Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A auf Vorderkiemen
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Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A auf Vorderkiemen
Originalarbeiten Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A Originalarbeiten Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A auf Vorderkiemenschnecken (Mollusca: Gastropoda: Prosobranchia) Ulrike Schulte-Oehlmann1, Michaela Tillmann2, Daire Casey3, Martina Duft2, Bernd Markert2 und Jörg Oehlmann1 1 2 3 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main, Zoologisches Institut, Siesmayerstr. 70, D-60054 Frankfurt Internationales Hochschulinstitut Zittau, Lehrstuhl Umweltverfahrenstechnik, Markt 23, D-02763 Zittau Cardiff University, School of Biosciences, PO Box 915, Cardiff CF10 3TL, U.K. __________________ Korrespondenzautor: Prof. Dr. Jörg Oehlmann; e-Mail: [email protected] DOI: http://dx.doi.org/10.1065/uwsf2001.10.070 Zusammenfassung. Im Rahmen eines vom Umweltbundesamt geförderten Forschungsprojektes zur Entwicklung eines biologischen Tests mit der Süßwasserschnecke Marisa cornuarietis für geschlechtshormonähnlich wirkende Substanzen wurden unter anderem die Effekte des als Xenoöstrogen verdächtigten Bisphenols A (BPA) untersucht. Zusätzlich zu den Laborversuchsreihen mit der Apfelschnecke M. cornuarietis wurden Versuche mit der Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum als Süßwasserspezies sowie zwei marinen Arten, der Netzreusenschnecke Nassarius reticulatus und der Nordischen Purpurschnecke Nucella lapillus, durchgeführt. Während N. reticulatus als sedimentbewohnende Art über Kunstsedimente exponiert wurde, erfolgte für die drei anderen Spezies die Exposition aquatisch. Die Tests mit der Apfelschnecke deckten einen nominalen Konzentrationsbereich von 1 bis 100 µg BPA/l in einem 5-monatigen Versuch mit adulten Tieren und einem kompletten Lebenszyklustest über 12 Monate sowie einen Bereich von nominal 0,05– 1 µg BPA/l (analytisch ermittelt: 0,0079–0,404 µg/l) in einem 6monatigen Experiment mit adulten Exemplaren ab. In den drei Versuchsreihen löste die Testsubstanz ein komplexes Syndrom physiologischer und morphologischer Veränderungen bei M. cornuarietis aus, das als Ausbildung von 'Superweibchen' bezeichnet wird. Betroffene Exemplare sind durch zusätzliche weibliche Geschlechtsorgane, eine Vergrößerung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen im Genitaltrakt, Missbildungen des pallialen Eileiterabschnitts mit einer daraus resultierenden erhöhten Mortalität der Weibchen und eine massive Stimulation der Ei- und Gelegeproduktion charakterisiert. Bei den Experimenten ergab sich eine LOEC von 48,3 ng/l, eine NOEC von 7,9 ng/l und eine EC10 von 13,9 ng/l. Superweibchen traten auch bei den drei anderen untersuchten Schneckenarten auf, doch wurden bei diesen wahrscheinlich aufgrund artspezifischer Unterschiede in der Anatomie der Genitaltrakte keine Eileitermissbildungen gefunden. Abstract. Xeno-estrogenic Effects of Bisphenol A in Prosobranchs (Mollusca: Gastropoda: Prosobranchia) (Review Article) Within a Federal Environmental Agency research project to develop a biological test for hormone-mimetic compounds using the freshwater snail Marisa cornuarietis, the effects of the suspected xenoestrogenic substance bisphenol A (BPA), not only on freshwater but also on marine prosobranch snails, were investigated. For the laboratory experiments the ramshorn snail Marisa cornuarietis and the ovoviviparous snail Potamopyrgus antipodarum were considered as freshwater species and two marine prosobranchs, Bei Potamopyrgus antipodarum löste BPA in einem 9-wöchigen Experiment (nominaler Konzentrationsbereich: 1 bis 100 µg/l) eine vermehrte Bildung von Embryonen während der sexuellen Ruhephase aus. Für den Versuch ergab sich eine invertiert Uförmige Konzentrations-Wirkungsbeziehung. Die 3-monatige Exposition von Nassarius reticulatus erfolgte über künstliche Sedimente (nominaler Konzentrationsbereich: 10–1000 µg/kg TG). BPA zeigte bei dieser Art konzentrationsabhängig eine uterotrophe Wirkung, die sich in einer signifikanten Vergrößerung und Gewichtszunahme der akzessorischen Eileiterdrüsen äußerte. Adulte Nucella lapillus wurden über einen Zeitraum von 3 Monaten aquatischen Nominalkonzentrationen von 1–100 µg BPA/ l ausgesetzt. Die Superweibchen waren bei dieser Art ebenfalls durch vergrößerte akzessorische Geschlechtsdrüsen und eine verstärkte Eibildung gekennzeichnet. Zusätzlich löste die Testsubstanz aber auch bei den Männchen charakteristische Veränderungen aus: Der Anteil fortpflanzungsfähiger Tiere mit reifen Spermien in der Vesicula seminalis ging ebenso zurück wie die Ausdehnung von Penis und Prostata. Auch bei dieser Spezies wurden bereits bei der niedrigsten Testkonzentration statistisch signifikante Effekte im Vergleich zur Kontrolle ermittelt (LOEC ≤ 1 µg BPA/l; NOEC < 1 µg BPA/l). Die Ergebnisse zeigen, dass Vorderkiemerschnecken bereits bei erheblich niedrigeren BPA-Konzentrationen als andere systematische Gruppen des Tierreichs negative Effekte zeigen. Daher ist zum Schutz der aquatischen Lebensgemeinschaften und vor dem Hintergrund der derzeit auf EU-Ebene stattfindenden Risikobewertung für BPA eine Berücksichtigung der vorgestellten Resultate zu fordern. Schlagwörter: Bisphenol A; Endokrine Disruptoren; Gefährdungsabschätzung; Marisa cornuarietis; Nassarius reticulatus; Nucella lapillus; Potamopyrgus antipodarum; Prosobranchia; Superweibchen; Xenoöstrogene the netted whelk Nassarius reticulatus and the dog whelk Nucella lapillus, were additionally employed. N. reticulatus, as a typical sediment-living species, was exposed via artificial sediments, while the three other prosobranchs were exposed via water. The test series with Marisa cornuarietis covered a nominal concentration range between 1 and 100 µg BPA/l in a 5 month experiment with adult snails and a complete life cycle test for 12 months. Additionally, a third test in the nominal range between 0.05 and 1 µg BPA/l (measured: 0.0079–0.404 µg/l) was performed with adults snails for 6 months. In these experiments, BPA induced a UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 319 – 333 (2001) © ecomed verlagsgesellschaft AG & Co. KG, D-86899 Landsberg und Ft. Worth/TX, USA • Tokyo, Japan • Mumbai, India • Seoul, Korea 319 Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A complex syndrome of physiological and morphological alterations in female Marisa referred to as the induction of ‘superfemales’. Affected specimens were characterised by the formation of additional female organs, an enlargement of the accessory pallial sex glands, gross malformations of the pallial oviduct section resulting in an increased female mortality, and a massive stimulation of oocyte and spawning mass production. For these tests, an LOEC of 48.3 ng/l, an NOEC of 7.9 ng/l and an EC10 of 13.9 ng/l were calculated. Superfemales occurred also in the BPA exposure experiment with the other snail species, but comparable oviduct malformations as in Marisa were not found, probably due to species differences in the gross anatomical structure of the pallial oviduct. During the 9 week test with Potamopyrgus antipodarum in the nominal concentration range between 1 and 100 µg/l, BPA induced an enhancement of embryo production even in the sexual repose phase of the reproductive cycle. A characteristic inverted U-type concentration response relationship was found. Nassarius reticulatus was exposed via BPA-spiked artificial sediments (nominal concentration range: 10–1000 µg/kg dry wt.) for 3 months. BPA exhibited a significant and concentration dependent uterotrophic effect which could be detected not only by an enlargement but also by a weight increase of the accessory pallial gland complex in the pallial oviduct section. Einleitung Für zahlreiche Umweltchemikalien wurden in den letzten Jahren Befunde veröffentlicht, die eine Beeinflussung des Hormonsystems bei Tieren und Menschen nahe legen. Diese als 'endokrine