Lectin activity in leaves from Indigofera suffruticosa

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Lectin activity in leaves from Indigofera suffruticosa
ATIVIDADE LECTÍNICA EM FOLHAS DE
INDIGOFERA SUFFRUTICOSA
Sônia P. Leite1; Ana C. R. Leite2; Maria B. R. Silva2; Patrícia M. G. Paiva2; Edeltrudes E. O. Lima3;
Luana C. B. B. Coelho2; Vera L. M. Lima2.
1
Departamento de Histologia e Embriologia do CCB –UFPE. Av. Prof. Moraes Rego, s/n – Cidade
Universitária – Recife/PE. Fone:(81) 3271.8515. CEP 50670-420.
2
Departamento de Bioquímica – CCB – UFPE. Av. Prof. Moraes Rego, s/n – Cidade Universitária –
Recife/PE. Fone: (81) 3271.8540. CEP 50670-420.* E-mail: [email protected] ou [email protected] ufpe. br
3
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba – João Pessoa - Pb.
Lectin activity in leaves from Indigofera suffruticosa
Lectin activity was detected in aqueous extracts obtained from stems, seeds, and leaves of Indigofera
suffruticosa (Fabaceae). Haemagglutination activity was detected in an ammonium sulphate fraction (F 0-60
%) obtained from leaves. The highest agglutination activity of F 0-60 % was found with glutaraldehydetreated rabbit erythrocytes; human erythrocytes of blood group AB were also agglutinated. I. suffruticosa leaf
lectin (IsuLL) was partially inhibited by glucose and mannose. The lectin was inhibited by ovalbumin, casein
and human colostrum.
Introdução
As lectinas são proteínas ou glicoproteínas de
origem não imunológica, capazes de interagir de
forma reversível com carboidratos através de
pelo menos dois sítios de ligação, aglutinam
células vegetais e/ou animais e precipitam
glicoconjugados (Goldstein et al., 1980). Essas
proteínas são amplamente distribuídas na
natureza sendo encontradas em animais e
vegetais. Nas plantas, as lectinas podem ser
detectadas em tecidos tais como folhas (Koike et
al., 1995), sementes (Kamemura et al., 1996),
cascas (Wititsuwannakul et al., 1998) e raízes
(Yamashita et al., 1992). Lectinas de
leguminosas têm sido intensamente estudadas
(Sharon & Lis, 1990; Paiva & Coelho, 1992,
Coelho & Silva, 2000). A especificidade de uma
lectina pode ser observada através de um ensaio
de inibição da atividade hemaglutinante (AH)
utilizando carboidratos ou glicoconjugados. De
acordo
com
o
monossacarídeo
e/ou
oligossacarídeo que mais efetivamente inibe sua
aglutinação por eritrócitos, as lectinas são
classificadas em grupos de reconhecimento e
especificidade.
Indigofera suffruticosa Mill (Fabaceae), comum
em Regiões Tropicais e Subtropicais, é uma
leguminosa utilizada na adubação verde e
cobertura dos solos. Esta forrageira anual ou
perene é adaptada à Região do Semi-Árido e
Agreste do Estado de Pernambuco. A planta é
considerada como tintória; as raízes e folhas têm
propriedades antiespasmódicas, sedativa e
diurética (Braga, 1985). Estudos farmacológicos
mostraram que extratos de I. suffruticosa
apresentam atividade anticonvulsivante (Alejo et
al., 1996), anti-genotóxica (Badell et al., 1998) e
antiepiléptica (Roig & Mesa, 1974). No estudo
farmacognóstico da droga, Kamal & Mangla
(1993) identificaram, isolaram, e quantificaram
seis rotenóides verificando a bioeficácia desta
planta contra larvas de Anopheles e
Callosobruchus chinensis adultos.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença
de lectina em folhas de I. suffruticosa.
Experimental
Obtenção de extrato de I. suffruticosa
I. suffruticosa foi coletada na fazenda Estivas em
São Caetano, Estado de Pernambuco; a amostra
da planta encontra-se catalogada no Herbário
UFP (nº 32859) da Universidade Federal de
Pernambuco. Os extratos das folhas, caules e
sementes foram efetuados em água destilada para
uma concentração final de 10% (p/v). O processo
de extração ocorreu em temperatura ambiente
por 16 h. O material foi submetido à
centrifugação a 12.100 x g, por 15 min. A
concentração
protéica
e
a
atividade
hemaglutinante foram determinadas nos extratos.
A purificação parcial das proteínas das folhas foi
feita através de fracionamento com sulfato de
amônio e seguiu a metodologia de Green &
Hughes (1955). Cada fração obtida da
precipitação do extrato da folha por sulfato de
amônio, ou seja, o material precipitado (F 0-60
%) e o sobrenadante (S 0-60 %) foram dialisados
em água destilada, tendo em seguida sido
determinada a concentração protéica e a
atividade hemaglutinante.
