AUFSTEIGENDE DILATATIONEN - Zentrale Hochschulbibliothek

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Aus dem Institut für Physiologie der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. Wolfgang Jelkmann
AUFSTEIGENDE DILATATIONEN: KALIUM-KANÄLE UND
CONNEXINE VERMITTELN DIE KOORDINATION IN DER
MIKROZIRKULATION
Inauguraldissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der
Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) an der
Universität zu Lübeck
vorgelegt von
Stephanie Elisabeth Wölfle
aus München
Lübeck, 2006
Tag der mündlichen Prüfung: 19.12.2006
Vorsitzender des Prüfungsausschusses:
Prof. Dr. rer. nat. R. Hilgenfeld (Institut für Biochemie, Universität Lübeck)
1. Berichterstatter:
Prof. Dr. med. W. Jelkmann (Institut für Physiologie, Universität Lübeck)
2. Berichterstatter:
Prof. Dr. rer. nat. H. Terlau (Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Lübeck)
1. Drittgutachter:
Prof. Dr. rer. nat. M. Hecker (Institut für Physiologie, Universität Heidelberg)
2. Drittgutachter:
Prof. Dr. med. C. Wagner (Institut für Physiologie, Universität Zürich)
Meinen Eltern gewidmet
Wenn du willst, dass Menschen ein Schiff bauen,
gib ihnen nicht einen Plan oder Hammer und Nägel,
sondern entzünde in ihnen die Sehnsucht nach dem
weiten offenen Meer
Antoine de Saint-Exupéry
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG
1
1.1
Durchblutung und Kreislaufregulation
1
1.2
Aufbau der Arteriolen
3
1.2.1
Endothelzellen
3
1.2.2
Glatte Muskelzellen
3
1.3
Potential vaskulärer Zellen
4
1.4
K+-Kanäle in vaskulären Zellen
5
1.4.1
Calciumabhängige Kaliumkanäle (KCa)
6
1.4.2
Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (KIR)
9
1.4.3
Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (KV)
9
1.4.4
ATP-sensitive Kaliumkanäle (KATP)
9
1.4.5
Weitere Kalium- und Ionenkanäle
10
1.5
Gap Junctions
10
1.6
Lokale Regulation des Gefäßtonus
11
1.6.1
Myogener Tonus
12
1.6.2
Endotheliale Autakoide
12
1.6.2.1
Stickstoffmonoxid (NO)
13
1.6.2.2
Prostazyklin
13
1.6.2.3
EDHF
15
1.7
Koordination des Gefäßverhaltens: Aufsteigende Vasomotorantworten
17
1.8
Atherosklerose: Systemische endotheliale Dysfunktion
19
1.9
Ziel der Arbeit
22
2
MATERIAL UND METHODEN
24
2.1
Material
24
2.1.1
Versuchstiere
24
2.1.2
Cholesterin- und fettreiche Diät
24
2.2
Methoden
25
2.2.1
Narkose
25
2.2.2
Versuchsvorbereitung und Präparartion
25
2.2.2.1
Tracheotomie und Katheterisierung
25
2.2.2.2
Cremasterpräparation
26
2.2.3
Intravitalmikroskopie: Versuchsaufbau und Durchführung
28
2.2.4
Globale und lokale Stimulation mit Agonisten
29
2.2.5
Membranpotentialmessung
29
2.2.6
Immunfärbung
32
2.2.6.1
Immunfluoreszenz
32
2.2.6.2
Konfokale Lasermikroskopie
33
2.2.6.3
Immunhistochemie von Paraffinschnitten
34
2.2.7
Genotypisierung der Connexin40 defizienten Mäuse
35
2.2.8
Magnetofektion
38
2.2.9
Cholesterinbestimmung
41
2.2.10
Mikropipetten
41
2.3
Versuchsprotokolle
42
2.3.1
Genereller Versuchsablauf
42
2.3.2
Intermittierende Durchmesserbestimmung nach globaler Stimulation
43
2.3.3
Kontinuierliche Durchmesserbestimmung: fortgeleitete Vasomotorantworten 43
2.3.4
Blockade von vaskulären K+-Kanälen
44
2.3.5
Membranpotential vaskulärer Zellen
45
2.3.6
Magnetofektion
46
2.4
Datenauswertung
47
2.4.1
Durchmesserbestimmung
47
2.4.1.1
Berechnung bei intermittierender Durchmesseruntersuchung
47
2.4.1.2
Kontinuierliche Durchmesserbestimmung
48
2.4.1.3
Membranpotentialmesung
49
2.5
Statistik
49
3
ERGEBNISSE
50
3.1
Mechanismen lokaler und fortgeleiteter Dilatationen
50
3.1.1
Connexin40 Expression in Arteriolen des M.cremaster
50
3.1.2
Acetylcholin und KCl-induzierte Fortleitung bei endothelialer Cx40 Defizienz 53
3.1.3
Bedeutung von KCa als Effektoren lokaler und fortgeleiteter Dilatationen
56
3.1.3.1
Beteiligung von BKCa an der Auslösung und Fortleitung von Dilatationen
56
3.1.3.1.1
Ruhetonus in BKCa-defizienten Mäusen
56
3.1.3.1.2
Rolle von BKCa als Effektor von NO und cGMP induzierten Dilatationen
57
3.1.3.1.3
Beteiligung von BKCa an Dilatationen nach ACh und Adenosin
58
3.1.3.1.4
Fortleitung von ACh-Dilatationen in BKCa-defizienten Mäusen
59
3.1.3.1.5
Rolle von NO und Prostazyklin bei ACh-induzierten Dilatationen in BKCadefizienten Mäusen
3.1.3.1.6
3.1.3.2
60
BKCa als Effektor von ACh- und SNP-induzierten Dilatationen in
unterschiedlichen Mausarten
63
Beteiligung von IKCa an der Auslösung und Fortleitung von Dilatationen
65
3.1.3.2.1
Ruhetonus in IKCa-defizienten Mäusen
65
3.1.3.2.2
Effekt des IKCa-Öffners DCEBIO in Wildtypen und IKCa-defizienten Mäusen
65
3.1.3.2.3
Beteiligung von IKCa als Effektor von ACh, Adenosin und SNP Dilatationen
66
3.1.3.2.4
DCEBIO induziert fortgeleitete Dilatationen
67
3.1.3.2.5
Beteiligung von IKCa bei fortgeleiteten Dilatationen nach ACh
68
3.1.3.3
Rolle von SKCa bei der Auslösung lokaler und fortgeleiteter Dilatationen
69
3.1.3.3.1
Beteiligung von SKCa als Effektor von ACh-, Adenosin- und
SNP-Dilatationen
69
3.1.3.3.2
SKCa als Effektor fortgeleiteter ACh-Dilatationen
71
3.1.4.
Charakterisierung von Effektoren lokal induzierter Adenosin Dilatationen
72
3.1.4.1
Rolle von NO und Prostazyklin als Mediatoren von lokal induzierten
fortgeleiteten Adenosin-Dilatationen
3.1.4.2
Vergleich der Ausbreitung lokal ausgelöster Dilatationen nach
Adenosin und ACh
3.1.4.3
72
73
IKCa und BKCa als Effektoren der fortgeleiteten Dilatationen nach ACh und
Adenosin
75
3.1.4.4
KATP als Effektor von Adenosin Dilatationen
76
3.2
Verstärkungsmechanismen fortgeleiteter Dilatationen
78
3.2.1
Bupivacain zeigt die Beteiligung unterschiedliche Fortleitungsmechanismen 78
3.2.2
Selektive Blockade spannungsabhängiger Na+-Kanäle mit Mepivacain
3.2.3
Rolle von KIR bei der Fortleitung ACh, Adenosin und Bradykinin induzierter
Dilatationen
82
83
3.2.4
Rolle von KV bei der Fortleitung ACh und Adenosin induzierter Dilatationen 85
3.3
86
3.3.1
Identifizierung der vaskulären Zellen
87
3.3.2
87
3.3.3
Effekt einer lokalisierten Applikation von ACh und Adenosin auf das
Membranpotential
89
3.4
Endotheliale Funktion in hypercholesterinämischen Mausmodellen
91
3.4.1
Plasmacholesterinspiegel in LDLR- und ApoE-defizienten Mäusen
91
3.4.2
Ruhetonus in hypercholesterinämischen Mäusen
92
3.4.3
Effekt von Hypercholesterinämie auf ACh-, Adenosin- und SNP- induzierte
Dilatationen
93
3.4.4
NO als Mediator von ACh Dilatationen in hypercholesterinämischen Mäusen 95
3.4.5
Fortgeleitete Vasomotorantworten nach ACh und KCl bei
Hypercholesterinämie
97
3.4.6
Immunhistochemischer Nachweis von Connexin40 in hypercholesterinämischen Mäusen
3.5
Magnetofektion in vivo
3.5.1
Targeting der Src homology domain 2 (SH2)-Tyrosinphosphatase-1
(SHP-1): Effekt auf ACh- und SNP- induzierte Dilatationen
3.5.2.
99
101
101
Targeting des M3-Rezeptors: Effekt auf ACh, Adenosin und SNP
induzierte Dilatationen
102
4
DISKUSSION
104
4.1
Cx40 Expression und Rolle von endothelialem Cx40 bei der
Ausbreitung von Gefäßantworten
104
4.2
Bedeutung von KCa-Kanälen in der Mikrozirkulation
107
4.2.1
BKCa bei NO- und endothelabhängigen Dilatationen
107
4.2.2
IKCa und SKCa bei endothelabhängigen Dilatationen
110
4.2.3
Charakterisierung der Effektoren lokal induzierter Adenosin Dilatationen
113
4.3
115
4.4
119
4.5
120
4.6
122
5
ZUSAMMENFASSUNG
124
6
LITERATURVERZEICHNIS
126
7
ANHANG
140
7.1
Verwendete Substanzen
140
7.2
Lösungen und Puffer
142
7.3
Weitere Materialien
143
7.4
Abkürzungsverzeichnis
144
Publikationen
146
Lebenslauf
148
Danksagung
149
1
EINLEITUNG
1
Einleitung
Das Kreislaufsystem hat die Aufgabe, die Gewebe und Organe ausreichend mit Sauerstoff
und Nährstoffen zu versorgen. Hierzu ist es erforderlich, dass einerseits ein hinreichender
Perfusionsdruck (arterieller Blutdruck) aufrechterhalten wird und andererseits eine
ausreichende Gesamtstromstärke (Herzzeitvolumen) bereitgestellt wird. Sind diese beiden
Voraussetzungen gegeben, so kann die Verteilung der Stromstärke auf die einzelnen
Organe bzw. die Gewebe (Organperfusion) im Sinne einer bedarfsorientierten Durchblutung
erfolgen. Da der Sauerstoffverbrauch der Organe nicht konstant ist, sondern mit deren
Aktivität variiert, muss auch die Durchblutung angepasst werden. Hierbei sind lokale,
innerhalb des einzelnen Gefäßgebiets ablaufende Regulationsvorgänge beteiligt. Die
Zunahme der Durchblutung einzelner Organe würde zu einer Reduktion des arteriellen
Blutdrucks (Perfusionsdruck) führen, wenn zentrale Regulationsmechanismen diesem nicht
durch
eine
Zunahme
Gesamtstromstärke
des
Herzzeitvolumens
entgegenwirken
würden.
und
Somit
vermehrter
lassen
Bereitstellung
der
funktionell
zwei
sich
unterschiedliche Regulationsmechanismen des Kreislaufs voneinander abgrenzen, nämlich
erstens
lokale
Regulationsmechanismen,
die
im
Dienste
einer
adäquaten
Gewebsdurchblutung stehen und zweitens überregionale bzw. zentrale Mechanismen, die im
Dienste der Aufrechterhaltung eines adäquaten Perfusionsdrucks und des Gesamtkreislaufs
stehen. Wird etwa durch einen maximalen lokalen Bedarf in mehreren Organen (z.B. Haut
und Muskel bei körperlichen Anstrengung in großer Hitze) das Herz und seine Pumpleistung
(Gesamtstromstärke) überfordert, so muß die Anstrengung beendet werden (Erschöpfung)
bzw. die zentralen Mechanismen sind nicht in der Lage, einen Perfusionsdruck
aufrechtzuerhalten
('Kreislaufversagen').
und
In
es
der
kommt
zum
vorliegenden
Versagen
Arbeit
der
werden
Kreislaufregulation
die
lokalen
Regulationsmechanismen, die in den Arterien und Arteriolen innerhalb des Organs ablaufen,
untersucht.
1.1
Durchblutung und Kreislaufregulation
Analog zum Ohmschen Gesetz ist die Durchblutung eines Organs proportional zur
Druckdifferenz zwischen arterieller und venöser Seite sowie umgekehrt proportional zum
Strömungswiderstand. Der Strömungswiderstand ist wiederum proportional zur Gefäßlänge
und zur Viskosität, aber umgekehrt proportional zur 4. Potenz des Gefäßradius (Hagen-
EINLEITUNG
2
Poiseuille). Druck und Gefäßradius sind also die bei der Regulation variierbaren Größen. Da
sich der Blutdruck bei dynamischer Belastung jedoch nicht wesentlich ändert, ist die
Veränderung des Widerstands die bedeutende Regulationsgröße. Der größte Widerstand ist
wegen ihres Durchmessers in den kleinen Arteriolen der Mikrozirkulation lokalisiert. Da der
Radius den Widerstand mit der 4. Potenz bestimmt, führen bereits kleine Änderungen ihres
Gefäßdurchmessers zu großen Änderungen des Widerstands und der Durchblutung. Die
bedarfsorientierte, lokale Durchblutung des Organs wird also über Durchmesseränderungen
der Arteriolen geregelt. In einem arbeitenden Skelettmuskel kann die Perfusion auf das
zwanzigfache des Ruhewertes ansteigen. Die Voraussetzung für diese Zunahme ist die
Fähigkeit der Gefäße zur Erweiterung (Dilatation). Somit müssen die Arterien und Arteriolen
im Ruhezustand ausreichend tonisiert sein, um sich bei Bedarf erweitern zu können. Dieser
Kontraktionszustand wird hauptsächlich bedingt durch den im Gefäß herrschenden Druck
(s.u.). Zwar führt die lokale Dilatation von Arteriolen im stoffwechselaktiven Gebiet zu einer
Durchblutungssteigerung, ist jedoch nicht ausreichend, um eine maximale Perfusion eines
Organs zu erreichen. Der Gefäßwiderstand muß auch im weiter stromaufwärts gelegenen
arteriolären Netzwerk sinken, so dass die maximale Steigerung des Blutflusses innerhalb
des Gewebes erreicht wird. Erst diese koordinierte Dilatation von peripheren und proximalen
Arteriolen sowie zuführenden Arterien erzeugt eine bis zu zwanzigfache Steigerung, wie sie
im Skeletmuskel beobachtet werden kann (1-3). Die Mechanismen, welche einer
Koordination des Gefäßverhaltens im Netzwerk zugrunde liegen, sind Gegenstand dieser
Arbeit.
Die zentrale, überregionale Kreislaufregulation bedient sich humoraler und nervaler
Mechanismen, um einen ausreichenden Blutdruck aufrechtzuerhalten. Die im Hirnstamm
gelegenen Kreislaufzentren erhalten Informationen über den aktuellen Druck über
Afferenzen. Als Efferenz dient das vegetative Nervensystem und humorale Faktoren, welche
Herz und Blutgefäße, aber auch die Niere, beeinflußen. Die wichtigsten gefäßwirksamen
Effektoren dieses Systems sind das Noradrenalin als Überträgerstoff des Sympathikus,
welches über den α-Rezeptor eine Konstriktion vermittelt, die Katecholamine aus dem
Nebennierenmark (v.a. das Adrenalin) und als humoraler Faktor das Angiotensin II, welches
durch das endotheliale Angiotensin-konvertierende Enzym (ACE) aus Angiotensin I gebildet
wird. Letzteres ensteht aus dem Angiotensinogen, das durch Renin umgesetzt wird. Diese
Effektoren der zentralen Regulation wirken zumeist vasokonstriktorisch und können so den
peripheren Widerstand und damit den Blutdruck erhöhen. Bei Änderungen der lokalen
Durchblutung kann durch diese vasokonstriktorischen Mechanismen der Gefäßwiderstand in
anderen Regionen erhöht und so der Blutdruck im Sinne einer reflexartigen Rückkopplung
konstant gehalten werden. Die Beeinflußung des Herzens und seiner Pumpleistung ist
EINLEITUNG
3
ebenfalls von wesentlicher Bedeutung, soll aber hier nicht weiter dargestellt werden.
1.2
Aufbau der Arteriolen
Die Mikrozirkulation setzt sich aus Arteriolen, Kapillaren, Venolen sowie den Lymphgefäßen
zusammen. Die Gefäße werden nach ihrer Funktion und ihrem Durchmesser in Arteriolen (8
- 100 µm), Kapillaren (4 - 8 µm) und Venolen (8 - 50 µm) eingeteilt. In dieser Arbeit wurden
als Effektoren der Widerstandsregulation Arteriolen mit einem Durchmesser von 10 - 70 µm
untersucht. Die innerste Schicht der Arteriolen wird durch die Tunica intima gebildet, die aus
Endothel und Subendothel besteht, und durch die Membrana elastica interna von der
glattmuskulären Zellschicht (Tunica media) getrennt wird. Die Tunica adventitia stellt die
äußerste Gefäßschicht dar, besteht aus Bindegewebe und ist v.a. in größeren Gefäßen
vorhanden.
1.2.1
Endothelzellen
Das Endothel ist eine einfache Lage langgestreckter, flacher Zellen, die parallel zur
Längsachse des Gefäßes ausgerichtet sind und die Innenseite aller Gefäße auskleiden.
Diese Endothelzellen haben eine Länge von 80 - 150 µm und eine Breite von ca. 7 µm (4).
Durch seine Lokalisation zwischen den glatten Muskelzellen und dem zirkulierenden Blut
kommt dem Endothel eine besondere regulatorische Bedeutung zu. Das Endothel ist eine
semipermeable Barriere, welche den Transfer kleiner und großer Moleküle reguliert.
Endothelzellen üben sowohl metabolische als auch synthetische Funktionen aus und
beeinflussen Durchblutung, Entzündung, Gerinnung und Angiogenese in entscheidender
Weise. Einerseits setzen sie im Blut befindliche Proteine zu aktiven humoralen Substanzen
oder Enzymen um, oder sie deaktivieren solche Stoffe. Andererseits bilden sie multiple
Faktoren, setzen diese frei oder exprimieren sie als Rezeptoren oder Enzyme auf ihrer
Oberfläche. So werden Thrombozyten und Leukozyten in ihrer Funktion moduliert und vor
allem die glatten Muskelzellen in ihrem Kontraktionszustand beeinflußt, wodurch das
Endothel einen entscheidenden Einfluß bei der lokalen Durchblutungsregulation ausübt (59).
1.2.2
Glatte Muskelzellen
Die Gefäßmuskelzellen umgeben als 80 - 150 µm lange, ca. 8 µm breite, zirkulär verlaufende
Zellen das Endothel. Im Gegensatz zu Arterien, in denen die Media aus mehreren Schichten
glatter Muskelzellen besteht, findet sich in Arteriolen teilweise nur eine Schicht. Der
4
EINLEITUNG
Kontraktionszustand
von
glatten
Muskelzellen
wird
über
die
zytoplasmatische
Calciumkonzentration sowie über die Calciumsensitivität der kontraktilen Filamente reguliert
(10). Calcium bindet konzentrationsabhängig an Calmodulin und dieser Komplex aktiviert
dann die Myosinleichtketten-Kinase. Die Kinase phosphoryliert Myosin, wodurch das unter
ATP Verbrauch ablaufende Übereinandergleiten der Myosin- und Aktinfilamente und somit
die
Kontraktion
der
Zellen
ermöglicht
wird.
Eine
Absenkung
des
zytosolischen
Calciumspiegels durch die Wiederaufnahme von Calcium in das endoplasmatische
Retikulum durch eine Ca2+ ATPase (SERCA) oder durch den aktiven Transport in den
Extrazellulärraum führt zur Dissoziation des Calcium-Calmodulin-Komplexes und der
Deaktivierung der Myosinleichtketten-Kinase, so dass die Aktivität der Myosinphosphatase
im Vordergrund steht, Myosin vermehrt dephosphoryliert wird und eine Relaxation erfolgt
(11). Hierbei steht die Calciumkonzentration im Vordergrund, während die Regulation der
Aktivität der Myosinphosphatase calciumunabhängig über eine Phosphorylierung erfolgt (12,
13). Die Aktivierung der Myosinphosphatase führt dann zu vermehrter Dephosphorylierung
des Myosins und somit zu einer verringerten Effektivität der Myosinkinase und erniedrigten
Sensitivität des kontraktilen Apparates für Calcium. Während die Regulation der Aktivität der
Myosinphosphatase Gegenstand aktueller Untersuchungen ist (14), ist schon relativ lang
bekannt, dass die intrazelluläre Calciumkonzentration rezeptorvermittelt durch verschiedene
Agonisten oder auch direkt durch physikalische Stimuli erhöht werden kann. Die Quelle des
Calciums sind hierbei die internen Speicher und/oder der Extrazellulärraum.
1.3
Potential vaskulärer Zellen
Das elektrische Potential ist in vielen Zellen ein wichtiges Signal, welches der
Informationsübertragung dient oder zu einer Änderung der Zellfunktion führt. Beide
Funktionen
nutzen
auch
vaskuläre
Zellen.
Das
Ruhemembranpotential
ist
die
Potentialdifferenz zwischen Innen- und Außenseite einer Zelle im Ruhezustand. Die Na+-K+ATPase und sekundär aktive Transporte erzeugen chemische Gradienten zwischen Intraund Extrazellulärraum, die zu einem Ionenstrom und somit auch zur Ladungsverschiebung
führen.
Die
hierbei
aufgebaute
Spannung
über
die
Membran
wirkt
dem
Konzentrationsgradienten entgegen, so dass sich ein elektrochemisches Gleichgewicht
einstellt. Die elektrische Spannung, die den Konzentrationsgradienten kompensiert, ist das
Gleichgewichtspotential für das entsprechende Ion. Voraussetzung für die Einstellung des
jeweiligen Potentials ist die selektive Permeabilität der Membran für dieses Ion. Die
Membranpermeabilität für Ionen wird von spezifischen Ionenkanälen gewährleistet, da die
5
EINLEITUNG
Lipidmembran für Ionen praktisch undurchlässig ist. Das Ruhemembranpotential hängt von
den Gleichgewichtspotentialen der Ionen ab, die im Ruhezustand die Membran durchdringen
können, wobei die Permeabilität für die verschiedenen Ionen ins Verhältnis gesetzt werden
muss. Gleichgewichtspotentiale, die von den chemischen Gradienten abhängen und in
glatten Muskelzellen bestimmt wurden, betragen für K+ -84, Cl- -31, Na+ +58 und Ca2+
+150 mV (15). Unter Ruhebedingungen ist die Offenwahrscheinlichkeit von Kaliumkanälen
am höchsten und damit die Leitfähigkeit der Membran für K+ am größten, weshalb das
in
vaskulären
Zellen
maßgeblich
durch
das
Kaliumgleichgewichtspotential beeinflußt wird. In vitro wurden Ruhemembranpotentiale von
-40 bis -55 mV gemessen (15-17). Da das Ruhemembranpotential somit positiver als das
Kaliumgleichgewichtspotential ist, müssen andere Ionen beteiligt sein. Im glatten Muskel wird
vor allem auch durch eine hohe Chlorid-Leitfähigkeit eine Verschiebung des Potentials zu
positiveren Werten verursacht (15). Dieses relativ hohe Potential hat zur Folge, dass die
Erhöhung der Leitfähigkeit für K+ durch die Zunahme der Offenwahrscheinlichkeit der K+Kanäle zu einer Negativierung des Potentials (Hyperpolarisation) führt (18). Das
Membranpotential kann also durch die Aktivierung oder Deaktivierung von Ionenkanälen zu
negativeren oder positiveren Werten verschoben werden.
Durch die Änderung des Membranpotentials steuert die Aktivität der Ionenkanälen eine
Vielzahl von zellulären Prozessen. Neben dem direkten Effekt der Ionenkanäle wird das
Membranpotential auch sekundär durch die nachfolgende spannungsgesteuerte Aktivierung
weiterer Ionenkanäle verändert. Wichtige spannungsgesteuerte Ionenkanäle sind bestimmte
K+-Kanäle, die nachstehend erläutert werden, sowie spannungsgesteuerte Ca2+-Kanäle, die
im glatten Gefäßmuskel zu finden sind. Die Aktivierung dieser Kanäle in der
Plasmamembran führt zu einer Erhöhung der zytoplasmatischen Calciumkonzentration in
glatten
Muskelzellen
(19-21).
In
glatten
Muskelzellen
bestimmt
die
intrazelluläre
Calciumkonzentration den Kontraktionszustand der glatten Gefäßmuskulatur, so dass das
Membranpotential eine wesentliche Determinante des Gefäßtonus ist (22, 23).
1.4
K+-Kanäle in vaskulären Zellen
Ionenkanäle
ermöglichen
den
Transfer
von
Ionen
über
die
Lipidmembran.
Die
Durchlässigkeit der Kanäle ist zumeist spezifisch für bestimmte Ionen, kann aber auch
unspezifisch sein, wie es bespielsweise bei einigen Kationenkanälen der Fall ist. Die
transmembranären Domänen des Kanals bilden eine wässrige Pore. Eine Kanalaktivierung
6
EINLEITUNG
führt zu einer Konformationsänderung, durch die ein Tormechanismus geöffnet wird und die
Pore zugänglich wird. Die hohe Selektivität von Kaliumkanälen beruht auf einem
Selektivitätsfilter, indem innerhalb der Pore Bindungsstellen präsentiert werden, welche die
Hydrathülle der Kaliumionen nachahmen und die Hydratisierungsenergie nach Eintritt des
Ions in die Pore konservieren können. Das Kaliumion diffundiert unter Verlust seiner
Hydrathülle in den Porenkanal, während Natriumionen ausgeschlossen werden, da der
energieaufwändige Vorgang der Dehydratisierung nicht stattfinden kann (24).
In vaskulären Zellen werden unterschiedliche Kaliumkanäle exprimiert. Alle bekannten
Kaliumkanäle gehören zu einer großen Proteinfamilie, deren Unterfamilien und Subtypen
sich durch die Mechanismen der Kanalaktivierung unterscheiden. Sowohl in Endothelzellen
als auch in glatten Muskelzellen konnten spannungsabhängige Kaliumkanäle (KV), einwärts
gleichrichtende
Kaliumkanäle
(KIR),
ATP
sensitive
Kaliumkanäle
(KATP)
und
calciumabhängige Kaliumkanäle (KCa) lokalisiert werden (18). Innerhalb dieser Gruppe
werden wiederum verschiedene Subtypen aufgrund ihrer Leitfähigkeit in BKCa (große
Leitfähigkeit), IKCa (mittlere Leitfähigkeit) und SKCa (kleine Leitfähigkeit) unterschieden (15).
Die Beteiligung dieser unterschiedlichen Kanäle bei der Regulation des Gefäßtonus kann
durch den Einsatz spezifischer Blocker untersucht werden. Eine Übersicht über die
wichtigsten vaskulären Kaliumkanäle ist in Tabelle 1.1 dargestellt.
1.4.1
Calciumabhängige Kaliumkanäle (KCa)
BKCa sind aus einer porenbildenden α- und einer regulatorischen β-Untereinheit aufgebaut.
Die Kanäle können durch einen Anstieg der Calciumkonzentration und spannungsabhängig
durch eine Depolarisation aktiviert werden, wobei die β-Untereinheit überwiegend die
Calciumsensitivität
Determinanten
beeinflußt
des
spannungsabhängigen
(25).
Im
glatten
Muskel
sind
Kontraktionszustandes.
BKCa-Kanäle
Calciumkanälen
der
und
BKCa-Kanäle
sind
wichtige
funktionell
Calciumfreisetzung
aus
mit
dem
endoplasmatischen Retikulum gekoppelt. Eine Aktivierung von spannungsabhängigen
Calciumkanälen führt zur Depolarisation und zu lokalisierten Erhöhungen der Ca2+
Konzentration in einen Konzentrationsbereich (3 – 10 µmol/l), der BKCa aktivieren kann (26,
27). Diese kurzen lokalisierten Anstiege der Calciumkonzentration werden Ca2+-Sparks
genannt und kommen durch die calciumabhängige Aktivierung von Ryanodin-Rezeptoren
des endoplasmatischen Retikulums und eine Calciumfreisetzung zustande (28). Beide
Ereignisse, der Calciumeinstrom und die Calciumfreisetzung, bewirken eine Aktivierung der
BKCa (29, 30). Dies führt zu spontanen transienten Auswärtsströmen (STOCs, spontaneous
transient outward currents) und damit zur Hyperpolarisation von glatten Muskelzellen (31).
7
EINLEITUNG
Tabelle 1.1: Kaliumkanäle in vaskulären Zellen:
Die Tabelle gibt eine Übersicht über die wichtigsten Kaliumkanäle in vaskulären Zellen sowie deren
Expressionsort (EC: Endothelzelle, SMC: glatte Muskelzelle), mögliche Mechanismen der Aktivierung,
Kanalöffner und Kanalblocker. BKCa: Calciumabhängiger Kaliumkanal großer Leitfähigkeit, IKCa:
Calciumabhängiger Kaliumkanal mittlerer Leitfähigkeit, SKCa: Calciumabhängiger Kaliumkanal kleiner
Leitfähigkeit, KIR: einwärts gleichrichtender Kaliumkanal, KV: spannungsabhängiger Kaliumkanal, KATP:
ATP abhängiger Kaliumkanal, PKA: Proteinkinase A, PKG: Proteinkinase G
Kanal
EC
SMC
Aktivierung
Öffner
Blocker
BKCa
-
+
Depolarisation, Calcium,
NO, PKA, PKG
-
Iberiotoxin
Charybdotoxin
IKCa
+
-
Calcium
DCEBIO
Charybdotoxin
Tram 34
SKCa
+
-
Calcium
-
UCL1684
Apamin
KIR
+
+
Hyperpolarisation, Kalium
-
Barium
KV
+
+
Depolarisation, PKA
-
4-Aminopyridin
KATP
+
+
ATP↓, PKA, PKG
Cromakalim
Glibenclamid
Hieraus
ergibt
sich
eine
Erniedrigung
2+
der
Offenwahrscheinlichkeit
von
2+
spannungsabhängigen Ca -Kanälen, Erniedrigung des intrazellulären Ca -Spiegels bei
vorhandener Hintergrundaktivität der Ca2+-Pumpen und eine Relaxation (Abb. 1.1). BKCaÖffnung kann also als negativer Rückkopplungsmechanismus betrachtet werden, der die
Aktivität von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen inhibiert und umso aktiver wird, je stärker
der initiale Stimulus war. Bedingt durch die große Leitfähigkeit der Kanäle kann bereits die
Aktivität von wenigen Kanälen einen großen Einfluß auf das Membranpotential ausüben (32).
In Mäusen, die defizient für die β-Untereinheit des Kanals sind, war die funktionelle Kopplung
von Calciumanstieg und Hyperpolarisation gestört und die Tiere wiesen eine arterielle
Hypertonie auf (33). Die porenformende α-Untereinheit des Kanals könnte in diesen Tieren
jedoch auch in Abwesenheit der regulatorischen Untereinheit durch eine Erhöhung der
Calcium- und Spannungssensitivität durch Agonisten oder Phosphorylierung aktiviert
werden. Die Entwicklung einer für die α-Untereinheit defizienten Maus (34) ermöglichte
deshalb die Untersuchung vaskulärer Funktionen in kompletter Abwesenheit des Kanals. Die
vaskuläre Funktion in der Mikrozirkulation dieser Tiere wurde in dieser Arbeit untersucht.
Desweiteren kann die Rolle dieser Kanäle durch die spezifische Blockade mit dem
Skorpiongift Iberiotoxin untersucht werden (35).
8
EINLEITUNG
Ca2+
K+
-
K+
Hyperpolarisation
Depolarisation
Vasodilatation
+
Vasokonstriktion
K+
offene K+ Kanäle
K+
K
geschlossene K+ Kanäle
+
K+
K+
Abb. 1.1: Negative Feedback-Regulation durch KV- und BKCa-Kanälen in glatten Muskelzellen
Die Aktivierung von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen führt zu einer Erhöhung der zytosolischen
Calciumkonzentration, Depolarisation und Vasokonstriktion. KV werden durch Depolarisation aktiviert
und BKCa-Kanäle sowohl durch eine Depolarisation als auch durch den Anstieg der
Calciumkonzentration. Die Kanalaktivierung führt zum Kaliumausstrom und dadurch zur
Hyperpolarisation. Hierdurch werden die spannungsabhängigen Calciumkanäle wiederum
geschlossen und ein weiterer Anstieg der zytosolische Calciumkonzentration begrenzt. Bei
gleichzeitiger Hintergrundaktivität der Ca2+-Pumpen sinkt der Ca2+-Spiegel, was zu einer Relaxation
der glatten Muskelzellen und Vasodilatation führt. Somit stellt diese Rückkopplung eine 'Servobremse'
dar, die umso aktiver wird, je stärker der initiale Auslöser war.Modifiziert nach Jackson, 2000 (36)
Die anderen Subtypen der KCa-Kanäle (SKCa und IKCa) werden überwiegend im Endothel
exprimiert und zeichnen sich durch eine geringere Leitfähigkeit aus. Weiterhin sind diese
Kanäle im Gegensatz zu BKCa nicht spannungsabhängig aktivierbar. Die Calciumsensitivität
der Kanäle wird wahrscheinlich durch gebundenes Calmodulin vermittelt (37, 38). Abhängig
von der Spezies und dem untersuchten Gefäßbett mediieren IKCa- und/oder SKCa-Kanäle die
Hyperpolarisation von Endothelzellen, die durch verschiedene Substanzen, wie ACh,
Bradykinin und Histamin, ausgelöst werden. Somit haben diese Kanäle eine zentrale Rolle
bei Dilatationen, die durch diese endothelabhängigen Stimuli induziert werden (18, 39, 40).
Der SKCa–Kanal kann durch das Bienentoxin Apamin sowie die Verbindung UCL1684
selektiv gehemmt werden, während das Skorpiongift Charybdotoxin zwar IKCa-, aber auch
BKCa- und KV-Kanäle hemmt (41, 42).
9
EINLEITUNG
1.4.2
Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (KIR)
Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (KIR) können als Kaliumsensoren betrachtet werden,
da ihre Aktivierung durch eine moderate Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration
(6 - 15 mmol/l) erfolgen kann (15). Obwohl ihr Name einen Einwärtsstrom suggeriert, kommt
es
physiologisch
immer
zu
einem
Auswärtsstrom
von
Kaliumionen
bei
einer
Kanalaktivierung, denn die Richtung des Kaliumstroms ist nicht vom Kanal, sondern nur vom
aktuellen Membranpotential und dem chemischen Gradienten abhängig. Demzufolge führt
die Aktivierung zur Hyperpolarisation und damit zur Dilatation (43). Des weiteren werden die
Kanäle auch spannungsabhängig durch eine Hyperpolarisation aktiviert und können somit
eine initiale Hyperpolarisation, die durch die Öffnung anderer K+-Kanäle wie SKCa und IKCa
induziert wurde, verstärken. Dieser Mechanismus kann für die Ausbreitung von
Hyperpolarisationen entlang der Arteriole über Gap Junctions von Bedeutung sein (44) (s.u.).
KIR-Kanäle können konzentrationsabhängig (≤ 100µmol/l) relativ selektiv durch Bariumionen
gehemmt
werden
(32),
allerdings
hemmt
extrazelluläres
Barium
bei
höheren
Konzentrationen auch andere Kanäle (45). Da die Hemmung von KIR-Kanälen in den meisten
Präparationen eine Depolarisation und damit Konstriktion induziert, ist von einer
kontinuierlichen Kanalaktivität unter Ruhebedingungen auszugehen (32).
1.4.3
Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (KV)
Sowohl in Endothelzellen als auch in glatten Muskelzellen werden verschiedene KV-Kanäle
exprimiert. Diese Kanäle werden spannungsabhängig durch eine Depolarisation in einem
Bereich von -55 bis -35mV aktiviert (32) und spielen vermutlich, gemeinsam mit BKCaKanälen, bei der negativen Feedback-Regulation des Membranpotentials eine Rolle. Eine
Aktivierung kann jedoch auch über den cAMP/PKA-Signaltransduktionsweg erfolgen, so
dass diese Kanäle auch an Dilatationen, welche durch PGI2 und Adenosin hervorgerufen
werden, beteiligt sein können (18). Umgekehrt werden sie durch einen Anstieg der
intrazellulären Calciumkonzentration und durch Proteinkinase-C-Aktivität gehemmt. Die
pharmakologische Blockade von KV-Kanälen kann mit 4-Aminopyridin erreicht werden, wobei
dieser Inhibitor möglicherweise auch KATP-Kanäle beeinflußt und in hohen Konzentrationen
auch KCa-Kanäle hemmt (15). Die physiologische Bedeutung von KV-Kanälen in
Endothelzellen ist noch nicht geklärt, jedoch führt die Hemmung von KV Kanälen in einigen
Präparationen zu einer Konstriktion der Gefäße, was auf eine basale Aktivität hindeutet (32).
1.4.4
ATP-sensitive Kaliumkanäle (KATP)
ATP-sensitive Kaliumkanäle (KATP) sind aus einer porenbildenden (KIR6.1) und einer
regulatorischen Untereinheit (Sulfonylharnstoffrezeptor) aufgebaut. Sie werden durch die
Erhöhung der intrazellulären ATP-Konzentration inaktiviert, woraus diese Bezeichnung
10
EINLEITUNG
resultiert. Eine wichtige Rolle spielen diese Kanäle in β-Zellen des Pankreas bei der
Freisetzung von Insulin. Die Kanäle zeigen aufgrund eines zu ihrer Hemmung ausreichenden
ATP-Spiegels in vaskulären Zellen unter basalen Bedingungen in den meisten Präparationen
eine relativ geringe Aktivität (43). Die Kanalaktivität wird jedoch auch durch andere Stimuli
moduliert. So inaktiviert die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration die Kanäle.
Die Aktivierung erfolgt durch ein Absinken des ATP-Spiegels sowie durch die Proteinkinase
A und G. Diese letzten beiden Wege spielen möglicherweise eine Rolle bei der
Hyperpolarisation und Dilatation, die endogene Subsanzen wie Adenosin (46, 47), PGI2 (47)
und NO (15) durch die Aktivierung von KATP-Kanälen induzieren können. Allerdings ist die
Beteiligung dieser Kanäle bei der Dilatation durch diese Substanzen nur in wenigen
Präparationen gezeigt. Die pharmakologische Blockade erfolgt mit Sulfonylharnstoffen (z.B.
Glibenclamid). Die Kanalblockade hat jedoch in den meisten Präparationen keinen Einfluß
auf das Membranpotential oder den Tonus (32). Für diesen Kanal stehen auch Substanzen
zur Verfügung (z.B. Cromakalim), die eine selektive Öffnung ermöglichen (43).
1.4.5
Weitere Kalium- und Ionenkanäle
Eine relativ neu entdeckte Gruppe von K+-Kanälen sind die K2P-Kanäle. Die Expression von
K2P-Kanälen (two pore domain) konnte vor kurzem auch in glatten Muskelzellen gezeigt
werden (48). Möglicherweise sind sie an der Regulation des vaskulären Tonus beteiligt (49).
Die funktionelle Bedeutung der K2P-Kanal-Aktivität ist Gegenstand aktueller Untersuchungen,
jedoch aufgrund mangelnder pharmakologischer Blocker schwer zu fassen. Weiterhin
werden in vaskulären Zellen Chlorid-Kanäle und eine Reihe von unspezifischen KationenKanälen der TRP-Familie (transient reseptor potential) exprimiert. TRP-Kanäle sind an der
IP3-vermittelten Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration nach Stimulation mit
Agonisten beteiligt (50). Spezifische Blocker dieser Kanäle stehen noch nicht zur Verfügung.
1.5
Gap Junctions
Gap Junctions werden aus bis zu einigen hundert interzellulären Kanälen gebildet, welche
aus
Connexinen
aufgebaut
sind.
Hierbei
bilden
jeweils
zwei
Halbkanäle
in
gegenüberliegenden Zellmembranen eine Pore. Ein Halbkanal ist wiederum aus sechs
Connexinen zusammengesetzt (51-53). Connexine werden in nahezu allen Geweben
exprimiert. In vaskulären Zellen wurden bisher vier verschiedene Connexine (Cx) identifiziert
(Cx43, Cx40, Cx37 und Cx45), die nach ihrem Molekulargewicht benannt werden (54, 55).
Hierbei wird Cx40 und Cx37 überwiegend in Endothelzellen exprimiert, wohingegen Cx43
EINLEITUNG
11
und Cx45 vorwiegend in glatten Muskelzellen zu finden sind (56, 57). Die Kanäle sind relativ
unspezifisch durchlässig für niedermolekulare Verbindungen bis zu 1 kDa und erlauben so
die Passage von Ionen und second Messengern wie cAMP und IP3. Da durch die
interzellulären Kanäle eine Verbindung mit niedrigem elektrischen Widerstand entsteht,
können sich elektrische Impulse zwischen benachbarten Zellen elektrotonisch ausbreiten.
Gap Junctions eröffnen somit einen Kommunikationskanal zwischen den Zellen und
ermöglichen ein koordiniertes Verhalten innerhalb des Zellverbands. In der Gefäßwand
existieren zwei potentielle Leitungswege, die glattmuskuläre Zellschicht und das Endothel,
denn beide Zelltypen sind durch Gap Junctions miteinander gekoppelt (58, 59). Die
homozelluläre Kopplung der Endothelzellen bzw. der glatten Muskelzellen wurde einerseits
durch die Ausbreitung fluoreszierender Farbstoffe (58) und andererseits durch die
Ausbreitung von lokal induzierten Membranpotentialänderungen aufgezeigt (59). Weiterhin
spielt aber auch eine heterozelluläre Kopplung der beiden vaskulären Zelltypen über
myoendotheliale Gap Junctions eine Rolle (60, 61). Endotheliale Projektionen treten durch
Öffnungen in der Membrana elastica interna und bilden so die Plattform für myoendotheliale
Zellkontakte (62). Eine bidirektionale Kommunikation elektrischer Signale wurde bisher aber
nur in isolierten Gefäßen gezeigt (63, 64). Die Bedeutung des Endothels als direkte Quelle
der Membranpotentialänderung des glatten Muskels nimmt jedoch mit zunehmender Dicke
der Media ab, da das Signal bei der Ausbreitung über mehrere Zellschichten schnell
abgeschwächt wird (65).
1.6
Lokale Regulation des Gefäßtonus
Die Perfusion des Skelettmuskels schwankt in Abhängigkeit vom Bedarf erheblich und die
maximale Durchblutung kann das 20-fache des Ruhewertes erreichen. Voraussetzung für
die Dilatation der Arteriolen ist eine ausreichende Tonisierung der Gefäße im Ruhezustand,
wobei sich der Gefäßtonus aus dem Verhältnis von Ruhe- und dem maximal dilatierten
Durchmesser des Gefäßes ergibt. Dieser basale Tonus der Gefäße beruht hauptsächlich auf
einem myogenen druckabhängigen Mechanismus, der vom kontinuierlich konstriktorischen
Einfluß des Sympathikus unterstützt wird. Des weiteren führt die Freisetzung von
vasoaktiven Substanzen aus dem Endothel zu einer Änderung des Gefäßtonus und auch
metabolische Faktoren können hier einen Einfluß ausüben.
1.6.1
Myogener Tonus
Arteriolen weisen einen spontanen Kontraktionszustand auf, der mit dem transmuralen Druck
12
EINLEITUNG
zunimmt. Bayliss postulierte erstmals 1902, dass der basale Gefäßtonus maßgeblich durch
den intravaskulären Druck determiniert wird (66). Diese druckinduzierte Konstriktion wird
durch glatte Muskelzellen erzeugt und ist in Abwesenheit von nervalen oder endokrinen
Stimuli und nach Endothelentfernung an isolierten Gefäßen zu beobachten, weshalb sie als
myogenen Ursprungs identifiziert wurde (67, 68). Allerdings wird die myogene Antwort durch
nervale oder endokrine Stimuli modifiziert (69-72). Auch in vivo kann beobachtet werden,
dass sich Änderungen des transmuralen Drucks auf den Kontraktionszustand der Gefäße
auswirken, denn eine Drucksenkung führt zur Dilatation und eine Drucksteigerung zur
Konstriktion. Die druckinduzierte Dehnung der Zellen bewirkt eine Depolarisation der
Zellmembran
Calciumkanälen,
mit
nachfolgender
einem
Aktivierung
Calcium-Einstrom,
der
von
L–Typ-spannungsabhängigen
Erhöhung
der
zytoplasmatischen
Calciumkonzentration und einer calciumabhängigen Konstriktion. Der initial aktivierte
Mechanosensor, der die Dehnung detektiert, ist jedoch weiterhin umstritten, könnte aber
möglicherweise ein dehnungsabhängiger Kationenkanal sein (68). Die physiologische
Bedeutung des myogenen Tonus einerseits ist die Erzeugung des basalen Tonus als
Voraussetzung für die Auslösung einer Dilatation und der myogenen Antwort andererseits
die Konstanthaltung des Blutflusses und des kapillaren Filtrationsdrucks im Sinne einer
Autoregulation bei Änderungen des Blutdrucks.
1.6.2
Endotheliale Autakoide
Das Endothel spielt bei der lokalen Regulation der Durchblutung eine entscheidende Rolle.
Durch die Freisetzung vasoaktiver Substanzen, die in unmittelbarer Umgebung ihrer Bildung
aktiv werden und daher Autakoide genannt werden, wird eine dilatierende oder
konstriktorische Wirkung erzielt. Die Freisetzung der Autakoide erfolgt kontinuierlich, kann
jedoch durch mechanische Stimulation, wie die durch den Blutfluß auf das Endothel
einwirkende Wandschubspannung oder durch pulsatile Druckschwankungen, sowie nach
Stimulation durch Agonisten gesteigert werden. Zu den vasodilatatorisch wirksamen
Autakoiden werden Stickstoffmonoxid (NO), Prostazyklin (PGI2) und ein weiterer Faktor, der
unabhängig von NO und Prostazyklin zur Hyperpolarisation von glatten Muskelzellen führt
und
deshalb
endothelabhängiger
hyperpolarisierender
Faktor
(Endothelium-derived
hyperpolarizing factor, EDHF) genannt wird, gerechnet. Im folgenden werden die auch in der
Abbildung 1.2 dargestellten Mechanismen der endothelialen Dilatation weiter ausgeführt.
