT durante 7 dias a 50°C. Posteriormente,
foram adicionados 8 mL de solução de leite desnatado a 5% sobre placas
e foi realizada a retirada superficial da massa celular aderida às placas.
Um mililitro da suspensão foi transferido para os frascos de penicilina
os quais foram resfriados imediatamente em banho de gelo por
10 minutos. Em seguida, o tampão de algodão do frasco foi retirado
sendo o frasco fechado com uma tampa de borracha lacrada com selo de
59
alumínio. Todos os procedimentos foram realizados, em duplicata,
dentro de uma câmara de fluxo laminar.
Para a reativação das linhagens estocadas, alguns fragmentos de
sílicas foram removidos assepticamente do frasco original e transferidas
para um tubo inclinado contendo o respectivo meio de cultura que foi
então incubado nas temperaturas ótimas.
3.1.6 Identificação das cepas de fungos filamentosos isolados
A identificação foi realizada a partir das observações
macroscópicas e microscópicas dos fungos filamentosos isolados. A
análise macroscópica foi baseada nas descrições das colônias nos meios
Ágar Czapeck Extrato de levedura (CYA), Ágar Extrato de Malte
(MEA), Ágar Glicerol Nitrato 25% (G25N), formulados de acordo com
Pitt e Hocking (1999). Após inoculação do fungo nas placas (duplicata),
estas foram levadas à incubação nas temperaturas de 25°C.
Adicionalmente, placas contendo meio CYA foram incubadas a 5°C e
37°C. A imagem 1 do Anexo I representa o crescimento fúngico nos
referidos meios. Para as espécies xerofílicas, uma incubação adicional a
25°C foi realizada utilizando meio CY20S (Ágar Czapeck Extrato de
levedura com 20% de sacarose). Após incubação por 7 dias, foram
executadas as análises micro e macroscópicas das colônias formadas. A
metodologia microscópica para a avaliação morfológica do fungo em
lâmina procedeu-se da seguinte maneira: primeiramente foi depositada
uma gota de álcool sobre a lâmina; em seguida, usando uma alça de
platina, um fragmento do fungo foi colocado sobre o álcool e, no caso
dos fungos termorresistentes, suas estruturas foram abertas pela
manipulação das agulhas (montadas de forma a ficarem fixas em uma
das extremidades de palitos de madeira). Em seguida, procedeu-se a
fixação do fungo flambando a lâmina em bico de Bunsen. A coloração
foi realizada pingando uma gota de corante lactofucsina 0,1% ou Cotton
blue.
Pela microscopia, foram verificadas as estruturas de
caracterização como conídios, ascocarpos, ascos e ascósporos. Além
disso, para os fungos termorresistentes foi identificada a fase anamorfa
(assexuada). Todo o processo baseou-se na chave de identificação e nas
características dos fungos apresentadas por Pitt e Hocking (1999).
Uma cepa suspeita de se tratar de P. expansum foi enviada para a
Fundação André Tosello (Campinas, SP) para a identificação e depósito
na Coleção de Culturas Tropical (CCT) (Resultado apresentado no
60
anexo I).
3.2 Metodologia utilizada no Artigo 2: Aplicação de
dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético para redução de
esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e
Alicyclobacillus acidoterrestris na superfície de maçãs e em
soluções aquosas
3.2.1 Micro-organismos e preparo da suspensão de esporos
As cepas dos micro-organismos Byssochlamys fulva (CCT 0056),
Penicillium expansum (CCT 4680) e Alicyclobacillus acidoterrestris
(CCT 4384) foram obtidas da coleção de culturas da Fundação Tropical
de Culturas André Tosello (Campinas, SP, Brasil). O preparo da
suspensão de esporos dos fungos P. expansum e B. fulva iniciou-se pela
pré-esporulação em placas de Petri contendo meio PDA (pH 3,5) por 7
dias a 25ºC e 30ºC, respectivamente. Os esporos coletados foram
adicionados às placas de esporulação, contendo meio MEA, e incubados
na temperatura indicada para cada micro-organismo por 10 dias
(P. expansum) e 30 dias (B. fulva). Após este período, adicionou-se
10 mL de água destilada estéril em cada placa e, depois da raspagem,
todo o conteúdo foi filtrado em 4 camadas de gaze estéril e centrifugado
a 3500 rpm (2000 x g) por 15 minutos. Este procedimento foi repetido
duas vezes ou até a constatação microscópica da ausência de hifas. Ao
final, foi feita a resuspensão dos esporos em água estéril, sendo a
suspensão mantida sob refrigeração a 4ºC até posterior utilização
(SALOMÃO, et al. 2007).
A suspensão de esporos de A. acidoterrestris foi pré-esporulada
em tubos inclinados (PDA; pH 3,5) e incubados a 44ºC/3 dias. A
biomassa obtida foi adicionada a 10 mL de caldo AAM (Meio
Alicyclobacillus acidocaldarius), formulado de acordo com Murakami
et al., 1998) e incubada a 45ºC por 24 horas. O caldo enriquecido foi
espalhado sobre placas de Petri contendo meio AAM (suplementado de
0,05% de MnCl2.4H2O e 1,5% de ágar; pH 4) e incubado por 10 dias a
45ºC. Após a confirmação microscópica da produção de esporos por
coloração usando verde de Malaquita (MASSAGUER, 2006), a cada
placa foi adicionado 10 mL de água seguida de raspagem. O esporos
obtidos foram centrifugados 5 vezes a 3500 rpm (2000 x g) por
15 minutos, sendo eliminado o sobrenadante. Ao final, foi feita a
resuspensão dos esporos em água estéril, sendo a suspensão mantida sob
refrigeração a 4ºC até posterior utilização (MURAKAMI et al., 1998).
61
3.2.2 Teste de ativação para os esporos de B. fulva CCT 0056
Para a determinação das condições ótimas de ativação dos
esporos de B. fulva foi utilizada a temperatura de 80°C, que está dentro
da faixa ótima para Byssochlamys spp. (TOURNAS, 1994) durante os
tempos 0 (controle), 5, 10 e 15 minutos.
Em cada tubo foi adicionado contendo 5,3 mL de água destilada
estéril foi adicionado 0,1 mL da suspensão de esporos. Após
homogeneização, os tubos foram aquecidos em um banho
termostatizado (Tecnal®, Modelo TE-184, ± 0,1ºC de precisão),
previamente ajustado à temperatura de 80ºC. O tempo de subida até a
temperatura desejada foi determinado previamente conforme item 3.2.3.
Transcorridos os tempos de aquecimento definidos, os tubos foram
resfriados imediatamente em um banho de gelo.
Para a determinação do número de esporos ativados, foram
realizadas diluições seriais em água peptonada 0,1%, plaqueamento por
profundidade em meio PDA e incubação a 30°C durante 5-7 dias. O
resultado foi expresso em esporos/mL. O teste foi realizado em
duplicata para cada temperatura testada. O Gráfico 1 do anexo II, mostra
a representação da ativação dos esporos de B. fulva CCT 0056.
3.2.3 Determinação do tempo de subida da temperatura
Os tubos foram preenchidos com suficiente quantidade de água e
adicionados de um termopar, de cobre-constantan tipo T fixado no
centro dos tubos, ligado ao sistema de aquisição que gera os dados no
programa monitor de termopares. Após esta montagem, o tubo contendo
o termopar, foi colocado no banho previamente ajustado na temperatura
desejada enquanto o programa monitor produziu o gráfico que
representou o aumento da temperatura pelo tempo transcorrido,
fornecendo assim, a determinação do tempo exato em que a amostra
atingiu a temperatura testada (tempo de subida). O tempo de subida para
cada temperatura foi determinado em triplicata.
3.2.4 Preparo das soluções sanitizantes
As soluções à base de dicloroisocianurato de sódio foram
formuladas a partir do produto Sumaveg® (Johnson Diversey, São
Paulo, Brasil) e as soluções à base de ácido peracético a partir do
62
produto Tsunami 100® (ECOLAB, São Paulo, Brasil). A concentração
dos princípios ativos de cada solução foi confirmada utilizando fitas
medidoras específicas para a medição de cloro livre (Test Systems Inc.,
Rock Hill, SC, Estados Unidos) e ácido peracético (Weber Scientific,
Chestertown, Md, Estados Unidos). Todas as soluções foram mantidas
nas temperaturas de 25°C e/ou 37°C.
3.2.5 Teste sobre a superfície das maçãs
Os testes sobre a superfície das maçãs foram baseados na
metodologia adaptada de Lee et al., 2004. As maçãs, da variedade Fuji,
foram adquiridas em mercado local, sendo que sempre procurou-se
escolher frutas sem lesões aparentes e de calibre semelhante. No
laboratório, primeiramente as maçãs receberam lavagem com água
potável e, em seguida, foram colocadas dentro de sacos estéreis com
100 mL de água destilada estéril e massageadas por 1 min.
Posteriormente, as maçãs foram secas em gaze estéril e sobrepostas em
superfície esterilizada com o pedúnculo voltado para cima. A inoculação
das maçãs foi feita na região em torno do pedúnculo utilizando-se
0,1 mL de suspensão dos esporos, com concentração de 105, 107 e
106 esporos/mL, respectivamente de P. expansum, B. fulva e
A. acidoterrestris. As frutas inoculadas com os fungos permaneceram
por duas horas em câmara de fluxo laminar para a fixação dos esporos
(tempo baseado em testes prévios) e, as inoculadas com
A. acidoterrestris, permaneceram 24 horas (SAPERS, et al., 2001). Para
o tratamento, as maçãs foram colocadas individualmente dentro de sacos
estéreis e adicionadas de 100 mL das soluções sanitizantes nas
concentrações de 0, 50, 80, 150, 200 e 250 ppm de ácido peracético e 0,
50, 100, 150, 200 e 250 ppm de cloro, separadamente para cada
concentração. Neste caso, foram testadas soluções estabilizadas à
temperatura de 25ºC e 37ºC para os esporos de B. fulva e de
A. acidoterrestris. Posteriormente, massageou-se a fruta com as mãos
durante 1 minuto e foi coletada a primeira amostra de 4,0 mL. Em
seguida, manteve-se o contato do sanitizante com a fruta (sem
massageamento) por mais 1 min e coletou-se outra amostra de 4,0 mL.
Imediatamente, cada amostra foi neutralizada com 1,3 mL de solução de
tiossulfato de sódio 0,6% por 2 minutos. À exceção dos esporos de
P. expansum, os demais receberam um choque térmico em banho
termostatizado (Tecnal®, Modelo TE-184, Piracicaba, Brasil ± 0,1ºC de
precisão) a 80ºC/10 min. Este tratamento de ativação foi baseado em
63
resultados anteriores para os esporos de B. fulva (item 3.2.2; Gráfico 1
do anexo II) e, para os esporos de A. acidoterrestris, utilizou-se o
mesmo choque térmico já utilizado por outros autores (MURRAY et al.,
2007; PEÑA; MASSAGUER, 2006; SILVA; GIBBS, 2001;
GROENNEWALD et al., 2009; WALLS; CHUYATE, 2000 e ORR;
BEUCHAT, 2000). Em seguida, as amostras foram diluídas serialmente
eplaqueadas em meio PDA (pH 3,5) (OKULL et al., 2006; OKULL;
LABORDE, 2004; SPLITTSTOESSER et al., 1993; MURRAY et al.,
2007). A incubação ocorreu a 25°C para P. expansum, 30°C para
B. fulva e 43°C para A. acidoterrestris durante um período de 4-5 dias.
A partir da amostra sem tratamento, foi calculado o número de reduções
decimais (RD) segundo a equação 3.1. Cada condição foi testada em
triplicata e um teste adicional foi executado para testar uma possível
ação do neutralizante na destruição dos esporos. Para tanto, as frutas
foram lavadas com 100 mL de água estéril e, após massageamento por
1 min, a amostra de 4 mL recebeu a adição de 1,3 mL de tiossulfato de
sódio 0,6%. Após o contato, as amostras foram ativadas (exceto esporos
de P. expansum), diluídas, plaqueadas e incubadas conforme descrito
anteriormente.
 No 
RD = log

 N 
(Equação 3.1)
Onde, No é a concentração inicial dos esporos, expressa em
(esporos/mL), e N é a concentração de esporos recuperada após cada
tratamento (esporos/mL).
64
a
b
c
d
Figura 3.1 - Sequência de análise: (a) secagem da fruta lavada, (b) inoculação
da suspensão do micro-organismo, (c) aplicação a da solução sanitizante e (d)
massageamento.
3.2.6 Teste em soluções aquosas
Os testes em soluções aquosas foram baseados na metodologia
adaptada de Orr e Beuchat (2000). Inicialmente, 0,1 mL da suspensão de
esporos foi adicionado aos tubos contendo 5 mL das soluções
sanitizantes em diferentes concentrações. Para esporos de P. expansum
foram testadas concentrações de 0, 25, 50, 75 e 100 ppm de cloro, nos
tempos de contato de 1, 2, 3, 4, 5 e 6 minutos e 0, 250 e 500 ppm de
ácido peracético por 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 e 120 minutos. Os
esporos de B. fulva foram testados em contato com concentrações de 0,
250, 400, 500, 600, 700 e 800 ppm de cloro nos tempos de 15, 30, 45,
60 e 75 minutos e 0, 500, 800, 1000, 1200, 1500 e 1800 ppm de ácido
peracético por 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos. Esporos de
A. acidoterrestris foram testados em contato com concentrações de 0,
250, 350, 400 e 500 ppm de cloro nos tempos de contato de 15, 30 45,
peracético por 15, 30, 45, 60 e 75 minutos. Neste teste, somente foram
65
usadas soluções sanitizantes estabilizadas a 25ºC. Após contato, foi
adicionado 1,6 mL de tiossulfato de sódio 0,6 % deixando-se agir por
2 minutos com o objetivo de neutralizar a ação dos sanitizantes. Após a
neutralização, as amostras contendo esporos de B. fulva e
A. acidoterrestris receberam um choque térmico de 80oC/10 min.
Seguidamente, cada amostra foi resfriada, diluída, plaqueada e incubada
conforme descrito já descrito. Cada condição foi testada
individualmente em triplicata. A partir da contagem das colônias
(esporos/mL), realizou-se o cálculo do número de reduções decimais de
acordo com a equação 3.1. Um ensaio adicional (triplicata) foi realizado
para testar uma possível ação do neutralizante (tiossulfato de sódio
0,6%) sobre os esporos, adicionando-se 1,6 mL deste reagente a 5 mL
de água e 0,1 mL da suspensão de esporos de micro-organismo. Após o
contato de 2 min, as amostras foram ativadas (exceto esporos de
P. expansum), diluídas, plaqueadas e incubadas conforme descrito
anteriormente.
3.2.7 Análise estatística dos dados
Utilizando o programa MINITAB® 14 (Minitab Inc., State
College, PA, Estados Unidos) os dados foram avaliados estatisticamente
pela análise de variância (ANOVA) sendo que os resultados foram
interpretados de acordo com o Teste de Tukey, onde as diferenças a
α=0,05 foram consideradas significativas.
3.3 Metodologia utilizada no artigo 3: Efficacy of sanitizing
treatments against Penicillium expansum inoculated on six
varieties of apples
3.3.1 Preparação da suspensão de esporos de Pencillium expansum
CCT4680
A suspensão foi preparada de acordo com o descrito na seção
3.2.1.
3.3.2 Frutas
Foram testadas as seguintes variedades: Red Delicious, Golden
Supreme, Empire, McIntosh, Fuji e Gala. Todas foram obtidas de
66
pomares pertencentes à Estação Experimental de Agricultura de Nova
York, Universidade de Cornell, Geneva, NY, Estados Unidos. Após a
colheita estas foram estocadas a 2ºC até uso.
a
b
d
c
e
f
Figura 3.2 - Variedades de maçãs: (a) Red Delicious, (b) Golden Supreme, (c)
Empire, (d) McIntosh, (e) Fuji e (f) Gala.
3.3.3 Inoculação na superfície das maçãs
Inicialmente as maçãs foram lavadas e esfregadas com água
corrente. Cada maçã foi então individualmente lavada com água
deionizada estéril e seca em gase estéril, dentro da câmara de fluxo
laminar. Ao redor do pedúnculo desenhou-se uma circunferência dentro
da qual foi depositado 0,1 mL (105 esporos/mL) da suspensão de
esporos de P. expansum. As maçãs inoculadas foram colocadas dentro
de uma câmara de fluxo laminar por 2 h para a fixação da suspensão.
3.3.4 Preparo das soluções sanitizantes
Foram preparadas soluções cloradas utilizando hipoclorito de
sódio (Ultra Bleach®) nas concentrações de 50, 100 e 200 ppm de cloro
livre. Depois da preparação, o pH das soluções atingiu 8,8, 9,3 e 9,7
para as três respectivas concentrações. Soluções cloradas, nas mesmas
concentrações foram acidificadas até pH 6,5 utilizando ácido fosfórico
67
0,25 N. Amostras controle foram preparadas utilizando água não
acidificada e acidificada a pH 6,5, usando o mesmo ácido.
Soluções à base de ácido peracético foram também testadas,
sendo estas elaboradas a partir do produto (Vortexx®, Ecolab) nas
concentrações de 50 e 80 ppm.
A concentração de cada solução foi confirmada utilizando fitas
medidoras específicas para a medição de cloro livre e ácido peracético.
Todas as soluções foram utilizadas imediatamente após o preparo e
mantidas nas temperaturas de 25°C.
3.3.5 Tratamento das maçãs
Cada variedade de maçã foi colocada, com a pedúnculo voltada
para baixo, dentro de um becker de 500 mL contendo 100 mL das
soluções sanitizantes ou água. Cada becker foi agitado manualmente por
30 s. Posteriormente, cada maçã foi imediatamente rinsada com 100 mL
de água deionizada para sessar a reação. A seção inoculada da maçã foi
removida assepticamente e a concentração de esporos restante nesta foi
extraída em água peptonada 0,1% em volume 10 vezes superior ao peso
da fruta cortada (diluição 1:10). Essa mistura foi agitada e, em seguida,
diluída serialmente em água peptonada 0,1% e plaqueada por
profundidade (duplicata) em PDA (Criterion) acidificado até pH 3,5.
A incubação ocorreu por 4-5 dias a 25ºC. O teste foi realizado em
triplicata.
3.3.6 Análises estatísticas
Os tratamentos foram analisados usando ANOVA e o teste
Student-Newman-Keuls. As diferenças significativas (P ≤ 0,05).
68
3.4
Metodologia
utilizada
nos
artigo
4:
Modeling
Penicillium expansum resistance to thermal and chlorine
treatments
3.4.1
Preparação
da
P. expansum CCT 4680
suspensão
dos
esporos
de
Foi realizada como descrito na seção 3.2.1.
3.4.2 Preparo das soluções sanitizantes à base cloro
As soluções cloradas foram preparadas como descrito no item
3.2.4, sendo os testes realizados à temperatura de 25ºC.
3.4.3 Teste em soluções aquosas
Os testes foram realizados como descrito no item 3.2.6 para
P. expansum, nas concentrações de 0, 25, 50 e 75 ppm de cloro.
3.4.4 Resistência térmica
A resistência térmica foi determinada em tubos capilares com
dimensões de 1,5 x 1,8 x 90 mm. O meio de aquecimento foi preparado
pela diluição de 1 mL da suspensão de esporos em 9 mL de suco de
maçã pasteurizado a 121ºC/5 min (pH 3,25; 12,2°Brix; acidez 0,45%).
Uma seringa equipada com um dispenser do tipo “Hamilton” foi usado
para injetar 0,04 mL do suco inoculado nos tubos capilares
(FUJIKAWA, et al., 2000; SPLITTSTOESSER; CHUREY, 1989).
Depois da selagem, 5 tubos foram aquecidos a 50, 52, 54, 56 e 60°C em
banho termostatizado (Haake® C1, ± 0,1ºC de precisão). Os tubos foram
removidos em vários intervalos sendo imediatamente resfriados em
banho de gelo e colocados em contato com álcool 95%, para reduzir o
nível de contaminação nos tubos capilares. O residual de álcool foi então
seco em papel filtro e os tubos, referentes ao mesmo tempo de contato,
foram transferidos para uma garrafa de diluição contendo água
peptonada 0,1% estéril suficiente para render um total de 20 mL de
solução. Os tubos capilares dentro das garrafas foram quebrados usando
um bastão gerando uma diluição inicial de 102 UFC/mL. Após as
69
subsequentes diluições, ocorreu um plaqueamento em PDA
(Criterion®), acidificado a pH 3,5, contendo 50 mg/mL de rosa de
bengala para inibir o espalhamento das colônias. A enumeração das
colônias ocorreu durante um período de 4-5 dias a 25ºC. Cada
experimento foi individualmente analisado em duplicata.
3.4.5 Modelagem da inativação de P. expansum
O software GInaFiT®, version 1.4.2 (GEERAERD et al., 2005)
foi usado para estimar os parâmetros de inativação. Para modelar a
inativação térmica de P. expansum CCT 4680 em suco de maçã, foi
comparada a habilidade dos modelos de Bigelow (equação 3.2) e
Weibull (equação 3.4) (MAFART et al., 2002). Para descrever a
inativação causada pelos tratamentos com sanitizante clorado, foi
comparada a habilidade do modelo Bifásico (equação 3.3), descrito por
Cerf (1970) e do modelo de Weibull. Os modelos foram comparados
utilizando os índices estatítisticos apresentados no item 3.4.6.
Os modelos de inativação foram:
t
 N 
Log 
=−
D
 No 
(Equação 3.2)
 N 
Log 
 = Log ( f × exp( − k max 1 × t ) + (1 − f ) × exp( − k max 2 × t )
 No 
t p
 N 
Log 
 = −( )
δ
 No 
(Equação 3.3)
(Equação 3.4)
Onde No é a concentração da população inicial de células
(UFC/mL); N é a concentração de sobreviventes depois de exposto a um
tempo t (UFC/mL); D é o tempo (min) para reduzir em 1 ciclo
logarítmico a concentração celular.
No modelo Bifásico, a fração f é considerada a sub-população
sensível ao tratamento e (1-f) é a outra fração da população que é
considerada resistente ao tratamento. As taxas específicas de inativação
das duas populações são kmax1 (min-1) e kmax2 (min-1),
respectivamente.
70
Na equação de Weibull, o fator p é o parâmetro de forma, sendo
que distribuição de Weibull corresponde a uma curva com concavidade
voltada para cima se p < 1 e concavidade voltada para baixo se p >1 e
linear se p =1. O parâmetro δ é o fator de escala e pode ser definido
como o “tempo para uma redução decimal”, se p = 1 (PELEG; COLE,
1998).
Os modelos secundários foram estabelecidos de acordo com o
modelo primário selecionados.
3.4.6 Comparação estatística dos modelos
A comparação dos modelos matemáticos foi realizada através dos
seguintes índices estatísticos: erro médio quadrático (MSE), fator bias e
fator de exatidão.
O cálculo do MSE foi realizado através da equação 3.5.
RSS
=
MSE =
n
∑ (Valor
− Valorpredito )
2
observado
n
(Equação 3.5)
onde: RSS é a soma dos quadrados residuais e n é o número de graus de
liberdade (número de pontos experimentais - número de parâmetros do
modelo).
Quanto menor o valor de MSE melhor é o ajuste do modelo aos
dados experimentais.
O fator bias representa a diferença média entre os valores
observados e preditos. Pode ser calculado através da equação 3.6.
fator bias = 10




∑
(
)
log Valorobservado / Valorpredito 


n

(Equação 3.6)
O fator bias é um desvio relativo médio. Se bias é igual 1, a
resposta observada é igual à resposta predita. No entanto, quando bias é
maior que 1, significa que o valor predito é maior que o observado.
Quando bias é menor que 1, significa que o valor predito é menor que o
observado.
O fator de exatidão (equação 3.7) é uma medida da diferença
média absoluta entre os valores preditos e observados.