Disruptoren' bezeichneten hormonmimetischen Substanzen können negative Auswirkungen auf die Fortpflanzungsfähigkeit haben und stehen im Verdacht, zur abnehmenden Spermiendichte bei Männern, zum Anstieg der Häufigkeit hormonabhängiger Tumorerkrankungen (z.B. Hoden- und Prostatakarzinom, einige Typen des Mammakarzinoms) und der Endometriose, von Genitalmissbildungen speziell bei männlichen Neugeborenen, wie Hypospadie (offene Harn-Samen-Röhren) und Kryptorchismus (= Maldescensus testis; Hodenhochstand), sowie zur vorzeitigen Pubertät von weiblichen Jugendlichen beigetragen zu haben (Gülden et al. 1997, Gist, 1998). Derartige hormonähnliche Wirkungen von Umweltchemikalien sind bisher fast ausschließlich für Wirbeltiere bekannt. Dagegen gibt es, von wenigen Ausnahmen abgesehen, kaum Berichte über endokrine Disruption bei Invertebraten, obwohl diese mit mehr als 95% aller bekannten Tierarten eine wesentliche Rolle in aquatischen und terrestrischen Ökosystemen spielen (deFur et al. 1999). Eine mögliche Beeinflussung der Fortpflanzung durch Umweltchemikalien bei sehr niedrigen Konzentrationen, wie sie für endokrine Disruptoren angenommen wird, kann daher gerade bei Wirbellosen weitreichende ökologische Folgen haben. Die geringe Zahl bekannt gewordener Beispiele ist unter anderem der Tatsache geschuldet, dass die unterschiedlichen und teilweise sehr diversen Hormonsysteme der meisten Invertebraten-Stämme im Vergleich zu denen der Wirbeltiere wesentlich schlechter charakterisiert sind, so dass eine durch exogene Substanzen hervorgerufene Beeinflussung derzeit möglicherweise nicht erkannt wird. In deFur et al. 320 Originalarbeiten Adult Nucella lapillus were tested for three months in the laboratory in a nominal concentration range between 1 and 100 µg BPA/l. Superfemales in the dog whelk were also characterised by enlarged accessory pallial sex glands and an enhancement of egg production, but the test compound also affected the males in this species. A lower percentage of exposed specimens had ripe sperm stored in their vesicula seminalis and male Nucella exhibited a reduced length of penis and prostate gland when compared to the control. Because statistically significant effects were observed already at the lowest nominal test concentration (1 µg/l), it can be assumed that even lower concentrations may have a negative impact on the snails. The results show that prosobranch snails are affected by BPA at lower concentrations compared to other systematic taxa in the animal kingdom. Consequently, it has to be claimed that the results of these experiment have to be considered for the current EU risk assessment for BPA in order to achieve a sufficient protection of wildlife in aquatic ecosystems. Keywords: Bisphenol A; endocrine disruptors; hazard assessment; Marisa cornuarietis; Nassarius reticulatus; Nucella lapillus; Potamopyrgus antipodarum; Prosobranchia; super females; xeno-estrogens (1999) sind gleichwohl zahlreiche Studien zusammengestellt, bei denen zumindest der Anfangsverdacht einer endokrinen Disruption in den untersuchten Invertebraten-Taxa gegeben ist. In dieser Übersichtsarbeit wird das durch Tributylzinnverbindungen (TBT) ausgelöste Imposex- und Intersexphänomen der Vorderkiemerschnecken (Prosobranchia) als eines der am besten auch mechanistisch untersuchten und bis zu den Effekten auf Populations- und Ökosystemebene dokumentierten Beispiele endokriner Disruption im gesamten Tierreich angeführt. Imposex und Intersex sind zwei für weltweit mehr als 150 Arten beschriebene Maskulinisierungsphänomene, die belegen, dass eine relativ triviale biochemische Veränderung, in diesem Fall die Hemmung der Cytochrom P450-abhängigen Aromatase (Bettin et al. 1996), massive Auswirkungen bis hin zur faktischen Sterilisierung der Weibchen haben kann (Gibbs et al. 1987, Oehlmann 1994, Bauer et al. 1995, 1997). Matthiessen und Gibbs (1998) betonen daher, es gebe keinen Grund anzunehmen, dass derart tiefgreifende Auswirkungen einzigartig und auf die Effekte von Organozinnverbindungen bei Vorderkiemerschnecken beschränkt seien. Vor diesem Hintergrund wurde im Auftrag des Umweltbundesamtes (Projekt 297 65001/04) ein organismischer Invertebraten-Biotest auf Basis der subtropischen Süßwasserschnecke Marisa cornuarietis entwickelt, um hormonähnliche Wirkungen von Testsubstanzen identifizieren zu können. In Laborexperimenten wurden die Effekte unterschiedlicher androgen-, antiandrogen- bzw. östrogenartig wirkender Modellsubstanzen auf die Testorganismen untersucht (vgl. Oehlmann et al. 2000, Schulte-Oehlmann et al. 2000, Tillmann et al. 2001), unter diesen auch das als Xenoöstrogen verdächtigte Bisphenol A (BPA), das chemisch zu den Dianen zu rechnen ist. Parallel wurden BPA-Expositionsversuche mit drei weiteren Schneckenarten, der limnischen Zwergdeckel- UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 Originalarbeiten Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A schnecke Potamopyrgus antipodarum und den beiden marinen Spezies Nassarius reticulatus (Netzreusenschnecke) und Nucella lapillus (Nordische Purpurschnecke), durchgeführt. BPA zählt zu den Chemikalien, die weltweit im größten Umfang hergestellt werden (Heemken et al. 2000). Die bedeutendste Anwendung ist als Intermediat für die Kunststoffindustrie bei der Herstellung von Polycarbonaten und Epoxidharzen. Ein geringerer Anteil der Gesamtproduktion wird als Antioxidans in Kunststoffen und hydraulischen Flüssigkeiten, für die Herstellung des Flammschutzmittels Tetrabrombisphenol A, für Thermopapiere in Druckern und FaxGeräten, für die Reifenherstellung sowie in Dentalfüllungen und -versiegelungen verwendet (BUA 1997, Heemken et al. 2000). Für das Jahr 1994 wurde der Gesamtverbrauch an BPA in Deutschland auf 163.000 t geschätzt, für 1995 auf 210.000 t (Leisewitz und Schwarz 1997). Die entsprechenden Werte für 1993 in Westeuropa waren 347.000 t, für die USA 552.000 t und für Japan 214.000 t (BUA 1997). Durch Rippen (1999) wurden die vorliegenden Befunde zur Belastung aquatischer Ökosysteme mit BPA zusammengefasst. In den Abwasserfahnen von Kläranlagen in Berlin wurden 1997 Konzentrationen von bis zu 160 ng/l nachgewiesen (arithmetisches Mittel: 80 ng/l; Median: 60 ng/l; n = 12). Die höchsten Konzentrationen in Flüssen wurden in Japan im Einzugsgebiet von Tokio mit 10 ng/l bis 1,9 µg/l (Rippen 1999) sowie in der Elbe mit 17–776 ng/l (Heemken et al. 2000) ermittelt. In kleineren Oberflächengewässern nahe Berlin wurden 1997 Konzentrationen von bis zu 410 ng/l nachgewiesen (arithmetisches Mittel: 23 ng/l; Median: 6 ng/l; n = 41). Im gleichen Einzugsbereich wiesen die Sedimente Gehalte zwischen < 5 und 150 µg BPA/kg (Trockengewicht) auf (Mittel- und Medianwert: 42 µg/kg; n = 19), in der Elbe zwischen 66 und 343 µg/kg (TG). HO OH H3C OH HO Abb. 1: Strukturformeln von Bisphenol A (oben) und 17ß-Östradiol (unten) im Vergleich nur 2–5 µg/l eine östrogenartige Wirkung besitzt, wenngleich die relative östrogene Potenz im Vergleich zum 17ß-Östradiol nur 10–3–10–4 beträgt (Sonnenschein et al. 1995, Safe und Gaido 1998). Dagegen sind die Ergebnisse aus in vivo-Studien mit Wirbeltieren teilweise widersprüchlich (siehe Diskussion). Auf EU-Ebene wird derzeit eine Risikobewertung für BPA durchgeführt, bei der neben den Wirkungen des Dians auf Wirbeltiere auch die Effekte auf Wirbellose zu berücksichtigen sind. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten biologischen Wirkungen von BPA auf Prosobranchier sollen einen Beitrag dazu leisten, Erkenntnislücken in diesem Bereich zu schließen. 