1.6.2.1 Stickstoffmonoxid (NO)
1980 entdeckten Furchgott und Zawadzki, dass Acetylcholin seine vasodilatatorische
Wirkung nur an Gefäßen mit intaktem Endothel entfalten konnte (5). Sie postulierten daher
13
EINLEITUNG
einen vom Endothel gebildeten Faktor (Endothelium-derived relaxing factor, EDRF). Diese
initialen Beobachtungen wurden zum Begriff der endothelabhängigen Dilatation. Wenig
später wurde EDRF von zwei Arbeitsgruppen als Stickstoffmonoxid (NO) identifiziert (73, 74).
NO wird aus der Aminosäure L-Arginin durch NO-Synthasen unter Bildung von L-Citrullin
gebildet (75). Die Aktivität der endothelialen NO-Synthase (eNOS) wird durch den
intrazellularen Ca2+-Spiegel kontrolliert. Eine durch Agonisten induzierte Erhöhung der
intrazellularem Ca2+-Konzentration führt nach Bildung des Ca2+-Calmodulin-Komplexes zur
Konformationsänderung der eNOS, die das Enzym in seine aktive Form überführt (76).
Neben der eNOS ist eine weitere Isoform der NO-Synthase im Endothel identifiziert worden,
die durch Entzündungen auch im Endothel induziert wird (induzierbare NOS, iNOS) (76). Im
Gegensatz dazu ist eNOS ein konstitutiv exprimiertes Enzym, dessen Expressionniveau aber
Regulationen unterliegt (77, 78). NO diffundiert in die Gefäßmuskelzellen und aktiviert dort
die
lösliche
Guanylatcyclase,
welche
aus
Guanosintriphosphat
das
zyklisches
Guanosinmonophosphat (cGMP) bildet. Die so ausgelöste Aktivierung der Proteinkinase G
führt
über
unterschiedliche
Mechanismen
zur
Erniedrigung
der
zytosolischen
Calciumkonzentration und damit zur Relaxation (79). Zumindest partiell induziert NO in
einigen Gefäßpräparationen jedoch auch eine Dilatation durch eine Hyperpolarisation glatter
Muskelzellen. Verschiedene Kaliumkanäle (BKCa, KIR, KATP) können durch NO aktiviert
werden, wobei dies entweder direkt (80) oder indirekt über einen cGMP abhängigen Weg
erfolgt (81, 82).
1.6.2.2 Prostazyklin
Die membranständige, calciumabhängige Phospholipase A2 spaltet aus Phospholipiden der
Zellmembran Arachidonsäure ab. Dies ist das Substrat der Cyclooxygenase, welche
zunächst Prostaglandin H bildet. Aus dieser Vorstufe entstehen eine Reihe weiterer
Eicosanoide mit unterschiedlichen Eigenschaften, wobei der bedeutendste Vasodilatator das
Prostazyklin (Prostaglandin I2, PGI2) ist. Die Prostazyklin induzierte Dilatation wurde erstmals
1976 beschrieben (83). PGI2 führt rezeptorvermittelt zu einer Aktivierung der Adenylatcyclase
und somit zu einem Anstieg der cAMP Spiegel im glatten Muskel, welches letztlich nach
Aktivierung der Proteinkinase A ein Absinken der intrazellulären Calciumkonzentration und
eine Relaxation zur Folge hat (84). Allerdings kann die Erhöhung des cAMP Spiegels
ebenfalls eine Aktivierung von KATP-Kanälen oder BKCa-Kanälen bewirken (38). So kann auch
beim PGI2 eine Hyperpolarisation der Zellen an der Relaxation beteiligt sein.
14
EINLEITUNG
Ado
ACh, Bk
K+
TRP
M3 ACh, B2
P1
PLC
[Ca2+↑]
?
IP3
Ca2+
Ca2+
KCa
ER
?
PLA2
AA
CYP450
COX
eNOS
PGI2
NO
AC
GC
cAMP ↑
cGMP ↑
EDHF
EC
Ado
P1
KATP
K+
EETs
BKCa
K+
KATP
K+
EDHF
SMC
BKCa
K+
BKCa
K+
HYPERPOLARISATION
RELAXATION
Abb. 1.2: Mechanismen von Agonist induzierten rezeptorvermittelten Hyperpolarisationen
Verschiedene Agonisten können rezeptorvermittelt eine Hyperpolarisation glatter Muskelzellen
induzieren. Dies kann auf endothelabhängigen oder endothelunabhängigen Mechanismen beruhen.
ACh: Acetylcholin; Bk: Bradykinin; Ado: Adenosin; M3: muskarinischer ACh Rezeptor; B2:
Bradykininrezeptor; P1: Purinerger-(Adenosin-)Rezeptor; PLC: Phospholipase C; IP3: Inositoltriphosphat; ER: Endoplasmatisches Retikulum; PLA2: Phospholipase A2; AA: Arachidonsäure;
CYP450: CytochromP450 Monooxygenase; COX Cyclooxygenase; eNOS: endotheliale NO-Synthase;
EDHF: endothelium derived hyperpolarizing factor; EET: Epoxyeicosatriensäure; PGI2: Prostazyklin;
NO: Stickstoffmonoxid; AC: Adenylatcyclase; GC: Guanylatcyclase; cAMP: zyklisches
Adenosinmonophosphat; cGMP: zyklisches Guanosinmonophosphat; KATP: ATP abhängiger
Kaliumkanal; KCa: Calciumabhängiger Kaliumkanal BKCa: Calciumabhängiger Kaliumkanal großer
Leitfähigkeit; TRP: transient receptor potential, unspezifischer Ca2+-Kanal
EINLEITUNG
15
1.6.2.3 EDHF
Die Beobachtung, dass endothelabhängige Dilatationen auch nach effektiver Hemmung der
NO- und Prostazyklinsynthese persistierten, führte zu dem Schluss, dass ein weiterer
Mechanismus beteiligt sei (85, 86). Dieser dritte, endothelabhängige Mechanismus geht mit
der Hyperpolarisation der glatten Muskelzellen einher und wurde zunächst in Arterien vom
Schwein, Meerschweinchen und Hund nach Stimulation mit ACh oder Bradykinin
beschrieben (87, 88, 88). Die Dilatation wurde einem nicht identifizierten endothelialen
Faktor, dem EDHF (endothelium-derived hyperpolarising factor) zugeschrieben (89). EDHF
mediierte Dilatationen wurden an vielen Gefäßpräparationen in verschiedenen Spezies und
auch an menschlichen Präparaten gezeigt. Die Identität des EDHF erwies sich jedoch als
heterogen und es wurden unterschiedliche Substanzen als EDHF vorgeschlagen bzw.
identifiziert. Das gemeinsame Merkmal von EDHF-vermittelten Dilatationen ist die
Endothelabhängigkeit, die Unabhängigkeit von NO bzw. Prostazyklin sowie die begleitende
Hyperpolarisation glatter Muskelzellen. EDHF-vermittelte Antworten werden jedoch nicht in
allen Präparationen beobachtet und die Bedeutung des EDHF nimmt mit abnehmender
Gefäßgröße zu (90).
Die endothelabhängige Hyperpolarisation (EDH) glatter Muskelzellen beruht zunächst auf
der Agonist-induzierten Hyperpolarisation des Endothels. Die Aktivierung endothelialer
calciumabhängiger Kalium-Kanäle (KCa) konnte als zentrales Ereignis der EDH identifiziert
werden, da die Blockade calciumabhängiger Kaliumkanäle die Hyperpolarisation und damit
Relaxation des glatten Muskels verhindert (91-93). Die nachfolgende Hyperpolarisation des
glatten Muskels kann über die Aktivität eines diffusiblen Faktors (EDHF) vermittelt werden
oder aber die Hyperpolarisation kann auch unabhängig von einem Faktor durch direkten
Ladungstransfer über myoendotheliale Gap Junctions erfolgen. Die wichtigsten beteiligten
Mechanismen werden im Folgenden näher erläutert und sind in der Abbildung 1.3
zusammengefasst.
Kalium
Die Öffnung endothelialer KCa führt zu einem Efflux von Kaliumionen und damit zu erhöhten
Kaliumkonzentrationen im interstitiellen Raum. Solche lokalisierten Erhöhungen der
Kaliumkonzentration können eine Aktivierung von einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen
(KIR) sowie die Aktivierung der Na+/K+-ATPase auf glatten Muskelzellen zur Folge haben.
Beide Mechanismen führen zu einer Hyperpolarisation des glatten Muskels, die zum einen
auf dem Kaliumaustrom über die Öffnung von KIR-Kanälen, zum anderen auf einer
Aktivitätssteigerung der elektrogenen Na+/K+-ATPase basiert, welche 3 Na+ im Austausch
gegen 2 K+ aus der Zelle transportiert. In einigen Präparationen (Arterien des
EINLEITUNG
16
Mesenterialgebiets) konnte durch die Hemmung der Na+/K+-ATPase und des KIR gezeigt
werden, dass Kaliumionen als EDHF zu identifizieren sind (94-96). Die Blockade von KIR mit
Barium und der Na+/K+-ATPase mit Ouabain führte aber in vielen anderen Gefäßen nicht zu
einer Hemmung der EDHF-vermittelten Dilatation.
Metabolite der Arachidonsäure
Epoxyeicosatrieensäuren (EET), die von der Cytochrom P450-Monooxygenase gebildet
werden, sind besonders in Gefäßen des Koronargebiets und in einigen Spezies auch des
Skeletmuskels an endothelabhängigen Hyperpolarisationen beteiligt (97-100). EET können
eine Hyperpolarisation durch die Aktivierung von BKCa-Kanälen in glatten Muskelzellen
induzieren, möglicherweise nach Bindung an einen spezifischen, membranständigen
Rezeptor (101-103). Des weiteren können EET auch die endotheliale Hyperpolarisation
durch eine Erhöhung der endothelialen Calciumkonzentration fördern und dies erhöht dann
wiederum die Offenwahrscheinlichkeit von KCa (104, 105). EET haben somit evtl. in einigen
Gefäßen eine EDHF-Funktion, während sie in anderen Gebieten die Funktion eines
interendothelialen Mediators und Verstärkers einnehmen oder aber auch bedeutungslos
sind.
Myoendotheliale Gap Junctions
Die heterozelluläre Kopplung von Endothelzellen und glatten Muskelzellen über Gap
Junctions könnte die direkte elektrische Kopplung dieser Zellen erlauben. Die endotheliale
Hyperpolarisation würde sich so direkt auf den glatten Muskel ausbreiten. An isolierten
Gefäßen konnte gezeigt werden, dass eine Hyperpolarisation, die entweder durch
Stimulation mit ACh oder durch direkte Strominjektion induziert wurde, in Endothelzellen und
glatten Muskelzellen simultan zu beobachten war. Dabei war der zeitliche Verlauf der
Potentialänderung in beiden Zelltypen identisch (63, 106). Zusätzlich führte die Blockade von
Gap Junctions in vitro zu einer Hemmung der glattmuskulären Hyperpolarisationen, ohne die
endotheliale Hyperpolarisation zu beeinflussen (62, 107). Dennoch ist die Bedeutung dieses
Mechanismus umstritten, und es werden Unterschiede zwischen in vitro und in vivo
Präparationen sowie zwischen unterschiedlich großen Gefäßen in Bezug auf die Relevanz
der heterozellulären Kopplung diskutiert.
17
EINLEITUNG
Agonist
Rezeptor
eNOS
+
EC
[Ca2+↑]
Arachidonsäure ↑
COX / LOX
+
HYPERPOLARISATION
SKCa
Apamin
MEGJ
+
PLA2
+
IKCa
[K+] ↑
PGs, LTs
Chtx
CYP450EPOX
EET
+
+
Ba2+
Ouabain
KIR
3Na+ 2K+
Ibtx
BKCa
HYPERPOLARISATION
SMC
RELAXATION
Abb. 1.3: Mechanismen der EDHF vermittelten Dilatation
Unterschiedliche Mechanismen können zu einer EDHF vermittelten Dilatation führen, verschiedene
diffusible Faktoren oder einfache Ladungsübertragung von Endothelzellen auf glatte Muskelzellen sind
hierbei identifiziert worden. EDHF induzierte Dilatationen werden initial durch einen Agonist
induzierten endothelialen Calciumanstieg ausgelöst. Dies führt zu einer Aktivierung der Phospholipase
A2 (PLA2) und der Aktivierung von calciumabhängigen Kaliumkanälen von kleiner (SKCa) und mittlerer
Leitfähigkeit (IKCa). Die endotheliale Hyperpolarisation könnte sich dann entweder passiv über
myoendotheliale Gap Junctions (MEGJ) ausbreiten, oder der Kaliumausstrom könnte durch
Aktivierung von Na+/K+ ATPase und KIR-Kanälen zu einer glattmuskulären Hyperpolarisation führen.
Weiterhin könnte die durch PLA2 freigesetzte Arachidonsäure, die durch Cyclooxygenase (COX) und
Lipoxygenase (LOX) zu Prostaglandinen und Leukotrienen umgesetzt wird, auch durch Cytochrom
P450 Monooxygenasen (CYP450) in Epoxyeicosatriensäuren (EET) umgesetzt werden, die BKCa-Kanäle
auf glatten Muskelzellen aktivieren könnten. Chtx: Charybdotoxin, Ibtx: Iberiotoxin
1.7
Koordination des Gefäßverhaltens: Aufsteigende Vasomotorantworten
Arteriolen besitzen für die Regulation der Durchblutung besondere Bedeutung, da in diesem
Gebiet 50-70% des gesamten Widerstands ruht. Daher werden diese Gefäße auch als
Widerstandsgefäße bezeichnet. Da sich der Widerstand in einem Gefäßgebiet jedoch aus
der Summe der hintereinander geschalteten Widerstände der arteriellen Gefäße ergibt, kann
eine maximale Dilatation der distalen Widerstandsgefäße den Gesamtwiderstand nur partiell
senken. Der flußlimitierende Widerstand verlagert sich in die weiter stromaufwärts gelegenen
Regionen. Dies verdeutlicht den Stellenwert einer koordinierten Dilatation von Arteriolen und
18
EINLEITUNG
stromaufwärtsgelegenen,
zuführenden
Gefäßen,
denn
nur
nach
Dilatation
der
vorangeschalteten Gefäße kann eine maximale Flußerhöhung erfolgen.
Die Bedeutung dieser Koordination in vivo wird durch eine Reihe von Studien
veranschaulicht. Experimentell kann die Fortleitung von Vasomotorantworten mittels
Intravitalmikroskopie untersucht werden, indem Arteriolen durch eine streng lokalisierte
Applikation von Agonisten über eine Mikropipette in unmittelbarer Nähe des Gefäßes oder
durch Strominjektion in Gefäßzellen stimuliert werden. Die Gefäßantwort bleibt nicht auf den
Ort der Stimulation beschränkt, sondern breitet sich rasch in beide Richtungen entlang des
Gefäßes aus, wobei dies je nach Spezies und Agonist in Arteriolen mit ~30 µm Durchmesser
über Entfernungen bis zu mehreren Millimetern erfolgen kann. Verschiedene Agonisten
können solche sich ausbreitenden Gefäßantworten, die Konstriktionen oder Dilatationen sein
können, auslösen. Allerdings induzieren nicht alle Agonisten eine Fortleitung und auch
hierbei existieren Speziesunterschiede. Dennoch wurden fortgeleitete Dilatationen im
Skelettmuskel von Hamstern und Mäusen (108-110) sowie in mesenterialen, cerebralen,
renalen und koronaren Arteriolen beobachtet (44, 111).
In den letzten Jahren wurde die flußinduzierte Dilatation in Arterien und Arteriolen als ein
möglicher Mechanismus von aufsteigenden koordinierten Dilatationen identifiziert (112). Die
Abhängigkeit der Gefäßwandbewegung von der Flußgeschwindigkeit wurde bereits 1921 von
Thoma und 1932 von Schretzenmayr an der Femoralarterie beschrieben (113). Hierbei ist
ein schubspannungsinduzierte endotheliale NO-Freisetzung entscheidend an der Dilatation
beteiligt (114). Eine metabolisch induzierte distale Dilatation führt zu einer lokalen
Widerstandssenkung und damit zu einer Flußsteigerung in stromaufwärtsgelegenen
Gefäßabschnitten. Die so induzierte NO-Freisetzung und Dilatation könnte zur Koordination
des Gefäßverhaltens beitragen und ist auch in Arteriolen von Bedeutung (8). Die
flußinduzierte Dilatation ist jedoch vergleichsweise langsam, die Dilatationen sind erst nach
10 - 40 Sekunden zu beobachten (114, 115). Im Gegensatz dazu ist die Ausbreitung
fortgeleiteter Dilatationen mit weniger als einer Sekunde nahezu instantan und eine
Zunahme der Wandschubspannung an entfernten Positionen nach lokaler Stimulation wurde
nicht beobachtet (99, 116). Da die Arteriolen des Cremastermuskels von einem dichten
Netzwerk perivaskulärer Nerven umgeben werden (109), könnte nervale Aktivität an der
Koordination der Gefäßantwort beteiligt sein. Die Blockade schneller Natriumkanäle mit
Tetrodotoxin zeigt jedoch, dass sowohl die Ausbreitung von lokal initiierten Konstriktionen als
auch die Ausbreitung von Dilatationen nach lokaler Stimulation mit Acetylcholin hierdurch
unbeeinflußt blieben (109, 116). Vor kurzem wurde jedoch postuliert, dass die Ausbreitung
19
EINLEITUNG
von Dilatationen nach Acetylcholin durch tetrodotoxininsensitive sensorische Nervenfasern
vermittelt werden könnte (117).
Die Substanzen, die eine fortgeleitete Vasomotorantwort auslösen, haben gemeinsam, dass
sie eine lokale Membranpotentialänderung in den vaskulären Zellen auslösen (58, 110, 118120). Die schnelle Ausbreitung des Signals führte zu der Hypothese, dass den fortgeleiteten
Antworten
eine
elektrotonische
Ausbreitung
einer
lokal
initiierten
Änderung
des
Membranpotentials zugrunde liegt. Tatsächlich wurden Membranpotentialänderungen auch
an entfernten Positionen beobachtet, bei Dilatationen eine vorangehende Hyperpolarisation,
bei Konstriktionen eine Depolarisation (22, 120). Die molekulare Grundlage für die
elektrotonische Ausbreitung bilden Gap Junctions und deren Blockade zeigte auch ihre
Bedeutung bei fortgeleiteten Gefäßantworten und der Koordination des Gefäßverhaltens (58,
121). Von den vaskulär exprimierten Connexinen ist das Cx40 von besonderer Bedeutung,
da die Ausbreitung von lokal induzierten Dilatationen in Cx40-defizienten Mäusen
abgeschwächt ist (110). Wie erwähnt, erstreckt sich die Ausbreitung von Gefäßantworten in
vivo über sehr große Strecken und besonders Dilatationen überbrücken große Distanzen.
Sie sind deutlich größer als bei passiver elektrotonische Signalausbreitung zu erwarten ist (3,
122). Dies legt die Vermutung nahe, dass ein aktiver Mechanismus beteiligt ist, welcher das
Signal entlang der Arteriole regeneriert (123). Zusammengefaßt zeigt sich, dass fortgeleitete
Dilatationen von besonderer Bedeutung sein können, ihre Mechanismen aber noch
unvollständig verstanden sind. In dieser Arbeit steht die Untersuchung von fortgeleiteten
Dilatationen und ihrer Mechanismen im Vordergrund.
1.8
Atherosklerose: Systemische endotheliale Dysfunktion
Hypercholesterinämie gehört zu den Hauptrisikofaktoren, welche die Entwicklung von
Atherosklerose
und
Herzinfarkt
fördern.
Physiologisches
Ziel
des
endogenen
Lipidstoffwechsels ist der Transport von Nahrungslipiden in die Leber und nachfolgender
Versorgung der peripheren Gewebe mit Cholesterin und Lipiden. Cholesterin und
Triacylglyceride werden im Körper mit Hilfe von Lipoproteinen transportiert. Die
Proteinkomponenten dienen dabei der Solubilisierung der hydrophoben Lipide. Lipoproteine
bestehen im Kern aus hydrophoben Lipiden, die von einer Hülle aus polaren Lipiden und
Apoproteinen
umgeben
werden.
Die
Lipoproteine
werden
nach
ihrer
Dichte
in
Chylomikronen, very low density lipoproteins (VLDL), intermediate density lipoproteins (IDL),
low density lipoproteins (LDL) und high density lipoproteins (HDL) klassifiziert. Besonders die
20
EINLEITUNG
LDL-Fraktion ist als proatherogen einzustufen.
Mäuse
sind
sehr
resistent
gegen
atherosklerotische
Veränderungen,
da
übliche
Cholesterinspiegel von 2.5 mmol/l überwiegend in der antiatherogenen HDL-Fraktion
vorliegen. Die Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen Diät führt in Mäusen jedoch
zu einer Verdoppelung bis Verdreifachung der Cholesterinspiegel, wobei die größte Menge
dann nicht in der HDL-Fraktion zu finden ist. Einige Mausarten (z.B. C57BL/6) entwickeln
nach mehreren Monaten Diät Läsionen vom fatty-streak-Typ, während andere Mausarten
keine Läsionen entwickeln. Auf der Suche nach in vivo Modellen, die den Krankheitsverlauf
im Menschen widerspiegeln, gelang es 1992 zwei Arbeitsgruppen eine ApoE-defiziente
Maus (ApoE-/-) zu generieren (124, 125). ApoE wird überwiegend in der Leber synthetisiert
und ist ein Oberflächenbestandteil von Lipoproteinen. Als Ligand von Lipoproteinrezeptoren
ist ApoE für die Erkennung und Clearance von VLDL-und Chylomikronen-Remnants durch
Lipoprotein-Rezeptoren von großer Bedeutung, weshalb ApoE-/- Tiere eine verzögerte
Lipoprotein-Clearance und erhöhte Plasmacholesterinspiegel haben. Durch die gezielte
Ausschaltung des LDL-Rezeptors wurde ein weiteres proatherogenes Modell in der Maus
erzeugt
(126).
Der
LDL-Rezeptor
ist
auf
Zelloberflächen
lokalisiert
und
erkennt
Apolipoprotein B auf LDL und ApoE auf IDL. LDL-Rezeptor-defiziente Mäuse (LDLR-/-)
haben infolgedessen hohe Plasmaspiegel dieser proatherogenen Lipide (126). Generell
entwickeln ApoE-defiziente Mäuse gravierendere Läsionen als LDLR-/- Tiere. Die
zusätzliche Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen Diät führt in beiden Modellen zu
einer
weiteren
Erhöhung
der
Cholesterinspiegel
und
einer
Progresssion
der
atherosklerotischen Vorgänge.
Die endotheliale Dysfunktion ist ein Begriff, der am ehesten eine systemische Erkrankung
widerspiegelt, und sich durch verminderte endothelabhängige Gefäßdilatationen bis hin zum
Auftreten einer paradoxen Vasokonstriktion auszeichnet. Dies beruht vermutlich auf einer
verminderten Bioverfügbarkeit von dilatierenden Autakoiden und gleichzeitig gesteigerter
Bildung von Vasokonstriktoren (127). Die Auswirkung von Hypercholesterinämie auf die
endotheliale Funktion in großen Leitungsgefäßen ist mittlerweile gut untersucht. NOmediierte, endothelabhängige Dilatationen sind in großen Leitungsgefäßen beeinträchtigt,
wie es in der Aorta (128-131), in Carotiden (132, 133) und Mesenterialarterien (134) gezeigt
wurde. Die Beteiligung der unterschiedlichen endothelialen Mediatoren (NO, Prostazyklin
und EDHF) bei der endothelabhängigen Dilatation ist jedoch in Abhängigkeit von Spezies,
Gefäßbett und vor allem Gefäßgröße unterschiedlich gewichtet. So ist EDHF der
Hauptmediator von ACh-induzierten Dilatationen in der Mikrozirkulation der Maus,
wohingegen die ACh-Dilatation in großen Arterien der Maus überwiegend von einer NO-
21
EINLEITUNG
Freisetzung abhängt (135). Der Effekt von Hypercholesterinämie auf endothelabhängige
Dilatationen in der Mikrozirkulation ist jedoch kaum untersucht, bedingt auch durch den
Befund, dass in Widerstandsgefäßen keine atherosklerotische Veränderungen in der
Gefäßwand beobachtet werden (136). Interessanterweise beeinflussen aber Änderungen
des
Cholesteringehalts
der
Plasmamembran
die
Offenwahrscheinlichkeit
von
calciumabhängigen Kaliumkanälen (KCa) (80). In Hasen führte Hypercholesterinämie zu einer
Verschiebung der Bedeutung von Autakoiden bei Dilatationen von NO zu NO-unabhängigen
Mechanismen. Die NO-unabhängigen Dilatationen wurden durch Aktivierung von KCa
vermittelt und die Gefäßantwort war in hypercholesterinämischen Tieren trotz einer
vergleichsweise erhöhten Bedeutung dieses EDHF-Mechanismus abgeschwächt (137). Auch
in menschlichen Arterien waren EDHF-Dilatationen bei Hypercholesterinämie deutlich
reduziert (138). Somit kann Hypercholesterinämie sowohl durch Beeinträchtigung von NOabhängigen als auch von NO-unabhängigen Mechanismen zur endothelialen Dysfunktion in
großen Arterien führen.
Hypercholesterinämie beeinflußt nicht nur die Aktivität, sondern auch die Expression von
Proteinen in der Gefäßwand. Interessanterweise ist auch die Expression von Cx40 und Cx37
in Aorten von ApoE-defizienten Mäusen reduziert (139). Dies war nicht nur in Gebieten mit
atherosklerotischen Veränderungen der Fall, sondern auch in morphologisch normal
erscheinenden Arealen. Weiterhin ist die Connexinexpression in atherosklerotischen Plaques
in chrakteristischer Weise verändert (140). Veränderungen in der Connexinexpression
könnten eine alterierte Zellkopplung nach sich ziehen, was sich in verminderten fortgeleiteten
Vasomotorantworten widerspiegeln kann. Daher sollte der Effekt der Hypercholesterinämie
auf fortgeleitete Vasomotorantworten in dieser Arbeit untersucht werden.
22
EINLEITUNG
1.9
Ziel der Arbeit
In dieser Arbeit sollte die Rolle verschiedener K+-Kanäle, die die Dilatation in der
Mikrozirkulation nach Stimulation mit endogenen Substanzen (ACh, Adenosin, NO)
induzieren und zu einer koordinierten Gefäßerweiterung führen, in Arteriolen des
Skeletmuskels der Maus charakterisiert werden.
→ Die Aktivierung calciumabhängiger Kaliumkanäle (KCa) ist ein Schlüsselereigneis bei der
Auslösung
EDHF-vermittelter
Dilatationen.
Die
spezifische
Funktion
der
unterschiedlichen Subtypen (BKCa, IKCa, SKCa) bei der Dilatation und deren Ausbreitung
sollte in IKCa- und BKCa-defizienten Mäusen sowie nach pharmakologischer Blockade des
SKCa untersucht werden.
→ Die Fortleitung lokal ausgelöster Dilatationen beruht auf der elektrotonischen
Ausbreitung von Hyperpolarisationen, die sich über mehrere Millimeter entlang des
Gefäßes erstrecken. Die Auslöser solcher Antworten, die Mechanismen, die eine
Regeneration des Signals ermöglichen können, und die beteiligten Leitungswege sollten
unter Zuhilfenahme unterschiedlicher Kanalblocker und Mäusen mit spezifischen
Gendeletionen untersucht werden.
→ Endothelabhängige Dilatationen sind in großen Leitungsgefäßen durch Atherosklerose
und Hypercholesterinämie beeinträchtigt. Der Effekt einer Hypercholesterinämie auf
endotheliale und fortgeleitete Dilatationen sollte daher in der Mikrozirkulation in zwei
hyperlipidämischen Mausmodellen (LDL-R-, ApoE-defiziente Tiere) untersucht werden.
2
Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1
Versuchstiere
24
Die Versuche wurden an männlichen Mäusen aus sieben verschiedenen Mausstämmen
durchgeführt. Die untersuchten Versuchstiere hatten ein Gewicht zwischen 15 und 52 g und
waren 3 - 17 Monate alt . Die Tiere wurden in der Tierhaltung des Institutes für Physiologie
der LMU München bzw. der Universität zu Lübeck gehalten und zum Teil gezüchtet. Maximal
sechs Mäuse waren in einem Typ 2 Makrolonkäfigen untergebracht. Die Tiere hatten freien
Zugang zu Standardfutter (bzw. speziellem Diätfutter) und Wasser. Alle Versuche erfüllten
die Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetzes und wurden durch die Regierung
Oberbayern (209.1/211-2531-12/99) bzw. das Ministerium für Umwelt, Naturschutz und
Landwirtschaft des Landes Schleswig-Holstein genehmigt (21/1g/03).
Insgesamt wurden 229 Versuchstiere untersucht. Hiervon waren aus der eigenen Zucht
C57BL/6 (123 Tiere), ApoE-defiziente Mäuse in einem C57BL/6 Hintergrund (25 Tiere), LDLRezeptor-defiziente Mäuse in einem C57BL/6 Hintergrund (29 Tiere), Cx40-defiziente Tiere
in einem C57BL/6 Hintergrund (11 Tiere). Des weiteren wurden BKCa-Kanal defiziente Mäuse
in einem SV129/C57BL/6 Mischhintergrund (9 BK+/+, 9BK-/- Tiere) (Kooperation mit Prof.
Ruth, Uni Tübingen), IKCa-Kanal defiziente Mäuse in einem 129ola/C57BL/6 Hintergrund (8
IK+/+, 8 IK-/-Tiere) (Kooperation mit PD Dr. Köhler, Uni Marburg) sowie ApoE-defiziente
Mäuse mit einer zusätzlichen endothelspezifischen Connexin40 Defizienz in einem C57BL/6
Hintergrund (2 Cx40+/+, 5 Cx40-/- TIE-2 CreTiere) (freundlicherweise von Dr. Kwak, Division
of Cardiology, University of Geneve, zur Verfügung gestellt) untersucht.
2.1.2
Cholesterin- und fettreiche Diät
Bei einem Teil der untersuchten transgenen hypercholesterinämischen Mäuse wurde die
bestehende Hypercholesterinämie durch Fütterung einer cholesterin- und fettreichen Diät
weiter akzentuiert. Dieses Futter hatte einen Cholesteringehalt von 0.5% und einen Fettanteil
von 40%. Die Tiere waren einer Langzeitdiät ausgesetzt. LDL-Rezeptor defiziente Mäuse
bekamen das Diätfutter über einen Zeitraum von 6 Monaten, ApoE defiziente Mäuse über
einen Zeitraum von 4 Monaten vor Durchführung der Versuche. Alle Tiere hatten freien
Zugang zu Futter und Wasser, der Diätgruppe stand während dieses Zeitraums
ausschließlich das Diätfutter zur Verfügung.
2.2
Methoden
2.2.1
Narkose
25
Die Narkose erfolgte initial durch eine intraperitoneale Gabe von Medetomidin (1 mg / kg)
Midazolam (10 mg / kg) und Fentanyl (0.1 mg / kg). Nach Einleitung der Narkose erreichten
die Tiere nach ca. 3 Minuten das Toleranzstadium. Die Narkose wurde nach Präparation
durch eine kontinuierliche Applikation während des gesamten Versuchs aufrechterhalten.
Hierzu wurde die Narkose mit einem Perfusor (Secura FT, B.Braun, Melsungen) über einen
Katheter in der V. jugularis infundiert (Medetomidin 0.01 mg / h; Midazolam 0.1 mg / h;
Fentanyl 0.001 mg / h). Während des Versuchs wurde die Narkosetiefe durch mechanische
Stimulation (Zwicken oder Pusten) überprüft und die Dosis gegebenenfalls angepasst. Die
Versuche zur Magnetofektion (s.u.) erforderten eine Antagonisierung der Narkose nach Ende
der Transfektion. Dies erfolgte durch subkutane Applikation der Antagonisten Naloxon (1.2
mg / kg), Flumazenil (0.5 mg / kg) und Atipamezol (2.5 mg / kg). Die Tiere erwachten ca. 3
Minuten nach Applikation. Nach Beendigung des Versuchs wurden alle Mäuse durch Gabe
einer i.v. Bolusinjektion von 0.3 ml Pentobarbital (16 g / 100 ml) euthanasiert.
2.2.2
Versuchsvorbereitung und Präparation
2.2.2.1 Tracheotomie und Katheterisierung
Zu Beginn des Versuchs wurden die Mäuse im Hals- und Genitalbereich mit einem
handelsüblichen Langhaarschneider (Braun, Kronberg) rasiert. Anschließend wurden sie auf
eine Präparierplattform aus Styropor überführt und an den Vorderpfoten fixiert. Nach Setzen
eines Hautschnitts wurde die Trachea freipräpariert und mit zwei Baumwollfäden
aufgespannt. Nach Inzision der Trachea zwischen zwei Knorpelsegmenten wurde ein
Polyethylenschlauch (PE 50) als Tubus eingeführt und mit den beiden Baumwollfäden fixiert.
Der Tubus erleichterte hierbei die Spontanatmung der Maus. Nach Lagerung der Maus auf
das Mikroskop wurde die Maus mit einem Respirator (Hugo-Basile, Italien) beatmet. Die
mechanische Ventilation erfolgte mit einer Frequenz von 150 / min und einem Druck von 2
cm H2O.
Zur Kanülierung der Halsvene wurde über den für die Tracheotomie gesetzten Hautschnitt
die rechte V. jugularis freipräpariert und mit zwei Baumwollfäden gespannt. Nach Inzision
wurde das Gefäß mit einem Polyethylen Katheter (PE 10) kanüliert. Die korrekte Lage des
Katheters wurde durch Aspiration von Blut überprüft und die Narkose im weiteren
Versuchsverlauf über diesen Zugang infundiert.
26
Speicheldrüsen
V. jugularis
Trachea
V. jugularis
V. jugularis
V. jugularis
Abb.: 2.1: Tracheotomie und Katheterisierung.
Nach Setzen eines Hautschnittes werden zur Tracheotomie und Kanülierung der Halsvene die
Trachea sowie die rechte V. jugularis freipräpariert.
2.2.2.2 Cremasterpräparation
Die Cremasterpräparation wurde nach einer erstmals 1973 von Baez beschriebenen
Methode (141) mit nur minimalen Modifikationen durchgeführt. Hierzu wurde die Maus in
Rückenlage auf einen für die Intravitalmikroskopie entworfenen Plexiglastisch mit
Heizvorrichtung gelagert. Das rechte Skrotum wurde dann am unteren Pol durch einen
kleinen Hautschnitt geöffnet und der Schnitt median Richtung kranial bis in die Inguinalregion
verlängert. Der untere Pol des nun freiliegenden M. cremaster wurde an einem Faden fixiert
und der Skelettmuskel senkrecht zur Maus aufgespannt. Nunmehr wurde vorsichtig das
umliegende Bindegewebe entfernt. Der freiliegende M. cremaster wurde nun horizontal
zwischen den Hinterbeinen der Maus über ein im Plexiglastisch eingelassenes Deckglas
gezogen und mit dem Faden in einem das Deckglas umgebenden Silikonring befestigt. Über
einen kleinen Schnitt in der Spitze des Skelettmuskels wurde der M. cremaster eröffnet,
indem der Schnitt median nach kranial verlängert wurde. Der Skelettmuskel wurde nun mit
insgesamt 6 Fäden so aufgespannt, dass er flach über dem Deckglas zu liegen kam (Abb.
2.2). Die Faszie, die Nebenhoden, Hoden und Skelettmuskel verbindet, wurde durchtrennt
und Hoden und Nebenhoden daraufhin in die Bauchhöhle zurückgeschoben. Der geöffnete
Skelettmuskel wurde vom ersten Schnitt an über die gesamte Versuchsdauer mit
temperierter (34 °C) Krebslösung betropft.
27
Abb. 2: Schematische Darstellung eines präparierten Cremastermuskels
In den Präparationen, in denen Membranpotentialmessungen durchgeführt werden sollten,
wurden zusätzliche präparatorische Schritte notwendig. Um störende Atembewegungen des
Tieres
auf
das
Präparat
zu
verhindern,
wurden
für
die
Durchführung
von
Membranpotentialmessungen zwei weitere Fäden jeweils rechts und links an der Basis des
Skelettmuskels gesetzt und im Silikonring befestigt. Durch Anlegen von Zugspannung konnte
das Präparat von der Atmungsbewegung isoliert werden. Anschließend wurden mit einem
Operationsmikroskop (Wild Heerbrugg, Schweiz) 2 - 3 für die Membranpotentialmessung
geeignete Arteriolen ausgesucht und über eine Strecke von etwa 2 mm vorsichtig von dem
sie umgebenden Skelettmuskel freipräpariert.
A
B
Abb. 2.3: Durchlichtaufnahme des Cremastermuskels und einer freipräparierten Arteriole
A: Abbildung des M.cremaster, der Gefäßbaum ist deutlich sichtbar. B: Skelettmuskel mit einer
freipräparierten Arteriole, wie sie zur Membranpotentialmessung verwendet wurde.
28
2.2.3
Intravitalmikroskopie: Versuchsaufbau und Durchführung
Wie auch während der Präparation des Skelettmuskels wurde der M. cremaster während der
gesamten Versuchsdauer mit temperierter Krebslösung superfundiert (Abb. 2.4). Das
Superfusionssystem bestand aus einem Vorratsbehältnis, das nur über ein dünnes Glasrohr
mit der Raumluft verbunden war. Über eine Öffnung im unteren Teil des Vorratsgefäßes
konnte die Superfusionslösung in ein zweites kleineres, doppelwandiges und beheiztes
Vorratsgefäß abfließen. Beim Abfließen der Lösung wurde die Flüssigkeit im Glasrohr durch
Luft ersetzt, das Ende der Luftsäule am Boden des großen Vorratsgefäßes bestimmte somit
den Flüssigkeitsstand im kleinen Vorratsgefäß. Über einen Drehregler konnte der
Flüssigkeitsfluß aus dem kleinen Gefäß auf eine konstante Geschwindigkeit von 8ml/min
eingestellt werden. Die Superfusionslösung wurde im kleineren Vorratsgefäß über eine Fritte
mit einem Gasgemisch (95% N2, 5% CO2) begast und der pH-Wert der Lösung aufgrund der
gewählten Hydrogencarbonatkonzentration in der Lösung somit auf 7.4 eingestellt. Die
Superfusionslösung
wurde
zusätzlich
über
einen
nachgeschalteten
beheizten
Schlangenkühler erwärmt, so dass die Salzlösung beim Erreichen des Skelettmuskels eine
Temperatur von 34°C besaß. Die doppelwandigen Glasgeräte wurden über ein
temperierbares zirkulierendes Wasserbad beheizt.
Abb. 2.4: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
29
Die Mikrozirkulation wurde mit einem Mikroskop (Nikon Eclipse E600, Nikon, Tokyo, Japan)
unter 200-facher Vergrößerung betrachtet (CFI Planfluor ELWD Objektiv: 20x / 0.45). Die
Bilder wurden mit einer CCD Kamera aufgenommen und zur späteren Auswertung auf
Videoband (S-VHS, Sony) aufgezeichnet.
Für die Membranpotentialversuche wurde ein Mikroskop mit einer 'fixed stage' Konstruktion
als Arbeitsbasis verwendet (Axioskop 2 FS, Zeiss, Jena). Durch die feste Tischposition sind
das Versuchstier auf der Mikroskopierbühne sowie die Mikromanipulatoren fixiert mit dem
ruhenden Tisch verbunden, während das Mikroskop auf einer beweglichen Bühne steht. Dies
ist für die Durchführung der empfindlichen Membranpotentialmessung von besonderem
Vorteil, da dadurch Erschütterungen der Mikroelektrode minimiert werden können. Die
freipräparierten
Arteriolen
wurden
mit
400-facher
Vergrößerung
betrachtet
(Wasserimmersionsobjektiv: 40x / 0.8). Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde eine
Quecksilberlampe verwendet (HBO, 100W, Osram, München). Der verwendete Filtersatz
(No 9, Zeiss, Jena) eignete sich zur Visualisierung der mit Fluorescein beladenen Zellen
(Anregung: 495nm, Emission: 517nm). Die Fluoreszenz wurde mit einer ICCD Kamera
(C8484, Hamamatsu, Herrsching) aufgenommen und die Bilder digital gespeichert.
2.2.4
Globale und lokale Stimulation mit Agonisten
Durch eine peristaltische Pumpe konnten der Superfusion vasoaktive Substanzen
zugemischt werden. Hierdurch wurde eine globale Stimulation des Skelettmuskels erreicht.
Die Substanzen wurden 100-fach konzentriert eingesetzt und der Superfusion mit einer
Geschwindigkeit von 0.08 ml/min zugesetzt, um die gewünschten Endkonzentrationen zu
erreichen. Im weiteren Text werden die Endkonzentrationen in der Superfusionslösung
angegeben. Die lokalisierte Stimulation von Arteriolen konnte durch gezielte Applikation
eines Agonisten über eine Mikropipette erfolgen. Hierzu wurde eine mit dem Agonisten
befüllte Mikropipette mit Hilfe eines Mikromanipulators in unmittelbarer Nähe des Gefäßes im
Skelettmuskel platziert und der Agonist durch einen kurzen Druckpuls (50 - 500 ms, 140
kPa) appliziert. Eine erfolgreiche Applikation konnte durch ein kurzes Auseinanderweichen
des Muskelgewebes an der Applikationsstelle erkannt werden.
2.2.5
Bei der intrazellulären Membranpotentialmessung wird das Membranpotential direkt
gemessen, das heißt die von der Zelle gesteuerten Spannungsänderungen werden
abgeleitet. Zur Messung einer Potentialdifferenz über eine Zellmembran sind zwei
Elektroden erforderlich. Eine indifferente Elektrode im extrazellulären Raum sowie eine
intrazelluläre Elektrode, innerhalb der Zelle. Um eine Zelle intrazellulär ableiten zu können,
30
muß zunächst ein elektrischer Zugang erreicht werden. Dies erfolgte mit einer scharfen
Elektrode. Es handelt sich hierbei um eine mit einer Salzlösung gefüllte Elektrode, in die ein
chlorierter Silberdraht ragt, der den elektrischen Zugang darstellt. Die Elektrode zeichnet sich
durch einen sehr kleinen Spitzendurchmesser (< 1 µm) und einen sehr großen Widerstand
(> 50 MΩ) aus. Mit einer scharfen Elektrode ist es möglich, die Zellmembran direkt zu
penetrieren, das heißt allein durch mechanische Belastung die Zellmembran zu
durchdringen. Die visuelle Kontrolle bringt bei Verwendung von scharfen Elektroden nur
geringe Vorteile mit sich, da die Spitzen von scharfen Elektroden selbst unter guten
Lichtmikroskopen nur schwer auflösbar sind. Die Penetration einer vaskulären Zelle mit einer
scharfen Elektrode ist somit visuell kaum steuerbar.
Um den Messplatz weitestgehend von seiner Umgebung zu isolieren, wurden verschiedene
Vorkehrungen getroffen. Da bei der intrazellulären Membranpotentialmessung bereits
geringe Erschütterungen eine erfolgreiche Zellpenetration verhindern können, wurde eine
mechanische Abschirmung des Messplatzes von seiner Umgebung vorgenommen. Um die
Übertragung von mechanischen Schwingungen der Umgebung zu minimieren wurde das
Mikroskop auf einen Mikroskopiertisch mit einer schweren Marmorplatte gestellt, der durch
Luftpolster vom Boden entkoppelt war. Die Membranpotentialmessung wird bereits durch
geringe elektromagnetische Strahlung, die beispielsweise durch das Niederspannungsnetz
erzeugt wird, gestört. Das Mikroskop mit Messelektrode wurde deshalb in einen nur nach
vorne geöffneten Faraday-Käfig gestellt, der zusätzlich mit einer Erdung verbunden war.
Sämtliche elektrischen Geräte, wie Computer, Verstärker und Oszilloskop wurden außerhalb
des Faraday-Käfigs platziert. Die Geräte selbst waren mit ihren Metallgehäusen am FaradayKäfig angeschlossen um eine gemeinsane Erdung zu erreichen.
Zur Membranpotentialmessung wurde eine Silber/Silberchloridelektrode verwendet. Der
Silberdraht der Messelektrode wurde vor jedem Versuch, durch einstündige Reaktion des
Silberdrahtes der Elektrode mit Natrium Hypochlorit, neu chloriert. Die Spitze der
Mikroelektrode wurde mit 10 % Carboxyfluorescein-Farbstoff (in 3 mol/l KCl gelöst) beladen.
Die Mikroelektrode war in einem Mikroelektrodenhalter befestigt, dessen Silberdraht in die
3M KCl-Lösung der Elektrode eintauchte und das Signal an den Vorverstärker weiterleitete.
Die Referenzelektrode wurde neben dem M. cremaster in der Superfusionslösung
positioniert. Die verwendete Technik der intrazellulären Ableitung wird auch als "voltage
follower" bezeichnet. Hierbei wird die Mikroelektrode mit einem Verstärker verbunden,
dessen Widerstand um ein vielfaches größer ist als der Widerstand der Mikropipette. Der
Ausgang des Verstärkers folgt dem Potential an der Spitze der Mikroelektrode. Der Strom
durch die Mikroelektrode wird hierbei auf null geklemmt. Das Membranpotential wurde mit
31
einem Potentialverstärker (SEC 1L, NPI Advanced Electronics, Tamm) gemessen, an dem
das Membranpotential auch digital abgelesen werden konnte. Zur Orientierung im Gewebe
wurde ein repetitiver Stromimpuls erzeugt. Da mit der Elektrode das gesamte Potential und
nicht nur das Membranpotential gemessen wird, ist es schwierig den generierten
wechselnden Spannungsabfall über die Elektrode von dem auf Zellpenetration beruhenden
Spannungsabfall zu unterscheiden. Daher werden spezielle Kompensationskreisläufe des
Verstärkers verwendet, die das durch den Verstärker erzeugte Signal subtrahieren. Der
generierte Stomimpuls interferiert somit nicht mit der Messung. Durch einen Impulsgenerator
(Anapulse Stimulator Model 302-T, W-P Instruments, New Haven, USA) wurde ein
rechteckförmiges Signal mit einer Dauer von 25 ms, einer Verzögerung von 10 ms und
einem Intervall von 65 ms erzeugt. Der Impulsgeber steuerte den Verstärker der einen
Stromimpuls von 0.3 nA erzeugte, der dann entlang der Meßelektrode floß. Der
Spannungsabfall, der sich aus dem Produkt von Stromfluß durch die Pipette und
Pipettenwiderstand ergibt, wurde mit einem externen Oszilloskop dargestellt und konnte nun
durch manuellen Abgleich über einen Drehregler am Verstärker aus der Aufzeichnung
eliminiert
werden.