fator exatidão = 10
∑
(
)
log Valorobservado / Valorpredito 

n

(Equação 3.7)
71
Quanto maior o valor do fator de exatidão, menor será a exatidão
da estimativa da média.
3.5 Metodologia utilizada nos artigo 5: Influence of storage
temperature and apple variety on patulin production by
Penicillium expansum
3.5.1 Preparação da cultura de Pencillium expansum CCT4680
A suspensão foi preparada de acordo com o descrito na seção
3.2.1.
3.5.2 Frutas
Foram testadas 6 variedades de maçã: Red Delicious, Golden
Supreme, Empire, McIntosh, Fuji e Gala. Todas foram obtidas de
pomares pertencentes à Estação Experimental de Agricultura de Nova
York, Universidade de Cornell, Geneva, NY, Estados Unidos e
estocadas a 2ºC até uso.
3.5.3 Inoculação da suspensão nas frutas
O teste foi realizado com 15 amostras de maçã de cada variedade.
Antes de cada experimento, as maçãs foram mantidas à temperatura
ambiente. Cada maçã foi lavada e esfregada sob água corrente.
Posteriormente, estas foram novamente lavadas com água deionizada
estéril e secas em gase estéril dentro de uma câmara de fluxo laminar.
As maçãs foram inoculadas, submergindo-as por 10 min dentro de
4 litros de suspensão de P. expansum CCT 4680 contendo
103 esporos/mL. A suspensão foi mantida à temperatura de 4ºC para
auxiliar na internalização dos esporos através do cálix e do pedúnculo. A
temperatura diferencial entre a maçã e a suspensão de esporos é
necessária para produzir uma pressão diferencial que promove a
internalização do micro-organismo (BARTZ, 2005; FDA, 1998). O
excesso de líquido foi drenado e as maçãs foram então estocadas em
duas diferentes temperaturas (11ºC e 20,5ºC). Adicionalmente, 15 maçãs
72
não inoculadas de cada uma das variedades foram mantidas nas mesmas
temperaturas para servir de controle.
3.5.4 Extração do suco das maçãs
Periodicamente, foram retiradas amostras das maçãs inoculadas e
o suco foi extraído para a análise de patulina. Cada fruta testada foi
triturada manualmente ou com auxílio de um liquidificador até formar
um purê que foi espremido através de quatro camadas de gaze para a
obtenção do suco. Todas as amostras de suco foram congeladas antes
das análises (-80ºC).
3.5.5 Análise de Patulina
As amostras congeladas foram enviadas para um laboratório
externo (Trilogy Analytical Laboratory, Inc. Washington, MO, Estados
Unidos) para análise de patulina no mesmo dia da extração ou no dia
seguinte. Foi utilizada para metodologia oficial adotada pela AOAC
para suco de maçã (método 995.10) (FDA, 2001b, BRAUSE et al.,
1996). O resultado foi expresso em µg/L ou partes por bilhão (ppb).
3.5.6 Fermentação do suco de maçã
Foi realizada uma fermentação do suco de maçã para verificar sua
ação em reduzir a patulina presente. Para tanto, utilizou-se uma levedura
seca comercial Saccharomyces cerevisiae (Lallemand®, Australia) para
fermentar o suco feito a partir de uma maçã da variedade McIntosh. O
suco foi preparado de acordo com a metodologia descrita anteriormente
(3.5.4) e, uma amostra deste foi enviada para o laboratório externo para
as análises de patulina de forma a deternimar a concentração inicial da
toxina no suco. Posteriormente, 60 mL deste suco (16,2ºBrix; pH 4,1)
foi divido em duas amostras de 30 mL que foram então individualmente
adicionadas de 0,5 g de levedura em pó para iniciar o processo de
fermentação. As amostras foram deixadas à temperatura ambiente (23 a
25ºC), sendo agitadas duas vezes por dia. A fermentação foi considerada
completa (7 dias depois da inoculação) quando acabou a evolução de
gás e o teor de sólidos solúveis atingiu 3,4 a 4,0ºBrix.
73
3.6 Metodologia utilizada nos artigo 6: Development of a sampling
plan at apple receiving step for patulin control in concentrated
apple juice
3.6.1 Estudo da seleção dos lotes (Etapa de recebimento das frutas)
Este estudo foi realizado dentro de uma indústria processadora de
suco de maçã concentrado localizada na região sul do Brasil. Vinte e
três lotes de maçã foram analisados em relação aos níveis de patulina
apresentados. Adicionalmente, foi desenvolvido um plano de
amostragem baseado na relação entre o número de maçãs apodrecidas e
sadias. Esse plano serve para selecionar lotes de maçã na etapa de
recebimento de forma que o produto final fique dentro nível máximo de
patulina permitido pelas agências regulatórias internacionais que é de
50 ppb (CODEX 2003a, FDA, 2001). As maçãs da variedade Fuji e/ou
Gala vieram tanto do campo (durante o período da safra – março a maio)
como de um packing house no período da entressafra (de julho até
outubro). O tamanho dos lotes foi baseado no volume (peso) das frutas
que são recebidas em caminhões (15.000 kg até 27.000 kg de maçã).
Considerando que o peso médio de uma maçã seja de 0,130 kg, o
tamanho dos lotes (em número de maçãs) foi estabelecido para ser
aproximadamente 100.000 até 200.000 maçãs. Cada lote foi analisado
(inspeção por atributos) e classificado como aceitável ou não aceitável
com base no número de maçãs não conformes. As maçãs não-conformes
foram definidas como aquelas com lesão ≥ 4 cm. Inicialmente, o plano
de amostragem foi baseado em uma referência normativa (NBR 5426 e
MIL STD 105D) (COSTA et al., 2005). O nível de qualidade aceitável
(NQA) escolhido foi de 15%, considerando as informações da indústria.
Levando-se em conta o número de maçãs recebidos em cada lote
(caminhão), uma amostra representativa deveria ser de 50 maçãs. A
partir desta amostra, um lote aceitável deveria conter até no máximo 11
maçãs podres. A elaboração do suco feito a partir das amostras e a
análise de patulina estão descritos nos itens 3.6.5. e 3.6.6,
respectivamente.
3.6.2 Estudo dos lotes hipotéticos (Etapa de recebimento das frutas)
Algumas frutas foram intensionalmente reunidas para formar uma
amostra (50 maçãs) de forma a determinar os níveis de patulina em
74
diferentes combinações de maçãs podres/sadias. As combinações são
explicadas abaixo:
(i) Considerando o tamanho da lesão ≥ 4 cm, os níveis de patulina
foram testados em amostras de 50 maçãs com as seguintes
combinações de podre/sadia: 5/45; 8/42 (duplicata), 11/39
(duplicada); 13/37 (duplicata) e 16/34. As amostras foram
tratadas como descrito no item 3.6.5.
(ii) Considerando o tamanho da lesão < 4 cm, os níveis de
patulina foram testados em amostras de 50 maçãs com as
seguintes combinações de podre/sadia: 8/42 (duplicata); 11/39
(duplicada); 13/37 (duplicata) e 16/34. As amostras foram
tratadas como descrito no item 3.6.5.
(iii) As frutas foram também combinadas para compor uma
amostra cujas maçãs podres contivessem alto nível de
contaminação por P. expansum: 11/39 (duplicada); 18/32 e
32/0. As amostras foram tratadas como descrito no item 3.6.5.
(iv) Três amostras (50 maçãs em cada amostra) contendo somente
frutas sadias sem nenhum visível desenvolvimento de fungo
foram montadas e preparadas como descrito no item 3.6.5.
3.6.3 Estudo de lavagem e sanitização (Etapa de lavagem das frutas)
(i) O primeiro estudo foi desenvolvido na etapa de lavagem
durante o processamento de suco concentrado de maçã, de
forma a verificar a eficácia da água sob alta pressão em
remover a toxina da fruta. A partir de cada lote recebido, uma
amostra de 50 maçãs foi retirada antes e depois da lavagem.
As amostras foram tratadas como descrito no item 3.6.5.
(ii) Quatro amostras de 250 mL da água usada durante a etapa de
lavagem foram coletadas do reservatório de recirculação de
água. Estas amostras foram congeladas a -18ºC e enviadas
para análise de patulina.
Adicionalmente, foi realizado um estudo da eficácia de
agentes sanitizantes em reduzir níveis de patulina. As
soluções foram preparadas a partir de dicloroisocianurato de
sódio (Sumaveg®, Jonshon Diversey) e ácido peracético
(Tsunami 100®, ECOLAB). Estes testes são descrito a seguir:
(iii) Esta investigação avaliou a eficácia dos sanitizantes em
reduzir níveis patulina de soluções aquosas. Um mililitro de
patulina (solução estoque B – item 3.6.7) foi adicionado a um
75
balão volumétrico de 100 mL e o volume restante foi
completado com soluções de cloro (0, 25, 50, 100 and
200 ppm) e ácido peracético (0, 80 and 100 ppm).
Imediatamente, cada amostra (duplicata) foi congelada à
temperatura de - 18ºC e enviada para análise.
(iv) Esta investigação avaliou a eficácia dos sanitizantes em
reduzir patulina de superfície de maçãs. Amostras de maçã
Fuji (compradas em um mercado local) foram submetidas aos
seguintes procedimentos: Primeiro, as frutas foram lavadas
em água corrente e depois novamente lavadas com água
destilada estéril e secas em gaze. Cada maçã foi colocada com
dentro de uma câmara de fluxo laminar e 100 µL da solução
estoque (solução estoque A – seção 3.6.7.) foi depositada ao
redor da pedúnculo. As maçãs artificialmente contaminadas
foram deixadas por 1 h dentro da câmara para permitir a
fixação da solução de patulina. Cada maçã individualmente
(duplicata) foi acondicionada em um saco e 100 mL de
soluções cloradas (0, 50, 100 e 200 ppm) foram adicionadas.
As frutas foram então massageadas por 30 s e 2 min
manualmente e, após o tempo de contato, o líquido dos sacos
foi transferido para um recipiente já contendo 5 mL de
tiossulfato 0,6% com o objetivo de impedir que o sanitizante
continuasse agindo. As soluções resultantes foram
imediatamente congeladas (-18ºC) e enviadas para um
laboratório externo para análises.
3.6.4 Análise do suco de maçã após prensagem (Etapa da
prensagem)
Paralelamente, um estudo foi conduzido para investigar os níveis
de patulina presentes no suco após a prensagem, de forma a avaliar
quanto de patulina, vinda das frutas, pode permanecer no suco prensado.
A etapa de prensagem ocorre logo após a moagem das frutas. Durante
este processo contínuo de moagem, quatro amostras do suco resultante
foram retidas. É importante salientar, que depois da prensagem o suco é
conduzido para etapas subsequentes, porém estas não foram amostradas
neste trabalho. Cada amostra foi tratada de acordo com o descrito no
item 3.6.5.
76
3.6.5 Preparação das amostras para as analises de patulina
As amostras de maçã foram trituradas em uma centrífuga caseira
e o produto resultante foi tratado enzimaticamente (Pectinex®,
YieldMASH, Novozymes) para a extração do suco. O processo ocorreu
sob aquecimento atingindo a temperatura de 80ºC com o objetivo de
descontaminar o suco e evitar futuras fermentações com consequente
degradação de patulina. Subsequentemente, cada amostra foi filtrada em
um filtro de papel (Fig. 3.3) sendo o suco resultante imediatamente
congelado a -18ºC e enviado para análises de patulina no laboratório
(The National Food Laboratory, Dublin, CA, Estados Unidos). As
amostras dos testes de lavagem e sanitização foram também congeladas
a temperatura de - 18ºC e enviadas para análises de patulina tanto no
laboratório citado anteriormente, quanto no Laboratório de Análises –
LABCAL, UFSC, Brasil.
3.6.6 Análises de patulina
Foi utilizada para metodologia oficial adotada pela AOAC para
suco de maçã (método 995.10) (FDA, 2001b, BRAUSE et al., 1996). O
resultado foi expresso em µg/L ou partes por bilhão (ppb), sendo o nível
de detecção de 10 ppb.
3.6.7 Preparação das soluções estoque de patulina
A patulina foi adquirida da empresa Sigma Chemical Co. (St.
Louis, Mo, Estados Unidos). Uma solução estoque foi preparada
dissolvendo 3 mg de patulina pura (cristalina) em 10 mL de água
destilada (solução estoque A). Outra solução estoque B foi preparada
dissolvendo 10 vezes a solução estoque A. Todas as soluções ficaram
mantidas congeladas a -18ºC.
77
a
c
b
d
Figura 3.3 - Preparação das amostras para as análises de patulina.
Procedimento descrito no item 3.6.5. (a; b) suco sendo submetido ao tratamento
enzimático; (c; d) filtragem do suco
d
b
78
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
Os resultados serão apresentados na forma de artigos como
descrito a seguir:
4.1 Artigo 1: Submetido à revista International Journal of Food
Microbiology.
Survey of molds and Alicyclobacillus from a
concentrated apple juice productive process in Brazil.
4.2 Artigo 2: Submetido à revista Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Aplicação de dicloroisocianurato de sódio e ácido
peracético
para
redução
de
esporos
de
Penicillium expansum,
Byssochlamys fulva
e
Alicyclobacillus acidoterrestris na superfície de maçãs
e em soluções aquosas.
4.3 Artigo 3: Publicado na revista Journal of Food Protection, v. 71,
n. 3, p. 643-647, 2008.
Efficacy of sanitizing treatments against Penicillium
expansum inoculated on six varieties of apples
4.4 Artigo 4: Aceito para publicação na revista Journal of Food
Protection, In Press.
Modeling Penicillium expansum resistance to thermal
and chlorine treatments
4.5 Artigo 5: Publicado na revista Journal of Food Protection, v. 72,
n. 5, p. 1030-1036, 2009.
Influence of storage temperature and apple variety on
patulin production by Penicillium expansum
4.6 Artigo 6: Submetido à revista Food Control
Development of a sampling plan at apple step for
patulin control in concentrated apple juice
79
4.1 Survey of molds and Alicyclobacillus from a concentrated apple
juice productive process in Brazil
Apresentação:
Este trabalho inicial teve o objetivo de realizar o levantamento da
microbiota do processo produtivo de suco de maçã concentrado de
forma a conhecer seus micro-organismos prevalentes e mais relevantes.
Survey of molds and Alicyclobacillus from a concentrated apple
juice productive process in Brazil
Beatriz de Cássia Martins SALOMÃO, Chalana MÜLLER, Gláucia
Maria Falcão de ARAGÃO*
Department of Chemistry Engineering and Food Engineering, Federal
University of Santa Catarina – UFSC, 88040-900, Florianópolis - SC, Brazil
*Phone: (48) 37219448 r.245 Fax: (48) 48 37219687 [email protected]
ABSTRACT
Bacteria and molds may spoil and/or contaminate apple juice
either by direct microbial action or indirectly by the uptake of
metabolites as off-flavours and toxins. Some of these microorganisms
and/or metabolites may remain in the food even after extensive
procedures. This study seeks to identify the presence of molds
(including heat resistant species) and Alicyclobacillus spp., during
concentrated apple juice processing. Molds were isolated at different
steps and then identified by their macroscopic and microscopic
characteristics after cultivation on CYA, MEA and G25N media at 5, 25
and 37°C, during 7 days. ATSB were identified as A. acidoterrestris by
a further investigation based on 16S rRNA sequence similarity. Among
the 19 genus found, 63% were identified as Penicillium with 50%
belonging to the P. expansum specie. With regards to heat resistant
molds, the species Neosartorya fischeri, Byssochlamys fulva and also
the genus Eupenicillium sp., Talaromyces sp. and Eurotium sp. were
isolated. The large contamination found indicates the need for methods
to eliminate or prevent the presence of these microorganisms in the
processing plants in order to avoid both spoilage of apple juice and toxin
production.
Keywords: Concentrated apple juice. Alicyclobacillus acidoterrestris.
Heat resistant mold. Penicillium expansum.
80
1 Introduction
Apple juice belongs to the most frequently consumed types of
fruit juices worldwide (ZIERLER et al., 2004). The necessity to
implement and optimize fast and efficient methods for quality control
appears as a consequence of this use (SILVA et al., 2007), and should
be done throughout the whole processing procedure, beginning in the
orchard (KUPFERMAN, 1986).
Some species of fungi may cause serious postharvest diseases in
apples (KUPFERMAN, 1986). Among them, Penicillium expansum is
reported as being responsible for major decay on apples. Studies show
that its inoculum is found in soil, on plant surfaces, in dump tank or
flume water (SPOTTS et al., 1988; SPOTTS; CERVANTES, 1993), in
contaminated wooden bins (SANDERSON; SPOTTS, 1995) and in the
atmosphere (AMIRI; BOMPEIX, 2005). Furthermore, this mold has the
ability to produce patulin (DOORES, 1983), a mycotoxin reported to
cause oxidative damage to the DNA in human cells, which plays a role
in mutagenesis and cancer initiation (LIU et al., 2003).
Heat resistant molds (HRM) are among the microorganisms of
great importance in the spoilage of heat-processed fruit juices, such as
apple juice. Representative species are found in the genera
Byssochlamys, Neosartorya, Eupenicillium, Talaromyces, (PITT;
HOCKING, 1999; TOURNAS, 1994, SURESH et al, 1996), Eurotium
(SPLITTSTOESSER et al., 1989, YILDIZ; COKSÖYLER, 2002) and
Paecilomyces (PIECKOVÁ; SAMSON, 2000; PEÑA et al., 2004).
Some of the heat resistant molds can cause both spoilage of fruit
products and produce toxic and sometimes carcinogenic compounds
(UGWUANYI; OBETA, 1999, TOURNAS, 1994).
Alicyclobacillus acidoterrestris is a thermoacidophilic sporeforming bacterium (ATSB) which is able to spoil acidic juices
(YAMAZAKI et al., 1996; CHEN et al., 2006; EGUCHI, et al., 1999;
GROENEWALD et al., 2009; BAHÇECI; ACAR, 2007). Spoilage by
Alicyclobacillus has become a problem for the apple juice industry and
effective solutions for its control can be found to control its
development. The spoilage generally is manifested as an off-flavour and
an off-odour of a medicinal or chemical nature due to the formation of
guaiacol and halophenols (CHANG; KANG, 2004; CHEN et al., 2006;
YAMAZAKI et al., 1996), leading to consumer rejections (ZIERLER et
al, 2004).
Apples rejected by the rigid selection criteria for the fresh fruit
consumption market are used for juice processing and those
81
microorganisms mentioned above may be present leading to a health
risk for consumers and/or high economic losses due to juice
deterioration. This study aims to survey molds (including heat resistant
ones) and Alicyclobacillus in a concentrated apple juice manufacturing
process.
2 Materials and methods
2.1 Sampling
Samples were obtained at different stages from a concentrated
apple juice processing plant in Brazil in 2005. The samples (collected in
the off-season period) were taken at the following steps: apples in the
reception (A); washed apples (WA); wash water (W) (recycled in a
close system); must (M); bagasse (B); before pre-concentration (BPC);
after pre-concentration (APC); enzymatic treatment (ET); before ultrafiltration (BUF); after ultra-filtration (AUF); before concentration (BC);
after concentration (AC) and final product (FP). All samples were
collected (approximately 250 mL per step) on the same day, then stored
under refrigeration in sterile sampling containers and analyzed within 24
h. Samples of apples were collected randomly to represent the real state
of the fruits. During the analysis, pieces of different apples were mixed
to maintain the randomness of the tests.
A diverse range of samples were tested in order to provide
comprehensive data on the occurrence of molds and yeasts, heat
resistant molds (HRM) and Alicyclobacillus at different stages of
processing. A duplicate trial from the final product (FP) was analyzed in
regards to heat resistant molds in another sampling made during harvestseason. In addition, a sample of a stored rotten apples (SA) with a
visible blue mold damage was taken from the packing house (at the offseason) in order to identify the mold specie. Figure 1 presents the flow
diagram of the production process indicating the sample codes and their
localization.
82
Figure 1. Concentrated apple juice flow diagram with samples codes.
83
2.2 Molds and Yeasts isolation
Molds and yeasts were detected by diluting 25 g of apples and
bagasse samples in 225 mL of 0.1% peptonated water, followed by a
two minute homogenization in a stomacher (ITR, Model 1204). Juice
and liquid samples were just diluted in water (10 mL of the sample in
90 mL of the diluent). Subsequently, serial dilutions were made and then
samples were plated in duplicate, using Potato Dextrose Agar (PDA,
Biolife®, Milan, Italy) acidified to pH 3.5 with 10% tartaric acid
solution. All plates were then incubated at 25ºC and colonies were
counted after 3-5 days. The results were expressed as CFU ml-1or CFU
g-1, depending on the kind of sample (SILVA et al., 1997).
2.3 Heat resistant molds isolation
Apples (previously mixed in a blender) and samples of bagasse
were homogenized (100 g of the samples plus 100 mL of sterile
distillated water) in a stomacher for 4 min. Two 50 mL portions of
homogenized samples were then transferred to sterile test tubes and heat
shocked in a water bath (Tecnal®, Model 184, +/- 0.1°C) at 80°C for 30
min. Concurrently, 50 mL samples of concentrated apple juice (70°Brix)
were diluted with 50 mL of sterile distillated water and then also heated
shocked. Liquids samples (35°Brix or less) were analyzed without any
previous dilution and two 50 mL aliquots of each sample were subjected
to the same heat treatment previously described. After heating, duplicate
samples of 50 mL were cooled and combined with 100 mL of acidified
(pH 3.5) PDA (double agar concentration) supplemented with 50 mg/L
of rose bengal and 4 mg/L of cloranfenicol. Subsequently, samples were
distributed in eight Petri dishes which were loosely sealed in a plastic
bag to prevent drying and incubated at 30°C for up to 30 days. Most
viable ascospores germinated and formed visible colonies within 7 to
10 days (BEUCHAT; PITT, 2001).
2.4 Alicyclobacillus isolation
The methodology of isolation was based on Eguchi et al. (1999)
which suggested one method for counting and another one for detecting
Alicyclobacillus spp. (ATSB).
84
In order to count ATSB, samples of concentrate juice were
diluted prior to analysis (10 mL of juice in 90 mL of sterile distilled
water). The other liquid samples (10 mL) were diluted in 90 mL of BAT
(Bacillus alicycloterrestris broth). Samples of apples and bagasse (25 g)
were blended with 225 mL of distillated water in a stomacher for 2 min
and 10 mL of these samples were then diluted in 90 mL of BAT broth.
The diluted samples were heated shocked at 80°C for 10 min, and
aliquots were plated on BAT agar by the pour plate technique. All plates
were incubated at 50°C for 4 days (plates were monitored for up to 10
days) for enumeration if the colonies grew on the plates.
Concurrently, a technique for detecting was also performed with
the same samples. In the detection method, the samples were prepared
and heated shocked at 80ºC for 10 min as described above and were
subsequently incubated at 50°C for 24 h to enrich the cultures. An
aliquot of 1 mL of the enrichment culture was directly pour plated with
BAT and incubated at 50°C for 4 days (plates were monitored for up to
10 days). This result was express as the absence or presence of
Alicyclobacillus (ATSB).
2.5 Mold identification
The mold identification was made by macroscopic and
microscopic observations using identification keys as described by Pitt
and Hocking (1999). Each strain isolated on PDA was transferred to
MEA (Malt Extract Agar) and CYA (Czapek Yeast Extract Agar) and
G25N (25% Glycerol Nitrate Agar) media in duplicate trials. Cultures
were grown on these three standard media at 25ºC for 7 days. Those
inoculated on CYA was additionally incubated at 5 ºC and 37ºC for the
same period. Furthermore, Czapek agar with 20% sucrose (CY20S) was
prepared to help in the identification of genera suspected to be
xerophilic. After incubation, the diameters of macroscopic colonies from
the underside were measured and macroscopic characteristics such as
color, texture and exudates, were analyzed for each colony. Microscopic
structures were investigated with a microscopic (Bioval®) by using
0.1% lactofuchsin stain or lactophenol fungal stain (Cotton blue). Yeasts
were not identified in this study; only molds were identified (heat
resistant or not).
In addition, this investigation identified the fungus present in a
storage apple (SA) with visual signs of blue mold invasion. For this, a
colony of mold from an apple were scraped and transferred to PDA and
85
incubated for 5 days at 25ºC. After the isolation, the strain was sent to
André Tosello Foundation (Campinas, SP, Brazil) for further
identification and to be deposited at the Collection of Tropical Cultures
(CCT).
2.6 Alicyclobacillus morphological characterization and identification
Single colonies present at the surface of BAT agar were picked
off and streaked onto the same medium used for isolation. Plates were
incubated at 50ºC for 48 to 72 h and then, the overall microscopic
morphology and the presence or characteristics of spores were
investigated. Strains with characteristic morphology were inoculated
onto Nutrient agar (Biolife®, Milan, Italy) at pH 7 and incubated at
50°C to confirm the acidophilic nature of the isolates and discard the
presence of acid tolerant bacilli.
The isolated Alicyclobacillus strains were sent to André Tosello
Foundation (Campinas, Brazil) for further identification on basis of
standard biochemical and morphological tests and also based on 16S
rRNA sequence similarity. Also, the isolated strains were deposited at
the Collection of Tropical Cultures (CCT).
3 Results
The occurrence of molds and yeast from the tested samples is
summarized on Table 1.
In order to express the results, each strain was encoded according
to the initial letters of the sample which was isolated and preceded by a
number that represents the sequence of isolation.
A total of 13 strains of molds were isolated of which 12 were
identified as belonging to the genus Penicillium: 1 strain from sample
SA (1SA), 1 strain from sample A (1A), 2 strains from sample W (1W;
2W), 2 strains from sample WA (1WA; 2WA), 3 strains from sample B
(1B; 2B; 3B), 1 strain M (1M) and 2 strains BPC (1BPC; 2BPC). From
this total, the species was encoded as SA, 1A, 1W, 1WA, 1B and 2BPC
was identified as Penicillium expansum. The strain SA was deposited in
the
Tropical
Collection
Cultures
and
re-encoded
as
Penicillium expansum CCT 7549. The strain isolated from sample AC
86
was identified as Talaromyces sp. (1AC). Only yeasts (not identified in
this study) were verified in the samples from ET, BUF, AUF and BC.
Table 1. Average number of molds and yeasts from different stages of a
concentrated apple juice process
Sample (code)
Apples at the reception (A)
Wash water (W)
Washed apples (WA)
Bagasse (B)
Must (M)
Before pre-concentration (BPC)
After pre-concentration (APC)
Enzymatic treatment (ET);
Before ultra-filtration (BUF)
After ultra-filtration (AUF)
Before concentration (BC)
Concentrate apple juice (AC)
Final product (FP)
Average number of
molds and yeasts
1.3 x105 CFU/g
6.6 x 105 CFU/mL
1.3 x 107 CFU/g
4.5 x 105 CFU/g
9.3 x 104 CFU/mL
7.0 x 105 CFU/mL
< 10 CFU/mL
1.5 x 102 CFU/mL
3.0 x 102 CFU/mL
2 CFU/mL
5 CFU/mL
1.7 x 102 CFU/mL
< 10 CFU/mL
The six strains of HRM isolated and identified in this
investigation are shown in Table 2.
Table 2. Average number of heat resistant molds (HRM) found at
different stages of a concentrated apple juice process and the strains
identified
Sample (code)
Average
number of
HRM
Wash water (W)
1 CFU/100mL
Washed apples (WA)
Before pre-concentration
(BPC)
Final Product (FP)
3 CFU/100g
HRM identified (code)
Eupenicillium
cinnamopurpureum (1Wr)
Eurotium sp. (1WAr )
Neosartorya fischeri (2WAr)
Eurotium sp. (3WAr)
1 CFU/100mL
Eupenicillium sp. (1BPCr)
2 CFU/100mL
Byssochlamys fulva (1FPr)
87
The methodology used to verify the incidence of Alicyclobacillus
included two different techniques. One technique involved counting
Alicyclobacillus and the other one was used only to detect their
presence. The incidence of Alicyclobacillus was only verified in those
samples that were subjected to the detection method, so that the result
was expressed based only on the presence or absence of Alicyclobacillus
(ATSB). The detection of Alicyclobacillus was observed in the two
following samples: enzymatic treatment (ET) and before ultra-filtration
(BUF). The strains ET and BUF were submitted for analysis based on
the 16 S rRNA sequence which indicated (98 and 99%) similarity with
the same gene of the A. acidoterrestris. The identified strains ET and
BUF were deposited at the Tropical Collection Cultures as
A. acidoterrestris CCT 7547 and A. acidoterrestris CCT 7548,
respectively.
The macroscopic and microscopic description of molds isolated in
this study is shown below. Furthermore, some images of their structures
are exhibited in Figure 2.
The isolates identified as Penicillium sp. (2W, 2WA, 2B, 3B, 1M
and 1BPC) showed macroscopically colonies with different
characteristics of color, texture and size, depending on the strain. It was
observed that all strains grow on CYA, MEA and G25N at 25ºC but not
on CYA at 37ºC and 5ºC. Microscopic observation revealed the
presence of different types of penicilli and spherical or ellipsoidal
conidia.
The P. expansum isolated (1A, 1W, 1WA, 1B and 2BPC) on
CYA (25-35 mm diameter) showed colonies centrally colored from dull
green to slightly brown, surrounded (annularly) by a thick external layer
of white color, clear to pale yellow exudates, tufted surface velutinous to
floccose, moderate sporulation and a deep brown underside (caramel).
The colors of colonies on MEA (20-35 mm diameter) ranged as seen on
CYA to slightly greyer with orange exudates and a pale underside.
Colonies on G25N (15-20 mm diameter) were centrally cream colored,
surrounded by a thin external layer of white with a dull brown
underside. No growth was observed at 5ºC and 37ºC. Microscopically,
conidiophores with smooth walls bearing terminal penicilli
terverticullate (P. expansum CCT 7549 represented in the Fig. 2 a) and
smooth walled ellipsoidal conidia (4 to 5 µm long) were observed. In
addition, 14.5-19.0 µm long metula and 10.0 - 14.0 µm long phialides
were observed.
The strain codified as 1AC showed colonies on CYA of 6070 mm of diameter, a floccose appearance, uniformly pale olive brown
88
color and a pale underside. Colonies on MEA (covering the whole Petri
dish) were very similar to those in CYA. Colonies on G25N (15-17 mm
of diam) were similar to those on CYA. At 37°C on CYA, colonies
covering the whole Petri dish were similar to those at 25°C. No
germination was observed at 5°C. Microscopically (Fig. 2 k, l, m, n) the
strain developed the characteristic of a HRM showing yellow
gymnothecia with closely interwoven hyphae and ascus characteristic of
the teleomorph Talaromyces. The conidia (around 5 µm long) were
strictly cylindrical to pyriform. Talaromyces is associated with an
anamorphic state characteristic of Penicillium, Paecilomyces or
Geosmithia. The observation of the anamorph showed phialides alone
