Skript Praktikum Gentech 2014-15_1202

Transcrição

Praktikum zum Modul Gentechnologie
Wintersemester 2014/2015
Lehrstuhl für Genetik
Universität Bayreuth
Version 12. 02. 2015
2
Biochemiker (je 12 Gruppen):
Kurs 1: 02.02.2015 – 13.02.2015
Kurs 2: 23.02.2015 – 06.03.2015
Inhaltsverzeichnis
1. Präparation eines Vektors zum Klonieren von PCR-Produkten (TA-cloning)
S. 4
2. Präparation von DNA des Phagen SPP1
S. 11
3. Präparation eines Molekulargewichts-Standards für die AgarosegelElektrophorese
S. 15
4. Konstruktion einer chromosomalen Bacillus subtilis-Knockout Mutante
S. 17
Anhang: Materialien und Arbeitsanleitungen, Versuche 1-4
S. 23
5. Molekulare Bestimmung des Integrationsortes von Transposons in
Drosophila melanogaster
S. 31
6. Klonierung und Überexpression von EGFP/mRFP1 in E. coli
S. 39
7. Untersuchung von Protein-Protein Wechselwirkungen im Hefe
Two-Hybrid-System
S. 57
Richtlinien für das Anfertigen des Protokolls
S. 63
3
Verzeichnis der Abkürzungen
A578
=
Amp
=
APS
=
BSA
=
cfu
=
EDTA =
EGTA =
EK
=
Em
=
Glc
=
IAA
=
IPTG =
LB
=
moi
=
PEG
=
pfu
=
RT
=
RPM =
SDS
=
TAE
=
TE
=
TEMED =
Tris
=
TY
=
ÜN
=
ÜNK =
U
=
VE
=
w/v
=
X-gal =
optische Dichte bei 578 nm
Ampicillin
Ammoniumperoxodisulfat
bovine serum albumine
colony forming units
Ethylendiaminotetraacetat
Ethylenglycol-bis (ß-amino-ethylether)-N, N, N , N-tetraacetat
Endkonzentration
Erythromycin
Glucose
Isoamylalkohol
Isopropylthiogalactosid
Luria-Bertani Medium oder Luria Broth
multiplicity of infection
Polyethylenglykol
plaque forming units
Raumtemperatur
rounds per minute; Umdrehungen pro Minute
sodium dodecyl sulfate
Tris-Acetat-EDTA Puffer
10 mM Tris-HCl, pH 7.9; 1 mM EDTA
N, N, N ,N -Tetramethylenethylendiamin
Tris (hydroxmethyl) aminomethan
Trypton Yeast Medium
über Nacht
Übernacht-Kultur
unit; Enzymeinheit
vollentsalzt
weight per volume; Gewicht pro Volumen
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β -D-galactopyranosid
4
Versuch 1
1. Präparation eines Vektors zum Klonieren von PCR-Produkten (TA-cloning)
Bei der Synthese von PCR-Produkten durch Taq-Polymerasen ohne „proofreading“-Aktivität
werden keine „blunt end“ DNA Fragmente erzeugt, sondern solche mit einem 3’-Nucleotid
Überhang. Bei Anwesenheit aller Nucleotide (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) in der PCR
Reaktion wird präferentiell ein Adenosin angehängt. Dies ist durch die „template-independent“
Terminale Transferase-Aktivität der Taq-Polymerase bedingt. Diesen A-Überhang kann man
sich bei der Klonierung solcher PCR-Fragmente zunutze machen indem man als KlonierungsPlasmid ein Konstrukt wählt, das einen komplementären 3’-Thymidin Überhang an der
Klonierungsstelle hat. Die Herstellung eines solchen T-Vektors wird in diesem Protokoll
beschrieben.
Hinweis: Thermostabile DNA Polymerasen mit „proofreading“-Aktivität hängen keinen
Nukleotid-Überhang an PCR-Fragmente. Sie enden als „blunt“-DNA und können daher nicht
in einen T-Vektor kloniert werden.
Prinzip: Zunächst wird ein Standard-Klonierungsvektor (in diesem Fall pBluescript) mit einem
„blunt“-schneidendem Restriktionsenzym (EcoRV) hydrolysiert. Dieses Enzym hat nur eine
Schnittstelle in dem Vektor. Dann wird dieser Vektor mit Taq-Polymerase in Gegenwart von
dTTP behandelt. Da nur dieses Nukleotid angeboten wird, wird, anstelle eines A-Überhangs,
ein T-Überhang synthetisiert. Dieser Vektor kann dann, nach Aufreinigung durch eine
Phenolextraktion, als Klonierungsvektor für PCR-Fragmente mit A-Überhängen verwendet
werden. Da sich pBluescript zum „blue-white“-Screening eignet, kann die
Klonierungseffizienz auf X-gal/IPTG-Agarplatten ermittelt werden.
Herstellen des T-Vektors:
1.
EcoRV-Hydrolyse von pBluescript
Auf Eis in einem 0.2 ml PCR-Reaktionsgefäß ansetzen:
H2O
8 µl
pBluescript (1 mg/ml)
10 x Puffer T
BSA (1 mg/ml)
EcoRV (10 units/µl)
2.
3.
5 µl
2 µl
4 µl
1 µl
Mischen und einige Sekunden zentrifugieren
Über Nacht bei 37°C in einer PCR Maschine inkubieren.
Versuch 1
5
4.
Zu den 20 µl des Restriktionsansatzes hinzugegen:
dTTP (20 mM)
2 µl
Taq Polymerase (5U/µl)
1 µl
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Durch Pipettieren mischen und einige Sekunden zentrifugieren
Für 2 Stunden bei 68°C in der PCR-Maschine inkubieren.
Mit H2O auf 50 µl auffüllen und in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführen.
Mit 50 µl Phenollösung versetzen, 1 min intensiv vortexen.
