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Molekularbiologie und Biochemie für Bioinformatiker
Lösungen und Pipettieren ( Häufig gestellte Fragen)
1. Was ist ein Mol?
Das Mol ist die Einheit der Stoffmenge. Es ist definiert als diejenige Menge Substanz,
die so viele Elementareinheiten (Atome, Ionen, Moleküle) enthält, wie Atome in 12g
des Kohlenstoff-Isotops C12 vorhanden sind. Das sind 6,02x10 23 Teilchen.
2. Was ist Molarität?
Molarität sind die Mole gelöster Substanz /Liter einer Lösung. Somit ist eine 1 molare
Lösung (1M) = 1Mol gelöste Substanz in Gramm pro Liter. Eine 1 millimolare (mM)
Lösung = 0,001mol/l
3. Wieviel Gramm sind in einem Mol?
Das ist wiederum unterschiedlich für die verschiedenen Elemente und Verbindungen.
Es ist festgelegt durch die Atommasse eines Elements, oder durch die
Molekularmasse einer Verbindung, welche die Summe der Atommassen der Atome,
die in einer Formel(einheit) der Verbindung gefunden werden, darstellt.
Zum Beispiel ist das Molekulargewicht von Wasser (H2O) 2x das Atomgewicht von
Wasserstoff und 1x das Atomgewicht von Sauerstoff.
Zahlenmäßig ist das: (2*1.00797)+(1*15.9994)=2.01594+15.9994=18.01534.
Ein anderes Beispiel: Das Molekulargewicht von KCl = 39.1 + 35.45 = 74.55.
Um also eine 1M Lösung von KCL herzustellen, benötigt man 74,55 g/l
Anmerkung: die oben genannten 74,55 Gramm pro Liter bedeuten die
Endkonzentration.
Das ist nicht das Gleiche wie 74,55 g zu einem Liter Wasser dazuzugeben.
Wenn man solch eine Lösung macht, sollte die zu lösende Substanz zunächst in einem
kleineren Volumen Wasser gelöst werden und dann auf den 1 Liter aufgefüllt werden.
4. Was ist Nomalität?
Der Begriff Normalität wird oft im Zusammenhang mit Säuren und Basen verwendet.
Eine einfache Definition ist: Normalität = Molarität x Z.
Wobei Z die Anzahl von Protonen (H+) enthalten in 1 Molekül einer Säure oder die
Anzahl der Hydroxydionen (OH-) enthalten in einem Molekül einer Base, darstellt. Z
ist typischerweise 1, 2, oder 3.
Beispiele:
Salzsäure, HCl, Z = 1
Calciumhydroxyd, Ca(OH)2, Z = 2
Phosphorsäure, H3PO4, Z = 3
Um also eine 1 N Lösung von Ca(OH)2, (F.W. = 74.09) herzustellen braucht man:
1/2 Mol pro Liter oder 37.05 g/l
5. Was ist eine 1% ige (vol/vol) Lösung?
Das bedeutet, dass eine bestimmte flüssige Chemikalie 1% des Gesamtvolumens der
Lösung ausmacht. Zum Beispiel enthält 1%ige Glycerollösung 1ml Gycerol in einem
Endvolumen von 100ml.
6. Was ist eine 1% (wt/vol) Lösung?
Wenn eine Chemikalie ein Feststoff ist, bedeutet eine 1%ige Lösung, dass 1g auf
100ml kommt. Zum Beispiel würde eine 1%ige SDS Lösung 1g SDS in einem
Endvolumen von 100ml enthalten.
7. Was ist eine 10X Lösung?
Das ist eine Vorratslösung mit einer Konzentration, die 10x höher ist als die Lösung,
mit der man arbeitet. Um eine 1X Lösung herzustellen muß man sie 10fach
verdünnen. Zum Beispiel um eine 1X Lösung von TE herzustellen muß man 100ml
einer !0X TE-Lösung auf ein Endvolumen von 1 Liter verdünnen.