1 Material und Methoden In der Literatur wird der log KOW für BPA mit 2,20 bis 3,82 angegeben (BUA 1997, Staples et al. 1998, Heemken et al. 2000). In Experimenten mit Karpfen wurden Biokonzentrationsfaktoren von < 100 ermittelt, während die auf Basis der physikochemischen Daten berechneten BCF-Werte bis zu 366 betragen. Entsprechend ist eine moderate Adsorption an Feststoffe in Oberflächengewässern und eine geringe Bioakkumulation in aquatischen Organismen zu erwarten (BUA 1997). BPA wird im Wasser relativ schnell mikrobiell abgebaut; nach Dorn et al. (1987) beträgt die Halbwertzeit 2,5–4 Tage. Die U.S. EPA gibt bei Anwendung eines modifizierten OECD-Tests eine Abbauzeit von 28 Tagen an (zitiert nach Heemken et al. 2000). Die Expositionsexperimente mit BPA wurden mit vier verschiedenen getrenntgeschlechtlichen Vorderkiemerschnecken-Spezies (Gastropoda: Prosobranchia) durchgeführt. Als Süßwasserarten wurden die tropische Apfelschnecke Marisa cornuarietis und die in Europa verbreitete Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum sowie als marine Spezies die Netzreusenschnecke Nassarius reticulatus (= Hinia reticulata) und die Nordische Purpurschnecke Nucella lapillus berücksichtigt. Die beiden limnischen Schnecken stammten aus der eigenen, seit vielen Jahren etablierten Zucht, während die marinen Arten im Frühjahr bzw. Herbst 1999 in Méan Mélen (Nucella lapillus) bzw. Pléneuf (Nassarius reticulatus) in der Bretagne gesammelt wurden. Erste Hinweise auf eine östrogene Wirkung von BPA wurden bereits vor mehr als 60 Jahren gefunden, so beispielsweise in den Fütterungsexperimenten von Dodds und Lawson (1936, 1938) mit ovarektomierten Ratten, bei denen die Testsubstanz einen uterotrophen Effekt zeigte, obwohl die äußere strukturelle Ähnlichkeit mit den natürlichen Östrogenen ein derartiges Wirkpotenzial nicht a priori nahe legt (Abb. 1). In neueren Untersuchungen mit Östrogenrezeptor(vgl. Greim 1998) und MCF-7-Assays (Krishnan et al. 1993) konnte gezeigt werden, dass BPA bei Konzentrationen von Die Versuche wurde als semistatische Systeme mit einer Erneuerung des Wassers nach 24 h (an Wochenenden 48 h) durchgeführt. Die Tests mit Potamopyrgus antipodarum fanden in 1 l-Erlenmeyerkolben ohne Filteranlage statt; die anderen Arten wurden in 40 l- (Nassarius reticulatus und Nucella lapillus) bzw. 60 l-Aquarien (Marisa cornuarietis) mit einer Eheim-Filteranlage exponiert, die mit konditioniertem Leitungswasser (Aktivkohlefilterung) bei Marisa cornuarietis und künstlichem Meerwasser (Salinität 35o/oo) bei den beiden marinen Spezies befüllt waren. Für die Apfel- UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 321 Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A Originalarbeiten schnecke wurde die Temperatur auf 22 ± 1°C, für die europäischen Arten auf 14 ± 1°C eingestellt; der Hell-DunkelZyklus betrug 12:12 h. Insgesamt wurden die folgenden sechs Expositionsexperimente mit BPA (Art. Nr. 8.03546, Merck Schuchardt) durchgeführt: 1. Hochkonzentrationsexperiment mit adulten Marisa cornuarietis: Je 200 geschlechtsreife Marisa cornuarietis wurden gegenüber aquatischen Nominalkonzentrationen von 1, 5, 25 und 100 µg BPA/l über 5 Monate exponiert; zusätzlich wurde eine Lösemittelkontrolle (Ethanol; Konzentration: 12,5 µg/l) eingesetzt. Die Stichprobengröße betrug 30 Individuen pro Versuchsgruppe. Es wurde eine Stichprobe einmalig am Anfang des Experiments und danach aus jeder Versuchsgruppe in monatlichen Abständen untersucht. 2. Lebenszyklusexperiment mit Marisa cornuarietis im Hochkonzentrationsbereich: Die von den adulten Apfelschnecken im Experiment 1 (Kontrolle, 1 und 100 µg BPA/l) produzieren Gelegemassen wurden abgesammelt und gruppenweise ex ovo weiter gegenüber diesen Nominalkonzentrationen exponiert, bis die geschlüpften Tiere der F1-Generation ein Alter von 12 Monaten erreicht hatten. Die letzten Tiere der F1-Generation waren mit 8 Monaten geschlechtsreif. Es wurden Stichproben von je 30 Exemplaren aus jeder Versuchsgruppe im Alter von 6, 8 und 12 Monaten untersucht. 3. Niedrigkonzentrationsexperiment mit adulten Marisa cornuarietis: Je 240 geschlechtsreife Marisa cornuarietis wurden gegenüber aquatischen Nominalkonzentrationen von 50, 100, 250, 500 und 1000 ng BPA/l über 6 Monate exponiert; zusätzlich wurde eine Lösemittelkontrolle (Ethanol; Konzentration: 12,5 µg/l) eingesetzt. Die Stichprobengröße betrug 30 Individuen pro Versuchsgruppe. Es wurde eine Stichprobe einmalig am Anfang des Experiments und danach aus jeder Versuchsgruppe in monatlichen Abständen untersucht. 4. Experiment mit adulten Potamopyrgus antipodarum: Geschlechtsreife Exemplare der parthenogenetischen, ovoviviparen Art Potamopyrgus antipodarum wurden gegenüber aquatischen Nominalkonzentrationen von 1, 5, 25 und 100 µg BPA/l über neun Wochen exponiert; zusätzlich wurde eine Lösemittelkontrolle (Ethanol; Konzentration: 12,5 µg/l) eingesetzt. Die Stichprobengröße betrug 20 Individuen pro Versuchsgruppe. Es wurde eine Stichprobe einmalig am Anfang des Experiments und danach aus jeder Versuchsgruppe im Abstand von 3 Wochen untersucht. 5. Experiment mit adulten Nassarius reticulatus: Geschlechtsreife Netzreusenschnecken wurden gegenüber Nominalkonzentrationen von 10, 50 und 1000 µg BPA/kg (Trockengewicht) in gespikten künstlichen Sedimenten (95% Quarzsand und 5% Torf) über 3 Monate exponiert; zusätzlich wurde eine Lösemittelkontrolle (Eisessig; Konzentration: 5 mg/kg) eingesetzt. Die Stichprobengröße betrug 30 Individuen pro Versuchsgruppe. Es wurde eine Stichprobe einmalig am Anfang des Experiments und danach aus jeder Versuchsgruppe in monatlichen Abständen untersucht. 6. Experiment mit adulten Nucella lapillus: Geschlechtsreife Purpurschnecken wurden gegenüber aquatischen Nominalkonzentrationen von 1, 25 und 100 µg BPA/l über 3 Monate exponiert; zusätzlich wurde eine Lösemittelkontrolle (Eisessig; Konzentration: 10 µg/l) eingesetzt. Die Stichprobengröße betrug 30 Individuen pro Versuchsgruppe. Es wurde eine Stichprobe einmalig am Anfang des Experiments und danach aus jeder Versuchsgruppe in monatlichen Abständen untersucht. Bei den beiden marinen Schneckenarten wurde Eisessig als Lösemittel für die Testsubstanz verwendet, weil nach Stroben et al. (1992b) Ethanol eine Virilisierung der Weibchen von Nassarius reticulatus und Nucella lapillus in Form einer Imposexentwicklung auslösen kann; bei den Süßwasserspezies weist Ethanol keine entsprechende Wirkung auf (Schulte-Oehlmann 1997). Mit Ausnahme des Niedrigkonzentrationsexperiments mit adulten Marisa erfolgte keine analytische Überprüfung der Nominalkonzentrationen. In Tabelle 1 sind die nominalen den analytisch ermittelten BPA-Konzentrationen gegenübergestellt. Während des ersten 24-stündigen Untersuchungszyklus konnte auch in der Kontrolle BPA als Folge eines Fehlers bei der Probenahme nachgewiesen werden: die Wasserproben wurden über neue, handelsübliche Kunststoffschläuche für Aquarienpumpen in die Probenahmegefäße geleistet, aus denen BPA auslaugte. In den folgenden Monaten wurden die Wasserproben gewonnen, indem die Probenahmegefäße direkt in die Expositionsaquarien getaucht wurden; in diesen Fällen konnte BPA in den Tabelle 1: Vergleich der nominalen und analytisch ermittelten Bisphenol A-Konzentrationen im Niedrigkonzentrationsexperiment mit adulten Marisa cornuarietis. Die Wasserproben wurden über drei 24 h-Zyklen mit je 8 Proben (2, 4 und 6 Monate nach Experimentbeginn) genommen, wobei jeder Zyklus 15 Minuten vor dem Wasserwechsel begann und 24 h später vor dem erneuten Wechsel endete. Alle Angaben in ng BPA/l Nominalkonzentration Kontrolle 50 100 250 500 1000 0 – 40 0 – 40 0 – 180 0 – 360 0 – 590 0 – 1200 0 0 45 60 120 235 9,2 ± 16 7,9 ± 16 48 ± 51 104 ± 120 205 ± 223 404 ± 429 — 15,8 48,3 41,7 41,0 40,4 Analytisch ermittelt Minimum – Maximum Median Arithmetisches Mittel ± Standardabweichung % der Nominalkonzentration (bezogen auf arithmet. Mittel) 322 UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 Originalarbeiten Kontrollbecken nicht mehr nachgewiesen werden. BPA erwies sich während der Experimente als relativ leicht biologisch abbaubar, so dass die analytisch ermittelten Konzentrationen lediglich 15,8–48,3% der Nominalkonzentrationen erreichten. Für die Ableitung von NOEC- und LOEC-Werten sowie für die Berechnung des EC10 werden im Kapitel 2 ausschließlich die analytisch ermittelten BPA-Konzentrationen herangezogen. Während der Experimente wurden täglich die Mortalität und die produzierte Anzahl an Gelegen und Eiern erfasst. Da es