5 min bei 12.000 rpm zentrifugieren
Die wässrige, obere Phase möglichst komplett in ein neues Reaktionsgefäß überführen.
Mit 50 µl Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung versetzen.
Vortexen und zentrifugieren wie oben.
Die wässrige, obere Phase möglichst komplett in ein neues Reaktionsgefäß überführen.
Zu den 50 µl der extrahierten Plasmidlösung 5 µl 3 M Na-acetat Lösung geben,
mischen und 100 µl eiskaltes 100%iges Ethanol zugeben, kurz vortexen (nicht durch
Pipettieren mischen!).
mindestens 30 Minuten auf Eis inkubieren.
20 Minuten bei mindestens 12000 rpm zentrifugieren.
Überstand vorsichtig entfernen und verwerfen. Vorsicht: Das Pellet ist wahrscheinlich
nicht sichtbar.
Zum Pellet 50 µl 70% Ethanol hinzugeben. Nicht mischen.
5 Minuten bei mindestens 12000 rpm zentrifugieren.
Überstand komplett aber vorsichtig entfernen und verwerfen. Vorsicht: Das Pellet ist
wahrscheinlich nicht sichtbar.
Das Pellet so lange trocknen bis keine Flüssigkeitsreste mehr zu sehen sind. Offen für
5-10 min auf der Laborbank stehen lassen.
Das Pellet in 20 µl TE-Puffer lösen.
3 µl dieser Plasmidlösung (versetzt mit 2 µl H2O und 1 µl Gel-Load) am nächsten Tag
gemeinsam mit dem PCR-Produkt (siehe unten) auf einem 1,0%igen Agarosegel
überprüfen. Die Probe für das Agarosegel sowie den Rest der Plasmidpräparation bei 20°C bis zur weiteren Verwendung einfrieren. pBluescript hat eine Größe von 3000 bp
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
6
Versuch 1
Herstellen eines PCR-Produkts:
1.
In einem 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäß auf Eis ansetzen:
Vorsicht: Die dünnwandigen PCR-Gefäße nicht drücken, da sich leicht Risse bilden!
H2O
10 x PCR Puffer
DNA-Template
Primer Mix
dNTPs (10 mM)
Taq-Polymerase
2.
40,5 µl
5 µl
1 µl
2 µl
1 µl
0,5 µl
Durch Pipettieren mischen und in PCR-Gerät überführen. Folgendes Programm starten:
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Extension
Final extension
30 sec
30 sec
30 sec
1 min
5 min
95°C
95°C 30x
55°C 30x
68°C 30x
68°C
3.
Nach Beendigung der Reaktion 3 µl der Reaktion mit 2 µl H2O und 1 µl Gel-Load
versetzen und auf einem 1,0 %igen Agarosegel überprüfen (auch die Vektor-DNA vom Vortag
auf dieses Gel laden). Erwartete Größe des PCR-Produkts ist 680 bp. Den Rest der Reaktion
(~47 µl) bei -20°C lagern. Konzentration des PCR-Produkts anhand des Gels und der
verwendeten DNA-Marker abschätzen.
Ligation des PCR-Fragments in den T-Vektor
1.
In einem 0,2 ml Reaktionsgefäß auf Eis ansetzen:
H2O
T-Vektor
PCR-Produkt
10 x Ligasepuffer
T4-Ligase
Gesamtvolumen
2.
3.
x µl
10-50 ng
5-20 ng (molares Insert:Vektor Verhältnis 3:1 bis 5:1)
1 µl
1 µl
10 µl
Auch eine Ligation ohne PCR-Fragment ansetzen!
Durch Pipettieren mischen, kurz zentrifugieren.
Versuch 1
4.
7
Bei 15°C über Nacht in einer PCR-Maschine inkubieren.
Transformation des Ligationsprodukts in E.coli XL1-Blue
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
In einem 1,5 ml Reaktionsgefäß auf Eis ansetzen:
Kompetente E. coli (siehe S. 48)
100 µl
Ligationsansatz
10 µl
30 Minuten auf Eis inkubieren
Hitzeschock für 90 Sekunden bei 42°C in einem Heizblock.
2 Minuten auf Eis
1 ml LB-Medium hinzugeben
45 Minuten auf einem Schüttler bei 37°C inkubieren (optionaler Schritt)
100 µl auf eine vorher präparierte IPTG/X-Gal/Ampicillin-LB-Agarplatte ausstreichen.
Die
restlichen
~900
µl
für
30
sec
bei
6000
rpm
zentrifugieren und den Überstand bis auf ~100 µl verwerfen. Zellpellet in diesen
verbliebenen 100 µl resuspendieren und Zellen dann ebenfalls ausplattieren.
Platten für einige Minuten offen stehen lassen um Flüssigkeitsfilm einzutrocknen.
Platten invertiert bei 37°C über Nacht inkubieren.
Am nächsten Morgen Platten auf blaue und weiße Kolonien analysieren. Oft wird die
blaue Farbe nach Inkubation im Kühlschrank für einige Stunden besser sichtbar.
Plasmidpräparation aus E. coli
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Am Nachmittag werden 4 weiße Kolonien von der Platte mit dem PCR/PlasmidTransformationsansatz mit gelben Pipettenspitzen „gepickt“ und in Reagenzgläser
mit jeweils 2 ml LB plus 100 µg/mL Ampicillin gegeben. Die Kulturen werden auf
einem Schüttler bei 37°C über Nacht angezogen.
Am Morgen werden jeweils 1,5 ml Kultur in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt
Zentrifugation für 20 sec bei 12000 rpm
Überstand komplett entfernen und verwerfen
Zellpellet in 150 µl kaltem GTER-Puffer durch vortexen resuspendieren. Wichtig:
Zellen dürfen nicht aggregiert sein!
200 µl Lysepuffer zugeben, Reaktionsgefäß exakt 8x manuell invertieren.
3-5 Minuten auf Eis inkubieren.
150 µl Neutralisationspuffer hinzugeben, Reaktionsgefäß exakt 4x manuell invertieren.