8. Was ist ein Mikroliter?
1 Mikroliter (ul or µl) ist 1/1000000 von einem Liter oder 1/1000 von einem
Milliliter.
9. Was ist eine Mikropipette?
Eine Mikropipette (oder micropipette oder micropipetor oder pipetman)wird benützt
um Lösungen in Mikrolitermengen aufzuteilen. Sie ist wahrscheinlich das am
häufigsten benützte Arbeitsinstrument in einem molekularbiologischem Labor.
10. Welche Mikropipette soll man benutzen?
Das Standartset enthält 3 Mikropipetten: P-20, P-200, and P-1000. Die Zahl zeigt
das maximal zu pipettierende Volumen der Pipette an. Es folgen die
Volumenbereiche jeder Pipette
P-20 = 2 - 20 ul
P-200 = 20 - 200 ul
P-1000 = 200 - 1000 ul
Anmerkung: Für Volumen, die sich 2 Pipetten teilen ist es genauer die zu benützen,
die das kleinere Volumen hat. Zum Beispiel für 20 ul ist es besser die P-20 als die P200 zu benützen..
Versuche niemals ein Volumen oberhalb des angegebenen Bereichs einer
Mikropipette zu benützen!
11. Wie lese ich das eingestellte Volumen meiner Mikropipette ab?
Jede Pipette zeigt 3 Zahlen an:
Für dieP-20, die oberste Zahl zeigt die Dezimalstelle an.
Also ist eine Einstellung von 156 = 15.6 ul. Eine Einstellung von 040 = 4 ul.
Für die P-200, entsprechen die Zahlen genau der Anzahl von Mikrolitern. Also ist
eine Einstellung von133 = 133 ul. Eine Einstellung von 045 = 45 ul.
Für die P-1000, werden die Zahlen mit 10 multipliziert. Also ist eine Einstellung von
050 = 500 ul. Eine Einstellung von 100 = 1000 ul (oder 1 ml)
12. Wie benütze ich eine Mikropipette?
a. Man muss immer eine Spitze benützen! Gelbe Spitzen für P-20/P-200, blaue
Spitzen für P-1000
b. Dann den Pipettenhub sanft bis zum ersten Stopp herunterdrücken
c. Die Spitze in die zu pipettierende Lösung eintauchen und den Pipettenhub sanft
loslassen bis er den ersten Stopp wieder erreicht hat.
d. Die Spitze in das dafür bestimmte Tube halten und den Pipettenhub sanft
herunterdrücken bis er am ersten Stopp angekommen ist.
e. Den Pipettenhub über den ersten Stopp hinaus drücken um die noch
übriggebliebene Flüssigkeit auszustoßen.
f. Die Spitze aus der Lösung ziehen und den Pipettenhub loslassen
g. Den weißen Knopf benützen um die Spitze abzuwerfen.
Anmerkung:
Wenn man einige Lösungen in das gleiche Tube pipettieren möchte, ist es das Beste
mit dem größten Volumen zu beginnen und dann die kleineren Volumina zuzugeben.
Man kann die Lösung dann mischen indem man immer wieder hoch und runter
pipettiert. Wenn man das so macht, darf man den Pipettenhub nicht über den ersten
Stopp drücken.. Außerdem darf man den Pipettenhub nicht zu schnell loslassen , denn
wenn man ihn zu schnell losläßt, bekommt man Luftblasen oder es bleibt Lösung an
der Pipettenspitze hängen.
Wenn man die gleiche Lösung in einige verschiedene Tubes pipettieren möchte, kann
man die gleiche Pipettenspitze benützen. Man muß allerdings sichergehen, dass man
keine andere Lösung damit berührt.
13. Wie benützt man eine Glaspipette und einen Peleusball?
a. Den Peleusball auf das Ende der Glaspipette stecken.
b. “A” drücken am oberen Ende des Balls und den Ball zusammendrücken um die
Luft aus dem Ball zu lassen.
c. Die Pipette in de Lösung halten und “S” in der Mitte drücken um die Lösung in die
Pipette aufzusaugen.
d. Auf das richtige Volumen bringen indem man “E” drückt an der Seite des Balls um
überschüssige Flüssigkeit auszustoßen.
e. Die Pipette in das vorgesehene Gefäß halten und “E” drücken um die Flüssigkeit
abzulassen.