characteristically swollen at the base and gradually narrowing into a
long beak. Based on this, considering the characteristic of the
conidiophores borne and conidia shape, the anamorph state was
identified as Paecilomyces.
On CYA at 25°C, the strain of Neosartorya fischeri (2WAr)
showed colonies (around 70 mm of diam) colored white to pale yellow
(centrally) with plane and sparse surface with a floccose texture and pale
underside. Similarly on MEA, colonies (75 mm of diam) were white to
pale cream showing a plane surface with a floccose texture and pale
underside. Colonies on G25N (15 mm diameter) were colored white
with a pale underside. At 37°C on CYA, colonies covering the whole
Petri dish were white to pale cream, sulcate, floccose and a pale
underside. No growth was observed at 5ºC. Microscopic observations
showed (Fig. 2 h, i, j) clear cleistothecia, ascus and ornamented
ascospores (7.5 µm long) with two longitudinal flanges. The anamporph
Aspergillus with the head formed from phialides was alone observed.
Eupenicillium cinnamopurpureum (1Wr) presented colonies on
CYA (10-20 mm of diam) of dense texture, sulcate, clear exudate of
white color and pale cinnamon underside. Colonies on MEA (12-17 mm
of diam) were colored white with a pale underside. Colonies on G25N
(12-15 mm of diam) were colored white with a cinnamon-colored
central region and a pale cinnamon underside. At 37ºC on CYA,
colonies with a diameter of 5-7 mm were colored white. No growth was
observed at 5ºC. Microscopic observations showed a strictly
monoverticulate penicillin with ampulliform phialides (Fig. 2 c) and
ellipsoidal spores. It was not possible to observe cleistothecia, however,
Pitt and Hocking (1999) affirmed that some isolates fail to produce
cleistothecia at all.
Colonies of Eupenicillium sp. (1BPCr) on CYA (45-50 mm of
diam), were colored white, radially sulcate, with a dense texture and
89
pale yellow underside. Colonies on MEA (50-55 mm of diam) were
similar to CYA. On G25N (5-7 mm of diam) colonies were colored
white with a floccose texture and pale yellow underside. At 37°C, white
colonies with a diameter of 25-30 mm were radially sulcate with a pale
yellow underside. No germination was observed at 5ºC. Microscopic
observations showed yellow cleistothecia (Fig. 2 b), however it was
difficult to observe ascospores.
The colonies of Eurotium sp. (1WAr) on CYA (17-20 mm of
diam) were dense, sulcate with an intense yellow color and an orange
underside. Both the colonies and the underside on MEA (5-10 mm of
diam) were orange. Colonies on G25N (30-35 mm of diam) were pale
yellow in color with a yellow underside. Colonies on CY20S (3035 mm) were sulcate, with white mycelium at the margins, becoming
yellow with an intense orange center and an orange underside. No
growth was observed at 5ºC. Microscopically (Fig. 2 d, e, f, g),
ascospores were not evident within 7 days, however after 14 days of
incubation, ascospores (around 5 µm long) showing smooth walls with
two prominent, parallel longitudinal flanges were observed.
Furthermore, yellow cleistothecia, ascus and the anamorph Aspergillus
producing only phialides was found.
Eurotium sp. (3WAr) showed colonies on CYA (20-22 mm of
diameter), sulcate with yellow at the margins, becoming orange brown
in the central area with a very intense orange underside. Colonies on
MEA (27-30 mm of diam) were sulcate, showing an intense orange
color and the same color on the underside side. No growth was observed
at 5ºC or 37ºC. Colonies on CY20S showed a diameter of 20 mm after 7
days of incubation reaching 40 mm after 14 days. These colonies
showed a texture plane, sulcate with a clear color at the margins
becoming intensely orange at the center with the same color on the
underside. Microscopic observations showed (after 14 days of
incubation) ellipsoidal ascospores without double flanges. The
anamorph Aspergillus with the head formed from phialides alone and
also cleistothecium enveloped in yellow hyphae was observed.
Byssochlamys fulva (1FP) showed colonies on CYA and MEA
covering the whole Petri dish with sparse, low floccose, heavy conidial
production and were colored olive brown on MEA and on CYA with
white filaments on CYA. The underside color was pale brown. Colonies
on G25N (5-8 mm of diam) were olive brown. No growth was observed
at 5ºC. Microscopically (Fig. 2 o), there were not any kind of bodies
typically present in most of ascomycetes. Furthermore, ellipsoidal
ascospores (5 µm long) with smooth walls and also asci (10 µm) were
90
observed. Anamorphic reproductive structures of penicillin were
observed.
a
d
c
b
e
h
g
f
i
j
m
k
l
n
o
Figure 2. Microscopic structures: (a) P. expansum CCT7549; (b) Eupenicillium sp.
1BPFr (cleistotecium structure); (c) Eupenicillium cinnamopurpureum 1Wr
(Penicillium anamorph state); Eurotium sp. 1WAr structures: (d) cleistotecia, (e)
ascospores, (f) Aspergillus (anamorph state), (g) asci; Neosartorya fischeri 2WAr
structures: (h) cleistotecia, (i) Aspergillus (anamorph state), (j) asci and ascospores;
Talaromyces sp. 1AC structures: (k) Paecilomyces (anamorph state), (l) conidia, (m)
gymnotheciium, (n) ascus; (o) B. fulva 1FP structures (asci, ascospores and
Paecilomyces (anamorph state). All microscopic observations were made in 400 X, except to
for pictures of cleistotecium and gymnotecia (b; d; h and m) which were made 40 X.
91
4 Discussions
The survey of mold and yeasts from a concentrated apple juice
process showed a high contamination mainly on the steps before heat
treatment. The mold Penicillium was the prevalent genera. However, the
pre-concentration step was enough to completely destroy Penicillium
spores since they were not found in the following stages. LABUDA et
al. (2005) investigated the incidence of toxinogenic fungi in fruits and
also reported Penicillium as the major contaminant. WELKE (2008)
also observed Penicillium (93%) as the predominant fungal genus in
apples used for juice, of which P. expansum represented 66% of the
isolates. Other researchers observed that P. expansum (30–62%) was the
most prevalent species on apples in storage rooms (AMIRI; BOMPEIX,
2005). In this present study, half of the Penicillium strains were
identified as P. expansum representing a concern for apple juice
processing since it is the typical contaminant of apple brown rot having
the ability to grow at low temperatures and to produce patulin on
decayed fruits (DOORES, 1983; SALOMÃO, et al., 2009; JACKSON et
al., 2003). During the off-season, juice companies are supplied with
apples stored in packing houses. Therefore, the presence of P. expansum
in apples should be considered a possible consequence of postharvest
handling of fruits associated with the extension and conditions of
storage. During the present investigation, as cited by other authors
(SYDENHAM et al., 1995), it was observed that at several times the
apples are not processed as soon as received in the processing plant.
This situation leads to a deck storage (under no refrigerated conditions)
for sometimes more than 5 days, resulting in serious implications in the
level of patulin (SYDENHAM et al., 1997). Therefore, monitoring the
quality of apple lots under a rigid selection criterion during the reception
step and minimizing storage at room temperature should be considered
important measures to control this toxigenic mold (FAO, 2003).
The sample of wash water also showed a high contamination by
molds and yeast (> 105 CFU/mL, including P. expansum (CODEX,
2003). In the wash step, the high-pressure water sprayed against apples
helps in the removal of rotten parts which contain high levels of toxin
(ACAR et al., 1998). Therefore, is important to use a sanitizer, such as
chlorine, during this step in order to reduce P. expansum spores
(SALOMÃO et al., 2008a). However, spores will be suspended in the
water causing a possible cross contamination and also increasing the
risk of mold growth during bulk storage (FAO, 2003). The apple sorting
should be rigorous enough to remove, as far as possible, rotten fruits,
92
even those with only small areas of rot (CODEX, 2003). However, in
the sample of washed apples P. expansum was again found, proving the
high prevalence of this mold in this fruit and the possibility of cross
contamination caused by contaminated water.
Talaromyces sp. (1AC) was the mold isolated from the
concentrated juice. This mold is a HRM that has been isolated on
several occasions in screening fruit juices (PITT; HOCKING, 1999).
The sequence of heat shocks applied during the process probably caused
the activation of its spores from the asexual to a sexual state. The
presence of Talaromyces species in the concentrated apple juice implies
a concern because they cause spoilage in heat-treated products and
members of this genus are known to produce the mycotoxin talaromycin
(ENIGL et al., 1993). SALOMÃO (2002) observed that Talaromyces sp.
was the prevalent genus of HRM found in frozen strawberry pulp. Their
ascospores are extremely heat resistant and can survive 5 to 12 min of
heating at 100ºC (PITT; HOCKING, 1985; TOURNAS, 1994).
The genus Eupenicillium was isolated from wash water (1Wr) and
before concentration treatment (1BPCr). Other authors also found the
same mold in a screening of processed apple nectar and also from frozen
strawberry pulp (SALOMÃO, 2002; ARAGÃO, 1989). This mold
showed D80°C of 14.5 min in strawberry juice (ARAGÃO, 1989).
N. fischeri was detected in washed apples. Other studies also
related the presence of this same HRM species with apple products
(GUMERATO, 1995; SALOMÃO et al., 2008b). N. fischeri ascospores
showed high resistance in juices and survived a heat treatment of 94ºC
for 20 min in apple juice (SALOMÃO et al., 2008b; SALOMÃO et al.,
2007; SALOMÃO et al., 2004). Some strains of N. fischeri are capable
of producing toxins such as fumitremorgins and verruculogen
(TOURNAS, 1994).
Eurotium species also were detected among the HRM and their
presence in the apples was unusual. Some species of Eurotium also
produces ascopores which would include them to the list of resistant
fungi (SPLITTSTOESSER et al., 1989; YILDIZ; COKSÖYLER, 2002).
Their xerophilic characteristic is probably the major reason for their
stability during dormancy (EICHER et al., 2002). The heat resistance of
Eurotium haerbariorum, isolated from a spoilage outbreak involving
grape preserves, showed D70°C of 2.5 min in 5°Brix grape juice and D71°C
of 5.2 min in 65°Brix juice (SPLITTSTOESSER et al., 1989).
The presence of B. fulva in the concentrated juice demonstrated
the ability of its ascospores to remain viable after being submitted to the
high temperatures applied during processing. A strain of B. fulva IOC
93
4518, isolated from apples, survived heating at 95ºC for 20 min
(SALOMÃO et al., 2008b) and its D values in apple juice at 85ºC, 90ºC,
92ºC and 95ºC were 64.5, 16.6, 6.3 and 3.1 min, respectively
(SANTÀNA et al., 2009). B. fulva also was detected from a pasteurized
strawberry juice supplemented with chemical additives, demonstrating
its thermal and chemical resistance (SALOMÃO, 2002). An
investigation showed that from 16 samples of apple juice concentrate
analyzed, 25% belonged to the Byssochlamys genera. Three strains were
identified as B. fulva and one strain as B. nivea (WELKE et al., 2009).
In addition to patulin, other metabolites have been reported to be
produced by B. fulva such as byssochlamic acid and byssotoxin A
(TOURNAS, 1994).
Although the incidence of HRM in the apple juice concentrate
was low (Table 2), all heat resistant genus cited in the literature were
detected in this investigation. Based on this, control measures should be
studied in order to minimize the contamination by these
microorganisms.
The presence of A. acidoterrestris in the samples are in
agreement with other studies that report its incidence in a wide range of
fruit juices as well as processing facilities, where it enters most probably
on fruit surfaces contaminated from soil during production and
harvesting (SPLITTSTOESSER et al., 1994; MURAKAMI et al. 1998;
CHEN et al., 2006; GRANDE et al., 2005). Therefore, considering that
Alicyclobacillus are soil-borne, its control should start in the fields along
with proper cleaning of fruits at the beginning of processing
(GROENEWALD et al., 2009).
Groenewald et al. (2009) also reported the isolation of
A. acidoterrestris from wash water and flume water, which increases the
risk of possible recontamination by this bacterium through the water.
In this present survey, A. acidoterrestris was also detected in the
step before ultra filtration (A. acidoterrestris CCT 75481) showing the
high resistance of its spores in remaining viable even after submitted to
the heat treatments applied in the pre-concentration stage (110-115ºC
for 30 s) and in the first pasteurization stage (85-90ºC for 30s). The D
values for A. acidoterrestris in apple juice at 85, 90 and 95ºC were 56,
23 and 2.8 min, respectively (SPLITTSTOESSER et al., 1994). Since A.
acidoterrestris is a thermoacidophilic and spore-forming bacterium they
can survive in acid media (such as apple juice) and grow at temperatures
higher than 20ºC, thereby having the potential to spoil the shelf stable
products during storage (CHEN et al., 2006).
94
Although A. acidoterrestris is not pathogenic, it is recognized as
a problem in the juice industries world-wide since spore-related juice
spoilage may result in offensive-smelling compounds (JENSEN;
WHITFIELD, 2002; WALLS; CHUYATE, 2000; SPLITTSTOESSER
et al., 1998).
5 Conclusion
The presence of P. expansum in the raw material represents a
likely risk of patulin in the final product, since this toxin shows
relatively high heat stability in an acidic environment. The detection of
B. fulva and A. acidoterrestris CCT 7548 in the stages after heat
treatment demonstrated their high heat resistance and also the possibility
of toxins and off-flavors remaining in the apple juice. Therefore, this
research concluded that P. expansum, B. fulva and A. acidoterrestris are
the most important biologic hazards for apple juice products.
Furthermore, considering that the application of more severe thermal
treatments to inactivate resistant spores and toxin is impracticable for
fruit juices, further investigations should attempt to discover strategies
aimed at reducing the target microorganisms from the raw material by
controlling the initial contamination of fruits during storage and also at
the beginning steps of production (receiving, wash and sorting steps).
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge the Capes Foundation
(Brazil) and CNPQ (National Counsel of Technological and Scientific
Development, Brazil) for Beatriz C. M. Salomão and Chalana Müller
scholarships, respectively. Besides, we would like to thank David C.
Manns for assistance with the manuscript preparation.
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101
4.2 Aplicação de dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético
para redução de esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys
fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris na superfície de maçãs e
em soluções aquosas
Apresentação:
Com base no trabalho anterior, verificou-se que os microorganismos relevantes para o processo produtivo de suco de maçã foram
Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus
acidoterrestris. Considerando que as maçãs são importantes fontes
iniciais de contaminação, esta etapa do trabalho visou avaliar a eficácia
de sanitizantes em maçãs e também em soluções aquosas. Neste
trabalho, além do ácido peracético, foi também utilizado o composto
clorado orgânico dicloroisocianurato de sódio.
Aplicação de dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético para
redução de esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e
Alicyclobacillus acidoterrestris em maçãs e em soluções aquosas
Beatriz de Cássia Martins SALOMÃO1, Chalana MÜLLER1; Pilar
Rodriguez de MASSAGUER 2, Gláucia Maria Falcão ARAGÃO1*
1
Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, 88040-900,
Florianópolis - SC, Brasil
2
Departamento de Processos Químicos, Faculdade de Engenharia
Química da Unicamp – FEQ Universidade Estadual de Campinas –
UNICAMP, 13081-970, Campinas - SP, Brasil
*Fone: (48) 37219448 r.245 Fax: (48) 48 37219687
[email protected]
RESUMO
A eficácia do sanitizante clorado orgânico dicloroisocianurato de sódio
(Dicloro) e do ácido peracético foi testada contra esporos de Penicillium
expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris em
superfície de maçãs e em solução aquosa. Os esporos de P. expansum
foram eficazmente eliminados em ambas as condições usando dicloro,
sendo que mais que 6 reduções decimais (RD) foram obtidas a
25 ppm/6 min em solução aquosa. Entretanto, o ácido peracético
102
mostrou-se ineficaz na redução de esporos de P. expansum. Na
superfície da maçã, os demais micro-organismos sofreram < 1 RD com
ambos os sanitizantes. Em solução aquosa o dicloro mostrou-se mais
eficaz que ácido peracético. B. fulva apresentou-se mais resistente que
A. acidoterrestris sendo este mais resistente que P. expansum. Concluiuse que dicloroisocianurato de sódio foi o sanitizante mais eficaz, sendo
recomendado na concentração de 25 ppm para uso na água de
resfriamento das maçãs destinadas à estocagem e também na água de
lavagem, visando, assim, destruir esporos de P. expansum e reduzir o
risco de produção de patulina no produto final. Nenhum sanitizante foi
eficaz contra os esporos de A. acidoterrestris e B. fulva.
Palavras-chave: Sanitização. Dicloroisocianurato de sódio. Ácido
peracético. Microbiota da maçã. Bolores termorresistentes.
ABSTRACT
The efficacy of sodium dichloroisocyanurate (Dichloro) and peracetic
acid (against Penicillium expansum, Byssochlamys fulva and
Alicyclobacillus acidoterrestris was evaluated on apples surface and
aqueous solution. P. expansum spores were efficiently destroyed in both
conditions using dichloro and more than 6 decimal reductions (DR)
were observed at 25 ppm/6 min in aqueous solution. However, low
efficacy was observed using peracetic acid against P. expansum spores.
In apple surface, the other microorganisms were reduced in < 1
logarithmic cycle, using both sanitizers. In aqueous solution dichloro
was more effective than peracetic acid. B. fulva was the most resistant
microorganism following by A. acidoterrestris and finally by
P. expansum. It follows that sodium dichloroisocyanurate was the most
efficient sanitizer and its use is recommended at 25 ppm in water used
for cooling apples designated for storage, and in the wash water, in
order to destroy P. expansum spores and to reduce the risk of patulin
production in juice. None sanitizer used were efficient against
A. acidoterrestris and B. fulva spores.
Keywords: Sanitizing treatments. Sodium dichloroisocyanurate.
Peracetic acid. Apple microbiote. Heat resistant molds.
103
1 Introdução
A cultura da maçã tem apresentado expansão no cenário
brasileiro, sendo que o estado de Santa Catarina se destaca como o
maior produtor nacional (BRASIL, 2007; CEPA, 2008). As frutas que
não alcançam padrão comercial (15-30% das frutas produzidas) são
destinadas ao setor industrial para a produção, principalmente, de suco
concentrado de maçã que, em sua maioria (> 90%), é destinado à
exportação (SANTÀNA, 2007; NOGUEIRA et al., 2007). As maçãs
são susceptíveis à contaminação por fungos como Penicillium expansum
e Byssochlamys fulva que são reconhecidamente produtores de patulina
em maçãs e seus produtos (DRUSCH; RAGAB, 2003; MOAKE et al.,
2005; SANTÀNA, 2007; SALOMÃO et al., 2008b). Além disso, o
segundo fungo apresenta esporos termorresistentes capazes de se
manterem viáveis após a pasteurização do suco, além de possuir
habilidade de produzir enzimas pectinolíticas que deterioram o produto
final (HOCKING; PITT, 1984; TOURNAS, 1994; SANTÀNA et al.,
2009). O suco de maçã também pode ser alvo do desenvolvimento de
bactérias termoacidofílicas como o Alicyclobacillus acidoterrestris que,
além de possuir esporos altamente termorresistentes, pode causar
alteração através da produção de guaicol que é uma substância capaz de
conferir ao suco gosto e cheiro descritos como antisséptico, desinfetante
ou medicinal (BORLINGHAUS; ENGEL, 1997; BAUMGART et
al., 1997; CHANG; KANG, 2004; YAMAZAKI et al., 1996;
MURAKAMI et al., 1998; PONTIUS et al., 1998; SPLITTSTOESSER
et al., 1998).
Durante o período da safra, as frutas fora do padrão comercial
para o consumo in natura são destinadas ao processamento do suco,
enquanto que as frutas dentro do padrão comercial são destinadas ao
beneficiamento e armazenamento em locais conhecidos como packing
houses. As frutas chegam nestes locais dentro de caixas de madeira
(bins) e, assim estocadas, são levadas ao pré-resfriamento em um
resfriador com circulação de água gelada (hydrocooler) por
aproximadamente 20 min. Em seguida, as maçãs são encaminhadas ao
armazenamento dentro de câmaras-frias, geralmente à temperatura de 10°C (92-96% de UR), em atmosfera controlada ou não, por um período
que pode variar de 4 a 12 meses, dependendo da variedade. Na
entressafra, as frutas retiradas do armazenamento que forem
consideradas inadequadas para comercialização são destinadas ao
processamento industrial (SANT’ANA, et al., 2008). Na planta de
processamento de suco, as maçãs são submetidas à lavagem pela ação de
jatos de água sob pressão (geralmente sem adição de sanitizante)
104
(SANTÀNA et al., 2008)
Sanitizantes a base de cloro inorgânico, como o hipoclorito de
sódio, são os mais amplamente utilizados em processos de sanitização
de frutas (ANDRADE; MACÊDO, 1996; JACKSON et al., 2003;
OKULL et. al., 2006; SIMMONS et al., 2006; BARAK et al., 2003,
CHEN et al., 2004; SALOMÃO et al., 2008a). Nos armazéns de
estocagem (packing houses), a cloração da água de manejo das frutas
destinadas ao armazenamento é geralmente realizada com hipoclorito de
sódio (KUPFERMAN, 1984), porém a concentração deste sanitizante
normalmente cai abaixo da mínima efetiva devido à introdução de
matéria orgânica (KOTULA et al., 1997; RUSSELL et al., 1992) e à
falta de monitoramento (OKULL et al., 2006). O uso de compostos
clorados orgânicos tem se expandido no Brasil, destacando-se o
dicloroisocianurato de sódio (MEYER, 1994; ANDRADE; MACÊDO,
1996). Entre as vantagens do uso destes está o fato de serem mais
estáveis em solução aquosa que os inorgânicos, o que implica numa
liberação mais lenta de ácido hipocloroso (agente microbicida) e,
consequentemente, em uma eficácia mais duradoura. Além disso, são
menos reativos com matéria orgânica e não formam níveis significantes
de trialometanos, que são agentes tidos como carcinogênicos (MEYER,
1994; ANDRADE; MACÊDO, 1996).
Ácido peracético é o princípio ativo de diversos sanitizantes
disponíveis comercialmente que têm sido frequentemente utilizados na
indústria de alimentos. Este agente não existe como uma única
substância química, mas como uma mistura estabilizada de ácido
peracético, peróxido de hidrogênio e ácido acético. O ácido peracético
possui baixo efeito residual, além de ser menos reativo com a matéria
orgânica (ANDRADE; MACÊDO, 1996; SAPERS, 2001).
A temperatura é um fator que pode influenciar na eficácia dos
sanitizantes uma vez que, em geral, temperaturas mais elevadas causam
aumento na velocidade das reações (MEYER, 1994; RUSSELL et al.,
1992).
Existe uma escassez de trabalhos científicos que avaliem a
eficácia de compostos clorados orgânicos, como o dicloroisocianurato
de sódio, sobre esporos de micro-organismos de importância na
indústria de alimentos e, até o momento, não há relatos de estudos
investigando a ação de qualquer sanitizante sobre esporos de
Byssochlamys fulva. Além disso, o ácido peracético vem assumindo o
papel de substituto para compostos clorados, o que salienta a
importância da comparação da eficácia de ambos os princípios.
O objetivo desta pesquisa foi a análise da resistência dos mais
105
relevantes micro-organismos da microbiota natural da maçã a agentes
sanitizantes, sendo que, em alguns casos, o aumento da temperatura foi
também testado. Os micro-organismos alvo do estudo foram B. fulva,
A. acidoterrestris e P. expansum, devido à sua ocorrência em maçãs e
seus produtos e por suas capacidades deteriorantes e/ou toxicológicas
que são fatores limitantes para a garantia de comercialização do suco
concentrado de maçã.
2 Materiais e Métodos
2.1 Micro-organismos e preparo da suspensão de esporos
As cepas dos micro-organismos Byssochlamys fulva (CCT 0056),
Penicillium expansum (CCT 4680) e Alicyclobacillus acidoterrestris
(CCT 4384) foram obtidas da coleção de culturas da Fundação Tropical
de Culturas André Tosello (Campinas, SP, Brasil). O preparo da
suspensão de esporos dos fungos P. expansum e B. fulva iniciou-se pela
pré-esporulação em placas de Petri contendo meio ágar batata dextrose
(PDA, Biolife, Itália) acidificado a pH 3,5 por 7 dias a 25ºC e 30ºC,
respectivamente. Os esporos coletados foram adicionados às placas de
esporulação, contendo meio Ágar Extrato de Malte (MEA, formulado de
acordo com Pitt e Hocking, 1999), e incubados na temperatura indicada
para cada micro-organismo por 10 dias (P. expansum) e 30 dias
(B. fulva). Após este período, adicionou-se 10 mL de água destilada
estéril em cada placa e, depois da raspagem, todo o conteúdo foi filtrado
em 4 camadas de gaze estéril e centrifugado a 3500 rpm (2000 x g) por
15 minutos. Este procedimento foi repetido duas vezes ou até a
constatação microscópica da ausência de hifas. Ao final, foi feita a
refrigeração a 4ºC até posterior utilização (SALOMÃO, et al. 2007).
(SALOMÃO, et al. 2007).
A suspensão de esporos de A. acidoterrestris foi pré-esporulada
em tubos inclinados (PDA; pH 3,5) e incubados a 44ºC/3 dias. A
biomassa obtida foi adicionada a 10 mL de caldo AAM (Meio
Alicyclobacillus acidocaldarius), formulado de acordo com Murakami
et al., 1998) e incubada a 45ºC por 24 horas. O caldo enriquecido foi
espalhado sobre placas de Petri contendo meio AAM (suplementado de
0,05% de MnCl2.4H2O e 1,5% de ágar; pH 4) e incubado por 10 dias a
45ºC. Após a confirmação microscópica da produção de esporos por
coloração usando verde de Malaquita (MASSAGUER, 2006), a cada
placa foi adicionado 10 mL de água seguida de raspagem. O esporos
106
obtidos foram centrifugados 5 vezes a 3500 rpm (2000 x g) por
15 minutos, sendo eliminado o sobrenadante. Ao final, foi feita a
refrigeração a 4ºC até posterior utilização (MURAKAMI et al., 1998).
2.2 Preparo das soluções sanitizantes
As soluções cloradas foram formuladas a partir do produto
comercial Sumaveg® (Johnson Diversey, São Paulo, Brasil) cujo
princípio ativo é o composto clorado orgânico dicloroisocianurato de
sódio (dicloro) e as soluções à base de ácido peracético (AP) foram
elaboradas a partir do produto Tsunami 100® (ECOLAB, São Paulo,
Brasil). A concentração do princípio ativo de cada solução foi
confirmada utilizando fitas medidoras específicas para a medição de
cloro livre (Test Systems Inc., Rock Hill, SC, USA) e ácido peracético
(Weber Scientific, Chestertown, Md, USA). Todas as soluções foram
mantidas nas temperaturas de 25°C e/ou 37°C.
2.3 Teste sobre a superfície das maçãs
Os testes sobre a superfície das maçãs foram baseados na
metodologia adaptada de Lee et al., 2004. As maçãs, da variedade Fuji,
foram adquiridas em mercado local, sendo que sempre procurou-se
escolher frutas sem lesões aparentes e de calibre semelhante. No
laboratório, primeiramente as maçãs receberam lavagem com água
potável e, em seguida, foram colocadas dentro de sacos estéreis com
100 mL de água destilada estéril e massageadas por 1 min.
Posteriormente, as maçãs foram secas em gaze estéril e sobrepostas em
superfície esterilizada com o pedúnculo voltado para cima. A inoculação
das maçãs foi feita na região em torno do pedúnculo utilizando-se
0,1 mL de suspensão dos esporos, com concentração de 105, 107 e
106 esporos/mL, respectivamente de P. expansum, B. fulva e
A. acidoterrestris. As frutas inoculadas com os fungos permaneceram
por duas horas em câmara de fluxo laminar para a fixação dos esporos
(tempo baseado em testes prévios) e, as inoculadas com esporos de
A. acidoterrestris, permaneceram 24 horas (SAPERS, et al., 2001). Para
o tratamento, as maçãs foram colocadas individualmente dentro de sacos
estéreis e adicionadas de 100 mL das soluções sanitizantes nas
concentrações de 0, 50, 80, 150, 200 e 250 ppm de ácido peracético e 0,
107
50, 100, 150, 200 e 250 ppm de cloro, separadamente para cada
concentração. Neste caso, foram testadas soluções estabilizadas à
temperatura de 25ºC e 37ºC para os esporos de B. fulva e de
A. acidoterrestris. Posteriormente, massageou-se a fruta com as mãos
durante 1 minuto e foi coletada a primeira amostra de 4,0 mL. Em
seguida, manteve-se o contato do sanitizante com a fruta (sem
massageamento) por mais 1 min e coletou-se outra amostra de 4,0 mL.
Imediatamente, cada amostra foi neutralizada com 1,3 mL de solução de
tiossulfato de sódio 0,6% por 2 minutos. À exceção dos esporos de
P. expansum, os demais receberam um choque térmico em banho
termostatizado (Tecnal®, Modelo TE-184, Piracicaba, Brasil ± 0,1ºC de
precisão) a 80ºC/10 min. Este tratamento de ativação foi baseado em
resultados anteriores (para os esporos de B. fulva) e, para os esporos de
A. acidoterrestris, utilizou-se o mesmo choque térmico já utilizado por
outros autores (MURRAY et al., 2007; PEÑA; MASSAGUER, 2006;
SILVA; GIBBS, 2001; GROENNEWALD et al., 2009; WALLS;
CHUYATE, 2000 e ORR; BEUCHAT, 2000). Em seguida, as amostras
foram diluídas serialmente e plaqueadas em meio PDA (pH 3,5)
(OKULL et al., 2006; OKULL; LABORDE, 2004; SPLITTSTOESSER
et al., 1993; MURRAY et al., 2007). A incubação ocorreu a 25°C para
P. expansum, 30°C para B. fulva e 43°C para A. acidoterrestris por 45 dias. A partir da amostra sem tratamento, foi calculado o número de
reduções decimais (RD) segundo a equação 1. Cada condição foi testada
em triplicata e um teste adicional foi executado para avaliar uma
possível ação do neutralizante na destruição dos esporos. Para tanto, as
frutas foram lavadas com 100 mL de água estéril e, após massageamento
por 1 min, a amostra de 4 mL recebeu a adição de 1,3 mL de tiossulfato
de sódio 0,6%. Após o contato, as amostras foram ativadas (exceto
esporos de P. expansum), diluídas, plaqueadas e incubadas conforme
descrito anteriormente.
 No 
(Equação 1)
RD = log