3-5 Minuten auf Eis inkubieren.
5 Minuten bei 12000 rpm zentrifugieren.
450 µl des Überstands in neue 1,5 ml Reaktionsgefäße überführen.
8
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Versuch 1
900 µl 100% Ethanol (bei Raumtemperatur) hinzugeben. Einige male invertieren.
Für 15 Minuten bei mindestens 12000 rpm zentrifugieren.
Überstand verwerfen
Zum Pellet 100 µl 70%iges Ethanol geben. Nicht mischen.
5 Minuten zentrifugieren
Überstand verwerfen und Pellets in offenen Reaktionsgefäßen gut trocknen
Pellets in 30 µl TE-Puffer lösen. Vortexen. Auf Eis oder bei -20°C aufbewahren.
Analyse der Plasmidpräparationen
Der Vektor enthält in seiner „multiple cloning site“ zwei EcoRI Schnittstellen, jeweils eine
upstream und downstream der cloning site. Daher kann die Authentizität des klonierten PCRFragments durch eine EcoRI/XhoI-Hydrolyse des Plasmids überprüft werden.
1.
In je einem 1,5 ml Reaktionsgefäß auf Eis für alle 4 Plasmidpräparationen ansetzen:
Plasmid DNA
10 x Puffer EcoRI
EcoRI
XhoI
2.
3.
4.
5.
8 µl
1 µl
0.5 µl
0.5 µl
Durch Pipettieren mischen und kurz zentrifugieren
2 Stunden bei 37°C inkubieren.
2 µl Gel-Load zugeben
Komplette Reaktion auf einem 1,0%igem Agarosegel überprüfen. DNA-Marker nicht
vergessen!
Materialien
a) Herstellen von X-gal/IPTG-Agarplatten
In das Zentrum einer LB-Agarplatte (mit Ampicillin) 100 µl 0,1 M IPTG-Lösung und 50 µl
einer 2% X-gal Lösung pipettieren. Diese Flüssigkeitsmischung mit einem Drigalski-Spatel
gleichmäßig über die Platte verteilen. Flüssigkeitsfilm dann bei leicht geöffnetem Deckel für
einige Minuten eintrocknen lassen. Dann im Kühlschrank aufbewahren oder unmittelbar zum
Ausplattieren von transformierten E. coli verwenden.
Versuch 1
9
b) Agarose-Gelelektrophorese
Gele vorbereiten
Aus 50 x TAE Elektrophoresepuffer 1 x TAE herstellen (mit VE-Wasser verdünnen). Pro
Minigel 40 ml veranschlagen (also z.B. für ein 1% (w/v) Agarose-Gel 0,4 g Agarose in eine
Duran-Flasche abwiegen und 40 ml 1 x TAE zugeben). Agarose in 1 x TAE im
Mikrowellenherd lösen, bis eine homogene Lösung entstanden ist. Dabei öfters den
Kochvorgang unterbrechen und die Flasche schwenken.
Vorsicht: Es ist unbedingt darauf zu achten, dass ein Siedeverzug vermieden
wird!
Die Lösung auf ca. 50°C abkühlen lassen und in vorbereitete Minigelapparaturen mit
positionierten Kämmen gießen. Gele nicht zu dick gießen (7-8 mm)! Die Gele erstarren lassen,
vorsichtig die Kämme entfernen, die Gele in die Elektrophoreseapparaturen einsetzen und mit
1 x TAE bedecken (ca. 3 - 5 mm Puffer über der Geloberfläche).
Die Proben werden vor dem Auftragen mit einer entsprechenden Menge an Gel-Load versetzt.
Jedes Gel muss, neben den Proben, einen für das jeweilige Experiment angebrachten DNALängenstandard enthalten.
Die Elektrophorese erfolgt bei 5 V/cm bis das Bromphenolblau ca. 2/3 der Gellänge erreicht hat.
Vorsicht: Vor Manipulation an der Elektrophoreseapparatur immer
Spannungsquelle abschalten und Kabel entfernen, Spannungsquelle und
Arbeitsplatz trocken halten!
Die Gele werden danach mit Ethidiumbromid angefärbt:
- 15 min langsam in Ethidiumbromidlösung (0,5 µg/ml H2O) schwenken
- 15 min langsam in H2O (VE) schwenken
- Gele unter UV-Licht fotografieren
Vorsicht: Ethidiumbromid ist eine interkalierende Substanz und potentiell
mutagen, blaue Nitril-Handschuhe tragen!
Vorsicht: UV-Licht, UV-Schutz tragen!
10
Versuch 1
c) Plasmid Minipräp Lösungen:
GTER-Puffer:
25 mM Tris-HCl, pH 8,0
50 mM Glucose
10 mM EDTA, pH 8,0
100 µg/ml RNase
Lysepuffer:
0,2 N NaOH
1% SDS
Neutralisierungspuffer:
3 M K-acetat, pH 4,8
d) Gel-Load (6 x; wird gestellt)
0,25% Bromphenolblau
0,25% Xylencyanol
30% Glycerin
e) 50 x TAE Puffer
2 M Tris-Base
1 M Essigsäure (Eisessig: 17,4 M)
50 mM EDTA, pH 8,0
Literatur:
Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A. Collins, F.S.: Construction of T-vectors, a rapid and
general system for direct cloning of unmodified PCR products.