für Marisa cornuarietis nicht möglich war, die Fekunditätsparameter für jedes einzelne Weibchen, sondern nur als Gruppenparameter mit einer post hoc bekannten Anzahl an weiblichen Exemplaren in den Expositionsaquarien zu bestimmen, können für diese Endpunkte bei der Apfelschnecke keine Variabilitätsparameter (z.B. Standardabweichung oder Standardfehler) angegeben werden. Alle Versuchstiere wurden vor der Untersuchung narkotisiert (2,5% MgCl2-Lösung in destilliertem Wasser für Marisa und Potamopyrgus, 7% MgCl2-Lösung für Nassarius und Nucella). Die individuelle Schalen- und Mündungshöhe wurde auf 0,1 mm (0,05 für Potamopyrgus antipodarum) genau bestimmt und der Weichkörper anschließend aus der Schale entnommen. Das äußere Erscheinungsbild aller Geschlechtsorgane wurde überprüft und ihre Ausdehnung auf 0,1 mm (0,05 für Potamopyrgus antipodarum) genau vermessen. Das Auftreten von Oozyten und Spermien in den ableitenden Geschlechtswegen wurden ebenso wie sichtbare Gewebswucherungen an den Genitalien und anderen Organen im Bereich der Mantelhöhle unter dem Stereomikroskop erfasst und protokolliert. Zusätzlich wurde der VDSI (Vas deferens Sequenz-Index = arithmetischer Mittelwert aller Imposexstadien in einer Stichprobe von 30 Tieren mit Werten zwischen 0 und 3 bei Marisa cornuarietis, 0 und 4 bei Nassarius reticulatus und 0 und 6 bei Nucella lapillus) als Maß der Imposexintensität in einer Versuchsgruppe berechnet (Details für die 3 Arten sind beschrieben in Oehlmann et al. 1991, Stroben et al. 1992a, Schulte-Oehlmann et al. 1995). Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A 100 µg/l auf adulte Apfelschnecken geprüft wurden, konnte erstmals ein komplexes Syndrom morphologischer und physiologischer Veränderungen bei den Versuchstieren beobachtet werden, das zuvor bei Expositionsversuchen gegenüber anderen Substanzen mit Marisa cornuarietis nicht beobachtet wurde, obwohl seit 1992 mehr als 8.000 Exemplare dieser Art in unserem Labor untersucht wurden. Die normale morphologische und histologische Struktur des männlichen und weiblichen Genitalsystems von M. cornuarietis sowie die im Zuge der durch Tributylzinnverbindungen (TBT) ausgelösten Imposexentwicklung auftretenden Veränderungen sind bei Schulte-Oehlmann et al. (1994, 1995) dokumentiert. Das unter dem Einfluss von BPA, aber auch von anderen östrogenartig wirkenden Substanzen wie Octylphenol oder Ethinylöstradiol auftretende Syndrom wird als die Induktion von 'Superweibchen' bezeichnet. Es ist durch eine Vergrößerung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen im pallialen Eileiterabschnitt (Abb. 2a,b), die Stimulation der Gelege- und Die statistische Absicherung der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms StatEasy für Windows 2000. Als Standardtests wurden Varianzanalysen (ANCOVA) mit multiplem (oder post hoc) Vergleich der Proben nach Tukey (geringer Stichprobenumfang) oder Student-Newman-Keuls (großer Stichprobenumfang), der H- oder Kruskal-WallisTest mit multiplem Vergleich der Proben nach Nemenyi, der χ2-Test, der Weir-Test für Klassengruppen sowie EC10- und EC50-Berechnung nach einer Probit-Transformation gemäß Weber (1972) und Lozán (1992) durchgeführt. 2 Ergebnisse und Diskussion 2.1 Hochkonzentrationsexperiment mit adulten Marisa cornuarietis Während der Experimentserie, bei der die Auswirkungen aquatischer BPA-Konzentrationen zwischen nominal 1 und UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 Abb. 2: Marisa cornuarietis. Makroskopische Aufnahmen vom Eileiter aus der Kontrolle (a) und von Superweibchen aus den BPA-Expositionsgruppen (b–c). (a) Unveränderter Eileiter mit geschlossener Eiweiß- und Kapseldrüse. (b) Vergrößerter Eileiter mit aufgeplatzter Eiweißdrüse (Pfeil). (c, d) Aufgeplatzte Eiweißdrüse, aus der Gelegemasse austritt (Pfeil). Abkürzungen: Ed, Eiweißdrüse; K, Kieme; Kd, Kapseldrüse; V, Vulva (weibliche Geschlechtsöffnung) 323 Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A Eiproduktion und daraus resultierende morphologische Missbildungen (Pathomorphosen) des Eileiters gekennzeichnet (Abb. 2b-d), die zu einer erhöhten Mortalität der Weibchen führen. In seltenen Fällen konnten auch Superweibchen gefunden werden, die zusätzliche weibliche Geschlechtsorgane ausbildeten, wie beispielsweise eine zweite Vagina (Oehlmann et al. 2000). Dagegen war die Vergrößerung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen ein regelmäßig bei allen exponierten Exemplaren zu beobachtendes Phänomen, das bereits bei der niedrigsten nominalen Testkonzentration von 1 µg BPA/l auftrat (LOEC ≤ 1 µg/l; NOEC < 1 µg/l). Originalarbeiten hervor (Abb. 2c,d) oder es sammelte sich eine aus abgestorbenen Eiern und ihren Hüllschichten bestehende (abortive) Kapselmasse im Übergangsbereich zwischen den beiden Drüsen des pallialen Eileiterabschnittes an. Das Superweibchen-Syndrom ging jedoch in einigen Fällen noch über die Hypertrophie der weiblichen Sexualdrüsen, die zu einer Vergrößerung vor allem des Volumens der Eiweiß- und Kapseldrüse führte, hinaus. Bei einigen Weibchen löste BPA, unabhängig von der eingesetzten Testkonzentration, einen Riss im pallialen Eileiterabschnitt aus, der, wie in Abb. 2b-d zu sehen ist, typischerweise im Übergangsbereich von der Eiweiß- zur Kapseldrüse auftrat. Die mittlere Inzidenz dieses Phänomens betrug bereits drei Monate nach Experimentbeginn 3,7%. Aus dem Riss trat bei mehr als der Hälfte der betroffenen Weibchen die aus den Eiern und der intrakapsulären Flüssigkeit bestehende Gelegemasse Die aus den Eileiterrissen hervortretenden Gelegemassen und die Akkumulation abortiver Geschlechtsprodukte im Eileiter ergab einen deutlichen Hinweis auf den Mechanismus, der zu diesen umfangreichen pathomorphologischen Veränderungen im Genitalsystem der Weibchen führte: BPA stimulierte in erheblichem Maße die Bildung der Geschlechtsprodukte. Entsprechend war die Zahl der in den BPA-exponierten Gruppen erfolgreich abgelaichten Eier (Abb. 3a) und Gelege (Abb. 3b) gegenüber der Kontrolle während des gesamten Versuchsverlaufs nicht nur dann signifikant erhöht (ANCOVA mit multiplem Vergleich der Proben nach Student-Newman-Keuls; p < 0,01), wenn die entsprechenden Parameter kumulativ untersucht wurden, sondern auch, wenn sie auf die Ei- und Gelegeproduktion pro Weibchen bezogen wurden (Abb. 4). Aus den Abbildungen geht hervor, dass bereits bei nominal 25 µg BPA/l ein maximaler Effekt eintrat, der durch eine weitere Konzentrationserhöhung auf 100 µg/l nicht zu steigern war. Für parallel durchgeführte Experimente mit Octylphenol ergaben sich sogar Hinwei- a b c d Abb. 3: Marisa cornuarietis. Entwicklung der kumulativen Ei- (a, c) und Gelegezahl (b, d) bei einer BPA-Exposition adulter Exemplare (a, b) und im Lebenszyklustest (c, d) im Hochkonzentrationsexperiment. Versuchsgruppen: (•) Kontrolle; (●) 1 µg BPA/l; (■) 5 µg BPA/l; (▲) 25 µg BPA/l; (+) 100 µg BPA/l 324 UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 Originalarbeiten Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A a nur ein Teil der wahrscheinlich von den Eileiterrissen betroffenen Weibchen identifiziert werden konnte. Die Mortalität war in allen BPA-exponierten Gruppen gegenüber der Kontrolle signifikant erhöht (Abb. 5). Da BPA generell eine nur sehr geringe akute Toxizität aufweist und deshalb auch in Lebensmittelverpackungen in großem Umfang eingesetzt wird (BUA 1997), ist anzunehmen, dass es sich bei den gegenüber der Kontrollgruppe zusätzlich verendeten Tieren um Weibchen handelt, die einem Oviduktriss aufwiesen. Zwar war aufgrund der rasch einsetzenden Verwesung eine Geschlechtsbestimmung bei toten Exemplaren nicht mehr möglich, doch konnte in allen BPA-Expositionsgruppen im Vergleich zur Kontrolle eine allerdings statistisch nicht signifikante Verschiebung des Geschlechterverhältnisses zugunsten der Männchen festgestellt werden (χ2-Test, p > 0,05). b 2.2 Lebenszyklusexperiment mit Marisa cornuarietis im Hochkonzentrationsbereich Die Testsubstanz BPA löste bei Konzentrationen von nominal 1 und 100 µg/l bei den