 N 
onde, N0 é a concentração inicial dos esporos, expressa em
(esporos/mL), e N é a concentração de esporos recuperada após cada
tratamento (esporos/mL).
2.4 Teste em soluções aquosas
Os testes em soluções aquosas foram baseados na metodologia
adaptada de Orr e Beuchat (2000). Inicialmente, 0,1 mL da suspensão de
108
esporos foi adicionado aos tubos contendo 5 mL das soluções
sanitizantes em diferentes concentrações. Para esporos de P. expansum
foram testadas concentrações de 0, 25, 50, 75 e 100 ppm de cloro, nos
tempos de contato de 1, 2, 3, 4, 5 e 6 minutos e 0, 250 e 500 ppm de
ácido peracético por 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 e 120 minutos. Os
esporos de B. fulva foram testados em contato com concentrações de 0,
250, 400, 500, 600, 700 e 800 ppm de cloro nos tempos de 15, 30, 45,
peracético por 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos. Esporos de
A. acidoterrestris foram testados em contato com concentrações de 0,
250, 350, 400 e 500 ppm de cloro nos tempos de contato de 15, 30 45,
peracético por 15, 30, 45, 60 e 75 minutos. Neste teste, somente foram
usadas soluções sanitizantes estabilizadas a 25ºC. Após contato, foi
adicionado 1,6 mL de tiossulfato de sódio 0,6 % deixando-se agir por
2 minutos com o objetivo de neutralizar a ação dos sanitizantes. Após a
neutralização, as amostras contendo esporos de B. fulva e
A. acidoterrestris receberam um choque térmico de 80oC/10 min.
Seguidamente, cada amostra foi resfriada, diluída, plaqueada e incubada
conforme descrito no item 2.3. Cada condição foi testada
individualmente em triplicata. A partir da contagem das colônias
(esporos/mL), realizou-se o cálculo do número de reduções decimais
(RD) de acordo com a equação 1. Um ensaio adicional (triplicata) foi
realizado para testar uma possível ação do neutralizante (tiossulfato de
sódio 0,6%) sobre os esporos, adicionando-se 1,6 mL deste reagente a
5 mL de água e 0,1 mL de esporos de micro-organismo. Após o contato
de 2 min, as amostras foram ativadas (exceto esporos de P. expansum),
diluídas, plaqueadas e incubadas conforme descrito anteriormente.
2.5 Análise estatística dos dados
Utilizando o programa MINITAB® 14 (Minitab Inc., State
College, PA, USA) os dados foram avaliados estatisticamente pela
análise de variância (ANOVA) sendo que os resultados foram
interpretados de acordo com o Teste de Tukey, onde as diferenças a
α=0,05 foram consideradas significativas.
109
3 Resultados
3.1 Teste sobre a superfície das maçãs
O efeito da sanitização na superfície das maçãs, utilizando
dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido peracético (AP), está
apresentado nas Tabelas de 1 a 3.
Tabela 1. Efeito da sanitização com dicloroisocianurato de sódio
(dicloro) e ácido peracético (AP) (25ºC) sobre esporos de P. expansum
expresso em logaritmo da população (Log P) e número de reduções
decimais (RD) no ensaio sobre superfície de maçãs Fuji após 1 e 2 min
de contato.
CL (ppm)
0
50
100
150
200
250
AP (ppm)
0
50
80
150
200
250
Log P ± DP
(1 min)
5,3 ± 0,3a*
3,1 ± 0,6b
1,9 ± 0,6c
1,8 ± 0,2c
0,7 ± 0,0d
0,2 ± 0,1d
Log P ± DP
(1 min)
5,2 ± 0,3a*
4,8 ± 0,3a, b
4,7 ± 0,3a, b
4,7 ± 0,3a, b
4,7 ± 0,3a, b
4,7 ± 0,3b
Log P ± DP
(2 min)
5,3 ± 0,3a*
1,8 ± 0,4b
1,8 ± 0,1b
1,2 ± 0,3b
0,0 ± 0,0c
0,0 ± 0,0c
Log P ± DP
(2 min)
5,2 ± 0,3a*
4,8 ± 0,3a, b
4,7 ± 0,3a, b
4,7 ± 0,3a, b
4,7 ± 0,3a, b
4,5 ± 0,3b
RD
(1 min)
0,0
2,2
3,4
3,5
4,6
5,1
RD
(1 min)
0,0
0,4
0,5
0,5
0,5
0,5
RD
(2 min)
0,0
3,5
3,5
4,1
>5,3
>5,3
RD
(2 min)
0,0
0,4
0,5
0,5
0,5
0,7
Log P: Média de 3 resultados; DP: Desvio padrão; RD = log (No/N).
*Na mesma coluna, a média dos valores que não são seguidos pela mesma letra são
considerados significativamente diferentes (α = 0,05).
Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% detectou (Log P ± DP):
5,2± 0,2.
110
(dicloro) e ácido peracético (AP) (25 e 37ºC) sobre esporos de B. fulva
decimais (RD) no ensaio sobre superfície de maçãs Fuji após 1 e 2 min
de contato.
CL
(ppm)
0
50
100
150
200
250
AP
(ppm)
0
50
80
150
200
250
25ºC
Log P
± DP
(1min)
3,7 ±
0,1a*
3,6 ±
0,1a, b
3,5 ±
0,2a, b
3,4 ±
0,1a, b
3,3 ±
0,1b
3,3 ±
0,1b
Log P ±
DP
(2min)
3,7 ±
0,1a*
3,6 ±
0,1a, b
3,4 ±
0,2a, b
3,3 ±
0,1b
3,3 ±
0,1b
3,2 ±
0,1b
Log P
± DP
(1min)
3.7 ±
0,1a
3,6 ±
0,1a,b
3,5 ±
0,0a, b
3,4 ±
0,1b, c
3,3 ±
0,1c
3,2 ±
0,0c
Log P ±
DP
(2min)
3.7 ±
0,1a
3,5 ±
0,1a, b
3,5 ±
0,1a, b
3,3 ±
0,0b, c
3,3 ±
0,0c
3,1 ±
0,1c
37ºC
RD
(1min)
RD
(2min)
-
-
0,1
0,1
0,2
0,3
0,3
0,4
0,4
0,4
0,4
0,5
Log P
± DP
(1min)
3,4 ±
0,0a*
3,3 ±
0,0a,b
3,2 ±
0,0b, c
3,1 ±
0,0c, d
3,0 ±
0,0d
3,0 ±
0,0d
Log P
RD
± DP
(1min)
(2 min)
3,4 ±
0,0a*
3,2 ±
0,1
0,0b
3,1 ±
0,2
0,0b, c
3,0 ±
0,3
0,0c, d
3,0 ±
0,4
0,0d, e
2,9 ±
0,4
0,0e
Log P
± DP
(1min)
3,4 ±
0,0a
3,3 ±
0,0a, b
3,2 ±
0,0b, c
3,1 ±
0,1c, d
3,0 ±
0,1d, e
2,9 ±
0,0e
Log P
± DP
(2min)
3,4 ±
0,0a
3,2 ±
0,0b
3,1 ±
0,1b, c, d
3,1 ±
0,0c, d
3,0 ±
0,0d, e
2,8 ±
0,1e
25ºC
RD
(2min)
0,2
0,3
0,4
0,4
0,5
37ºC
RD
(1min)
RD
(2min)
-
-
0,1
0,2
0,2
0,2
0,3
0,4
0,4
0,4
0,5
0,6
RD
(1min)
RD
(2min)
-
-
0,1
0,2
0,2
0,3
0,3
0,3
0,4
0,4
0,5
0,6
Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% (25ºC) detectou (Log P ±
DP): 3,6 ± 0,1.
111
(dicloro) e ácido peracético (AP) (25 e 37ºC) sobre esporos de
A. acidoterrestris expresso em logaritmo da população (Log P) e
número de reduções decimais (RD) no ensaio sobre superfície de maçãs
Fuji após 1 e 2 min de contato.
CL
25ºC
37ºC
Log P
± DP
(1min)
Log P
RD
RD
Log P ±
± DP (1min) (2min)
DP
(2min)
(1min)
4,5 ±
0,1a*
a4,5 ±
0,0a, b
4,5 ±
0,0a, b
4,3 ±
0,1a, b
4,3 ±
0,1a, b
4,2 ±
0,1b
4,5 ±
0,1a*
4,4 ±
0,0a, b
4,4 ±
0,0a, b
4,3 ±
0,1a, b
4,2 ±
0,1a, b
4,2 ±
0,1b
(ppm)
Log P
± DP
(1min)
Log P
RD
RD
Log P ±
± DP (1min) (2min)
DP
(2min)
(1min)
0
4,6 ±
0,0a
4,5 ±
0,0a, b
4,4 ±
0,0b
4,4 ±
0,0b
4,4 ±
0,0b
4,3 ±
0,0c
4,6 ±
0,0a
4,5 ±
0,0a, b
4,4 ±
0,0b
4,4 ±
0,0b
4,4 ±
0,0b
4,2 ±
0,0c
(ppm)
0
50
100
150
200
250
AP
50
80
150
200
250
-
-
0,0
0,1
0,0
0,1
0,2
0,2
0,2
0,3
0,3
0,3
4,4 ±
0,0a*
4,3 ±
0,0a, b
4,2 ±
0,0a, b, c
4,2 ±
0,0b, c
4,1 ±
0,1c, d
4,0 ±
0,1d
25ºC
Log P ±
DP
(2min)
4,4 ±
0,0a*
4,2 ±
0,0a, b
4,2 ±
0,0b, c
4,2 ±
0,0b, c
4,1 ±
0,1c, e
3,9 ±
0,0e
RD
RD
(1min) (2min)
-
-
0,1
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,3
0,3
0,4
0,5
37ºC
-
-
0,0
0,1
0,1
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,3
0,4
4,4 ±
0,0a
4,3 ±
0,0a
4,2 ±
0,0a, b
4,1 ±
0,0b, c
4,1 ±
0,1b, c
4,0 ±
0,1c
Log P ±
DP
(2min)
4,4 ±
0,0a
4,2 ±
0,0a, b
4,2 ±
0,0a, b
4,1 ±
0,1b, c
4,0 ±
0,0c, e
3,9 ±
0,1e
RD
RD
(1min) (2min)
-
-
0,1
0,2
0,2
0,2
0,3
0,3
0,3
0,4
0,4
0,5
Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% (25ºC) detectou (Log P ±
DP): 4,5± 0,1.
112
Os dois sanitizantes agiram de forma diferenciada sobre os
esporos de P. expansum, sendo que as soluções cloradas orgânicas
apresentaram-se mais eficazes. O tratamento a 50 ppm de dicloro/1 min
foi significativamente diferente de todos os demais tratamentos no
mesmo tempo de contato, causando 2,2 RD (Tabela 1). Não houve
diferença significativa entre tratamentos a 100 ou 150 ppm de
dicloro/1 minuto, assim como não foi verificada diferença entre os
tratamentos com dicloro às concentrações de 50, 100 e 150 ppm por
2 minutos. Quando foram comparados os dois tempos de contato (dentro
de uma mesma concentração), somente o tratamento de 50 ppm de
dicloro/1 min mostrou ser diferente do tratamento de 2 min, sendo que,
a partir daí, à medida que a concentração é aumentada, o tempo de
contato não influenciou significativamente. Na superfície das maçãs, os
esporos de P. expansum tratados com AP não sofreram redução
significativa, independente das concentrações e tempos de contato
testados.
Na superfície da maçã, os dois sanitizantes testados causaram
menos que 1 RD nos esporos de B. fulva (Tabela 2) e A. acidoterrestris
(Tabela 3), sendo que o aumento da temperatura de 25ºC para 37ºC não
causou diferença perceptível na sua eficácia. Os resultados dos testes
que mediram o possível efeito de tiossulfato de sódio 0,6% sobre os
esporos não evidenciaram qualquer influência.
3.2 Teste em soluções aquosas
Os resultados obtidos nos tratamentos com soluções de dicloro e
de AP estão apresentados nas Tabelas de 4 a 6.
113
(dicloro) e ácido peracético (AP) sobre esporos de P. expansum
expresso em logaritmo da população (Log P) após contato e número de
reduções decimais (RD) no ensaio em soluções aquosas.
CL
(ppm)
Tempo
(min)
-
0
25
50
75
100
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
Log P ± DP
RD
6,0 ± 0,0a*
2,7 ± 0,2b
2,4 ± 0,3c
1,9 ±0,1d, i
1,2 ± 0,2e
0,5 ± 0,1f
0,0 ± 0,0g
2,2 ±0,0c, d
1,8 ± 0,2i
1,2 ± 0,1e
0,4 ± 0,0f
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
1,6 ± 0,0i
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0
3,3
3,6
4,1
4,8
5,5
> 6,0
3,8
4,2
4,8
5,6
> 6,0
> 6,0
4,4
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
AP
(ppm)
Tempo
(min)
-
0
250
500
15
30
45
60
75
90
105
120
15
30
45
60
75
90
105
120
Log P ±
DP
6,0 ±
0,0a*
5,9 ± 0,1a
5,9 ± 0,1a
3,8 ± 0,1b
3,6 ± 0,2b
2,2 ± 0,1c
1,8 ± 0,0d
1,1 ± 0,1e
0,5 ± 0,2f
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
RD
0,0
0,1
0,1
2,2
2,4
3,8
4,2
4,9
5,5
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
> 6,0
Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% detectou (Log P ± DP): 6,0
± 0,1
114
(dicloro) e ácido peracético (AP) sobre esporos de B. fulva expresso em
logaritmo da população (Log P) e número de reduções decimais (RD) no
ensaio em soluções aquosas
CL (ppm)
0
250
400
500
600
700
800
Tempo
(min)
Log P ± DP
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
3,7 ± 0,0
3,6 ± 0,0a
3,6 ± 0,0a
3,6 ± 0,0a
3,6 ± 0,0a
3,6 ± 0,0a
3,6 ± 0,0a
3,6 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
2,5 ± 0,1b
2,5 ± 0,0b
1,8 ± 0,0c
1,2 ± 0,1d
0,6 ± 0,1e
0,5 ± 0,0e
0,1 ± 0,2f
0,1 ± 0,1f
0,0 ± 0,0f
0,0 ± 0,0f
0,5 ± 0,1e
0,0 ± 0,0f
0,0 ± 0,0f
0,0 ± 0,0f
0,0 ± 0,0f
a*
RD
0,0
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
1,2
1,2
1,9
2,5
3,1
3,2
3,6
3,6
> 3,7
> 3,7
3,2
> 3,7
> 3,7
> 3,7
> 3,7
AP
(ppm)
Tempo
(min)
Log P ± DP
RD
0
0
30
60
90
120
150
180
30
60
90
120
150
180
30
60
90
120
150
180
30
60
90
120
150
180
30
60
90
120
150
180
30
60
90
120
150
180
a*
3,6 ± 0,0
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,5 ± 0,0a
3,4 ± 0,1a
3,3 ± 0,1a
3,5 ± 0,1a
3,5 ± 0,1a
3,5 ± 0,0a
3,4 ± 0,0a
3,4 ± 0,0a
3,3 ± 0,1a
2,6 ± 0,1b
2,3 ± 0,1c
2,3± 0,1c
2,3 ± 0,0c
2,3 ± 0,0c
2,2 ± 0,1c
2,2 ± 0,0c
2,2 ± 0,0c
2,0 ± 0,0c
1,6 ± 0,1d
1,5 ± 0,0d
1,2 ± 0,0e
1,0 ± 0,1e, f
1,0 ± 0,0e, f
1,0 ± 0,1e, f
0,9 ± 0,1e, f
0,8 ± 0,1f, g
0,8 ± 0,1f, g
1,0 ± 0,0e, f
0,9 ± 0,1e, f
0,9 ± 0,1e, f
0,8 ± 0,1f, g
0,7 ± 0,1f, g
0,5 ± 0,1g
0,0
0,1
0,1
0,2
0,2
0,2
0,3
0,1
0,2
0,2
0,2
0,2
0,3
1,0
1,3
1,3
1,3
1,3
1,4
1,5
1,5
1,6
2,0
2,1
2,5
2,6
2,6
2,6
2,7
2,8
2,8
2,6
2,7
2,7
2,8
2,9
3,1
500
800
1000
1200
1500
1800
Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% detectou (Log P ± DP): 3,6 ± 0,0.
115
(dicloro) e ácido peracético (AP) sobre esporos de A. acidoterrestris
decimais (RD) no ensaio em soluções aquosas
CL
Tempo
(ppm)
(min)
0
250
350
400
500
0
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
Log P ± DP
*
4,6 ± 0,1ª
4,6 ± 0,1a
3,5 ± 0,1b
3,5 ± 0,0b
3,5 ± 0,1b
3,5 ± 0,1b
3,3 ± 0,1b
3,3 ± 0,1b
3,3 ± 0,0b
2,9 ± 0,0c
2,6 ± 0,1d
1,4 ± 0,2e
1,4 ± 0,2e
1,4 ± 0,1e
1,2 ± 0,0e
1,0 ± 0,0f
0,1 ± 0,1g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
0,0 ± 0,0g
RD
0,0
0,0
1,1
1,1
1,1
1,1
1,3
1,3
1,3
1,7
2,0
3,2
3,2
3,2
3,4
3,6
4,5
> 4,6
> 4,6
> 4,6
> 4,6
AP
Tempo
(ppm)
(min)
0
250
500
650
750
850
1000
0
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
15
30
45
60
75
Log P ± DP
RD
a*
0,0
0,0
0,0
0,1
0,1
0,2
0,0
0,0
0,2
0,5
0,8
0,5
0,5
0,7
1,0
1,4
0,5
0,5
1,0
1,8
2,8
0,7
4,6 ± 0,0
4,6 ± 0,0a
4,6 ± 0,0a
4,5 ± 0,1a
4,5 ± 0,0a
4,4 ± 0,1a
4,6 ± 0,0a
4,6 ± 0,0a
4,4 ± 0,0a
4,1 ± 0,0b
3,8 ± 0,1c
4,1 ± 0,0b
4,1 ± 0,0b
3,9 ± 0,0c
3,6 ± 0,0d
3,2 ± 0,1e
4,1 ± 0,0b
4,1 ± 0,0b
3,6 ± 0,1c, e
2,8 ± 0,0f
1,8 ± 0,1g
3,9 ± 0,1c
3,8 ± 0,1c,
d
3,3 ± 0,2e
2,5 ± 0,0h
1,5 ± 0,1i
2,9 ± 0,1f
2,8 ± 0,1f
1,5 ± 0,0i
0,0 ± 0,0j
0,0 ± 0,0j
0,8
1,3
2,1
3,1
1,7
1,8
3,1
> 4,6
> 4,6
Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% detectou (Log P ± DP): 4,6
± 0,1.
116
No teste em solução aquosa sobre esporos de P. expansum,
verificou-se que os tratamentos a 50 ppm de dicloro/2 min e 25 ppm de
dicloro/3 min mostraram-se significativamente iguais e capazes de
causar mais de 4 RD. Os tratamentos à base de cloro orgânico, na
concentração de 25 ppm de dicloro por 6 min ou 50 ppm por 5 e 6 min,
destruíram toda a população presente (> 6 RD). Da mesma forma o
fizeram os tratamentos a 75 ppm (dicloro) a partir de 2 min, e todos os
tratamentos a 100 ppm. Os esporos de P. expansum mostraram-se mais
resistentes ao ácido peracético, tanto que, em soluções aquosas, os
tratamentos se iniciaram com concentração 10 vezes superior às usadas
com cloro, sendo o tempo de contato inicial 2,5 vezes maior.
Comparando a ação dos dois sanitizantes sobre esporos de P. expansum,
verificou-se que, para se obter em torno de 5,5 RD, seria necessário um
tratamento a 25 ppm de dicloro/5 min ou um tratamento a
250 ppm (AP)/2 horas.
Em relação ao B. fulva (Tabela 5), os tratamentos com dicloro até
500 ppm causaram discreta redução de esporos (≤ 0,2 RD). Porém, o
tratamento com 600 ppm (dicloro) alcançou 1,2 RD (15 min) e 3,1 RD
(75 min). Estes tempos de desinfecção, no entanto, são impraticáveis na
indústria. A ação do ácido peracético sobre esporos de B. fulva causou
no máximo 0,3 RD até concentrações de 800 ppm. Ao aumentar a
concentração de AP para 1000 ppm, no máximo 1,4 RD foram obtidas
(180 min). Duas ou mais RD nos esporos de B. fulva somente foram
alcançadas a partir do tratamento a 1200 ppm(AP)/120 min.
Comparando-se os dois fungos, para se alcançar 3,6 RD foi necessário
um tratamento a 700 ppm de dicloro/30 min para B. fulva e
25 ppm (CL)/2 min para P. expansum.
Esporos de A. acidoterrestris (Tabela 6) demonstraram ser um
pouco menos resistentes que os de B. fulva e, assim como este, muito
mais resistentes que os esporos de P. expansum. Por exemplo, para se
causar em torno de 3 RD, foi necessário um tratamento a 25 ppm de
dicloro/1 min
(P. expansum),
400 ppm de
dicloro/15 min
(A. acidoterrestris) e 700 ppm de dicloro/15 min (B. fulva). Também
sobre esporos de A. acidoterrestris, o ácido peracético demonstrou ser
menos eficaz que dicloroisocianurato de sódio. Enquanto que 4,5 RD
foram obtidas a 500 ppm de dicloro/15 min, a mesma concentração de
AP não causou nenhuma destruição na população de esporos. Não foi
verificada ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% sobre os
esporos.
117
4 Discussões
Nos testes realizados sobre a superfície das frutas, verificou-se
que os esporos de B. fulva e A. acidoterrestris obtiveram uma redução
máxima de 0,5-0,6 ciclos logarítmicos (Tabelas 2 e 3). A evolução na
redução dos esporos destes micro-organismos somente foi observada
nos testes em soluções aquosas quando as concentrações e tempos de
contato foram aumentados (Tabelas 5 e 6), ficando clara a superioridade
do sanitizante orgânico clorado frente ao ácido peracético.
Na superfície da maçã, o teste com 250 ppm de dicloro/1 min a
25ºC causou 0, 3 RD nos esporos de A. acidoterrestris. Orr e Beuchat
(2000) utilizaram hipoclorito de sódio acidificado em concentrações
mais altas de 500 ppm/1 min e 1000 ppm/1 min e obtiveram 0,9 RD e
2,27 RD, respectivamente para esporos desta mesma bactéria na
superfície das maçãs.
Os esporos de P. expansum foram eficazmente reduzidos em
tratamentos com dicloroisocianurato de sódio na superfície das maçãs,
porém, conforme observado com os outros micro-organismos, as
reduções causadas por ácido peracético não atingiram 1 ciclo
logarítmico. Nos testes sobre a maçã, enquanto os tratamentos com 50,
100 e 200 ppm de cloro por 1 min causaram 2,2, 3,4 e 4,6 RD na
população de P. expansum, respectivamente, o ácido peracético
(Tsunami 100®, Ecolab), nas concentrações de 50 a 250 ppm, reduziu
no máximo 0,5 ciclo logarítmico após 1 min de contato. Em pesquisa
anterior SALOMÃO et al. (2008a) verificaram que os esporos de P.
expansum, tratados com 50, 100 e 200 ppm de hipoclorito de sódio
acidificado (pH 6,5) por 30 s, foram reduzidos da superfície de maçã
Fuji em 2,46, 2,6 e 3,4 ciclos logarítmicos, respectivamente. No mesmo
trabalho também foi testada a eficácia de sanitizante à base de ácido
peracético, porém foi utilizado outro produto (Vortexx®, Ecolab) cuja
formulação contém o ácido octanóico que possui ação anti-fúngica, e 1,3
RD foram alcançadas a 50 e 80 ppm/30 s.
Os limites máximos de solução sanitizante permitidos para a
lavagem direta de frutas é de no máximo 80 ppm de ácido peracético,
100 ppm de cloro livre (quando se utiliza dicloroisocianurato de sódio) e
200 ppm de cloro livre (quando se utiliza hipoclorito de sódio) (FDA,
1998; SAPERS, 2001). Concentrações de ácido peracético e
dicloroisocianurato de sódio superiores às recomendadas foram também
testadas para se verificar uma possível melhora na eficácia dos
tratamentos. Nos testes realizados sobre a superfície das maçãs,
descartou-se a possibilidade de se aumentar o tempo de contato de
118
forma a melhorar a eficácia do tratamento, pois na indústria, este
processo dura, no máximo, em torno de 2,5 minutos.
Devido à baixa ação do ácido peracético no teste sobre a
superfície das maçãs, a princípio, acreditou-se haver alguma barreia
natural que pudesse mascarar sua atividade, como por exemplo, a cera
da fruta. Porém, os resultados dos testes em solução aquosa descartaram
esta possibilidade. Em trabalho anterior (SALOMÃO et al., 2008a), o
ácido peracético também mostrou-se menos eficaz que o hipoclorito de
sódio acidificado, pois enquanto o tratamento a 50 ppm (cloro) sobre a
superfície da maçã Gala causou 1,8 RD, na mesma concentração, o
ácido peracético causou apenas 0,9 RD nos esporos de P. expansum.
Orr e Beuchat (2000) testaram a inativação de esporos de
A. acidoterrestris (uma mistura de 5 diferentes cepas) em soluções de
hipoclorito de sódio e obtiveram 2,4 e 5,6 RD após 10 minutos de
contato, nas concentrações de 200 e 500 ppm, respectivamente. Os
resultados obtidos no presente trabalho não evidenciaram nenhuma
redução nos esporos de A. acidoterrestris (CCT 4384) quando tratados
em soluções aquosas 250 ppm de dicloro/15 minutos, demonstrando que
a cepa utilizada na pesquisa atual pode ser mais resistente que as cepas
testadas por aqueles autores. Porém, foi obtida 4,5 RD quando os
esporos entraram em contato com 500 ppm de dicloro/15 min. Os
mesmos autores testaram a ação de sanitizante à base de ácido
peracético (Tsunami 100®) sobre os esporos de A. acidoterrestris e
observaram uma eficácia de 0,11, 0,17 e 0,23 RD após contato de
10 minutos a 40, 80 e 160 ppm, respectivamente. Da mesma forma, os
presentes resultados evidenciaram baixa eficiência deste sanitizante,
atingindo 0,2 RD em tratamento a 250 ppm/75 min. Farah (2004)
também verificou uma pequena destruição, de aproximadamente 0,15
RD, nos esporos de A. acidoterrestris após tratamento a 150 e
200 ppm (AP)/15 s. Kreske et al. (2006) avaliaram a ação de tratamentos
sobre esporos de Bacillus (B. cereus e B. thuringiensis) na superfície de
maçãs por 5 min de contato e provaram que o ácido peracético
(Tsunami 200®) a 40 e 80 ppm causou apenas 0,19 a 0,29 RD,
respectivamente. Semelhantemente, na superfície da maçã,
Tsunami 100® a 25ºC causou 0,1 e 0,2 RD nos tratamentos a 50 e
80 ppm/1 min. Lee et al. (2004) verificaram que o dióxido de cloro
causou 1,2 e 3,3 RD nos esporos de A. acidoterrestris sobre a maçã por
1 e 2 min de contato, respectivamente, porém foi necessária uma
concentração de dióxido de cloro (40 ppm) mais de 10 vezes superior à
recomendada (FDA, 1998).
Nos testes em solução aquosa sobre os esporos de P. expansum,
119
Chen et al. (2004) verificaram uma redução de aproximadamente 1 log
(NMP/mL) na população ao utilizar hipoclorito de sódio a
200 ppm/5 min. O atual trabalho mostrou que dicloroisocianurato de
sódio, em concentração 4 vezes menor (50 ppm), causou 3,8 RD em
apenas 1 minuto de contato direto com os esporos. Na superfície da
maçã, a mesma concentração (50 ppm) causou 2,2 e 3,5 RD após 1 e
2 minutos de contato, respectivamente. Comparando os dois trabalhos,
constatou-se que, sobre os esporos de P. expansum foi detectada uma
maior eficácia dos sais de cloro orgânicos (dicloroisocianurato de sódio)
frente ao hipoclorito de sódio (composto inorgânico).
Okull e Laborde (2004) estudaram a contaminação cruzada de
esporos de P. expansum entre maçãs e verificaram que, após imersão em
água, de frutas “machucadas”, contendo em torno de 106 esporos/mL,
100 % destas desenvolveram apodrecimento durante armazenamento.
Porém, quando as frutas foram subsequentemente tratadas por
submersão em 200 ppm de hipoclorito de sódio acidificado/5 min o
apodrecimento foi reduzido para 16,7 a 43,4% durante estocagem.
Estudos realizados em armazéns de estocagem refrigerada (packing
houses) reportaram a ocorrência de até 104 esporos de P. expansum/mL
na água que entra em contato com as frutas e relacionaram a presença
desses esporos como uma das maiores causas do apodrecimento de
maçãs durante o armazenamento (SANDERSON, 2000; SPOTTS;
CERVANTES, 1986; SPOTTS; CERVANTES, 1993). Na fruta, outros
autores constataram a presença de populações médias de Penicillium na
ordem de até 2,6 log de esporos/cm2 (AMIRI; BOMPEIX, 2005). Outra
motivação para a adequada cloração da água de resfriamento das frutas,
é que, neste procedimento, as frutas vindas do campo (ainda quentes)
entram em contato com a água gelada que causa uma contração interna
na fruta (pressão diferencial) permitindo a internalização de microorganismos que estavam na sua superfície ou presentes na água
(SAPERS, 2001). Além disso, as caixas de madeira que transportam as
frutas “bins” geralmente possuem alta carga de P. expansum (em torno
de 106 esporos/bin) e, como as maçãs são resfriadas dentro dos bins,
estes, ao entrarem em contato com a água do resfriador, disseminam
esporos que irão manter o ciclo das recontaminações pois a mesma água
é recirculada para o resfriamento de várias cargas de maçãs
(SANDERSON, 2000). Os resultados obtidos no atual estudo, feito em
soluções aquosas, mostraram que dicloroisocianurato de sódio a
25 ppm/6 min pode causar mais de 6 RD nos esporos de P. expansum.
Estes dados salientam a importância da cloração da água de resfriamento
das frutas de forma a diminuir a contaminação cruzada e a incidência de
120
apodrecimento por P. expansum (“podridão azul”). O desenvolvimento
deste fungo nas maçãs é acompanhado pela consequente produção de
patulina (SALOMÃO et al., 2009) e, sucos de maçã produzidos a partir
destas frutas, podem colocar em risco a saúde dos consumidores, uma
vez que esta toxina não será eliminada durante a etapa de pasteurização
por ser relativamente estável aos processos térmicos (MOAKE et al.,
2005).
5 Conclusões
Pode-se afirmar que os esporos de A. acidoterrestris e B. fulva
não serão eficazmente eliminados pela ação de nenhum dos sanitizantes
testados, dentro das concentrações máximas permitidas. Além disso,
constatou-se que sanitizantes à base de ácido peracético não devem ser
considerados substitutos para compostos clorados, pois não seriam
capazes de eliminar esporos de P. expansum dentro das concentrações
recomendadas, tanto na superfície das maçãs quanto na água de lavagem
e resfriamento das mesmas.
O dicloroisocianurato de sódio provou ser um bom substituto
para o hipoclorito uma vez que se mostrou efetivo em reduzir
populações de P. expansum (como por exemplo a redução de mais de
6 ciclos logarítmicos no tratamento a 25 ppm/6 min). Este sanitizante
apresenta ainda a vantagem de não necessitar de correções de pH e ser
menos reativo com a matéria orgânica, além de produzir menores níveis
de trialometanos. Como no resfriador (hydrocooler) o contato das frutas
ocorre por um tempo mais longo (aproximadamente 20 min),
recomenda-se o uso de 25 ppm de dicloroisocianurato de sódio para a
cloração da água de resfriamento, pois este tratamento irá garantir a
redução da população de esporos de P. expansum presentes tanto na
fruta como na água. Nas fábricas onde o processamento inclui o
armazenamento das frutas lavadas antes do processamento, o uso da
mesma concentração de cloro pode auxiliar na redução da carga de
esporos de P. expansum presentes tanto na água de lavagem como nas
maçãs.
Na planta de processamento de suco, a cloração da água de
lavagem não seria suficiente para a causar eliminação de
A. acidoterrestris e B. fulva. Outras medidas devem ser tomadas para
impedir a contaminação do suco por estes micro-organismos.
121
Agradecimentos
Os autores agradecem à Fundação Capes (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e ao CNPQ (Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio
prestados a este trabalho através do fornecimento da bolsa de doutorado
para Beatriz de Cássia Martins Salomão (CAPES), bolsa de pesquisador
visitante a Pilar Rodriguez de Massaguer (CNPQ) e bolsa PIBIC para
Chalana Müller (CNPQ).
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1996.
127
4.3 Efficacy of sanitizing treatments against Penicillium expansum
inoculated on six varieties of apples
Apresentação:
Considerando a importância do P. expansum como o maior
causador de deterioração/produção de patulina em maçãs, foi realizado
um estudo para avaliar a ação de sanitizantes contra este fungo
inoculado em seis diferentes variedades de maçãs que estão entre as
mais utilizadas para produção de suco nos Estados Unidos. Este trabalho
pretendeu verificar a ação do agente clorado mais extensivamente
utilizado (hipoclorito de sódio) que foi testado acidificado e não
acidificado. Estes resultados foram comparados com os tratamentos
realizados com ácido peracético.
Research Note
Efficacy of sanitizing treatments against Penicillium expansum
inoculated on six varieties of apples
BEATRIZ C. M. SALOMÃO2, GLÁUCIA M. F. ARAGÃO2, JOHN
J. CHUREY1, and RANDY W. WOROBO1*
1
Department of Food Science and Technology, New York State
Agricultural Experiment Station, Cornell University, Geneva, NY
14456-0462, USA
2
Department of Chemical Engineering and Food Engineering, Federal
University of Santa Catarina, UFSC, Florianópolis, SC 88040-900,
Brazil
Keywords: Penicillium expansum, apples, sanitizing, sodium
hypochlorite, peracetic acid, patulin
*Author for correspondence. Phone: 315-787-2279; Fax: 315-787-2284;
E-mail: [email protected]
ABSTRACT
The effectiveness of several wash treatments was evaluated
against spores of P. expansum inoculated on six varieties of apples (Red
Delicious, Golden Supreme, Empire, Macintosh, Fuji and Gala). The
treatments included water, acidified water (pH 6.5), acidified (pH 6.5)
sodium hypochlorite, non-acidified (pH 8.8, 9.3, and 9.7) sodium
hypochlorite (50, 100 and 200 ppm, respectively), and peracetic acid (50