Nucleic Acids Research 19, 1154 (1991)
Versuch 2
11
2. Präparation von DNA des Phagen SPP1
2.1 Einleitung
SPP1 ist ein virulenter Bakteriophage mit dsDNA als Genom, der das gram-positive Bakterium
Bacillus subtilis infiziert. Infizierte Zellen werden ca. 30 min nach der Infektion lysiert. Das
SPP1 Genom umfasst 44 kb und wird mittels des „headful“-Mechanismus‘ in die
ikosaedrischen Phagenköpfe verpackt. Zur präparativen Isolierung der Phagen-DNA erfolgt
zunächst die Infektion einer exponentiell wachsenden B. subtilis Kultur mit einer multiplicity
of infection (m.o.i.) <1. Man läßt die Kultur lysieren und reichert die Phagenpartikel aus dem
Kulturmedium durch eine PEG/NaCl Präzipitation an. Eine Reinigung und weitere
Konzentration der Partikel erfolgt durch eine CsCl Stufengradienten-Ultrazentrifugation. Nach
enzymatischer Hydrolyse der Phagen-Proteinhülle wird die DNA durch eine Phenolextraktion
isoliert.
Literatur:
Alonso et al. (1997) Gene 204: 201 – 212
2.2 Versuchsziel
Isolierung von SPP1-DNA im präparativen Maßstab
2.3 Material
Benötigte Lösungen:
CsCl-Lösungen: Dichte 1,32 g/cm3
45 g CsCl + 90 ml TBT (1x)
1,45 g/cm3
3
1,6 g/cm
5 x TBT
60,5 g Tris
29,22 g NaCl
10,2 g MgCl2 x6H2O
ad 1 l mit VE-Wasser
pH 7,4 mit HCl einstellen
Folgende Lösungen und Medien müssen für diesen Versuch angesetzt werden:
4 x 50 ml 1 M MgCl2
7 x 200 ml TBT-Puffer (5x)
3 x 200 ml TE-Puffer (10x)
12
Versuch 2
Kulturmedium: TY-Medium
Tryptone (Difco)
Hefeextrakt (Difco)
MgCl2
MnCl2
10 g
5g
20 ml einer 1 M Stammlösung(= 20 mM)
1 ml aus 100 mM Stammlösung (= 0,1 mM)
pH 7,4 einstellen
ad 1000 ml mit H2O dest. Auffüllen
MgCl2 und MnCl2 nach dem Autoklavieren aus sterilen Stammlösungen zugeben
Bereits vorbereitet:
CsCl-Lösungen
Proteinase K-Lösung (Stammlösung: 20 mg/ml)
neutralisiertes Phenol
RNase (20 mg/ml)
Chloroform-Isoamylalkohol (24:1)
100 mM MnCl2-Lösung
Chloroform
Dialyseschläuche (autoklaviert in TE)
2.4 Vorgehen
1. Tag:
1. 250 ml TY-Medium in einem 500 ml Kolben mit Schikanen; autoklavieren
2. 50 ml TY-Medium in 100 ml Schraubflasche; autoklavieren
3. ÜNK von B. subtilis 168 ansetzen, in 5 ml TY-Medium; ÜN bei 37°C
2. Tag:
1. Beimpfung: 250 ml TY-Medium mit 2 ml ÜNK von B. subtilis 168 animpfen und die OD578
bestimmen
2. Schütteln bei 37° C bis OD578 = 1,5 (wichtig! genau einhalten), dann Infektion (Zugabe von
100 µl SPP1-Lysat)
3. Schütteln ÜN bei 37° C
Versuch 2
13
3. Tag:
1. Abschlussmessung OD578
1. Wenn die Zellen lysiert sind (klares Medium), die lysierte Kultur vorsichtig in eine 500-mlSchottflasche dekantieren.
2. Zugabe von RNase (EK: 1 µg/ml); 30 min bei RT rühren
3. Lösung auf 0,5 M NaCl bringen, Salz unter Rühren lösen
4. Wenn das Salz gelöst ist, Lösung auf 10 % PEG bringen (PEG unter Rühren lösen), dann
zwei Tage bei +4°C stehen lassen.
4. Tag:
1. Ca. 50 – 100 ml vom Überstand vorsichtig abpipettieren, ohne das Phagenpräzipitat am
Boden der Flasche aufzuwirbeln.
2. Restflüssigkeit mit den Phagen komplett in einen JA14-Zentrifugenbecher überführen.
Zentrifugation: JA14-Rotor, 20 min, 8000 rpm, 4°C. Überstand vorsichtig abgießen und
verwerfen.
3. Pellet (enthält Phagen) gründlich in 15 ml 1 x TBT-Puffer suspendieren und in ein steriles
50 ml Einmal-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss überführen;
Zugabe des gleichen Volumens Chloroform (im Abzug arbeiten!); gut mischen.
4. Zentrifugation: Eppendorf 54xx, 10 min, 4000 rpm, 4°C, swing-out Rotor. Die obere,
wässrige Phase enthält die Phagen.
5. Phagenlysat vorsichtig mit Pasteurpipette abnehmen (darauf achten, daß kein Chloroform
mitgeführt wird) und in neues 50 ml Zentrifugenröhrchen überführen --- Kühlschrank
5. Tag:
1. Da für den nachfolgenden Ultrazentrifugationsschritt nur 6 Plätze im Rotor zur Verfügung
stehen, werden die Ansätze von 2-3 Gruppen vereinigt (Rücksprache mit Assistenten)
2. CsCl-Stufengradient vorbereiten:
In Ultra-Clear-Röhrchen zunächst 6 ml CsCl-Lösung Dichte 1,6 g/cm3
dann 6 ml CsCl-Lösung Dichte 1,45 g/cm3
und schließlich 6 ml CsCl-Lösung Dichte 1,3 g/cm3
vorsichtig überschichten.
Anschließend das Phagenlysat aus dem 50 ml Zentrifugenröhrchen auftragen (bis ca. 5 mm
unter den Rand befüllen). Röhrchen mit 1 x TBT austarieren.
2. Zentrifugation: SW28-Rotor, Beckman Ultrazentrifuge, 2,5 h, 22000 rpm, 15°C; ohne
Bremse auslaufen lassen (am Lehrstuhl)
14
Versuch 2
3. Vor schwarzem Hintergrund bläulich schimmernde Phagenbande mit Kanüle und
Einwegspritze abziehen.