Gleichzeitig
wurde
über
eine
Anzeige
am
Drehregler
der
Pipettenwiderstand abgelesen.
Die
wird
durch
die
Kapazität
am
Verstärkereingang
beeinträchtigt. Deshalb mußte die Kapazität ebenfalls kompensiert werden. Die Kapazität hat
verschieden Ursachen, z.B. die Kapazität über die Glaswand des Teils der Mikroelektrode
der in die Superfusionslösung taucht, die Streukapazität des übrigen Teils der Mikropipette
oder die Streukapazität des Mikroelektodenhalters. Der Kapazitätsausgleich erfolgte mit
einem speziellen Kreislauf zur Neutralisation der Kapazität und konnte am Verstärker
eingestellt werden. Eine Überkompensation der Kapazität wurde in manchen Fällen zur
Penetration von Zellen genutzt. Der Kontakt der Elektrodenspitze mit einer Zellmembran
konnte
durch
die
auftretende
Widerstandsänderung
erkannt
werden,
die
als
Spannungsänderung auf dem Oszilloskop beobachtet werden konnte. Die Zellpenetration
erfolgte dann mit Hilfe eines Piezo-Steppers durch schnelle kurze (1 µm Schritte)
Vorwärtsbewegung der Mikropipette. Um die Zellpenetration zu erleichtern wurde zeitweise
ein kurzer hochfrequent oszillierender Stromstoß über die Mikroelektrode appliziert. Das
Membranpotential wurde dann über einen Analog-Digitalwandler (Elektronikwerkstatt der
LMU München) mit Open Source Software (XmAD) auf der Festplatte eines Rechners mit
einer Frequenz von 500 Hz aufgezeichnet. Vor der Messung erfolgte eine Kalibrierung des
Messprogramms.
32
2.2.6
Immunfärbung
Die Immunhistochemie ist eine sensitive Methode zum Nachweis von Proteinen. Die
Methode wurde 1940 von dem Mikrobiologen Albert Coons eingeführt (142). Die indirekte
Immunfluoreszenz ermöglicht es mit Hilfe von spezifischen, gegen das Zielprotein
gerichteten primären Antikörpern Proteine zu lokalisieren. Die Visualisierung erfolgt dann
entweder durch Bindung von sekundären Antikörpern, die mit einem Fluorophor gekoppelt
sind, oder durch Bindung von Enzymen an den sekundären Antikörper, die in Gegenwart der
entsprechenden Substrate zur Bildung eines gefärbten Niederschlags führen. Nach
Anregung der Farbstoffe mit bestimmten Wellenlängen emittieren Chromophore Licht im
sichtbaren
Bereich.
Das
heute
meist
durchgeführte
Verfahren
ist
die
indirekte
Doppelimmunfluoreszenz. Mit Hilfe dieser Technik ist es möglich, eine Kolokalisation von
zwei verschiedenen Proteinen nachzuweisen.
2.2.6.1 Immunfluoreszenz
Um
Connexin40
in
den
Arteriolen
des
M.
cremasters
nachzuweisen,
wurden
Immunfluoreszenzversuche am ganzen Präparat durchgeführt. Hierzu wurde zunächst der
Cremaster wie beschrieben präpariert und mit Hilfe eines Mikroskops mit 20-facher
Vergrößerung eine Karte des Gefäßbaumes gezeichnet, um später Gefäße anhand ihrer
Lokalisation als Venolen oder Arteriolen identifizieren zu können. Der Cremaster wurde
anschließend an der Basis abgeschnitten und die Spannfäden aus dem Silikonring gelöst.
Nach Kennzeichnung der ursprünglichen Ausrichtung, durch spezifische Verknotung der
Fäden wurde der Cremaster in 4.5 % Formaldehyd für 10 min fixiert. Die für die
Immunfärbung verwendeten thorakalen Aorten wurden den Tieren entnommen und in einen
mit Sylgard bedeckten Well überführt. Die Gefäße wurden dann vom umgebenden
periadventitiellem Fett befreit. Nach Fixierung eines Endes mit einer Präpariernadeln wurde
die Aorta aufgeschnitten und mit der luminalen Seite nach oben mit weiteren Nadeln
aufgespannt. Die weiteren Arbeitsschritte erfolgten ohne die Position des Gefäßes zu
verändern. Die Fixierung erfolgte 3 Minuten in 4.5 % Formaldehyd. Die Vorhöfe wurden
ebenfalls sofort nach Organentnahme fixiert (10 min, 4.5 % Formaldehyd).
Anschließend wurden alle Präparate in Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) überführt,
ausgiebig gewaschen und danach 2 Stunden in einem Blockier-Puffer aus 2 % BSA und
0.2 % Triton-X in PBS bei Raumtemperatur blockiert, um unspezifische Bindungsstellen
abzusättigen und so das Hintergrundsignal bei der folgenden Immunodetektion zu
minimieren. Die Präparate wurden anschließend mit dem Antikörper gegen Connexin40 (1:
400) (Rabbit Anti-Maus Cx40, Chemicon, Temucula, USA) in Blockier-Puffer über Nacht bei
4 °C inkubiert. Nach wiederholtem Waschen mit 1 % Triton-X in PBS und abschließendem
33
Waschen in PBS wurde mit dem sekundären Antikörper (1:800 in PBS, Alexa Fluor 594 Goat
Anti-Rabbit, Molecular Probes, Leiden, NL) 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zugabe
des Kernfarbstoffs Hoechst (1:10000) zur Inkubationslösung erfolgte die Färbung der
Zellkerne ebenfalls in diesem Schritt. Abschließend wurde nochmals intensiv mit PBS
gewaschen. Der M. cremaster wurde dann entsprechend seiner ursprünglichen Ausrichtung
auf einem Objektträger aufgespannt. Die Aorten wurden vorsichtig auf den Objekträger
überführt, so dass sie mit der luminalen Seite nach oben lagen. Die Vorhöfe wurden
ebenfalls auf Objektträger überführt. Alle Präparate wurden in Mowiol (Calbiochem,
Darmstadt) eingebettet und über Nacht getrocknet.
Die Präparate wurden bis zur mikroskopischen Betrachtung lichtgeschützt gelagert. Die
Betrachtung der Zielstrukturen erfolgte mit einem Axioplan 2 Imaging Fluoreszenzmikroskop
der Firma Zeiss (Jena) in 200-facher (Objektiv: plan-Neofluar 20x / 0.5), 400-facher
(Objektiv: plan-Neofluar 40x / 0.75) und 630-facher (Ölimmersionsobjektiv: plan-Apochromat
63x / 1.40) Vergrößerung. Das Mikroskop ist mit mehreren Filtersätzen ausgestattet, welche
unter anderem eine Visualisierung von Alexa Fluor 594 ermöglichen. Diese Verbindung
emittiert Licht nach Anregung mit einer Wellenlänge von 617 nm (rot). Außerdem kann der
Kernfarbstoff Hoechst durch Emission im Bereich von 385-470nm (blau) zur Darstellung
gebracht werden.
2.2.6.2 Konfokale Lasermikroskopie (CLSM)
Ein Teil der wie oben beschrieben aufgearbeiteten Präparate wurde mit einem konfokalen
Laser-Scanning-Mikroskop betrachtet (LSM, LSM 5 Meta, Zeiss, Jena). Die Aufnahme der
konfokalen Bilder erfolgte in Kooperation mit Prof. Dr. Gebert, Institut für Anatomie,
Universität zu Lübeck. Bei dieser Methode rastert ein fokussierter, monochromatischer
Laserstrahl zeilenweise über die Probenoberfläche. Die aus den erleuchteten Bereichen des
Gewebes emittierte Strahlung gelangt über eine konfokale Blende (Pinhole) auf einen
Detektor, wo ihre Intensität gemessen wird. Das Pinhole ist die entscheidende Besonderheit
eines konfokalen Mikroskops gegenüber herkömmlichen Lichtmikroskopen. Durch die
konfokale Blende gelangt lediglich Laserlicht aus einer extrem dünnen Fokusebene auf den
Detektor (xy-Scan). Durch schrittweises Verfahren der Höhenposition des Objekttischs wird
eine Stapel von Einzelbildern parallel zur Oberfläche erhalten. Durch Übereinanderprojektion
dieser parallelen Einzelbilder kann rechnergestützt eine Summation aller Bildinformationen
erreicht werden, so dass Mikrogewebestrukturen im Verlauf durch das Gewebe als
dreidimensionales Bild visualisiert werden können. Mit einem konfokalen Mikroskop ist es
somit möglich eine Probe bis zu einer Tiefe von etwa 100 µm in optischen Schnitten
abzubilden. Der Vorteil der Methode ist, dass die von uns verwendeten relativ dicken
34
Gewebeproben in Form der 'optischen Schnitte' scharf abgebildet werden können. Es wurde
die Connexin40 Expression in Vorhof, Aorta und Arteriolen des M. cremasters in Wildtypen
und als Negativkontrolle in Connexin40-defizienten Mäusen untersucht. Des weiteren
wurden Kontrollen, bei denen auf die Inkubation mit dem primären Antikörper verzichtet
wurde, untersucht. Die Kernfärbung erfolgte mit Hoechst, darüber hinaus wurde die
Autofluoreszenz der Gefäße und des Vorhofgewebes genutzt, um Gewebestrukturen
darzustellen. Es wurden Bilder mit einer Größe von 512 x 512 Bildpunkten aufgenommen.
Die Aufnahmen erfolgten mit 200-facher (Objektiv: Plan Apochromat 20x/0.75), 400-facher
(Wasserimmersionsobjektiv:
C-Apochromat
40x/1.2)
und
630-facher
((Wasserimmersionsobjektiv: C-Apochromat 63x/1.2) Vergrößerung mit Objektiven der Firma
Zeiss.
Tabelle 2.1: Verwendete Anregungswellenlängen am CLSM
Fluorophor
Autofluoreszenz
Alexa Fluor 594
Hoechst
Laser
Argon/Krypton
Helium/Neon
Argon
verwendete Emissionslinie (nm)
488
543
364
2.2.6.3 Immunhistochemie von Paraffinschnitten
Der immunhistochemische Nachweis der Expression von Connexin40, sowie die Färbung
des endothelzellspezifischen Markers wurde an Paraffinschnitten der Aorta und an Schnitten
von aus dem Cremaster isolierten Arteriolen in hypercholesterinämischen und wildtyp
Mäusen durchgeführt. Die Durchführung erfolgte in Kooperation mit PD Dr. Wagner, Klinik
für Anästhesiologie, Universität zu Lübeck. Nach Einleitung der Narkose wurde der M.
cremaster wie beschrieben präpariert. Um Arteriolen nach Fixierung zu identifizieren wurde
eine detaillierte Karte des Gefäßbaumes gezeichnet. Die Gefäße wurden fixiert, indem das
Gefäßsystem der Mäuse nach Öffnung des Thorax über den linken Ventrikel durch eine
hydrostatische Drucksäule perfundiert wurde. Zunächst wurde eine Lösung aus 1 % FCS, 10
U / µL Heparin, 10 µmol / l SNP in angewärmter Salzlösung verwendet, anschließend wurde
mit 2 % Formaldehyd in Salzlösung perfundiert. Die zuvor ausgewählten Arteriolen wurden
nun aus dem Cremaster isoliert, die Aorta thoracalis wurde ebenfalls freipräpariert und
isoliert. Die Gefäße wurden über Nacht in 0.45 % Formaldehyd gelagert. Nach Dehydratation
und Einbettung in Paraffin wurden 2 µm Schnitte angefertigt. Die Schnitte wurden dann mit
Xylol entparaffinisiert und mit absteigenden Konzentrationen von Ethanol (100 - 70 %)
rehydriert. Die Wiedergewinnung der Antigenbindungsstellen erfolgte durch Erhitzen der
Schnitte mit 0.01 mol/l Natriumcitrat (pH 6) in einer Mikrowelle. Endogene Peroxidasen
35
wurden durch Behandlung mit 0.3 % Wasserstoffperoxid-Lösung inaktiviert. Die Präparate
wurden blockiert (Blocking-Solution: CSA-Kit K1500; Dakocytomation, Carpenteria, CA) und
über Nacht mit dem Cx40 Antikörper (1:200; Chemicon, Temucula, USA) inkubiert. Zur
Visualisierung des primären Antikörpers wurde ein Signalverstärkungssystem (Catalyzed
Signal Amplifikation, CSA, DakoCytomation, Carpenteria, USA) verwendet. Es handelt sich
hierbei um eine empfindliche Färbemethode, die eine Signalverstärkung benutzt, welche auf
der Peroxidase katalysierten Ablagerung einer biotinylierten phenolischen Verbindung
beruht. Zur Verwendung des primären Cx40 Antikörpers, der aus Hasenserum stammte,
mußte ein 'CSA Rabbit Link' verwendet werden, um das System einsetzen zu können.
Dadurch konnte der zur Detektion des primären Antikörpers eingesetzte, biotinylierte
sekundäre Antikörper den primären Antikörper erkennen. Im nächsten Schritt wurde ein
Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex zugesetzt der an den biotinylierten sekundären
Antikörper bindet. Die so gebundene Peroxidase katalysiert die Präzipitation eines
biotinylierten Phenols. Peroxidase gekoppelte Antikörper wurden mit Diaminobenzidin braun
gefärbt. Bei Koimmunfärbungen wurde Double Stain Block (Dakocytomation, Carpenteria,
USA) zwischen der Inkubation mit zwei primären Antikörper verwendet. Bei der Detektion der
Antikörper gegen den endothelspezifischen Marker von Willebrand Faktor wurde das Enzym
Alkalische Phosphatase als Sonde eingesetzt. Das Enzym führt ebenfalls zur Bildung eines
lokalen gefärbten Niederschlags. Die Entwicklung erfolgte hier mit Fast Red. Die Betrachtung
der Zielstrukturen erfolgte auch hier mit dem Axioplan 2 Imaging Fluoreszenzmikroskop wie
unter 2.2.6.1, Immunfluoreszenz beschrieben.
2.2.7
Genotypisierung der Connexin40 defizienten Mäuse
Mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) läßt sich eine sehr kleine Menge eines
definierten DNA-Abschnitts so stark vervielfältigen, dass er problemlos nachgewiesen und
untersucht werden kann. Vorraussetzung hierfür ist, dass die Sequenzen am Anfang und am
Ende des DNA Fragments bekannt sind. Dann können spezifische Primer hergestellt
werden, die komplementär zu den Anfangs- und Endsequenzen sind und mit der Matritze
hybridisieren. Die Vervielfältigung erfolgt durch DNA-Polymerasen, die sich an je ein Ende
des hybridisierten Primers heften und den neuen DNA-Strang komplementär zur Matritze
synthetisieren.
Eine PCR besteht aus mehreren aufeinanderfolgenden Zyklen, wobei jeder Zyklus die DNAMenge verdoppelt. Ein Zyklus besteht aus drei Phasen, Erhitzung, einer Abkühlung und
erneutem Erwärmen. In der ersten Phase wird der Doppelstrang der DNA durch Erhitzen in
zwei Einzelstränge getrennt (Denaturierung). In der zweiten, kühleren Phase lagern sich die
Primer an die Bereiche der Einzelstränge mit ihrer komplementären Sequenz (Anlagerung)
36
an. Durch erneutes Erwärmen auf die optimale Temperatur der Polymerase kann diese an
den Primern beginnend aus einzelnen Nukleotiden neue komplementäre Stränge zu den
vorhandenen Einzelsträngen bilden (Elongation). Auf diese Weise entstehen aus je einem
Einzelstrang ein doppelsträngiges DNA-Fragment. Danach folgt der nächste Zyklus mit den
gleichen Temperaturwechseln. Die zur Genotypisierung der Connexin40 defizienten Mäuse
verwendeten Primer (MWG Biotech AG, Ebersberg) sind in Tabelle 2.2 aufgelistet. Die
Vervielfältigung erfogte mit einem Thermocycler (iCycler, Biorad, München), das verwendete
Programm ist in Tabelle 2.3 dargestellt.
Tabelle 2.2: Verwendete Primer
Primer
Sequenz
Länge
Cx 40-/- forward
Cx40-/- reverse
wt forward
wt reverse
5'-GGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCAC-3'
5'-CTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCG-3'
5'-GGGAGATGAGCAGGCCGACTTCCGGTGCG-3
5'-GTAGGGTGCCCTGGAGGACAATCTTCCC-3'
30-mer
31-mer
29-mer
28-mer
Tabelle 2.3: Programm Connexin40 PCR
Anzahl der Zyklen
Temperatur
Zeit
38 Zyklen
94°C
65°C
72°C
40sec
1min
1min
Einmalig
72°C
7min
Zur Gewinnung der genomischen DNA wurde den Mäusen in einem Alter von ca. 6 Wochen
ein etwa 2 mm langes Stück der Schwanzspitze entnommen. Die Probe wurde in Laird
Puffer überführt, mit Proteinase K (0.2 mg / ml) versetzt und bei 55°C 24 h verdaut. Nach
Inaktivierung des Enzyms durch Erhitzen auf 95°C für 20min wurde die DNA mit eiskaltem
Isopropanol gefällt und abzentrifugiert (13000 rcf, 15 min Microzentrifuge MC-13, Amicon,
Witten). Nach Aufnehmen des DNA-Pellets in TE-Puffer wurden die Proben für die
Amplifikation eingesetzt. Der Reaktionsansatz für die PCR-Reaktion ist Tabelle 2.4 zu
entnehmen.
37
Tabelle 2.4: PCR-Reaktionsansatz
Mastermix (Endkonzentration)
Volumen (µl)
MgCl2 (2.5mM)
10xPCR Puffer
Primermix (0,8pmol/µl)
dNTP-Mischung (0,16mM)
H2O
Taq Invitrogen (0,05U/µl)
Probe
2,5
5,0
1,6
0,8
32,6
0,5
7,0
Der Erfolg der PCR kann mit Hilfe einer Gel-Elektrophorese überprüft werden. Dabei werden
DNA-Fragmente in einem Agarose-Gel durch ein elektrisches Feld nach ihrer Größe
aufgetrennt. Um die DNA-Fragmente anzufärben, wird der DNA-Interkalator Ethidiumbromid
verwendet. So kann die DNA unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Die amplifizierte DNA
wurde in einem 0.5 % TBE-Agarosegel für 35 min bei 60 mA und 120 V in einer dafür
gebauten Gelkammer aufgetrennt. Als Negativkontrolle wurde Wasser und als Referenzskala
DNA Ladder Plus (100 bp, Invitrogen, Karlsruhe) eingesetzt. Das PCR-Produkt für das
Wildtyp-Allel hatte eine Länge von 314 bp und das Produkt des Connexin40-defizienten
Allels 494 bp.
494 bp
314 bp
Cx40+/+
Cx40-/-
Cx40+/-
H2 O
Marker
Abb. 2.5: Genotypisierung der Connexin40-defizienten Mäuse
Aus der Verpaarung der heterozygoten Connexin40 Mäuse (eigene Zucht) ergeben sich drei mögliche
Genotypen: Connexin40 wildtyp (Cx40+/+), Connexin40 defizient (Cx40-/-) und Connexin40
heterozygot (Cx40+/-). Die zwei unterschiedlichen DNA-Abschnitte (314 bp für das Wildtyp-Allel und
494 bp für das k.o.-Allel) wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt. Als Negativkontrolle diente
Wasser. Der verwendete 100bp Marker diente als Referenz.
2.2.8
38
Magnetofektion
Magnetofektion ist eine relativ neue Technologie, welche die einfache und schnelle
Transfektion von Zellen in Kultur ermöglicht. Die Methode beruht auf der reversiblen
Kopplung von Oligonukleotiden oder Genvektoren an magnetische Nanopartikel, die von
einer kationischen Polymerhülle umgeben sind und in wässriger Suspension vorliegen. Diese
"Ferrofluide" können mit Hilfe eines externen Magnetfeldes am Zielort festgehalten und
dadurch konzentriert werden. Die Aufnahme der Oligonukleotide in die Zellen erfolgt durch
Endozytose. Wie in unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden konnte, erreicht die
Magnetofektion in vitro gegenüber den klassischen Transfektionsmethoden eine höhere
Transfektionseffizienz und eignet sich insbesondere als Methode zur Transfektion von
schwer transfizierbaren Zelllinien. Des weiteren konnte in vivo nach Injektion von
fluoreszenzmarkierten Antisenseoligonukleotiden in die A. femoralis, aus der das den M.
cremaster versorgende Gefäß hervorgeht, fluoreszenzmikroskopisch die zelluläre Aufnahme
und Lokalisation der Oligonukleotide am Zielort gezeigt werden (143). Ziel unserer weiteren
Arbeit war die Etablierung der magnetischen Transfektion in vivo, um in dem transfizierten
Gefäßareal die Effekte der Ausschaltung bestimmter Zielproteine mittels Gen-Silencing auf
die vaskuläre Funktion zu untersuchen. Die erfolgreiche Etablierung würde es ermöglichen,
die spezifische Funktion bestimmter Proteine (z.B. K+-Kanäle, K2P) für die es keine
spezifischen Hemmstoffe gibt, zu charakterisieren.
Antisenseoligonukleotide sind kurze Nukleotidsequenzen, bestehend aus 15 - 20 Basen, die
komplementär zur Ziel-mRNA sind. Die Wirkung von Antisense-Oligonukleotiden beruht auf
unterschiedlichen Mechanismen. Ein Mechanismus ist die Aktivierung der RNase H. Dieses
Enzym erkennt DNA/RNA Doppelstränge und schneidet den mRNA Strang, was zu einem
Abbau der Ziel mRNA führt. Des weiteren können Antisenseoligonukleotide durch sterische
Behinderung des Ribosoms die Proteinsynthese inhibieren (Abbildung 2.6).
39
Abb. 2.6: Wirkmechanismus von Antisenseoligonukleotiden
A: Durch Bindung von Antisenseoligonukleotiden an die Ziel mRNA kommt es zu einer Aktivierung der
RNAse H. Dieses Enzym erkennt RNA/DNA Doppelstränge und schneidet den RNA Strang. Dies führt
zum Abbau der Ziel mRNA. B: Durch Bindung an die Ziel mRNA führen Antisensoligonukleotide zu
einer Hemmung der Translation, da das Riosom sterisch gehindert wird. Modifiziert nach Kurreck,
2003 (144)
Die Halbwertszeit von Oligonukleotiden in biologischen Flüssigkeiten ist allerdings nur
gering, da ein rascher Abbau durch Nukleasen erfolgt. Um die Stabilität der verwendeten
Oligonukleotide
zu
erhöhen,
wurden
Modifikationen
des
5'
und
3'
Endes
der
Nukleotidsequenzen vorgenommen, hierbei wurden jeweils die ersten 5 und letzten 4 Basen
modifiziert. Die häufigste Modifikation, die auch in dieser Arbeit verwendet wurde, ist eine
Veränderung des Phosphoesters. Hierbei wird eines der nichtbindenden Sauerstoffatome
durch Schwefel ersetzt (Abbildung 2.7). Dadurch erhöht sich die Halbwertszeit in humanem
Serum von 1h auf 9-10h.
Abb. 7: Stabilisierung von Antisenseologonukleotiden
Durch Modifikationen des Zucker-Phosphat Rückgrats wird die DNA stabilisiert. Eines der
nichtbindenden Sauerstoffatome des Phosphoesters wird durch Schwefel ersetzt. Dies erhöht die
Halbwertszeit um den Faktor 10.
40
Target
unserer
Versuche
war
zunächst
die
Src
homology
domain
2
(SH2)-
Tyrosinphosphatase-1 (SHP-1). SHP-1 wurde in menschlichen Endothelzellen der
Umbilicalvene (HUVEC) als wichtiger Regulator der NADPH-Oxidase abhängigen SuperoxidProduktion identifiziert. In diesen Endothelzellen vermindert SHP-1 sowohl die basale als
auch die stimulierte Superoxid-Produktion (145).
In einer weiteren Gruppe von Experimenten wurde der muskarinische Acetylcholin-Rezeptor
(M3 Rezeptor), welcher die Acetylcholin (ACh) induzierte Gefäßdilatationen über Freisetzung
endothelialer Faktoren vermittelt, als Target ausgewählt. Um den im Endothel exprimierten
M3 Rezeptor auszuschalten, wurde eine in der Zellkultur erfolgreich eingesetzte Mischung
von
sechs
verschiedenen
gegen
die
mRNA
des
M3
Rezeptors
gerichteten
Antisenseoligonukleotiden verwendet (146). Die entsprechenden, gegen die mRNA
gerichteteten
Antisenseoligonukleotide
wurde
kommerziell
erworben
(MWG-Biotech,
Ebersberg).
Tabelle 5: Sequenz der verwendeten Oligonukleotide
Oligonukleotid
Sequenz (5' → 3')
Modifikation
SHP-1 antisense
SHP-1 nonsense
RAF1_nonsense
CCTTGAGCAGGGTCTCTGCATCC
CCGGCCCTGAAGCATG
TCCCGCGCACTTGATGCTTT
PS
PS
PS, 5' Fluorescein
M3 ACh antisense
M3 ACh antisense (1/6)
ACAGTCTCTCAATTGGACAG
CTGTTATTGTGCAAGGTCAT
GCTGCTCGAGAAACATTGTA
TGGAGAGGAGAAATTGCCAG
GAAGACCACTTGCCAGACGG
TGACCTTAAATGACACAATT
ATCAGATCGGCACAGGCCAG
PS
PS
PS
PS
PS
PS
PS
Alle
Versuche
wurden
in
C57Bl/6
Mäusen
durchgeführt.
Zur
Herstellung
des
Transfektionsgemisches wurden Antisenseoligonukleotide (0.01 µg / µl) und Eisenpartikel
(PolyMAG, 0.02 µg / µl) im Verhältnis 1:2 in isotonischer NaCl Lösung gemischt. Ein
Zeitraum von 30 min wurde zur vollständigen Aggregation eingehalten. Nach Narkotisierung
der Tiere wurde ein Katheter in die A. femoralis gelegt, durch den die an magnetische
Nanopartikel gekoppelten Antisenseoligonukleotide über den Zeitraum von einer Minute
injiziert wurden. Ein starker Magnet (Neodelta, IBS Magnet, Berlin) wurde während der
Injektion sowie weitere 15 Minuten nach Applikation unmittelbar über dem Hoden platziert.
Nach Verschließen der Wunde wurde die Narkose antagonisiert. Die vaskuläre Funktion
wurde drei Tage nach Transfektion intravitalmikroskopisch untersucht.
41
2.2.9
Cholesterinbestimmung
Das Gesamtcholesterin wurde im Plasma von hypercholesterinämischen Mäusen (ApoE-/-,
LDL-R-/-) nach Standardfutter oder einer fett- und cholesterinreichen Diät und von WildtypKontrollen (C57BL/6) bestimmt. Hierzu wurde in den Mäusen nach Abschluß des
durchgeführten Versuches die A. carotis freipräpariert. Das Gefäß wurde mit zwei
Baumwollfäden aufgespannt und katheterisiert. Über diesen Zugang wurde die Maus
exsanguiniert. Das entnommene Blutvolumen variierte zwischen 600 - 1000 µl. Die zur
Entnahme verwendete Spritze sowie der kurze Katheterschlauch waren mit 100µl
heparinisierter NaCl befüllt, so dass eine Endkonzentration von 12 – 30 IE / ml Heparin in der
Blutprobe erreicht wurde. Die Probe wurde sofort zentrifugiert (3000 rcf, 15 min,
Microzentrifuge MC-13, Amicon, Witten), das Plasma abgenommen und zur späteren
Cholesterinbestimmung eingefroren (-20 °C).
Die Cholesterinbestimmung erfolgte in Kooperation mit Dr. Dibbelt, Institut für Klinische
Chemie, Universität zu Lübeck. Es wurde ein kommerziell erwerblicher Kit zur
Cholesterinbestimmung verwendet (Cholesterol, Abbott Clinical Chemistry, Ludwigshafen).
Zunächst wurde die Probe mit Cholesterinesterasen versetzt, um Cholesterinester zu
Cholesterin und freien Fettsäuren zu hydrolisieren. Das freie Cholesterin und die
ursprünglich vorhandenen Menge an ungebundenem Cholesterin wird, durch das Enzym
Cholesterinoxidase
zu
Cholest-4-en-3-on
und
Wasserstoffperoxid
oxidiert.
Wasserstoffperoxid reagiert dann mit Hydroxybenzoesäure und 4-Aminophenazon zu einem
Chinonimin-Farbstoff. Die Quantifizierung des Chromophors erfolgte photometrisch bei
500nm.
2.2.10 Mikropipetten
Alle verwendeten Mikropipetten wurden aus Borosilikatglaskapillaren mit internem Filament
(Aussendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser 0,58 mm, Länge 100 mm) mit einem
Mikropipettenpuller (Model P-20 Sutter Instrument Co., Novato, CA, USA) gezogen. Da die
verwendeten Pipetten unterschiedlichen Anforderungen entsprechen mußten, wurden
verschiedene Programme, die in Tabelle 2.6 zusammengefaßt sind, zum Ziehen der
Kapillaren verwendet.
42
Tabelle 2.6: Herstellung von Mikropipetten
Aufgelistet sind die Programme die zum Ziehen von einfachen Stimulationspipetten, für die
Membranpotentialmessung verwendeten Stimulationspipetten und Elektroden benutzt wurden.
Pipettenart
Heat
Pull
Velocity
Time
einfache Stimulationspipette
cycle1
cycle2
285
315
170
40
160
150
100
Elektrodenpipette
cycle1
305
140
100
130
MP-Stimulationspipette
cycle1
cycle2
cycle3
300
300
310
-
70
50
110
150
200
150
2.3
Versuchsprotokolle
2.3.1
Genereller Versuchsablauf
Nach Präparation des Cremastermuskels und Überführung der Maus auf den Mikroskoptisch
wurde eine ca. 30 minütige Äquilibrationsphase eingehalten. Während dieser Zeit wurde das
Präparat auf gleichmäßige Perfusion, den Kontraktionszustand der Arteriolen sowie auf
eventuelle Blutungen im Muskel selbst überprüft. Bereiche, in denen der Blutfluß
unzureichend war, die Blutungen aufwiesen und Gefäße, welche zu dicht am Rand des
Präparates lagen, wurden vom Versuch ausgeschlossen. Es wurden zwei unterschiedliche
Versuchsabläufe durchgeführt. Um Konzentrations-Wirkungskurven zu erhalten, wurden die
Durchmesser von mehreren Gefäßen (8 - 12 Gefäße) in einem Präparat vor und nach
Behandlung
mit
unterschiedlichen
Agonisten
untersucht
(intermittierende
Durchmessermessung). Um die Durchmesseränderung kontinuierlich über die Zeit zu
beobachten wurden ein bzw. maximal vier Gefäße je Präparat über einen Zeitraum von zwei
Minuten kontinuierlich in ihrem Verhalten vor und nach Behandlung mit unterschiedlichen
Agonisten untersucht (kontinuierliche Durchmessermessung).
In einigen Versuchen wurde, um den NO- und Prostazyklin-unabhängigen Anteil der
Gefäßantwort zu untersuchen, Nω-nitro-L-arginin (L-NA, 30 µM), ein NO-Synthase Inhibitor
und Indomethacin, ein Hemmstoff der Cyclooxygenase (3 µM), superfundiert. Nach einer
Inkubationszeit von 20 Minuten erreichen die eingesetzten Konzentrationen in unserer
Präparation eine effektive Hemmung beider Enzyme (7). Um den maximalen Durchmesser
der untersuchten Arteriolen zu bestimmen, wurde am Ende jedes Versuches eine
Kombination aus den Vasodilatatoren SNP , Adenosin und Acetylcholin in supramaximalen
Konzentrationen (jeweils 30 µM) superfundiert.
43
2.3.2
Intermittierende Durchmesserbestimmung nach globaler Stimulation
Um
die
Bedeutung
verschiedener
Agonisten
unter
physiologischen
und
pathophysiologischen Bedingungen sowie die Beteiligung verschiedener K+-Kanäle an der
lokalen Dilatation zu untersuchen, wurden die Durchmesser der Arteriolen während
unterschiedlicher Behandlungen im Wildtyp und transgenen Mäusen bestimmt. Hierzu
wurden mehrere Gefäße untersucht, die jeweils unmittelbar vor und nach Stimulation mit den
Agonisten betrachtet wurden. Um zu gewährleisten, dass über die gesamte Versuchsdauer
immer
dieselben
Gefäßabschnitte
betrachtet
werden
konnten,
wurde
in
der
Äquilibrationsphase eine detaillierte Skizze des Gefäßbaums angefertigt. Nerven, Venen und
besonders markante Verläufe der Arteriolen dienten als Orientierungshilfe. In einem Präparat
wurden
8
-
12
Arteriolen
unterschiedlicher
Gefäßgenerationen,
unterschiedlichen
Kontraktionszustandes und unterschiedlicher Lage innerhalb des Gefäßbaumes zur
Durchmesserbeobachtung ausgewählt. Diese Arteriolen wurden im weiteren Versuchsablauf
in definierter Reihenfolge aufgesucht, jeweils etwa fünf Sekunden fokussiert und gleichzeitig
auf Videoband aufgenommen. Die Beobachtung aller ausgewählten Gefäße dauerte ca. eine
Minute und erfolgte sowohl unmittelbar vor Stimulation mit einem Agonisten als auch
während der Superfusion der vasoaktiven Substanz. Die Agonisten wurden dem Superfusat
wie bereits beschrieben mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe beigemischt. Die nächsthöhere
Konzentration oder eine weitere Substanz wurden erst untersucht, wenn die Gefäße den
Ausgangsdurchchmesser wiedererlangt hatten. Dies variierte je nach Agonist und
Kontraktionszustand der Arteriolen und dauerte etwa 1-5 Minuten.
2.3.3
Kontinuierliche Durchmesserbestimmung: fortgeleitete Vasomotorantworten
Die Arteriolen, an denen die Ausbreitung von lokal induzierten Dilatationen oder
Konstriktionen untersucht wurden, mussten mehreren Anforderungen entsprechen. Zum
einen war eine Gefäßlänge von mindestens 1.5 mm zwingende Voraussetzung um die
Durchmesseränderungen an den entfernten Positionen betrachten zu können. Zum anderen
sollte die Arteriole weder in Nachbarschaft zu einer Vene lokalisiert sein, um veno-arterielle
Diffusion der Agonisten ausschließen zu können, noch im Randbereich der Präparation
liegen. Des weiteren mußte die Arteriole einen ausreichenden Kontraktionszustand
aufweisen, um die Ausbreitung von lokal induzierten Dilatationen zu untersuchen. Die
Gefäßstimulation erfolgte über eine Mikropipette, welche mit Hilfe eines Mikromanipulators in
unmittelbarer Nähe des Gefäßes (Abstand < 15 µm) im Skelettmuskel positioniert wurde. Die
Mikropipette war mit der Stimulationssubstanz (Kaliumchlorid (3 M), Adenosin (10 mM),
Bradykinin (10 mM) oder Acetylcholin (10 mM) gefüllt und hatte einen Spitzendurchmesser
von ca. 2 µm. Durch Druckejektion (140 kPa, 50 - 800 ms) wurde ein sehr kleines Volumen
44
der Stimulationssubstanz lokal appliziert. Die Durchmesseränderung nach Stimulation wurde
an der lokalen Position und dann nach erneuter lokaler Stimulation an den entfernten
Positionen beobachtet. Die entfernt gelegenen Stellen (Stimulation mit KCl: 225 µm, 550 µm,
775 µm und 1100 µm; Stimulation mit Adenosin oder ACh: 550 µm, 1100 µm) wurden
stromaufwärts von der Stimulationsstelle gewählt, um einen konvektiven Transport des
Agonisten mit dem Blut zur beobachteten entfernten Stelle auszuschließen. Wenn die
Stimulationsstelle außerhalb des Blickfeldes lag, wurde nach jeder Stimulation die korrekte
Position der Mikropipette überprüft. Der Gefäßdurchmesser wurde sowohl an der
Stimulationsstelle als auch an entfernt gelegenen Positionen 30 Sekunden vor und 90
Sekunden nach Stimulation beobachtet und auf Videoband aufgezeichnet. Je nach
Fragestellung wurden anschließend Substanzen superfundiert und das Stimulationsschema
wiederholt.
2.3.4
Blockade von vaskulären K+-Kanälen
In Versuchen, die die Beteiligung von K+ und Na+ -Kanälen an lokalen und fortgeleiteten
Dilatationen untersuchen wurde nach Aufzeichnung der Kontrollserien, sowohl bei
Versuchen mit globaler als auch lokaler Stimulation Hemmer von K+-Kanälen superfundiert.
Die Messungen wurden daraufhin nach einer Inkubationszeit von ca. 20 - 30 Minuten
wiederholt. Charybdotoxin, Iberiotoxin, 4-Aminopyridin, Bariumchlorid, Bupivacain und
Mepivacain wurden in Wasser gelöst. UCL1684, Glibenclamid und die Kanal-Öffner DCEBIO
(5,6-Dichloro-1-ethyl-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one) und Cromakalim wurden in DMSO
gelöst und auf die im Versuch eingesetzten Konzentrationen weiter mit Wasser verdünnt. Die
maximale DMSO-Konzentration betrug für Superfusions-Experimente 1 % DMSO. Bei lokaler
Applikation der Kanalöffner war der Einsatz von 50 % DMSO im Lösungsmittelgemisch
erforderlich. Für alle Versuche, in denen DMSO zum Lösen von Substanzen eingesetzt
wurde, wurden Kontrollen mit DMSO in der entsprechenden Konzentration durchgeführt. Das
Präparat wurde in der Regel einige Zeit mit den Blockern vorinkubiert, der Blocker wurde
dann während des Versuchs weiter superfundiert. Ausnahme waren die Substanzen
Charybdotoxin und Iberiotoxin, hier wurde das Präparat lediglich vorinkubiert, die
nachfolgende Messung wurde innerhalb von 45 Minuten durchgeführt. Tabelle 2.7 und 2.8
geben eine Übersicht über die verwendeten Substanzen.
45
Tabelle 2.7: Ionenkanal-Blocker
Kanal
Blocker
Konzentration
Lösungsmittel
Inkubation
Superfusion
IKCa / BKCa
BKCa
SKCa
KV1.5/1.6
KIR 2.1
KATP
Na+ / K+
Na+ >> K+
Charybdotoxin
Iberiotoxin
UCL 1684
4-Aminopyridin
Barium
Glibenclamid
Bupivacain
Mepivacain
1
0.1
100
1
75
1
100
200
µM
µM
µM
µM
µM
µM
µM
µM
H2O
H2O
1% DMSO in H2O
H2O
H2O
0,5% DMSO inH2O
H2O
H2O
20min
20min
20min
20min
15min
30min
20min
20min
nein
nein
ja
ja
ja
ja
ja
ja
Konzentration
Lösungsmittel
Applikationsart
50% DMSO in H2O
0,5% DMSO in H2O
50% DMSO in H2O
lokal
global
lokal
Tabelle 2.8: K+-Kanal Öffner
K+-Kanal
Kanal-Öffner
IKCa
IKCa
KATP
DCEBIO
DCEBIO
Cromakalim
2.3.5
Um
1 mM
10 µM
1 mM
das
vaskulärer
Zellen
sowie
die
Änderung
des
Membranpotentials nach lokaler Stimulation zu untersuchen, wurde zunächst mit einem
Mikromanipulator (M-152, Narishige, Tokio) eine Stimulationspipette am stromabwärts
gelegenen Ende der freipräparierten Arteriole in einem Abstand von 5 – 10 µm vor dem
Gefäß positioniert. Die Applikation der Substanzen erfolgte über einen Druckgeber. Durch
steigende Druckpulsdauer (50 - 7000 ms) konnten ansteigende Konzentrationen des
Agonisten erreicht werden. Um zu verfizieren, dass der applizierte Bolus das Gefäß erreicht,
wurde der Stimulationslösung eine kleine Menge Carboxyfluorescein (ca. 1:1000)
beigemischt. Die Ejektion des Agonisten konnte somit unter Fluoreszenzmikroskopie verfolgt
werden und wurde nach jeder Zellpenetration überprüft. Die Mikroelektrode wurde von der
gegenüberliegenden Seite des Gefäßes, stromaufwärts von der Stimulationspipette mit
einem elektrischen Mikromanipulator (PM 20H, Samwoo Scientific Co., Seoul, Korea) in
einem Winkel von etwa 45° positioniert. Der Mikromanipulator wurde über einen Joystick
bedient, der auch den Piezostepper steuerte. Die verwendeten Mikroelektroden hatten einen
Spitzendurchmesser < 1 µm und einen elektrischen Widerstand von ca. 80 - 120 MΩ . Die
Spitze der Elektrode war lang ausgezogen und daher so flexibel, dass sie sich in der
Gefäßwand bewegen konnte. Kontakt der Elektrodenspitze mit einer Zellmembran führte zu
einem raschen Spannungsabfall auf dem Oszilloskop. Zellpenetration erfolgte durch schnelle
kurze Vorwärtsbewegung der Elektrode. Kriterien für eine erfolgreiche Punktion waren 1. ein
rascher Potentialabfall, 2. ein geringer Widerstand über die Zellmembran, 3. ein stabiles
46
Potential über mindestens 30 s, sowie 4. eine schnelle Rückkehr auf den Nullwert nach dem
Austritt der Elektrode aus der Zelle. Sobald die Mikroelektrode die Zellmembran penetriert
hatte, wurde der Stromimpuls am Verstärker ausgeschaltet und die Messung begonnen.
Gemessen wurde sowohl das Ruhemembranpotential als auch die Potentialänderung nach
Gefäßstimulation mit steigenden Konzentrationen von ACh und Adenosin. Nach Penetration
der Zelle diffundiert der Fluoreszenzfarbstoff aus der Mikroelektrode in die gemessene Zelle
und ermöglicht so deren Identifizierung als Endothelzelle oder glatte Muskelzelle. Die
Identifizierung der vaskulären Zellen erfolgte direkt im Anschluß an die Messung mittels
Fluoreszenzmikroskopie anhand ihrer jeweils charakteristischen Ausrichtung in Bezug auf
das Gefäß.
1
2
Abb. 2.8: Schematische Darstellung einer für die Membranpotentialmessung isolierten
Arteriole
Zur Membranpotentialmessung wurden eine Arteriole von dem umgebenden Skelettmuskel
freipräpariert und Zellen in einem Winkel von 45 - 90° mit der Messelektrode penetriert (1). Stimulation
mit ACh und Adenosin erfolgte über zwei stromaufwärts der Messelektrode in unmittelbarer Nähe der
Gefäßwand positionierten Stimulationspipetten (2).
2.3.6
Magnetofektion
Mittels Magnetofektion transient transfizierte Mäuse wurden drei Tage nach Transfektion
untersucht. Hierzu wurden die Tiere wie bereits beschrieben narkotisiert und präpariert.
Gefäßantworten wurden vor und nach globaler Stimulation mit ACh und SNP (10-7 - 10-5 M)
sowie Adenosin (10-6 M) aufgezeichnet. In einer Reihe von Vorversuchen wurde außerdem
der Effekt einer Kompression der abdominalen Aorta auf die Transfektion untersucht,
wodurch der Blutfluß im Cremastermuskel während der Applikation von AntisenseOligonukleotiden unterbunden werden konnte.
47
2.4
Datenauswertung
2.4.1
Durchmesserbestimmung
Die Bestimmung der Innendurchmesser der Gefäße erfolgte im Anschluss an den Versuch
anhand der aufgezeichneten Videosequenz mit kommerziell erwerblicher Software
(LABView, National Instruments), welche in unserem Labor an den jeweiligen Bedarf
angepasst wurde. Das Video wurde zunächst digitalisiert, im Anschluß daran wurde nach
Erreichen der jeweiligen zu messenden Position die Gefäßränder mit zwei parallelen Balken
markiert. Der Abstand der beiden Balken, multipliziert mit einem Faktor, um die
Vergrößerung des Mikroskops zu berücksichtigen, ergab den Durchmesser des Gefäßes.
Die vorherige Kalibration erfolgte mittels eines Objektmikrometers dessen Abbildung durch
das Mikroskop auf Videoband aufgezeichnet wurde.
Die kontinuierliche Durchmesserbestimmung erfolgte anhand des analog aufgezeichneten
Videos. Hierzu wurde ein rechteckiger Kasten auf das Abbild des Gefäßes gelegt. Der
Durchmesser des Rechtecks konnte mittels Tastendruck verändert werden, so dass der
Untersucher die Balken über den Untersuchungszeitraum hinweg immer entsprechend dem
jeweiligen Innendurchmesser auf den Gefäßrändern positionieren konnte. Die gemessenen
Durchmesserwerte wurden kontinuierlich mit einer Frequenz von 2 Hz auf der Festplatte
gespeichert. Die maximale Auflösung, die mit unserem System erreicht werden konnte,
betrug 0.5 µm.
2.4.1.1 Berechnung bei intermittierender Durchmesseruntersuchung
Um den Tonus (Kontraktionszustand) der Arteriolen zu untersuchen, wurde der
Ruhedurchmesser (D0) jedes Gefäßes auf seinen maximalen Durchmesser (Dmax).
Tonus = D0 / Dmax
Hierbei ist (D0) der Ruhedurchmesser des Gefäßes im unbehandelten Zustand. Dmax ist der
maximale Durchmesser, der durch Superfusion von SNP, ACh und Adenosin (30 µM) am
Ende des Versuches ermittelt wurde. Der Tonus ist umso höher, je kleiner die
dimensionslose Zahl.
48
Die Dilatation der Arteriolen nach Superfusion von Agonisten wurde in Prozent der
maximalen Dilatation angegeben und nach folgender Formel berechnet:
% der maximalen Dilatation = [(Di – D0) / (Dmax – D0)] x 100
Hierbei ist Di der Durchmesser während der Behandlung mit einem Agonisten, D0 der basale
Gefäßdurchmesser, welcher unmittelbar vor Behandlung gemessen wurde, und Dmax der
maximale Durchmesser. Die Normalisierung der Durchmesseränderung des Gefäßes (Di –
D0) auf die maximal mögliche Dilatation (Dmax – D0) der Arteriole ermöglicht es, die
Gefäßantwort unabhängig von dem absoluten Durchmesser bzw. Kontraktionszustand zu
beurteilen.