ppm and 80 ppm) solutions. Spores of P. expansum were dried on the
surface of the apples for 2 hours prior to exposure to the different sanitizer
128
solutions. Each apple was submerged in 100 ml of each treatment solution
for 30 s and the number of spores remaining were recovered and
enumerated. The efficacy of chlorine solutions was enhanced by
decreasing the pH to 6.5 (up to 5 log reduction, depending on apple
variety). Peracetic acid solutions (50 and 80 ppm) resulted in less than a 2
log spores/g reduction and had statistically (P ≤ 0.05) the same efficacy as
unacidified chlorine solutions (50, 100 and 200 ppm). Control water
solutions showed a 1.34 log spores/g reduction in P. expansum spores. The
results show that chlorine solutions at pH 6.5 resulted in the largest
reduction of P. expansum spores for all apples varieties tested.
INTRODUCTION
Penicillium expansum is a common contaminant in apples and is
responsible for significant spoilage losses in fresh and stored apples. In
addition, P.expansum is the primary patulin producer in apple and apple
products. The production of patulin by P. expansum has been shown to be
dependent on apple variety and degree of ripeness (10). Patulin, a thermal
resistant mycotoxin (6, 11, 21), has been shown to exhibit carcinogenic,
teratogenic and mutagenic effects in laboratory animals (3, 6, 11, 18, 22).
The presence of P. expansum in or on the surfaces of apples must be
controlled or eliminated in an attempt to prevent the spread of this mold to
uninfected apples. The elimination or reduction of P. expansum from
apple surfaces directly results in the retention of fruit quality and the
prevention of patulin production in apples and apple juice produced from
fruit that were sanitized prior to storage. Therefore, it is in the interest of
the apple industry to develop interventions that reduce the risk of
P. expansum growth and production of patulin in apples that may be used
for juice or other apple products. In order to improve the safety of these
products, an important line of defense is apple decontamination by
washing or sanitizing treatments prior to storage (6, 14, 15).
Chlorine is the most widely used sanitizing agent for fruits (1, 2,
4, 5, 8, 9, 12, 16). In water, sodium and calcium hypochlorite are
converted to the hypochlorite ion and hypochlorous acid. The latter is
present in higher proportions at lower pHs (<8.0) and is responsible for the
antimicrobial activity of chlorine solutions (13, 15). Peracetic acid is an
equilibrium mixture of the peroxy compound, hydrogen peroxide and
acetic acid. This sanitizer is approved by the FDA as an addition to wash
water for fruit decontamination (15).
Although P. expansum is commonly found in apples, there are no
reports that have evaluated the effectiveness of sanitizer treatments against
129
this potentially hazardous mold in these fruits (5, 12). In one previous
study (12), the authors analyzed the effect of chlorine solutions spiked
with various surfactants against suspensions of P. expansum in vitro but
not on the fruit surface. Other work (5) was undertaken to compare the
effectiveness of chlorine solutions with other chemical treatments against
P. expansum on Empire apple slices and mold suspensions (in vitro).
However, the effectiveness of the most commonly used sanitizers for P.
expansum inactivation on whole apple surfaces was lacking and the
objective of this study was to determine the effectiveness of chlorine and
peracetic acid sanitizers against P. expansum spores on the surface of six
different apples varieties (Red Delicious, Gala, Macintosh, Fuji, Empire
and Golden Supreme).
MATERIAL AND METHODS
Culture Preparation: Penicillium expansum CCT 4680 was obtained
from the André Tosello Foundation, Campinas, S.P., Brazil. The mold
was grown on Malt Extract Agar (MEA) (17) plates for 10 days at 25ºC.
The inoculum was prepared by adding 10 ml of sterile deionized water
followed by gentle swirling to release the spores. The spore suspension
was filtered through four layers of sterile cheesecloth to remove
mycelial debris and then centrifuged twice at 2000 X g for 15 min at
4ºC. The final pellet was resuspended in sterile deionized water at a
concentration of 108 spores/ml.
Apples: Red Delicious, Golden Supreme, Empire, McIntosh, Fuji and
Gala apple varieties were obtained from orchards at the New York State
Agricultural Experiment Station – Cornell University, Geneva, NY,
USA and were stored at 2ºC until needed.
Apple Inoculation: Initially, the apples were washed in water and
brushed to remove surface debris. Each apple was then rinsed with
sterile deionized water and dried on sterile cheesecloth in a laminar flow
hood. A section having a circumference of 3.5 cm radius was drawn
around the stem of each apple and a 100 µl spore suspension was
deposited in small, approximately equal volumes at 10 to 12 locations
on the skin surface within the target area. Inoculated apples were placed
in a biosafety hood for 2 h at room temperature to allow for drying of
the spore suspension prior to treatment with sanitizers. All apples
varieties were inoculated with approximately 5 log spores/g of P.
expansum.
Preparation of treatment solutions: Chlorine solutions were prepared
from sodium hypochlorite and sterile deionized water to obtain
130
concentrations of 50, 100 and 200 ppm of free chlorine. After
preparation, the pH of the solutions were 8.8, 9.3 and 9.7, for 50, 100
and 200 ppm free chlorine, respectively. Acidified chlorine solutions at
the same concentrations listed above were prepared with the final pH
adjusted to 6.5, using sterile 0.25 N phosphoric acid. As a control,
water solutions were tested with and without acidification to pH 6.5
using the same acid. Concentrations of free chlorine were confirmed
with chorine test strips (Test Systems, Inc. Rock Hill, SC, USA). A
peracetic acid-based sanitizer (Vortexx, Ecolab, Inc., St. Paul, MN) was
prepared at concentrations of 50 and 80 ppm by dilution with sterile
deionized water. The concentration of the solutions was confirmed with
peracetic acid test strips (Weber Scientific, Chestertown, MD, USA).
Treatment of Apples: Triplicates of the six inoculated apples varieties
were placed individually, stem down, in a 1000 ml beaker containing
100 ml of chlorine solution (0, 50, 100 and 200 ppm) or peracetic acid
solution (0, 50 and 80 ppm). The temperature of all solutions were 25ºC.
Each beaker was agitated for 30 s by gentle hand swirling. Each apple
was then immediately rinsed with approximately 100 ml of sterile
deionized water to stop the sanitizer action. The inoculated section of
the apple was removed using a sterile blade and extracted in a volume of
sterile 0.1% peptone water equal to ten times the weight of the apple
section. The extracts were serially diluted in sterile 0.1% peptone water,
pour plated (1 ml in duplicate) on potato dextrose agar acidified to pH
3.5 with 10% tartaric acid, and incubated for 4-5 days at 25ºC.
Triplicates of the six apples varieties inoculated with P. expansum
without any sanitizer treatment were also analyzed serving as an
untreated control.
Statistical analyses: Experiments were replicated three times for each
of the six varieties. Each replicate experiment consisted of three samples
exposed to the same treatment conditions. Treatments were analyzed for
significant differences using ANOVA and Student-Newman- Keuls.
Significant differences (P ≤ 0.05) are reported between mean
populations of each surviving P. expansum spore counts for water
treatments and the various sanitizing solutions as well as between the
different apples varieties.
RESULTS AND DISCUSSION
Populations of P. expansum spores recovered from a 30 s wash
at 25°C using the various sanitizer treatment solutions and water wash
treatments are shown in Table 1. All wash treatments were significantly
131
different (P ≤ 0.05) from the control except for Macintosh, Empire and
Golden Supreme varieties treated with peracetic acid at 50 ppm and for
Gala apples washed with tap water.
Treatment with tap water reduced the number of viable spores
by 0.23 to 0.78 log spores/g in all apple varieties except for Macintosh,
in which the water wash reduced the initial population by 1.34 log
spores/g. The treatment using tap water acidified with 0.25 N
phosphoric acid served as a control against the potential antimicrobial
activity of the acid itself. However, the results show that the acidified
water treatment was slightly less effective, but not significantly different
than the treatment using non-acidified tap water, reducing the viable
spore population by 0.10 to 0.37 log spores/g. Therefore, the phosphoric
acid was not responsible for the inactivation that was observed with
acidified chlorine solutions. The acid simply decreases the pH of the
solutions, resulting in the shift of the reaction equilibrium to yield more
hypochlorous acid ion, making the chlorine treatment more effective (2).
The number of spores detected after 30 s of contact with nonacidified chlorine solutions (50, 100 and 200 ppm) equated to reductions
ranging from 0.92 to 2.41 log spores/g. All treatments using nonacidified chlorine for the Red Delicious, Gala and Empire varieties and
the treatment of non-acidified 200 ppm chlorine for Golden Supreme
were significantly more effective than the water treatment alone.
However, for the three other varieties there was no significant difference
(P ≥ 0.05) between washing with water or any non-acidified chlorine
solution. This is in line with another study that showed spores of P.
expansum were not significantly affected by treatment with 200 ppm of
sodium hypochlorite at pH 9.7 (5). With one exception (the less
effective 50 ppm non-acidified chlorine; Red Delicious), there were no
significant differences among apple varieties tested with non-acidified
chlorine treatments. These results show that for most of apple varieties,
a four-fold increase in the non-acidified chlorine concentration does not
significantly alter the recovery of P. expansum spores. Furthermore, for
two varieties (Macintosh and Fuji), water treatment had the same effect
as the non-acidified chlorine solutions at all the concentrations tested.
These results exemplify the importance of pH adjustment for chlorine
solutions to ensure that hypochlorous acid is formed with hypochloritebased sanitizing solution (7).
Good Agricultural Practice (GAP) guidelines currently
recommend a post-harvest wash treatment of fresh produce in 50 to 200
ppm total chlorine solution at a pH range from 6.0 to 7.5 (19). In our
132
study, the results of apples treatments with chlorine solutions at a pH 6.5
caused reductions of more than 5 log spores/g for Macintosh, Empire
and Golden Supreme at 200 ppm . The treatment at 100 ppm reduced
the population by 2.60 log spores/g with Fuji apples, and by
4.22 log spores/g for Macintosh apples. At all acidified chlorine
concentrations, Macintosh apples showed the highest spore reductions.
Treatments at 50 ppm using acidified chlorine solutions yielded decimal
reductions of 1.86 log spores/g, with Gala and 3.5 log spores/g with
Macintosh. When comparing treatments using non-acidified versus
acidified chlorine solutions, the effectiveness was significantly higher
for acidified solutions for all apple varieties at 100 and 200 ppm. At 50
ppm, the effectiveness of the acidified chlorine treatments was higher
than non-acidified chlorine treatments for all varieties excluding Gala
and Macintosh, where no significant differences were observed. At pH
6.5, higher chlorine concentrations resulted in higher P. expansum spore
reductions for all varieties except for Gala and Fuji in which no
significant differences were observed between higher concentrations of
acidified chlorine solutions. Okull et al. (12), also observed that the
activity of acidified sodium hypochlorite solutions were significantly
higher (1.1 log cfu/ml) than alkaline solutions (0.4 log cfu/ml) for
P. expansum spores (in vitro) using chlorine solutions at 50 ppm for
30 s. Our study shows at the same chlorine concentration markedly
higher decimal reduction than that found by Okull et al. Chen et al. (5)
observed that sodium hypochlorite at 200 ppm decreased P. expansum
spores populations (in vitro) by approximately 1 log MPN/ml after 5
min of contact. For all apples varieties, treatments using acidified
chlorine at 50 ppm were more effective than treatments using the same
concentration of peracetic acid.
The P. expansum spore count reductions due to peracetic acid
treatments ranged from 0.85 at 50 ppm to 1.93 at 80 ppm. However, for
all varieties the efficacy of the 50 ppm peracetic acid treatment was not
significantly different from the 80 ppm treatment. In addition, for all
varieties there was no significant difference in the reduction of P.
expansum spores when comparing non-acidified chlorine solutions with
peracetic acid solutions at any concentration. This supports previous
evidence concerning the activity of peracetic acid solutions and chlorine
solutions against yeasts and molds in apples (1). Furthermore, P.
expansum spore recovery from Macintosh, Empire, and Golden
Supreme varieties showed no statistical differences between tap water
and 50 ppm peracetic acid treatments. Different apple varieties did not
contribute significantly for the results of the treatments since no
133
statistical differences (P ≥ 0.05) were observed among the six apple
varieties tested.
In summary, chlorine at pH 6.5 was more effective than all other
treatments and substantially more effective than non-acidified chlorine
at 100 and 200 ppm in killing P. expansum spores on the apple's surface.
Peracetic acid at 50 and 80 ppm concentrations, and non-acidified
sodium hypochlorite at 50, 100 and 200 ppm were similar in
effectiveness in reducing P. expansum spore populations. The US Food
and Drug Administration recommends that the total concentration used
for sanitizing fruit not exceed 200 ppm of sodium hypochlorite and
80 ppm of peracetic acid in wash water (20). However, for non-acidified
chlorine and peracetic acid, this study showed that the maximum
permitted concentrations only reduce the initial population by 1 to 2 log
spores/g for five of the six varieties studies. Results of this study show
that a decrease in the pH of the sodium hypochlorite solutions used to
sanitize apples can significantly reduce the population of P. expansum
naturally occurring on the surface of these fruits. In addition, this
research also shows that a simple wash with water in the apple wash
process will have less than a 1 log spores/g reduction of P. expansum,
which does very little to reduce this patulin producing mold on apple
surfaces.
ACKNOWLEDMENTS
We gratefully acknowledge the Capes Foundation (Brazil) for the
financial support of Beatriz de Cássia Martins Salomão for her Ph.D.
studies. The authors also thank David C. Manns for his help with the
statistical analyses and the assistance with the manuscript preparation.
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Accessed 7 February 2007.
136
137
4.4 Modeling Penicillium expansum resistance to thermal and
chlorine treatments
Apresentação:
A diminuição da contaminação por P. expansum no processo
produtivo deve acontecer principalmente pela redução de sua carga nas
maçãs (através das estapas de lavagem e seleção das frutas) e também
pela sua destruição durante o processo térmico de pasteurização, o qual
é considerado um ponto crítico de controle. Levando-se em conta que a
pasteurização do suco de maçã a ser mantido refrigerado utiliza
temperaturas mais amenas (71ºC/6 s), esse trabalho teve o objetvo de
estudar a resistência térmica destes esporos. Além disso, estudou-se a
habilidade de modelos matemáticos em descrever as curvas de
inativação de P. expansum obtidas por aquecimento e também por
sanitização.
Research Note
Modeling Penicillium expansum resistance to thermal and chlorine
treatments
BEATRIZ C. M. SALOMÃO2, JOHN J. CHUREY1, GLÁUCIA M. F.
ARAGÃO2, and RANDY W. WOROBO1*
1
14456-0462, USA.
2
Department of Chemical Engineering and Food Engineering,
Federal University of Santa Catarina, UFSC, Florianópolis, SC 88040900, Brazil.
*Author for correspondence. Phone: 315-787-2279, Fax: 315-787-2284.
Keywords: Penicillium expansum, patulin, apple juice, apple sanitizing,
Bigelow Model, Weibull Model, and Biphasic Model.
Abstract
Apples and apple products are excellent substrates for
Penicillium expansum to produce patulin. In an attempt to avoid
excessive levels of patulin, limiting or reducing P. expansum
138
contamination levels on apples designated for storage in packing houses
and/or during apple juice processing is critical. The aim of this work
was (i) to determine the thermal resistance of P. expansum spores in
apple juice; comparing the ability of Bigelow and Weibull models to
describe the survival curves and (ii) to determine the inactivation of
P. expansum spores in aqueous chlorine solutions at varying
concentrations of chlorine solutions; comparing the ability of Biphasic
and Weibull models to fit the survival curves. The results showed that
Bigelow and Weibull models were similar for describing the heat
inactivation data because the survival curves were almost linear. In this
case, the concept of D and z values could be used and the D-values
obtained were 10.68, 6.64, 3.32, 1.14 and 0.61 min at 50°C, 52°C, 54°C,
56°C and 60°C, respectively; while the z-value was determined to be
7.57°C. For the chlorine treatments, although Biphasic model presented
a slightly superior performance, Weibull model has been choose
considering parsimony principal, since it has less parameters than
Biphasic model. In conclusion, the typical pasteurization regime used
for refrigerated apple juice (71ºC/6 s) is capable of achieving a 6-log of
P. expansum spores.
Introduction
Apples and apple products, like juice and cider, are excellent
substrates for Penicillium expansum to grow and produce patulin. This
fungus is the most important causative agent of blue mold rot in this
fruit (12, 18, 26) and apple juice contaminated with patulin is indicative
of rotted fruit used for juicing (27, 29). The presence of patulin in apple
products such as juice represents an important concern since this
mycotoxin is considered to be carcinogenic, mutagenic and teratogenic
for animals and it is suspected to be a health risk in humans (8, 9, 14,
22, 33).
Apple storage at low temperature fails to impede fungal growth
and patulin production (25), then alternative treatments need to be
identified to avoid this problem in fruit destined for juicing over the offseason months. In this way, sanitizer treatments are important measures
to reduce mold spore contamination levels with these fruit. Sodium
hypochlorite based sanitizers are efficient for disinfection (24) and
widely used. However, organic chlorine compound (sodium
dichloroisocyanurate) also shown to be effective in reducing
P. expansum spores on apple surfaces (unpublished data).
139
Another effective treatment for reducing P. expansum spores is
through the thermal treatment of the apple juice. In this step, mold
spores can be destroyed by heating (28) but since patulin is relatively
stable to thermal degradation in the pH range of 3.5 to 5.5, very little
patulin destruction occurs (7, 16). P. expansum spores can be introduced
at the juice processing facility by contaminated fruits. During harvest
season, although fruit with no visible rot are generally used for juicing,
they may be contaminated with internal fungal growth (11, 27). During
the off-harvest season, visible blue mold infected apples are commonly
found and wash treatments using high-pressure water spray can remove
damaged areas (1, 31). However, spores will be suspended in the flume
or wash water and this inoculum will increase the risk of mold growth
during bulk storage (4). Thermal processing has been suggested as a
critical control point for juice to avoid the growth of P. expansum and
subsequent patulin production in the finished juice. However, it is more
important to control P. expansum development in the fruits by reducing
mold contamination levels prior to apple storage.
Determination of the thermal processing regime (for juice
pasteurization) and the efficacy of chlorine sanitizer conditions (to
reduce spores during handling of apples in water at packing houses or in
the wash water in the juice industries) is essential for controlling
P. expansum since this information is very limited in the literature.
The inactivation kinetics of microorganisms, primarily the heat
resistance of microorganisms, has been determined by the classic
Bigelow’s model (D and z concepts). Numerous microorganisms,
including fungi, show non-linear, semi-logarithmic survival curves (2, 5,
10, 23). Peleg (19) and Van Boekel (32) considered that the linear
behavior for the survival curves is the exception rather than the rule.
The Weibull model has been proposed to estimate thermal and
non-thermal inactivation of microorganisms (3, 20, 21, 32). This model
assumes that cells and spores in a population have different resistances
and a survival curve is the cumulative form of a distribution of lethal
agents (19).
In order to model the inactivation behavior that displays tailing,
Cerf (2) proposed a two-fraction Biphasic model capable of describing
log-linear, linear with tailing and biphasic survival curves (6).
The aim of this work was to determinate the heat resistance of
P. expansum in apple juice and also to estimate its response to sanitizer
treatments, choosing the appropriate models to describe the survival
curves obtained in both cases.
140
Material and methods
Preparation of mold spore suspension: P. expansum CCT 4680 strain
was obtained from André Tosello Foundation, Campinas, S.P., Brazil.
The mold was grown on Malt Extract Agar (23) plates at 25°C for 10
days. After incubation, 10 ml of deionized sterile water was added to the
surface of the plates and the mold growth was scraped using a sterile
scraper. The suspension was filtered through four layers of sterile
cheesecloth to remove hyphae and then centrifuged at 2000 x g for 15
minutes at 4°C twice. The final spore suspension concentration was
adjusted with deionized sterile water to achieve roughly > than
109 spores/ml.
Heat Resistance: The heat resistance was determined in 1.5 x 1.8 x 90
mm capillary tubes. The heating menstrum used was prepared by the
dilution of 1 ml of spore suspension in 9 ml of apple juice pasteurized at
121ºC/5 min (pH 3.25; 12.2°Brix; 0.45% total acidity). A 1 ml syringe
equipped with a Hamilton repeating dispenser was used to inject 0.04 ml
of the inoculated juice into each capillary tube (5, 30). After flame
sealing, 5 tubes for each temperature were submerged in a circulating
water bath (Haake® C1, Karlsruhe, Germany) at 50, 52, 54, 56, and
60°C. The tubes were removed at the various time intervals, immediately
cooled in an ice water bath, and then placed in 95% ethanol to reduce
the level of surface contamination on the capillary tubes. The residual
ethanol was then blot dried on sterile filter paper, and the five capillary
tubes from each sample time were transferred to a dilution bottle
containing 20 ml of sterile water. The capillary tubes inside the bottle
were then crushed using a sterile glass rod. This resulted in an initial
dilution of 102 CFU/ml. Appropriate decimal dilutions were performed
in 0.1% peptone water and plated on Potato Dextrose Agar (Criterion®,
Santa Maria, CA, U.S.A.), pH 3.5, containing 50 mg/ml Rose Bengal to
inhibit spreading. The colonies were enumerated after an incubation
period of 4-5 days at 25°C. Each test was individually analyzed in
duplicate trials.
Sanitizer in aqueous solutions: The chlorine solutions were prepared
using sodium dichloroisocyanurate-based sanitizer (Sumaveg®, Johnson
Diversey, São Paulo, Brazil) at 0, 25, 50 and 75 ppm of free chlorine.
The level of free chlorine was measured using free chlorine test strips
(Test Systems®, Rock Hill, SC, U.S.A.). The tests were carried out by
the contact of 0.1 ml of P. expansum suspension spores and 5 ml of the
141
above described chlorine solutions for the duration of 1, 2, 3, 4, 5 and
6 min, for each chlorine concentration. In order to inactivate the chlorine
at the end of each time point, 1.6 ml of 0.6% sodium thiosulfate solution
was added and held for 2 min. Each sample (triplicate) was diluted and
plated on Potato Dextrose Agar (Biolife®, Milan, Italy), pH 3.5,
containing 50 mg/ml Rose Bengal to inhibit spreading. The colonies
were counted after an incubation period of 4-5 days at 25°C.
P. expansum inactivation modeling: GInaFiT® software, version 1.4.2
(6) was used to estimate the inactivation parameters. For modeling
P. expansum CCT 4680 heat inactivation in apple juice, the ability of
the classic Bigelow model (Equation 1) and Weibull model (Equation 3)
(13) was compared. The biphasic model (Equation 2) described by Cerf
(2) and the Weibull model were fit to survival curves and its ability to
describe the inactivation after sanitizer treatments was compared.
The inactivation models were:
Bigelow model:
t
 N 
Log 
=−
D
 No 
(Equation 1)
Cerf (biphasic) model:
 N 
(Equation
Log 
 = Log ( f × exp( − k max 1× t ) + (1 − f ) × exp( − k max 2 × t )
 No 
2)
Weibull model:
t p
 N 
Log 
 = −( )
δ
 No 
(Equation 3)
In these equations, N represents the number of surviving spores
after the duration (t) of treatments, while No is the initial level of
P. expansum spores at the beginning of treatment (t = 0 min). In
equation 1 (Bigelow model), D is the time (min) needed to reduce the
population by one logarithmic cycle.
The Biphasic model (equation 2) assumes the existence of two
sub-populations which are characterized by the difference in their levels
of sensitivities to the treatment where f is the fraction of treatmentsensitive and (1-f) is the treatment-resistant fraction. The specific
142
inactivation rates of the two populations are kmax1 (min-1) and kmax2
(min-1), respectively.
In the Weibull model (equation 3), p is a shape parameter (for
p > 1, convex curves are obtained while for p < 1, concave curves are
described) and δ is a scale parameter.
In an effort to best explain the observed data, for each
experimental set, a secondary model was established using the
information attained when fitted to the primary model selected.
Model comparison: The following three criteria were used to compare
different models.
MSE (Mean square error)
The smaller mean square error (MSE) values, the better the
model to fit data.
RSS ∑ (observed − predict )
(Equation 4)
=
MSE =
n
n
Where RSS is the residual sum of squares, n is the number of
degrees of freedom.
bias factor
If there is structural derivation and the bias factor = 1, the model
is exact.
2
bias factor = 10