4. Dialyse zur Entfernung von CsCl: üN und 2 x 2 h in je 2 l 1 x TBT-Puffer
6. Tag:
1. Phagen aus Dialyseschlauch in ein 15 ml Einmal-Zentrifugenröhrchen überführen. Je nach
Ausbeute muss die Präparation eventuell verdünnt werden. Bitte mit Assistenten
Rücksprache halten. Danach werden die Präparationen wieder auf die einzelnen Gruppen
verteilt. Jede Gruppe erhält in zwei 1,5 ml Reaktionsgefäße je 600 µl Phagenpräparation.
2. Proteinase K-Behandlung: Proteinase K (EK: 50 µg/ml) und SDS (EK: 0,1 %) zugeben. 1 h
bei 60°C im Wasserbad inkubieren.
3. Extraktion der Phagen-DNA in Eppendorf-Reaktionsgefäßen:
1 x 1 Vol. Phenol
1 x 1 Vol. Phenol/Chloroform
2 x 1 Vol. Chloroform/IAA (24:1)
Phasentrennung jeweils durch Zentrifugation 5 min, 12000 rpm, RT. Die Phagen-DNA
befindet sich jeweils im wässrigen Überstand
4. Dialyse des finalen Überstands: üN und 2 x 2 h gegen je 2 l 1 x TE-Puffer.
5. Photometrische Bestimmungen der Konzentration und Reinheit durch Messung der A260 und
A280. Dazu die DNA-Lösung 1:50 verdünnen (10 µl + 490 µl 1 x TE)
1 OD260 nm entspricht 50 µg/ml dsDNA
2.5 Protokoll
Für die Versuche 2 und 3 sollte ein zusammenfassender Protokollabschnitt erstellt werden.
Für Details siehe Punkt 3.5.
Versuch 3
15
3. Präparation eines Molekulargewichts-Standards für die Agarosegel-Elektrophorese
3.1 Einleitung
Zur Bestimmung der Größe von DNA-Fragmenten wird ihr Migrationsverhalten in
Agarosegelen mit dem von Fragmenten bekannter Größe verglichen. Zu diesem Zweck ist eine
Vielzahl von unterschiedlichen DNA Längenstandards kommerziell erhältlich. Diese enthalten
entweder eine Mischung von PCR-Fragmenten definierter Größe, oder aber werden durch
Restriktionshydrolyse von Plasmid-, von Viren-, oder von Bakteriophagen-DNA generiert.
Idealerweise decken diese Fragmente einen weiten Größenbereich ab und generieren ein
typisches Muster, ohne allerdings größere Lücken oder schwer auftrennbare Doppelbanden
nach der Elektrophorese aufzuweisen.
3.2 Versuchsziel
Präparative Hydrolyse der im Versuch 2 isolierten SPP1-DNA mit EcoRI und Nachweis der 15
erwarteten DNA-Fragmente mittels Agarosegel-Elektrophorese.
3.3 Material
50 x TAE-Puffer: (siehe S. 10)
Bereits vorbereitet:
10 x Restriktionspuffer
Gel-Load
3.4 Vorgehen
1. Tag:
Hydrolyse der SPP1-DNA mit EcoRI
Restriktionsansatz:
x µl SPP1-DNA (entsprechend 10 µg)
10 µl 10x Restriktionspuffer
(88-x) µl Aqua bidest.
2 µl EcoRI (10 units/µl)
ÜN im 37°C Schrank inkubieren
2. Tag:
1. Agarosegel gießen: 0,8% Agarose in 1 x TAE-Puffer; in Mikrowelle aufkochen (lösen); auf
ca. 55°C abkühlen lassen, dann das Gel gießen; Laufpuffer = TAE-Puffer (1x)
16
Versuch 3
2. Zwei Proben auftragen (Gesamtvolumen = 12 µl):
a) 5 µl Restriktionsansatz + 5 µl Aqua bidest + 2 µl Gel-load
b) 10 µl Restriktionsansatz + 2 µl Gel-load.
3. Agarosegel im Ethidiumbromidbad färben, dann entfärben
4. auf eine UV-Durchlichtbank legen; fotografieren
5. Auswertung des Gelbilds; bei vollständiger Hydrolyse ergeben sich 15 Fragmente mit
folgenden Größen (bp):
8576
7425
6106
4899
3639
2799
1953
1882
1515
1482
1164
992
710
492
359
3.5 Protokoll
Evaluieren Sie Ausbeute und Reinheit der SPP1-DNA. Sind sämtliche erwarteten 15
Fragmente nach Hydrolyse der selbst präparierten SPP1-DNA mit EcoRI sichtbar? Wenn dies
nicht der Fall ist, wie könnte man die Diskrepanz erklären? Gibt es Hinweise auf eine
Kontamination mit unspezifischen Nukleasen? Die Firma Roche vertreibt mit EcoRI
hydrolysierte SPP1-DNA als „DNA Molecular Weight Marker VII“. Für 50 µg bezahlt man ca.
150 €. Berechnen Sie den Marktwert ihrer eigenen SPP1-DNA-Präparation.
Versuch 4
17
4. Konstruktion einer chromosomalen Bacillus subtilis-Knockout Mutante
Literatur: V. Vagner et al. (1998) Microbiology 144 : 3097-3104
Einleitung:
Die Inaktivierung eines bestimmten Genes („Knockout“) dient zur Charakterisierung seiner
Funktion. Durch anschließende Untersuchungen des konstruierten Knockout-Stammes können
Informationen darüber gewonnen werden, welche Rolle das Gen in der Zelle spielt.
Im Praktikumsversuch soll das Gen yrdB inaktiviert werden, das wahrscheinlich ein integrales
Protein der inneren Membran kodiert..
Abb. 1: Klonierung des yrdB Gens in das Plasmid pMUTIN4. Aus dem B. subtilis
Chromosom wurde das Gen yrdB (A) über PCR amplifiziert (B) und mittels der
Restriktionsschnittstellen EcoRI/BamHI (C) in das Plasmid pMUTIN4 kloniert
(D).