Weibchen der F1-Generation des Lebens-Zyklus-Tests vergleichbare Effekte wie bei den exponierten geschlechtsreifen Tieren der Parental-Generation aus. Der Anteil der durch Eileitermissbildungen nicht mehr fortpflanzungsfähigen Weibchen war jedoch gegenüber der Parental-Generation erhöht, während die Stimulation der Ei(Abb. 3c) und Gelegebildung (Abb. 3d) in der 100 µg BPA/lGruppe weniger ausgeprägt war. Abb. 4: Marisa cornuarietis. Vergleich der pro Weibchen produzierten Ei(a) und Gelegezahlen (b) relativ zur Kontrolle im Hochkonzentrationsexperiment mit adulten Exemplaren. Da beide Parameter nicht individualisiert, sondern lediglich für die Expositionsgruppen erfasst werden konnten, können keine Standardabweichungen oder andere Variabilitätsgrößen angegeben werden Die ersten Weibchen mit Eileiterrissen konnten bereits im Alter von sechs Monaten unmittelbar nach dem Eintritt der Geschlechtsreife in einem parallel durchgeführten Octylphenol-Experiment gefunden werden (Oehlmann et al. 2000). Unter dem Einfluss von BPA wurden jedoch erst am Ende der Versuchs im Alter von 12 Monaten die ersten Apfelschnecken mit entsprechenden Missbildungen gefunden; ihre Inzidenz war mit 5,2% bei 1 µg BPA/l und 11,8% bei 100 µg/l deutlich höher als in der ersten Versuchsreihe mit der se auf eine invertiert U-förmige Konzentrations-Wirkungsbeziehung (Oehlmann et al. 2000). Am Beispiel der detaillierten Untersuchungen zu den biologischen Effekten einer TBT-Exposition bei marinen Vorderkiemerschnecken (z.B. Nucella lapillus, Ocinebrina aciculata) konnte gezeigt werden, dass dort als Folge einer Vaginalblockade auftretende Risse im Eileiter zu einer erhöhten Mortalität der Weibchen führten, so dass es beim Überschreiten artspezifischer TBT-Schwellenkonzentrationen zu einer Verschiebung des Geschlechterverhältnisses zugunsten der Männchen kommt (Gibbs et al. 1987, Oehlmann et al. 1996). Auch für Marisa cornuarietis kann entsprechend davon ausgegangen werden, dass die im Zuge der Superweibchen-Entwicklung auftretenden Eileiterrisse mit ihren großen Wundflächen und dem massiven Hämolymphverlust schnell den Tod der betroffenen Tiere verursachen. Es kann daher nicht verwundern, dass bei einer Untersuchung von 30 Tieren pro Versuchsgruppe in monatlichen Abständen UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 Abb. 5: Marisa cornuarietis. Absolute und relative Mortalität in den Expositionsgruppen des Hochkonzentrationsexperiment mit adulten Exemplaren. Die Sterne verweisen auf signifikante Unterschiede zur Kontrolle (χ2-Test): ★, p < 0,05; ★★, p < 0,01 325 Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A Parental-Generation. Wie bereits bei den adulten Marisa cornuarietis war auch in der F1-Generation die Mortalität in beiden exponierten Gruppen mit 14,8 bzw. 21,5% zwischen dem 6. und 12. Versuchsmonat gegenüber 8,6% in der Kontrolle statistisch signifikant erhöht (χ2-Test; p < 0,05). In den beiden gegenüber dem Dian exponierten Gruppen setzte die erste Laichtätigkeit im Vergleich zur Kontrolle mit einer zeitlichen Verzögerung von 18 Tagen ein (Abb. 3c, d). Danach wurden aber, wie bereits in der Parental-Generation, signifikant mehr Eier und Gelege produziert (ANCOVA mit multiplem Vergleich der Proben nach Tukey; p < 0,05); die Unterschiede zwischen den beiden BPA-Konzentrationen waren statistisch nicht signifikant. Der im Vergleich zum Experiment mit adulten Apfelschnecken abgeschwächte Effekt der höheren nominalen BPA-Konzentration ist möglicherweise die Folge einer 'Down-Regulation' der Östrogenrezeptoren. Bei zahlreichen Wirbeltieren wurde beobachtet, dass eine Dauerbehandlung mit Östrogenrezeptor-Agonisten zu einer sogenannten 'Down-Regulation' der Östrogenrezeptoren und einer parallelen 'Up-Regulation' der Androgenrezeptoren führt. Die 'Down-Regulation' kann sich beispielsweise in einer reduzierte Rezeptordichte im Gewebe und/oder einer verringerten Sensitivität der Rezeptoren manifestieren (Marquardt und Schäfer 1994). Originalarbeiten Am Versuchsende stieg in der 100 µg BPA/l-Versuchsgruppe die Imposexintensität im Vergleich zur Kontrolle statistisch signifikant an (Weir-Test für Klassengruppen, p < 0,001), während im Test mit der Parental- und auch in der F1-Generation nach 6 und 8 Monaten alle Versuchsgruppen vergleichbar hohe VDSI-Werte wie die Kontrolle aufwiesen. Die bereits erwähnte Up-Regulation der Androgenrezeptoren als Folge einer Dauerbehandlung mit hohen Konzentrationen eines Östrogenrezeptor-Agonisten stellt eine mögliche Erklärung für diese äußerliche Virilisierung der Schneckenweibchen dar, die in diesem Fall bei unveränderten endogenen Testosteronkonzentrationen, aber erhöhter Androgenrezeptordichte und/oder -sensitivität im Gewebe auftreten kann. 2.3 Niedrigkonzentrationsexperiment mit adulten Marisa cornuarietis Wie bereits im Hochkonzentrationsexperiment mit adulten Apfelschnecken konnte auch bei nominalen BPA-Konzentrationen ≤ 1 µg/l keine Imposexentwicklung festgestellt werden (Varianzanalyse und Weir-Test für Klassengruppen; p > 0,2). Bei der Betrachtung der kumulativen Ei- (Abb. 6a) und Gelegezahlen (Abb. 7a) über den gesamten Versuchs- a b c d Abb. 6: Marisa cornuarietis. Entwicklung der kumulativen Eizahl bei BPA-Exposition im Niedrigkonzentrationsexperiment mit adulten Exemplaren über die Gesamtdauer des Versuchs (a), zwischen 0-60 Tagen (b), zwischen 60-120 Tagen (c) und 120–180 Tagen Exposition (d) . Versuchsgruppen: (•) Kontrolle; (●) 50 ng BPA/l; (■) 100 ng BPA/l; (▲) 250 ng BPA/l; (+) 500 ng BPA/l, (◆) 1000 ng BPA/l (jeweils Nominalkonzentrationen) 326 UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 Originalarbeiten verlauf ergibt sich zumindest für die beiden höchsten Testkonzentrationen sowie zusätzlich für die 100 ng/l-Gruppe bezüglich der Gelegezahl eine statistisch signifikant erhöhte Produktion im Vergleich zur Kontrolle (ANCOVA mit multiplem Vergleich nach Student-Newman-Keuls; p < 0,05). Die Weibchen, die den beiden höchsten Dian-Konzentrationen ausgesetzt waren, produzierten 14% mehr Gelege und 32% mehr Eier (500 ng BPA/l) bzw. 13% mehr Gelege und 28% mehr Eier (1000 ng BPA/l) als die Kontrolltiere. Bei genauerer Analyse der Abb. 6a und 7a zeigt sich jedoch, dass innerhalb des Untersuchungszeitraums von 180 Tagen unterschiedliche Phasen des Reproduktionszyklus durchlaufen werden, was vor allem an dem Verlauf der Ei- und Gelegeproduktion in der Kontrolle deutlich wird, die für beide Parameter einen sigmoiden Verlauf aufweist. Dieser sigmoide Verlauf ist vor allem dadurch begründet, dass das zweite Drittel des Versuchs, etwa vom Tag 60–120 der Exposition, in die Hauptlaichperiode im saisonalen Fortpflanzungszyklus der Schnecken fiel. Durch die auch in der Kontrollgruppe in diesem Zeitraum maximale Produktion an Geschlechtsprodukten können daher die biologischen Effekte der BPAExposition zumindest teilweise maskiert werden. Eine die verschiedenen Phasen des Reproduktionszyklus berücksichtigende Auswertung des Verlaufes der kumulativen Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A Ei- und Gelegeproduktion ist deshalb in Abb. 6 und 7 (jeweils b-d) wiedergegeben, für die eine getrennte Darstellung der drei unterschiedlichen Phasen des Gesamtversuchs mit je 60 Tagen vorgenommen wurde. Für die ersten 60 Tage des BPA-Experiments ergab sich mit Ausnahme der 50 ng/l-Gruppe eine statistisch signifikante Steigerung der Ei- (Abb. 6b) und Gelegeproduktion (Abb. 7b) gegenüber der Kontrolle (ANCOVA mit multiplem Vergleich nach Student-Newman-Keuls; p < 0,05). Bei den höchsten nominalen BPA-Konzentration von 500 bzw. 1000 ng/l war die Gelegeproduktion im Vergleich zur Kontrolle um 104% bzw. 106% und die Eiproduktion um 160% bzw. 158% gesteigert. Dass es sich dabei um eine konzentrationsabhängige Beziehung handelt, wird vor allem in den ersten 40 Tagen des Untersuchungsintervalls deutlich; am Ende wiesen jedoch die beiden höchsten eingesetzten Konzentrationen untereinander keine Unterschiede mehr auf. Eine EC10-Berechnung auf Basis der analytisch ermittelten BPAKonzentrationen in den Versuchbecken ergibt für diesen Zeitraum einen Wert von 13,9 ng BPA/l (Tabelle 2). Während der natürlichen Hauptlaichperiode der Apfelschnecken in den folgenden beiden Monaten November und Dezember (61.