∑
Log (observed / predicted ) 

n

(Equation 5)
Af (Accuracy factor)
The larger the value, the less accurate the average estimate.
A f = 10




∑
Log( predicted / observed 


n

(Equation 6)
Results and discussion
The model parameters and statistic comparison obtained for
thermal inactivation are presented in Table 1 where it is possible to
observe that both models describe all thermal inactivation curves
similarly well. Using the Weibull model, when p-value is close to 1 (p
values ranged from 1.00 to 1.13) the survival curve is almost linear and
143
δ values can be compared to D values. Therefore, as can be seen in
Figure 1, these results show that the survival curves are almost linear,
and the classical Bigelow model can be used to describe the heat
resistance of P. expansum in apple juice under the investigated
conditions (50, 52, 54, 56 and 60°C) without the risk of an inaccurate
thermal death time calculation.
A secondary model was established showing the behavior of
log D with the temperature (T) variation (Figure 2). As the relation is
almost linear in the investigated temperature range, the z value could be
calculated using the D values obtained from the Bigelow model
(z = 7.57°C; r2 = 0.97), and the equation obtained was:
Log D = -0.1321T + 7.6274
(Equation 7)
The ability of Biphasic and Weibull models to describe the
chlorine inactivation of P. expansum CCT 4680 was compared. Both
models were able to describe microbial inactivation, as can be
concluded analyzing the statistical data on Table 2. Biphasic model
presented a slightly superior performance, but this model has three
parameters and Weibull model has two. Considering parsimony
principal, Weibull model has been choose to describe the chlorine
inactivation and its parameters (p and δ) are presented on Table 2. It can
be observed that the higher the chlorine concentration, the lower were
the p and δ values. The survival curves displayed a Weibull behavior
when analyzing the chlorine treatments of P. expansum CCT 4680 and p
values obtained were less than 1 describing concave curves (Figure 3).
The Figure 4 and 5 present the fit of secondary model to chlorine
treatments obtained by variation of δ (exponential) and p (linear)
parameters with chlorine concentration from 25 to 75 ppm. The
equations obtained for secondary models considering δ (r2 = 0.99) and
p (r2 = 0.98) parameters were:
δ = 0.36e -0.072(chlorine)
p = 0.005(chlorine) + 0.52
(Equation 8)
(Equation 9)
Marquenie et al. (15) studied the heat resistance of
Botrytis cinerea and Monilia fructigena in 10 mM phosphate buffer
(pH 7.2). They showed that after 15 minutes of heating at 45°C,
B. cinerea levels were reduced by approximately 5.5-log. In the case of
M. fructigena, it required 15 minutes at 43°C to reach an approximately
144
4-log reduction. Contrary to the findings of this study, the data of log
(N0/N) vs. time showed that the survival curves were not log linear.
Therefore, the use of the D concept must be avoided. In addition, it is
possible to observe that the heat resistance of P. expansum in the present
work is higher than those molds studies by Marquenie et al. (15). For
example, it required 15 min of heating at 50ºC to reach a 1.4-log
reduction of the initial population of P. expansum CCT 4680 while an
approximately 4.5-log reduction was achieved after 15 min of heating at
54ºC.
Shearer et al. (28) studied the heat resistance of juice spoilage
microorganisms and reported the maximum D60ºC of 0.016, 0.290 and
0.449 min for Penicillium citrinum, Penicillium roquefortii and
Aspergillus niger, respectively. The present investigation found a higher
D60ºC of 0.61 min for P. expansum CCT 4680 spores than the previous
study. Using the 7th equation (Log D = -0.1321T + 7.6274), it is possible
to show that the D-value at 71ºC is 0.017 min (D71ºC=1.020 s).
Therefore, the typical pasteurization regimes used for refrigerated fruit
juice (71ºC/6 s) is capable of achieving a 6 log reduction of P. expansum
CCT 4680.
The quality of the raw material should also be controlled at the
beginning of process to minimize the patulin levels in the finished apple
products. The use of organic chlorine treatments in reducing
P. expansum spores was found to be efficient to reduce the incidence of
mold growth in apples during storage. Furthermore, the results showed
that the well known Bigelow model can be used for the thermal
inactivation conditions for P. expansum used in this study while the
Weibull model was best in describing the inactivation of P. expansum
spores due to sanitizer treatments.
Acknowledments
financial support of Beatriz C. M. Salomão for her Ph.D. studies. This
research was supported by the M-1033 Regional Hatch Funds and the
New York State Agricultural Experiment Station. The authors would
like to thank David C. Manns of Cornell University for his assistance
with the manuscript preparation.
145
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Figures
Figure 1 – Thermal survival curves of P. expansum CCT 4680 at 50 (♦),
52(▲), 54 (+) , 56 (●) and 60°C (▫).The line () corresponds to
Bigelow Model fitted to survival curves.
Figure 2 –Secondary model showing the dependence of log D with
temperature (°C).
Figure 3 –Sanitizer survival curves of P. expansum CCT 4680 when
treated with chlorine sanitizer at 25 (+), 50 (●) and 75 ppm (▫). The line
() corresponds to Weibull Model fitted to survival curves.
Figure 4 –Secondary model obtained by variation of
concentration (ppm)
δ vs. chlorine
Figure 5 –Secondary model obtained by variation of p vs. chlorine
concentration (ppm)
Table1. Statistic indices for Bigelow and Weibull models and thermal
inactivation parameters of P. expansum CCT 4680 in apple juice
Bigelow model
T(ºC)
D
(min)
MSE
bias
Af
δ
50
52
54
56
60
10.68
6.64
3.32
1.14
0.61
0.01
0.01
0.02
0.08
0.01
1.00
1.00
0.99
1.00
1.01
1.01
1.02
1.01
1.00
1.01
11.77
7.56
3.33
1.36
0.65
Weibull Model
p
MSE
bias
Af
1.08
1.10
1.10
1.13
1.06
0.01
0.01
0.03
0.08
0.06
1.00
1.00
0.99
1.00
0.96
1.01
1.02
1.01
1.00
1.04
149
Table 2. Statistic indices for Biphasic and Weibull models and Weibull
model parameters for chlorine inactivation of P. expansum CCT 4680
Chlorine
(ppm)
Biphasic Model
MSE bias Af
δ
25
0.02
0.98
1.02
0.06
50
0.06
0.90
1.11
0.01
75
0.02
0.99
1.01
5
10
15
Weibull Model
p
MSE bias
1.55x10
-5
Af
0.39
0.07
1.02
1.16
0.29
0.04
0.98
1.16
0.14
0.16
1.08
1.08
35
40
0
-1
0
20
25
30
Log N/No
-2
-3
-4
-5
-6
-7
Time (min)
1.10
0.90
Log D
0.70
0.50
0.30
0.10
-0.10 50
51
52
53
54
55
56
-0.30
Temperature (o C)
57
58
59
60
150
0
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Log N/No
-2
-3
-4
-5
-6
-7
Time (min)
0.06
0.05
δ
0.04
0.03
0.02
0.01
0
25
50
Chlorine (ppm)
75
151
0.4
0.35
p
0.3
0.25
0.2
0.15
25
50
Chlorine (ppm)
75
152
4.5 Influence of storage temperature and apple variety on patulin
production by Penicillium expansum
Apresentação:
Os resultados anteriores mostraram que as maçãs destinadas ao
processamento podem estar contaminadas com esporos de P. expansum.
O grau de contaminação por este fungo pode variar dependendo das suas
condições previas de estocagem. O desenvolvimento deste fungo na
matéria-prima pode levar ao apodrecimento das frutas com consequente
produção de patulina no produto final. Assim, este estudo avaliou a
produção de patulina por P. expansum em seis diferentes variedades de
maçã durante armazenamento em duas condições de temperatura.
Research Paper
Influence of storage temperature and apple variety on patulin
production by Penicillium expansum
BEATRIZ C. M. SALOMÃO2, GLÁUCIA M. F. ARAGÃO2, JOHN J.
CHUREY1, OLGA I. PADILLA-ZAKOUR1, and RANDY W.
WOROBO1*
1
14456-0462, USA
2
Brazil
*Author for correspondence. Phone: 315-787-2279; Fax: 315-787-2284.
Keywords: Penicillium expansum, apples, patulin, cider, juice, storage
temperature
ABSTRACT
This study examined the potential for patulin production in six
different varieties of apples (Red Delicious, Golden Supreme, Gala,
Fuji, Empire and McIntosh) inoculated with Penicillium expansum
spores and stored at two different temperatures (11°C and 20.5°C).
Samples for patulin analysis were randomly taken from apples stored at
different time periods ranging from 21 to 93 days. While patulin was
153
produced at both storage temperatures, apples incubated at 20.5°C
yielded significantly higher patulin concentrations than those incubated
at 11°C. All apple varieties showed mold spoilage at both temperatures,
except Red Delicious and Empire. A total of 44% of the samples
analyzed showed patulin concentrations over the FDA regulatory limit
(50 ppb). The highest patulin productions occurred in Golden Supreme
(54,221 ppb) and McIntosh (52,131 ppb and 48,457 ppb) varieties. Our
results showed that careful culling of apples is essential for high juice
quality since high patulin levels in some apples varieties could result in
a greater than 50 ppb level of this mycotoxin in the finished juice or
cider even when only one contaminated apple occurs in one thousand
apples.
INTRODUCTION
Patulin is a mycotoxin that is produced by certain species of
molds including Penicillium expansum, the causative fungus for core rot
in apples, which can be considered as the primary species responsible
for the production of this mycotoxin in the pre-processing stages of the
fruit (pre-harvest and post-harvest). Although patulin can occur in
different food products, the most important source of patulin for humans
are apples with blue mold rot and apple products made from P.
expansum rotted apples (1, 9, 10, 14, 16, 23, 25, 33, 34, 36).
The presence of patulin in apple products has been of particular
interest because studies in animals have shown that patulin can cause
acute effects to the intestinal tract which may include epithelial cell
degeneration, inflammation, ulceration, and hemorrhages. Chronic
symptoms
such
as
genotoxic,
neurotoxic,
immunotoxic,
immunosuppressive, teratogenic and carcinogenic effects have also been
attributed to patulin exposure over time. On a cellular level, patulin has
been shown to result in plasma membrane disruption, protein synthesis
inhibition, disruption of transcription and inhibition of DNA synthesis
(5, 16, 17, 18, 20, 26, 28, 29, 33, 39, 45). Therefore, apple products
contaminated with patulin pose a serious health risk, particularly to
children who consume high levels of apple products, placing them at
increased risk for patulin toxicity (25, 42).
Thermal processing, frequently used to treat apple juice and
cider, does not inactivate patulin since this mycotoxin is relatively heat
resistant, particularly in acidic environments (pH 3.5 to 5.5) (46).
Patulin contained in apple juice or cider is stable after typical
pasteurization processes (8, 13, 21, 24). Since the compound persists in
154
heated juices, it has been suggested that the presence of patulin in
processed apple products may be a good indicator of the quality of the
fruit used in production (18). However, it has been reported that patulin
can be destroyed during the course of yeast fermentation (35).
Although the toxicity of patulin in humans has not been
demonstrated conclusively, limiting its concentration in apple juice is
desirable since infants are the predominant consumers of these products
and the effects of long-term exposure to patulin are not known (18).
Several government food safety organizations worldwide have set limits
on patulin content in apple products. FDA and Codex Alimentarius
established a maximum patulin concentration of 50 µg/l in singlestrength and reconstituted apple juices (7, 41, 42). In Europe, a
maximum level of 50 µg/kg has been established for apple juice and
apple cider, while maximum levels for apple products and apple
products intended for consumption by young children have been set at
25 µg/kg and 10 µg/kg, respectively (11).
The FDA has recommended control measures for patulin that
include purchasing only sound tree-picked apples, culling, and trimming
apples prior to processing to eliminate moldy, damaged, or rotten apples
(43). However, the trimming process is labor intensive and automated
trimming of infected tissue is not possible. In addition, P. expansum
infected apples may appear as sound on the exterior but core rot may be
present and can be overlooked during culling operations (3). Therefore,
careful selection of apples still remains the prerequisite for high quality
juice (31). Since patulin has been detected frequently in apple juices and
apple cider and is relatively stable to processing treatments for extended
periods of time, it is essential that patulin control measures are taken
prior to juice extraction and processing. Codex Alimentarius
recommends that good agricultural practices (GAP) and good
manufacturing practices (GMP) are used throughout the production
chain in an attempt to limit the amount of patulin in the finished juice
(6). The Food and Agriculture Organization of the United Nations
(FAO) and the FDA (12, 43), have recommended the adoption of the
Hazard Analysis and Critical Control Points system (HACCP) to
guarantee that patulin levels do not exceed the 50 µg/kg regulatory
action level (33).
Patulin production in fruit is believed to be affected by many
factors. Apple variety is a very important factor since different varieties
differ in their susceptibilities to P. expansum rot and patulin formation.
Furthermore, apple storage temperature is a major environmental factor
that affects apple shelf life and fungal deterioration rate (18).
155
Considering the concerns for patulin production by P. expansum
in apples, it is important to understand and characterize its production in
different apples varieties under different storage conditions. The purpose
of this investigation was to determine patulin production rates in apples
infected with P. expansum, evaluated at two different incubation
temperatures (11°C and 20.5°C) for six different apples varieties
commonly used for apple cider and juice (Red Delicious, Golden
Supreme, Gala, Fuji, Empire and McIntosh) (44). In addition, a small
portion of this study was conducted in order to confirm that yeast
fermentations were capable of reducing patulin levels in apple juice and
provide a plausible explanation for some of the patulin levels observed
in extensively rotted apples but low levels of patulin were observed.
This study provides a basis for target culling levels in juice
manufacturing facilities to yield patulin levels in the final product that
are below the limit allowed by regulatory agencies.
MATERIAL AND METHODS
Culture Preparation: Penicillium expansum CCT 4680 strain was
obtained from the André Tosello Foundation, Campinas, S.P., Brazil.
The mold was grown on Malt Extract Agar (MEA) (32) plates for 10
days at 25ºC. The inoculum was prepared by adding 10 ml of sterile
deionized water to each plate followed by gentle swirling to facilitate
spore release. The spore suspension was filtered through four layers of
sterile cheesecloth to remove mycelial debris and then centrifuged twice
at 2000 X g for 15 minutes at 4ºC. The final pellet was resuspended in
sterile deionized water at a concentration of 108 spores/ml. From this,
working suspensions with a concentration of 103 spores/ml were
produced and maintained at 4ºC until apple inoculation.
Apples: Red Delicious, Golden Supreme, Empire, McIntosh, Fuji and
Gala apple varieties were harvested at commercial maturity according to
standard horticultural practices from orchards at the New York State
Agricultural Experiment Station – Cornell University, Geneva, NY,
USA and were stored at 2ºC until needed.
Apple Inoculation: Before each experiment, 15 selected apples of each
variety were allowed to equilibrate to room temperature. Each apple was
washed and brushed to remove surface debris and then rinsed with
sterile deionized water and dried on sterile cheesecloth in a laminar flow
hood. Apples were inoculated by a 10 minute dip in 4 liters of the
P. expansum suspension containing 103 spores/ml. The suspension was
maintained refrigerated at 4ºC to aid in the internalization of the spores
through the calyx and stem. The temperature differential between apple
156
and spores suspension is necessary to produce the pressure differential
responsible for the internalization of the microorganism (2, 40). Excess
liquid of the spore suspension was drained from apples and inoculated
apples were then stored at two different temperatures (11ºC and 20.5ºC).
Fifteen selected, non-inoculated apples of each variety were also
maintained at the same temperatures, serving as uninoculated controls.
Patulin production study: Samples of juice from incubated apples
were periodically taken for patulin analysis. The apple juice was made
by squeezing the juice of cut and mashed apple pieces from a single
entire apple and the resulting juice was filtered through four layers of
cheesecloth. All samples were frozen prior to analysis.
Patulin analysis: Frozen samples of the juice from each single apple
were sent to an external laboratory (Trilogy Analytical Laboratory, Inc.
Washington, MO) for patulin analysis on the same day of extraction or
the following day. The methodology used was the official method
adopted by AOAC Intl. for apple juice (method 995.10) (4, 42). Results
were expressed as µg/L or parts per billion (ppb).
Apple juice Fermentation: Commercially purchased dry yeast of
Saccharomyces cerevisiae (Lallemand, Australia) was used to ferment
juice made from rotted McIntosh apple. Juice was prepared according to
the methodology above, and an aliquot was sent to the external
laboratory (Trilogy Analytical Laboratory, Inc. Washington, MO) for
patulin analysis in order to determine the initial patulin concentration in
the juice. This juice (16.2ºBrix, pH 4.1) was used to determine whether
the fermentation process could reduce the patulin concentration. Sixty
milliliters of this juice was divided in two samples of thirty milliliters
and each sample was placed into a 50 ml Erlenmeyer flask fitted with
fermentation trap. A 0.5 g inoculation of the yeast powder in both juice
samples initiated the fermentation process. The samples were left at
room temperature (23 to 25ºC) and were swirled twice daily to insure
suspension of the yeast and to permit observation of gas evolution.
Fermentation was considered complete (7 days after inoculation) when
gas evolution ceased and the soluble solids ranged from 3.4 to 4.0°Brix.
RESULTS
Patulin production in rotted apples: Table 1 and Table 2 show all
patulin results found in apples incubated at 20.5°C and 11°C,
respectively.
157
Signs of apple rot were observed after 21 days of incubation at
both temperatures (11°C and 20.5°C). After 21 days, only Red Delicious
and Empire varieties showed no signs of mold rot at 20.5°C. No patulin
was detected in McIntosh and Gala varieties at 20.5°C, after 21 days of
incubation. Under the same conditions, Golden Supreme (Figure 1a and
Figure 1b) and Fuji (Figure 1c) showed levels greater than 6,000 ppb. At
11°C, Gala showed no detectible patulin levels after 21 days of
incubation. However, low levels of patulin were found in Golden
Supreme apples under the same conditions.
After 29 days at 20.5°C, a sample of Golden Supreme apple was
completely rotted showing mold internalization in the central apple
tissue and high levels of patulin were detected (Figure 1d). At 11°C,
although McIntosh and Golden Supreme were completely rotted, no
patulin was detected in either variety.
The patulin concentrations found in Gala, McIntosh and Golden
Supreme varieties after 35 days at 20.5°C showed differences with high
and extremely high levels of patulin, respectively. In this case, McIntosh
and Golden Supreme showed visible internal mold growth (Figure 1e
and Figure 1f, respectively). After 44 days at 20.5°C, a Golden Supreme
sample became partly rotted with patulin levels exceeding the regulatory
upper limit.
The Golden Supreme apples, incubated for 59 days at 20.5°C,
became completely rotted showing visible mold growth on the exterior
and interior of the fruit. However, no patulin was detected in this
sample. Similarly, McIntosh apple, incubated under the same
conditions, showed both sound and decayed sections within the fruit and
yielded very high levels of patulin (Figure 1g). After 59 days of
incubation at 11°C, no patulin was detected in the Fuji variety and,
under the same conditions; P. expansum produced low levels of patulin
in Golden Supreme apples and high levels in McIntosh apples (Table 2).
A sample of Fuji apple analyzed after 80 days of incubation at
20.5°C showed visible mold growth on the exterior surface and very
high levels of patulin (Figure 1h and Figure 1i). In a molded McIntosh
sample that was incubated for 80 days at 20.5°C, no patulin was
detected. After 80 days of incubation at 11°C, no patulin was detected in
the McIntosh variety. Also at this temperature after 93 days of
incubation, no patulin was detected in Golden Supreme apples. After
93 days of incubation at 20.5°C, no patulin was detected in the
McIntosh and Fuji varieties. However, after the same incubation time,
158
the concentration of patulin was six times the maximum allowed
regulatory limit in Golden Supreme variety.
Apple juice fermentation: The initial patulin concentration in the juice
was 288 ppb. After fermentation, no patulin was detected in either
sample.
DISCUSSION
Samples incubated at 20.5°C became more rotted due to mold
compared to those incubated at 11°C. However, even at lower
temperature (11°C), McIntosh, Golden Supreme, Gala, and Fuji
varieties became rotted and the two first varieties cited produced patulin.
P. expansum exhibited psychrotrophic characteristics, growing and
producing patulin under refrigerated storage. Paster et al. (27) studied
the ability of P. expansum strains to grow and produce patulin in apples
stored at different temperatures (0, 3, 6, 17 and 25°C) and it was
determined that the maximum production of patulin in apples occurred
at 17°C.
Patulin levels like those found in this study for whole apples, are
considered extremely high and clearly show the potential of
P. expansum to produce high levels of patulin in select varieties of
apples. In accord agreement with other work (15), our results show that
storage temperature is a major factor for patulin production in apples.
Empire and Red Delicious varieties did not become rotted
throughout the entire test period implying that these varieties could be
considered more resistant against P. expansum growth and
consequently, patulin production. However, another study (19) reported
that cider pressed from ground-harvested Red Delicious apples had
higher levels of patulin than cider prepared from other varieties (Golden
Delicious, Granny Smith, Fuji, Gala, McIntosh and Red Rome). Our
work is in accord with other authors (10, 18) who concluded that the
mere presence of P. expansum did not necessarily imply that patulin was
present since mycotoxin production is influenced by many factors
including environmental conditions (i.e. temperature), variety and
nutritional status of the fruit. A factor that may explain the differences in
the various studies is the integrity of the fruit and the fruit storage
conditions. The fruit used in this study was tree picked and the
inoculation of the apples was performed within 1 day of harvest.
It was clear in this study that patulin concentration is dependent
on apple variety. Marín et al. (22) also showed that apple variety was the
159
main factor affecting patulin content. In their study, they describe a
markedly higher patulin concentration in Golden Delicious apples than
in Fuji apples, attributed to the fact that Golden Delicious apples have a
softer flesh and is more acidic than Fuji. A study from Brazil (30)
comparing patulin production in two different varieties (Gala and Fuji)
showed that 30 days after inoculation with P. expansum at 25°C, patulin
levels reached a concentration of 2,400 µg/l in the Fuji variety and
325 µg/l in the Gala variety. Comparing the same varieties but with
different incubation conditions, our results similarly showed higher
patulin concentrations in the Fuji variety (6,144 µg/l, after 21 days of
incubation at 20.5°C) than in the Gala variety (66 µg/l, after 21 days of
incubation at 20.5°C). However, our results showed (in a shorter period
of time and a lower temperature of incubation) that P. expansum
produced 2.5 fold more patulin in the Fuji variety than in the former
study. This may be explained by differences in the patulin production of
the P. expansum strain used in both studies as well as variations in apple
characteristics such as maturity and acid levels which may influence the
propensity for patulin production by P. expansum.
The maximum limit allowed for patulin in the U.S. is 50 ppb
(41). This study showed that 44% of the samples analyzed contain
patulin levels exceeding 50 ppb and the concentration of this mycotoxin
in some samples was approximately 1,000 fold higher than the allowed
limit. Table 1 shows the high levels of patulin produced by P. expansum
in McIntosh and Golden Supreme after 35 days of incubation, and also
for McIntosh after 59 days of incubation.
Considering the high concentrations of patulin that were found
in many of the samples incubated at 20.5ºC, we can conclude that the
presence of those contaminated apples among sound apples designated
for juice or cider production could result in patulin levels exceeding the
allowed limit established (50 ppb). In Table 1, from the 16 apples
analyzed, 7 (44%) indicated patulin concentrations from 6,000 to
50,000 ppb. If only one of these apples was processed with 100 and
1,000 sound apples respectively, the resulting juices would contain
patulin concentrations above the regulatory upper limit of 50 ppb.
Effective and meticulous culling of apples is essential to control
excessive levels of patulin in processed apple products.
Previous studies have suggested that patulin may diffuse to
healthy tissue and that cutting or trimming infected portions of the apple
flesh may be insufficient to reduce patulin levels to an acceptable level
in the fruit (22, 31, 38). Marín et al. (22) identified the importance of
160
adequate handling aimed at avoiding damaging the apples prior to
processing, since patulin concentrations in both portions (decayed and
sound) of the apples was dependent on the diameter of the damaged
areas. Moreover, bruises, skin breaks, and other physical damage within
these apples provide a point of entry for P. expansum (25). That damage
in the fruit is generally associated with insect injury, storm damage, and
handling procedures (19). Hassan (15) showed that the spoilage of
apples by fungi was accompanied with the production of mycotoxin and
that patulin represented the main toxin in the lesion and other parts of
brown rotten fruit.
Thus, considering this information and the FAO recommendation
(12), monitoring of fruit quality during reception is the first control
measure for patulin reduction. Apples of inferior quality (dropped or
damaged fruit but not rotted) should be processed immediately, as
extended storage or inadequate refrigeration during storage will lead to
mold growth and thus, the potential for patulin production. In a study by
Jackson et al. (19), patulin was not detected in cider from culled, treepicked apples stored 4 to 6 weeks at 0 to 2°C, but patulin was detected
(1 to 64 µg/kg) in stored, tree-picked, unculled fruit.
Our investigation also indicated some rotted samples incubated at
20.5ºC for 59 days (Golden Supreme), 80 days (McIntosh) and 93 days
(McIntosh and Fuji) contained no detectable amount of patulin. In these
samples, it was noted that in addition to mold growth, yeast spoilage
was also occurring, since there was a strong yeast odor associated with
these apples. Our first impression was that in these samples the patulin
produced might be inactivated by the yeast growth occurring in the
rotted apples. In order to confirm this fact, a juice with a known patulin
concentration, was inoculated with a strain of yeast and allowed to
ferment. The patulin concentration in the unfermented juice was found
to be 288 ppb but no patulin was detected in the sample that had
undergone yeast fermentation. It is likely that the yeast contained in the
rotted apples destroyed the patulin that was present in rotted apples. In
accordance with our results, Stinson et al. (35) also observed that patulin
levels were reduced by more than 99% from their original amounts
during alcoholic fermentation. However, the disappearance of patulin
during alcoholic fermentation does not necessarily eliminate the
potential health hazard incurred by its initial presence since it can be
converted to other degraded forms or compounds during alcohol
fermentation which have also shown to possess varying levels of
toxicity (35).
161
The results of this study indicate that storage temperature is an
important variable for the production of patulin in infected apples when
stored for extended time periods prior to processing. Similar findings
were reported by Sydenham et al. (37) where after 7 days of storage at
ambient temperature, the mean concentration of patulin was 90 µg/ml
and after 15 days and 33 days of storage, the mean accumulation of
patulin was 395 µg/ml and 2,445 µg/ml, respectively. Therefore, storage
temperature of apples prior to processing should be controlled and lack
of refrigerated storage will result in high levels of patulin in the finished