18
Versuch 4
Die Inaktivierung des Gens erfolgt durch Unterbrechung des Leserasters mit Hilfe eines
Insertionsplasmids. Dabei handelt es sich um den Vektor pMUTIN4, in den ein PCRAmplifikat aus dem Gen yrdB einkloniert wurde (Abb. 1).
Nach Transformation in Bacillus subtilis erfolgt die Integration des gesamten Plasmids mittels
homologer Rekombination in das B. subtilis Chromosom in das Gen yrdB (Abb. 2).
Abb. 2: Konstruktion eines B. subtilis yrdB Knockout-Stammes durch chromosomale
Integration des Plasmids pMUTIN4yrdB. Das yrdB-Gen wird unterbrochen, der
ursprüngliche yrdB Promotor wird transkriptionell mit dem lacZ-Gen fusioniert
und die dem yrdB nachfolgenden Gene gelangen unter die Kontrolle des IPTG
regulierbaren Promotors Pspac.
Versuch 4
19
Experimentelle Durchführung:
1. Tag: Transformation von gereinigter Plasmid-DNA in B. subtilis
1. Zwei Aliquots eingefrorene kompetente B. subtilis 168-Zellen bei 37°C auftauen
2. damit je 10 ml Low-Salt-Medium animpfen; 2 h bei 30°C inkubieren; dabei langsam
schütteln
3. Kolben mit kompetenten Zellen aus Wasserbad nehmen - plus 110 µl 0,1 M EGTA - für 5
min bei RT inkubieren
4. jede Gruppe entnimmt 1 ml in ein großes Wassermannröhrchen - plus 20 µl PlasmidDNA (= ca. 5 µg); 2 h bei 37°C schütteln; quantitativ in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß
überführen
5. Zentrifugation: 2 min bei 12000 rpm; Überstand bis auf ca. 100 µl abnehmen und
verwerfen; in den restlichen ca. 100 µl das Bakterienpellet resuspendieren
6. auf LB + Em (1 µg/ml) ausplattieren und ÜN bei 37°C inkubieren
2. Tag: Screening auf Platten mit erhöhter Em-Konzentration
Platte mit Transformanten
(LB Em 1 µg/ml)
1
LB Em 100 µg/ml
1
2
...
2
LB Em 1 µg/ml
1
2
...
Alle Kolonien (maximal 52) auf LB-Platten mit a) 100 und b) 1 µg/ml Em mit sterilen
Zahnstochern ausstreichen
20
Versuch 4
3. Tag:
Zwei positive Klone (gewachsen auf 100 µg/ml Em) von der LB-Platte mit 1 µg/ml Em! in
5 ml LB + Em (1 µg/ml) animpfen
4.Tag: Präparation der chromosomalen DNA
Präparation der chromosomalen DNA nach der CTAB-Methode (siehe Anhang)
5.Tag:
1. Konzentrationsbestimmung: 50-fache Verdünnung (8 µl + 392 µl TE)
OD260 messen
1
OD260 entspricht 50 µg/ml dsDNA
2. Verdau der chromosomalen DNA und elektrophoretische Auftrennung
Reaktionsansatz:
5 µg chromosomale DNA
5 µl 10x Puffer
2 µl EcoRV
Aqua bidest ad 50 µl
2 h bei 37°C inkubieren
plus weitere 2 µl EcoRV, 2 h bei 37°C
6. Tag: Southern-Blot (Vakuumblot)
1. 10 µl Gel-Load zum Restriktionsansatz; 30 µl des Ansatzes zur Auftrennung der Fragmente
auf ein 0,8% Agarosegel auftragen (Gel für Blot)
2. Restliche 30 µl auf Kontrollgel (0,8%)  EtBr-Färbung
Versuch 4
21
3. Filter auf Gelgröße zurechtschneiden (QiaBrane) und 10 min in 20 x SSC wässern
4. Vakuumblot aufbauen; Gel überschichten mit:
 15 min Depurinierungslösung
 15 min Denaturierungslösung
 15 min Neutralisierungslösung
 2 h Transferpuffer 20 x SSC
 Filter 1 h bei 120°C trocknen
5. pro Blot 20 ml Prähybridisierungslösung herstellen
6. Hybridisierung:
 Filter in Hybridisierungsröhrchen überführen und 20 ml Prähybridisierungslösung
zugeben; 1 h 68°C
 Sonde (2 µg/ml in Prähybridisierungslösung): 15 min bei 95°C denaturieren
dann 15 min auf Eis
7. Prähybridisierungslösung dekantieren, Sonde in Hybridisierungs-Röhrchen geben und ÜN
bei 68°C inkubieren
8. Waschlösungen für den nächsten Tag herstellen:
2 x SSC, 0,1 % SDS (pro Blot 100 ml; RT)
0,1 x SSC, 0,1 % SDS (pro Blot 150 ml; auf 68 °C stellen)
7. Tag: Nachweis der Fragmente
1. Filter waschen:
 2 mal 5 min RT mit je 50 ml 2x SSC, 0,1 % SDS
 3 mal 15 min bei 68 °C mit je 50 ml 0,1 x SSC, 0,1 % SDS
zwischendurch Blocking Puffer herstellen:
pro Blot 50 ml; 5 ml 10 % Blocking Reagenz + 45 ml Puffer 1
 2 min Puffer 1
 30 min mit 30 ml Blocking Puffer
22
Versuch 4
 30 min mit 20 ml Blocking Puffer und Antikörper (Fab-Fragment; konjugiert mit
alkalischer Phosphatase (AP)) 1:10.000
 2x 30 min Waschpuffer
2. Zwei min äquilibrieren mit Detektionspuffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 9.5)
3. Reaktionslösung herstellen
pro Blot:
1 ml Detektionspuffer
+ 10 µl CDP-Star
CDP-Star
4. Filter leicht abtropfen lassen, auf eine Folie legen und mit der Reaktionslösung
überschichten. Danach den Filter mit einer zweiten Folie bedecken
 5 min bei RT inkubieren
5. Überschüssige Flüssigkeit abwischen.