–120. Tag des Versuchs) zeigt sich dagegen, dass die Laichaktivität der Kontrolltiere in diesem Zeit- a b c d Abb. 7: Marisa cornuarietis. Entwicklung der kumulativen Gelegezahl bei BPA-Exposition im Niedrigkonzentrationsexperiment mit adulten Exemplaren über die Gesamtdauer des Versuchs (a), zwischen 0-60 Tagen (b), zwischen 60-120 Tagen (c) und 120-180 Tagen Exposition (d). Versuchsgruppen: (•) Kontrolle; (●) 50 ng BPA/l; (■) 100 ng BPA/l; (▲) 250 ng BPA/l; (+) 500 ng BPA/l, (◆) 1000 ng BPA/l (jeweils Nominalkonzentrationen) UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 327 Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A Tabelle 2: Marisa cornuarietis. Vergleich der berechneten EC10- und EC50Werte für Bisphenol A mit 95%-Vertrauensintervall (in Klammern) in der Phase 1 (Versuchstag 0 bis 60) im Niedrigkonzentrationsexperiment mit adulten Apfelschnecken auf Basis der arithmetischen Mittelwerte der analytisch ermittelten BPA-Konzentrationen (vgl. Tab. 1). Alle Konzentrationen sind in ng BPA/l angegeben Parameter EC10 (95%-Vertrauensintervall) EC50 (95%-Vertrauensintervall) Eiproduktion 13,9 (12,8 – 15,0) 63,3 (62,3 – 64,3) Gelegeproduktion 14,6 (13,8 – 15,4) 59,8 (52,9 – 68,8) intervall mit Ausnahme der Eiproduktion in den 100 und 500 ng/l-Gruppen die der anderen BPA-Versuchsgruppen signifikant übertraf (Abb. 6c, 7c; ANCOVA mit multiplem Vergleich nach Student-Newman-Keuls; p < 0,05). Zwischen dem 121. und 180. Untersuchungstag (Januar und Februar) produzierten die Organismen aus den BPA-Versuchsgruppen mit Ausnahme der niedrigsten Konzentrationsgruppe von 50 ng/l schließlich wieder signifikant mehr Gelege und Eier als die Kontrolltiere (Abb. 6d, 7d; ANCOVA mit multiplem Vergleich nach Student-Newman-Keuls; p < 0,05). Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Expositionsgruppen in der letzten Phase der Untersuchung waren, wahrscheinlich auch in Folge der hohen Anzahl bereits vorher abgegebener Geschlechtsprodukte, nicht mehr konzentrationsabhängig. Parallel zu der erhöhten Laichaktivität konnten auch in den Experimenten im Niedrigkonzentrationsbereich von BPA Superweibchen mit Pathomorphosen der Eiweiß- und Kapseldrüse nachgewiesen werden. Die Missbildungen an den ableitenden weiblichen Geschlechtswegen ließen sich, wie zuvor in den Hochkonzentrationsexperimenten, unabhängig von der Höhe der eingesetzten Konzentration der beiden Originalarbeiten Chemikalien bei Tieren aus allen Expositionsgruppen, außer in der Kontrolle und der 100 ng BPA/l-Versuchsgruppe, identifizieren. Dabei waren die Inzidenzen von missgebildeten Weibchen mit 1,2% bei 50 ng/l, 0% bei 100 ng/l und 2% bei 250 ng/l geringer als in den Experimenten mit hohen BPA-Konzentrationen (Kap. 2.1 und 2.2). Für die beiden höchsten Nominalkonzentrationen von 500 bzw. 1000 ng/l wurden jedoch mit 3,1% bzw. 3,2% vergleichbare Inzidenzen dieser Pathomorphosen wie für die niedrigste Nominalkonzentration (ebenfalls 1000 ng/l) in der ersten Versuchsreihe mit adulten Apfelschnecken von 3,7% ermittelt; dies zeigt, dass sowohl die Effekte auf Ebene der Fekunditätsparameter als auch der Pathomorphosen für die vergleichbaren Expositionsszenarien der einzelnen Versuchsreihen reproduzierbar waren. 2.4 Experiment mit adulten Potamopyrgus antipodarum Während der 9-wöchigen Versuchsreihe mit dem zweiten limnischen Prosobranchier, der auch in Mitteleuropa verbreiteten Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum, konnte die massive Beeinflussung der Fekunditätsparameter durch BPA aus den Versuchen mit Marisa cornuarietis weitgehend bestätigt werden. Das Expositionsexperiment wurde während der sexuellen Ruhephase der Schnecken im Hochsommer durchgeführt, während der die mittlere Embryonenzahl im Brutraum der Weibchen sehr niedrig ist. Bereits 3 und 6 Wochen nach dem Beginn des Versuchs war die Embryonenzahl in allen exponierten Gruppen gegenüber der Kontrolle erhöht; diese Differenzen waren nach 3 Wochen nur für die 25 µg/l-Gruppe und nach 6 Wochen für die 5- und 25 µg/l-Gruppen statistisch signifikant (Kruskal-Wallis-Test mit multiplem Vergleich der Proben nach Nemenyi; p < 0,05). Es ergab sich zu beiden Zeitpunkten eine invertiert U-förmige Konzentrations-Wirkungsbeziehung, die sich auch am Versuchsende erneut einstellte (Abb. 8). Nach 9 Wochen war die mittlere Embryonenzahl im Brutraum der Weibchen, die der niedrigsten Nominalkonzentration von BPA ausgesetzt waren, kaum noch gegenüber der Kontrolle erhöht, bei 100 µg/l sogar leicht erniedrigt, während die Weibchen aus den beiden mittleren Konzentrationen (5 und 25 µg/l) eine um den Faktor 10 gegenüber der Kontrolle erhöhte Embryonenzahl aufwiesen. 2.5 Experiment mit adulten Nassarius reticulatus Abb. 8: Potamopyrgus antipodarum. Durchschnittliche Zahl der Embryonen (arithmetisches Mittel mit Standardabweichung; n = 20 pro Gruppe) in der Bruttasche der Weibchen nach 9-wöchiger Exposition gegenüber den angegebenen nominalen Bisphenol A-Konzentrationen. Die Sterne verweisen auf signifikante Unterschiede zur Kontrolle (Kruskal-Wallis-Test mit multiplem Vergleich der Proben nach Nemenyi): ★, p < 0,05 328 Die marine Netzreusenschnecke Nassarius reticulatus wurde für einen Zeitraum von 3 Monaten über das Sediment nominalen BPA-Gehalten von 10 bis 1000 µg/kg (TG) ausgesetzt, was einen umweltrelevanten Bereich abdeckt, wie die Analysenwerte von Heemken et al. (2000) für die Elbe mit 66 bis 343 µg/kg (TG) verdeutlichen. Dieser Versuch fand im Frühjahr während der Hauptreproduktionsphase von N. reticulatus statt, als auch in der Kontrolle eine maximale Fortpflanzungsaktivität festzustellen war. So wiesen bereits alle Kontrollweibchen Eizellen im Eileiter auf, so dass für diesen Parameter keine weitere Steigerung bei den BPA- UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 Originalarbeiten exponierten Tieren möglich war. Dennoch konnte bei der Netzreusenschnecke unter dem Einfluss von BPA, wie auch in einer parallel durchgeführten Versuchsreihe mit Octylphenol als zweite östrogenartig wirkende Substanz, eine konzentrationsabhängige Vergrößerung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen (Eiweiß-, Ingestions- und Kapseldrüse) im pallialen Abschnitt des Eileiters festgestellt werden. Der Komplex aus diesen drei Drüsen ist bei den Neogastropoden, zu denen N. reticulatus und Nucella lapillus gehören, für die Lagerung und Versorgung der bei der Kopulation vom Männchen übernommenen Spermien, die Produktion der perivitellinen Flüssigkeit, mit der die sich entwickelnden Embryonen u.a. ernährt werden, sowie der Gelegekapsel verantwortlich (Oehlmann et al. 1988). Aufgrund dieser weitgehend analogen Funktion zum Uterus der Säugetiere wird der entsprechende Eileiterabschnitt der Neogastropoden in älteren Arbeiten häufig ebenfalls als 'Uterus' bezeichnet. Da sich der Drüsenkomplex relativ einfach aus den Tieren herauspräparieren und anschließend wiegen lässt, wurde die Beobachtung der Drüsenvergrößerung genutzt, um – analog zum entsprechenden Testparameter bei ovarektomierten Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A Nagetieren – einen 'uterotrophen Assay' für diese Evertebraten-Spezies zu erproben. Bereits nach dem ersten Versuchsmonat waren für die höchste und nach zwei Monaten für die beiden höchsten BPA-Konzentrationen im Sediment signifikant schwerere 'Uterus'-Gewichte als in der Kontrolle festzustellen. Am Versuchsende war dann das Gewicht des Drüsenkomplexes in allen exponierten Gruppen gegenüber der Kontrolle signifikant erhöht (Abb. 9a; Kruskal-Wallis-Test mit multiplem Vergleich der Proben nach Nemenyi; p < 0,01). 