Anmerkung: Viele Pipetten sind so hergestellt, daß sie einen letzten Tropfen
Flüssikeit zurückbehalten. Deshalb kann eine kleine Menge in der Pipette
zurückbleiben, nachdem man „E“ gedrückt hat.
14. Was ist ein Gel?
Ein Gel ist eine Substanz, die bei Raumtemperatur nur halbfest ist. Beispiele sind
Haargel und Pudding. Im Labor benutzt man Gele, die aus Agar (ein Algenprodukt),
Stärke (oft aus Kartoffeln) oder Acrylamiden, bestehen.
Diese Substanzen können benutzt werden um Moleküle von unterschiedlicher Größe
und unterschiedlichem Molekulargewicht voneinander zu trennen, wenn man sie
einem elektrischen Feld aussetzt. Das nennt man eine Gelelektrophorese.Gele kann
man auch benutzen um Nährmittel bereitzustellen, sodaß etwas auf ihrer Oberfläche
wachsen kann, wie zum Beispiel Bakterien und Viren.
15. Was ist die Steriltechnik?
Die Steriltechnik ist eine Technik die in fast allen Labortechniken, die hier ausgeführt
werden, benützt wird. Diese Technik beinhaltet, dass man lernt, wie man sein
Experiment davor bewahrt kontaminiert zu werden.
Es ist extrem wichtig Steriltechnik zu lernen und zu üben, da sonst die Experimente,
die hier durchgeführt werden, nicht funktionieren. Diese Technik schützt auch davor,
dass man durch die im Labor benützten Substanzen Schaden nimmt.
Was wir heute tun sollten:
Die folgenden praktischen Übungen sollten im Kurs durchgeführt werden.
Verschiedene Gruppen bekommen unterschiedliche Anweisungen wie die folgenden
Übungen durchgeführt werden. Sie müssen in der Lage sein alle diese Techniken in
den folgenden Laborübungen anzuwenden. Dafür sollen Sie sich Aufzeichnungen
machen, was Sie tun und wie Sie etwas tun.
Wenn Sie unsicher sind, fragen Sie uns!!!
A. Benützen der Mikropipette:
Pipettieren Sie 10 ul, 100 ul, und 500 ul Wasser in 3 verschiedene Eppendorftubes.
Vergeichen Sie die Tubes mit den bereitgestellten Standarts. Enthalten sie das geiche
Volumen an Flüssigkeit? Nehmen Sie das Wasser wieder aus jedem Tube, indem sie
die Mikropipette benützen. Sie sollten in der Lage sein das Wasser ganz genau wieder
aus dem Tube herauszuholen, sodass das Tube komplett leer ist und die Pipettenspitze
keine Luftblasen enthält.
Pipettieren Sie 50 ul Wasser in ein Eppendorftube. Dann pipettieren Sie 5 ul Glycerol
dazu. Beachten Sie, dass Glycerol ziemlich dickflüssig ( viskos) ist und Sie deshalb
langsam pipettieren müssen. Also beachten Sie, dass etwas Glycerol außen an der
Pipettenspitze hängen bleibt. Sie sollten diesen Glycerolrest entfernen, indem sie die
Pipette an der Ecke des Glycerolgefäßes abstreifen. Beobachten Sie das Glycerol,
wenn Sie es zum Wasser geben, es sollte zu Boden sinken.
Jetzt teilen Sie sich in unterschiedliche Gruppen auf, jede Gruppe wird zu einer
“Station” gehen, wo Sie die folgenden Techniken ausführen:
B. Gießen eines Agarosegels:
Dieses Gel wird hergestellt aus einer Mischung von TAE und Agarose. Es kann
benützt werden um Proteine, RNA oder DNA im elektrischen Feld laufen zu lassen.