 Detektion mit dem Fuji LAS Imaging System (s.S. 53)
Lösungen für Versuch Nr. 4
vorhandene Lösungen :
- RNase (20 mg/ml)
- Lysozym (5 mg/ml)
- Proteinase K (20 mg/ml)
- Erythromycinlösungen (Em) 1 bzw. 100 mg/ml
- LS-Medium
- EGTA 0,1 M
- 10% SDS
- CTAB/NaCl-Lösung
- kompetente B. subtilis-Zellen (B.s. 168)
Versuch 4
vorbereitet werden müssen:
- 100 ml TE-Puffer
- 50 ml 5 M NaCl
- 1 l LB-Medium
- 30 LB-Platten mit Em (1 µg/ml)
- 15 LB-Platten mit Em (100 µg/ml)
- 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Na-citrat)
- Depurinierungslösung (0,25 M HCl)
- Denaturierungslösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl)
- Neutralisierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris/HCl pH 7,4)
- Prähybridisierungslösung (5x SSC, 1 % Blocking Reagens,
0,1 % Lauroylsarcosin, 0,02 % SDS)
- Puffer 1 (100 mM Maleinsäure, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% Tween 20)
zum pH einstellen zunächst pro Liter 8 g Natriumhydroxid (fest) zugeben
23
24
Versuch 4
Anhang
1. Herstellung kompetenter B. subtilis-Zellen
2. CTAB-Methode: Präparation chromosomaler DNA
1. Herstellung kompetenter B. subtilis-Zellen
Literatur:
C. Anagnostopoulos, J. Spizizen (1961) J. Bacteriol. 81: 741-746. D. Dubnau et al. (1971) J.
Mol. Biol. 56: 209-221.
1. Tag:
1. 20 ml ÜNK des gewünschten Stammes in HS-Medium, 37°C, 100 ml Kolben mit Schikanen
verwenden
2. Tag:
1. 100 ml HS-Medium in einem 300 ml Erlenmeyer mit der ÜNK auf A578 = 0,1 inokulieren;
unter starkem Schütteln bei 37°C inkubieren
2. Zellwachstum mit einer Wachstumskurve kontrollieren, d.h. alle 30 min die A578 messen,
protokollieren und in halblogarithmisches Papier eintragen
3. Beim Übergang in die stationäre Phase (nach 4-5 h) 5 ml entnehmen, 0,5 ml steriles
Glycerin zugeben und gut durchmischen
4. Aliquotieren in Fraktionen à 1 ml in Reaktionsgefäße und in flüssigem Stickstoff einfrieren
(Schutzbrille tragen)
5. Proben bei -80°C aufbewahren
Anmerkung: Die kompetenten B. subtilis-Zellen werden nicht selber hergestellt sondern zur
Verfügung gestellt.
3. Tag:
1. Ein Aliquot eingefrorene Zellen im 37°C Wasserbad auftauen und dann in einen Erlenmeyer
mit 10 ml LS-Medium pipettieren; 120 min bei 30°C inkubieren
Versuch 4
25
2. Transformationsansatz: 1 ml LS-Kultur in ein Wassermann-Röhrchen geben und 10 µl 0,1
M EGTA zufügen; 5 min bei RT inkubieren
3. Plus 1 µg Plasmid-DNA; weitere 2 h bei 37°C unter Schütteln inkubieren
4. Ausplattieren auf Selektionsmedium; Platten bei 30 oder 37°C inkubieren
5. Kontrolle: Transformationsansatz ohne Plasmid-DNA
Medien für die Transformation:
10x S-Base (Spizizens Salz):
2 g (NH4)2SO4
14 g K2HPO4
6 g KH2PO4
1 g Na-citrat x 2H2O
Aqua bidest.ad 100 ml; nach dem Autoklavieren 0,1 ml 1 M MgSO4 zugeben
HS-Medium:
66,5 ml Aqua bidest.
10 ml 10x S-Base
2,5 ml 20% Glucose
5 ml 1mg/ml D,L-Tryptophan (sterilfiltrieren)
1 ml 2% Caseinhydrolysat (Sigma)
5 ml 10% Hefeextrakt (Difco!)
10 ml 8%-Arginin, 0,4%-Histidin
Alle Komponenten getrennt autoklavieren und dann steril zusammengeben
LS-Medium:
80 ml Aqua bidest.
10 ml 10x S-Base
2,5 ml 20% Glucose
0,5 ml 1 mg/ml DL-Tryptophan (sterilfiltrieren)
0,5 ml 2% Caseinhydrolysat
5 ml 2% Hefeextrakt (Difco!)
0,25 ml 1 M MgCl2
0,05 ml 1 M CaCl2
0,1 M EGTA:
380 mg EGTA in ca. 5 ml Aqua bidest. lösen; mit 10 N NaOH auf pH 7,2 einstellen, auf 10 ml
auffüllen und autoklavieren
26
Versuch 4
2. CTAB-Methode: Isolierung von chromosomaler B. subtilis-DNA
1. Tag: Anlegen einer ÜNK
1. Inkubation von 5 ml LB mit dem entsprechenden Antibiotikum; Inkubation ÜN bei 37°C
2. Tag: Präparation der chromosomalen DNA
1. ÜNK auf je zwei Reaktionsgefäße aufteilen (2 Klone, 2 Eppis pro Klon = 4 Eppis
insgesamt)
2. Pelletieren der Bakterien: 5 min bei 8000 RPM und 4°C zentrifugieren
3. Überstand verwerfen, Bakterien-Pellets in 270 µl TE-Puffer resuspendieren und Inhalt der
beiden Reaktionsgefäße gleicher Klone vereinigen (= 1 Eppendorfgefäß je Klon)
4. plus 25 µl Lysozymlösung (5 mg/ml); gründlich mischen, nach diesem Schritt nicht mehr
vortexen!