2.6 Experiment mit adulten Nucella lapillus Die Versuchsreihe, bei der die Nordische Purpurschnecke Nucella lapillus aquatischen Nominalkonzentrationen von 1–100 µg BPA/l über 3 Monate ausgesetzt wurde, fand im Frühsommer unmittelbar nach dem Ende der Fortpflanzungsperiode der Tiere statt. Zu diesem Zeitpunkt sind die Eileiterdrüsen der Weibchen zwar noch vergrößert, nur ein geringer Anteil der Tiere in der Population produziert jedoch weiterhin Eier (Oehlmann 1994). Auch in diesem Experi- a b c d Abb. 9: Nassarius reticulatus (a) und Nucella lapillus (b-d). Durchschnittliches Gewicht der weiblichen Drüsen im pallialen Eileiterabschnitt (arithmetisches Mittel mit Standardabweichung; n = 12–20 pro Gruppe) nach 3-monatiger Exposition (a, b), Anteil der Weibchen mit Eizellen im Eileiter nach 2(weiße Säulen) und 3-monatiger Exposition (schraffierte Säulen) (c) und durchschnittliche Länge der Prostata der Männchen (arithmetisches Mittel mit Standardabweichung; n = 15–22 pro Gruppe) nach 3-monatiger Exposition (d) gegenüber den angegebenen nominalen Bisphenol A-Konzentrationen. Die Exposition von N. reticulatus erfolgte über das Sediment, von N. lapillus über das Wasser. Die Sterne verweisen auf signifikante Unterschiede zur Kontrolle (Kruskal-Wallis-Test mit multiplem Vergleich der Proben nach Nemenyi in (a) und (b); χ2-Test in (c); ANOVA mit multiplem Vergleich nach Student-Newman-Keuls in (d)): ★, p < 0,05; ★★, p < 0,01, ★★★, p < 0,001 UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 329 Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A ment führte BPA zur Ausbildung von Superweibchen, bei denen eine Hypertrophie der akzessorischen Sexualdrüsen im pallialen Eileiterabschnitt (Abb. 9b) und eine Stimulation der Eiproduktion (Abb. 9c) festgestellt werden konnte. Im Unterschied zu Marisa cornuarietis und in Übereinstimmung mit den beiden anderen getesteten ProsobranchierSpezies wurden jedoch keine Missbildungen am Eileiter (z.B. Risse) gefunden; entsprechend war die Mortalität in keiner der Versuchsgruppen gegenüber der Kontrolle erhöht. Dieser wesentliche Unterschied zwischen den genannten Arten ist wahrscheinlich durch die artspezifische morphologischanatomische Struktur der weiblichen Genitaltrakte bedingt, da lediglich die Apfelschnecke unter den vier untersuchten Spezies eine flaschenhalsähnliche Verengung im Eileiter aufweist, an der sich die Geschlechtsprodukte stauen können (Oehlmann et al. 1988, Schulte-Oehlmann et al. 1994). Zusätzlich ist jedoch zu berücksichtigen, dass weder Nucella lapillus noch Nassarius reticulatus Gelegekapseln produzieren und ablaichen, wenn sie aus dem Freiland in das Labor gebracht werden. Statt dessen werden die gebildeten Eier und Gelege in der Ingestionsdrüse abgebaut. Unter Freilandbedingungen würde jedoch ein Anstieg der Eiproduktion, wie er in Abb. 9c für alle Testkonzentrationen nach einer Versuchsdauer von 2 und 3 Monaten dargestellt ist, zu einer entsprechenden Mehrproduktion an Gelegekapseln mit der Gefahr einer Akkumulation abortiven Kapselmaterials im Eileiter führen. Während bei der Netzreusenschnecke BPA konzentrationsabhängig eine uterotrophe Wirkung im untersuchten Konzentrationsbereich zeigte (Abb. 9a), konnte für Nucella lapillus keine Konzentrationsabhängigkeit der Effekte auf die Weibchen festgestellt werden. Entsprechend liegt eine vergleichbare Intensität der uterotrophen Wirkung (Abb. 9b) wie auch der Stimulation der Eibildung (Abb. 9c) für alle drei berücksichtigten Nominalkonzentrationen vor. Im Unterschied zu Marisa cornuarietis zeigte die Testsubstanz negative Effekte bei männlichen Purpurschnecken, die fortpflanzungsrelevant sein können. Bereits am Ende des ersten Versuchsmonats sank der Anteil der Männchen, die reife Spermien in der Samenblase (Vesicula seminalis) gespeichert hatten, auf 64,7–75,0%, während noch alle Kontrollmännchen reife Spermien aufwiesen; diese Unterschiede sind statistisch signifikant (χ2-Test; p < 0,05). Am Ende des zweiten und dritten Monats konnten bei keinem der gegenüber dem Xenoöstrogen exponierten Männchen mehr reife Spermien in der Vesicula nachgewiesen werden, während der entsprechende Anteil in der Kontrollgruppe noch 18,8% bzw. 12,5% betrug. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass BPA eine verfrühte sexuelle Ruhephase der Männchen auslöst. Aber auch auf morphologisch-anatomischer Ebene konnten Effekte einer BPA-Exposition nachgewiesen werden, die negative Implikationen für die Fortpflanzungsfähigkeit der männlichen Purpurschnecken haben. Die durchschnittliche Länge des Penis und der Prostatadrüse war in allen Versuchsgruppen über den gesamten Verlauf des Experiments gegenüber der Kontrolle statistisch signifikant reduziert (ANOVA mit multiplem Vergleich der Proben nach 330 Originalarbeiten Student-Newman-Keuls; p < 0,05), wie in Abb. 9d am Beispiel der Prostata nach drei Monaten demonstriert; in diesem Fall konnte auch eine Konzentrationsabhängigkeit des Effekts nachgewiesen werden. Da bei der Kopulation der Penis in die Bursa copulatrix des Weibchens eingeführt wird, die sich bei den Neogastropoden im distalen Abschnitt des Eileiters befindet, ist eine gewisse Mindestgröße des Penis für eine erfolgreiche Übertragung der Spermien notwendig. Die reduzierte Ausdehnung von Penis und Prostata können daher den Fortpflanzungserfolg der Männchen im Freiland einschränken. Ein Vergleich der eigenen Ergebnisse mit Literaturdaten wird durch den Umstand erschwert, dass in bislang nur wenigen Studien mögliche hormonmimetische Effekte von BPA oder anderen als Xenoöstrogene verdächtigten Prüfsubstanzen an Wirbellosen getestet wurden. Die Ergebnisse für den Standard-Testorganismus unter den Evertebraten in der aquatischen Toxikologie, den Wasserfloh Daphnia magna, sind widersprüchlich. Zou und Fingerman (1997) ermittelten eine reduzierte Häutungsfrequenz in ihren Experimenten, doch konnten ihre Beobachtungen durch Caspers (1998) nicht bestätigt werden. Zudem zweifelt der Autor die generelle Eignung der Häutung als toxikologischen Endpunkt bei der Erfassung hormonmimetischer Wirkungen an, da es zumindest zweifelhaft sei, ob Steroidhormone eine funktionelle Rolle bei Crustaceen spielen (deFur et al. 1999). Die in der vorliegenden Untersuchung ermittelten Befunde bei den Vorderkiemerschnecken zeigen eine auffallende Ähnlichkeit zu den Effekten, die in der Studie von Andersen et al. (1999b) mit dem Copepoden Acartia tonsa gefunden wurden. Auch dieser Arthropode reagierte auf eine Exposition gegenüber 23 µg 17β-Östradiol/l oder 20 µg BPA/l mit einer Stimulation der Eiproduktion, ähnlich wie Dickkopfelritzen (Pimephales promelas), bei denen Giesy et al. (2000) unter dem Einfluss von 50 ng/l des ebenfalls als Xenoöstrogen verdächtigten Nonylphenols eine gesteigerte Produktion weiblicher Geschlechtsprodukte fanden. In diesen Fischversuchen wurde eine vergleichbar invertiert Uförmige Konzentrations-Wirkungsbeziehung gefunden wie in den eigenen Experimenten mit den Prosobranchiern. Im Gegensatz zu den wenigen Studien mit Evertebraten gibt es zahlreiche Untersuchungen zu den möglichen hormonmimetischen Effekten von BPA in in vitro-Tests und mit Wirbeltieren, wobei gerade für die in vivo-Versuche sehr widersprüchliche Ergebnisse publiziert wurden. Andersen et al. (1999a) untersuchten die östrogene Wirkung von 20 Testsubstanzen in 8 verschiedenen Kurzzeittests; BPA ergab dabei einen positiven Befund bei allen Assays in allen beteiligten Labors. Lutz und Kloas (1999) konnten eine vergleichbare Affinität der schwachen Östrogenrezeptor-Agonisten BPA und Octylphenol beim Krallenfrosch Xenopus laevis nachweisen. Wenn die gleiche Spezies während der Larvalentwicklung gegenüber niedrigen aquatischen Konzentrationen von BPA oder Octylphenol exponiert wurde, stieg der Anteil weiblicher Phänotypen unter den Adulten signifikant an (Kloas et al. 1999). In einer bisher unveröffentlichten Stu- UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 Originalarbeiten die unter veränderten Bedingungen im Labor von Astra Zeneca konnten jedoch bei BPA-exponierten X. laevis die Resultate von Kloas et al. (1999) nicht bestätigt werden (DB Pickering, pers. Mitteilung). Nach vom Saal et al. (1998) führt BPA zu einer reduzierten Spermienproduktion und nach