Atividade
protéica
hemaglutinante
e
quantificação
A suspensão de eritrócitos glutarizados foi
procedida segundo Bing et al. (1967). Para a
determinação da atividade hemaglutinante (AH)
foram utilizados eritrócitos de coelho e de
humano tipo AB tratados com glutaraldeído. AH
foi descrita de acordo com Correia & Coelho
(1995) e foi definida pelo inverso da maior
diluição em que foi observada a aglutinação
total. AH específica (AHE) foi encontrada pela
divisão da AH pela concentração protéica
(mg/ml). Ensaio de inibição da AH foi realizado
com
os
carboidratos
D(+)galactose,
D(+)rafinose,
D(+)sacarose,
D(+)frutose,
D(+)arabinose, D(+)manose e D(+) glicose, bem
como glicoproteínas (ovoalbumina, caseína e
colostro humano). Placas de microtitulação
foram preenchidas com 50 µl da solução dos
carboidratos (200 mM) em NaCl 0,15 M ou
glicoproteínas (1 mg/ml) em NaCl 0,15 M e em
seguida foram adicionados 50 µl da preparação
lectínica (F 0-60 %). Foi procedida a incubação
em temperatura ambiente, por 45 min, ao
término da quais, 50 µl da suspensão de
eritrócitos glutarizados de coelho a 2,5 % (v/v)
em NaCl 0,15 M foram adicionados a cada poço.
As inibições da AH em cada concentração dos
carboidratos e glicoproteínas foram avaliadas
após 45 min.
Resultados e Discussão
Na Tabela 1 estão representados os dados
referentes à concentração protéica e a AHE dos
extratos de folhas, caules e sementes de I.
suffruticosa. A maior AHE foi obtida no extrato
de sementes. Entretanto, as folhas constituíram o
material de escolha desde que são utilizadas na
medicina popular com atividade antimicrobiana.
Tabela 1. Concentração protéica e atividade
hemaglutinante específica de diferentes extratos
de I. suffruticosa.
Extratos
Proteína
(mg/ml)
Folhas
Caules
Sementes
10,7
3,9
8,1
AHE
192
531
8091
AHE, atividade hemaglutinante especifica.
AH, com eritrócitos glutarizados de coelho.
.
Preparações protéicas de folhas foram
principalmente ativas na fração F 0-60 %, com
eritrócitos glutarizados de coelho. F 0-60 % e S
0-60 % apresentaram AH para eritrócitos de
coelho e humanos do tipo AB (Tabela 2).
Tabela 2. Atividade hemaglutinante
preparações de folhas de I. suffruticosa.
de
Preparações de folhas
Eritrócitos
Humano
(AB)
Coelho
F 0-60 %a S 0-60 %b
64 64
2048 8
a - Precipitação de proteínas; b - Sobrenadante.
A purificação parcial de lectinas de folhas de I.
suffruticosa através de precipitação com sulfato
de amônio (F 0-60 %) mostrou AHE de 225
(Tabela 3).
F 0-60 % foi inibida parcialmente por glicose e
manose; ovoalbumina, caseína e colostro humano
também inibiram IsuLL (Tabela 4).
Resultados similares referentes à atividade
hemaglutinante foram reportados por Coelho e
Silva (2000) em folhas de Bauhinia monandra.
Dahot (1999) utilizou o mesmo gênero
Indogofera para isolar e caracterizar 4 frações
protéicas de extrato aquoso de folhas de I.
oblongifolia.
Os eritrócitos quando tratados com glutaraldeido
promovem a estabilidade e aumentam a
sensibilidade das células para a lectina, através
da exposição de grupos reativos (Moreira et al.,
1991; Correia e Coelho, 1995).
Tabela 3. Purificação parcial da lectina de folha
de I. suffruticosa.
Amostra
V P PT AH AHE
(ml) (mg/ml) (mg)
Extratos
400 8,2 3280 64 8
F 0-60%
50 9,1 455 2048 225
V- volume; P- proteínas; PT- proteínas totais.
AH - Atividade Hemaglutinante de eritrócitos de
coelho; AHE – AH específica.
Tabela 4 - Atividade hemaglutinante de F 0-60
% de folhas de I. suffruticosa em presença de
carboidratos e glicoproteínas.
Carboidratos (100 mM)
Glicose
Manose
Galactose
Rafinose
Sacarose
Frutose
Arabinose
AH
512
512
2048
2048
2048
2048
2048
Glicoproteínas (1mg/ml)
Ovoalbumina
Caseína
Humano Colostro
8
2
32
AH - F 0-60% em NaCl 0,15 M (2048).
A similaridade das estruturas sacarídicas
encontradas em diversas glicoproteínas e
receptores de superfície celular permitem que
ligantes específicos de carboidratos como as
lectinas
possam
reconhecer
unidades
monossacarídicas ou semelhantes estruturas
oligossacarídicas em uma proteína e em
superfície celulares (Coelho e Silva, 2000).
A purificação de IsuLL por afinidade está em
desenvolvimento e as preparações contendo a
lectina serão avaliadas para atividade
antimicrobiana.
Conclusões
Extratos de folhas, caules e sementes de I.
suffruticosa possuem atividade lectínica. IsuLL
foi principalmente detectada com eritrócitos de
coelho, sendo inibida por carboidratos e
glicoproteínas.
Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientifico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio
financeiro. Os autores agradecem à Bióloga
Marlene Barbosa do Departamento de Botânica
da UFPE pela identificação e catalogação da
espécie vegetal em estudo.
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