Die Berechnung der Konstriktion erfolgte entsprechend, wobei die maximal erreichbare
Änderung ein Durchmesser von 0 ist, und sich folgende Formel ergibt:
% der maximalen Antwort =(Di / D0 x 100) - 100
Zur genaueren Charakterisierung der Konzentrations - Wirkungsbeziehungen wurden EC50,
die Konzentration die eine halbmaximale Antwort hervorruft, und Emax, die maximale Antwort
bestimmt. Emax und EC50 wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse nach folgender
Formel errechnet:
E = Emax x Konzentration / (EC 50 + Konzentration)
Hierbei ist E jeweils der gemessene Effekt (Dilatation), der bei der jeweiligen untersuchten
Konzentrationen aufgetreten ist. Signifikante Änderungen der Emax und EC50 wurden nach
der von Meddings und Mitarbeitern (147) beschriebenen Methode errechnet.
2.4.1.2 Kontinuierliche Durchmesserbestimmung
Die Berechnung des Gefäßtonus erfolgte bei Versuchen in denen der Durchmesser
kontinuierlich bestimmt wurde, innerhalb des Zeitintervalls von 30 Sekunden vor der
Stimulation. Hierzu wurde der Mittelwert aus den Daten vor Stimulation gebildet und durch
den maximalen Gefäßdurchmesser geteilt. Die Berechnung des prozentualen Anteils der
maximal möglichen Antwort erfolgte bei der kontinuierlichen Durchmesserbestimmung für
jede Sekunde separat, hierbei wurde als Ruhedurchmesser (D0) der Mittelwert aus den
Durchmesserwerten 30 Sekunden vor der Applikation des Agonisten verwendet. Die Zeit der
gesamten Antwort (Dauer der Konstriktion bzw. Dilatation) wurde aus dem Zeitintervall
49
zwischen
Gefäßstimulation
und
dem
Wiedererreichen
des
Ausgangsdurchmessers
errechnet. Aus der Dauer der Antwort und der aktuellen Durchmesseränderung zu den
verschiedenen Zeitpunkten wurde das Integral der Gefäßantwort errechnet (area under
curve, AUC).
2.4.1.3 Membranpotentialmessung
Die arteriolären Durchmesser wurden mit LABView (National Instruments) bestimmt. Das
Membranpotential wurde mit dem open source Datenverarbeitungsprogramm XmAD
(http://www.ibiblio.org/pub/Linux/science/lab)
Anschließend
wurden
die
Dateien
auf
einem
mit
Linuxsystem
dem
aufgezeichnet.
Programm
XmANA
(http://www.ibiblio.org/pub/Linux/science/lab) analysiert und konvertiert.
2.5
Statistik
Alle Daten wurden mit dem Statistikprogramm Stata 8.0 (Stata Corporation, College Station,
Texas, USA) weiterverarbeitet. Es wurden Zusammenfassungen gebildet, Größen abgeleitet
und statistische Vergleiche angestellt.
Alle dargestellten Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) angegeben.
Statistische Vergleiche zweier Behandlungen untereinander wurden, in Abhängigkeit von
den Versuchsvariablen, mit einem t-test für gepaarte oder ungepaarte Werte durchgeführt.
Unterschiede wurden als signifikant erachtet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner 5 %
(p < 0.05) war.
ERGEBNISSE
3
Ergebnisse
3.1
Mechanismen lokaler und fortgeleiteter Dilatationen
3.1.1
Connexin40 Expression in Arteriolen des M. cremaster
50
Gap Junctions bestehen aus interzellulären Kanälen, die aus Connexinen aufgebaut sind. In
vaskulären Zellen wurden bisher vier Connexine (Cx) identifiziert, Cx43, Cx40, Cx37 und
Cx45. Aufgrund der zentralen Rolle von Cx40 bei der Fortleitung von Acetylcholin induzierten
Dilatationen sollte dessen Expression in vaskulären Zellen des Cremastermuskels der Maus
gezeigt werden.
Zur Etablierung der Methode in unserem Labor wurde die Cx40-Immunfärbung zunächst an
der Aorta und im Vorhof des Herzens (148, 149) von Wildtyp- und Cx40-defizienten Mäusen
durchgeführt. In der Maus wird Cx40 in den Vorhöfen und im proximalen Teil des
ventrikulären Leitungssystems exprimiert (149-151). Connexine ermöglichen hier die
elektrische Kopplung von Kardiomyozyten. In der Aorta wird Cx40 im Endothel exprimiert
(57, 151, 152), daher wurden Vorhof und Aorta zunächst als Positivkontrollen verwendet.
Wie erwartet wurde Cx40 im Vorhof und der Aorta von C57BL/6 Mäusen exprimiert (Abb. 3.1
A,C), in Cx40-defizienten Mäusen war Cx40 hingegen nicht detektierbar (Abb 3.1 B,D). Cx40
wurde in der Aorta an den Zellgrenzen der Endothelzellen lokalisiert, die anhand ihrer
longitudinalen Ausrichtung entlang der luminalen Gefäßoberfläche identifiziert werden
konnten.
ERGEBNISSE
51
Cx40+/+
Cx40-/-
A
B
C
D
Vorhof
Aorta
Abb.3.1: Connexin40 Expression in Vorhof und Aorta in C57BL/6 und Cx40 defizienten Mäusen.
Spezifische Connexin-Färbung in Kardiomyozyten des Vorhofs (A) und Endothelzellen der Aorta (C).
Abbildung C zeigt eine luminale Aufsicht auf die Aorta. Cx40 wurde an den Grenzen der
Endothelzellen nachgewiesen, die durch ihre longitudinale Ausrichtung entlang des Gefäßes
identifiziert werden konnten. B,D: Die Behandlung von Präparaten aus Cx40 defizienten Mäusen
zeigte wie erwartet keine detektierbare Färbung. Balken entspricht 50µm.
Die Detektion von Cx40 in den Arteriolen des Cremasters erfolgte am ganzen
Muskelpräparat. Die Behandlung mit Cx40-Antikörpern ergab eine spezifische Färbung von
Cx40 (Abb. 3.2). In den Arteriolen des M. cremaster konnte Cx40 ebenfalls an den
Zellgrenzen der Endothelzellen lokalisiert werden (Abb. 3.2 A-D). Die Spezifität der Färbung
wurde durch das Fehlen eines Signals in Cx40 defizienten Mäusen (Abb.3.2 E) sowie durch
Immunfluoreszenz in einem Muskel einer Wildtypmaus, der als Negativkontrolle nicht mit
dem primären Antikörper inkubiert wurde, (Abb. 3.2 F) gezeigt.
ERGEBNISSE
52
Abb. 3.2: Connexin40 Expression in Arteriolen des M. cremaster der Maus.
Gezeigt sind Cx40-Färbung (rot) und Kernfärbung (blau). A-D: Cx40 Färbung in Arteriolen
unterschiedlicher Größe im Wildtyp. Die Kernfärbung zeigt die Zellkerne von glatten Muskelzellen
perlenschnurartig entlang des Gefäßes aufgereiht sowie längliche Endothelzellkerne (B). Die
Lokalisation von Cx40 an den Zellgrenzen der Endothelzellen ist deutlich sichtbar. E: Cx40-Expression
und Kernfärbung in einer Cx40 defizienten Maus. Wie zu erwarten wird Cx40 nicht exprimiert. F: Als
Negativkontrolle wurde der Cremaster (Wildtyp) ohne primären Antikörper inkubiert. Der sekundäre
Antikörper verursacht keine unspezifische Färbung. Die Pfeile zeigen den Gefäßverlauf (E,F). Balken
entspricht 20µm.
ERGEBNISSE
3.1.2
53
Acetylcholin und KCl-induzierte Fortleitung bei endothelialer Cx40 Defizienz
Homologe Rekombination ermöglicht es, spezifisch bestimmte Gene in der Keimbahn von
Mäusen zu mutieren und somit auszuschalten (153, 154). Die Funktion einzelner Proteine
kann
so
in
vivo
untersucht
werden.
Um
die
Geninaktivierung
auf
bestimmte
Zellsubpopulation zu begrenzen, stehen Systeme für ein konditionelles, zelltypspezifisches
Gen-Targeting
(155)
sequenzspezifische
zur
Verfügung.
Rekombinase
aus
Das
dem
Cre-lox-System
Cre/loxP
macht
sich
eine
Rekombinationssystem
des
Bakteriophagen P1 zunutze. Es benötigt zwei Komponenten: das rekombinierende Protein
Cre-Rekombinase sowie die Cre-spezifische Erkennungssequenz loxP (156, 157) Zur
Generierung konditioneller „Knockouts“ wird ein Target-Konstrukt mit zwei die Zielsequenz
flankierenden loxP-Stellen verwendet. Kreuzung der loxP-tragenden Maus mit einer
transgenen Maus, die das Gen für die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines
zelltypspezifischen Promotors exprimiert (endothelialer Promotor: Tie-2), führt zum
Herausschneiden der von loxP-flankierten Zielsequenz (Cx40) im Zielgewebe (Endothel)
(155). Basierend auf diesem System wurden Mäuse mit einem endothelialen Cx40-Verlust
untersucht. Die Mäuse waren außerdem homozygot defizient für ApoE und hatten einen
C57BL/6 Hintergrund. Sie wurden freundlicherweise von Dr. Kwak, Division of Cardiology,
University of Geneve, zur Verfügung gestellt. Es wurden 5 Mäuse mit einem endothelialen
Cx40-Verlust (eCx40-/-) und als Kontrolle 2 Mäuse mit einem gefloxten Cx40-Gen ohne Cre Rekombinase untersucht.
Wie bereits von unserer Arbeitsgruppe gezeigt wurde, ist die Ausbreitung von AChDilatationen in Cx40-defizienten Mäusen beeinträchtigt, wohingegen die Ausbreitung von
KCl-induzierten Konstriktionen nicht beeinflußt wird. Dies könnte durch unterschiedliche
Ausbreitungswege entlang der endothelialen oder glattmuskulären Zellschicht bedingt sein.
Daher wurde der Effekt eines endothelialen Cx40-Verlustes auf die Fortleitung von
Vasomotorantworten untersucht, indem Gefäße lokal mit ACh oder KCl stimuliert wurden.
Die untersuchten Gefäße (n = 10) hatten einen maximalen Durchmesser von 25 bis 40 µm
(Mittelwert: 32 ± 1 µm). Lokalisierte Applikation von ACh induzierte sowohl in Kontrolltieren
als auch in eCx40-/- Tieren nach 2 ± 0.2 s eine rasche Dilatation, deren Maximum nach 11 ±
2 bzw. 9 ± 1 s in Cx40+/+ oder eCx40-/- Tieren erreicht wurde (Abb. 3.3 A). Die lokale
Dilatation breitete sich ohne zeitliche Verzögerung (<1s) entlang des Gefäßes aus.
ERGEBNISSE
54
A
Kontrolle
% der maximalen Dilatation
ACh
90
eCx40 ko
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
60
90
-30
0
30
Zeit
[s] [s]
Zeit
ZeitZeit
[s]
60
90
-30
0
[s]
30
60
90
Zeit [s]
% der maximalen Antwort
B
KCl
30
0
lokal
-30
0
Zeit [s]
60
275µm
0
60
Zeit [s]
550µm
0
Zeit [s]
775µm
60
0
Zeit [s]
1100µm
60
0
60
Zeit [s]
Abb. 3.3: Fortgeleitete Vasomotorantworten in eCx40 defizienten Mäusen.
Die Arteriolen wurden lokal mit ACh oder KCl stimuliert. Dargestellt sind die Durchmesseränderungen
an der lokalen Position und (nach erneuter lokaler Stimulation) an den entfernten Positionen
stromaufwärts von der Stimulationsstelle über die Zeit. A: Lokalisierte Stimulation mit ACh führte zu
einer raschen Dilatation, die sich entlang des Gefäßes in die Entfernung ausbreitet. B: Lokale
Stimulation der Arteriolen mit KCl löste eine fortgeleitete Konstriktion aus. Kontrolle: n=3 Gefäße in 2
Mäusen, eCx40-/-: n= 7 Gefäße in 4 Mäusen
In der eCx40-/- Gruppe erfolgte eine stärkere lokale Stimulation mit ACh als in der
Kontrollgruppe (79 ± 3 vs 65 ± 2 % der maximalen Dilatation, p<0.01). Dennoch war die
Amplitude der Dilatation in eCx40-/- Tieren in einer Entfernung von 1100 µm verringert (55 ±
5 % der maximalen Dilatation), wohingegen die Amplitude der Dilatation in der
Kontrollgruppe über diese Entfernung nicht abnahm (72 ± 6 % der maximalen Dilatation). Die
Dauer der Dilatation verringerte sich in der eCx40-/- Gruppe von 42 ± 4 s (lokal) auf 24 ± 2 s
(1100 µm), während die Dauer der Dilatation der Dilatation in den Kontrollen konstant blieb
(lokal: 32 ± 4 s, 1100 µm: 35 ± 7s, Abb. 3.4 A). Um dies weiter zu analysieren, wurden die
Gefäßantworten auf die lokale Dilatation normalisiert. Diese Normalisierung zeigt, dass die
Dilatation in eCx40-/- mit der Entfernung deutlich abnahm, wohingegen die Amplitude in den
Kontrolltieren konstant blieb (Abb. 3.5)
Die Ausbreitung von Vasokonstriktionen, induziert durch lokale Depolarisation (KCl), wurden
in 4 Arteriolen in 2 Kontrolltieren und 8 Arteriolen in 5 eCx40-/- Mäusen untersucht. Die
Arteriolen hatten in beiden Gruppen einen ähnlichen Durchmesser (51 ± 1 µm). Lokale
ERGEBNISSE
55
Applikation von KCl führte in beiden Gruppen zu einer raschen Konstriktion an der lokalen
Stelle (51 ± 6 bzw. 51 ± 4 % der maximalen Antwort). Dieses Maximum wurde in den
Kontrolltieren nach 4 ± 0.6 s und in eCx40-/- Tieren ebenfalls nach 4 ± 0.4 s erreicht und
unterschied sich somit nicht. Auch die Dauer der lokalen Konstriktion war in beiden Gruppen
gleich (Abb. 3.4 B). Die Konstriktion breitete sich ohne zeitliche Verzögerung entlang der
Arteriole aus (Abb. 3.3 B), wobei die Amplitude mit zunehmender Entfernung in beiden
Gruppen in identischer Weise abnahm (Abb. 3.5). Interessanterweise war die Entfernung,
über die sich die Konstriktion erstreckte, deutlich kleiner als dies bei den ACh-induzierten
Dilatationen zu beobachten war (Abb.3.4 B). Dies läßt vermuten, dass unterschiedliche
Fortleitungswege an der Ausbreitung von Dilatationen und Konstriktionen beteiligt sind. Da
der endotheliale Cx40-Verlust nur die Ausbreitung der Dilatation modifiziert, steht das
Endothel als Leitungsweg hierbei wahrscheinlich im Vordergrund und benötigt Cx40.
A
100
Amplitude
80
*
KCl
-60
B
ACh
*
60
40
20
0
Amplitude
-50
-40
-30
-20
-10
0
60
550
1100
0
Kontrolle
eCx40-/-
Dauer
Zeit [s]
40
*
*
275
30
Zeit [sec]
0
550
825
1100
Kontrolle
eCx40-/-
Dauer
20
10
20
0
0
0
550
1100
Entfernung von der Stimulationsstelle [µm]
0
275
550
825
1100
Abb. 3.4: Amplitude und Dauer der Ausbreitung von lokal induzierten ACh und KCl Antworten.
Amplitude (oben) und Dauer (unten) der ACh-Dilatationen (A) und der KCl-induzierten Konstriktionen
(B) entlang der Arteriole. Kontrolle n = 3 - 4 in 2 Mäusen, eCx40-/- n = 7 - 8 in 5 Tieren. * t-Test p ≤
0.01 vs lokal.
ERGEBNISSE
56
Amplitude
Amplitude
KCl
100
*
50
eCx40+/+
eCx40-/0
0
550
% der lokalen Antwort
% der lokalen Antwort
ACh
1100
100
50
eCx40+/+
eCx40-/0
0
275
550
825
1100
Abb. 3.5: Amplitude nach Normalisierung der Antworten.
Dargestellt sind die Gefäßantworten entlang der Arteriole nach Normalisierung auf die lokal induzierte
Antwort. Die Dilatation nach ACh-Stimulation nahm in eCx40-/- Tieren über die Strecke ab, was in der
Kontrolle nicht zu beobachten war. Die Amplitude der Konstriktion nach KCl nahm in beiden Gruppen
mit der Entfernung monoton ab. * t-Test p ≤ 0.01 vs lokal.
3.1.3 Bedeutung von KCa als Effektoren lokaler und fortgeleiteter Dilatationen
Die endotheliale Hyperpolarisation ist das zentrale Ereignis bei der Auslösung von ACh
induzierten Dilatationen. Die endotheliale Hyperpolarisation beruht auf einer Aktivierung von
KCa-Kanälen. In vaskulären Zellen werden unterschiedliche KCa-Kanäle exprimiert, die
aufgrund ihrer Leitfähigkeit in BKCa- (große Leitfähigkeit), IKCa- (mittlere Leitfähigkeit) und
SKCa-Kanäle (kleine Leitfähigkeit) unterschieden werden. Spezifische Blocker hemmen
selektiv diese Kanäle, Apamin und UCL1684 SKCa-, Charybdotoxin BKCa- und IKCa- und
Iberiotoxin BKCa-Kanäle. Die Rolle von KCa als Effektoren von Dilatationen, die durch
Agonisten (Acetylcholin, Bradykinin oder Adenosin) ausgelöst werden, sollte in Tieren
defizient für BKCa- oder IKCa-Kanälen in Kombination mit diesen Blockern untersucht werden.
3.1.3.1 Beteiligung von BKCa an der Auslösung und Fortleitung von Dilatationen
Die untersuchten Mäuse waren defizient für die porenbildende Untereinheit des BKCa-Kanals
(BK-/-). Der genetische Hintergrund der Tiere war eine Kombination aus SV129 und C57BL/6
(immer F2-Generation, 18 Tiere).
3.1.3.1.1
Ruhetonus in BKCa defizienten Mäusen
Der Gefäßtonus wurde berechnet, indem das Verhältnis aus Ruhedurchmesser und
maximalem Durchmesser der Arteriolen gebildet wurde. In diese Berechnung wurden
ausschließlich Gefäße einbezogen, die in den Experimenten zur globalen Stimulation mit
ERGEBNISSE
57
Tabelle 3.1: Ruhetonus in Arteriolen von BK-/-, BK+/+ und C57BL/6 Mäusen.
Angegeben ist die Anzahl der Gefäße (n) und deren spontaner Kontraktionszustand (Tonus), der sich
aus dem Ruhedurchmesser und dem maximalen Durchmesser (Maximum, angegeben in µm)
errechnet. Der Tonus ist angegeben für unbehandelte Arteriolen (Kontrolle) und nach Hemmung der
NO-Synthase und Cyclooxygenase (LNA, 30 µM, Indo, 3 µM) sowie nach Blockade des BKCa-Kanals
mit Iberiotoxin (Ibtx, 0.1 µM). * t-Test p≤ 0.01 vs Kontrolle.
n
Maus
Behandlung
Tonus
Durchmesser
Maximum
50
47
79
55
21
49
21
BK+/+
BK-/BK+/+
BK-/Bl6
BK+/+
Bl6
Kontrolle
Kontrolle
Indo LNA
Indo LNA
Indo LNA
Indo LNA Ibtx
Indo LNA Ibtx
0.36 ± 0.02
0.41 ± 0.02
0.25 ± 0.02 *
0.27 ± 0.02 *
0.22 ± 0.03
0.24 ± 0.02
0.24 ± 0.04
14 ± 1
15 ± 1
9±1
10 ± 1
6±1
9±1
8±2
39 ± 1
36 ± 2
37 ± 1
35 ± 2
29 ± 2
34 ± 2
29 ± 2
ACh untersucht wurden, wobei der Ruhedurchmesser den Durchmesser vor Stimulation mit
den Agonisten darstellt. Die maximalen Durchmesser der untersuchten Gefäße waren in
BK-/- und deren Wildtypwurfgeschwister identisch. Somit wurden Gefäße gleicher
Generationen untersucht. Der Tonus in diesen Arteriolen war in BKCa-defizienten Tieren nicht
unterschiedlich zu den Wildtypen (Tabelle 3.1). Hemmung der NO-Synthase und
Cyclooxygenase (L-Nitroarginin und Indomethacin, LNA Indo) führte in beiden Genotypen zu
einer signifikanten Erhöhung des Tonus. Eine zusätzliche Blockade von BKCa mit Iberiotoxin
hatte weder in BK+/+, BK-/- noch in BL6 einen Effekt auf den Ruhetonus. Dies zeigt, dass
die basale Aktivität des BKCa den Ruhedurchmesser nicht beeinflußt, wohingegen NO und/
oder Prostazyklin-Synthese kontinuierlich erfolgt und dilatierend ist.
3.1.3.1.2
Rolle von BKCa als Effektor der NO und cGMP induzierten Dilatation
Die Aktivierung des NO/cGMP/Proteinkinase G Signaltransduktionsweges führt zu einer
Relaxation von glatten Muskelzellen, die in einigen Präparationen partiell über eine
Aktivierung von BKCa-Kanälen erfolgt. Deshalb sollte die Beteiligung von BKCa bei NO und
cGMP-Dilatationen in Arteriolen getestet werden. Hierzu wurde die Dilatation nach globaler
Superfusion von NO-Donoren (DEA NONOate und SNP, 0.3-10 µM) sowie dem
zellpermeablen cGMP Derivat 8-pCPT-cGMP (1-10 µM) in BKCa-defizienten Tieren und
Wildtypen untersucht. In BK+/+ Tieren wurden 50 Arteriolen mit einem maximalen
Durchmesser von 39 ± 1 µm untersucht, in BK-/- 47 Arteriolen. Der maximale
Gefäßdurchmesser betrug 36 ± 2 µm und unterschied sich nicht zwischen den Gruppen. Der
NO-Donor SNP bewirkte in beiden Gruppen eine konzentrationsabhängige Dilatation. Das
Ausmaß der SNP-induzierten Dilatation war bei einer Konzentration von 10µM in den BKCa -/-
ERGEBNISSE
58
*
50
25
0
0.3
1
10 µM
DEA NONOate
75
50
25
0
0.3
1
10 µM
SNP
75
BK+/+
BK-/8-pCPT-cGMP
75
50
25
0
1
10 µM
Abb. 3.6 NO induzierte Dilatationen in Tieren defizient für BKCa-Kanäle
Globale Stimulation mit steigenden Konzentrationen der NO Donoren SNP und DEA NONOate sowie
des zellpermeablen cGMP Analogon 8-pCPT-cGMP induzierte konzentrationsabhängige Dilatationen
in beiden Genotypen. Die Gefäßantwort war in BK-/- Tieren nicht abgeschwächt. BK+/+: n=50 Gefäße
in 5 Tieren, BK-/-: n=47 Gefäße in 5 Tieren. * t-Test p ≤ 0.01 vs BK+/+.
Tieren signifikant erhöht (43 ± 4 vs 61 ± 4 % der maximalen Dilatation). Ein chemisch
unterschiedlicher
NO-Donor,
DEA
NONOate,
induzierte
ebenfalls
eine
konzentrationsabhängige Dilatation in den Arteriolen, die in BKCa +/+ und BKCa -/- Mäusen
aber nicht unterschiedlich war (10 µM: 61 ± 4 vs 63 ± 4 % der maximalen Dilatation). Das
zellpermeable
cGMP-Derivat
8-pCPT-cGMP
bewirkte
ebenfalls
eine
konzentrationsabhängige Dilatation von ähnlichem Ausmaß in beiden Gruppen (10 µM: 21 ±
4 vs 23 ± 2 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.6). Diese Ergebnisse zeigen, dass BKCaKanäle als Effektoren von NO-induzierten Dilatationen in der Mikrozirkulation keine Rolle
spielen.
3.1.3.1.3
Beteiligung von BKCa an Dilatationen nach ACh und Adenosin
Um die Rolle der BKCa als Effektoren von ACh und Adenosin induzierten Dilatationen zu
untersuchen, wurden die Arteriolen global mit steigenden Konzentrationen der Agonisten
stimuliert (0.3-10 µM) und die Dilatation in BK+/+ (n = 50 Gefäße in 5 Tieren) und BK-/(n = 47 Gefäße in 5 Tieren) untersucht. Acetylcholin induzierte in Wildtypen und BKCa
defizienten Tieren eine konzentrationsabhängige Dilatation, die durch BKCa-Defizienz nicht
abgeschwächt wurde. 10 µM ACh induzierte in BK+/+ Tieren 79 ± 4 und in BK-/- Mäusen
73 ± 4 % der maximalen Dilatation. Adenosin induzierte-Dilatationen waren in BK-/- Mäusen
ebenfalls unverändert (10 µM: 48 ± 4 vs 52 ± 5 % der maximalen Dilatation). Nur bei einer
Konzentration von 0.3 µM war die Dilatation in BK-/- Mäusen signifikant stärker (5 ± 3 vs
19 ± 4 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.7).
59
90
ACh
60
30
BK+/+
BK-/-
0
-7
-6
ERGEBNISSE
-5
90
Adenosin
BK+/+
60
BK-/30
*
0
-7
[log mol/l]
-6
-5
[log mol/l]
Abb 3.7: Dilatationen nach globaler Stimulation mit ACh und Adenosin.
Die Dilatation ist dargestellt als % der maximalen Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration von
ACh (links) und Adenosin (rechts) nach globaler Stimulation. Die ACh und Adenosin induzierten
Dilatationen waren in BKCa-defizienten Tieren nicht abgeschwächt. BK+/+: n=50 Gefäße in 5 Tieren
BK-/-: n=47 Gefäße in 5 Tieren. * t-test p ≤ 0.01 vs BK+/+.
Acetylcholin
induzierte
in
Wildtypen
und
BKCa-defizienten
Tieren
eine
konzentrationsabhängige Dilatation, die durch BKCa -Defizienz nicht abgeschwächt wurde.
10 µM ACh induzierte in BK+/+ Tieren 79 ± 4 und in BK-/- Mäusen 73 ± 4 % der maximalen
Dilatation. Adenosin induzierte-Dilatationen waren in BK-/- Mäusen ebenfalls unverändert
(10 µM: 48 ± 4 vs 52 ± 5 % der maximalen Dilatation). Nur bei einer Konzentration von
0.3 µM war die Dilatation in BK-/- Mäusen signifikant stärker (5 ± 3 vs 19 ± 4 % der
maximalen Dilatation, Abb. 3.7).
3.1.3.1.4
Fortleitung von ACh Dilatationen in BKCa defizienten Mäusen
Um die Rolle von BKCa-Kanälen bei der Ausbreitung von lokal induzierten fortgeleiteten AChDilatationen zu untersuchen, wurde die Fortleitung in BK+/+ Tieren (n=8 Arteriolen in 6
Tieren) und BK-/- Tieren (n= 12 Arteriolen in 9 Tieren) untersucht . Die lokale Applikation von
ACh mittels eines Druckpulses (1,4bar; 100-300ms) über eine Mikropipette führte zu einer
raschen lokalen Dilatation in Wildtypen und BK-/- Mäusen. Die Amplitude der lokalen
Dilatation war in BK-/- Mäusen (54 ± 3 % der maximalen Dilatation) verglichen mit Wildtypen
(64 ± 4 % der maximalen Dilatation) geringfügig, aber signifikant erniedrigt. Die Dilatation
breitete sich in beiden Gruppen ohne zeitliche Verzögerung (<1 s) entlang des Gefäßes aus.
Weder in einer Entfernung von 550 noch 1100µm war die Dilatation in den BK-/- im Vergleich
zu den BK+/+ Tieren abgeschwächt (1100µm: BK+/+ 48 ± 5 vs BK-/- 38 ± 4 % der
maximalen Dilatation, p = 0.18). Die Dauer der Dilatation war in den BK-/- Tieren an der
lokalen Position etwas verkürzt (40 ± 3 vs 29 ± 2 s), dieser Effekt ließ sich an den entfernten
Positionen nicht beobachten (1100µm: 25 ±1 vs 17 ± 2 s, Abb. 3.8). Somit ist die Ausbreitung
von ACh induzierten Dilatationen unabhängig von einer Aktivierbarkeit der BKCa-Kanäle
ERGEBNISSE
60
BK+/+
ACh
90
BK-/-
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.8: Ausbreitung von ACh Dilatationen in BKCa defizienten Tieren.
ACh wurde lokal über eine Mikropipette an das Gefäß als Bolus appliziert (vertikale Linie). Die
Abbildungen zeigen von links nach rechts die Dilatation an der lokalen, sowie an entfernten Positionen
(550 und 1100µm) stromaufwärts von der Stimulationsstelle über die Zeit. Die Applikation von ACh
induziert eine lokale Dilatation, die sich entlang der Arteriole ausbreitet. Obwohl die lokale Dilatation in
BK-/-Tieren marginal abgeschwächt war, ist die Dilatation an den entfernten Positionen nicht
verschieden. BK+/+: n=7 Gefäße in 5 Tieren; BK-/-: n=6 Gefäße in 4 Tieren. * t-Test p ≤ 0.05 vs
BK+/+.
3.1.3.1.5
Rolle von NO und Prostacyclin bei ACh induzierten Dilatationen in BKCa defizienten
Mäusen
Möglicherweise kommt es in BK-/- Tieren zu einer kompensatorisch erhöhten NO- und
Prostazyklin-Freisetzung.
Um
dies
zu
untersuchen,
wurden
Arteriolen
nach
pharmakologischer Blockade der NO-Synthase (L-NA) und Cyclooxygenase (Indo) in BKCa
defizienten Mäusen und Wildtypen mit ACh stimuliert. Die Arteriolen wurden nach 20
Minuten mit den Hemmstoffen inkubiert und dann bei kontinuierlicher Superfusion der
Blocker mit Acetylcholin stimuliert. In Experimenten mit globaler Stimulation erfolgte die
Bestimmung der Kontrollantworten in Wildtypen an 50 Arteriolen in 5 Tieren, die Gefäße
hatten einen maximalen Durchmesser von 39 ± 1 µm. Nach Behandlung mit Indo und LNA
wurden 79 Arteriolen in 8 Tieren mit einem maximalen Durchmesser von 37 ± 1 µm
untersucht. In BKCa-defizienten Tieren wurden 47 Arteriolen in 5 Tieren mit einem maximalen
Durchmesser von 36 ± 2 µm bzw. 55 Arteriolen in 6 Tieren mit einem maximalen
Durchmesser von 35 ± 2 µm (Indo und LNA) untersucht. Die Hemmung der NO-Synthase
und Cyclooxygenase führte in beiden Genotypen zu einer signifikanten Konstriktion (BK+/+:
von 14 ± 1 auf 9 ± 1 µm, BK-/- von 15 ± 1 auf 10 ± 1 µm). Der Ruhetonus war somit in beiden
Genotypen vor und nach Hemmung der NO-Synthase und Cyclooxygenase gleich (Tabelle
3.1). Dies zeigt, dass die basale Freisetzung dieser Autakoide unverändert ist. Die globale
Stimulation mit steigenden Acetylcholinkonzentrationen (0.3 - 10 µM) führte in beiden
Gruppen auch in diesen Versuchsgruppen zu einer konzentrationsabhängigen Dilatation
(Abb.3.9).
Obwohl
die
Hemmung
von
NO-Synthase
und
Cyclooxygenase
die
Ruhedurchmesser der Gefäße verringerte, wurde die durch ACh-induzierte Dilatation der
Gefäße in BK+/+ und BK-/- Tieren nicht signifikant beeinträchtigt (Abb. 3.9)
61
BK+/+
90
60
30
Kontrolle
Indo LNA
0
-7
-6
ACh [log mol/l]
-5
ERGEBNISSE
BK-/-
90
60
30
Kontrolle
Indo LNA
0
-7
-6
-5
ACh [log mol/l]
Abb. 3.9: ACh Dilatationen in BK-/- nach Hemmung von Cyclooxygenase und NO-Synthase.
Dargestellt ist die Dilatation in Abhängigkeit von der ACh-Konzentration. Globale Stimulation mit ACh
führt sowohl in Wildtypen als auch in BK-/- Mäusen zu einer konzentrationsabhängigen Dilatation, die
durch Superfusion von Hemmstoffen der NO-Synthase (L-NA) und Cyclooxygenase (Indo) nicht
signifikant verändert wurde. BK+/+: n= 50 in 5 bzw n= 79 in 8 Tieren (Indo und L-NA); BK-/-: n= 47 in 5
bzw n= 55 in 6 Tieren (Indo und L-NA).
In ähnlicher Form wurde die Beteiligung von NO und Prostazyklin bei der Ausbreitung von
lokal induzierten ACh Dilatationen untersucht. Es wurden 5 Arteriolen in 3 Mäusen mit einem
maximalen Durchmesser von 37 ± 2 µm (BK+/+) und 10 Arteriolen in 8 Tieren mit einem
maximalen Durchmesser von 38 ± 1 µm (BK-/-) untersucht. Die lokale Stimulation mit
Acetylcholin erfolgte mittels Druckpuls (140 kPa) bei einer Stimulationsdauer von
100 - 300 ms. Wie bereits gezeigt (3.1.3.1.4), induzierte ACh in Wildtypen und BK-/- Mäusen
eine lokale Dilatation, die sich rasch entlang der Arteriole ausbreitete (Abb. 3.10).
In Wildtypen hatte die Hemmung von NO- und Prostazyklinsynthese weder einen Effekt auf
die lokal induzierte ACh Dilatation noch auf deren Ausbreitung (maximale Amplitude in
BK+/+: lokal 60 ± 4 vs 52 ± 5 %, 550 µm 47 ± 4 vs 45 ± 5 %, 1100 µm 45 ± 7 vs 44 ± 5 % der
maximalen Dilatation). In BKCa-defizienten Tieren war die Amplitude der lokalen Antwort zwar
nach LNA und Indo signifikant abgeschwächt (BK-/- lokal: 53 ± 3 vs 35 ± 4 % der maximalen
Dilatation), die Ausbreitung des Signals in die entfernten Positionen blieb jedoch nach
Hemmung der Cyclooxygenase und NO-Synthase unbeeinträchtigt, da die maximale
Amplitude der Dilatation mit der Entfernung nicht stärker abnahm als dies in unbehandelten
BK-/- Tieren der Fall war (BK-/-: 550 µm 44 ± 4 vs 30 ± 3, 1100 µm 38 ± 5 vs 22 ± 2 % der
maximalen Dilatation, Abb. 3.10:). Somit findet sich ein Unterschied zwischen den
Genotypen nur nach Behandlung mit Indo und LNA. Da nach globaler Stimulation kein
signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Behandlung mit Indo und LNA zu finden
war, ist dies vermutlich auf ein unterschiedliches Ausmaß der lokalen Stimulation
zurückzuführen. Die Dauer der Dilatation wurde durch die Behandlung mit Indo und LNA
ERGEBNISSE
62
kaum beeinträchtigt, lediglich an der lokalen Position war eine Verkürzung zu beobachten
(Abb.3.11). Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass NO und Prostazyklin weder im
Wildtyp noch kompensatorisch in BK-/- als Mediatoren der ACh-Dilatation von Bedeutung
sind und auch die Ausbreitung der Dilatation nicht auf diesen Autakoiden beruht.
BK+/+
Kontrolle
ACh
90
Indo LNA
60
lokal
30
550µm
0
-30
0
30
60
90
-30
0
30
Zeit [s]
BK-/% der maximalen Dilatation
1100µm
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
Zeit [s]
Zeit [s]
Zeit [s]
Kontrolle
ACh
90
Indo LNA
*
60
*
*
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
Zeit
[s]
60
90
-30
0
30
Zeit
Zeit
[s][s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.10: Ausbreitung von Dilatationen in BK-/- nach Hemmung der NO- und
Prostazyklinsynthese.
ACh wurde lokal über eine Mikropipette an das Gefäß appliziert (vertikale Linie). Die Abbildungen
zeigen von links nach rechts die Dilatation an der lokalen und an entfernten Positionen (550 und
1100µm über die Zeit. Hemmung der Cyclooxygenase und NO-Synthase (Indo und LNA) veränderte
die Amplitude der Dilatation im Wildtyp nicht. Demgegenüber war die Dilatation in BK-/- Tieren
hierdurch an allen Positionen abgeschwächt, die Ausbreitung selbst blieb jedoch unverändert. Dies ist
am ehesten mit einer reduzierten lokalen Stimulation vereinbar, da die Dilatation nach globaler
Stimulation unverändert war (Abb. 3.9). BK+/+: n = 5 Arteriolen in 3 Tieren, BK-/-: 10 in 8 Tieren, *
p<0.05 vs Indo LNA.
ERGEBNISSE
63
Amplitude
90
60
*#
*#
*#
30
0
0
550
1100 [µm]
BK+/+
BK-/-
40
#
Zeit [s]
BK+/+ Indo LNA
Dauer
50
BK-/- Indo LNA
Abb. 3.11: Amplitude und Dauer
der fortgeleiteten ACh induzierten
Dilatationen
Dargestellt ist die Amplitude (oben)
und die Dauer (unten) der
fortgeleiteten Dilatationen nach
lokaler Stimulation mit ACh in BK+/+
und BK-/- Mäusen vor und nach
Hemmung
der
NOund
Prostazyklinsynthese. Die Amplitude
war nach Indo und LNA lediglich in
BK-/- Mäusen abgeschwächt. Da
dies
an
allen
Positionen
gleichmäßig der Fall war, ist die
Ausbreitung des Signals entlang der
Arteriole jedoch nicht beeinträchtigt.
Die Dauer der Dilatation war im
Wildtyp durch Behandlung mit Indo
und L-NA lokal verkürzt. Anzahl der
Beobachtungen siehe Abb. 3.10
* P<0.05 vs Kontrolle; # P< 0.05 vs
BK+/+
*
30
20
10
0
0
3.1.3.1.6
550
1100 [µm]
BKCa als Effektor von ACh- und SNP-induzierten Dilatationen in unterschiedlichen
Mausarten
Die intakte ACh-Dilatation in diesen Tieren war überraschend, da in vorhergehenden
Versuchen in unserer Arbeitsgruppe die pharmakologische Blockade von BKCa mit Iberiotoxin
zu einer deutlichen Abschwächung der ACh-Dilatation vor und nach Hemmung der NOSynthase und Cyclooxygenase führte (Indo und LNA, 3 bzw. 30 µM). Diese vorhergehenden
Experimente sind jedoch an Tieren mit einem anderen genetischen Hintergrund (C57BL/6)
durchgeführt worden. Daher haben wir diese Untersuchungen nochmals an C57BL/6 sowie
BK+/+ Mäusen in diesem Mischhintergrund (C57BL/6 / SV129, F2 Generation) durchgeführt.
Hierzu wurden in Anwesenheit von Indo und LNA zunächst durch globale Stimulation mit
0.1 - 10 µM ACh-Kontrollantworten bestimmt und nach 20-minütiger Inkubation mit
Iberiotoxin die Stimulation widerholt. Es wurden 49 Arteriolen in 5 Mäusen mit einem
maximalen Durchmesser von 34 ± 2 µm in Tieren mit einem C57BL/6 / SV129
Mischhintergrund und 21 Arteriolen in 2 C57BL/6 Mäusen mit einem maximalen
ERGEBNISSE
64
Durchmesser von 29 ± 2 µm untersucht. Die Superfusion von Iberiotoxin (0.1 µM) hatte
keinen Einfluß auf den Ruhetonus der Gefäße (BL6: 0.22 ± 0.03 vs 0.24 ± 0.04, BK+/+: 0.27
± 0.02 vs 0.24 ± 0.02, Tabelle 3.1). In BK+/+ Mäusen (C57BL/6 / SV129 Mischhintergrund)
führte die Superfusion steigender ACh Konzentrationen (0.3 - 10 µM), wie in den
vorhergehenden Versuchen, zu einer konzentrationsabhängigen Dilatation. Nach Inkubation
mit Iberiotoxin blieb die Dilatation in diesen Tieren unbeeinflußt. Die Superfusion des NODonors SNP führte ebenfalls zu einer Dilatation (10 µM: von 9 ± 1 auf 22 ± 1 µm), die nach
Iberiotoxin ebenfalls nicht beeinträchtigt wurde (von 8 ± 1 auf 20 ± 2 µm, Abb. 3.12). In
C57BL/6 Mäusen induzierte ACh ebenfalls eine konzentrationsabhängige Dilatation, die aber
nach Iberiotoxin signifikant reduziert war (Abb. 3.12). Im Gegensatz zum ACh wurde die
endothelunabhängige Dilatation (SNP, 10 µM) nicht beeinflußt. Somit ist die durch SNP
induzierte Dilatation in der Mikrozirkulation beider Mausstämme nicht durch eine Aktivierung
von BKCa vermittelt. Im Gegensatz dazu ist die ACh Dilatation einerseits vermittelt durch die
Aktivierung des BKCa-Kanals (C57BL/6) und andererseits von diesen Kanälen unabhängig
(C57BL/6 / SV129 Mischhintergrund).
BK+/+
ACh
90
90
60
60
30
30
0
0
SNP
Indo LNA
Indo LNA Ibtx
-7
-6
-5
-5
[log mol/l]
[log mol/l]
C57BL/6
ACh
90
90
60
SNP
60
*
30
*
Indo LNA
30
Indo LNA Ibtx
*
0
0
-7
-6
[log mol/l]
-5
-5
[log mol/l]
Abb. 3.12: Effekt von Iberiotoxin
auf ACh und SNP-induzierte
Dilatationen in unterschiedlichen Mausstämmen.
Dargestellt ist die Dilatation in
abhängigkeit
von
der
Konzentration des Agonisten.
Während Iberiotoxin in BK+/+
Mäusen mit einem C57BL/6 /
SV129 Hintergrund ohne Wirkung
auf die Dilatation war (oben),
reduzierte es die ACh Dilatation in
C57BL/6 Mäusen (unten). Die
durch
den
NO-Donor
SNP
induzierten Dilatationen blieben
jeweils
unbeeinträchtigt.
Alle
Versuche in Anwesenheit von
Indo und LNA (3 bzw. 30 µM).
BK+/+: n = 49 Arteriolen in 5
Mäusen, C57BL/6: n = 21
Arteriolen in 2 Mäusen. *p < 0.01
vs Indo LNA.
ERGEBNISSE
65
3.1.3.2 Beteiligung von IKCa an der Auslösung und Fortleitung von Dilatationen
Die endotheliale Hyperpolarisation als zentrales Ereignis bei der Auslösung von AChvermittelten Dilatationen beruht vermutlich auf einer Aktivierung endothelialer IKCa und/oder
SKCa-Kanäle. Der Beitrag des IKCa-Kanals als Effektor von ACh-, Adenosin- und SNPinduzierten Dilatationen in der Mikrozirkulation sollte in IKCa defizienten Mäusen (IK-/-)
untersucht werden. Die Tiere wiesen einen 129ola/C57BL/6 Mischhintergrund auf. Daher
wurden als Kontrolltiere die Wildtypwurfgeschwister (IK+/+) mit einem identischen
genetischen Hintergrund untersucht.
3.1.3.2.1
Ruhetonus in IKCa defizienten Mäusen
Der Ruhetonus wurde nach Hemmung von NO- (LNA) und Prostazyklin- Synthese (Indo) in
80 Arteriolen in 8 IK+/+ Tieren untersucht. Die Gefäße hatten einen Ruhedurchmesser von
12 ± 1 µm bei einem maximal möglichen Durchmesser von 37 ± 1 µm. In den IK-/- Tieren
wurden ebenfalls 80 Arteriolen in 8 Mäusen untersucht, deren Ruhedurchmesser 9 ± 1 µm
bei einem maximal erreichbaren Durchmesser von 38 ± 1 µm betrug. Der Gefäßtonus war
somit in IK-/- Mäusen (0.22 ± 0.01) im Vergleich zur Kontrollgruppe (0.31 ± 0.02) signifikant
erhöht (p<0.01). Die basale Aktivität des IKCa-Kanals ist somit eine wichtige Determinante
des vaskulären Gefäßtonus in Abwesenheit von NO und Prostaglandinen.
3.1.3.2.2
Effekt des IKCa Öffners DCEBIO in Wildtypen und IKCa defizienten Mäusen
Um den mechanischen Effekt einer IKCa-Aktivierung in der Mikrozirkulation zu untersuchen,
wurden die Arteriolen mit dem IKCa-Öffner DCEBIO superfundiert. Die Durchmesseränderung
wurde nach globaler Stimulation mit DCEBIO in 30 Arteriolen von 3 IK+/+ Mäusen
(maximaler Durchmesser: 32 ± 2 µm) und 40 Arteriolen in 4 IK-/- Tieren (maximaler
Durchmesser: 38 ± 2 µm) untersucht. Die Stimulation der Arteriolen mit DCEBIO (0.1µM)
führte im Wildtyp zu einer Erweiterung der Arteriolen von 6 ± 1 auf 16 ± 2 µm (p< 0.01). Im
Gegensatz
dazu
war
in
den
Gefäßen
der
IK-/-
Tieren
keine
signifikante
Durchmesseränderung zu beobachten (von 13 ± 2 auf 12 ± 2 µm, Abb. 3.13). Da DCEBIO
eine Verbindung mit äußerst lipophilen Eigenschaften ist, war die Herstellung von Lösungen
in wäßrigem Medium nicht möglich. Die Substanz wurde daher in DMSO gelöst und eine
wässrige Verdünnung mit einer Endkonzentration von 0.5% DMSO hergestellt. Die globale
Superfusion von 0.5% DMSO hatte jedoch keinen Effekt auf den arteriolären Durchmesser
(von 11 ± 1 auf 11 ± 1 µm, 60 Arteriolen in 6 Tieren). Dies zeigt, dass die Aktivierung von
IKCa-Kanälen in der Mikrozirkulation eine Vasodilatation induziert.
66
ERGEBNISSE
DCEBIO [0.1µM]
40
30
20
10
IK+/+
IK-/IK+/+ 0.5% DMSO
0
Abb. 3.13: Effekt der Aktivierung von IKCa-Kanälen auf den arteriolären Durchmesser.
Die globale Stimulation mit einem Öffner von IKCa-Kanälen (DCEBIO) führt im Wildtyp zu einer
Dilatation, das Lösungsmittel (0.5% DMSO) hatte keinen Effekt. DCEBIO war in IKCa-/- Tieren ohne
Wirkung auf den Durchmesser. IK+/+: n = 30, IK-/-: n =4, DMSO: n= 60.*p< 0.01 vs IK+/+.