Howdeshell et al. (1999) zu einem erhöhten postnatalen Prostatagewicht bei den männlichen Nachkommen von CF1-Mäusen, die während des 11. bis 17. Trächtigkeitstags mit einer niedrigen Dosis von 2 bzw. 2,4 µg/kg Körpergewicht behandelt wurden. Eine Nagerstudie von Ashby et al. (1999) ergab jedoch keine Hinweise auf eine Beeinflussung des Prostatagewichts. Takao et al. (1999) konnten zeigen, dass eine orale Verabreichung von BPA vor und während der Pubertät bei männlichen Mäusen zu reduzierten freien Testosteronspiegeln im Blutplasma und zu Veränderungen bei der Differenzierung des Genitalsystems führte. Laws et al. (2000) überprüften die östrogene Wirkung von BPA im Vergleich mit anderen Xenoöstrogenen unter Verwendung von Ethinylöstradiol und 17β-Östradiol als Positivkontrollen in Fütterungsexperimenten mit präpubertären und ovarektomierten geschlechtsreifen Ratten als 3-tägiger uterotropher Assay. BPA zeigte dabei in einem Dosisbereich von 100–200 mg/kg Körpergewicht östrogenartige Effekte. Bereits fünf Jahre zuvor berichteten Sharpe et al. (1995), dass die männlichen Nachkommen von Wistar-Ratten, die während der Schwangerschaft und Laktation über das Trinkwasser niedrigen BPADosierungen ausgesetzt waren, ein reduziertes Hodengewicht und eine verringerte Spermienproduktion zeigten; diese Resultate konnten in einer vergleichenden Untersuchung durch Cagen et al. (1999) nicht bestätigt werden. Aufgrund der erheblichen Humanrelevanz, die diese Untersuchungen haben, und der sich widersprechenden Ergebnisse, kam es in den Jahren 1999 und 2000 zu einem teilweise auch in der Öffentlichkeit geführten Schlagabtausch speziell zwischen den Arbeitsgruppen von Frederic vom Saal und John Ashby, der seinen Höhepunkt auf einem vom Umweltbundesamt und der FU Berlin organisierten Workshop zu Niedrigdosis-Effekten von BPA in Berlin im November 2000 fand. Praktisch zeitgleich kam ein vom U.S. EPA eingesetztes Expertengremium, das diese Untersuchungen vergleichend bewertete und dabei auch die Rohdaten hinzuzog, zu dem Schluss, dass die Studien aus beiden Labors gemäß wissenschaftlicher Kriterien durchgeführt und die gezogenen Schlussfolgerungen valide seien (Kaiser 2000); aufgetretene Unterschiede seien auf das jeweilige experimentelle Design mit unterschiedlichen Versuchstierstämmen und unterschiedlicher Phytoöstrogen-Belastung der Tiernahrung in den beteiligten Labors zurückzuführen. Bei einem Vergleich der eigenen Ergebnisse mit den angeführten Befunden an anderen Evertebraten, vor allem Acartia tonsa, aber auch mit den Wirbeltier-Resultaten, zeigt sich eine erstaunliche Übereinstimmung, speziell hinsichtlich der Stimulation der Ei- und Gelegeproduktion, der uterotrophen Wirkung und der Reduktion der Penis- und Prostatalänge sowie der Beeinflussung der männlichen Keimzellbildung bei UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A Nucella lapillus. Die ökologische Relevanz gerade auch der Wirkungen auf die Fekunditätsparameter bei den weiblichen Schnecken darf dabei nicht unterschätzt werden. Die vier untersuchten Arten weisen ein artspezifisches jahreszeitliches Maximum in der Reproduktion auf. Außerhalb dieser saisonalen Fortpflanzungsphase kommt die Reproduktion zwar nicht vollständig zum Erliegen, doch werden deutlich weniger Eier oder Embryonen gebildet. Unter dem Einfluss östrogenartig wirkender Umweltchemikalien können offensichtlich auch in diesen sexuellen Ruhephasen in erheblichem Umfang weibliche Geschlechtsprodukte gebildet werden. Dies belastet nicht nur das limitierte Energiebudget der Weibchen mit der Folge, dass in der eigentlichen Hauptfortpflanzungsphase der Spezies weniger Eier gebildet werden (vgl. Abschnitt 2.3), sondern es werden vermehrt Jungtiere zu einem Zeitpunkt produziert, zu dem die Umweltbedingungen für das Heranwachsen weniger günstig sind. Entsprechend sind die Überlebenschancen für den Nachwuchs außerhalb der eigentlichen Fortpflanzungsphase deutlich geringer. Daher liegen populationsrelevante Effekte nicht nur bei Marisa cornuarietis mit den durch BPA ausgelösten Eileitermissbildungen vor, sondern aufgrund der Stimulation der Produktion von Eiern oder Embryonen in der sexuellen Ruhephase auch bei den anderen Spezies. Die untersuchten Schneckenarten zeigten in der Regel bereits bei den niedrigsten BPA-Nominalkonzentrationen im Umgebungswasser (1 µg/l) oder im Sediment (10 µg/kg TG) Effekte, so dass in diesen Versuchen die NOEC (no observed effect concentration) nicht bestimmt werden konnte. Lediglich für Marisa cornuarietis konnte eine weitere Versuchsserie im Bereich unterhalb von 1 µg BPA/l mit einer analytischen Überprüfung der aquatischen Konzentrationen der Testsubstanz durchgeführt werden. Bei diesem Experiment ergaben sich eine LOEC von 48,3 ng/l, eine NOEC von 7,9 ng/l und eine EC10 von 13,9 ng/l für BPA, so dass eine Gefährdung von Prosobranchierpopulationen im Freiland angesichts der in der Umwelt ermittelten, teilweise deutlich höheren BPA-Konzentrationen nicht auszuschließen ist. Die Sensitivität der Prosobranchier gegenüber BPA zeigt eine erstaunliche Parallelität zu den TBT-Wirkkonzentrationen in der gleichen systematischen Gruppe. Vorderkiemerschnecken hatten sich bereits bezüglich dieser Organozinnverbindung als die sensitivste Gruppe aller bisher untersuchten Taxa des Tierreichs erwiesen. TBT wirkt hormonmimetisch, indem es den Phase I-Metabolismus des Testosterons beeinflusst (Bettin et al. 1996); insofern ist es wenig erstaunlich, dass sich die Prosobranchier auch bezüglich anderer Umwelthormone, wie im Falle des BPA, sensitiver als andere Evertebraten und die Wirbeltiere erweisen. Danksagung. Die experimentellen Arbeiten mit Marisa cornuarietis wurden durch das Umweltbundesamt Berlin im Rahmen des Forschungsprojektes 297 65001/04 gefördert. Wir danken außerdem Constanze Stark, Ulrike Schneider, Christina Schmidt und Simone Ziebart für die hervorragende technische Unterstützung bei der Versuchsdurchführung und -auswertung sowie zwei anonymen Gutachtern für die wertvollen Hinweise. 331 Östrogenartige Wirkungen von Bisphenol A Literatur Andersen HR, Andersson AM, Arnold SF, Autrup H, Barfoed M, Beresford NA, Bjerregaard P, Christiansen LB, Gissel B, Hummel R, Jorgensen EB, Korsgaard B, Le Guevel R, Leffers H, McLachlan J, Moller A, Nielsen JB, Olea N, Oles-Karasko A, Pakdel F, Pedersen KL, Perez P, Skakkebaek NE, Sonnenschein C, Soto AM, Sumpter JP, Thorpe SM, Grandjean P (1999a): Comparison of short-term estrogenicity tests for identification of hormone-disrupting chemicals. Environ Health Perspect 107 Suppl 1, 89–108 Andersen HR, Halling-Sorensen B, Kusk KO (1999b): A parameter for detecting estrogenic exposure in the copepod Acartia tonsa. 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Two critical issues concerning endocrine disruption are the existence of possible low dose effects which do not occur at high doses and the impact on the developing organism. Bisphenol A (BPA), an estrogenic chemical used in the manufacture of epoxy resins and polycarbonates, is a substance ubiquitously found in consumer products and will be the sole endocrine active compound discussed at this workshop. Studies investigating its potential adverse effects have yielded conflicting results. Alterations in the reproductive system have been observed in some investigations on BPA exposure at doses far below the current accepted NOAEL of 50 mg/kg while no effect has been seen in other studies. The aim of this workshop is to cla<rify which factors may be responsible for these conflicting results and to identify and prioritize future research strategies. This workshop will not serve as a regulatory risk assessment evaluation: http://www.bisphenol-a.de 'Endocrine Disruptors Low-Dose' North Carolina, USA 10.–12. Oktober 2000 Die wichtigen Daten der internationalen Bewertung von Bisphenol A sowie der abschließende Bericht, veröffentlicht von der US EPA, finden sich unter: http://ntp-server.niehs.nih.gov/htdocs/liason/LowDoseWebPage.html UWSF – Z Umweltchem Ökotox 13 (6) 2001 333