a metodologia de superfície de resposta (msr) na otimização

A METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE
RESPOSTA (MSR) NA OTIMIZAÇÃO DE
PROCESSOS BIOLÓGICOS: A
DETERMINAÇÃO DOS VALORES DE PH
E TEMPERATURA ÓTIMOS PARA A
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Edy S. de Brito*, Gustavo A. S. Pinto, Laura M. Bruno, Henriette M.C. de Azeredo
Embrapa Agroindústria Tropical, R Dra Sara Mesquita, 2270, Pici, Fortaleza-CE, 60511 110
([email protected])
The response surface methodology (RSM) in biological process optimization: The determination of
optimum pH and temperatures values for enzymatic activity
Responce surface methodology (RSM) is a technique in which a series of experiments will yield an
adequate and reliable behavior of the response of interest. RSM may determine the optimal settings of the
experimental factors that produce the maximum, or minimum, value of responce. RSM also may determine
a mathematical model that best fits the data collected from the design, if an appropiate test of hypothesis
were conducted. The determination of optimum pH and temperature for enzymatic activity was selected to
ilustrate the aplication of RSM in biological systens. This methodology allows, not only an ordinate pair,
like in traditional method, but improves, the response obtained, to a large range of combinations of pH and
temperature values. In this optimun region, any combination, produces similar enzymatic activity.
Introdução
A MSR pode ser definida como um
método estatístico que utiliza dados quantitativos
de um desenho experimental adequado para
determinar e simultaneamente solucionar
equações multivariadas. Essas equações podem
ser representadas graficamente como superfícies
de resposta, que podem ser usadas de três
formas: 1) descrever como a variáveis em teste
afetam as respostas; 2) para determinar as
interrelacões entre as variáveis em teste; e 3)
para descrever efeitos combinados de todas as
variáveis em teste sobre a resposta
(Montgomery, 2001)
Devemos definir alguns termos para
uma maior compreensão do texto.
-Fatores ou variáveis independentes são
características que podem ser variadas no
sistema; por exemplo, concentração de reagentes,
forca iônica, pH, temperatura, etc.
-Níveis são o grau ou faixa de variação que um
fator sofrerá; por exemplo, pH 2-10, tampão
acetato 0,1 a 2M.
-Resposta ou variável dependente é a variável
em que estamos interessados e sofre efeito dos
diferentes fatores; por exemplo, glicosilacão,
esterificacão, hidrólise, etc.
Basicamente a MSR é um processo em
quatro etapas.
1-Identificar os fatores. O primeiro passo é
identificar até 5 fatores que sejam críticos ao
estudo, ou seja os fatores responsáveis pela
maior variação no processo. Esta etapa presume
que o pesquisador conheça quais são os fatores
que influenciam o processo. Se os fatores não
forem conhecidos deve-se realizar experimentos
preliminares para identificar os principais
fatores.
2-Definir os níveis. O segundo passo consiste
em definir a faixa em que os fatores estarão
contidos. Se a faixa for muito ampla corre-se o
risco de não encontrarmos o ótimo. Nesse caso
um segundo planejamento com uma faixa mais
restrita deve ser realizado.
3-Escolher
o
desenho
experimental
apropriado. Os desenhos estabelecem uma
ordem em como os experimentos devem ser
realizados. Ao cobrir toda a faixa escolhida para
o experimento enfatiza-se os pontos mais
próximos ao ponto médio (ponto central), ao
mesmo tempo em que são reduzidos os números
de experimentos.
4-Análise dos dados. O quarto passo é analisar
os dados usando um programa computacional
adequado. As conclusões desse experimento
devem ser confirmadas por experimentos
posteriores na condição considerada ótima.
Como em qualquer outro estudo científico, os
resultados não podem ser extrapolados para além
dos limites estabelecidos.
Fatores que devem ser considerados quando
usamos a MSR
O uso efetivo da MSR deve considerar
cinco presupostos:
1-Os fatores que são críticos ao processo são
conhecidos.
2-A região em que os fatores influem o processo
é conhecida.
3-Os fatores variam continuamente ao longo da
faixa experimental escolhida.
4-Existe uma função matemática que relaciona
os fatores à resposta medida.
5-A resposta que é definida por essa função é
uma superfície lisa.