3.1.3.2.3
Beteiligung von IKCa als Effektor von ACh, Adenosin und SNP Dilatationen
Um die Beteiligung von IKCa als Effektor von ACh-, Adenosin- und SNP- induzierten
Dilatationen zu untersuchen, wurden die Agonisten in steigenden Konzentrationen
(0.1 - 10 µM) global superfundiert. Alle Experimente wurden in Anwesenheit von Indo (3 µM)
und LNA (30 µM) durchgeführt, um die NO- und Prostazyklin-unabhängige Komponente der
Dilatation zu betrachten. Es wurden jeweils 80 Arteriolen in 8 IK+/+ und 8 IK-/- Tieren
untersucht. Die Gefäße hatten einen maximalen Durchmesser von 36 ± 1 µm in Wildtypen
und 38 ± 1 µm in IKCa-defizienten Tieren. Stimulation mit ACh induzierte im Wildyp eine
konzentrationsabhängige Dilatation (Abb. 3.14). In IKCa-defizienten Tieren führte dies
ebenfalls zu einer konzentrationsabhängigen Dilatation. Im Vergleich zu den Wildtypen war
die Dilatation aber vor allem im mittleren Konzentrationsbereich (0.3 - 3 µM) deutlich
abgeschwächt (Abb. 3.14). Bei der höchsten untersuchten ACh-Konzentration (10 µM) war
auch in diesen Tieren eine deutliche Dilatation zu beobachten (Abb. 3.14 A). Der
endothelunabhängige Agonist SNP dilatierte die Arteriolen in Wildtyp und in IKCa-defizienten
Mäusen
ebenfalls
konzentrationsabhängig.
In
IK-/-
Tieren
war
im
mittleren
Konzentrationsbereich eine geringe, aber signifikante Abschwächung der Dilatation zu
beobachten, wobei die maximale Antwort auf SNP nicht beeinträchtigt war (10 µM: 63 ± 3 vs
66 ± 3 % der maximalen Dilatation, Abb.: 3.14 B). Im Gegensatz dazu war die Adenosin
induzierte Dilatation in IKCa defizienten Tieren nicht reduziert, sondern im Vergleich zum
Wildtyp sogar gering verstärkt. Die Aktivierung von IKCa-Kanälen ist somit für die ACh
induzierte Dilatation von großer Bedeutung, für die NO induzierte Dilatation jedoch von
untergeordneter Bedeutung und bei Adenosin induzierten Dilatationen nicht beteiligt.
ERGEBNISSE
67
A
B
ACh
90
60
#
60
*
*
#
60
30
30
IK+/+
IK-/0
IK+/+
IK-/0
-7
-6
[log mol/l]
Ado
90
#
*
30
SNP
90
*
*
C
-5
IK+/+
IK-/0
-7
-6
[log mol/l]
-5
-7
-6
[log mol/l]
-5
Abb. 3.14: Dilatation auf ACh, NO und Adenosin in IK-/- Mäusen.
Dargestellt ist die Dilatation nach globaler Stimulation mit verschiedenen Agonisten (A: ACh , B: SNP,
C: Adenosin) in Abhängigkeit von deren Konzentration. Die konzentrationsabhängige Dilatation in IK-/war vor allem nach Stimulation mit ACh reduziert. Die Dilatationen nach Stimulation mit dem
endothelunabhängigen Dilatator SNP waren nur leicht beeinträchtigt und Adenosin induzierte
Dilatationen waren nicht abgeschwächt. Alle Experimente erfolgten in Anwesenheit von Indo und LNA.
n = 80 Arteriolen in 8 Tieren je Gruppe. t-Test # p<0.05 * p<0.01 vs IK+/+.
3.1.3.2.4
DCEBIO induziert fortgeleitete Dilatationen
Arteriolen wurden lokal mit DCEBIO (1 mM) stimuliert, um zu untersuchen, ob die
Aktivierung
von
IKCa-Kanälen
eine
fortgeleitete
Dilatationen
auslösen
kann.
Die
Stimulationsdauer betrug 100 - 400 ms und erfolgte mit einem Druck von 140 kPa. Die
Experimente erfolgten nach Hemmung der NO- und Prostazyklinsynthese. Es wurden 5
Arteriolen in 5 IKCa-defizienten Mäusen (maximaler Durchmesser 41 ± 2 µm) und 4 Arteriolen
in 4 Wildtypwurfgeschwistern (maximaler Durchmesser 37 ± 2 µm) untersucht. Die lokale
Stimulation mit DCEBIO induzierte eine lokale Dilatation, die sich ohne zeitliche Verzögerung
in beide Richtungen entlang des Gefäßes ausbreitete. Die Amplitude nahm mit zunehmender
Entfernung ab (Abb. 3.15 A). DCEBIO wurde in 50% DMSO gelöst. Das Lösungsmittel
alleine hatten jedoch keinen Effekt auf die Durchmesser (n=4 Arteriolen in 4 IK+/+ Tieren,
Abb.:3.15 B). In IK-/- Tieren führte die lokale Applikation von DCEBIO zu keiner Änderung
des Gefäßdurchmessers (Abb. 3.15 A).
ERGEBNISSE
68
A
IK+/+
DCEBIO
90
IK-/-
60
*
30
*
lokal
550µm
1100µm
*
0
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
Zeit [s]
B
IK+/+
50% DMSO
90
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
60
90
-30
0
30
60
90
-30
Zeit [s]
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.15: Lokale Aktivierung von IKCa-Kanälen durch DCEBIO
DCEBIO (A) bzw die Lösungsmittelkontrolle wurde lokal appliziert (vertikale Linie) und die
Durchmesseränderung an der Stimulationsstelle und entfernten Positionen gemessen. In IK+/+
Mäusen wurde eine lokale Dilatation induziert, die sich entlang des Gefäßes ausbreitete. Dies war
nicht bedingt durch das Lösungsmittel (50% DMSO). In IKCa defizienten Tieren war DCEBIO ohne
Effekt. IK+/+: n=4 Arteriolen in 4 Tieren, IK-/-: n= 5 Arteriolen in 5 Tieren, DMSO: n=4 Arteriolen in 4
IK+/+ Tieren . * ttest p < 0.01 vs IK+/+.
3.1.3.2.5
Beteiligung von IKCa bei fortgeleiteter Dilatationen nach ACh
Da die Aktivierung von IKCa-Kanälen eine fortgeleitete Dilatation induzierte, sollte nun die
Beteiligung von IKCa an der Auslösung von fortgeleiteten Dilatationen nach lokalem AChStimulus untersucht werden. Die Experimente wurden in Anwesenheit von Indo und LNA (3
bzw. 30 µM) durchgeführt. ACh-Dilatationen wurden in 8 Arteriolen in 8 IK+/+ Tieren
(maximaler Durchmesser 39 ± 1 µm) und in 7 Arteriolen in 7 IK-/- Tieren (maximaler
Durchmesser 42 ± 2 µm) durchgeführt. ACh Applikation erfolgte mit einer Stimulationsdauer
von 100 - 500 ms und einem Druck von 140 kPa.
Die lokal induzierte Dilatation war in IK-/- Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe bereits lokal
abgeschwächt. Dennoch breiteten sich die Dilatationen in beiden Genotypen ohne
signifikante Abnahme der Amplitude in die Entfernung aus (Abb. 3.16). Die maximale
Amplitude der Dilatation war an allen beobachteten Positionen in IK-/- Tieren signifikant
erniedrigt (Abb. 3.16).
ERGEBNISSE
69
IK+/+
ACh
90
IK-/-
*
*
60
*
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
-30
0
30
Zeit [s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.16: Fortgeleitete Dilatationen nach ACh in IK-/- Tieren:
Dargestellt ist die Durchmesseränderung nach lokaler Stimulation mit ACh (vertikale Linie). ACh löste
auch in IKCa-defizienten Tieren eine fortgeleitete Dilatation aus. Die Amplituden der Gefäßantwort
waren jedoch gegenüber dem Wildtyp an allen Positionen signifikant erniedrigt. Alle Experimente in
Anwesenheit von Indo und LNA (3 bzw. 30µM). IK+/+: n = 8 Arteriolen in 8 Tieren, IK-/-: n=7 Arteriolen
in 7 Tieren. * ttest p<0.01 vs IK-/-.
3.1.3.3 Rolle von SKCa bei der Auslösung lokaler und fortgeleiteter Dilatationen
3.1.3.3.1
Beteiligung von SKCa als Effektor von ACh-, Adenosin- und SNP- Dilatationen
In dieser Serie wurde untersucht, ob die Aktivierung von SKCa-Kanälen an Dilatationen nach
globaler Stimulation mit ACh und Adenosin beteiligt sind. In allen Experimenten wurden die
Prostazyklin- und NO-Synthese blockiert. Die Blockade der SKCa-Kanäle erfolgte durch
Superfusion des spezifischen pharmakologischen Blockers UCL 1684 (100 µM). Hierzu
wurden 30 Arteriolen in 3 IK+/+ Tieren und 3 IK-/- Tieren mit einem maximalen Durchmesser
von 17 - 70 µm (Mittelwert IK+/+: 36 ± 1, IK-/- 38 ± 1 µm) untersucht. Die 20-minütige
Inkubation mit UCL 1684 führte zu einer Verminderung des Durchmessers von 10 ± 1 auf
7 ± 1 µm (p<0.01) bei einem maximalen Durchmesser von 36 ± 1 µm im Wildtyp. Der hieraus
berechnete Basaltonus erhöhte sich somit von 0.27 ± 0.02 auf 0.18 ± 0.02 in Kontrollieren
(p<0.01). Auch in den IK-/- Tieren konstringierte UCL 1684 die Arteriolen von 10 ± 1 auf 8 ± 1
µm (p<0.01) und der Tonus erhöhte sich von 0.25 ± 0.02 auf 0.19 ± 0.01 (p<0.01). Somit ist
eine basale Aktivität bei der Regulation des Ruhedurchmessers der Arteriolen beteiligt.
ACh induzierte im Wildtyp auch in diesen Experimenten eine konzentrationsabhängige
Dilatation, die in Anwesenheit von UCL1684 nicht abgeschwächt war (Abb. 3.17 A). Die
durch Adenosin induzierten Dilatationen waren nach der Blockade der SKCa-Kanälen
ebenfalls intakt (Abb. 3.17 B).
ERGEBNISSE
70
A
B
ACh
90
*
60
30
60
30
*
Indo LNA
Indo LNA UCL
0
-7
Ado
90
*
Indo LNA
0
-6
-5
[log mol/l]
Indo LNA UCL
-7
-6
[log mol/l]
-5
Abb. 3.17: ACh- und Adenosin-induzierte Dilatation in IK+/+ Tieren nach Blockade von SKCaKanälen
Dargestellt ist die Dilatation nach globaler Stimulation mit steigenden ACh- (A) und Adenosin- (B)
Konzentrationen in IK+/+ Mäusen nach Blockade von SKCa-Kanälen mit UCL1684. Weder ACh noch
Adenosin-induzierte Dilatationen wurden durch die Blockade von SKCa-Kanälen abgeschwächt. Alle
Experimente erfolgten nach Hemmung von NO und Prostazyklinsynthese. n = 30 Arteriolen in 3 IK+/+
Mäusen. * ttest <0.05 vs Indo LNA
Die ACh-Dilatation, die in IKCa-defizienten Mäusen verblieb, und nur nach Applikation der
höchsten verwendeten ACh Konzentration (10 µM) ausgeprägt war (von 9 ± 1 auf 20 ± 1
µm), wurde nach Blockade der SKCa-Kanäle fast vollständig aufgehoben. Nur nach
Stimulation mit 10 µM ACh dilatierten die Arteriolen signifikant von 8 ± 2 auf 13 ± 2 µm (Abb.
3.18 A). Dagegen waren konzentrationsabhängige Dilatationen, die durch den NO-Donor
SNP ausgelöst wurden, in Anwesenheit von UCL1684 nicht beeinträchtigt (Abb. 3.18 B).
ACh
SNP
A
B
Indo LNA
90
90
Indo LNA UCL
60
60
*
30
30
Indo LNA
0
0
-7
-6
-5
[log mol/l]
Indo LNA UCL
-7
-6
-5
[log mol/l]
Abb. 3.18: ACh- und SNP-induzierte Dilatationen in IK-/- Tieren nach Blockade von SKCaKanälen
Dargestellt ist die Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration der Agonisten. Arteriolen wurden in
IK-/- Tieren global mit steigenden Konzentrationen von ACh (A) oder SNP (B) stimuliert. Die Blockade
von SKCa-Kanälen erfolgte durch Superfusion von UCL1684 (100 µM). Nach Hemmung von SKCa
konnte durch ACh keine Dilatation mehr induziert werden. Durch den NO-Donor SNP induzierte
Dilatation Dilatationen waren hingegen unbeeinträchtigt. Die Experimente wurden in Anwesenheit von
Indo und LNA durchgeführt. n = 20 Arteriolen in 2 IK-/- Mäusen. * ttest <0.05 vs Indo LNA
ERGEBNISSE
71
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität der SKCa-Kanäle bei ACh-induzierten
Dilatationen beteiligt ist. SKCa-Kanäle haben jedoch gegenüber IKCa-Kanälen eine eher
untergeordnete Bedeutung, da ihre Blockade in IK+/+ Tieren keinen Effekt hatte. NOvermittelte Dilatationen sind hingegen unabhängig von der Aktivierung der SKCa-Kanäle.
3.1.3.3.2
SKCa als Effektor fortgeleiteter ACh-Dilatationen
In diesen Experimenten sollte untersucht werden, welche Rolle die Aktivität von SKCaKanälen bei der Ausbreitung von ACh-induzierten Dilatationen hat. Hierzu wurde die
Gefäßantwort nach lokaler ACh-Stimulation in 3 Gefäßen (maximaler Durchmesser 36 ± 1
µm) in 3 IK+/+ Mäusen vor und nach pharmakologischer Blockade von SKCa mit UCL1684
untersucht. Die lokale Stimulationsdauer betrug 200 ms (Druck: 140 kPa). Alle Experimente
erfolgten in Anwesenheit von Indo (3 µM) und LNA (30 µM). ACh induzierte im Wildtyp eine
fortgeleitete Dilatation, wie auch in den vorangegangenen Experimenten gezeigt wurde.
Nach Blockade von SKCa induzierte ACh weiterhin eine fortgeleitete Dilatation, deren
Amplitude weder lokal noch an den entfernten Positionen reduziert war (Abb. 3.19). Die AChinduzierte Dilatation breitet sich somit unabhängig von der Aktivierung von SKCa-Kanälen
entlang der Arteriole aus.
IK+/+
Indo LNA
ACh
90
Indo LNA UCL
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
60
90
-30
0
30
Zeit [s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.19: Fortgeleitete Dilatationen auf ACh nach Blockade von SKCa mit UCL1684:
Dilatationen wurden durch lokale Stimulation (vertikale Linie) mit ACh induziert, dargestellt sind die
Dilatationen in Abhängigkeit von der Zeit entlang der Arteriolen (links: lokal, Mitte: 550 µm, rechts:
1100 µm Entfernung). Die Fortleitung der lokal induzierten ACh-Dilatation wurden durch Blockade von
SKCa-Kanälen nicht beeinträchtigt Alle Experimente in Anwesenheit von Indo und L-NA. n = 3
Arteriolen in 3 Mäusen.
ERGEBNISSE
72
3.1.4. Charakterisierung von Effektoren lokal induzierter Adenosindilatationen
In diesen Experimenten wurde untersucht, ob die lokale Stimulation mit Adenosin (10 µM)
eine fortgeleitete Dilatation auslöst. Hierzu wurden 6 Arteriolen in 5 C57BL/6 Mäusen lokal
stimuliert und die Dilatation lokal und nach erneuter lokaler Stimulation in einer Entfernung
von 550 und 1100 µm stromaufwärts von der Stimulationsstelle beobachtet. Die Arteriolen
hatten einen maximalen Durchmesser von 34 ± 2 µm. Die Stimulation erfolgte über eine
Mikropipette für 50 - 400 ms mit 140 kPa. Adenosin induzierte eine lokale Dilatation, die nach
1 Sekunde auch in einer Entfernung von 1100 µm zu beobachten war. Die maximale
Amplitude der Dilatation nahm über die beobachtete Strecke von 1100 µm signifikant ab
(lokal: 62 ± 5, 550 µm: 51 ± 4, 1100 µm: 41 ± 5 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.20).
3.1.4.1 Rolle von NO und Prostazyklin als Mediatoren von lokal induzierten fortgeleiteten
Adenosin-Dilatationen
Die Beteiligung von NO und Prostazyklin als Mediatoren bei der Auslösung von lokalen
Adenosin induzierten Dilatationen sowie deren Ausbreitung entlang der Arteriole wurden in 4
Arteriolen in 4 C57BL/6 Mäusen untersucht. Der mittlere maximale Durchmesser betrug 36 ±
1 µm. Die lokale Stimulation der Arteriolen erfolgte mittels Druckpuls (140 kPa) für 50 - 500
ms. Adenosin induzierte auch nach Hemmung der Cyclooxygenase und NO-Synthase mit
Indomethacin (Indo, 3 µM) und LNA (30 µM) eine fortgeleitete Dilatation. Die maximale
Amplitude der Dilatation war weder an der Stimulationsstelle noch an den entfernten
Positionen verändert (lokal: 61 ± 5 vs 64 ± 4, 550 µm: 51 ± 4 vs 53 ± 4, 1100 µm: 34 ± 6 vs
31 ± 4 % der maximalen Dilatation), die Abbildung 3.21 zeigt den zeitlichen Verlauf. Somit
sind lokal induzierte Dilatationen nach Adenosin und deren Ausbreitung entlang der Arteriole
unabhängig von NO und Prostazyklin.
BL6
Kontrolle
Ado
90
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
Zeit
[s]
60
90
-30
0
30
Zeit
Zeit
[s][s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.20: Ausbreitung von lokal durch Adenosin induzierten Dilatationen:
Arteriolen wurden lokal mit Adenosin durch Mikroapplikation stimuliert (vertikale Linie). Abgebildet ist
die Durchmesseränderung nach lokaler Stimulation und nach erneuter lokaler Stimulation an den
Positionen in einer Entfernung von 550 und 1100 µm über die Zeit. Adenosin induziert eine lokale
Dilatation, die sich in die Entfernung ausbreitet. Hierbei nimmt die Amplitude mit der Entfernung ab. n
= 6 Arteriolen in 5 Mäusen.
ERGEBNISSE
73
BL6
Kontrolle
Ado
90
Indo L-NA
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
Zeit
[s]
60
90
-30
0
30
Zeit
Zeit
[s][s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.21: Fortleitung der Dilatation auf Adenosin nach Hemmung der Prostaglandine und NO
Dargestellt sind die Durchmesseränderungen nach lokaler Applikation von Adenosin (vertikale Linie)
an der Stimulationsstelle und entfernten Positionen über die Zeit. Nach Hemmung der
Cyclooxygenase (Indo, 3 µM) und NO-Synthase (LNA, 30 µM) war weder die lokal induzierte
Adenosindilatation noch deren Ausbreitung entlang der Arteriole reduziert. n = 4 Arteriolen in 4
C57BL/6 Mäusen.
3.1.4.2 Vergleich der Ausbreitung lokal ausgelöster Dilatationen nach Adenosin und ACh
Die Ausbreitung der lokal ausgelösten Dilatationen nach Adenosin sollten weiter
charakterisiert werden. Hierzu wurden die maximale Amplitude der Dilatation, deren Dauer
und die Fläche unter der Kurve an der lokalen und den Positionen in 550 und 1100 µm
Entfernung berechnet und mit Gefäßantworten, die durch ACh induziert wurden, verglichen.
Die Daten von 23 Arteriolen in 23 Tieren nach Adenosinstimulation (maximaler Durchmesser
30 ± 1 µm) und von 30 Arteriolen in 27 Tieren nach ACh-Stimulation (maximaler
Durchmesser 35 ± 1µm) wurden zusammengefasst. Alle Experimente waren in Anwesenheit
von Indo und LNA (3 bzw. 30 µM) durchgeführt worden. Arterioläre Stimulation mit Adenosin
erfolgte lokal über eine Mikropipette für 50 - 500 ms (Mittelwert: 210 ±11 ms) und einem
Druck von 140 kPa. Adenosin induzierte eine fortgeleitete Dilatation, deren Amplitude über
die Entfernung abnahm. ACh induzierte nach arteriolärer Stimulation (50 - 300 ms,
Mittelwert: 120 ± 6 ms, 140kPa) dagegen eine Dilatation, die sich ohne Abnahme der
Amplitude bis in die größte beobachtete Entfernung von 1100 µm ausbreitete (Abb. 3.22 A).
Somit war die Amplitude der Dilatation nach ACh in 1100 µm Entfernung signifikant größer
als die jenige nach Stimulation mit Adenosin, obwohl an der Stimulationsstelle die Amplitude
nach Adenosin signifikant größer war (Abb. 3.22 A). Auch die Dauer der Dilatation war bei
den Stimuli unterschiedlich. Die Dauer der Adenosin-induzierten Dilatationen war an den
entfernten Positionen im Vergleich zur lokalen Antwort signifikant verkürzt, dies war bei
Stimulation mit ACh nicht zu beobachten (Abb. 3.22 B). Beide Parameter (Amplitude und
Dauer) determinieren die Gesamtfläche unter der Kurve (AUC), die in Abbildung 3.22 C
ebenfalls dargstellt ist. Es zeigt sich, dass sich die Fläche unter Kurve nach Stimulation mit
Adenosin mit zunehmender Entfernung signifikant reduziert. ACh induzierte Dilatationen
zeigten hingegen keine Abnahme der Fläche über eine Entfernung von 1100 µm. Somit ist
ERGEBNISSE
74
die AUC nach Adenosinstimulation in der Entfernung von 1100 µm signifikant kleiner als
diejenige nach ACh-Stimulation, obwohl dies an der Stimulationsstelle umgekehrt war.
Zusammengenommen zeigt dies, dass nach lokaler Stimulation der Arteriole sowohl mit ACh
als auch mit Adenosin eine fortgeleitete Dilatation induziert wird. Die Ausbreitung der
Dilatation in die Entfernung ist jedoch nach Stimulation mit Adenosin weniger effizient als
nach ACh.
A
Adenosin
ACh
80
Amplitude
*
60
#
*
#
40
20
0
0
550
1100
B
60
*
Dauer
Zeit [s]
#
#
40
20
0
0
550
1100
C
Fläche
900
600
*
AUC
#
*
#
300
0
0
550
1100
Abb. 3.22: Vergleich der Ausbreitung
von Dilatationen nach Adenosin und
ACh
Nach lokaler Stimulation der Arteriolen
mit ACh oder Adenosin wurde die
Amplitude und Dauer der Dilatation
sowie die Fläche unter der Kurve an der
lokalen Stelle und in einer Entfernung
von 550 und 1100µm berechnet. A: Die
Amplitude der Adenosindilatation war an
den entfernten Position im Vergleich zur
lokalen Antwort signifikant verringert.
Dagegen blieb die Amplitude der AChAntwort bis in die größte beobachtete
Entfernung von 1100µm konstant. B:
Auch die Dilatationsdauer verkürzte sich
nach Stimulation mit Adenosin mit
zunehmender Entfernung. Die Dauer
der ACh-induzierten Dilatation blieb
hingegen über die Entfernung konstant.
C: Die Berechnung der Fläche unter der
Kurve (AUC) zeigt, dass Adenosin
induzierte Dilatationen sich mit der
Entfernung deutlich reduzierten. AChAntworten blieben hingegen über die
beobachtete Entfernung konstant Alle
Versuche in Anwesenheit von Indo und
LNA (3 bzw. 30 µM). Es wurden 23
Arteriolen in 23 Tieren mit Adenosin
stimuliert und in 30 Arteriolen in 27
Tieren ACh appliziert. * p< 0.05 vs ACh;
# p<0.05 vs lokale Stelle.
ERGEBNISSE
75
3.1.4.3 IKCa und BKCa als Effektoren der fortgeleiteten Dilatationen nach ACh und Adenosin
In den oben dargestellten Experimenten wurde gezeigt, dass IKCa- und BKCa-Kanäle bei der
ACh-Dilatation von entscheidender Bedeutung sind. Daher sollte hier untersucht werden, ob
die Aktivierung von diesen KCa-Kanälen auch an der Auslösung und Fortleitung von
Adenosin-induzierten Dilatationen beteiligt ist. Es wurden 3 Arteriolen in 3 C57BL/6 Mäusen
untersucht, deren maximaler Durchmesser 38 ± 1 µm betrug. In jedem Gefäß wurden
fortgeleitete Dilatation sowohl mit Adenosin als auch mit ACh ausgelöst. Nach Aufzeichnung
der Kontrollantworten wurden die Gefäße 10 min mit Charybdotoxin (1 µM), einem Blocker
der IKCa- und BKCa-Kanäle, inkubiert und anschließend die Stimulationen mit ACh und
Adenosin erneut wiederholt. Alle Experimente wurden in Anwesenheit von Indo und LNA (3
bzw. 30 µM) durchgeführt. Die lokale Applikation von Adenosin führte zu einer sich
ausbreitenden Dilatation, deren maximale Amplitude durch Charybdotoxin weder an der
lokalen noch den entfernten Stellen beeinträchtigt wurde (lokal: 54 ± 9 vs 50 ± 4, 550 µm: 43
± 6 vs 51 ± 1, 1100 µm: 44 ± 7 vs 55 ± 2 % der maximalen Dilatation). Die Abbildung 3.23 A
zeigt den zeitlichen Verlauf. Im Gegensatz dazu war die lokal induzierte ACh-Dilatation in
A
Indo LNA
Ado
90
Indo L-NA Chtx
60
lokal
30
550µm
0
-30
0
30
60
90
-30
0
30
Zeit [s]
B
1100µm
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
Zeit [s]
Zeit [s]
Zeit [s]
Indo LNA
ACh
90
Indo L-NA Chtx
*
60
*
*
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
Zeit
[s]
60
90
-30
0
30
Zeit
Zeit
[s][s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.23: Vergleich fortgeleiteter Dilatationen auf Adenosin und ACh nach Blockade von KCa
Abgebildet ist die Änderung des Gefäßdurchmessers nach lokaler Stimulation mit Adenosin (A) oder
ACh (B) an der Stimulationsstelle sowie in 550 und 1100 µm Entfernung über die Zeit. Lokalisierte
Stimulation der Arteriolen mit Adenosin führt zu einer lokalen Dilatation, die sich in die Entfernung
ausbreitet. Durch pharmakologische Blockade von IKCa- und BKCa-Kanälen mit Charybdotoxin (1 µM)
wurde weder die lokale noch die fortgeleitete Dilatation abgeschwächt. Im Gegensatz dazu waren
ACh-Dilatationen in denselben Gefäßen wie erwartet an allen beobachteten Stellen fast vollständig
aufgehoben. Alle Versuche erfolgten in Anwesenheit von Indo und LNA (3 bzw. 30 µM). n =3
Arteriolen in 3 Gefäßen. *p <0.01 vs Indo LNA.
ERGEBNISSE
76
denselben Gefäßen an der lokalen Stelle und auch in der Entfernung fast vollständig
aufgehoben (Amplitude lokal: 60 ± 4 vs 14 ± 3, 550 µm: 53 ± 3 vs 17 ± 2, 1100 µm: 45 ± 4 vs
10 ± 6 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.23 B). Die deutliche Abschwächung der AChDilatation verifiziert die Effektivität der Blockade der KCa-Kanäle und die hierbei erhaltene
Antwort auf Adenosin zeigt, dass Adenosin unabhängig von der Aktivität von IKCa- und BKCaKanälen dilatierend wirkt und dieses Signal sich entlang der Arteriole ausbreitet.
3.1.4.4 KATP als Effektor von Adenosin Dilatationen
An einigen isolierten Arteriolen wurde gezeigt, dass Dilatationen nach Adenosin auf der
Öffnung von KATP-Kanälen beruhen. In diesen Experimenten wurde daher die Beteiligung
dieser Kanäle in der Mikrozirkulation bei fortgeleiteten Dilatation untersucht. Hierzu wurde
einerseits geprüft, ob der KATP-Öffner Cromakalim eine sich ausbreitende Dilatation auslösen
kann und andererseits, ob die Hemmung dieser Kanäle die Dilatation nach Adenosin
modifiziert. Es wurden 4 Arteriolen in 4 C57BL/6 Mäusen (maximaler Durchmesser: 38 ± 0.3
µm) mit Cromakalim für 100 - 500 ms mit 140 kPa lokal stimuliert. Alle Experimente wurden
in Anwesenheit von Indo und LNA durchgeführt. Cromakalim induzierte eine lokale
A
Indo LNA
Cromakalim
90
Indo LNA Glib
*
60
*
lokal
30
550µm
1100µm
*
0
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
Zeit
[s]
30
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Zeit
Zeit
[s][s]
B
Indo LNA
50%DMSO
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
-30
0
30
Zeit
[s] [s]
Zeit
60
90
-30
0
30
ZeitZeit
[s]
60
[s]
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.24: Gefäßantworten nach lokaler Stimulation mit dem KATP-Öffner Cromakalim
Dargestellt ist die Durchmesseränderung über die Zeit. Nach lokaler Stimulation mit Cromakalim
wurden die Durchmesser lokal und nach erneuter lokaler Stimulation in 550 und 1100 µm bestimmt.
Der KATP-Öffner Cromakalim induziert in Arteriolen eine fortgeleitete Dilatation die durch den KATPBlocker Glibenclamid (Glib) vollständig aufgehoben wurde (A). Das zum Lösen von Cromakalim
verwendete DMSO (50%) verursachte keinen Gefäßrektion (B). In 550 µm Entfernung zeigt das Gefäß
spontane Vasomotion, die unabhängig von der Applikation auftrat. Alle Experimente in Anwesenheit
von Indo und LNA. n=4 Arteriolen (4Tiere). p<0.05 vs Indo LNA.
ERGEBNISSE
77
Dilatation, die sich mit abnehmender Amplitude in die Entfernung ausbreitete. Die durch den
KATP-Öffner induzierte Dilatation ließ sich mit dem KATP-Blocker Glibenclamid (1 µM)
blockieren (maximale Amplitude: lokal: 43 ± 7 vs 1 ± 2, 550 µm: 24 ± 8 vs -5 ± 8, 1100 µm:
17 ± 7 vs -2 ± 3 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.24 A). Die lokale Applikation des
verwendeten Lösungsmittels (50% DMSO) löste im Gegensatz zum Cromakalim keine
Dilatation aus (Abb. 3.24 B). Dies zeigt, dass die lokale Aktivierung von KATP-Kanälen nicht
nur eine lokale Dilatation auslöst, sondern sich diese lokale Dilatation auch entlang der
Arteriole ausbreitet. Die Beteiligung von KATP-Kanälen an der Auslösung von Adenosininduzierten Dilatationen und deren Fortleitung wurde untersucht, indem Gefäße mit Adenosin
und ACh vor und nach Superfusion des KATP-Blockers Glibenclamid (1 µM) lokal stimuliert
wurden. Die Dilatation nach Adenosin wurde sowohl an der Stimulationsstelle als auch an
allen entfernten Positionen durch Glibenclamid komplett aufgehoben (maximale Amplitude:
lokal: 53 ± 7 vs 1 ± 3, 550 µm: 35 ± 8 vs -1 ± 4, 1100 µm: 32 ± 1 vs -4 ± 5 % der maximalen
Dilatation Abb. 3.25 A). Im Gegensatz dazu blieb die ACh-induzierte Dilatation in
Anwesenheit von Glibenclamid unverändert (maximale Amplitude: lokal: 43 ± 4 vs 35 ± 12,
550 µm: 47 ± 5 vs 50 ± 2, 1100 µm: 48 ± 8 vs 40 ± 6 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.25
B). Somit ist die Aktivierung von KATP Kanälen entscheidend für die sich ausbreitende
Dilatation nach Adenosin, während diejenige nach ACh hiervon komplett unabhängig ist.
A
Indo LNA
Ado
90
Indo L-NA Glib
*
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
B
*
*
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
Zeit [s]
Zeit [s]
Zeit [s]
Indo LNA
ACh
90
Indo L-NA Glib
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
Zeit
[s]
60
90
-30
0
30
Zeit
Zeit
[s][s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.25: Adenosin und ACh induzierte Dilatationen nach Blockade von KATP-Kanälen
Dargestellt ist die Dilatation nach lokaler Stimulation mit Adenosin (A) und ACh (B) über die Zeit.
Adenosin induzierte Dilatationen wurden durch Superfusion des KATP-Blockers Glibenclamid (Glib) an
allen beobachteten Positionen komplett blockiert. ACh-induzierte Dilatationen und deren Fortleitung
blieben hingegen unbeeinflußt (B). n = 4 Arteriolen in 4 Tieren. * ttest p<0.01 vs Indo LNA.
ERGEBNISSE
3.2
78
Lokale Stimulation von Gefäßen führt bei einer Reihe von Agonisten nicht nur zu einer
lokalen Dilatation, sondern die Gefäßantwort breitet sich wie im Kapitel 3.1.3 und 3.1.4
gezeigt instantan über eine Strecke von mehreren Millimetern in beide Richtungen entlang
des Gefäßes aus. Diese Ausbreitung ermöglicht eine Koordination des Gefäßverhaltens
innerhalb des Netzwerks. Die Amplitude der fortgeleiteten Dilatation nahm nach lokaler
Stimulation mit ACh über eine Strecke von 1100 µm nicht signifikant ab (Kapitel 3.1.3). Dies
impliziert, dass möglicherweise ein aktiver Mechanismus beteiligt ist, der das Signal bei
seiner Ausbreitung entlang der Gefäßwand verstärkt bzw. auffrischt. Hierbei könnten
besonders K+-Kanäle eine Rolle spielen, die eine Hyperpolarisation möglicherweise
verstärken. Da die Ausbreitung in Abhängigkeit vom Agonisten (Adenosin, ACh)
unterschiedlich war, sind eventuell auch differente Verstärkungsmechanismen beteiligt. Die
Identität der an der Ausbreitung der Dilatation beteiligten Kanäle wurde durch Superfusion
verschiedener Ionenkanalblocker untersucht.
3.2.1
Bupivacain zeigt die Beteiligung unterschiedliche Fortleitungsmechanismen
Das Lokalanästhetikum Bupivacain hemmt relativ unspezifisch K+- und Na+-Kanäle, nämlich
spannungsabhängige
Na+-Kanäle
und
aus
der
Gruppe
der
K+-Kanäle
BKCa,
+
spannungsabhängige (KV) und möglicherweise einwärts gleichrichtende K -Kanäle (KIR).
Daher wurde Bupivacain verwendet, um zu untersuchen, ob unterschiedliche Mechanismen
nach lokaler Stimulation mit unterschiedlichen Agonisten an der Ausbreitung des Signals
entlang der Arteriole beteiligt sind. Nach Bestimmung der Kontrollantworten wurden die
Arteriolen 20 min mit Bupivacain (100 mM) inkubiert und die Durchmesseränderugen
anschließend in dessen Anwesenheit erneut bestimmmt. Die Applikation von Bupivacain
führte zu einer signifikanten Erhöhung des Ruhetonus der Arteriolen in An- und Abwesenheit
von NO und Prostaglandinen (Tabelle 3.2).
Tabelle 3.2: Ruhetonus in Arteriolen nach Hemmung von Na+- und K+-Kanälen mit Bupivacain
Der Gefäßtonus wurde durch Bupivacain sowohl in An- als auch in Abwesenheit von Indo und LNA
signifikant erhöht. * ttest p < 0.01 vs Kontrolle bzw Indo LNA.
n
Maus
Behandlung
Tonus
Durchmesser
Maximum
14
5
5
4
C57BL/6
C57BL/6
C57BL/6
C57BL/6
Kontrolle
Bupivacain
Indo LNA
Bupivacain
0.45 ± 0.01
0.36 ± 0.01*
0.38 ± 0.01
0.21 ± 0.02*
14 ± 0.3
12 ± 0.4
13 ± 0.5
7 ± 0.6
32 ± 1
33 ± 1
33 ± 1
34 ± 1
ERGEBNISSE
79
Die Fortleitung von ACh-induzierten Dilatationen wurde in 3 Arteriolen (3 C57BL/6 Mäuse)
mit einem maximalen Durchmesser von 35 ± 1 µm untersucht. Die lokale Stimulation mit
ACh erfolgte für 100 – 300 ms mit 140 kPa. Die ACh induzierte-Dilatation war an der lokalen
Stelle nach Bupivacain zwar deutlich abgeschwächt, die Fortleitung dieser lokal
schwächeren Dilatation war jedoch nicht eingeschränkt. So war die maximale Amplitude in
einer Entfernung von 1100 µm nicht signifikant unterschiedlich zur lokalen Antwort vor und
nach Bupvicain (Kontrolle: lokal 65 ± 7, 550 µm 50 ± 4, 1100 µm 55 ± 4%; Bupivacain: lokal
44 ± 5, 550 µm 26 ± 11, 1100 µm 23 ± 5 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.26 A). Ähnliche
Befunde wurden in Anwesenheit von Indo und LNA erhoben (5 Gefäße in 3 Tieren,
maximaler Gefäßdurchmesser 32 ± 1 µm). Die lokale Gefäßantwort war nach Behandlung
mit Bupivacain abgeschwächt, die Ausbreitung des abgeschwächten Signals entlang der
Arteriole jedoch nicht beeinträchtigt. Auch unter diesen Bedingungen unterschied sich die
Amplitude an den entfernten Stellen nicht von der lokalen Antwort (Indo LNA: lokal 65 ± 6,
550µm 68 ± 5, 1100 µm 59 ± 8; Bupivacain: lokal 40 ± 6, 550 µm: 35 ± 7, 1100 µm: 49 ± 7 %
der maximalen Dilatation, Abb. 3.26 B).
A
Kontrolle
ACh
90
*
Bupivacain
*
60
lokal
30
550µm
0
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
B
1100µm
Zeit [s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Zeit [s]
Indo LNA
ACh
90
30
Zeit [s]
*
*
Indo LNA Bupivacain
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
Zeit
[s]
60
90
-30
0
30
Zeit
Zeit
[s][s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
+
+
Abb. 3.26: Ausbreitung der ACh-induzierten Dilatation nach Blockade von Na - und K -Kanälen
ACh wurde mittels Mikropipette appliziert (vertikale Linie) und die Durchmesseränderungen sind lokal
und in der Entfernung über die Zeit dargestellt. In unbehandelten (A) Arteriolen und nach Indo LNA (B)
reduzierte Bupivacain (100 mM) die Dilatation an der Stimulationsstelle. Diese abgeschwächte
Dilatation breitete sich aber ohne signifikante Abschwächung der Amplitude entlang der Arteriole bis in
eine Entfernung von 100 µm aus. n= 3 (Kontrolle) bzw. 5 (Indo und LNA) Arteriolen in jeweils 3
Mäusen, * ttest p<0.05 Bupivacain vs jeweilige Kontrolle.
ERGEBNISSE
80
Der Effekt von Bupivacain auf lokal ausgelöste, fortgeleitete Adenosindilatationen wurde in 2
Arteriolen betrachtet. Die Stimulation erfolgte in der Kontrollgruppe für 50 – 100 ms und nach
Behandlung mit Bupivacain für 80 – 200 ms mit 140 kPa. Im Gegensatz zu ACh, waren
Adenosin-induzierte Dilatationen an der Stimulationsstelle nicht abgeschwächt. Dagegen war
die fortgeleitete Antwort bereits in einer Entfernung von 550 µm komplett aufgehoben (Abb.
3.27 A). In einer größeren Gruppe (5 Arteriolen in 5 Tieren, maximaler Durchmesser von 35
± 0.3 µm) wurde Bupivacain auch nach Hemmung der NO-Synthase und Cyclooxygenase
untersucht. Die Stimulation mit Adenosin erfolgte für 50 – 500 ms mit 1.4 bar. Ähnlich wie in
unbehandelten Präparationen war auch hier die lokale Antwort durch Bupivacain nur wenig
beeinflußt (Indo LNA: 51 ± 3, Bupivacain: 37 ± 7%), während die Dilatation an entfernten
Stellen nach Bupivacain komplett aufgehoben war (Indo LNA: 550 µm 43 ± 8, 1100 µm: 33 ±
7%, Bupivacain: 550 µm -10 ± 7, 1100 µm -8 ± 8% der maximalen Dilatation, Abb.: 3.27 B).
A
Kontrolle
Ado
90
Bupivacain
60
lokal
*
1100µm
30
0
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
B
*
550µm
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
Zeit [s]
Zeit [s]
Zeit [s]
Indo LNA
Ado
90
Indo LNA Bupivacain
*
60
*
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
Zeit
[s]
60
90
-30
0
30
Zeit
Zeit
[s][s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
+
+
Abb. 3.27: Ausbreitung der Adenosin-induzierten Dilatation nach Blockade von Na - und K Kanälen
Adenosin (Ado) wurde mittels Mikropipette appliziert (vertikale Linie) und die Durchmesseränderungen
sind lokal und in der Entfernung über die Zeit dargestellt. In unbehandelten (A) Arteriolen und nach
Indo LNA (B) hatte Bupivacain (100 mM) nur wenig Einfluß auf die lokale Dilatation, während die
Dilatation in der Entfernung komplett aufgehaben war. n = 5 Arteriolen in 5 C57BL/6 Tieren. * p<0.01
vs Kontrolle bzw. Indo LNA.
ERGEBNISSE
81
Kontrolle
BK
90
Bupivacain
*
60
*
*
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
0
30
Zeit [s]
60
90
-30
0
30
60
Zeit [s]
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.28: Bradykinin-induzierte Dilatationen nach Blockade von Na+- und K+-Kanälen
Bradykinin (Bk) wurde mittels Mikropipette appliziert (vertikale Linie). Dargestellt sind
Durchmesseränderungen an der Stimulationsstelle und in der Entfernung über die Zeit. Bupivacain
(100 mM) reduzierte die lokale Dilation. Diese abgeschwächte Dilatation breitete sich jedoch
uneingeschränkt entlang der Arteriole aus. n= 5 Arteriolen in 5 Mäusen. *p<0.05 vs Kontrolle
Um neben Acetylcholin einen weiteren endogenen endothelabhängigen Dilatator zu
untersuchen, wurde Bradykinin (Bk) verwendet (n = 5 Arteriolen in 5 C57BL/6 Mäusen,
maximaler Durchmesser 34 ± 0.3 µm). Die lokale Stimulation mit Bradykinin erfolgte für 20 400 ms mit 140 kPa. Bradykinin induzierte ebenso wie ACh eine lokale Dilatation, die sich
entlang der Arteriole ausbreitete. Nach Behandlung mit Bupivacain war die lokale Antwort
deutlich abgeschwächt, aber die Ausbreitung dieses abgeschwächten Signals war nicht
beeinträchtigt. Die maximale Amplitude war ebenso wie nach ACh in einer Entfernung von
1100 µm nicht schwächer als die lokale Antwort in unbehandelten Arteriolen (lokal: 58 ± 6,
550 µm: 51 ± 9, 1100 µm: 41 ± 8 %) und nach Bupivacain (lokal: 28 ± 7, 550 µm: 26 ± 10,
1100 µm: 17 ± 5 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.28).
Möglicherweise hat Bupivacain einen Effekt auf die Zellkopplung selbst. Daher wurde als
Stimulus die lokale Depolarisation untersucht, die eine Ausbreitung einer Konstriktion entlang
des Gefäßes auslöst. Eine lokale Depolarisation wurde durch die Applikation einer
hochmolaren KCl-Lösung (3 M) induziert. In 6 Arteriolen (maximaler Gefäßdurchmesser: 42
± 2 µm) in 4 Mäusen führte die Stimulation mit KCl für 20 – 200 ms zu einer lokalen
Konstriktion (maximale Amplitude: -55 ± 5%), die sich mit abnehmender Amplitude entlang
der Arteriole ausbreitete (275 µm: 47 ± 4, 550 µm: 27 ± 6, 825 µm: 19 ± 5, 1100 µm: 12 ± 5%
der maximalen Antwort). Dadurch war die Strecke, über die sich die Konstriktion erstreckte,
geringer als dies bei fortgeleiteten Dilatationen der Fall war. Bupivacain hatte keinen
signifikanten Effekt auf die lokale Konstriktion und auch nicht auf deren Ausbreitung
(Amplitude: lokal: 49 ± 5, 275 µm: 41 ± 5, 550 µm: 35 ± 6, 825 µm: 27 ± 7, 1100 µm: 3 ± 6 %
der maximalen Antwort, Abb. 3.29). Nach der Konstriktion war in unbehandelten Arteriolen
eine Dilatation zu beobachten, die sich ebenfalls entlang der Arteriole ausbreitete. Diese
nachfolgende Dilatation wurde durch Bupivacain unterbunden (Abb.3.29).
ERGEBNISSE
82
Kontrolle
KCl
Bupivacain
30
0
lokal
-30
0
15
30
Zeit [s]
275µm
0
15
Zeit [s]
30
550µm
0
15
Zeit [s]
775µm
30
0
15
Zeit [s]
1100µm
30
0
15
30
Zeit [s]
Abb. 3.29: Ausbreitung lokal induzierter Konstriktionen nach Blockade von Na+- und K+Kanälen
Lokale KCl-Applikation (3 M, vertikale Linie) induzierte eine Konstriktion, die sich ohne zeitliche
Verzögerung entlang der Arteriole ausbreitet. Im Gegensatz zu Dilatationen, nimmt die Amplitude der
Konstriktion mit zunehmender Entfernung ab. Bupivacain hatte keinerlei Einfluß auf die lokale Antwort
oder die Fortleitung der Konstriktion, lediglich die sich anschließende Dilatation wurde durch
Bupivacain aufgehoben. n= 6 Arteriolen in 4 C57BL/6 Mäusen.
Zusammengefaßt zeigen diese Daten, dass die relativ unspezifische Kanalblockade mit
Bupivacain die Ausbreitung der Dilatationen unterschiedlich beeinflußt. So wird die
Fortleitung nach Adenosin unterdrückt, während nach ACh und Bradykinin kein wesentlicher
Effekt zu beobachten ist. Ebenso bleibt die Ausbreitung einer lokal ausgelösten Konstriktion
unverändert. Dies zeigt, dass bei der Ausbreitung der Dilatationen differente Mechanismen
beteiligt sind und nur Kanäle, die nach Adenosinstimulation aktiviert werden, gegenüber
Bupivacain sensitiv sind.
3.2.2 Selektive Blockade spannungsabhängiger Na+-Kanäle mit Mepivacain
Die Beobachtung, dass die Fortleitung von Adenosin induzierten Dilatationen nach
Behandlung mit dem Lokalanästhetikum Bupivacain aufgehoben waren, könnte auf die
Beteiligung spannungsabhängiger Na+-Kanäle und eines nervalen Mechanismus deuten.