juice.
In summary, the culling process to remove damaged or rotted
fruit prior to storage and juice extraction is a critical step to reduce the
levels of patulin in finished processed apple products. Cool storage
(11°C) did not prevent patulin accumulation but yielded lower levels of
patulin than in juice made from apples stored at 20.5°C. Refrigerated
storage of fruit is an effective control practice to reduce patulin levels in
combination with effective culling practices prior to juice extraction.
However, over extended refrigerated storage can increase patulin levels
in apples. It was observed that apple varieties have differing
susceptibilities to P. expansum. Of the six varieties tested, Red
Delicious and Empire were less susceptible to P. expansum degradation
and consequently resulted in lower levels of patulin in their respective
juices, whereas, Golden Supreme and McIntosh were the most
susceptible and yielded high patulin levels at both storage temperatures.
Based on our findings, the presence of a single P. expansum rotted apple
in 1,000 sound apples can result in juice that exceeds the regulatory
action limit of 50 ppb. Therefore, the starting fruit quality, storage
conditions and meticulous culling practices are essential for controlling
patulin in finished apple products.
ACKNOWLEDMENTS
financial support of Beatriz de Cássia Martins Salomão for her Ph.D.
studies and the New York State Agricultural Experiment Station
(Geneva, NY) for funds to carry out this research. The authors would
also like to thank David Manns for the assistance with the manuscript
preparation.
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167
168
4.6 Development of a sampling plan at apple receiving step for
patulin control in concentrated apple juice
Foi verificado que o fungo P. expansum pode produzir patulina
mesmo à baixas temperaturas. Assim sendo, tornou-se importante
conhecer a carga de patulina presente nas frutas que chegam para o
processamento, tanto na época da safra (vindas direto do campo para a
fábrica) quanto na entressafra (após o armazenamento refrigerado).
Visando conhecer as condições reais de processamento, este trabalho
pretendeu ir a campo e buscar informações que pudessem ser usadas
como base para as indústrias processadores do suco. Desta forma, o
trabalho englobou o estudo da seleção dos lotes de maçãs durante o
recebimento, de forma a garantir que produto final estivesse dentro dos
padrões internacionais para níveis de patulina. Além disso, o processo
de desinfecção foi extensivamente estudado.
Research Paper
Development of a sampling plan at apple receiving step for patulin
control in concentrated apple juice
Beatriz C. M. Salomão1, Chalana Müller1, Hudson C. Amparo, Gláucia
M. F. Aragão1*
1
Brazil
*Phone: (55) 48 37219448, r. 245; Fax: (48) 48 3721 9687
Abstract
Patulin (PAT) is a mycotoxin that can be found in apple juice
produced from rotten apples contaminate by P. expansum. The aim of
this study was to assess strategies to reduce PAT by monitoring lots of
apples during reception and also determining the effect of wash
treatments. PAT was not detected in all lots analyzed throughout the
harvest season. However, 86% of lots from off-season yielded > 50 ppb
of PAT. During the receiving step, samples (50 apples) from each lot
were visually analyzed and the sampling plan indicated that lots should
be rejected if more than 8 rotten apples were found, because the risk
of > 50 ppb of PAT in the final product. Wash treatments reduced PAT
levels by 64 to 100%, but the toxin was transferred to the water.
170
However, the use of 25 ppm of sodium dichloroisocyanurate proved to
be efficient at reducing 100% of PAT in aqueous solution.
Keywords: apple juice concentrate, patulin, receiving step, wash step,
sampling plan.
1 Introduction
PAT is a mycotoxin produced primarily by Penicillium
expansum, the mold most commonly found in apples. Normally, fungal
growth results in a substantial fruit loss due to soft “blue mold rot”
decay. High levels of PAT can be found in apple juice produced from
P. expansum-rotten apples, increasing the risk for their consumers
(Drusch & Ragab, 2003; Moake, Padilla-Zakour & Worobo, 2005;
Sant’Ana, Rosenthal & Massaguer, 2008; Doores, 1983; Lai; Fuh &
Shih, 2000).
Human exposure to PAT via consumption of infected products
may result in severe toxicosis. According to Liu et al. (2003), PAT has
the ability to cause oxidative damage to the DNA in human cells, which
plays a role in mutagenesis and cancer initiation. In animals, PAT has
exhibited chronic effects including teratogenicity (Roll, Matthiaschk &
Korte, 1990), neurotoxigenicity (Hopkins, 1993) immunotoxicity
(Escoula, Thomsen, Bourdiol, Pipy, Peuriere & Roubinet, 1988;
Sharma, 1993), as well as acute intoxications (Sant’Ana et al., 2008;
Devaraj, Shanmugasundaram & Shanmugasundaram, 1986; McKinley,
Carlton & Boon, 1982; Gashlan, 2008).
Apples not approved by the rigid selection criteria for fresh fruit
consumption (around 15-30% of the apples produced in Brazil) are used
for juice processing and the majority (90%) of concentrated apple juice
produced in Brazil is exported, mainly for U.S. (Nogueira, Teixeira,
Demiate & Wosiacki, 2007). International regulatories agencies
advisory maximum level for apple juice is 50 ppb of PAT (Codex, 2003;
FDA, 2001a). Considering this toxin’s serious heath risk, particularly to
children whom have been shown to consume increased levels of apple
products (Moake et al., 2005), some U.S. juice importers may require
lower PAT levels which are based on the maximal daily intake of
0.4 µg/kg body weigh for PAT (WHO, 1998; FDA, 2001b) and also on
the Europe regulation (Europe Union, 2003) which has recommended a
maximum level of 25 ppb (for solid apple products) and 10 ppb (juice or
foods for infants). Therefore, this mycotoxin is the primary barrier for
apple juice exportation (Barkai-Golan & Paster, 2008) forcing exporters
171
to assess their techniques and strategies to successfully produce apple
juice concentrate below the control limits set for this toxin.
Surveys on the incidence of PAT in apple products have been
conducted in many countries like as Italy (Beretta, Gaiaschi, Galli &
Restani, 2000; Ritieni, 2003; Piemontese, Solfrizzo & Visconti, 2005),
the United Kingdom (Montimer, Parker, Shepherd & Gilbert, 1985),
Spain (Murillo-Arbizu, Amézqueta, González-Peñas & Cerain, 2009),
Turkey (Gökmen & Acar, 1998; Yurdun, Omurtag & Ersoy, 2001),
Brazil (Sylos & Rodriguez-Amaya, 1999), South Africa (Leggot &
Shephard, 2001), Belgium (Tangni, Theys, Mignolet, Maudoux,
Michelet & Laromdelle, 2003; Baert, De Meulenaer, Kamala, Kasase &
Devlieghere, 2006), Iran (Cheraghali, et al. 2005), Japan (Watanabe &
Shimizu, 2005), Argentina (Funes & Resnik, 2009), the USA (Trucksess
& Tang, 1999) and Australia (Burda, 1992). In all countries were
detected samples contaminated by PAT. In those studies, levels of this
mycotoxin in apple products have been found up to 1150 µg/l.
Several methods for reducing PAT levels in apple juice have been
studied, but its presence in those products commercialized throughout
the world indicates that, to a certain extent, this mycotoxin is stable
during the manufacturing process including heat treatments (Huebner et
al., 2000; Gökmen, Artık, Acar, Kahraman & Poyrazoglu, 2001; Lovett
& Peeler, 1973); Worobo & Splittstoesser, 2005; Harrison, 1989).
Levels of PAT in fruit products can be reduced by removing
decayed fruit or by trimming moldy portions of apples prior to
processing (Lovett, Thompson & Boutin, 1975; Sydenham, Vismer,
Marasas, Brown, Schlecter & Rheeder, 1997; Taniwaki, Hoenderboom,
De Almeida Vitali & Eiroa, 1992). Another recent study (Salomão,
Aragão, Churey, Padilla-Zakour & Worobo, 2009) showed that culling
of apples is essential for good juice quality, since high PAT amounts in
some apples varieties could result in a level greater than 50 ppb in the
finished product, even when only one contaminated apple occurs in
1,000 apples. The Food and Agriculture Organization of the United
Nations (FAO, 2003) and the United States Food and Drug
Administration (FDA, 2002) have recommended the adoption of the
Hazard Analysis and Critical Control Points system (HACCP) to
guarantee mycotoxin amounts under the regulatory action level. Sorting
to remove visibly moldy apples during the process is a recommended
critical control point (CCP) that will make a contribution towards
achieving acceptable levels of toxin in the final product (FAO, 2003).
However, this process is labor intensive, not automated and, sometimes,
the corrective action can imply in a rejection of the entire juice load.
172
Besides, this operation will increase costs forcing small-scale producers,
who cannot afford these losses, to the point that many may cease
operating (Moake et al., 2003). In addition, PAT can be detected in
visibly sound fruit (Jackson et al., 2003) and may be present even after
the rotten parts has been removed, since it can spread from damaged
areas into sound areas (Beretta et al., 2000; Taniwaki et al., 1992;
Rychlik & Schieberle, 2001; Barkai-Golan et al., 2008).
Although sorting or trimming moldy apples during the process
appears to be one of the most important methods for reducing PAT in
juice (Jackson et al., 2003), it is clear that successful PAT control will
most likely result, not from a single treatment, but from a combination
of control measures throughout the production process (Moake et al.,
2005). With this affirmation in mind, this work focuses in the
investigation of another measure not yet studied. The apple receiving
step should also be considered a very important point to minimize PAT
contamination into juices since the quality of the fruit will be assessed
before they enter the processing line and not after the production has
started. Post-production inspection of the fruit can lead to great
economic losses because, in this case, juice has been processed and may
be discarded. According to FAO (2003), lots with a high percentage of
damaged and rotten fruit should to be avoided, even with a sorting step,
because it will be extremely difficult to sort manually, and a high level
of PAT will likely be present in the finished product. However, even
now, there are no studies appointing measures for monitoring the quality
of lots at the receiving step. In addition, the real risk of PAT at this point
of production has not yet been investigated. Therefore, this investigation
was carried out to develop a sampling plan which provides a basis to be
used in juice manufacturing industries to yield a final product containing
a toxin level below the amount limited by regulatory agencies.
This study also was interested in elucidating the effect of wash
and sanitizer treatments on reducing PAT in fruits and water wash, since
few findings were published on this issue (Jackson et al., 2003;
Sydenham et al., 1997; Sydenham et al., 1995; Acar et al., 1998).
Furthermore, little is known about differences in PAT levels between
harvest season and off-season. The specific objectives of this study were
(i) to determine PAT levels in non-stored apples (harvest season) and
refrigerated stored apples (off-season); (ii) to determine a method for
sorting apple lots in the receiving step, in order to produce juice within
the PAT levels set by regulatory agencies (≤ 50 ppb) and (iii) to
determine the effectiveness of apple wash or sanitizer treatments are
effective in reducing PAT levels.
173
2 Material and Methods
2.1. Apple sorting lots study (Receiving step)
This study was carried out inside a concentrated apple juice
manufacturing facility located in the Brazil. A total of 23 lots of apples
were taken and analyzed for their PAT levels. Additionally, the
relationship between the number of rotten and sound apples was verified
to develop a sampling plan for sorting lots at the receiving step in order
to guarantee the action level of 50 ppb of PAT (Codex, 2003;
FDA, 2001a). Apples from Fuji and/or Gala varieties were supplied by
orchards (during harvest season, from March to May) and by a packing
house after a period of refrigerated storage (during off-season, from July
to October). The apple lot size was based on the weight of fruit
delivered in trucks (from 15,000 kg to 27,000 kg of apple). Considering
0.130 kg as the weight of a single apple, the lot size (in numbers of
apples) were established to be approximately 110,000 to 200,000 apples.
Each lot was analyzed under inspection by attributes and classified as
acceptable or unacceptable on basis of the number of nonconforming
apples. Nonconforming apples were defined as rotten apples with a
lesion size ≥ 4 cm. Initially, the sampling plan was based in both
Brazilian (NBR 5426) and American (MIL STD 105D) normative
reference (Costa, Epprecht &Carpinetti, 2005) and an acceptable quality
level (AQL) of 15% (based in the industry backgrounds) was chosen.
Considering the number of apples delivered in trucks, a representative
sample size should be 50 apples. From this sample, a lot acceptable for
further processing should contain up to 11 rotten apples. From each
sample the juice produced as explained in section 2.5.
2.2. Hypothetic lots study (Receiving step)
Some fruits were assembled to compose a sample (of 50 apples)
in order to determine the PAT levels in different combinations of sound
and rotten apples. These combinations are explained bellow.
(i) Considering a lesion size ≥ 4 cm, PAT levels were tested in samples
of 50 apples with the following combinations: 5 (rotten) +
45 (sound); 8 (rotten) + 42 (sound) (duplicate trial); 11 (rotten) +
39 (sound) (duplicate trial); 13 (rotten) + 37 (sound) and 16 (rotten)
+ 34 (sound). Each combination of 50 apples was pressed for juice as
174
explained in section 2.5.
(ii) Considering a lesion size < 4 cm, PAT levels were tested in samples
of 50 apples with the following combinations: 8 (rotten) +
42 (sound) (duplicate trial); 11 (rotten) + 39 (sound) (duplicate trial)
and 16 (rotten) + 34 (sound). Each combination of 50 apples was
produced as explained in section 2.5.
(iii) Fruits were assembled to compose a sample with rotten apples
highly contaminated with a heavy load of visible P. expansum
growth: 11 (rotten) + 39 (sound) (duplicate trial); 18 (rotten) +
32 (sound) and 32 (rotten) + 0 (sound) apples. From each sample (50
or 32 apples) the juice was produced as explained in section 2.5.
(iv) Three samples of sound apples without any visible mold damage
were assembled (50 apples by sample) and the juice was prepared as
explained in section 2.5.
2.3. Wash and sanitizer treatment study (Wash step)
(i) The first study was developed during juice processing at the wash
treatment step in order to evaluate the effectiveness of a highpressure water in removing the toxin. From each lot received, a
sample of 50 apples was taken before and after the wash step. The
50 apples sampled after and before treatment, were singly pressed
and the juice was extracted as explain in section 2.5.
(ii) Four samples (250 ml) of water used during wash treatment were
collected from the reservoir (which stores recycled water) for PAT
analysis. Samples were frozen at -18ºC until analysis.
Other two wash investigations were undertaken to analyze the
efficacy PAT reduction due to sanitizer treatments. One study was
conducted in aqueous solution and another one on the apple surface.
The sanitizer solutions were prepared from sodium
dichloroisocyanurate (Sumaveg®, Jonshon Diversey, São Paulo,
Brazil) and peracetic acid-based sanitizer (Tsunami 100®,
ECOLAB, São Paulo, Brazil). Concentrations of the sanitizing
solutions were confirmed using test strips for free chlorine (Test
Systems Inc., Rock Hill, SC, USA) and peracetic acid (Weber
Scientific, Chestertown, Md, USA).
(iii) This investigation evaluated the efficacy of the sanitizer in reducing
PAT in aqueous solution. In a 100 mL volumetric flask 1 ml of PAT
solution (called stock solution B – section 2.7) was added and the
remaining volume was supplemented with solutions of chlorine (0,
175
25, 50, 100 and 200 ppm) and peracetic acid (0, 80 and 100 ppm).
Immediately, each sample (duplicate trial for each sanitizing
concentration) was frozen at -18ºC and sent to an external laboratory
for PAT analyzes.
(iv) This investigation evaluated the efficacy of the sanitizer in reducing
PAT on apple surface. Fuji apples purchased from a local market
were submitted to the following procedures: first, fruits were
washed in tap water and subsequently in sterile distillated water then
dried using cheesecloth. Each apple was placed inside a laminar
flow hood with the stem up and 100 µl of synthetic PAT stock
solution (called stock solution A – section 2.7) was deposited on the
skin surface area around the stem. Inoculated apples were left to dry
for 1 h to allow for PAT fixation. The trials were performed in
duplicate. Each apple was placed in a sterile bag and 100 ml of
chlorine solution (0, 50, 100 and 200 ppm) were added. Each apple
in the bag was massaged for 30 s or 2 min by hand and then, the
solution was immediately transferred to a second recipient
containing 5 ml of 0.6% sodium thiosulfate in order to stop the
sanitizer action. The resulting solution was immediately frozen at 18ºC and sent to an external laboratory for PAT analysis.
2.4 Pressed apple juice analyses (Pressing step)
A parallel study was conducted in order to investigate PAT levels
in the pressed juice. According to the flow of the production process,
after wash treatment, the apples are ground and then, are conduced to
the stage of pressing. Therefore, during the pressing step, four samples
of the resulted juice were taken. After this stage the juice were conduced
to the subsequent steps, but no more samples were taken. Each sample
was treated as described in section 2.5.
2.5 Preparation of samples for patulin analysis
Each sample of apples were pressed though a centrifuge, and the
resulting juice was treated enzymatically (Pectinex®, YieldMASH,
Novozymes) for juice extraction and heated up to 80ºC to decontaminate
and avoid further fermentation and consequently PAT degradation.
Subsequently, each sample was filtered though a homemade filter and
the resultant product was immediately frozen at -18ºC and send for PAT
176
analysis through an external laboratory (The National Food Laboratory,
Dublin, CA, US). Samples from wash or sanitizer treatments were also
frozen at -18ºC and sent for PAT analysis to the same external
laboratory cited previously or to Laboratório de Análises – LABCAL,
Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, Brazil).
2.6 Patulin analysis
The methodology used was the official method adopted by
AOAC for apple juice (method 995.10) (FDA, 2001a, Brause,
Trucksess, Thomas & Page. 1996). Results were expressed as µg/l or
parts per billion (ppb). The limit of detection was 10 ppb.
2.7. Patulin standard solution
PAT was purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo,
USA). A stock standard solution was prepared by dissolving 3 mg of
pure crystalline PAT in 10 ml of distillated water (stock solution A).
Another stock solution B was prepared by diluting (10 times) the stock
solution A. The standard solutions were kept frozen at -18 C until used.
3. Results and Discussion
Table 1 shows PAT levels found in samples of apples taken from
23 different lots during harvest season (March to May) and off-harvest
season (July to October).
No PAT was found in any of the nine lots (lots from 1 to 9) tested
throughout the harvest season (Table 1). Therefore, there is no evidence
that juice produced during the harvest season may be contaminated with
this toxin. However, from the 14 lots of apples sampled in off-season
(lots 10 to 23), 12 lots (86%) yielded PAT levels greater than 50 ppb
(Table 1). Additionally, only during the off-season, blue moldy apples
showed up and one of those colonies was identified (in another study) as
P. expansum. Therefore, this mold showed its ability to grow during the
storage time under refrigeration (0ºC) and, subsequently, to produce the
toxin. As observed in other studies (Salomão et al., 2009; Jackson et al.,
2003), storage at low temperatures was not enough to avoid both blue
mold growth and PAT production. As observed throughout the test,
apples with visible P. expansum development produced substantial
levels of PAT. For example, during the sampling of the lot 23, severely
damaged apples showed evidence of mold development resulting in
177
550 ppb of toxin. The extended time of storage during off-season further
contributes in both P. expansum and mycotoxin production, since the
longer the storage of the apples, the greater the risk of increased PAT
content. Juice producers in the U.K. also observed dramatic rises of
PAT in the months just prior to the new harvest season where apples
have been stored for almost a year (Moake et al., 2005).
During the off-season, the packing house supplied the
manufacturing industry with stored fruits rejected by the fresh fruit
market. In several cases, it was observed that apples used for juicing
were not processed as soon as received in the factory and sometimes,
fruits waited to be processed (on the trucks or on the receiving
platforms) more than 5 days at room temperatures. In addition, usually
apples removed from cold storage in packing houses can wait around 3
to 4 days before transportation to a juicing facility (personal
information). This procedure probably leads to high PAT production.
Studies made in apples that were taken out from cold storage (Morales,
Marín, Centelles, Ramos & Sanchis, 2007) showed that PAT amounts
significantly increased on the 2nd day at 20ºC. Besides, the same
investigation confirmed that lesion size can increase fast during deck
storage, since they observed a significant expansion from 2 cm rot
damage to 5 cm by the 5th day. Therefore, is important to estimate the
capacity for juice processing and also the quality of apples entering in
the manufacturing plant in order to program or avoid deck storage and
minimize PAT accumulation, since rapid mold development occurs
when fruits are transferred to a warm environment (Morales, Marín,
Rovira, Ramos & Sanchis, 2006). Ideally, apples should be maintained
under refrigeration (<10ºC) throughout storage at the manufacturing
industry until processed. When refrigerated storage is not possible, then
time must be minimized for a maximum of 48 hours of storage at
ambient temperature (FAO, 2003).
The test to evaluate PAT amounts in the three samples of 50
sound apples (without any visible mold damage) showed the following
results: 36 ppb, 15 ppb and nondeductible level. PAT production is
common in molded fruit. However, findings of this investigation
showed, as described by Jackson et al. (2003), that PAT can also be
detected in visually sound fruit.
Table 2 shows PAT levels in samples (50 apples) assembled with
different combinations of sound and rotten apples with lesions < 4 cm,
≥ 4 cm (i.e. Fig. 1a; 1b) or combinations of sound apples and moldy
apples with a visibly high load of P. expansum development (i.e.
Fig. 1c; 1d).
178
This study showed that fruits with lesions < 4 cm yielded less
than 50 ppb of PAT even when 11 or 16 rotten apples were pressed with
more 39 or 34 sound fruits, respectively (Table 2). These findings
indicated that fruits with less than a 4 cm lesion should not be
considered rotten, unless they show visible development of “blue mold
rot” (i.e. Fig. 1e). Similar findings has been reported showing that no
PAT was produced during a short cold storage (6 weeks) in decayed
apples with lesions smaller than 3.5 cm (Morales et al., 2007) and that
PAT is primarily produced when apples were further kept at room
temperature. The same investigation observed that apples with initial
lesion size of 4 cm accumulated significantly greater amounts of PAT
(368 ppb) than the rest with lower lesion size.
Amounts of PAT in apples were correlated with the extent of
rotten areas, since very high levels of this toxin (greater than 1,700 ppb)
were detected when rotten apples with a visibly high load of
P. expansum were processed together with sound apples (Table 2). It
suggests that the mold itself has both a wide ability to develop very well
in this substrate (apple) and produce secondary metabolites as described
by Barkai-Golan et al. (2008).
Rotten apples with lesions bigger than 4 cm yield less than
50 ppb of PAT when 5 or 8 rotten apples were processed along with 45
or 42 sound apples, respectively (Table 2). However, when 13 or 16
rotten apples were pressed together with 37 or 34 sound apples,
respectively, the PAT content was higher than the allowed concentration
(222 and 110 ppb, respectively). Table 2 shows that a combination of
11 rotten + 39 sound apples yield 269 ppb in the first trial but the toxin
was undetected in the second one. Therefore, if 11 rotten apples were
found in a total of 50 apples, probably the lot evaluated will result in a
risk of unacceptable levels of toxin in the final juice.
Considering apples with lesions greater than 4 cm, results showed
that 8 rotten + 42 sound apples may results in a safe lot producing juice
most likely under the action toxin level (Table 2). Therefore, lots should
be accepted if 8 or less rotten apples are found in a representative
sample of 50 apples. However, if 9 or more rotten apples are found in 50
apples, the lot should be rejected. In order to improve the confidence of
this sampling plan, a duplicate trial is suggested. Then, if results found
in the first and second trials lead to the same conclusion, it will be the
final decision. However, if the first and second trials show different
conclusions, it will be necessary to reanalyze (triplicate trial) the lot to
determine the final conclusion. In case of a triplicate sample, the
decision should be made on the similar duplicate result. This sampling
179
plan is just necessary in the off-season since there is no evidence of PAT
in the harvest season. Here, the risk of toxin contamination can be
minimized by culling apples during the wash step and also by
monitoring the accuracy of pasteurization treatment step in order to
destroy P. expansum spores.
Table 3 shows the effect of wash treatments (using high-pressure
water) in decreasing PAT levels from fruits
The wash treatment step could efficiently decrease PAT content
from 64% up to 100% from its initial concentration (Table 3) since the
soft damaged area was removed by spraying high-pressure water against
apples. Sydenham et al. (1995) found that PAT levels in cider decreased
from 920 to 190 ppb after a wash treatment step (reduction of
approximately 80%). Washing with high-pressure water has been shown
to reduce PAT levels within the apple juice by 21% to 54% (Acar et al.,
1998). Another study observed that while non-processed fruit reached
90, 395 and 2245 ppb of PAT after 5, 15 and 33 days of deck-storage
(room temperature), values decreased to 75, 100 and 695 ppb,
respectively, after the washing stage (Sydenham et al., 1997). All PAT
levels present in the fruit could not be removed in most of the
experiments probably because in apples this toxin can diffuse from
rotten core areas into sound areas up to 1 to 2 cm, so that PAT can be
present in some degree even after the rotten area has been removed
(Beretta et al., 2000; Taniwaki et al., 1992; Rychlik & Schieberle,
2001). Figure 1f clearly shows the difference between fruits after and
before wash step. On the other hand, wash treatment may also serve as a
source of water contamination. Results showed patulin contamination in
wash water was from 24 ppb to very high levels of 353 and 444 ppb
(Table 4). During wash treatment, PAT present in the rotten parts was
leached by pressure spray and was transferred to the water phase.
Therefore, the cyclic system of water can provide a source of PAT and
also fungal inoculum in poorly sanitized water. FAO (2003) stated that
PAT levels will be reduced at this step, but spores will be suspended in
the water and will increase the risk of mould growth during bulk
storage.
A parallel study was conducted in order to investigate PAT levels
in the extracted juice during the pressing step. Although after this stage,
the extracted juice is conduced to the subsequent steps, only were
analyzed samples on the pressing stage. The results showed levels of
30 ppb (8:30 am),
29 ppb (9:30 am),
51 ppb (10:15 am)
and
22 ppb (11:30 am) of PAT, respectively. The presence of this toxin in
the pressed juice indicated that low quality raw material was used.
180
Besides, the results stated that the juice at the beginning of process was
contaminated reaching 51 ppb in one sample. Then, subsequent stages
should contribute to PAT reduction in order to the final product not
exceed the maximum allowed level established for apple products
intended for children (10 ppb).
Table 5 shows the first report of an experiment to evaluate the
efficacy of direct contact between aqueous sanitizer solutions and PAT.
Findings showed that, unlike the peracetic acid, all sodium
dichloroisocyanurate solution tested (25, 50, 100 and 200 ppm) were
efficient to completely destroy the toxin present. Therefore, the use of
an organic chlorine solution at 25 ppm can be an alternative for
drastically reducing PAT from the water used for handling and washing
apples. Furthermore, chlorination of water may be a good option not