A MSR tem como limitações:
1-Grandes variações dos fatores podem resultar
em conclusões falsas.
2-Os fatores críticos não foram especificados
corretamente.
3-A região de ótimo pode não ser determinada
devido ao uso de uma faixa muito estreita ou
muito ampla.
4-Como em qualquer experimento, resultados
destorcidos podem ser obtidos se bons
procedimentos estatísticos não forem seguidos,
tais como aleatorizacão e blocagem.
5-Superestimar a computação. O pesquisador
deve usar de bom senso e o seu conhecimento
sobre o processo para chegar a conclusões
apropriadas dos seus dados.
Usos da MSR
A MSR apresenta uma ampla aplicação
na pesquisa, porque ela considera vários fatores
em níveis diferentes e as interações
correspondentes entre esses fatores e níveis.
Objetivo
O objetivo desse trabalho é familiarizar
os pesquisadores com a MSR e despertar o
interesse pelo método, tomando como exemplo a
determinação dos valores ótimos de pH e
temperatura de diferentes enzimas produzidas
por Aspergillus niger em fermentação submersa.
Experimental
Microrganismo: Aspergillus niger da coleção de
culturas da EMBRAPA/Agroindústria Tropical.
Meio de fermentação: em cada 100g de farelo de
trigo foram adicionados 60 mL de solução de
(NH4)2SO4 0,91%pv, a fim de que a mistura
contenha 37,5% de água. 40 g do meio foram
transferidos para erlenmeyers de 500 mL e
autoclavados a 1atm / 15 minutos.
Fermentação: após a inoculação de esporos, de
7
forma a obter uma concentração de 10
esporos/g, e subseqüente homogenização o meio
foi transferido para erlenmeyer e incubado em
câmera climática a 30°C por 48 horas.
Obtenção do extrato enzimático: ao término do
período de fermentação o meio foi transferido
para erlenmeyers de 500 mL, contendo 100 mL
de tampão acetato 20 mM pH 5,0. A extração
ocorreu por uma hora a 30°C sem agitação. O
extrato contendo as enzimas de interesse foi
separado da fase sólida por meio de filtração
utilizando papel de filtro Whatmann no 1.
Determinação de atividade da poligalacturoase:
0,1 mL de extrato enzimático foi adicionado em
4,0 mL de soluçâo 0.25% de ácido
poligalacturônico (tampão acetato 200 mM, pH
4,5). A mistura reacional foi incubada por 30
minutos a 35°C (Couri, 1993).
Determinação de atividade da a- amilase: 1 mL
do extrato enzimático foi adicionado à 1 mL de
uma solução 2% de amido, incubados por 15
minutos à 37°C em banho termostático. Após
esse período adicionou-se 0,5 mL de NaOH 1 N
para paralisar a reação (Gomes, 1995)
Determinação
de
atividade
da
carboximetilcelulase (CMCase): : 1.0 mL do
extrato enzimático foi adicionado a 3.0 mL de
solução
de
carboximetilcelulose
0,4%
tamponada. Esta mistura foi incubada por 10
minutos. A reação enzimática foi paralisada com
1.0 mL de NaOH 1N (Gomes, 1995).
Determinação dos grupos redutores: Os grupos
redutores
formados
foram determinados
conforme o método do DNS.Planejamento
analítico: para cada enzima foi utilizado um
conjunto de planejamentos experimentais
fatoriais, onde diversas faixas de pH e
temperatura foram utilizados. Inicialmente foram
empregados planejamentos fatoriais completos
22 com ponto central em triplicata. Para a
determinação da região de máximo de máxima
atividade, o planejamento fatorial completo foi
acrescido dos pontos axiais.
através
do
pacote
Análise
estatística:
STATISTICA 5.0.
Resultados e Discussão
Figura 2: superfícies de resposta para a atividade de CMCase
ao redor dos valores ótimos de pH e temperatura.
Figura 3 Superfície de resposta para região ao redor dos
valores ótimos de pH e temperatura para a
poligalacturonase.
Figura 1: sequência de superfícies de resposta para a
atividade de amilase em diferentes faixas de pH e
temperatura.