Daher wurde in dieser experimentellen Serie das Lokalanästhetikum Mepivacain (200 µM)
untersucht, da diese Substanz ebenfalls spannungsabhängige Na+-Kanäle blockiert, K+Kanäle jedoch nicht oder in deutlich geringerem Ausmaß beeinflußt. Die Superfusion von
Mepivacain führte nicht zu einer signifikanten Änderung des arteriolären Durchmessers (14 ±
1 vs. 12 ± 1 µm, maximaler Durchmesser: 34 ± 1 µm, n = 7) und der Ruhetonus blieb im
Gegensatz zu Bupivacain konstant (0.41 ± 0.03 vs 0.35 ± 0.02, p = 0.1).
Adenosin-induzierte fortgeleitete Dilatationen waren nach Behandlung mit Mepivacain in
Anwesenheit von Indo und LNA weder lokal noch in einer Entfernung von 1100 µm
abgeschwächt (Abb. 3.30 B). Die durch ACh induzierte Dilatationen wurde durch Mepivacain
an der lokalen Stelle signifikant abgeschwächt, die Ausbreitung dieser verminderten Antwort
ERGEBNISSE
83
A
Indo LNA
ACh
90
*
Indo LNA Mepivacain
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
Zeit [s]
B
Indo LNA
Ado
90
Indo LNA Mepivacain
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
-30
0
30
60
90
-30
Zeit [s]
0
30
Zeit [s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.30: Effekt von Mepivacain auf fortgeleitete Dilatationen nach ACh und Adenosin
Dargestellt sind die Durchmesseränderungen nach lokaler Stimulation mit Adenosin (Ado, oben) und
ACh (unten) entlang der Arteriole. Mepivacain (200 µM) ließ die Dilatation nach Adenosin und deren
Ausbreitung unbeeinflußt. Die lokal induzierte Dilatation nach ACh wurde reduziert, deren Ausbreitung
entlang der Arteriole wurde jedoch nicht beeinträchtigt. Alle Experimente in Anwesenheit von Indo und
LNA. n = 2 in 2 (Ado) bzw. n= 5 Arteriolen in 4 Mäusen (ACh). p<0.05 vs Indo LNA.
entlang der Arteriole wurde jedoch nicht beeinträchtigt (maximale Amplitude, Kontrolle vs
Mepivacain, lokal: 65 ± 6 vs 45 ± 6, 550 µm: 57 ± 4 vs 48 ± 4, 1100 µm: 50 ± 7 vs 38 ± 7 %
der maximalen Dilatation, Abb. 3.30 A). Somit sind spannungsabhängige Na+-Kanäle und ein
nervaler Mechanismus nicht beteiligt und daher auch nicht die Ursache für die oben gezeigte
hemmende Wirkung des Bupivacains.
3.2.3 Rolle von KIR bei der Fortleitung ACh, Adenosin und Bradykinin induzierter
Dilatationen
Einwärts gleichrichtende K+-Kanäle (KIR) können durch eine Hyperpolarisation aktiviert
werden und kommen deshalb als Verstärkungsmechanismus bei fortgeleiteten Dilatationen
in Frage. Die Beteiligung einer Aktivierung von KIR an der Ausbreitung von Dilatationen
wurde durch die Applikation des Hemmers Ba2+ (75 µM) untersucht. Diese Hemmung von KIR
führte zu einer signifikanten Konstriktion der Gefäße von 11 ± 1 auf 9 ± 1 µm (maximaler
ERGEBNISSE
84
Durchmesser: 31 ± 1 µm, n = 4), der Ruhetonus stieg von 0.37 ± 0.01 auf 0.29 ± 0.01
(p < 0.05).
In Anwesenheit von Ba2+ war die nach lokaler ACh Stimulation induzierte Dilatation weder
lokal (maximale Amplitude: 67 ± 6 vs 70 ± 5%) noch in einer Entfernung von 550 µm (54 ± 5
vs 50 ± 7%) abgeschwächt. An der entfernten Position 1100 µm stromaufwärts von der
Stimulationsstelle führte Ba2+ jedoch zu einer signifikanten Abschwächung der Amplitude der
Dilatation (57 ± 3 vs 34 ± 6 %). Diese Abschwächung spiegelte sich auch in einer
A
Kontrolle
ACh
90
BaCl2
*
#
60
lokal
30
550µm
1100µm
0
-30
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
Zeit [s]
B
Indo LNA
Ado
90
Indo LNA BaCl2
*
60
*#
lokal
30
*
#
550µm
1100µm
0
-30
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
Zeit [s]
C
Kontrolle
Bk
90
BaCl2
60
lokal
550µm
1100µm
30
0
-30
-30
0
30
Zeit [s]
60
90
-30
0
30
Zeit [s]
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.31: Effekt von Ba2+ auf die Fortleitung lokal ausgelöster Dilatationen
Dargestellt sind Dilatationen auf lokale Applikation von ACh (A), Adenosin (Ado, in Anwesenheit von
Indo und LNA, B) und Bradykinin (C) entlang der Arteriole über die Zeit. In Anwesenheit von Ba2+ (75
µM) war die Dilatation nach ACh lediglich an der entferntesten Position (1100 µm) reduziert. Die
Ausbreitung von Adenosin induzierten Dilatationen ist nach Ba2+ am deutlichsten reduziert. Die
Dilatation war bereits in einer Entfernung von 550 µm stark abschwächt und bei 1100 µm kaum noch
zu beobachten. Im Gegensatz dazu waren lokale und enfernte Dilatationen nach Bk unverändert.
ACh: n = 5 in 4, Ado n = 5 in 5 und Bk n = 4 Arteriolen in 4 Tieren. ttest * p < 0.01 vs Kontrolle bzw.
Indo LNA, # p < 0.01 vs lokal.
ERGEBNISSE
85
signifikanten Abnahme der Amplitude mit zunehmender Entfernung in Anwesenheit von Ba2+
wider (lokal: 70 ± 5, 1100µm: 34 ± 6%, p < 0.05), was in unbehandelten Kontrollen nicht zu
beobachten war (lokal: 67 ± 6, 1100 µm: 57 ± 3% der maximalen Dilatation). Der zeitliche
Verlauf ist in Abbildung 3.31 A dargestellt. Wurde Adenosin zur lokalen Stimulation
verwendet, so war die lokale Dilatation nach Ba2+ geringfügig abgeschwächt (68 ± 5 vs 45 ±
7%, p <0.05) und die Amplitude der fortgeleiteten Dilatation bereits in einer Entfernung von
550 µm stark reduziert (37 ± 8 vs 14 ± 5%). In einer Entfernung von 1100 µm war die
Dilatation nach Ba2+ kaum nachweisbar (25 ± 7 vs 7 ± 4% der maximalen Dilatation). Diese
Reduktion ist nicht allein auf die abgeschwächte lokale Antwort zurückzuführen, denn die
Amplitude der Dilatation war in einer Entfernung von 550 µm gegenüber der lokalen Antwort
reduziert (lokal: 45 ± 7, 550 µm: 14 ± 5%,, p<0.01), was in unbehandelten Arteriolen auch zu
beobachten war (lokal: 68 ± 5, 550 µm: 26 ± 7% Abb. 3.31 B). Im Gegensatz dazu hatte Ba2+
keinen wesentlichen Effekt auf Bradykinin-induzierte Dilatationen und deren Ausbreitung
entlang der Arteriole. Die Amplituden der Dilatation waren zwar tendenziell nach Ba2+
geringer ohne jedoch das Signifikanzniveau zu erreichen (Kontrolle vs Ba2+, lokal: 66 ± 5 vs
53 ± 4, 550 µm: 61 ± 2 vs 51 ± 5, 1100 µm: 51 ± 7 vs 38 ± 7 % der maximalen Dilatation).
Der zeitliche Verlauf ist in Abbildung 3.31 C dargestellt. Somit trägt die Aktivität von KIR bzw.
von Ba2+-sensitiven Kanälen entscheidend zur Verstärkung des Adenosin induzierten Signals
entlang der Arteriole bei, während deren Rolle bei der Fortleitung von Dilatationen nach ACh
und Bradykinin eher untergeordnet sind.
3.2.4
Rolle von KV bei der Fortleitung ACh und Adenosin induzierter Dilatationen
Die Beteiligung von KV Kanälen an der Ausbreitung von ACh- und Adenosin-induzierten
Dilatationen wurde in 5 Arteriolen in 5 Tieren durch globale Superfusion des Blockers 4Aminopyridin (4-AP, 1 mM) untersucht. Der unstimulierte Durchmesser (13 ± 1 µm) in den
Arteriolen mit einem maximalen Durchmesser von 32 ± 1 µm änderte sich nach Applikation
von 4-AP nicht (Ruhetonus: 0.39 ± 0.02 vs. 0.36 ± 0.02). Die lokal induzierte Dilatation auf
ACh wurde durch 4-AP nicht beeinflußt (Amplitude: 58 ± 8 vs 48 ± 6%), die Amplitude der
Dilatation an den fortgeleiteten Positionen war jedoch in einer Entfernung von 550 µm
abgeschwächt (57± 5 vs 39 ± 7%) und bei 1100 µm etwa um die Hälfte reduziert (52 ± 6 vs
20 ± 6 % der maximalen Dilatation, zeitlicher Verlauf in Abb. 3.32 A). Die Dilatation an der
Stimulationsstelle blieb ebenfalls nach Mikroapplikation von Adenosin unverändert
(Amplitude: 50 ± 4 vs 47 ± 6%) und im Gegensatz zu ACh hatte 4-AP keinen Effekt auf die
Amplitude der Dilatationen in der Entfernung (550 µm: 48± 8 vs 42 ± 10, 1100 µm: 40 ± 10 vs
28 ± 9 % der maximalen Dilatation, p = 0.30). Abbildung 3.32 B zeigt den zeitlichen Verlauf.
ERGEBNISSE
86
A
Indo LNA
ACh
90
Indo LNA 4-AP
*
60
*
lokal
550µm
1100µm
30
0
-30
-30
0
30
60
-30
90
0
Zeit [s]
30
60
90
-30
0
30
60
90
Zeit [s]
Zeit [s]
B
Indo LNA
Ado
90
Indo LNA 4-AP
60
lokal
550µm
1100µm
30
0
-30
-30
0
30
60
90
-30
0
Zeit [s]
30
60
90
-30
Zeit [s]
0
30
60
90
Zeit [s]
Abb. 3.32: Effekt der Hemmung von KV-Kanälen auf lokal ausgelöste Dilatation und
Konstriktion
Dargestellt sind relative Durchmesseränderungen auf lokale Applikation von ACh (A), Adenosin (Ado,
B) und entlang der Arteriole über die Zeit. In Anwesenheit von 4-Aminopyridin (4-AP, 1 mM), einem
Blocker von KV Kanälen waren die lokal ausgelösten Gefäßantworten unverändert. Während die
Ausbreitung nach Adenosin unbeeinflußt blieb, war die Dilatation nach ACh an den entfernten
Positionen (550 und 1100 µm) reduziert. Alle Experimente in Anwesenheit von Indo und LNA. ACh
und Ado: n = 5 Arteriolen in 5 Tieren; * p< 0.05, # p< 0.01 vs Indo LNA.
Somit verhält sich die hemmende Wirkung von 4-AP umgekehrt zu Ba2+, denn 4-AP
schwächt die Ausbreitung der Dilatation nach ACh ab, läßt aber die Ausbreitung nach
Adenosin im wesentlichen unbeeinflußt.
3.3
Die Messung des Membranpotentials von Gefäßzellen in Arteriolen der Maus in vivo zeigte,
die unterschiedliche hyperpolarisierende Wirkung von ACh auf Endothelzellen und glatte
Muskelzellen, denn Endothelzellen werden stärker hyperpolarisiert. Das Endothel hat somit
als
Leitungsweg
Hyperpolarisation
für
fortgeleitete
beruht
auf
der
Dilatationen
nach
Aktivierung
von
ACh
KCa,
große
K+
Bedeutung.
strömt
entlang
Die
des
Konzentrationsgradienten aus der Zelle und das Membranpotential wird negativer. Sowohl
ERGEBNISSE
87
das Ruhemembranpotential als auch die Potentialänderungen nach ACh sind in
Endothelzellen und glatten Muskelzellen unterschiedlich. Dies zeigt, dass die heterozelluläre
Kopplung in vivo nicht sehr ausgeprägt oder stark reguliert ist. Es ist daher möglich, dass
fortgeleitete Dilatationen nach Adenosin sich im Gegensatz zur ACh-Dilatation überwiegend
entlang der glattmuskulären Zellschicht ausbreiten. Die Potentialänderung, die nach
Adenosin-Applikation an der Stimulationsstelle und an entfernten Positionen auftreten und
die Zellschicht, in der das Signal weitergeleitet wird, sollten deshalb charakterisiert werden.
Deshalb
sollten
die
Methode
in
unserem
Labor
neu
etabliert
werden,
um
Membranpotentialänderungen, insbesondere an entfernten Positionen, nach Blockade der
potentiellen Verstärkungsmechanismen von fortgeleiteten Dilatationen (KATP, KIR) messen zu
können.
3.3.1
Identifizierung der vaskulären Zellen
Um die Zellen, in denen das Membranpotential gemessen wurde, zu visualisieren, wurde der
Elektrolytlösung in der Mikroelektrode der anionische Farbstoff Carboxyfluorescein
zugesetzt. Nach Penetration einer Zelle diffundierte der Farbstoff entlang seines
Konzentrationsgradienten in die Zelle. Endothelzellen sind entlang der Gefäßlängsachse
orientiert sind, wohingegen glatte Muskelzellen quer zur Gefäßlängsachse liegen. Nach
Visualisierung der gefärbten Zelle mit einem Fluoreszenzmikroskop konnte der Zelltyp daher
anhand seiner Ausrichtung in Bezug auf das Gefäß identfiziert werden. Parallel zur
Gefäßlängsachse orientierte Zellen wurden daher als Endothelzellen (Abb. 3.33 D), quer zur
Gefäßlängsachse angeordnete Zellen als glatte Muskelzellen (Abb. 3.33 B) identifiziert.
3.3.2
Das Membranpotential wurde in jeder Zelle nach einer kurzen Stabilisierungsphase
gemessen, insgesamt wurden 13 Tiere untersucht. Das mittlere Ruhemembranpotential der
Endothelzellen betrug -42 ± 5 mV und wurde in 7 Zellen gemessen. In glatten Muskelzellen
betrug das Membranpotential (-21 ± 2 mV) und wurde in 11 Zellen ermittelt (Abb. 3.34). Die
Endothelzellen hatten somit ein um 21 ± 5 mV negativeres Potential (p < 0.01).
ERGEBNISSE
88
A
B
C
D
Abb 3.33: Identifizierung der vaskulären Zellen
B: Gezeigt ist eine mit Carboxyfluorescein gefärbte glatte Muskelzelle, die anhand Ihrer Ausrichtung
quer zur Gefäßlängsachse identifiziert wurde. D: Angefärbte Endothelzelle, die Ausrichtung parallel
zur Gefäßlängsachse ist charakteristisch für diesen Zelltyp. A und C, entsprechende Durchlichtbilder
zu den Fluoreszenzaufnahmen, die die Arteriole zeigen.
Membranpotential [mV]
0
EC
SMC
-15
*
-30
-45
Abb 3.34: Ruhemembranpotential vaskulärer Zellen
Das Ruhemembranpotential wurde in Endothelzellen (EC) und glatten Muskelzellen (SMC) gemessen.
Das Potential der glatten Muskelzellen war gegenüber den Endothelzellen deutlich depolarisiert. EC
n=7, SMC n=11, p<0.01 vs EC.
ERGEBNISSE
3.3.3
89
Effekt einer lokalisierten Applikation von ACh und Adenosin auf das
Membranpotential.
Um den Effekt einer lokalisierten Applikation von Adenosin und ACh auf das
Membranpotential zu untersuchen, wurden die Gefäße nach erfolgreicher Penetration einer
Zelle lokalisiert mit steigenden Konzentrationen des Agonisten stimuliert und das
Membranpotential simultan aufgezeichnet. Das Membranpotential wurde nach Stimulation
mit ACh in 6 und nach Adenosin in 4 glatten Muskelzellen gemessen. Adenosin und ACh
(jeweils 10 mM) induzierten eine Hyperpolarisation, deren Amplitude und Dauer mit
steigender Applikationsdauer und somit Konzentration der Agonisten zunahm. Abbildung
3.35 oben) zeigt die Originalregistrierung des Membranpotentials. Diese Befunde zeigen,
dass sowohl Adenosin als auch ACh eine Hyperpolarisation von glatten Muskelzellen
induzieren können.
SMC
Adenosin 100ms
Adenosin 4000 ms
-20
-30
-40
8
10
12
14
Zeit [s]
Adenosin 1000 ms
ACh 100ms
16
18
20
22
Zeit [s]
ACh 1000 ms
90
92
94
96
Zeit [s]
ACh 2000 ms
-20
-30
-40
448 450 452 454
472 474 476 478
486 488 490 492
Zeit [s]
Zeit [s]
Zeit [s]
Abb. 3.35: Originalregistrierung des Membranpotentials einer glatten Muskelzelle nach
Stimulation mit ACh und Adenosin
Dargestellt ist das Membranpotential in einer glatten Muskelzelle (SMC) nach lokaler Stimulation
durch Adenosin (oben) und ACh (unten) mit steigender Applikationsdauer (von links nach rechts). Die
vertikalen Linien zeigen den Applikationszeitpunkt an. ACh und Adenosin induzieren eine
Hyperpolarisation glatter Muskelzellen, deren Amplitude und Dauer mit zunehmender
Stimulationsdauer zunehmen.
ERGEBNISSE
90
EC
Adenosin 100 ms
Adenosin 1000 ms
-20
-30
-40
-50
252 254 256 258
274 276 278 280
Zeit [s]
Zeit [s]
ACh 100 ms
ACh 700 ms
-20
-30
-40
-50
252
254
256
258
270 272 274 276
Abb. 3.36: Originalregistrierung des Membranpotentials einer Endothelzelle nach Stimulation
mit ACh und Adenosin
Dargestellt ist das Membranpotential einer Endothelzelle (EC) nach lokaler Stimulation mit Adenosin
und ACh, die Applikationsdauer ist von links nach rechts erhöht. Die vertikalen Linien geben den
Zeitpunkt der ACh- bzw. Adenosin-Ejektion an. ACh induzierte eine Hyperpolarisation der
Endothelzellen während Adenosin keine erkennbare Änderung hervorrief.
In Endothelzellen induzierte ACh ebenfalls eine Hyperpolarisation, deren Ausmaß durch
steigende Appplikationsdauer von ACh vergrößert wurde (Abb 3.36, unten). Adenosin
induzierte in den beobachteten Zellen keine Hyperpolarisation (Abb 3.36, oben). Allerdings
ist die Anzahl der Versuche bisher gering (ACh n = 8 , Adenosin n = 3). Die Ergebnisse sind
jedoch ein Hinweis darauf, dass ACh sowohl glattmuskuläre als auch endotheliale
Hyperpolarisation auslöst, wohingegen Adenosin vermutlich nur eine glattmuskuläre
Hyperpolarisation erzeugt.
ERGEBNISSE
3.4
91
Die Hypercholesterinämie beeinträchtigt die endotheliale Funktion in großen Gefäßen. Dies
zeichnet sich durch eine verminderte Vasodilatation der Gefäße auf Stimulation mit
endothelabhängigen Dilatatoren (z.B. Acetylcholin) aus, bis hin zum Auftreten einer
paradoxen Vasokonstriktion. Sowohl in Leitungs- als auch in Widerstandsgefäßen nimmt das
Endothel durch die Freisetzung der vasoaktiven Autakoide NO, Prostazyklin und des
endothelialen hyperpolarisierenden Faktors (EDHF) entscheidenden Einfluß auf den
Kontraktionszustand der glatten Muskelzellen. Neben der kontinuierlichen Freisetzung wird
die Bildung der Autakoide auch durch Stimulation mit Acetylcholin induziert. Der Effekt der
Hypercholesterinämie auf die endothelabhängige Dilatation in der Mikrozirkulation ist jedoch
nicht bekannt und könnte sich anders als in Leitungsgefäßen verhalten, da die beteiligten
Mediatoren in den verschiedenen Gefäßtypen möglicherweise variieren. In diesen
Experimenten sollten daher endothelabhängige Dilatation und die Fortleitung lokal
ausgelöster Dilatationen in hypercholesterinämischen Mausmodellen untersucht werden.
3.4.1
Plasmacholesterinspiegel in LDL-R- und ApoE-defizienten Mäusen
Mäuse müssen für eine Hypercholesterinämie und atherosklerotische Veränderungen
sensibilisiert werden. Die Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen Diät führt zu einer
Verdoppelung bis Verdreifachung der Cholesterinspiegel und einige Mausarten (z.B.
C57BL/6) entwickeln nach mehreren Monaten Diät atherosklerotische Läsionen. Akzentuiert
ist die Entwicklung einer Hypercholesterinämie in Mäusen, die für Proteine zur Entfernung
des Cholesterins aus dem Plasma defizient sind, wie der LDL-Rezeptor- (LDLR-/-) und
ApoE-defizienten Maus (ApoE-/-). Cholesterinspiegel wurden in 11 C57BL/6, 8 LDLR-/- und
5 ApoE-/- bei normaler Diät (ND) und nach Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen
Plasmacholesterin
Gesamtcholesterin [mmol/l]
20
15
C57BL/6 ND
LDLR-/- ND
ApoE-/- ND
LDLR-/- HCD
ApoE-/- HCD
*
*
#
#
*
10
*
5
0
ohne Diät
mit Diät
Abb. 3.37: Plasmacholesterinspiegel in
LDLR-/- und ApoE-/- Mäusen
LDLR-/- und ApoE-/- Tiere haben bereits
bei normaler Diät (ND) gegenüber dem
Wildtyp (C57BL/6) erhöhte Plasmacholesterinspiegel, die nach Verabreichung einer
cholesterin- und fettreichen Diät (HCD)
weiter anstiegen. n = 11 (C57BL/6) bzw
jeweils 5 - 8 Tiere (LDLR-/- und ApoE-/-).
* p<0.01 vs C57BL/6, # p<0.05 vs ND.
ERGEBNISSE
92
Diät (HCD) bestimmt. Die Plasmacholesterinspiegel waren sowohl in LDLR-/- als auch in
ApoE-/- Mäusen gegenüber dem Wildtyp signifikant erhöht (Abb. 3.37). Die cholesterin- und
fettreiche Diät erhöhte die Cholesterinspiegel weiter. Diese Diät führte in LDLR-/- nach 6
Monaten Diät und in ApoE-/- Tieren nach 4 Monaten Diät zu ähnlich hohen
Cholesterinspiegeln (Abb. 3.37).
3.4.2
Ruhetonus in hypercholesterinämischen Mäusen
Die untersuchten Gefäße hatten einen maximalen Durchmesser von 16 – 61 µm und waren
zwischen den untersuchten Gruppen nicht verschieden. Der Ruhetonus der Arteriolen war in
transgenen Mäusen gegenüber dem Tonus der Kontrolltiere nicht unterschiedlich (C57BL/6:
0.39 ± 0.02; LDLR-/-: 0.43 ± 0.02; ApoE-/- 0.38 ± 0.02). Die Gruppierung der Arteriolen in
kleine (maximaler Durchmesser ≤ 35 µm) und große Arteriolen (max. Durchmesser > 35 µm)
zeigte, dass der Kontraktionszustand der großen Arteriolen im Wildtyp signifikant kleiner war,
d.h. der Ruhetonus nahm einen größeren Wert an (0.59 ± 0.04 vs 0.33 ± 0.02). Ein ähnlich
verminderter Kontraktionszustand war in großen Arteriolen der transgenen Mäuse, die mit
normaler Diät gefüttert wurden, zu beobachten (Tabelle 3.3). Demgegnüber war aber in
LDLR-/- und ApoE-/- Tieren nach der cholesterin- und fettreichen Diät kein erniedrigter
Kontraktionszustand in den großen Arteriolen zu beobachten, so dass der Ruhetonus in
großen Arteriolen in diesen Gruppen keinen signifikanten Unterschied gegenüber dem Tonus
in kleinen Arteriolen aufwies (Tabelle 3.3). Dies zeigt, dass in den großen Arteriolen nach
Diät kontinuierlich eine Dilatationswirkung fehlt oder ein konstringierender Faktor hinzutritt.
Tabelle 3.3: Ruhetonus hypercholesterinämischer Mäuse
Ruhetonus (Durchmesser / maximalen Durchmesser) im Wildtyp (C57BL/6) und in LDLR-/- und
ApoE-/- Mäusen ohne (ND) oder mit cholesterin- und fettreicher Diät (HCD). Die Arteriolen wurden
nach ihrem maximalen Durchmesser gruppiert. * p<0.05 vs kleine Arteriolen
Genotyp
C57BL/6
LDLR-/ApoE-/LDLR-/ApoE-/-
Diät
ND
ND
ND
HCD
HCD
kleine Gefäße
(max Durchmesser ≤ 35 µm)
große Gefäße
(max Durchmesser > 35 µm)
n
Tonus
Maximum
n
Tonus
Maximum
75
36
68
30
30
0.33±0.02
0.35±0.03
0.36±0.02
0.33±0.02
0.40±0.02
28±1
29±1
29±1
30±1
30±1
23
35
21
36
19
0.59±0.04 *
0.50±0.03 *
0.45±0.05 *
0.39±0.03
0.40±0.03
43±2
42±1
43±2
44±1
40±1
ERGEBNISSE
93
3.4.3 Effekt von Hypercholesterinämie auf ACh-, Adenosin- und SNP-induzierte
Dilatationen
Der Einfluß von Hypercholesterinämie auf die endotheliale Funktion wurde durch globale
Superfusion von steigenden ACh Konzentrationen (0.3 – 10 µM) untersucht. Weiterhin
wurden Dilatationen, die durch den endothelunabhängigen Dilatator SNP (0.3 – 10 µM)
induziert wurden, sowie Dilatationen nach Stimulation mit Adenosin (1, 10 µM) untersucht.
Es wurden 90 Arteriolen in 9 C57BL/6 Mäusen, 59 Arteriolen in 6 LDLR-/- Tieren und 81
Arteriolen
in
8
ApoE
defizienten
Mäusen
beobachtet.
ACh
induzierte
konzentrationsabhängige Dilatationen in allen Gruppen. Die Dilatation, die durch die maximal
verwendete ACh-Konzentration ausgelöst wurde, war nicht unterschiedlich zwischen den
Gruppen (C57BL/6: 74 ± 3; LDLR-/-: 83 ± 3; ApoE-/-: 79 ± 2 % der maximalen Dilatation). In
transgenen Mäusen, die normale Diät erhalten hatten, war jedoch eine geringe aber
signifikante Abschwächung der Dilatation bei einer Konzentration von 1 µM zu beobachten.
Dieser Effekt war in ApoE-/- Mäusen stärker ausgeprägt als in LDLR-/- Mäusen (C57BL/6: 50
± 3; LDLR-/-: 39 ± 4; ApoE-/-: 19 ± 4 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.38). Die
abgeschwächte Dilatation im mittleren Konzentrationswirkungsbereich deutet auf eine
reduzierte Sensitivität gegenüber ACh hin. Daher wurde die Konzentration, die eine
halbmaximale
Wirkung
induziert
(EC50),
sowie
A
maximale
Antwort
(EMax)
der
B
ND
100
die
75
75
50
50
C57BL/6
25
HCD
100
LDLR-/-
C57BL/6
25
LDLR-/-
ApoE -/-
0
ApoE -/-
0
-7
-6
ACh [log mol/l]
-5
-7
-6
-5
ACh [log mol/l]
Abb. 3.38: ACh-induzierte Dilatationen in hypercholesterinämischen Mäusen und
Kontrolltieren.
Die transgenen Tiere (LDLR-/-, ApoE-/-) erhielten entweder normales Futter (ND) oder eine
cholesterin- und fettreiche Diät (HCD) über mehrere Monate. Dargestellt ist die Dilatation nach
Superfusion von ACh in steigenden Konzentrationen. A: In Tieren mit normaler Diät führte ACh zu
einer konzentrationsabhängigen Dilatation, wobei die Dilatation im mittleren Konzentrationsbereich in
ApoE-/- Tieren abgeschwächt war (reduzierte Sensitivität). Die maximale Dilatation war unverändert.
B: Cholesterin-und fettreiche Diät führte in transgenen Mäusen trotz signifikanter Erhöhung der
Cholesterinspiegel nicht zu einer weiteren Abschwächung der ACh Antwort. n = 90 Arteriolen in 9
C57BL/6 Mäusen, 59 Arteriolen in 6 LDLR-/- Tieren und 81 Arteriolen in 8 ApoE-/- Mäusen. EC50 und
Emax Werte in Tabelle 3.4.
ERGEBNISSE
94
Tabelle 3.4: Halbmaximale Konzentration (EC50 in µM) und maximale Antwort (Emax in % der
maximalen Dilatation) nach Stimulation mit ACh
n: Anzahl der beobachteten Arteriolen; ND: normale Diät, HCD: cholesterin- und fettreiche Diät; LNA:
L-Nitroarginin (30 µmol/l) *: p < 0.05 vs. Wildtyp ND, #: p < 0.05 vs. jeweilige Kontrollgruppe.
Genotyp
Diät
Behandlung
n
EC50
EMax
C57BL/6
LDLR-/ApoE-/LDLR-/ApoE-/-
ND
ND
ND
HCD
HCD
------
90
59
81
56
40
0.58 ± 0.09
0.57 ± 0.12
2.11 ± 0.32 *
0.48 ± 0.08
1.40 ± 0.30 *
78 ± 3
81 ± 4
98 ± 5*
85 ± 3
89 ± 6
C57BL/6
C57BL/6
ApoE-/ApoE-/-
ND
ND
ND
ND
Kontrolle
L-NA
Kontrolle
L-NA
30
30
30
30
0.99 ± 0.24
4.46 ± 1.46 #
1.96 ± 0.30
2.15 ± 0.49
86 ± 6
102 ± 15
103 ± 5
93 ± 7
verschiedenen Konzentrationswirkungskurven berechnet. Es zeigte sich, dass die EC50 in
ApoE-/- Tieren ohne Diät gegenüber den Kontrolltieren auf das ca. 3-fache erhöht war ohne
eine Abschwächung der EMax (Tabelle 3.4). Obwohl die Plasmacholesterinspiegel durch eine
cholesterin- und fettreiche Diät signifikant erhöht wurden, führte die Diät in den transgenen
Mäusen nicht zu einer weiteren Abschwächung der ACh-Dilatation, da sowohl die maximalen
Gefäßantworten (EMax) als auch die EC50 in ND- und HCD-Gruppen ähnlich waren (Tabelle
3.4). Somit zeigt sich lediglich ein geringer Effekt einer Hypercholesterinämie auf
endothelabhängige Dilatationen in der Mikrozirkulation im Sinne einer Desensitivierung.
A
B
ND
75
*
50
HCD
75
50
25
C57BL/6
25
C57BL/6
LDLR-/-
LDLR-/-
ApoE -/-
0
ApoE -/-
0
-7
-6
SNP [log mol/l]
-5
-7
-6
-5
SNP [log mol/l]
Abb. 3.39: SNP induzierte Dilatationen in hypercholesterinämischen Mäusen.
Dargestellt ist die Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration des NO-Donors Nitroprussid
(SNP). In allen Gruppen führte die Applikation des NO-Donors SNP zu einer
konzentrationsabhängigen Dilatation und die Gefäßantwort war in LDLR-/- und ApoE-/- Tieren weder
nach Standardfutter (ND, A) noch nach Fütterung einer cholesterin- und fettreichen Diät (HCD, B)
abgeschwächt. n= 90 Arteriolen in 9 C57BL/6 Mäusen, 59 Arteriolen in 6 LDLR-/- Tieren und 81
Arteriolen in 8 ApoE-/- Mäusen. * p<0.05 vs C57BL/6.
ERGEBNISSE
95
60
}
}
ND
LDLR-/HCD
ND
ApoE-/HCD
C57BL/6
*
80
40
#
20
#
#
0
-6
-5
Adenosin [log mol/l]
Abb. 3.40: Adenosin induzierte Dilatationen in hypercholesterinämischen Mäusen.
Superfusion von Adenosin induzierte konzentrationsabhängige Dilatationen in allen Gruppen. Bei
niedrigen Adenosin-Konzentrationen (1 µM) war die Dilatation jedoch in transgenen Mäusen mit und
ohne cholesterin- und fettreiche Diät reduziert, während die maximale Dilatation nicht verändert war.
n=40 Arteriolen in 4 Tieren. *p<0.05, # p<0.01 vs C57BL/6.
Dilatationen, die durch den endothelunabhängigen Dilatator NO-Donor SNP induziert
wurden, waren in keiner der untersuchten Gruppen mit oder ohne Diät gegenüber der
Kontrollgruppe reduziert (Abb. 3.39). Ebenso waren die Dilatationen nach Adenosin (10 µM)
in LDL-/- und ApoE-/- unabhängig von deren Diät unverändert (n=40 Arteriolen in 4 Mäusen).
Allerdings war in den transgenen Mäusen bei niedriger Adenosinkonzentration (1 µM) eine
Reduktion gegegenüber den Kontrolltieren zu beobachten (Abb. 3.40). Insgesamt sind NOinduzierte, endothelunabhängige Dilatation unverändert, während nach Adenosin wie bei
ACh beobachtet ebenfalls eine Desensitiverung vorliegen könnte.
3.4.4
NO als Mediator von ACh Dilatationen in hypercholesterinämischen Mäusen
Da die Sensitivität der Arteriolen bei Hypercholesterinämie gegenüber ACh vermindert war,
könnte dies auf der selektiven Beeinflußung der Bildung und Wirkung eines Autakoids,
welches besonders im niedrigen Konzentrationsbereich die Dilatation vermittelt, beruhen.
Um zu untersuchen, ob diese in den transgenen Mäusen beobachtete Abschwächung auf
einer verminderten Verfügbarkeit von NO beruht, wurden die Konzentrationswirkungskurven
in Anwesenheit eines Inhibitors der NO-Synthase (LNA) erneut erstellt. Die Versuche wurden
in
30
Arteriolen
(3
Tiere)
durchgeführt. In
Wildtyptieren
verursachte
LNA
eine
Rechtsverschiebung der Konzentrationswirkungskurve und eine signifikante Erhöhung der
EC50 (Kontrolle vs LNA: 0.99 ± 0.24 vs 4.46 ± 1.46 µM, p < 0.05) ohne die maximale
ERGEBNISSE
96
A
B
C57BL/6
100
ApoE
100
Kontrolle
Kontrolle
LNA
LNA
75
75
50
50
25
25
0
0
-7
-6
ACh [log mol/l]
-5
-7
-6
-5
ACh [log mol/l]
Abb. 3.41: Effekt der Inhibition der NO-Synthase auf ACh-Dilatationen in C57BL/6 und ApoE-/Tieren
Dargestellt ist die ACh-Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration. A: In Wildtyptieren (C57BL/6)
induzierte LNA eine Rechtsverschiebung der Konzentrationswirkungskurve ohne die maximale
Dilatation zu beeinflussen. B: Im Gegensatz dazu hat LNA keinen Effekt in ApoE-/- Mäusen. Jeweils n
= 30 Arteriolen in 3 Tieren. EC50 und Emax sind in Tabelle angegeben
Dilatation auf ACh (EMax, Tabelle 3.4) zu verändern (Abb. 3.41). Demgegenüber hatte die
Behandlung mit LNA in den hypercholesterinämischen ApoE-/- Mäusen, deren EC50 schon
unter Kontrollbedingungen erhöht war, keinen Einfluß auf die ACh-Dilatation (Abb. 3.41,
Tabelle 3.4). SNP-induzierte Dilatationen wurden dagegen in keiner der beiden Gruppen
durch LNA beeinflußt (Abb. 3.42)
60
40
Kontrolle
LNA
Kontrolle
LNA
20
} C57BL/6
} ApoE-/-
0
SNP [1µM]
Abb.3.42: Effekt der Inhibition der NO-Synthase auf SNP-Dilatationen
Der Inhibitor der NO-Synthase (LNA) hatte keinen Effekt auf die SNP induzierte Dilatation. Jeweils
n = 30 in 3 C57BL/6 und 3 ApoE-/- Tieren.
ERGEBNISSE
97
3.4.5 Fortgeleitete Vasomotorantworten nach ACh und KCl bei Hypercholesterinämie
Die Ausbreitung einer Gefäßantwort benötigt eine Kopplung der Zellen über Gap Junctions
und bei der Ausbreitung von Dilatationen hat Cx40, wie in Kapitel 3.1 gezeigt, eine
besondere Bedeutung. Eine Hypercholesterinämie geht mit einer reduzierten Expression von
Cx40 und Cx37 in Aorten in morphologisch normal erscheinenden Gebieten einher. Somit
könnte sich eine durch Hypercholesterinämie veränderte Expression der Connexine auf die
Ausbreitung von lokal induzierten Vasomotorantworten entlang des Gefäßes auswirken.
Deshalb sollte in diesen Experimenten die Ausbreitung von lokal induzierten Gefäßantworten
in hypercholesterinämischen Mäusen untersucht werden.
Es wurden Arteriolen mit einem maximalen Gefäßdurchmesser von 36 ± 1 µm lokal mit ACh
über Mikropipetten stimuliert. Diese lokalisierte Applikation von ACh induzierte im Wildtyp
(C57BL/6) eine lokale Dilatation, die innerhalb von 10 ± 1 s ein Maximum von 69 ± 5%
erreichte (n = 8 Arteriolen in 6 Tieren). Die Gefäße erreichten ihren Ausgangsdurchmesser
LDL-/-
C57BL/6
LDL-/- ND
ACh
LDL-/- HCD
90
60
lokal
550µm
1100µm
30
0
-30
-30
0
30
60
-30
Zeit [s]
30
60
-30
0
30
60
Zeit [s]
Zeit [s]
ApoE-/% der maximalen Dilatation
0
C57BL/6
ApoE-/- ND
ACh
ApoE-/- HCD
90
60
lokal
550µm
1100µm
30
0
-30
-30
0
Zeit [s]
30
60
-30
0
30
Zeit [s]
60
-30
0
30
60
Zeit [s]
Abb. 3.43: Fortgeleitete Dilatationen nach ACh in hypercholesterinämischen Tieren
Dargestellt sind die Durchmesseränderungen nach lokaler Stimulation mit ACh (vertikale Linie) in
LDLR-/- (oben) und ApoE-/- Tieren (unten) über die Zeit. Die Tiere erhielten entweder eine normale
(ND) oder eine cholesterin- und fettreiche Diät (HCD). Zum Vergleich sind die Antworten in
Wildtyptieren (C57BL/6) in beiden Abbildungen dargestellt. Weder die lokale Dilatation noch die
Ausbreitung der Dilatation entlang der Arteriole wurde durch Hypercholesterinämie beeinträchtigt.
Ebenso blieb die weitere Erhöhung der Cholesterinspiegel durch Diät (HCD) ohne Auswirkung auf die
ACh Dilatation und deren Fortleitung. n= 8 - 12 Arteriolen in 6 Mäusen für jede Gruppe.
ERGEBNISSE
98
innerhalb 43 ± 5 s. Die lokale Dilatation breitete sich ohne Verzögerung (< 1 s) entlang der
Arteriole aus, wobei die Amplitude der Dilatation bis in eine Entfernung von 1100 µm nicht
abnahm. Die Dauer der Dilatation verkürzte sich jedoch mit zunehmender Entfernung von
der Stimulationsstelle (Abb. 3.44). Die lokalisierte Stimulation der Arteriolen mit ACh führte in
den transgenen Tieren ebenfalls zu einer fortgeleiteten Dilatation (LDLR-/-: n = 12 in 6,
ApoE-/-: n = 8 in 5 Tieren). Die Dilatation breitete sich auch in diesen Tieren über eine große
Entfernung entlang der Arteriole aus (Abb. 3.43). Die Gefäßantworten an der lokalen Position
und den entfernten Stellen unterschieden sich in der Amplitude und der Dauer nicht von der
Dilatation im Wildtyp (Abb. 3.44). Die weitere Erhöhung der Cholesterinspiegel durch die
Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen Diät über einen Zeitraum von 4-6 Monaten
hatte ebenfalls keine Auswirkung auf die fortgeleiteten Dilatationen in den transgenen
Mäusen (Abb. 3.43 und 3.44). Somit ist die Ausbreitung von Dilatationen, die durch ACh
lokal ausgelöst wurden, bei Hypercholesterinämie nicht eingeschränkt.
A
Amplitude
100
80
60
40
20
0
0
B
550
1100
}
}
ND
LDLR-/HCD
ND
ApoE-/HCD
C57BL/6
Dauer
60
40
s
*
* *
20
0
0
550
1100
Abb. 3.44: Amplitude und Dauer
fortgeleiteteter Dilatationen nach
ACh bei Hypercholesterinämie
A: Die Amplitude der Dilatation
zeigte in allen Gruppen bis in eine
Entfernung von 1100 µm keine
Abschwächung und war in den
verschiedenen
Gruppen
nicht
unterschiedlich. Eine zusätzliche
Erhöhung der Cholesterinspiegel in
den transgenen Mäusen durch eine
cholesterinreiche
Diät
(HCD)
anstelle des Standardfutters (ND)
hatte ebenso keinen Einfluß auf die
Gefäßantwort.
B: Die Dauer der Dilatation
verkürzte sich in den meisten
Gruppen
mit
zunehmender
Entfernung. Dennoch fanden sich
keine signifikanten Unterschiede
zwischen den Genotypen oder den
mit Diät behandelten Gruppen. Die
Daten stammen aus 8 - 12
Arteriolen in 6 Experimenten.
* p < 0.05 vs lokal.
ERGEBNISSE
3.4.6 Immunhistochemischer
99
Nachweis
von
Connexin40
in
hypercholesteri-
nämischen Mäusen
Die Expression von Connexin 40 wurde in hypercholesterinämischen Mäusen mittels
Immunhistochemie an Paraffinschnitten untersucht. Es wurde der Creamstermuskel mit den
in ihm verlaufenden Arteriolen (n = 6) und zur methodischen Kontrolle Aorten (n = 4) und der
Vorhof des Herzens (n = 2) untersucht, da in diesem Gewebe Cx40 reichlich exprimiert wird.
Das Gewebe wurde Wildtyp- und ApoE-/- Tieren sowie als Negativkontrolle Cx40-defizienten
Mäusen entnommen. Um die Methode zu etablieren, wurden zunächst Aorten betrachtet.
Cx40 wurde in Aorten von Wildtypmäusen detektiert (Abb. A, braune Färbung) und war mit
dem endothelspezifischen Marker von Willebrand Faktor (vWF, rote Färbung, Abb. 3.45 A,
D) kolokalisiert. Diese Färbung war spezifisch, da in Aorten Cx40-defizienter Mäusen zwar
vWF lokalisiert werden konnte, das Cx40 Signal jedoch nicht detektierbar war (Abb. 3.45 B,
E). Weiterhin war nach Inkubation der Schnitte ohne die jeweiligen primären Antikörper
weder eine Rot- (vWF) noch eine Braunfärbung (Cx40) detektierbar (Abb. 3.45 C, F). Als
weitere Positivkontrolle wurde der Vorhof von Wildtyptieren untersucht, auch in diesem
Gewebe war eine deutliche Braunfärbung als Nachweis des Cx40 sichtbar (Abb. 3.45 G). Die
Untersuchung der Arteriolen erwies sich jedoch als technisch schwierig. Die meisten
angefertigten Schnitte waren nicht zu verwerten, da in diesen Arteriolen nicht eindeutig zu
erkennen waren und nur in wenigen Schnitten konnten Arteriolen identifiziert verwertet. Die
Abbildungen 3.45 H und I zeigen eine Arteriole in dem Cremastermuskel einer ApoE-/Maus. Cx40 ist deutlich sichtbar (braun) und kolokalisiert mit vWF (rot). Da die
Gewebeaufarbeitung nicht optimiert werden konnte und die wenigen erhaltenen Ergebnisse
heterogen waren, würde eine Quantifizierung selbst unter optimalen Bedingungen
bestenfalls einen Hinweis auf eine veränderte Cx40 Expression liefern. Von weiteren
Experimenten und der Quantifizierung wurde daher abgesehen. Dennoch zeigen diese
Befunde, dass Cx40 auch in hypercholesterinämischen Tieren in den Arteriolen exprimiert
wird.
ERGEBNISSE
100
Abb. 3.45: Immunhistochemischer Nachweis von Cx40 in hypercholesterinämischen Tieren
Paraffinschnitte der Aorta, des Vorhofs und Arteriolen des M. cremaster nach immunhistochemischer
Färbung von Cx40 (braun) und eines endothelspezifischen Markers (von Willebrand Faktor, vWF, rot).
In der Aorta einer Wildtypmaus war Cx40 (braun) und vWF (rot) kolokalisiert (A; D). Cx40 war in der
Aorta einer Cx40-defizienten Maus nicht detektierbar (B; E), obwohl das Endothel erkennbar am
Nachweis von vWF (rot) intakt war. Ohne die Inkubation der Schnitte mit den primären Antikörpern
war keine Färbung detektierbar (C; F). Cx40 wurde ebenfalls im Vorhof des Herzens detektiert (G,
braun). Im Cremastermuskel einer ApoE-/- war Cx40 (braun) in einem longitudinal angeschnittenen
Gefäß mit vWF (rot) deutlich sichtbar kolokalsiert (H, I).
ERGEBNISSE
3.5
101
3.5.1 Targeting der Src homology domain 2 (SH2)-Tyrosinphosphatase-1 (SHP-1):
Effekt auf ACh- und SNP- induzierte Dilatationen
Magnetofektion ermöglicht die einfache und schnelle Transfektion von Zellen in Kultur. Die
Methode beruht auf der reversiblen Kopplung von Oligonukleotiden oder Genvektoren an
magnetische Nanopartikel, die von einer kationischen Polymerhülle umgeben sind und in
wässriger Suspension vorliegen. Die magnetischen Nanopartikel mit den gebundenen
Antisensenukleotiden können mit Hilfe eines externen Magnetfeldes am Zielort fixiert und
konzentriert werden.