Heute stellen wir ein 1% Agarosegel im 1X TAE her.
1) Wenn wir 30ml Gel machen:
a. Wieviel 10X TAE braucht man?
b. Wieviel Wasser braucht man?
c. Wieviel Agarose braucht man?
2) Wenn Sie die Fragen beantwortet haben und Ihre Antworten kontrolliert
worden sind, können Sie alles abmessen und in der Mikrowelle erhitzen.
Die Mischung muss kochen, aber nicht zu lang. Sie sollten dann umrühren,
aber es sollten keine Luftblasen entstehen. Nach dem Umrühren sollten Sie
prüfen ob die Flüssigkeit komplett klar ist, oder ob es immer noch kleine
Ablagerungen gibt. Wenn noch Ablagerungen vorhanden sind, müssen Sie
noch weiter in der Mikrowelle erhitzen. Sind Sie sehr vorsichtig- es wird
sehr heiß und kann leicht überkochen!!!
3) Wenn alles etwas abgekühlt ist, kann das Gel gegossen werden. Gießen
Sie das Gel auf den vorbereiteten Gelträger. Es dauert 15-20 Minuten, bis
es abgekühlt und ausgehärtet ist. Während Sie warten üben Sie Ihre
Pipettierfähigkeit!
C. Laden des Gels:
Der Gel-Lade-Puffer (LB) ist in einer 6X Konzentration. Wieviel vom 6X LB sollten
Sie zu 10 ul Wasser hinzufügen um eine Endkonzentration von 1X herzustellen?
Pipettieren Sie 10 ul Wasser in ein Eppendorf-Tube. Dann fügen Sie ____ ul 6X GelLade-Puffer (Endkonzentration = 1X) hinzu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf
und ab pipettieren. Laden Sie die Lösung in die vorgesehene Geltasche auf ihrem Gel.
Wiederholen Sie das, wenn Sie mehr Übung brauchen.
Unterhalb steht das Rezept für den 6X Gel-Lade-Puffer. Füllen Sie die Lücken um zu
zeigen wie viel von jeder Chemikalie Sie benötigen um 100 ml von 6X LB
herzustellen:
6X Gel- Lade-Puffer(gel loading buffer):
0.25% (wt/vol) Bromophenolblau (= _____ g per 100 ml)
0.25% (wt/vol) Xylencyanol FF (= _____ g per 100 ml)
30.0% (vol/vol) Glycerol (= _____ ml per 100 ml)
Bromophenolblau und Xylencyanol sind Farben, die uns erlauben unsere Proben zu
sehen und den Lauf des Gels zu verfolgen. Warum geben Sie Glycerol zum 6X LB?
D. Benützen von Glaspipetten:
Saugen Sie 10 ml Wasser in eine 10 ml Glaspipette. Teilen Sie 5 ml in jede der 2
Kulturgläser auf. Enthalten die 2 Gläser die gleiche Menge Wasser? Haben Sie das
Gleiche Volumen wie das 5ml Referenzglas?
E. LB Agarplatten gießen
LB steht für Luria Broth, welches die Salze, Aminosäuren und Zucker enthält, die
Bakterien zum Wachsen brauchen. Diese Brühe muss perfekt steril sein, damit man
nur die erwünschten Bakterien wachsen läßt. Damit dies passiert,müssen der Agar
und die Brühe autoklaviert werden. Autoklavieren setzt die Glasware, die Lösungen
und die Instrumente etc. extrem hoher Hitze und extrem hohen Drücken aus. Fast
keine lebenden Organismen können Autoklavieren überleben und deshalb ist der Agar
steril. Jede Gruppe hat eine kleine Flasche von vorautoklaviertem LB-Agar.
Gießen Sie 2 Platten pro Person 10 mls (Platte1/3 voll) proLB-Agar-Platte. Gießen
Sie langsam und vorsichtig, gehen Sie sicher, daß Sie Blasen vermeiden! Lassen Sie
eine Platte mit dem Deckel darauf abkühlen, die andere mit geöffnetem Deckel. Wenn
die Platten ausgehärtet sind, benennen Sie sie mit Deckel offen, Deckel geschlossen.