O método tradicional e comumente
utilizado, para determinação dos valores de pH e
temperatura, que maximizam a atividade
enzimática, é feito através da obtenção de duas
curvas (unidimenionais) subseqüentes. Assim se
estabelece um valor empírico para a temperatura
reacional e varia-se o pH. Uma vez determinado
o valor de pH, onde ocorre a maior atividade,
faz-se a análise em diferentes temperaturas, neste
pH. Ao término do processo tinha-se um par
ordenado como resposta (Voet e Voet, 2000).
A utilização da enzima numa
combinação de pH e temperatura, próxima as
curvas, sempre gera a questão de quanto da
atividade máxima é preservada. Ou mesmo, se
ainda não poderia haver esse ponto não poderia
apresentar atividade maior que o máximo
determinado, mas que devido a abordagem
metodológica, não se pode observar tal fato.
A utilização da MSR possibilita a
pesquisa das duas variáveis simultaneamente
(Figuras 1 a 3). Nesta metodologia, um prévio
conhecimento do objeto em estudo é de grande
valia para a definição dos níveis de cada fator.
A Figura 1, por exemplo, apresenta a
seqüência de planejamentos utilizada para a
determinação da região de máxima atividade de
amilase. A superfície obtida, com auxílio de
software estatístico, demonstra boa correlação
com os pontos experimentais e que pH 4,0 e
temperatura de 35oC maximizam a atividade da
enzima. O fator temperatura apresentou efeito
positivo significativo, enquanto que o fator pH
não apresentou significância. Assim em um
segundo planejamento, adotou-se o mesmo
intervalo de pH, porém com temperaturas
maiores. Neste planejamento, o grau de
correlação e a significância dos efeitos
calculados foram baixos. Observa-se pela figura
que o valores do ponto central são similares aos
do ponto onde estaria a região de máximo.
Assim expandiu-se o planejamento, com a
inclusão de pontos axiais. A inclusão dos novos
níveis possibilitou o refinamento da superfície de
resposta, uma vez que o programa estatístico
pode calcular efeitos quadráticos. Com isso no
terceiro planejamento observa-se uma região,
onde diferentes combinações de pH e
temperatura, propiciam atividade de amilase
similar.
De
maneira
similar
obteve-se
superfícies de máxima atividade para CMCase
(Figura 2) e poligalacturonase (Figura 3).
A Tabela 1 mostra os intervalos de pH e
temperatura, onde se encontram as regiões de
atividade máxima das enzimas. Nota-se com isso
que diferentemente da metodologia anterior, há
uma região onde as três enzimas estudadas
apresentam atividade máxima simultaneamente.
A utilização da MSR possibilitou a
determinação de regiões de máxima atividade
das enzimas, com um número reduzido de
ensaios.
A MSR pode ser aplicada não apenas a
determinação dos valores de pH e temperatura
ótimos, mas também aos mais diversos ramos da
biotecnologia. Podendo gerar redução no tempo
gasto de obtenção dos resultados, e nos gastos
com reagentes e equipamentos.
A aplicação da MSR vem crescendo nos
últimos anos (Figura 4). Isto se deve a maior
divulgação da metodologia e a disponibilidade
de softwares comerciais "amigáveis" de análise
estatística, que incluem rotinas específicas para
MSR.
Tabela 1: Valores dos intervalos de pH e tempartura para as
regies de maior atividade das diferentes enzimas.
ENZIMA
Amilase
CMCase
Poligalac.
pH
Min.
3,6
3,9
3,4
Max.
5,3
5,7
5,0
Temperautra
(oC)
Min. Max.
44
54
42
65
23
50
Bibliografia
Barros Neto, B.; Scarminio, I.S.; Bruns, R.E.
Planejamento
e
otimização
de
experimentos. Editora da Unicamp,
Campinas, 1995.
Montgomery, D.G. Design and analysis of
experiments. Johr Wiley & Sons, New
York, 2001.
Voet, J.; Voet, D. Biochemistry. Johr Wiley &
Sons, New York, 2001.
12 0
Artigos
10 0
80
60
40
20
0
2001
20 00
1999
1998
1 997
1996
1995
1994
19 93
1992
199 1
Ano
M E D LIN E - M SR + enzim a
M E D LIN E - M SR
F STA - M SR + enzim a
F STA - M SR
Figura 4: Artigos publicados e indexados com os termos MSR ou MSR + enzima, nas bases de dados FSTA e MEDLINE.
1990