only to destroy PAT, but also to control Penicillium expansum growth.
An investigation showed that acidified sodium hypochlorite at
50 ppm/30s resulted in 2.5 decimal reductions of the P. expansum
spores on Fuji apple surfaces (Salomão, Aragão, Churey & Worobo,
2008). Another study (not yet published) also proved that sodium
dichloroisocyanurate at 25 ppm/6 min reduced more than 6 cycles of its
spores in aqueous solution.
The test to verify the efficacy of sanitizer solutions in reducing
PAT adhered on the apple surface showed that sodium
dichloroisocyanurate was able to reduce PAT by 47.5% to 74.8%
(Table 6). In this test, the time of contact between sanitizers and PAT
was short (30 s and 2 min), most likely causing less reduction than the
test in aqueous solution.
Another study (Jackson et al., 2003) tested the efficacy of apple
wash treatments using 100 and 200 ppm of chlorine. The authors
observed a reduction of PAT levels in the cider from 10% to 100%,
depending on the initial PAT levels and the type of wash solution used.
4. Conclusions
In harvest season P. expansum was not visually found in apples,
since the mold did not have enough time either to grow or produce PAT.
However, stored apples from the off-season showed visible blue mold
contamination which may bring a risk of PAT presence above
internationally established safe limits. This results in a sanitary barrier
for apple juice exportation.
181
Results showed that only apples with lesions greater than 4 cm or
those with visible P. expansum development should be considered
rotten. In the off-season, the receiving step should be monitored to avoid
accepting lots meant for juice processing that contain a high proportion
of rotten fruit. A sampling plan, developed in this investigation, suggest
that a risk of PAT levels rising above 50 ppb will exist if more than 8
rotten apples (lesions ≥ 4 cm) are found in a sample of 50 apples. A
sampling plan of lots in the receiving step will also help processors to
assess the quality of fruits and to adjust deck storage accordingly, with
the aim to minimize PAT accumulation.
During wash treatments, the high pressurized water removed the
soft damaged areas and reduced their PAT amount by 64 to 100%.
However, this process transferred PAT to the water, which probably
implies a risk of cross-contamination. Subsequently, this study suggests
the use of 25 ppm chlorine in the water destined for apple handling as an
alternative to reduce both PAT and P. expansum spores (Salomão et al.,
2008). However, the use of organic chlorine compounds, like as sodium
dichloroisocyanurate, is recommended since they are less susceptible to
inactivation by organic matter (Russel, Hugo & Aylife, 1992).
As a conclusion, control measures in the first step of production
(receiving step) may provide one of the most important sources for
effective PAT reduction in the final product because, once rotten apples
are present after processing has been started, it will be extremely
difficult to sort them manually, and will likely be arduous to attain the
acceptable level of PAT in the finished product.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge the Capes Foundation
(Brazil) and CNPQ (National Counsel of Technological and Scientific
Development, Brazil) for Beatriz C. M. Salomão and Chalana Müller
scholarships, respectively. Besides, we would like to thank David C.
Manns for assistance with the manuscript preparation.
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a
b
c
c
d
e
f
Figure 1. Pictures from apples obtained during the study and their different
kinds of lesions. (a) apple with a lesion < 4 cm (not considered rotten apple); (b)
lesion > 4 cm (considered rotten apple); (c ; d) lesion showing a heavy load of
visible P. expansum damage (leading to a high risk of PAT contamination); (e)
small lesion but with mold development (considered rotten fruit); (f) apple
before wash treatment showing rot damage (left) and apple after wash treatment
with high-pressure water spray showing removal of rot damage area (right).
f
188
Table 1 - PAT concentration (ppb) in apples sampled from lots taken
during the harvest season (March to May) and off-season (July to
October) and the relationship between rotten and sound apples in each
lot
March
April
PAT concentration (ppb)
May
July
August September
Lot 1
Nd
(11 rotten)*
Lot 4
Nd
(20 rotten)*
Lot 7
Nd
(11
(16 rotten)*
(26 rotten+74
(16 rotten)*
(16 rotten)*
Gala***
Fuji
rotten)*
Fuji
sound)**
Fuji
Fuji
Lot 17
71
Lot 20
25
Lot 10
34
Fuji
Lot 12
67
Lot 16
51
October
Lot 19
226
Fuji
Lot 2
Nd
Lot 5
Nd
Lot 8
Nd
(11
(18 rotten)*
(23 rotten)*
(16 rotten)*
(17 rotten)*
Gala
rotten+74
rotten)*
Gala
Fuji
Fuji
Fuji
sound)**
Fuji
-
Lot 14
101
Lot 18
73
Lot 21
233
(9 rotten)*
(26
Lot 11
387
Lot 13
78
Fuji
Lot 3
Nd
Lot 6
Nd
Lot 9
Nd
(10 rotten)*
(29 rotten)*
(8 rotten)*
(17 rotten+83
(18 rotten)*
(16 rotten)*
Gala
Fuji
Fuji
sound)**
Fuji
Fuji
-
Lot 22
120
Fuji/Gala
-
-
-
-
Lot 15
104
(11 rotten)*
(16 rotten)*
Fuji
-
-
-
-
Fuji
-
Lot 23
550
(16 rotten)*
Gala
Nd: Non detectable level of PAT (detection limit = 10 ppb).
*Relationship between rotten and sound apples in a representative sample of 50 apples.
**From 12 to 15 rotten apples, the lot should be recounted (total sample = 100 apples) and
more than 16 rotten apples leaded to a lot rejection (according to the regulation which this plan
was based).
***Apple variety analyzed.
189
Table 2 - PAT concentrations (ppb) from hypothetic combinations of
sound and rotten apples with lesion sizes < 4 cm, ≥ 4 cm or lesions with
a high load of visible P. expansum damage
Number of
rotten aples
PAT
in 50
(ppb)
apples
Size lesion < 4 cm
8a
8b
11a
11b
16a
Number of
rotten aples
in 50 apples
Number of
rotten
PAT
aples in 50
(ppb)
apples
Lesion with a high load
mold development*
11
1741
11
1866
18
2673
32
2121
PAT
(ppb)
Size lesion ≥ 4 cm
5a
8a
8b
11a
11b
13a
16a
Nd
Nd
Nd
Nd
17
27
20
Nd
269
Nd
222
110
a: Samples of Fuji variety taken from Lot 19.
b: Sample of Fuji variety taken from Lot 22.
*Samples of Gala variety collected directly from a packing house (4 months of storage) in June
(off-harvest season).
Table 3 - Effects of wash treatments (high-pressure water) on PAT
levels. Samples have been taken after and before wash step
Month
Variety
Before
wash
After wash
PAT
Reduction
May
Fuji
15
PAT (ppb)
July
September
Gala Fuji
Fuji
Fuji
48
3772*
71
73
Fuji
233
October
Fuji
Gala
120
550
Nd
17
361
14
22
12
Nd
31
100.0
64.6
90.4
80.3
69.8
94.8
100.0
94.4
%
%
%
%
%
%
%
%
*Test made only with rotten apples
190
Table 4 - PAT levels of water used during wash treatment
Water Sample*
Transportation water**
Transportation water
Transportation water
Wash water***
Wash water
Time (h)***
8:20 am
9: 30 am
10:30 am
9:00 am
10:30 am
PAT (ppb)
444
28
353
36
24
*Samples were collected from the reservoir which stores recycled water.
**Water used to move apple to the next wash step and also to remove gross filth.
***Water pressured against apple during wash treatment (collected from the reservoir which
stores recycled water).
Ps. This production occurred from 8:00 to 11:30 am, during the off-season (October).
Table 5 - Effect of sanitizing aqueous solutions on PAT reduction.
Chlorine solution (sodium dicloroisocyanurate) and peracetic acid (PA)
solution
Chlorine
(ppm)
25
25
50
50
100
100
200
200
PAT reduction after
Chlorine treatment (%)
100.0 (1)
100.0 (2)
100.0 (1)
100.0 (2)
100.0 (1)
100.0 (2)
100.0 (1)
100.0 (2)
(1)first trial of the same test.
(2)second trial of same test.
PA (ppm)
80 PA (1)
80 PA (2)
100 PA (1)
100 PA (2)
PAT reduction after
PA treatment (%)
61.1
56.6
14.0
41.9
191
Table 6 - Effect of chlorine solutions on PAT reduction from the apple
surface after 30 s or 2 min of contact. Chlorine solution (sodium
dicloroisocyanurate)
Chlorine (ppm)
Time of contact
50
50
50
50
100
100
200
200
200
200
30 s (1)
30 s (2)
2 min (1)
2 min (2)
2 min (1)
2 min (2)
30 s (1)
30 s (2)
2 min (1)
2 min (2)
PAT reduction after chlorine
treatment (%)
62.6
66.4
73.3
73.4
47.5
51.6
74.8
71.8
73.3
57.3
(1)first trial of the same test.
(2)second trial of same test.
PS.A duplicate trial test verified that sodium thiosulfate 0.6% (used to neutralize sanitizers)
had any influence in the PAT reductions observed.
CAPÍTULO 5
CONCLUSÕES
Através deste estudo, que teve como objetivo geral detectar
patulina em maçãs e avaliar do processo de lavagem/desinfecção das
frutas destinadas à produção de suco foi possível tirar as seguintes
conclusões:
Três micro-organismos foram considerados os mais relevantes no
processo produtivo de suco concentrado de maçã: P. expansum,
devido à sua alta incidência e capacidade de produzir patulina em
maçãs. B. fulva que demonstou alta termorresistência por sobreviver
aos tratamentos térmicos aplicados e por ser relacionado à produção
de patulina no suco de maçã. A. acidoterrestris por possuir esporos
extremamente termorresistentes e pela alta capacidade deteriorante
em produzir off-flavors no produto final durante a estocagem;
Os testes com sanitizantes mostraram que os esporos de
A. acidoterrestris e B. fulva não serão eficazmente eliminados pela
desinfecção usando dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido
peracético, dentro das concentrações máximas permitidas. Além
disso, nem mesmo o aumento da temperatura de 25ºC para 37ºC
melhorou a eficácia dos sanitizantes na redução destes microorganismos.
O sanitizante dicloro, mesmo quando utilizado em baixas
concentrações de 25 ppm, mostrou ser eficaz em causar mais de 6
reduções decimais nos esporos de P. expansum após 6 minutos de
contato. Entretanto, o sanitizante à base de ácido peracético
Tsunami 100 não deve ser considerado substituto para compostos
clorados, pois este não foi capaz de eliminar sequer os esporos de
P. expansum, dentro das concentrações recomendadas (tanto na
superfície das maçãs quanto em solução aquosa);
O sanitizante à base de ácido peracético Vortexx possui na sua
formulação o ácido octanóico (agente anti-fúngico) e mostrou-se
mais eficaz em reduzir esporos de P. expansum que Tsunami 100.
Entretanto, Vortexx é menos eficaz que o hipoclorito de sódio
acificado (pH 6,5) na redução destes esporos.
Nos testes utilizando hipoclorito de sódio, foi verificado que a
diminuição do pH para 6,5 melhorou a eficácia da sanitização em
relação às soluções não acidificadas;
193
A inativação de P. expansum causada por dicloro entre 25 e 75 ppm
apresentou um comportamento que foi bem descrito pelo modelo de
Weibull;
O processo de pasteurização branda de 71ºC/6 s muitas vezes
aplicado ao suco de maçã é suficiente para causar 6 reduções
decimais na população de esporos de P. expansum, sendo que o
clássico modelo de Bigelow pode ser utilizado para descrever a
inativação térmica destes esporos entre 50ºC e 60ºC;
P. expansum pode produzir patulina tanto em maçãs mantidas à
temperatura de 20,5ºC quanto nas mantidas a 11ºC.
Na análise de produção de patulina após crescimento de P.
expansum em diferentes variedades de maçãs, Red Delicious e
Empire mostraram que não são susceptíveis ao desenvolvimento do
fungo ou produção de patulina. Golden Supreme e McIntosh
mostraram ser as variedades mais susceptíveis ao desenvolvimento
de podridão por P. expansum e produção de patulina;
A produção de patulina é concentrada no período da entressafra.
Durante a safra, não foi verificada presença de patulina;
Os lotes de maçã devem ser amostrados na etapa do recebimento. O
plano de amostragem proposto sugeriu a retirada de 50 frutas/lote,
sendo que deve-se rejeitar o lote que apresente mais que 8 maçãs
podres, pois existe o risco de produção de patulina acima de 50 ppb
no produto final. Devem ser consideradas podres somente as frutas
com lesões maiores que 4 cm ou com visível desenvolvimento de
“mofo azul” (P. expansum);
Na etapa de lavagem das frutas, a água pressurizada mostrou ser
eficiente para remover total ou parcialmente os níveis de patulina
das frutas. Entretanto, o processo transferiu patulina para a fase
aquosa;
Dicloroisocianurato de sódio pode ser utilizado para reduzir níveis
de patulina na fase aquosa. Nas concentrações entre 25-200 ppm,
dicloro foi capaz de destruir 100% da patulina presente na água. Na
fruta, a redução de patulina foi de 47,8-74,8%. O sanitizante à base
de ácido peracético (Tsunami 100®) não apresentou boa eficácia na
redução de patulina da água.
Este trabalho traz importantes contribuições para a indústria
processadora de suco de maçã, fornecendo dados que servirão de base
para que seja produzido suco dentro das normas internacionais de
concentração de patulina, que além de ser uma toxina nociva à saúde do
consumir, representa uma barreira sanitária na comercialização deste
produto.
CAPÍTULO 6
REFERÊNCIAS
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ANEXOS
224
ANEXO I
1. Imagens de Penicillium expansum CCT 7549 nos meios de
identificação
a
b
c
Imagem 1. Colônias de Penicillium expansum CCT 7549 cultivadas durante 7
dias a 25ºC: (a) Cultivo em CYA; (b) Cultivo em MEA e (c) Culivo em G25N.
2. Imagens da deterioração das maçãs causada pelo “fungo azul”
(P. expansum)
Imagem 2. Maçãs apodrecidas apresentando visível crescimento fúngico
(fungo azul).
225
3. Imagem de esporos de A. acidoterrestris CCT 7548
Imagem 3. A. acidoterrestris CCT 7548 (coloração Gram).
Aumento de 1000X.
226
4. Laudo de identificação das cepas de P. expansum e
A. acidoterrestris isolados do processo produtivo de suco de maçã
concentrado
227
Relatório Técnico final
Serviço: Identificação de
microrganismos
Interessado: Universidade Federal de
Santa Catarina – Laboratório Engebio
Serviço No.
080139-1
080139-2
080139-3
Relatório: 080139rf
Data da chegada da
amostra: 23/01/2009
Descrição da Amostra/Serviço
Tubo com a identificação 1 TEAly (Taxonomia
Molecular)
Tubo com a identificação 1 AUFAly (Taxonomia
Molecular)
Tubo com a identificação 2M – suspeita de
Penicillium (Taxonomia Convencional)
1. Objetivos:
Identificação de microrganismos por Taxonomia Clássica e Molecular.
2. Metodologia utilizada:
- Taxonomia clássica convencional.
A identificação é baseada na análise comparativa de características
diferenciais de morfologia, fisiologia e metabolismo bioquímico da
linhagem teste com dados citados na literatura de referência.
- Taxonomia Molecular
Identificação de bactéria, utilizando sequenciamento e análise
filogenética de fragmentos de gene RNAr 16S:
1. Amplificação do RNAr 16S pela metodologia de PCR, utilizando
como molde o DNA genômico extraído diretamente da amostra. Os
primers (oligonucleotídeos sintéticos) utilizados para a reação de PCR
foram p27f e p1401r.
2. Sequenciamento em seqüenciador automático MegaBACE 1000 (GE
Healthcare). Os primers utilizados foram p10f, 765f, 782r, p1100r.
3. Análise filogenética: as seqüências parciais de RNAr 16S obtidas
com os diferentes primers foram montadas em um contig (seqüência
única combinando os diferentes fragmentos obtidos) e comparadas com
as seqüências de organismos representados nas bases de dados do
Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
e
do
RDP
(http://rdp.cme.msu.edu/). Foram selecionadas seqüências de
228
organismos relacionados ao organismo desconhecido para a realização
das análises filogenéticas. O programa utilizado para alinhamento foi
CLUSTAL X (Thompson et al. 1997) e para análise filogenética MEGA
4.0 (Tamura et al.,2007). A matriz distância evolutiva foi calculada com
o modelo de Kimura (1980) e a construção da árvore filogenética foi
feita pelo método de Neighbor-Joining (Saitou&Nei, 1987), com valores
de bootstrap calculados a partir de 1000 re-amostragens, utilizando o
software incluído no programa MEGA 4.0.
3. Resultados da identificação
Amostra
Serviço
No.
080139-1 Tubo com a identificação
1 TEAly
080139-2
Tubo com a identificação
1 AUFAly
080139-3
Tubo com a identificação
2M – suspeita de
Penicillium
Resultado
Alicyclobacillus
acidoterrestris (Deinhard et
al. 1988) Wisotzkey et al.
1992 sinônimo Bacillus
acidoterrestris
Alicyclobacillus
acidoterrestris (Deinhard et
al. 1988) Wisotzkey et al.
1992 sinônimo Bacillus
acidoterrestris
Penicillium expansum Link
ex Gray 1821
4. Comentários Análise Molecular:
As seqüências parciais do gene RNA ribossomal 16S das amostras
OS080139-1 e 2 apresentaram entre 98 e 99% de similaridade com as
seqüências do gene RNA ribossomal 16S da linhagem tipo
Alicyclobacillus acidoterrestris e outras linhagens desta espécie.
Porcentagens de similaridades mais baixas, entre 95 e 97% foram
observadas com as especies Alicyclobacillus fastidiosus, A. hesperidium
e A. sacchari contidas nas bases de dados. A análise filogenética
agrupou as amostras com a linhagem tipo Alicyclobacillus
acidoterrestris, formando um agrupamento coeso, com o alto valor de
bootstrap (99%) confirmando a identificação das amostras .
229
Referências:
KIMURA, M. 1980. A simple model for estimating evolutionary
rates of base substitutions through comparative studies of
nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16: 111-120
MAIDAK, B.L.; LILBURN, T.G.; PARKER, C.T. Jr.; SAXMAN, P.R.;
FARRIS, R.J.; GARRITY, G.M.; OLSEN, G.J.; SCHMIDT, T.M. &
TIEDJE, J.M. 2001 The RDP-II (Ribosomal Database Project).
Nucleic Acids Res. 29(1):173-174.
SAITOU, N. & NEI, M. 1987. The neighbor-joining method: a new
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TAMURA,K.; DUDLEY J.; NEI, M & KUMAR S. 2007. MEGA 4:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software
version 4.0.Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599
THOMPSON, J. D., HIGGINS, D. G., GIBSON, T. J., et al. 1997. The
Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple
sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleid Acids
Research 24, 4876-4882
WISOTZKEY, J.D.; JURTSHUK, P; FOX, G.E.; DEINHARD, G.;
PORALLO, K. 1992 Comparative sequencesAnalyses on the 16S
rRNA (rDNA) of Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris,
and Bacillus cycloheptanicus and proposal for creation of a new
genus, Alicyclobacillus gen. Nov. Int. J Syst Bacteriol. 42.263-269
DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
Zellkulturen disponivel em: http://www.dsmz.de/
und
PITT, J.I. The genus Penicillium and its teleomorphic states
Eupenicillium and Taralomyces. London: Academic Press, 1979.
634p.
Observações:
As análises de identificação por taxonomia molecular foram realizadas
pela Dra. Valéria Maia Merzel e Dra. Fabiana Fantinatti Garboggini, nos
230
laboratórios do Centro Pluridisciplinar Pesquisas Químicas, Biológicas e
Agrícolas – Universidade Estadual de Campinas.
As análises de identificação de fungo filamentoso, foram realizadas nos
laboratórios da UNESP – Campus de Rio Claro, pela Dra. Derlene Attili
de Angelis.Os resultados têm significação restrita e se aplicam somente
à amostra recebida para análise. As culturas serão mantidas em nosso
laboratório pelo período de um mês a partir desta data. Após este
período elas serão descartadas.
Data
17/abr/2009
Emitido por Aline de Souza Lopes
Identificações / Testes e ensaios
FICHA DE IDENTIFICAÇÃO - No. SERVIÇO: 080139-3
Resultado da identificação: Penicillium expansum Link ex Gray 1821
a
b
c.
Legenda: a. Ausência de crescimento em CYA, a 37°C, após 7 dias.
Microscopia óptica: b. e c. conidióforos e conídios em CYA e
MEA a 25oC (x 400).
Descrição: A cultura observada em CYA a 37°C não cresceu (uma das
características da espécie). A 25oC apresentou diâmetro médio de 25-30
mm; micélio branco, superfície aveludada a flocosa, formando corêmio,
esporulação moderada e reverso com pigmentação caramelo. Em MEA a
25oC o diâmetro médio foi 35,0 mm. Conidióforos de parede lisa
originando penicílios na maioria triverticilados, e biverticilados. Métulas
de 14,5-19,0µm comprimento, e fiálides medindo entre 10,0–14,0 µm de
comprimento. Conídios subglobosos a elipsoidais, parede lisa, 4,5-5,0
µm de diâmetro. Coloração empregada para microscopia: lactofenol azul
de algodão.
231
232
ANEXO II
Curva de ativação dos esporos de Byssochlamys fulva CCT 0056
Log esporos B.fulva/mL
4
3
2
0
5
10
15
Tempo (min)
Gráfico 1. Curva de ativação dos esporos de Byssochlamys fulva CCT
0056.
233
ANEXO III
1. Meios de Cultura e reagentes utilizados
1) Água Peptonada 0,1%
Peptona Bacteriológica………………………………………...........0,1g
Água destilada……………………………………………………100 mL
Modo de preparar: pesar a peptona, dissolve-la com água destilada e
autoclavar a 121°C/15min.
2) Corante Lactofucsina 0,1%
Ácido Fucsínico ……………………………………………........…0,1g
Ácido Láctico 85% de pureza…………………………………....100mL
Modo de preparar: dissolver o ácido fucsínico em ácido láctico com
grau de pureza 85%. Este corante é utilizado para a verificação das
estruturas fúngicas e não há necessidade de esterilização.
3) Concentrado Czapek
NaNO3…………………………………………………………....…30g
KCL…………………………………………………………………..5g
MgSO4.7H2O…………………………………………………………5g
FeSO4.7H2O………………………....……………………………...0,1g
Água……………………………………………………………...100mL
Modo de preparar: pesar todos os reagentes, homogeneizar bem e
guardar em recipiente tampado dentro da geladeira durante tempo
indefinido sem necessidade de esterilização. O precipitado de Fe (OH)3
que se forma com o tempo pode ser ressuspendido pela agitação antes
do uso.
4) Czapek Ágar extrato de Levedura (CYA)
K2HPO4……………………………………………...…………….1,0 g
Czapek concentrado…………………………………..……..……10 mL
Extrato de levedura ...........……………........…………………….….5 g
Sacarose………………...………………………………….....…….30 g
Ágar ………………………………………………………….........15 g
Água destilada…………………………..……………….......……1 litro
Modo de preparar: pesar todos os reagentes, acrescentar água e
5) Ágar extrato de Levedura com 20% de sacarose (CY20S)
K2HPO4…………...……………………………………………….1,0 g
234
Czapek concentrado……………………………………………....10 mL
Extrato de levedura ...........……………………....……………….….5 g
Sacarose…………………………………………...………...…….200 g
Ágar ……………..……………………………………………....... 15 g
Água destilada………………………………………...……………1 litro
6) Ágar Nitrato de Glicerol 25% (G25N)
K2HPO4………………………………………….…………......…0,75 g
Czapek concentrado………….......……………………………....7,5 mL
Extrato de levedura em pó ………………………………………...3,7 g
Glicerol (Grau analítico)………………………………………......250 g
Ágar ……………...……………………………........……………...12 g
Água destilada………....………………………….......…….......750 mL
7) Ágar Extrato de Malte (MEA)
Agar....................................................................................................20 g
Extrato de Malte.............………………………………...…….........20 g
Peptona……………………………………………………....……..1,0 g
Glicose………………………………………………………...........20 g
Água destilada……………………………………………..……...1 litro
8) Ágar Batata Dextrose (PDA) (Biolife e Criterion)
Ágar Batata Dextrose ……………………………...……………...3,9 g
Água destilada……………………………………......………...100 mL
9) PDA com cloranfenicol e concentração dupla de Ágar
Ágar Batata Dextrose ……………………………...………………3,9 g
Ágar………………………………………………………………...1,5 g
Cloranfenicol………………..…………………………………......0,4 g
Água destilada…………………………………………………...100 mL
autoclavar a 121°C/15min. Antes de utilizar adicionar ácido tartárico
10% para ajustar o pH a 3,5.
235
10) Solução de Ácido Tartárico 10%
Ácido Tartárico ……………………………………………………10 g
Água destilada..………………………………………………….100 mL
Modo de preparar: pesar o reagente, adicionar água destilada e
11) Solução de Rosa de Bengala 5%
Rosa de bengala …………………………………………………...0,5 g
Água destilada........………………………………………………....10 g
Modo de preparar: pesar o reagente, adicionar água e autoclavar a
121°C/10min. Manter sob refrigeração coberto com papel alumínio para
que o sal não seja oxidado na presença da luz.
12) Tiossulfato de sódio (0,6%)
Tiossulfato de sódio.........…………………………………..............0,6 g
Água destilada …………………………………………….....…..100 mL
Modo de preparar: pesar o reagente, adicionar água destilada e
autoclavar a 121°C/15mim.
13) Solução de leite desnatado 5%
Leite Desnatado em pó……………………………………………....5 g
Água destilada…………………………………………...….......100 mL
Modo de preparar: pesar o leite em pó, adicionar água destilada e
autoclavar a 121°C/10mim.
14) Lactofenol azul de algodão (Cotton Blue)
Fenol (cristais)...................................................................................20 g
Ácido Láctico..................................................................................20 mL
Glicerol............................................................................................40 mL
Água................................................................................................20 mL
Metil blue.........................................................................................0,05%
15) Meio Alicycloterrestris acidocaldarius (AAM) suplementado
(Meio de esporulação)
Componentes da solução (1):
Extrato de levedura...............................................................................1 g
(NH4)2SO4.........................................................................................0,2 g
CaCl2 .............................................................................................0,189 g
MgSO4.7H2O……………………………………………...………..0,5 g
Glicose……………………………………………………...........…...1 g
KH2PO4………………………………………...…………………...0,6 g
236
MnCl2.4H2O…………………………….......………………………0,5g
Água destilada...............................................................................500 mL
Modo de preparar: pesar os reagentes, adicionar água destilada e fazer
ajuste para pH 4,0 com H2SO4 1N e autoclavar separadamente da
solução 2 a 121°C/15min.
Ágar.....................................................................................................15 g
Água destilada................................................................................500 mL
Modo de preparar: pesar o reagente e esterilizar separadamente da
solução 1 a 121°C/15min. Misturar assepticamente a solução 1 com a
solução 2 na proporção somente no momento de uso.
16) Caldo Alicycloterrestris acidocaldarius (AAM) (caldo de
esporulação)
(NH4)2SO4.........................................................................................0,2 g
CaCl2 .............................................................................................0,189 g
MgSO4.7H2O……………….....................…………………………0,5 g
Glicose…….....................…………………………………………..1,0 g
KH2PO4………………….………………………………………….0,6 g
Água destilada..............................................................................1000 mL
Modo de preparar: pesar os reagentes, adicionar água destilada, fazer
ajuste para pH 4,0 com H2SO4 1N e autoclavar a 121°C/15min.
17) BAT Ágar (Ágar Bacillus acidoterrestris)
Extrato de levedura................................................................................2 g
(NH4)2SO4..........................................................................................0,2 g
CaCl2 ..............................................................................................0,189 g
MgSO4.7H2O……………………………………………………......0,5 g
Glicose……………….............................................................………..5 g
KH2PO4……………………………………………………….....…..3,0 g
Solução de Elementos traços…………………………............……..1,0 g
237
Ágar.....................................................................................................20 g
Modo de preparar: pesar o reagente e esterilizar separadamente da
18) Caldo BAT (Caldo Bacillus acidoterrestris)
(NH4)2SO4..........................................................................................0,2 g
CaCl2 .............................................................................................0,189 g
MgSO4.7H2O……………………………………….................…….0,5 g
Glicose…………………………………………………………...........5 g
KH2PO4……………………………………………………………...3,0 g
Solução de Elementos traços………………………...........………...1,0 g
Água destilada..............................................................................1000 mL
Ágar.....................................................................................................20 g
Água destilada...............................................................................500 mL
Modo de preparar: pesar o reagentes e esterilizar separadamente da
19) Solução de Elementos Traços
CaCl2.2H2O......................................................................................0,66 g
ZnSO4.7H2O....................................................................................0,18 g
CuSO4.5H2O....................................................................................0,16 g
MnSO4.4H2O...................................................................................0,15 g
CoCl2.5H2O....................................................................................0,18 g
H3BO3.............................................................................................0,10 g
Na2MoO4.2H2O..............................................................................0,30 g
Água destilada................................................................................1 litro
Modo de preparar: pesar todos os reagentes e autoclavar a 121°C/15min.
20) Ágar Nutriente (Biolife)
Caldo Nutriente.................................................................................2,4 g
238
Ágar...................................................................................................4,5 g
Água...............................................................................................300 mL
Modo de preparar: pesar os reagentes, adicionar água destilada e

universidade federal de santa catarina centro tecnológico programa

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