Target
unserer
Versuche
war
zunächst
die
Src
homology
domain
2
(SH2)-
Tyrosinphosphatase-1 (SHP-1). SHP-1 wurde in menschlichen Endothelzellen der
Nabelschnur (HUVEC) als wichtiger Regulator der NADPH-Oxidase abhängigen SuperoxidProduktion identifiziert. In Endothelzellen reduziert SHP-1 sowohl die basale als auch die
stimulierte Superoxid-Produktion, was sekundär die NO-vermittelte Dilatation beeinflußen
könnte, da Superoxid prinzipiell in der Lage ist, NO zu deaktivieren. Der Effekt der
Behandlung mit Antisensenukleotiden gegen SHP-1 auf SNP- und ACh- induzierte
Dilatationen wurde in 42 Arteriolen (4 Tieren) untersucht. Als Kontrollen wurden Mäuse
verwendet, die mit einer Nonsense-Sequenz (Scrambled) transfiziert wurden (39 Arteriolen in
4 Tieren). Die vaskuläre Funktion wurde 3 Tage nach der Applikation der Nukleotide in der
Mikrozirkulation in Arteriolen mit einem maximalen Durchmesser von 10 bis 56 µm
untersucht. Der NO Donor SNP induzierte in beiden Gruppen eine Konzentrationsabhängige
Dilatation, die in den transfizierten Tieren nicht abgeschwächt war, es zeigte sich ein leicht
verstärkte Dilatation, dieser Effekt war jedoch nicht signifikant (1µM: p= 0.055). ACh
induzierte
ebenfalls
eine
konzentrationsabhängige
Dilatation,
in
den
mit
SHP-1
Antisenseoligonukleotiden transfizierten Tieren. Die Dilatation war nicht wesentlich
unterschiedlich zu der Dilatation, die in den mit einer Nonsense-Sequenz behandelten Tieren
beobachtet wurde. Lediglich bei der Konzentration von 0.1 und 10 µM ACh war die Dilatation
in den mit der wirksamen Nukleotidsequenz behandelten Tieren abgeschwächt, der Effekt
war jedoch nur bei 0.1µM signifikant (0.1µM: 1 ± 7 vs 17 ± 4, p = 0.02; 10 µM: 56 ± 6 vs 70 ±
5, % der maximalen Dilatation, p = 0.06, Abb. 3.46).
ERGEBNISSE
102
.
A
B
SNP
90
60
60
30
30
Antisense
Kontrolle
0
-6
ACh
90
-5
Konzentration [log mol/l]
*
Antisense
Kontrolle
0
-7
-6
-5
Konzentration [log mol/l]
Abb. 3.46: Effekt nach Transfektion von Antisenseoligonukleotiden gegen die Tyrosinposphatase SHP-1 auf die Dilatation
Die vaskuläre Funktion wurde 3 Tage nach Applikation der Oligonukleotide untersucht. Dargestellt ist
die Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration von ACh bzw. SNP. SNP (A) und ACh (B)
induzieren konzentrationsabhängige Dilatationen die sich zwischen Antisense- und NonsenseSequenz (Kontrolle) nicht wesentlich unterschied. n = 39 - 42 in 4 Tieren je Gruppe.
3.5.2 Targeting des M3-Rezeptors: Effekt auf ACh, Adenosin und SNP induzierte
Dilatationen
In einer weiteren Gruppe von Experimenten wurde der muskarinische Acetylcholin-Rezeptor
(M3 Rezeptor) als Target ausgewählt, da dieser endotheliale Rezeptor die Acetylcholin (ACh)
induzierte Gefäßdilatationen vermittelt. Hierzu wurde ein Gemisch aus 6 verschiedenen
Antsenseoligonukleotiden verwendet, die die Expression des M3 Rezeptors in Keratinozyten
in vitro um 80% reduzierte.
Die endotheliale Funktion wurde 3 Tage nach Behandlung mit den Oligonukleotiden in der
Mikrozirkulation untersucht. Die ACh induzierte Dilatation wurden durch diese Behandlung
jedoch nicht verändert, die Konzentrationswirkungskurven verliefen nahezu identisch (Abb.
3.47 A). SNP induzierte Dilatationen waren nach der Applikation der Oligonukleotide sogar
signifikant verstärkt (Abb. 3.47 B), während die Dilatation induziert durch die Superfusion von
Adenosin unverändert blieb (Abb. 3.47 C). Dies zeigt, dass eine effektive Ausschaltung des
die ACh-Dilatation vermittelnden Rezeptors mit dieser Methode nicht durchführbar ist. Auch
die Untersuchung der vaskulären Funktion zu einem früheren Zeitpunkt nach Behandlung
waren ohne deutlichen Hemmeffekt (Daten nicht gezeigt).
ERGEBNISSE
103
A
B
ACh
90
C
SNP
90
60
60
30
30
*
*
90
*
Adenosin
60
*
30
Antisense
Kontrolle
0
Antisense
Kontrolle
0
-7
-6
[log mol/l]
-5
Antisense
Kontrolle
0
-7
-6
[log mol/l]
-5
-6
-5
[log mol/l]
Abb. 3.47: Vaskuläre Funktion nach Behandlung mit Nukleotiden zur Ausschaltung des
muskarinischen ACh-Rezeptors
Ein Gemisch aus 6 Antisensenukeotiden, die gegen die mRNA des muskarinischen M3-Rezeptors
gerichtet war, wurde 3 Tage vor der Untersuchung der vaskulären Funktion appliziert. Dargestellt ist
die Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration der Agonisten ACh (A), SNP (B) und Adenosin
(C). Weder durch ACh- noch durch Adenosin-induzierte Dilatationen wurden hierdurch beeinflußt,
während die SNP-induzierten Dilatationen nach Behandlung verstärkt waren. n= 50 Arteriolen in 5
Tieren. * ttest p<0.05 vs Kontrolle.
Die direkte Beobachtung der Arteriolen während und nach der Injektion von mit Fluorescein
markierten Oligonukleotiden zeigte eine unzureichende Fixierung und Konzentrierung der
Partikel am Zielort. In den Arteriolen des Cremasters waren nur vereinzelt Ansammlungen
von Oligonukleotiden in der Gefäßwand zu beobachten. Der überwiegende Teil der Partikel
schien mit dem Blut zu zirkulieren. Das angelegte Magnetfeld schien also nicht ausreichend
stark zu sein, um die mit dem Blut zirkulierenden Partikel zurückzuhalten. Auch manuelle
Kompression der abdominalen Aorta während der Injektion hatte keine positiven
Auswirkungen. Die Methode wurde deshalb trotz der guter Erfolge in der Zellkultur für die
Transfektion in vivo als ungeeignet gewertet.
104
DISKUSSION
4
Diskussion
4.1
Cx40 Expression und Rolle von endothelialem Cx40 bei der Ausbreitung
von Gefäßantworten
Die Regulation der Organperfusion ermöglicht die schnelle und adäquate Anpassung der
Perfusion an den momentanen Bedarf des Organs. Die Koordination erfolgt einerseits durch
vaskuläre Effekte der Wandschubspannung, die durch das fließende Blut auf die Gefäßwand
ausgeübt werden (8) und andererseits durch Fortleitung von Vasomotorantworten entlang
der Zellschichten der Gefäßwand (158). Die Fortleitung von Vasomotorantworten beruht auf
der Ausbreitung von Membranpotentialänderungen, wobei sowohl die glattmuskuläre
Zellschicht als auch das Endothel als separate Leitungswege dienen können (120, 159).
Lokal induzierte Membranpotentialänderungen können sich über eine Strecke von mehreren
Millimetern entlang des Gefäßes ausbreiten (59, 160). Dabei ist die Ausbreitung des Signals
abhängig von einer intakten elektrischen Kopplung der Zellen über Gap Junctions.
Connexin40 (Cx40) hat für die Ausbreitung von ACh-induzierten EDHF-vermittelten
Dilatationen entlang der Arteriole eine besondere Bedeutung, wie von unserer Arbeitsgruppe
bereits gezeigt wurde (110). In Cx40-defizienten Mäusen war die Ausbreitung des Signals in
die Entfernung deutlich abgeschwächt. In dieser Arbeit wurde untersucht, in welcher
Zellschicht
Cx40
die
Fortleitung
ermöglicht.
Immunfärbung
in
Arteriolen
des
Cremastermuskels zeigte die Lokalisation von Cx40 an den Zellgrenzen der Endothelzellen.
Die Konturen der Endothelzellen werden nach Markierung von Cx40 gänzlich sichtbar, was
die reichliche Expression von Cx40 in der Zellmembran deutlich zeigt. Diese Lokalisation ist
vereinbar mit der Hypothese, dass fortgeleitete Dilatationen, die durch ACh induziert wurden,
sich entlang der Endothelzellschicht ausbreiten. Die Expression von Cx40 konnte in einer
Reihe von Spezies im Endothel von Leitungs- und Widerstandsgefäßen nachgewiesen
werden (56, 106, 161-165). In der vorliegenden Arbeit wurde in glatten Muskelzellen kein
Cx40 detektiert und auch in der Literatur sind Berichte über eine Expression in glatten
Muskelzellen mit Ausnahme des Nachweises von Cx40 in Renin sekretierenden Zellen der
afferenten Nierenarteriolen selten (166-168). Allerdings wurde in der Mikrozirkulation der
Backentasche des Hamsters Cx40 sowohl in Endothelzellen als auch in glatten Muskelzellen
lokalisiert, was auf gewebe- oder speziesspezifische Unterschiede der Connexinexpression
hindeutet (163, 164). Möglicherweise findet sich Cx40 auch in der glatten Muskulatur in dem
hier untersuchten Präparat, welches unterhalb der Nachweisbarkeitsgrenze der verwendeten
Methode nicht detektiert werden konnte. Ein solch niedriges Expressionsniveau kann
eventuell auch eine intakte elektrische Kopplung von Zellen über vereinzelte Gap Junctions
herstellen, ohne dass sie mittels Immunfluoreszenz nachweisbar waren (169).
Daher wurde die Ausbreitung von Dilatationen und Konstriktionen auch in Mäusen mit einem
105
DISKUSSION
endothelialen Cx40 (eCx40-/-) Verlust untersucht. Die untersuchten Tiere wiesen ein von loxSites flankiertes Cx40 Gen auf (floxed Cx40), welches durch die Cre-Rekombinase unter der
Kontrolle eines TIE-2 Promotors selektiv im Endothel deletiert wurde. (170). In diesen Tieren
und dem Wildtyp breiteten sich ACh induzierte Dilatationen in die Entfernung aus. Der
endotheliale
Cx40
Verlust
führte
jedoch
mit
zunehmender
Entfernung
von
der
Stimulationsstelle zu einer Abschwächung der Amplitude der Gefäßantwort, wohingegen die
Amplitude im Wildtyp konstant blieb. Dies zeigt, dass die endotheliale Zellschicht bei der
Ausbreitung von ACh-induzierten Dilatationen als Leitungsweg im Vordergrund steht und
Cx40 hier eine besondere Bedeutung zukommt. Prinzipiell stehen sowohl das Endothel als
auch die glattmuskuläre Zellschicht als Leitungsweg zur Verfügung. In Arteriolen der
Backentasche des Hamsters konnten ACh-induzierte Dilatationen beide Leitungswege
nutzen, wie durch selektive Zerstörung der einzelnen Leitungswege gezeigt wurde. Erst nach
Zerstörung der Endothel- und der glattmuskulären Zellschicht breitete sich das Signal nicht
mehr in die Entfernung aus (120, 159). Ähnliche Experimente im Cremastermuskel der Maus
identifizierten jedoch das Endothel als alleinigen Leitungsweg, entlang dessen sich das
Signal nach lokaler ACh-Stimulation ausbreitete (164). Die intakte glatte Muskelzellschicht
war hierbei nicht in der Lage, die Zerstörung des Endothels zu kompensieren. Diese Befunde
lassen für die abgeschwächte Fortleitung in eCx40-/- vermuten, dass andere Connexine die
longitudinale Kopplung entlang des Endothels zumindest partiell ermöglichen und dass nicht
die glatte Muskelzellschicht als Signalweg für die verbleibende Antwort fungiert.
Die Untersuchung spezifischer Funktionen in Mausmodellen mit einer Deletion eines
Connexins ist dadurch erschwert, dass die Deletion das Expressionsmuster anderer
Connexine beeinflussen kann. So führte die Deletion von Cx40 im Mausmodell zu einer
gesteigerten Expression von Cx37 und Cx43 (171, 172). Der endothelspezifische Verlust von
Cx43 führte hingegen zu einer ebenfalls verringerten Expression von Cx43 in glatten
Muskelzellen (173). Der Einfluß des endothelspezifischen Verlusts von Cx40 auf die
Expression anderer Connexine wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Die vorliegenden
Daten erlauben jedoch die Schlußfolgerung, dass Cx40 für die Ausbreitung von ACh
Dilatationen von großer Bedeutung ist und die Ausbreitung der Dilatation vermutlich entlang
des Endothels erfolgt. Offen ist die Frage, ob eine mögliche Heraufregulation anderer
Connexine im Endothel nach spezifischer Deletion von Cx40 die verbleibende Fortleitung nur
nach der Deletion ermöglicht oder ob dies den physiologischerweisen Beitrag der anderen
Connexine widerspiegelt. Um dies zu beantworten, muß die Funktion von Cx40 kurzfristig
ausgeschaltet werden. Da spezifische Blocker nicht zur Verfügung stehen, ist hierzu eine
gewebsspezifische und zeitlich induzierbare Gendeletion notwendig. Interessanterweise ist
die kombinierte Deletion der beiden wichtigen endothelialen Connexine Cx40 und Cx37 nicht
106
DISKUSSION
mit dem Leben vereinbar (174), was die physiologische Relevanz der Zellkopplung im
Endothel nochmals betont.
Konstriktionen, die durch lokale Applikation von KCl induziert wurden, breiteten sich im
Gegensatz zu ACh induzierten Dilatationen mit abnehmender Amplitude in die Entfernung
aus. Dies wurde durch den Verlust von endothelialem Cx40 nicht beeinflußt. In der
Hamsterbackentasche konnten Segal und Mitarbeiter durch selektive Zerstörung von glatten
Muskelzellen oder Endothelzellen in einem Bereich zwischen Stimulationsstelle und
beobachteter Position zeigen, dass eine lokal induzierte biphasische Gefäßantwort nach
KCl-Stimulation in unterschiedlichen Zellschichten fortgeleitet wurden. Die biphasische
Gefäßantwort bestand aus einer Konstriktion, die von einer Dilatation gefolgt wurde. Hierbei
breitete sich die Konstriktion ausschließlich entlang der glattmuskulären Zellschicht aus,
wohingegen die Dilatation entlang des Endothels fortgeleitete wurde (159). KCl induzierte in
unserer Präparartion ebenfalls eine biphasische Reaktion und beide Komponenten wurden in
die
Entfernung
fortgeleitet.
Die
initiale
Konstriktion
entsteht
durch
die
Öffnung
spannungsabhängiger Calciumkanäle, die durch die direkte KCl-induzierte Depolarisation
aktiviert werden, denn sie wurde durch den Calcium-Kanal-Blocker Nifedipin inhibiert (159).
Die folgende Dilatation ist in tonisierten Gefäßen zu beobachten und beruht vermutlich auf
der allmählichen Abnahme der lokalen Kaliumkonzentration nach Stimulation. Im Gegensatz
zur Depolarisation bei hohen Kaliumkonzenztrationen aktiviert Kalium in einem niedrigen
Konzentrationsbereich von 6 - 20 mM zum einen KIR-Kanäle und zum anderen die
elektrogene Na+/K+ ATPase. Beide Vorgänge bewirken eine Hyperpolarisation und eine sich
ausbreitende Dilatation (159). Die Ausbreitung dieser Dilatation wurde jedoch durch den
Verlust von endothelialem Cx40 nicht beeinflußt. Möglicherweise sind andere Connexine
(Cx37, Cx43) an der Ausbreitung der Dilatation entlang des Endothels beteiligt oder das
Signal breitet sich in dieser Präparation ebenfalls entlang der glattmuskulären Zellschicht
aus. Auffällig ist, dass sich die durch KCl induzierten Konstriktionen im Vergleich zu
Dilatationen nach ACh deutlich schlechter in die Entfernung ausbreiten. Das Endothel ist
aufgrund seiner longitudinalen Ausrichtung entlang des Gefäßes und der Länge, die eine
Endothelzelle besitzt (~150 µm), als Leitungsweg besonders geeignet. Ein sich
ausbreitendes Signal müßte zur Überwindung einer Strecke von 2 mm 280 glatte
Muskelzellen, jedoch nur 14 Endothelzellen passieren (4). Die größere Zellzahl, die das
Signal bei der Ausbreitung entlang der glattmuskulären Zellschicht überwinden muß, könnte
an der Abschwächung des Signals in der Entfernung beteiligt sein. Ebenso könnte das
Ausmaß der homozellulären Kopplung entlang der glattmuskulären Zellschicht Einfluß auf
die Effizienz der Fortleitung nehmen, denn die Zellkopplung über Gap Junctions ist in glatten
Muskelzellen weniger gut ausgeprägt (166). Die mathematische Modellierung der
DISKUSSION
107
Signalweitergabe in Arteriolen zeigt ebenfalls, dass differente Signalwege existieren und die
glatte Muskelzellschicht deutlich schlechter gekoppelt ist (175). Die hier vorgelegten
Ergebnisse lassen vermuten, dass die Ausbreitung von Konstriktionen entlang dieser
glattmuskulären Zellschicht erfolgt und unabhängig von Cx40 ist.
4.2
Bedeutung von KCa–Kanälen in der Mikrozirkulation
4.2.1
BKCa bei NO- und endothelabhängigen Dilatationen
In vitro Untersuchungen haben gezeigt, dass die Aktivität von spannungs- und
calciumsensitiven BKCa-Kanälen in glatten Muskelzellen den Calciumeinstrom und damit die
Kontraktion inhibieren (Abb. 1.1 (30, 36, 176-179)). Kanalaktivierung repolarisiert glatte
Muskelzellen und führt dadurch zum Schließen von spannungsabhängigen Calciumkanälen,
die zuvor beispielsweise durch Agonisten aktiviert wurden (38). Die Kanäle zeigen jedoch
auch basale Aktivität, die durch lokalisierte Freisetzung von Ca2+ aus internen Speichern
induziert wird (180). Der Verlust der regulatorischen β-Untereinheit des Kanals führt in der
Maus zu arterieller Hypertonie und kardialer Hypertrophie (33, 181). Aktuelle Befunde
zeigen, dass die verminderte Expression der β-Untereinheit in Ratten ebenfalls eine
Hypertonie begünstigt (182) und erhöhte Aktivität der regulatorischen Untereinheit die
Prävalenz eines diastolischen Hypertonus senkt (183). Da die porenbildende α-Untereinheit
jedoch auch in Abwesenheit der regulatorischen Untereinheit Aktivität zeigen könnte, wurde
eine Maus entwickelt, die für die α-Untereinheit defizient ist (34). Die vaskuläre Funktion
dieser Tiere wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht.
Der Ruhetonus der Arteriolen in der Mikrozirkulation dieser Tiere war im Vergleich zu
Wildtyp-Wurfgeschwistern nicht erhöht. Im Gegensatz dazu, war in kleinen Arterien (A.
tibialis, Durchmesser ca. 120 µm) sowohl das Ruhemembranpotential als auch der myogene
Tonus erhöht (184). Erstaunlicherweise wiesen diese Tiere im Gegensatz zu Mäusen, in
denen die regulatorische Untereinheit ausgeschaltet war, nur eine leichte Erhöhung des
Blutdrucks von 5 mmHg ohne Anzeichen einer kardialen Hypertrophie auf (184). Diese
moderate Blutdruckerhöhung wurde von Sausbier und Mitarbeitern auf endokrine und
vaskuläre Effekte zurückgeführt. In BK-/- Mäusen waren die Aldosteronspiegel erhöht und
die Dilatation auf cGMP, einem Effektor in der NO/PKG Signalkaskade, vermindert. Als
weitere Ursache des erhöhten myogenen Tonus wurde die Abwesenheit von transienten
Kaliumauswärtsströmen (STOCs) identifiziert, die ein Strom über KCa nach Aktivierung durch
lokale Ca2+ Freisetzung aus internen Speichern sind, und eine dilatierende Wirkung in
108
DISKUSSION
myogen aktiven Gefäßen haben (184). STOCs sind ebenso in Tieren, denen die
regulatorische β-Untereinheit des Kanals fehlt, ohne eine Änderung der Ca2+-Sparks
vermindert (185).
Die Beteiligung des BKCa bei endothelunabhängigen Dilatationen wurde durch die Applikation
von NO oder cGMP-Analoga untersucht und zeigte, dass BKCa-Kanäle in der Mikrozirkulation
nicht als Effektoren des NO/cGMP/PKG Signaltransduktionsweges beteiligt sind, da weder
die Dilatation nach NO-Donoren noch nach einem cGMP-Analogon in BKCa-defizienten
Tieren verändert war. Dies bestätigt Untersuchungen in eNOS-defizienten Mäusen, in denen
die pharmakologische Blockade des BKCa ebenfalls ohne Effekt auf NO-induzierte
Dilatationen blieb (186). In anderen Präparationen kann NO jedoch entweder direkt oder
auch cGMP abhängig BKCa-Kanäle aktivieren (80, 82). Ebenso fand sich in der A. tibialis in
BKCa-defizienten Tieren eine Abschwächung von Dilatationen nach NO (184). In der NOSignalkaskade ist die Proteinkinase G (PKG) ein wichtiges Glied und auch die Relevanz
dieser Kinase war ebenfalls verschieden zwischen der A. tibialis (187) und den Arteriolen in
der Mikrozirkulation (186). Die beobachteten Unterschiede zeigen in der Summe, dass bei
der NO-mediierten Dilatation in der Mikrozirkulation andere Signaltransduktionswege als bei
größeren Gefäßen verwendet werden, die Proteinkinase G ist bedeutend, aber der BKCa–
Kanal ist nicht beteiligt. Offensichtlich ist auch die basale Aktivität dieses Kanals
unterschiedlich, möglicherweise bedingt durch eine stärkere Depolarisation der glatten
Muskulatur in größeren Gefäßen.
KCa-Kanäle haben als Effektoren der endothelabhängigen EDHF-vermittelten Dilatationen
große Bedeutung und die Aktivierung von BKCa ist in einer Reihe von Präparationen an der
Dilatation beteiligt (118, 119, 186, 188). Die Rolle dieser Kanäle bei Dilatationen nach
Adenosin und Acetylcholin wurden durch globale Superfusion der Agonisten untersucht.
Adenosin
induzierte
Dilatationen
waren
unabhängig
von
BKCa-Kanal-Aktivität.
Überraschenderweise waren jedoch auch Dilatationen, die durch ACh induziert wurden, in
BKCa-defizienten Tieren unbeeinträchtigt. Dies steht im Gegensatz zu Ergebnissen, die in
unserer Arbeitsgruppe nach pharmakologischer Blockade der BKCa-Kanälen erhoben
wurden, denn nach Blockade der BKCa-Kanäle waren ACh-Dilatation deutlich abgeschwächt
(186). Auch nach lokaler Applikation von ACh zeigte sich jedoch, dass die lokale Antwort und
auch deren Ausbreitung entlang der Arteriole durch den Verlust von BKCa unbeeinträchtigt
war.
Da
möglicherweise
in
BKCa-defizienten
Tieren,
anders
als
bei
transienter
pharmakologischer Blockade, die Synthese von Prostazyklin und NO kompensatorisch
erhöht ist, wurden diese Versuche in Anwesenheit einer Blockade von NO-Synthase und
Cyclooxygenase wiederholt. Obwohl die Hemmung der Prostazyklin- und NO-Synthese den
109
DISKUSSION
basalen Tonus der Arteriolen erhöhte, was die effektive Blockade der Produktion dieser
Mediatoren aufzeigt, blieb die Dilatation nach globaler Stimulation mit steigenden AChKonzentrationen in BKCa-defizienten Mäusen und auch den Wildtypwurfgeschwistern
unbeeinflußt. Lediglich die Dilatation nach lokaler Stimulation mit ACh war nach Hemmung
der NO-Synthase und Cyclooxygenase in BKCa-defizienten Mäusen an der Stimulationsstelle
abgeschwächt. Die Ausbreitung dieser Antwort entlang der Arteriole war jedoch nicht
beeinträchtigt. Im Gegensatz zur globalen Stimulation ist die Kontrolle der Konzentration des
Agonisten bei lokaler Stimulation nur schwierig zu gewährleisten und die beobachtete
Abschwächung am ehesten auf eine unterschiedlich starke Stimulation der Arteriolen vor und
nach Behandlung zurückzuführen. Somit zeigen diese Daten, dass BKCa-Kanäle in diesen
Tieren bei der Dilatation nach Adenosin und ACh nicht beteiligt sind. Desweiteren tragen
auch die anderen endothelialen Mediatoren, NO und Prostazyklin, weder im Wildtyp noch
kompensatorisch in BK-/- Tieren als Mediatoren hierzu bei.
Die Diskrepanz zu den Ergebnissen nach pharmakologischer Blockade des Kanals mit
Iberiotoxin (186) könnte auf Unterschieden zwischen den Mausstämmen beruhen. Die
transgenen Mäuse sowie deren Wildtyp-Wurfgeschwister hatten einen genetischen
Mischhintergrund (C57BL/6 / SV129, F2 Generation), wohingegen die vorhergehenden
Experimente, in denen Iberiotoxin eingesetzt wurde, an C57BL/6 Mäusen durchgeführt
wurden (186). Deshalb wurde die Rolle von BKCa in C57BL/6 und dem Wildtyp im
Mischhintergrund mittels pharmakologischer Blockade erneut überprüft. Hierbei bestätigte
sich die starke Abschwächung der ACh-Dilatation nach Blockade von BKCa-Kanälen in
C57BL/6 Mäusen, während Iberiotoxin in den BK+/+ Mäusen mit einem Mischhintergrund
keinen Einfluß auf die Gefäßantwort nach ACh hatte. Die Dilatation auf exogenes NO blieb
dagegen in beiden Mausstämmen intakt und zeigt, wie oben diskutiert, die Unabhängigkeit
der NO-Dilatation von diesen Kanälen. Im Gegensatz dazu war die ACh-Dilatation in
C57BL/6, aber nicht im C57BL/6 / SV129 Mischhintergrund, vermittelt durch den BKCa-Kanal.
Der Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die Funktion unterschiedlicher Vorgänge ist
bekannt. Bereits bei der Narkose verschiedener Mausstämme sind verschiedene Narkotika
unterschiedlich
effektiv,
was
vermutlich
auf
die
unterschiedliche
Expression
metabolisierender Enzyme zurückzuführen ist (189). Verschiedene Mausstämme weisen
ebenfalls eine unterschiedliche Prädisposition für die Entwicklung von Hyperlipidämie und
atherosklerotischen Veränderungen auf (190). Die hier erhobenen Daten verdeutlichen den
Stellenwert des genetischen Hintergrundes bei der Interpretation experimenteller Befunde
und betont die Notwendigkeit der Verwendung von Wildtypwurfgeschwistern als Kontrolle.
Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse verschiedener Labore ist nur dann gewährleistet, wenn
110
DISKUSSION
eine zeitaufwändige Rückkreuzung der Tiere in einen üblichen genetischen Hintergrund (z.B.
C57BL/6) erfolgt ist. Die vorgelegten Ergebnisse machen deutlich, dass die Auswirkung der
globalen Defizienz der porenbildenden Untereinheit des BKCa-Kanals auf die vaskuläre
Funktion sehr vorsichtig zu interpretieren ist, da dieser Kanal bereits im Wildtyp mit einem
Mischhintergrund nur eine untergeordnete Bedeutung besitzt. Dies spiegelt sich auch in dem
nur moderat erhöhten Blutdruck der Tiere (184) im Gegensatz zu der Hypertonie und
kardialen Hypertrophie, die nach Verlust der vaskulär exprimierten regulatorischen
Untereinheit beobachtet wird (33, 181). Allerdings wurden auch in diesen beiden Studien
Subtypen eines Mausstamms verwendet (SV129 und 129svj), die in ihrem genetischen
Hintergrund
ebenfalls
erheblich
variieren
können
(191,
192).
Nach
vollständiger
Rückkreuzung der BKCa-defizienten Tieren in den C57BL/6 Hintergrund sollte die erneute
Durchführung ähnlicher Versuche weiteren Aufschluß über die Funktion des BKCa-Kanals in
der Mikrozirkulation ergeben.
4.2.2
IKCa und SKCa bei endothelabhängigen Dilatationen
Die Aktivierung von endothelialen SKCa- und IKCa-Kanälen ist ein Schlüsselereignis, das zur
Hyperpolarisation und Relaxation von glatten Muskelzellen führt und somit mit der EDHFabhängigen Dilatation verknüpft ist (39, 82, 193). Die Kanäle werden durch Agonisten
aktiviert, die einen Anstieg der endothelialen Calciumkonzentration induzieren (194). Hierbei
können SKCa und IKCa gemeinsam an der endothelabhängigen Dilatation beteiligt sein oder
jeder Kanal spezifisch zur EDHF-Antwort beitragen. So wurde die EDHF-Antwort in
Leberarterien von Ratten und Koronararterien von Schweinen sowie Mesenterialarterien von
Ratten erst nach simultaner Blockade von IKCa- und SKCa-Kanälen inhibiert (95, 195, 196).
Interessanterweise waren endotheliale Hyperpolarisationen und somit EDHF-Dilatationen in
Cerebralarterien von Ratten und menschlichen Mesenterialarterien (197, 198) durch die
alleinige Blockade von IKCa-Kanälen, aber in Mesenterialarterien von Hasen durch alleinige
SKCa-Blockade aufgehoben (199). Dies deutet auf eine spezifische Funktion von IKCa- und
SKCa-Kanälen hin. Die Generierung einer Maus, die defizient für den IKCa-Kanal ist,
ermöglicht die differenzierte Betrachtung der Bedeutung von SKCa- und IKCa-Kanälen (200).
Der Verlust des IKCa-Kanals führte in der Mikrozirkulation zu einer Erhöhung des
Gefäßtonus. Die Aktivierung der Kanäle mit dem IKCa-Öffner DCEBIO führte im Wildtyp, nicht
aber in IK-/- Tieren, zur Dilatation. Dies zeigt, dass einerseits die basale IKCa-Aktivität in
Abwesenheit von NO und Prostazyklin einen kontinuierlichen dilatierenden Effekt hat und
andererseits die spezifische Aktivierung von IKCa-Kanälen eine weitere Dilatation auslösen
kann. Die Beteiligung von IKCa -Kanälen an ACh-, NO- und Adenosin-induzierten Dilatationen
DISKUSSION
111
wurde durch globale Superfusion der Agonisten untersucht. Die Dilatationen nach NO waren
in IKCa-defizienten Mäusen lediglich im mittleren Konzentrationsbereich leicht abgeschwächt,
wobei die maximale Dilatation nicht beeinflußt wurde. Dieser Befund ist überraschend, da es
bisher keine Hinweise auf eine durch NO induzierte Aktivierung von IKCa-Kanälen gibt. Der
Effekt ist jedoch nicht sehr ausgeprägt und möglicherweise ist die Abschwächung nicht auf
eine direkte Beteiligung von IKCa an NO-induzierten Dilatationen zurückzuführen, sondern auf
den erhöhten Kontraktionszustand der Gefäße in IKCa-defizienten Tieren. Im Gegensatz
hierzu waren Dilatationen nach Adenosin in IKCa- defizienten Tieren nicht beeinträchtigt.
Auch nach zusätzlicher Blockade von SKCa waren die Gefäßantworten auf Adenosin in den
IK-/- Tieren intakt. EDHF ist der entscheidende Mediator bei ACh-induzierten Dilatationen in
der Mikrozirkulation der Maus (160, 186) und die Aktivität von KCa-Kanälen ist für diese NOund Prostazyklin-unabhängige Antwort essentiell. Die Dilatation auf ACh war nach globaler
Stimulation in IK-/- Tieren vor allem im mittleren Konzentrationsbereich deutlich
abgeschwächt und auch die maximale Gefäßantwort war reduziert. Nach zusätzlicher
Blockade des SKCa-Kanals mit UCL1684 war auch die verbleibende Antwort verschwunden.
Im Wildtyp hatte diese Substanz hingegen keinen Effekt. Dies zeigt, dass SKCa- und IKCaKanäle essentielle Mediatoren bei Dilatationen nach ACh sind, wobei der IKCa Kanal
allerdings im Vordergrund steht. Lediglich eine Restantwort kann durch die Aktivität des
SKCa-Kanals aufrechterhalten werden.
Bereits publizierte Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass die endotheliale
Hyperpolarisation nach pharmakologischer Blockade von SKCa mit Apamin abgeschwächt
wird. Dagegen war die Hyperpolarisationen der glatten Muskelzelle durch Blockade von IKCaund BKCa-Kanälen mit Charybdotoxin oder durch selektive Blockade von BKCa durch
Iberiotoxin reduziert (119). Die mechanische Gefäßantwort wurde in diesen Versuchen
ähnlich beeinflußt. Die Blockade von SKCa schwächte die Dilatation nach ACh lediglich ab,
während die Blockade von BKCa mit Iberiotoxin oder IKCa und BKCa mit Charybdotoxin einen
deutlich stärkeren Effekt hatte (119). Die Rolle des IKCa als Effektor wurde in diesen
Versuchen jedoch nicht untersucht, da ein selektiver Blocker nicht eingesetzt wurde. Die in
dieser Arbeit in IKCa-defizienten Mäusen erhobenen Befunde zeigen eine übergeordnete
Bedeutung der Aktivierung von IKCa gegenüber SKCa und die Beteiligung von SKCa zeigte
sich erst nach Verlust der IKCa-Aktivität. Dies läßt vermuten, dass IKCa eine zusätzliche
Funktion als Verstärker einer SKCa induzierten Hyperpolarisation bzw. Dilatation haben.
Umgekehrt ist der Verlust der IKCa-Komponente der EDHF-abhängigen Dilatation durch SKCa
Aktivität nicht zu kompensieren.
In Mesenterialarterien von Ratten in vitro wurde eine umgekehrte Gewichtung von IKCa und
DISKUSSION
112
SKCa bei Antworten nach ACh beobachtet. Die Hyperpolarisation war komplett SKCa
abhängig und Blockade von IKCa blieb ohne Effekt (196). Nach Vorkontraktion mit
Noradrenalin hatte SKCa zwar weiterhin den größten Anteil an der Hyperpolarisation, aber
unter diesen Bedingungen war ein Teil der Antwort auch auf die Aktivität von IKCa
zurückzuführen. Aufgrund der Beobachtung von Oishi und Mitarbeitern, dass Stimulation von
glatten Muskelzellen mit Noradrenalin einen Anstieg der endothelialen Calciumkonzentration
induziert, der vermutlich auf der Diffusion von IP3 oder Calcium durch myoendotheliale Gap
Junctions beruht (201), spekulierten die Autoren, dass SKCa-Kanäle an myoendothelialen
Gap Junctions lokalisiert sein könnten, wohingegen IKCa-Kanäle an Endothelzellgrenzen
exprimiert werden (196). Dadurch könnte die Aktivierung von SKCa durch einen
Calciumtransfer aus dem glatten Muskel umgekehrt wiederum eine glattmuskuläre
Hyperpolarisation fördern und somit der Kontraktion entgegenwirken. Eine ähnliche negative
Rückkopplung des glatten Muskels auf die Bildung endothelialer Autakoide vermittelt durch
myoendotheliale Gap Junctions wurde auch in kleinen Arterien des Cremastermuskles in
vitro gefunden (202). Die Blockade von SKCa führte jedoch in unserer Präparation nicht zu
einer Beeinflussung des glattmuskulären Membranpotentials und weiterhin ist die
heterozelluläre Kopplung in unserer Präparartion nicht ausgeprägt (160). Dennoch zeigen
diese Befunde in IKCa-defizienten Tieren, dass SKCa und IKCa spezifische Funktionen
ausüben, da die Aktivität von IKCa durch SKCa nicht kompensiert wird. Die Aktivierung von
Kanälen, welche in Mikrodomänen mit anderen Proteinen funktionell gekoppelt vorliegen und
somit spezifische Funktionen ausüben, ist ein faszinierendes Konzept, das der Komplexität
der in vivo beobachteten Vorgänge gerecht werden kann.
Die Beteiligung von IKCa- und SKCa-Kanälen bei der Fortleitung von lokal induzierten
Dilatationen wurde ebenfalls in IKCa-defizienten Tieren und nach pharmakologischer
Blockade von SKCa mit UCL1684 im Wildtyp untersucht. Lokale Applikation des IKCa-Öffners
DCEBIO induzierte im Wildtyp eine sich ausbreitende Dilatation, aber wie erwartet nicht in
IKCa-defizienten Tieren. Da die lokale selektive Aktivierung von IKCa eine fortgeleitete
Dilatation auslöst, ist möglicherweise auch die fortgeleitete Dilatation nach ACh von IKCa
abhängig. Tatsächlich war auch die ACh-Antwort bei Deletion des IKCa an der
Stimulationsstelle deutlich abgeschwächt, jedoch war die Fortleitung dieser verminderten
Antwort entlang der Arteriole nicht von IKCa-Aktivität abhängig. Blockade von SKCa mit
UCL1684 hatte weder einen Effekt an der lokalen noch an den entfernten Positionen. Im
Cremastermuskel des Hamsters ist die EDHF-Aktivität an der lokalen Stelle für die
Auslösung einer sich ausbreitenden Dilatationen notwendig, während die lokalisierte
Blockade von BKCa mit Iberiotoxin oder IKCa und BKCa mit Charybdotoxin an der entfernten
Position keine Abschwächung der Dilatation zur Folge hatte (99). Die Befunde in IKCa-
DISKUSSION
113
defizienten Mäusen ergänzen dies, denn auch hier war IKCa nur an der lokalen Stelle, nicht
jedoch bei dem Ausbreitungsprozess, von Bedeutung. SKCa-Kanäle sind, zumindest bei
Vorhandensein von IKCa, für die Auslösung und Ausbreitung von lokal induzierten AChDilatationen nicht relevant. Zusammengefasst lassen diese Daten den Schluß zu, dass die
Aktivierung von KCa-Kanälen bei der Initiierung des Signals, welches sich entlang des
Gefäßes ausbreitet, nicht aber bei dem Ausbreitungsprozess selbst beteiligt ist.
4.2.3
Charakterisierung der Effektoren lokal induzierter Adenosin Dilatationen
Adenosin-induzierte Dilatationen wurden in unserer Präparartion bisher nicht genauer
charakterisiert und sind in dieser Arbeit untersucht worden. Es ist jedoch bekannt, dass
Adenosin über unterschiedliche Mechanismen zur Dilatation führen kann. Unterschiedliche
Adenosinrezeptoren, welche Vasodilatation vermitteln können, werden in vaskulären Zellen
exprimiert. Bisher wurden A1, A2A, A2B und A3 Adenosinrezeptoren, die sowohl auf
Endothelzellen als auch auf glatten Muskelzellen lokalisiert sein können, beschrieben (203).
In der Mikrozirkulation vermitteln insbesondere A1- und A2-Rezeptoren die Vasodilatation.
Die Mechanismen, über die Adenosin eine Dilatation induzieren kann, zeigen in Abhängigkeit
vom untersuchten Gefäßbett und von der Spezies eine hohe Variabilität. Die Dilatation kann
nicht nur über die Aktivierung unterschiedlicher Rezeptoren erfolgen, sondern die durch
Rezeptoraktivierung ausgelösten Signalkaskaden sind zusätzlich abhängig vom jeweiligen
Ort der Expression. So kann die Aktivierung von endothelialen A2A-Rezeptoren zu einem
Ca2+ Anstieg führen, der dann die endotheliale NO-Synthase aktiviert (204). Die Erhöhung
der endothelialen Calciumkonzentration könnte jedoch ebenfalls eine vermehrte Bildung von
Prostazyklin oder die Aktivierung von KCa-Kanälen zur Folge haben. Eine Aktivierung von A2A
Rezeptoren auf glatten Muskelzellen kann hingegen über einen anderen Mechanismus zur
Dilatation führen. An kleinen isolierten koronaren Arteriolen wurde gezeigt, dass Adenosin
A2A-Rezeptoren in glatten Muskelzellen aktiviert und die Dilatation auf Öffnung von KATPKanälen beruht (205). Adenosin kann also eine Öffnung von Kaliumkanälen induzieren, was
zu einer Hyperpolarisation führt und somit auch eine fortgeleitete Vasomotorantwort
auslösen könnte. In der Mikrozirkulation der Backentasche des Hamsters führte die
lokalisierte Applikation von Adenosin zu einer fortgeleiteten Dilatation, die sowohl lokal als
auch in der Entfernung von einem endothelialen Calciumanstieg abhängig war (206). Die
beteiligten Kaliumkanäle sowie die Rolle von NO wurden in dieser Arbeit jedoch nicht
untersucht.
Die lokalisierte Applikation von Adenosin zeigte, dass auch in der Mikrozirkulation der Maus
eine fortgeleitete Dilatation induziert wurde. Sowohl die lokale als auch die entfernte
114
DISKUSSION
Gefäßantwort war unabhängig von NO und Prostazyklin. Dies läßt vermuten, dass die
Aktivierung von Kaliumkanälen und eine Hyperpolarisation beteiligt ist. Allerdings waren
Dilatationen nach globaler Stimulation mit Adenosin unabhängig von der Aktivierung von KCaKanälen, wie in 4.2.1 und 4.2.2 dargestellt. Da vor allem die lokale Stimulation mit Adenosin
mit einem Anstieg der endothelialen Ca2+-Konzentration assoziiert ist (206), wurde dennoch
der Effekt der pharmakologischen Blockade von IKCa- und BKCa-Kanälen mit Charybdotoxin
untersucht, hatte aber weder einen Effekt auf die lokale Adenosin induzierte Dilatation noch
auf deren Fortleitung. Die pharmakologische Blockade war effektiv, denn Charybdotoxin
führte an der lokalen sowie den entfernten Positionen zu einer fast vollständigen Aufhebung
der
ACh-Dilatation.
Dies
bestätigt
die
Bedeutung
von
KCa-Kanälen
und
einer
Hyperpolarisation bei ACh-Dilatationen. Eine Aktivierung von KATP-Kanälen durch Adenosin
(205) könnte ebenfalls eine Hyperpolarisation auslösen, die sich entlang der Gefäßwand
ausbreitet. Tatsächlich führte die lokalisierte Aktivierung von KATP-Kanälen mit dem KATPÖffner Cromakalim zur Auslösung einer fortgeleiteten Dilatation. Die Superfusion des KATPBlockers Glibenclamid zeigte weiterhin, dass diese Kanäle essentiell für die Auslösung
Adenosin-induzierter Dilatationen sind. Demgegenüber hatte KATP-Blockade keinen Einfluß
auf Gefäßantworten nach Stimulation mit ACh. Dies zeigt, dass in Abhängigkeit vom
Agonisten unterschiedliche K+-Kanäle beteiligt sind, um eine Hyperpolarisation und Dilatation
an der lokalen Stelle auszulösen. Dennoch wird in beiden Fällen eine koordinierte
Gefäßreaktion
beobachtet
und
dies
verdeutlicht
den
gemeinsamen
Nenner,
die
Membranpotentialänderung, bei sich ausbreitenden Gefäßantworten.
Der Vergleich von fortgeleiteten Adenosin- und ACh-Dilatationen zeigt, dass die
Gefäßantwort nach Adenosin in einer Entfernung von 1100 µm bereits reduziert war,
während sich die Amplitude der Dilatation nach ACh in derselben Entfernung nicht
vermindert hatte. Somit breiten sich Dilatationen nach Adenosin weniger effizient in die
Entfernung aus. Wie in Abschnitt 4.1 gezeigt, breiten sich Dilatationen nach ACh v.a. entlang
des Endothels aus. Möglicherweise steht bei der Ausbreitung von Adenosin-induzierten
Dilatationen die glattmuskuläre Zellschicht als Leitungsweg im Vordergrund und diese
Zellschicht ist weniger gut gekoppelt, wie die Ausbreitung von KCl-induzierten Konstriktionen
zeigt (s. Abschnitt 4.1). Weiterhin könnte die bessere Ausbreitung von ACh-induzierten
Dilatationen auch auf einer spezifischen Eigenschaft des Agonisten beruhen. Emerson und
Mitarbeiter zeigten an isolierten Arterien des Retraktormuskels von Hamstern, dass
Hyperpolarisationen, die durch ACh induziert wurden, sich effizienter ausbreiteten, als dies
durch elektrische Stimulation der Gefäße erreicht werden konnte (207). Die Autoren
postulierten, dass die durch ACh induzierte Erhöhung des endothelialen Calciumspiegel
nicht nur die Aktivierung von KCa-Kanälen induziert, sondern gleichzeitig eine Steigerung der
115
DISKUSSION
Synthese
von
NO
und
Arachidonsäuremetaboliten
stimuliert
und
hierdurch
die
Offenwahrscheinlichkeit von Gap Junctions erhöht wird. Da jedoch die Hemmung der NOund Prostazyklin-Synthese die Ausbreitung von ACh-induzierten Dilatationen in unserer
Präparation nicht beeinträchtigt, scheint die Ausbreitung von ACh Dilatationen über große
Entfernungen in dieser Präparation auf anderen Mechanismen zu beruhen. Dennoch ist die
Beteiligung eines aktiven Mechanismus als Signalverstärker wahrscheinlich.
4.3
Die lokale Stimulation von Gefäßen führt bei einer Reihe von Agonisten, wie auch in dieser
Arbeit gezeigt, nicht nur zu einer lokalen Dilatation, sondern zu einer instantanen
Ausbreitung der Gefäßantwort über eine Strecke von mehreren Millimetern entlang der
Arteriole. Diese Ausbreitung ermöglicht eine Koordination des Gefäßverhaltens innerhalb
des Netzwerks. Die Entfernungen, über die sich diese Dilatationen erstrecken, sind jedoch
größer als durch rein passive elektrotonische Ausbreitung des Signals erklärt werden kann
und impliziert einen aktiven Mechanismus, der das Signal bei seiner Ausbreitung verstärkt
bzw. regeneriert. Hierbei könnten besonders K+-Kanäle eine Rolle spielen, die eine
Hyperpolarisation verstärken. Da die Ausbreitung in Abhängigkeit vom Agonisten (Adenosin,
ACh) unterschiedlich war, sind eventuell auch differente Verstärkungsmechanismen beteiligt.