Nächste Woche werden Sie sehen, wie steril Sie wirklich waren!
F. Ausplattieren von Medium auf der Agarplatte:
In zukünftigen Laborpraktika werden wir Bakterien auf Agarplatten wachsen lassen.
Da das Ausplattieren von den kleinen Proben Bakterien auf einer Platte knifflig sein
kann, üben Sie heute indem Sie blauen Farbstoff auf der Agarplatte möglichst
gleichmäßig verteilen. Auf diesem Weg können Sie sehen ob Sie erfolgreich
ausplattieren oder wenn Sie zu fest aufdrücken nicht genug verteilen etc.
1. Ziehen Sie 50 ul der vorbereiteten Farbstofflösung auf (welche Pipette sollten
Sie benützen?)
2. Pipettieren Sie den Farbstoff vorsichtig auf die Oberfläche der vorgesehenen
LB-Agarplatte. Wenn Sie es zu schnell aufbringen wird es spritzen! Nehmen
Sie den Drygalski-Glasspatel und tränken Sie ihn im Ethanol/Wassergemisch.
Schwenken Sie ihn über der Flamme und warten Sie dann, bis die Flamme
ausgebrannt ist und das Glas sich etwas abkühlt. Wenn Sie den Glasspatel
benützen, solange er noch zu heiß ist, töten Sie Ihre Bakterien ab.
3. Wenden Sie leichten Druck auf den Glasspatel an und drehen Sie den Fuß.
Bewegen Sie den Glasspatel vorsichtig vor und zurück und quer über die
Platte. Machen Sie das aber nicht zu lang, sonst trocknet es zu sehr aus.
Beobachten Sie, wo Ihr Farbstoff sich befindet. Ein feiner Überzug über die
gesamte Platte wäre gut. Sehen Sie Streifen? Haben Sie Ihre Platte
durchstoßen?
G. Kolonien aufnehmen und in einer flüssigen Kultur wachsen lassen:
In den zukünftigen Laborpraktika werden Sie Plasmid-DNA von einer flüssigen
Bakterienkultur extrahieren. In dieser Übung werden Sie lernen, wie man eine
flüssige Kultur aus einer einzigen Bakterienkulur ansetzt, indem man die Steriltechnik
anwendet. Zuerst müssen Sie 5 ml flüssiges LB in ein Kulturgefäß geben indem Sie
die Steriltechnik anwenden.
1. Benützen Sie einen Bunsenbrenner, ziehen Sie die Öffnung des
Kulturgefäßes durch die Flammen, dann pipettieren Sie 5ml von LB in das
Gefäß indem Sie eine sterile Glas- oder Plastikpipette benutzen.
2. Ziehen Sie die Öffnung des Kulturgefäßes nochmals durch die Flamme
und geben Sie erst dann den Deckel zurück auf das Gefäß. Machen Sie
das für alle Kolonien die Sie aufzunehmen planen. ( 1 Kolonie pro Gefäß).
Nehmen Sie eine sterile Impföse oder eine gelbe Pipettenspitze, stechen
Sie in die Oberfläche der Agarplatte, wo sich eine einzelne, sich nichtüberlappende Kulur befindet..
3. Benützen Sie wieder den Bunsenbrenner. Ziehen Sie die Öffnung des
Kulturgefäßes wieder durch die Flamme, dann lassen Sie die Impföse oder
die Pipettenspitze in das Gefäß fallen, mit der Bakterienseite nach unten.
Ziehen Sie die Öffnung des Kulturgefäßes nochmals durch die Flamme
und geben Sie den Deckel zurück auf das Gefäß.
4. Die Kulturen werden jetzt in einem Inkubator, der sie schüttelt bei 37 °C
für mindestens 8 Stunden (aber nicht länger als 16-18 Stunden) zum
Wachsen gebracht.