Die an der Ausbreitung der Dilatation beteiligten Kanäle wurde durch Superfusion
verschiedener Ionenkanalblocker untersucht. Die unselektive Blockade von Na+- und K+Kanälen (BKCa, KV und eventuell KIR) mit dem Lokalanästhetikum Bupivacain (208-211)
zeigte bereits deutliche Unterschiede der Mechanismen, die der Auslösung und Fortleitung
von Adenosin, Bradykinin- und ACh-induzierten Dilatationen zugrunde liegen. Während die
Blockade dieser Kanäle nach Stimulation mit ACh oder Bradykinin zwar zu einer Reduktion
der lokalen Gefäßantwort führte, war die Fortleitung nicht beeinträchtigt. Vermutlich führt vor
allem die Blockade von BKCa zur Abschwächung der lokalen Antwort, da dieser Kanal an der
Auslösung der Dilatation auf ACh und Bradykinin, wie oben dargelegt wurde, beteiligt ist. Im
Gegensatz dazu war die lokale Dilatation nach Adenosin nicht beeinträchtigt, aber die
Fortleitung des Signals vollständig aufgehoben. Somit wird die lokale Aktivierung von KATPKanälen durch Bupivacain nicht gehemmt, jedoch sind die Kaliumkanäle, die eine
Ausbreitung des Signals ermöglichen, sensitiv gegenüber Bupivacain. Offensichtlich werden
durch Bupivacain ebenfalls Kanäle beeinflußt, die basal aktiv sind, denn die Substanz
erhöhte den Gefäßtonus. Dies ist jedoch nicht als unspezifische Ursache für die reduzierte
lokale Antwort nach ACh oder die eingeschränkte Ausbreitung nach Adenosin zu betrachten,
116
DISKUSSION
da umgekehrt die lokale Dilatation nach Adenosin bzw. die Ausbreitung nach ACh nicht
beeinträchtigt war. Weiterhin blockiert Bupivacain auch nicht Gap Junctions, wie die intakte
Ausbreitung der Konstriktion nach lokaler Applikation von KCl aufzeigt. Allerdings wurde die
dilatatorische Komponente der biphasische Gefäßantwort nach Bupivacain nicht mehr
beobachtet. Dies ist am ehesten durch die Blockade der KIR-Kanäle bedingt, die diese
Dilatation induzieren (159).
Die Ausbreitung von Adenosin induzierten Dilatationen könnte allerdings durch nervale
Aktivität vermittelt sein, da Bupivacain nicht nur K+-, sondern auch spannungsabhängige
Na+-Kanäle blockiert. Die Fortleitung von Vasomotorantworten sind in der Literatur aber als
weitgehend unabhängig von der Aktivität perivaskulärer Nerven beschrieben (212) und nur in
wenigen Studien wurden sie als beteiligter Mechanismus identifiziert. So wurde die nervale
Fortleitung von Vasomotorantworten in Arterien von Hasen gezeigt (213). Diese Gefäße
hatten jedoch einen Durchmesser von 1 - 2 mm und waren somit nicht vergleichbar mit der
Mikrozirkulation. Üblicherweise wird die Rolle nervaler Mechanismen durch die Blockade von
Na+-Kanälen mit dem spezifischen Hemmer Tetrodotoxin untersucht (214) und in vielen
Untersuchungen fand sich keinerlei Effekt dieses spezifischen Blockers (109, 116, 121, 215,
216). Kürzlich wurde die Beteiligung von Tetrodotoxin-insensitiven Na+-Kanälen in
sensorischen Nervenfasern bei der Fortleitung von Metacholin-induzierten Dilatationen in der
Mikrozirkulation
des
Hamsters
beschrieben
(117).
Die
Aktivierung
sensorischer
Nervenfasern an der Stimulationsstelle führte zu einer Freisetzung des Transmitters CGRP
(Calcitonin-gene related peptide) aus perivaskulären Nervenendigungen, die dann an
entfernten Positionen zu einer Dilatation führte. Die Differenzierung zwischen einem Effekt
des Bupivacain auf nervale Na+- bzw. vaskuläre K+-Kanäle ist möglich durch die Verwendung
eines Lokalanästhetikums, welches Na+-Kanäle mit einer höheren Selektivität blockiert und
K+-Kanäle erst bei höheren Konzentration beeinflußt, wie es für Mepivacain beschrieben ist
(217). Tatsächlich ließ Mepivacain den Gefäßtonus unverändert und damit bleibt
offensichtlich die Aktivität der K+-Kanäle, die durch Bupivacain noch beeinflußt wurde und zu
einer Konstriktion führte, unverändert. Weiterhin hatte Mepivacain keinen Einfluß auf die
Ausbreitung des Signals nach Stimulation mit ACh oder Adenosin. Somit kann die
Beteiligung perivaskulärer Nervenfasern und spannungsabhängiger Na+-Kanäle am
Fortleitungsprozess ausgeschlossen werden. Dies bedeutet, dass die differentielle
Beeinflußung der sich ausbreitenden Dilatation nach Adenosin und Acetylcholin durch die
Beteiligung unterschiedlicher K+-Kanäle verursacht wird.
Um diese K+-Kanäle eindeutiger zu charakterisieren, wurden unterschiedliche Blocker
eingesetzt. KCa-Kanäle sind bei der Ausbreitung des Signals wohl nicht beteiligt, wie im
117
DISKUSSION
Abschnitt
4.2.1
und
4.2.2
Verstärkungsmechanismus
dargelegt
besonders
wurde.
in
Dagegen
Frage,
da
kommen
diese
KIR-Kanäle
Kanäle
durch
als
eine
Hyperpolarisation aktiviert werden. Bereits 1979 wurde im muskulösen Pharynx von
Nematoden ein Kaliumstrom gemessen, der durch Hyperpolarisation aktiviert wurde und
hierdurch den initialen Stimulus verstärkte (218). Die Beteiligung von KIR-Kanälen bei der
Ausbreitung von Dilatationen nach Adenosin und Bradykinin wurde in Koronararterien von
Schweinen (44) sowie nach Stimulation mit ACh in Arteriolen des Retraktormuskels von
Hamstern (219) und Mesenterialarterien von Ratten gezeigt (220). Die Blockade von KIRKanälen mit Barium führte in dieser Arbeit zu einer Erhöhung des Gefäßtonus und zeigt die
basale
Aktivität
der
Kanäle
und
die
Beteiligung
an
der
Einstellung
des
Ruhemembranpotentials. Dies könnte den Blutdruck erhöhen und ist mit der Beobachtung,
dass Hypertension mit einer verminderten KIR-Kanal-Aktivität assoziiert sein kann (32),
vereinbar. Interessanterweise ist die Fortleitung von Vasomotorantworten in hypertensiven
Tieren bedingt durch den Verlust des Beitrags von KIR-Kanälen gestört (220). Die hier
erhobenen Daten zeigen, dass KIR-Kanäle differentiell beteiligt sind. Die Ausbreitung der
Dilatation nach Bradykinin wurde nicht beeinträchtigt und nach ACh war eine geringe
Reduktion an der entferntesten Position zu beobachten. Im Gegensatz dazu haben KIRKanäle als Verstärkungsmechanismus der fortgeleiteten Dilatation nach Adenosin eine große
Bedeutung. Da das Signal sich nach Adenosin wie oben erläutert wahrscheinlich entlang des
glatten Muskels ausbreitet, könnte der KIR-Kanal vor allem in dieser Zellschicht für eine
Verstärkung sorgen (Abb. 4.1). Die Blockade von KV-Kanälen mit 4-Aminopyridin zeigte ein
umgekehrtes Bild. Nach Applikation dieses Blockers war die Ausbreitung der Dilatation nach
ACh, jedoch nicht nach Adenosin reduziert. Allerdings war der Effekt auch bei Stimulation mit
ACh
nur
begrenzt,
weshalb
noch
weitere,
bisher
nicht
identifizierte
+
Verstärkungsmechanismen zu vermuten sind. Hierbei sind besonders K -Kanäle der K2PFamilie zu nennen, die im vaskulären Gewebe exprimiert werden (48, 49). Unterschiedliche
Subtypen werden durch Bupivacain (210, 221, 222) aber auch Barium (223) inhibiert.
Momentan sind jedoch keine spezifischen Blocker dieser Kanäle bekannt.
Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, warum und wie die Ausbreitung einer gleichartigen
lokal
induzierten
Hyperpolarisation
in
Abhängigkeit
vom
Agonist
unterschiedliche
Verstärkungsmechanismen aktiviert. Die einfachste Erklärung wäre die Beteiligung jeweils
unterschiedlicher Zellschichten, entlang derer sich das Signal ausbreitet: Nach ACh dient die
Endothelzellschicht, nach Adenosin die glattmuskuläre Schicht als Ausbreitungsweg.
Dennoch sollen auch andere Möglichkeiten betrachtet werden. So ist die Ausbreitung
einerseits calciumabhängig andererseits calciumunabhängig möglich. Duling und Mitarbeiter
118
DISKUSSION
lokal
K+
1100 µm
Acetylcholin
KCa
KV KIR ?
Bupivacain
insensitiv
K+
Bradykinin
KCa
NO
Bupivacain
insensitiv
K+
Adenosin
KATP
KIR
Bupivacain
sensitiv
Abb. 4.1: Auslösung und Verstärkung fortgeleiteter Dilatationen
Verschiedene Agonisten induzieren lokale und fortgeleitete Dilatationen durch Aktivierung
unterschiedlicher K+-Kanäle. Acetylcholin (ACh) und Bradykinin aktivieren lokal calciumabhängige
Kaliumkanäle (KCa), Adenosin dagegen KATP-Kanäle. Die Dilatation breitet sich entlang des Gefäßes
aus (dargestellt als Durchmesseränderung über die Zeit). Hierbei sind Verstärkungsmechansimen
beteiligt: ACh ist abhängig von der Aktivierung spannungsabhängiger Kaliumkanäle (KV) und in
geringerem Ausmaß einwärts gleichrichtender Kaliumkanäle (KIR), während Adenosin die Aktivität von
KIR-Kanälen benötigt. Die beteiligten Kanäle sind auch differentiell sensitiv gegenüber Bupivacain.
Bradykinin induziert eventuell eine NO-Welle (159). Möglicherweise sind unterschiedlicher
Fortleitungswege beteiligt (Endothel: ACh; glatter Muskel: Adenosin).
zeigten vor kurzem in Arteriolen der Backentasche von Hamstern, dass Acetylcholininduzierte Dilatationen lediglich lokal mit einem Anstieg des endothelialen Calciumspiegels
assoziiert sind (224). Dagegen waren fortgeleitete Dilatationen nach Adenosin sowohl lokal
als auch in der Entfernung von einem endothelialen Calciumanstieg abhängig (206). Es ist
jedoch unwahrscheinlich, dass die Fortleitung selbst auf der Ausbreitung einer Calciumwelle
beruht. In der Zellkultur breiten sich Calciumwellen nur mit einer Geschwindigkeit von etwa
11 µm / s entlang der Endothellzellen aus (225) und damit ist die Geschwindigkeit deutlich
langsamer als bei einer fortgeleiteten Dilatation (> 1000 µm/s). Dies macht deutlich, dass
nicht nur unterschiedliche K+-Kanäle beteiligt sind, sondern auch Calcium different beteiligt
ist. Ob die funktionelle Kolokalisation von Effektorproteinen in Mikrodomänen, die eine
spezifische Aktivierung unterschiedlicher Fortleitungsmechanismen ermöglichen würde,
hierzu beiträgt, muß zur Zeit noch offen bleiben.
119
DISKUSSION
4.4
Die Ausbreitung von lokal induzierten Gefäßantworten beruht auf Membranpotentialänderungen, die sich entlang der Arteriole ausbreiten. Obwohl die Kopplung innerhalb einer
Zellschicht sehr ausgeprägt ist, wurde in unserer Arbeitsgruppe durch die Messung des
Membranpotentials gezeigt, dass die heterozelluläre myoendotheliale Kopplung in vivo nicht
sehr ausgeprägt oder stark reguliert ist (160). Es ist daher möglich, dass fortgeleitete
Dilatationen nach Adenosin sich im Gegensatz zu ACh überwiegend entlang der
glattmuskulären
Zellschicht
ausbreiten.
Daher
sollten
Potentialänderungen
nach
Adenosinapplikation direkt gemessen werden. Die elektrophysiologisch gemessenen Zellen
konnten nach Farbstoffanfärbung fluoreszenzmikroskopisch anhand ihrer Ausrichtung
identifiziert werden. Endothelzellen sind parallel und glatte Muskelzellen quer zur
Längsachse des Gefäßes angeordnet (59, 108). Die Messung des Ruhemembranpotentials
in den beiden Zelltypen in dieser Arbeit bestätigte das negativere Membranpotential der
Endothelzellen im Vergleich zu glatten Muskelzellen, wie bereits publiziert (160) und zeigt
erneut eine nur schwach ausgeprägte myoendotheliale Kopplung. Während in vitro in fast
allen Untersuchungen identische Membranpotentiale in Endothel- und glatten Muskelzellen
gefunden wurden (22, 106, 226), zeigen die wenigen Untersuchungen, die in vivo
durchgeführt wurden, dass die myoendotheliale Kopplung nicht vorhanden oder nur schwach
ausgeprägt ist (63, 159, 160) . Es ist noch ungeklärt, ob dies durch die Untersuchung
unterschiedlich großer Gefäße oder durch differente Regulationsmechanismen in vivo und in
vitro bedingt ist.
Beide Agonisten, ACh und Adenosin induzierten in der vorgelegten Arbeit eine
Hyperpolarisation in glatten Muskelzellen, deren Amplitude mit steigender Stimulationsdauer
zunahm. Im Gegensatz dazu führte Adenosin nicht zu einer Hyperpolarisation der
Endothelzellen, während ACh auch die Endothelzellen hyperpolarisierte. Diese Beobachtung
ist mit der oben formulierten Hypothese, dass Adenosin ein sich entlang der glatten
Muskelzellschicht ausbreitendes Signal auslöst, vereinbar. Allerdings muß einschränkend
bemerkt werden, dass die Anzahl der Beobachtungen bisher nur gering ist. Insbesondere die
Messung des Membranpotentials an entfernten Positionen ist notwendig, um diese Frage
abschließend zu beantworten.
120
DISKUSSION
4.5
Das Endothel reguliert den Kontraktionszustand glatter Muskelzellen durch die Freisetzung
verschiedener vasoaktiver Substanzen. Die Vasodilatation wird durch NO, Prostazyklin und
EDHF induziert, wobei der Beitrag der einzelnen Mediatoren in Abhängigkeit vom Gewebe
und vor allem von der Gefäßgröße variiert. Die Freisetzung der Autakoide kann durch
Agonisten wie Acetylcholin induziert werden, welches daher oft zur Untersuchung der
endothelialen Funktion verwendet wird. Eine endotheliale 'Dysfunktion' wird bereits im
Frühstadium
der
Atherosklerose
beobachtet
und
tritt
interessanterweise
auch
in
morphologisch unveränderten Gefäßabschnitten auf. In Mausmodellen der Atherosklerose
und Hypercholesterinämie war die endothelabhängige NO-mediierte Dilatationen in großen
Arterien wie Aorta (128-131), A. carotis (132, 133) und Mesenterialarterien (134)
abgeschwächt. Da die Dilatation in großen Gefäßen überwiegend durch NO, in der
Mikrozirkulation aber durch EDHF mediiert ist (186, 227), können diese Ergebnisse nicht
unmittelbar auf die Mikrozirkulation übertragen werden. Obwohl in der Mikrozirkulation bei
Hypercholsterinämie keine morphologischen Veränderungen beobachtet werden, beeinflußt
oxidiertes LDL dennoch die Kontraktilität glatter Muskelzellen in kleinen Arterien (228). Daher
wurde der Effekt von Hypercholesterinämie auf endothelabhängige Dilatationen in
Widerstandsgefäßen untersucht.
In zwei Modellen der Hypercholesterinämie in der Maus (LDL-Rezeptor- und ApoE-defiziente
Tiere) war die endothelabhängige Dilatation nur wenig beeinträchtigt und die maximale
Dilatation intakt. Auch die weitere Erhöhung der Plasmacholesterinspiegel auf das 10-fache
der Spiegel im Wildtyp hatte keine zusätzliche Wirkung. Lediglich in ApoE-defizienten Tieren
war eine Verschiebung der Konzentrationswirkungskurve zu 3 bis 4-fach höheren Werten zu
beobachten. Eine solche geringe Verschiebung konnte im Wildtyp durch Hemmung der NOSynthase reproduziert werden, während dies in ApoE-defizienten Tieren zu keiner weiteren
Verschiebung führte. Hieraus läßt sich folgern, dass in hypercholesterinämischen Tieren eine
verminderte NO-Verfügbarkeit ursächlich ist, denn die Effektivität von NO, eine Dilatation
auzulösen, war nicht beeinträchtigt. Die verminderte Verfügbarkeit von NO ist vermutlich
auch
die
Ursache
des
erhöhten
Gefäßtonus
in
den
großen
Arteriolen
der
hypercholesterinämischen Mäuse. Der Mangel an NO könnte auf einer vermehrter
Inaktivierung durch Superoxidradikale und oxidierte Lipoproteine (229, 230) oder auf einer
verminderter Verfügbarkeit des Substrats der NO-Synthase L-Arginin beruhen (231, 232). Im
Gegensatz dazu, war die EDHF-vermittelte Dilatation, die in der Mikrozirkulation von
besonderer Bedeutung ist, durch Hypercholesterinämie nicht beeinträchtigt. Dies weist
daraufhin, dass nicht das Endothel selbst durch die Hypercholesterinämie geschädigt wird,
DISKUSSION
121
sondern dass Mechanismen in Gang gesetzt werden, die spezifisch mit dem NO-Signalweg
interagieren. Ähnlich wurde eine Reduktion der endothelialen Funktion in Koronargefäßen
hypercholesterinämischer Mäuse auf eine selektive Abschwächung der NO-vermittelten
Antwort zurückgeführt (233). Die Beeinträchtigung des durch NO-mediierten Anteils ist
jedoch im Vergleich zur intakten EDHF-Dilatation von untergeordneter Bedeutung, so dass
die Gesamtdilatation in den Arteriolen der hypercholesterinämischen Tiere weitgehend
unbeeinträchtigt war.
Neben der Regulation des Gefäßtonus durch Freisetzung von vasoaktiven Substanzen
ermöglicht das Endothel als Leitungsweg eine Koordination des Gefäßverhaltens, wie in
Kapitel 4.1 dargestellt. Diese wichtige endotheliale Funktion ist unter bestimmten
pathophysiologischen Bedingungen beeinträchtigt. So ist die Ausbreitung der Dilatation nach
ACh in chronisch hypertensiven Tieren in vivo (234) und in vitro (220, 235) beeinträchtigt,
möglicherweise bedingt durch eine veränderte Expression von Connexinen (166) oder K+Kanälen (220). Die Hypercholesterinämie führt ebenfalls zu einer Modifikation der
Connexinexpression in großen Gefäßen. In der Aorta war die Expression von Cx40 und
Cx37 nicht nur in atherosklerotischen Plaques (140), sondern interessanterweise auch in
morphologisch normal erscheinenden Arealen modifiziert bzw. reduziert (139). Solche
Umverteilungen könnten die Leitfähigkeit der Endothelzellschicht einschränken. Die lokale
Stimulation mit ACh führte jedoch auch in hypercholesterinämischen Mäusen zu einer
fortgeleiteten Dilatation, deren Amplitude sich bis in eine Entfernung von 1100 µm nicht
verringerte. Somit war die Amplitude und Dauer der Dilatation entlang des Gefäßes in ApoEund LDL-R-defizienten Tieren nicht von den im Wildtyp beobachteten Antworten
verschieden. Auch die weitere Erhöhung der Plasmacholesterinspiegel durch eine fett- und
cholesterinreiche Diät über mehrere Monate hatte keine Reduktion der Ausbreitung der AChinduzierten Dilatationen zur Folge. Mittels Immunhistochemie konnte in diesen Tieren Cx40
im Endothel nachgewiesen werden, allerdings war eine exakte Quantifizierung in den
Arteriolen mit dieser immunhistochemischen Nachweismethode nicht möglich. Auch eine
semiquantitative Bestimmung der Expression von Cx40 mittels Westernblot war wegen der
geringen Proteinmenge, die sich aus diesen kleinen Arteriolen isolieren läßt, nicht erfolgreich
(Daten nicht gezeigt). Somit bleibt offen, ob die Connexinexpression in den Arteriolen
tatsächlich alteriert war. Dennoch zeigen die Befunde, dass die Zellkopplung über Gap
Junctions funktionell intakt ist und durch eine ausgeprägte Hypercholesterinämie weder die
Fortleitung von lokal ausgelösten Dilatationen entlang der Arteriolen oder die hierbei
beteiligten Verstärkungsmechanismen (s. Kapitel 4.3) noch die Freisetzung und Wirkung von
EDHF, dessen Freisetzung die Antwort initiiert, beeinträchtigt wird.
122
DISKUSSION
4.6
Die funktionelle Untersuchung der Mechanismen, die bei lokalen und fortgeleiteten
Dilatationen beteiligt sind, erfordert die gezielte Ausschaltung von Proteinen wie
Ionenkanälen oder Rezeptoren. Es stehen jedoch nicht für alle Zielproteine spezifische
Blocker zur Verfügung, wie beispielsweise für Kaliumkanäle der K2P-Familie. Andere Kanäle
können nur mit relativ unspezifischen Blockern ausgeschaltet werden (z.B. KIR-Kanal mit
Barium). Die spezifische Ausschaltung von Proteinen am Zielort würde das Spektrum der
Möglichkeiten erweitern und wäre für die Untersuchung beteiligter Mechanismen von großer
Bedeutung. Die Magnetofektion erschien als Methode geeignet, da hierbei Proteine gezielt
ausgeschaltet werden können und sich die Methode in vitro, vor allem bei der Transfektion
schwer transfizierbarer Zelllinien wie Primärkulturen ausgezeichnet hatte (143, 236, 237).
Zunächst wurde die Src homology domain 2 (SH2)-Tyrosinphosphatase-1 (SHP-1) als
Zielprotein untersucht. Diese Tyrosinphosphatase ist in menschlichen Endothelzellen der
Nabelschnur ein wichtiger Regulator der NADPH-Oxidase abhängigen Superoxidproduktion
und reduzierte in Endothelzellen sowohl die basale als auch die stimulierte Superoxidbildung
(145). Eine Ausschaltung von SHP-1 sollte daher zur vermehrten Bildung reaktiven
Sauerstoffspezies führen und so vermehrt NO inaktivieren. Die funktionelle Untersuchung
der
mit
der
Antisense-Sequenz
behandelten
Tieren
zeigte
jedoch,
dass
die
konzentrationsabhängige Dilatation, die durch exogen appliziertes NO induziert wurde, nicht
wie erwartet abgeschwächt war. Auch die Dilatation nach ACh war im wesentlichen
unverändert, was eine intakte Endothelfunktion aufzeigt. Somit ließ sich hier keine
erfolgreiche Transfektion vaskulärer Zellen nachweisen.
Um ein einfach zu untersuchendes Protein auszuschalten, wurde für die weitere Etablierung
des Verfahrens der muskarinische ACh-Rezeptor (M3), der die Effekte des ACh im Endothel
vermittelt, als Target ausgewählt. In Keratinozyten führte das verwendete Gemisch aus
Antisenseoligonukleotiden zu einer Reduktion des M3-Rezeptors um 80% (146). Drei Tage
nach Transfektion war jedoch in diesen Tieren die Gefäßantwort weder nach Stimulation mit
ACh, SNP noch nach Adenosin abgeschwächt. Da die Halbwertszeit des Rezeptors sich in
der Mikrozirkulation in vivo von der Zellkultur unterscheiden könnte, wurde die vaskuläre
Funktion auch zu früheren Zeitpunkten untersucht, ohne jedoch deutliche Hemmeffekte zu
beobachten. Die Applikation mit fluoreszenzmarkierten Antisenseoligonukleotiden unter
visueller Kontrolle mit einem Fluoreszenzmikroskop zeigte eine unzureichende Anreicherung
der Oligonukleotide am Zielort in der Arteriole. Das Magnetfeld war offensichtlich nicht
ausreichend, um die Partikel zurückzuhalten, denn die fluoreszierender Partikel zirkulierten
DISKUSSION
123
überwiegend mit dem Blutstrom. Auch die manuelle Kompression der Aorta während der
Applikation der Oligonukleotide blieb uneffektiv. Obwohl in vorhergehenden Versuchen
fluoreszenzmarkierte Oligonukleotiden nach 48h im Gefäß zu lokalisieren waren (143), ist die
transfizierte Menge nicht ausreichend, um eine funktionell relevante Reduktion des
Zielproteins zu erreichen. Eine komplette Ausschaltung von Proteinen ist auch in der
Zellkultur nicht möglich und es ist anzunehmen, das die Transfektionseffiziens in vivo
deutlich geringer ist. Daher läßt sich nicht entscheiden, ob die Ausschaltung eines
Zielproteins nicht gelang oder dieses Protein funktionell irrelevant ist. Die Methode muß
daher für die Transfektion in vivo, um die funktionelle Beteiligung bestimmter Proteine zu
untersuchen als ungeeignet eingestuft werden.
ZUSAMMENFASSUNG
5
124
Zusammenfassung
Die Organdurchblutung ist ein dynamischer Vorgang, der kontinuierlich dem Sauerstoff- und
Nährstoffbedarf der Gewebe angepaßt werden muss. Diese lokale Regulation beinhaltet die
Freisetzung gefäßwirksamer metabolischer Substanzen, die endotheliale Bildung von
Autakoiden (NO, PGI2, EDHF) und eine aufsteigende Dilatation, um auch zuführende Gefäße
zu erweitern und eine maximale Perfusion zu erreichen. Diese koordinierte Gefäßantwort hat
eine Schlüsselrolle bei der Durchblutungsregulation des Skelettmuskels und wird ausgelöst
durch Membranpotentialänderungen, die sich entlang des Gefäßes ausbreiten, da vaskuläre
Zellen über von Connexinen gebildete Gap Junctions gekoppelt sind. Experimentell kann
eine solche fortgeleitete Antwort durch eine lokale Stimulation der Arteriole initiiert werde,
wobei eine Depolarisation zur Konstriktion und eine Hyperpolarisation zur Dilatation führt. In
dieser Arbeit wurden die Mechanismen, die fortgeleiteten Gefäßantworten ausgelöst durch
lokale Applikation der endogenen Substanzen Acetylcholin (ACh), Adenosin und Bradykinin
zugrunde liegen, unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen untersucht.
Die Untersuchungen wurden mittels intravitaler Beobachtung von Arteriolen ergänzt durch
Membranpotentialmessung und Immunhistochemie im Skeletmuskel der Maus durchgeführt.
Die endothelabhängige Dilatation ist in der Mikrozirkulation vor allem durch einen
endothelabhängigen hyperpolarisierenden Faktor (EDHF) vermittelt. Die ACh-induzierte
Dilatation war in Mäusen mit einer Deletion des calciumabhängigen Kaliumkanals (KCa)
mittlerer Leitfähigkeit (IKCa) selektiv reduziert. Die verbleibende Antwort war nach
pharmakologischer Blockade der KCa kleiner Leitfähigkeit (SKCa) aufgehoben. Da IKCa und
SKCa endothelial exprimiert werden, ist die EDHF Dilatation somit von der Aktivität dieser
Kanäle und einer endothelialen Hyperpolarisation abhängig. Der Verlust des IKCa kann nicht
durch die Aktivität des SKCa kompensiert werden, was auf eine differente Funktion dieser
Kanäle deutet. Der vor allem im glatten Muskel exprimierte KCa großer Leitfähigkeit (BKCa) ist
ebenfalls notwendig, denn die pharmakologische Blockade hebt die ACh-Dilatation selektiv
auf. Die intakte Dilatation in Mäusen mit einer Deletion des BKCa zeigt aber, dass spezifische
Unterschiede zwischen Mausstämmen bestehen, was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse in
verschiedenen Laboren von einer einheitlichen Rückkreuzung transgener Tiere abhängig
macht. Die Koordination entlang des Gefäßes wurde durch lokalisierte Stimulation untersucht
und zeigte, dass lokal ausgelöste Dilatationen sich rasch entlang der Arteriole ausbreiten.
Die zellspezifische Deletion von Connexin40 (Cx40), welches im Endothel der Arteriolen
nachgewiesen wurde, vermindert die Ausbreitung von ACh-induzierten Dilatationen ohne die
Ausbreitung von Konstriktionen zu verändern. Als Auslöser der fortgeleiteten Antwort nach
ACh wurde die lokale Aktivierung der KCa-Kanäle identifiziert und selektive, lokalisierte
Aktivierung von IKCa kann den Fortleitungsmechanismus auslösen. Ebenso konnten
125
ZUSAMMENFASSUNG
fortgeleitete Dilatationen durch Adenosin ausgelöst werden, die im Gegensatz zu ACh
unabhängig von der Aktivierung von KCa waren und auschließlich auf der Öffnung von KATPKanälen
beruhten.
Obwohl
die
lokale
Antwort
abhängig
vom
Agonisten
durch
unterschiedliche K+-Kanäle hervorgerufen wurde, bewirkte sowohl ACh als auch Adenosin
eine Hyperpolarisation des glatten Muskels, wie durch Membranpotentialmessung gezeigt
wurde.
Während
ACh
auch
das
Endothel
hyperpolarisiert,
ist
Adenosin
hierzu
möglicherweise nicht in der Lage. Die Mechanismen, die der Ausbreitung zugrunde liegen,
zeigten weitere Unterschiede zwischen diesen Agonisten. Während die Amplitude der
Dilatation nach Adenosin bis in eine Entfernung von 1100 µm abnahm, war dies bei ACh
nicht der Fall. Lediglich die Fortleitung nach Adenosin war sensitiv gegenüber dem
unspezifischen Kanalblocker Bupivacain. Spezifischere Blocker zeigten, dass an der
Fortleitung beteiligte Verstärkungsmechanismen bei Adenosin den einwärts gleichrichten K+Kanal (KIR) und bei ACh spannungsabhängige K+-Kanäle (KV) beinhalten. Diese Ergebnisse
deuten darauf hin, dass die Ausbreitung des Signals entlang unterschiedlicher Leitungswege
stattfindet. Adenosin verwendet vermutlich die glattmuskuläre Zellschicht und ACh das
Endothel, was vereinbar mit den Ergebnissen der endothelzellspezifischen Deletion von
Cx40 ist. Die Untersuchung der endothelialen Funktion in zwei Mausmodellen der
Atherosklerose (ApoE- und LDL-R-defiziente Maus) zeigte, dass in der Mikrozirkulation eine
Hypercholesterinämie die endothelabhängige ACh-Dilatation nicht beeinträchtigt. Diese
intakte
Endothelfunktion
wird
verständlich
durch
die
Beobachtung,
dass
in
der
Mikrozirkulation das Endothel vor allem EDHF und nicht, wie in Leitungsgefäßen, NO
freisetzt. Der marginale NO-Anteil war in der Mikrozirkulation ebenfalls beeinträchtigt.
Weiterhin war die Auslösung und die Fortleitung von ACh-Dilatation komplett intakt und
damit die Zellkopplung und die Koordination des Gefäßverhaltens trotz drastischer
Hypercholesterinämie unbeeinträchtigt.
Die vorgelegte Arbeit stellt die eminente Bedeutung von Membranpotentialänderungen, die
endothelabhängig durch einen hyperpolarisierenden Faktor ausgelöst werden, heraus. In
Abhängigkeit vom Stimulus und der physiologischen Funktion sind eine Reihe verschiedener
K+-Kanäle beteiligt, deren Aktivität im Konzert eine Koordination des Gefäßverhaltens
ermöglichen. Hierbei breiten sich lokal ausgelöste Membranpotentialänderungen (KATP, KCa
im besonderen IKCa) entlang der über Connxine und Gap Junctions gekoppelten Zellen unter
Zuhilfenahme spezifischer Verstärkungsmechanismen (KIR, KV) über große Strecken entlang
des Endothels (ACh) oder der glatten Muskulatur (Adenosin) aus und erlauben aufsteigende
Gefäßantworten, die unbeeinträchtigt von einer Hypercholesterinämie eine maximale
Perfusionssteigerung erst ermöglichen.
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140
ANHANG
7
7.1
Anhang
Verwendete Substanzen
Substanz
Hersteller
4-Aminopyridin
Sigma, Deisenhofen
8-pc-cGMP
BioLog, Bremen
Acetylcholin
Sigma, Deisenhofen
Adenosin
Fluka, Seelze
Agarose
Invitrogen, Karlsruhe
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit (Polyclonal)
Molecular Probes
Atipamezol (Antisedan)
Pfizer, Karlsruhe
BaCl2
Sigma, Deisenhofen
Blocking-Solution: CSA-Kit K1500;
Dakocytomation, Carpenteria, CA, USA
Borsäure
Fluka, Seelze
Bovines Serumalbumin
Sigma, Deisenhofen
Bradykinin
Bachem, Weil am Rhein
Bromphenolblau
Serva, Heidelberg
Bupivacain
Sigma, Deisenhofen
CaCl2
Merck Darmstadt
Carboxyfluorescein
MOBiTec, Göttingen
Catalyzed Signal Amplifikation, CSA
Charybdotoxin
Cholesterol Kit
Abbott clinical Chemistry, Abbott park IL, USA
Cromakalim
Tocris Bioscienc, Bristol, UK
CSA Rabbit Link
DABCO
Sigma, Deisenhofen
DCEBIO
Tocris Bioscienc, Bristol, UK
DEA NONOate
Alexis Biochemicals, Lausen, CH
DMSO
Merck, Darmstadt
DNA Ladder
Invitrogen, Karlsruhe
dNTP
New England Biolabs, Frankfurt
Double Stain Block
EDTA
Amersham Biosciences, Braunschweig
Ethanol 96%
Fluka, Seelze
Ethidiumbromid
Carl Roth, Karlsruhe
Fast Red
Abcam, Cambridge, UK
Fentanyl
Curamed, Karlsruhe
141
ANHANG
Flumazenil
Fluka, Seelze
Formaldehyd
Roche, Grenzbach-Whyhlen
Glibenclamid
Alexis Biochemicals, Lausen, CH
Glycerin
Santa Cruz, Heidelberg
Heparin, Liquimin N 25000
Hoechst (Bisbenzimid Fluorochrom)
Molecular Probes, Leiden, NL
Iberiotoxin
Indomethacin
Dumex, Bad Vibel
Isopropanol
Merck, Darmstadt
KCl
Merck, Darmstadt
KH2PO4
Merck, Darmstadt
L-Nitroarginin
Sigma, Deisenhofen
Medetomidin
Pfizer, Karlsruhe
Mepivacain
Sigma, Deisenhofen
MgSO4 x 7H20
Merck, Darmstadt
Midazolam
MOPS
Roth Karlsruhe
Mowiol
Calbiochem, Schwalbach
NaCl
Fluka, Seelze
NaHCO3
Merck, Darmstadt
Naloxon
Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg
Natriumcitrat
Sigma, Deisenhofen
Ouabain
Sigma, Deisenhofen
Pentobarbital (Narcoren)
Merial, Hallbergmoos
PolyMAG
Chemicell, Berlin
Proteinase K
Sigma, Deisenhofen
Rabbit Anti-Mouse Connexin40 (Polyclonal)
Chemicon Int. Eastleigh, UK
SDS
Porphyrin Systems, Lübeck
SNP (Sodium Nitroprussid)
Sigma, Deisenhofen
Sylgard
WPI, Berlin
Taq Polymerase
MBI Fermentas, St Leon Rot
Tris HCl
Roth, Karlsruhe
Triton X 100
Merck, Darmstadt
UCL 1684
Tocris Bioscience, Ellisville, USA
vWF (H300) Rabbit (Polyclonal)
Santa Cruz, Heidelberg
Wasser (entionisiert) RS 90-4/US
SG Reinstwassersysteme, Hamburg
Wasserstoffperoxid
Merck, Darmstadt
Xylol
Merck, Darmstadt
Gasgemisch 5%CO2, 95% N2
Linde, München
142
ANHANG
7.2
Agarosegel
1% Agarose
0.004% Ethidiumbromid
TBE Puffer
Blockierlösung
2%
BSA
0.2% Triton-X 100
PBS
Superfusionslösung
(Krebs-Puffer)
138
5
mM Na+
mM K+
2.5 mM Ca2+
1.2 mM Mg2+
20
mM HCO3-
1.2 mM SO421.2 mM H2PO4127.2 mM ClAqua bidest
die Lösung wurde zur Einstellung des pH auf 7.4
mit 5% CO2, 95% N2 begast
Laird Puffer
100 mM Tris –HCl (pH 8.5)
0.2%
SDS
5 mM
EDTA
200 mM NaCl
Aqua bidest
Loading Dye
30% Glycerin
0.25% Bromphenolblau
Aqua bidest
143
ANHANG
PBS (phosphate buffered saline)
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
8.1 mM Na2HPO4 x H2O
1.5 mM KH2PO4
Aqua bidest
Ringer
147 mM NaCl
4 mM KCl
22 mM CaCl2 x 2H20
TBE Puffer
89 mM
Tris
89 mM
Borsäure
2 mM
EDTA
Aqua bidest
TE Puffer
1 M
Tris (pH 8)
0.25 M EDTA
Aqua bidest
Waschlösung
1% Triton-X 100
PBS
7.3
Weitere Materialien
Chirurgisches Nahtmaterial 6/0 (Prolene®)
Firma Ethicon, Hamburg
Polyethylenkatheter PE 10 (venöser Katheter)
Schubert, München
(Di: 0.28mm; Da: 0.61mm)
Polyethylenkatheter PE 50 (Tubus)
Schubert, München
(Di: 0.5mm; Da: 1.00mm)
Magnet Neodelta
IBS Magnet Berlin
Mikroloader
Eppendorf, Hamburg
144
ANHANG
7.4
[Ca2+]i
intrazelluläre Calciumkonzentration
4-AP
4-amino - Pyridin, KV Blocker
8-pCPT-cGMP
8- (4- Chlorophenylthio)guanosine- 3', 5'- cyclic monophosphate,
zellpermeables cGMP Analogon
ACh
Acetylcholin
Ado
Adenosin
AgCl
Silberchlorid
BaCl2
KIR Blocker
BK-/-
Maus defizient für BKCa
BK+/+
Wildtyp Maus (SV129/C57BL/6 Hintergrund)
BKCa
KCa mit großer Leitfähigkeit
cAMP
zyklisches Adenosinmonophosphat
cGMP
zyklisches Guanosinmonophosphat
Chtx
Charybdotoxin, Blocker der IKCa- und BKCa-Kanäle
COX
Cyclooxygenase
Cromakalim
KATP Öffner
Cx
Connexin
Cx40-/-
Maus defizient für Cx40
Cx40+/+
Wildtyp Maus (C57BL/6)
CYP450
Cytochrom-P450-Epoxygenase
DCEBIO
IKCa-Öffner
DEA-NONOate
2-(N,N-diethylamino)-diazenolat-2-oxid, nicht-enzymatischer NO Donor
EC
Endothelzelle
EDH
Endothelium-Derived Hyperpolarization
EDHF
Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor
EET
Epoxyeicosatriensäure
eNOS
endotheliale NO-Synthase
eNOS-/-
Mäuse, defizient für die endotheliale NO-Synthase
Glibenclamid
KATP Blocker
Ibtx
Iberiotoxin, BKCa Blocker
IK-/-
Maus defizient für IKCa
IK+/+
Wildtyp Maus (129ola/C57BL/6 Hintergrund)
IKCa
KCa mit mittlerer Leitfähigkeit
Indo
Indomethacin, Cyclooxygenasehemmer
145
ANHANG
IP3
Inositol-1,4,5-trisphosphat
KATP
ATP-abhängiger Kalium-Kanal
KCa
Calcium-abhängiger Kalium-Kanal
KIR
einwärts gleichrichtender Kalium-Kanal
KV
spannungsabhängiger Kalium-Kanal
LNA
Nω-nitro-L-Arginin, NO-Synthasehemmer
n
Anzahl der Beobachtungen
NOS
endotheliale NO-Synthase
PGI2
Prostazyklin
PKG
cGMP-abhängige Proteinkinase
PLC
Phospholipase C
sGC
lösliche Guanylatzyklase
SKCa
KCa mit geringer Leitfähigkeit
SMC
glatte Gefäßmuskelzelle (smooth muscle cell)
SNP
Nitroprussid-Natrium (sodium nitruprusside)
UCL1684
selektiver SKCa Blocker
ANHANG
146
Publikationen
ORIGINALARBEITEN
1.
Wölfle SE, de Wit C. Intact endothelium-dependent dilation and conducted responses in
resistance vessels of hypercholesterolemic mice in vivo. J.Vasc.Res., 42: 475-482, 2005
2.
Siegl D, Koeppen M, Wölfle SE, Pohl U, de Wit C. Myoendothelial coupling is not prominent in
arterioles within the mouse cremaster microcirculation in vivo. Circ.Res., 97: 781-788, 2005
3.
Si H, Heyken WT, Wölfle SE, Tysiac M, Schubert R, Grgic I, Vilianovich L, Giebing G, Maier T,
Gross V, Bader M, de Wit C, Hoyer J, Köhler R. Impaired endothelium-derived hyperpolarizing
factor-mediated dilations and increased blood pressure in mice deficient of the intermediateconductance Ca2+-activated K+ channel. Circ Res (in press)
4.
Wölfle SE, de Wit C. Conducted responses initiated by acetylcholine and adenosine are
amplified by different K+-channels. (in Vorbereitung)
ÜBERSICHTSARBEITEN
5.
Hoepfl B, Wölfle S, Boettcher M, de Wit C. Conducted vasodilation. In: Proceedings of the 23th
European Conference on Microcirculation. Eds.: Martins e Silva J, Saldanha C, Oliveira V, Pries
A, Shore A. Monduzzi Editore, Bologna, Italy. pp. 15-20, 2004
6.
de Wit C, Hoepfl B, Wölfle SE. Endothelial mediators and communication through vascular gap
junctions. Biol. Chem, 387: 3–9, 2006
7.
de Wit C, Wölfle SE, Hoepfl B. Connexin-dependent communication within the vascular wall:
Contribution to the control of arteriolar diameter. Adv. Cardiol. 42: 268-283, 2006
8.
de Wit C, Wölfle SE. EDHF and gap junctions: Important regulators of vascular tone within the
microcirculation. Curr Pharm Biotechnol (in press)
ANHANG
147
KONGRESSBEITRÄGE MIT ABSTRACTPUBLIKATIONEN
1.
Wölfle SE, de Wit C. ACh-induced dilator and conducted responses remain largely intact in the
microcirculation of hyperlipidemic mice J.Vasc.Res. 41: 460, 2004
2.
Wölfle SE, de Wit C. Intact endothelial function in the microcirculation of hypercholesterolemic
mice in vivo. Pflügers Arch. 449 (Suppl 1): S26, 2005
3.
Wölfle SE, de Wit C. Hypercholesterolemia does not impair EDHF-mediated and conducted
dilations in arterioles in vivo. FASEB J. 19 (Suppl): A724, 2005
4.
Wölfle SE, Sausbier M, Ruth P, de Wit C. Striking differences between mouse strains: Divergent
role for BKCa channel in ACh dilations. J.Vasc.Res. 43: 31, 2006
5.
Wölfle SE, de Wit C. Different mechanisms contribute to the conduction of locally induced
acetylcholine and adenosine dilations. Acta Physiol. Scand. 168 (Suppl 1):102,2006
6.
Wölfle SE, de Wit C. Different mechanisms induce remote responses:acetylcholine versus
adenosine. FASEB J. 20 (4): A276, 2006
KONGRESSBEITRÄGE OHNE ABSTRACTPUBLIKATION
1.
Wölfle SE, de Wit C. Endotheliale Funktion in der Mikrozirkulation atherosklerotischer Mäuse. IX.
Treffen der Ostseephysiologen, Greifswald, 2004
2.
Wölfle SE, de Wit C. Different mechanisms contribute to conducted vasodilation induced by
varying agonists. Rostock workshop on smooth muscle function, 2005
3.
Wölfle SE, de Wit C. Die Koordination des arteriolären Verhaltens erfolgt durch verschiedene
Mechanismen. XI. Treffen der Ostseephysiologen, Lübeck, 2006
148
ANHANG
Lebenslauf
ANGABEN ZUR PERSON
Stephanie E Wölfle
geboren am 09.01.1974 in München
Staatsangehörigkeit: deutsch
STUDIUM
1995 – 2002
Studium der Pharmazie an der Ruprecht-Karls-Universität in
Heidelberg
2002
Approbation als Apothekerin
2003
Beginn der Doktorarbeit am Institut für Physiologie an der
Universität zu Lübeck
PREISE
2006
Benjamin Zweifach Student Award der Microcirculatory Society
DRITTMITTEL
2006
DFG Zuschuss zu einer Kongressreise (1200 EUR)
ANHANG
149
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Dr. Cor de Wit für die Überlassung des faszinierenden Themas
und die großartige Betreuung in experimentellen und theoretischen Belangen sowie die
extensive Fortbildung am PC und insbesondere auch für die Einführung in die Welt der
Shortcuts. Seine Unterstützung meiner Forschung in den letzten Jahren hat den Grundstein
für das Gelingen dieser Arbeit gelegt. Die Möglichkeit der wissenschaftlichen Weiterbildung
bei Vorträgen und nationalen und internationalen Kongressen hat entscheidend zu meiner
beruflichen Weiterentwicklung beigetragen.
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Jelkmann danke ich für die freundliche Aufnahme im Institut, die
mir vom ersten Tag an die Herzlichkeit und gute Zusammenarbeit an diesem Institut
vermittelt hat. Des weiteren möchte ich mich für die Möglichkeit der Teilnahme an
Kongressen und das zur Verfügung gestellte Material sowie für seine kontinuierliche
Unterstützung bedanken.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich für die Finanzierung meines Projektes
und der Gelegenheit Teile dieser Arbeit auf einem internationalen Kongress zu präsentieren.
Allen Mitarbeitern des Institutes danke ich für die gute Stimmung, die stete Ansprechbarkeit
und die selbstverständliche Hilfe bei großen und kleinen Problemen.
Insbesondere danke ich Rita Meuer für Hilfestellung in unterschiedlichsten Belangen und die
kompetente und engagierte Unterstützung im Labor und Dr. Reinhard Depping für unzählige
konstruktive Diskussionen und seinen Rat in molekularbiologischen Fragestellungen.
Susann Schindler und Inga Jensen danke ich für die Einführung in die Welt des WesternBlot, die stete Hilfsbereitschaft und die gute Stimmung.
Anika Wagner und Kathrin Döge danke ich für für die vielen Gespräche über die Arbeit und
auch darüber hinaus .
Ferdinand Greitschuss danke ich für die Entwicklung des Auswertungsprogramms und die
hervorragende Unterstützung bei allen 'Computer-Problemen'.
Meiner 'Mitsitzerin' Uschi möchte ich ganz besonders für ihre Geduld, ihre konstruktive Kritik
und ihre Freundschaft danken, die mir sehr viel bedeuten.
Ich bedanke ich mich bei meiner Familie die mich in allen Vorhaben unterstützt hat und
besonders bei meinen Eltern die mir die Promotion ermöglicht haben und immer für mich da
waren.
Mein ganz besonderer Dank gilt Roland, der mir während der letzten Jahre mit Rat und Tat
zur Seite stand und mir alles ermöglichte.

AUFSTEIGENDE DILATATIONEN - Zentrale Hochschulbibliothek

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2. Abend in der Stadt 3. Die Ruine 4. Die Piloten 5. Die Kneipe 6