5. 30 min bei 37°C inkubieren
6. plus 30 µl 10%ige SDS-Lösung (in Aqua bidest.) und 3 µl Proteinase K (20 mg/ml in Aqua
bidest.); sorgfältig mischen; 1 h bei 37°C inkubieren
7. plus 100 µl 5 M NaCl; gründlich mischen
8. plus 80 µl CTAB/NaCl-Lösung; durchmischen
9. Inkubation für 10 min bei 65°C
10. Extraktion mit 700 µl Chloroform/IAA (24:1)
11. Zentrifugation: 5 min und 12000 RPM (Phasentrennung)
12. wäßriger, nukleinsäurehaltiger visköser Überstand mit der weißlichen Interphase in ein
neues Reaktionsgefäß überführen
13. Phenolisierung: 1 x Phenol (je 600 – 700 µl), 1 x Phenol/Chloroform (1:1) 2 x
Chloroform/IAA (24:1)
14. Zentrifugation: jeweils 5 min bei 12000 RPM (Phasentrennung)
15. Überstand ohne Interphase in ein neues Reaktionsgefäß überführen, plus 10 µl RNaseLösung (20 mg/ml), 30 min, RT
16. Zugabe von 0,6 Volumina Isopropanol, Ansatz durchmischen, dann ÜN bei 4°C im
Kühlschrank fällen
Versuch 4
27
3. Tag: DNA-Pellet in Puffer bringen
1. Zentrifugation: 15 min bei 4°C und 12000 RPM (Pelletierung der DNA)
2. DNA-Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol waschen (10 min bei 12000 RPM);
Pellet ca. 10 min an der Flamme trocknen
3. DNA-Pellet in 100 µl TE-Puffer resuspendieren (kann bis zu 1 h dauern); Konzentration
liegt typischerweise zwischen 60-100 ng/µl
Lösungen:
CTAB/NaCl-Lösung: 10% CTAB in 0,7 M NaCl
4,1 g NaCl in 80 ml Aqua bidest. lösen
unter Rühren und Erhitzen langsam 10 g CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid bzw.
Hexadecyltrimethylammoniumbromid) zugeben
falls notwendig zum Lösen auf 65°C erhitzen
Endvolumen auf 100 ml einstellen
CTAB ist ein kationisches Detergenz und bildet unlösliche Komplexe mit Proteinen und
sauren Polysacchariden bei hoher Ionenstärke (0,7 M NaCl). Chromosomale DNA wird nicht
präzipitiert.
28
Versuch 4
Rezepte der im Verlauf des Praktikums häufiger verwendeten Medien und Lösungen:
1. LB-Medium:
10 g Caseinhydrolysat (Trypton oder Pepton)
5 g Hefe-Extrakt
5 g NaCl
deionisiertes Wasser ad 1000 ml
2. LB-Platten:
LB-Medium mit 15 g Agar pro Liter (Rührfisch in die Flasche geben!); nach dem
Autoklavieren auf 50 - 60°C abkühlen lassen (in ein 55°C Wasserbad stellen); ggf.
unmittelbar vor dem Gießen das entsprechende Antibiotikum zugeben
3. Antibiotikum-Lösungen (Stamm-Lösungen):
Amp: 100 mg/ml in Aqua dest., sterilfiltrieren; EK = 100 µg/ml
Em: 1 mg/ml in absolutem Ethanol; EK in den LB-Platten = 1 µg/ml
Em: 100 mg/ml in absolutem Ethanol; EK in den LB-Platten = 1 µg/ml und 100 µg/ml
Alle Antibiotikum-Lösungen werden bei -20°C aufgehoben
4. Tris-Puffer:
Man setzt immer eine 1 M Stammlösung an; entsprechende Menge Tris in wenig Aqua
bidest. lösen; den entsprechenden pH mit konzentrierter HCl einstellen, dann auf das
Endvolumen auffüllen
5. EDTA:
Eine 0,5 M Stammlösung ansetzen; entsprechende Menge Substanz in Aqua bidest. lösen;
am pH-Meter auf pH 8,0 mit 10 N NaOH einstellen
Versuch 4
6. TE-Puffer (1x):
1 mM EDTA, pH 8,0
als 10x-Puffer ansetzen
7. DNase I:
1 mg/ml in 50% Glycerin, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2; bei -20°C lagern
8. RNase A:
20 mg/ml in 0,1 M Na-Acetat (pH 4.8)
10 min auf 100°C erhitzen (Inaktivierung von DNasen)
9. Proteinase K:
20 mg Proteinase K in 1 ml Proteinase-K-Puffer
Proteinase K-Puffer: 10 mM Tris/HCl (pH 7.8)
5 mM EDTA
0,5 % SDS
10. Phenol-TE:
mit TE-Puffer äquilibriertes Phenol (wird als solches gekauft)
11. Chloroform/IAA (24:1):
96 % Chloroform (v/v)
4 % Isoamylalkohol (v/v)
29
30
Versuch 4
Während des Praktikums verwendeter Bakterienstämme, Phagen:
Bezeichnung
relevanter Genotyp/Phänotyp
_________________________________________________________________
(1) Bakterienstämme
Bacillus subtilis
B. subtilis 168
trpC2
Escherichia coli
E. coli XL1-Blue:
F´ ::Tn10 proA+B+ lacIq lacZΔM15/ recA1 endA1 gyrA96 (NalR) thi hsdR17 (rK– mK+) glnV44
relA1 lac
(2) Phagen
SPP1
virulenter B. subtilis Phage
Alonso, J. C. et al. (1997): The complete nucleotide sequence and functional organization of
Bacillus subtilis bacteriophage SPP 1. Gene 204: 201-212
Versuch 5
31
5. Molekulare Bestimmung des Integrationsortes von Transposons in Drosophila
melanogaster
5.1 Einleitung
In der klassischen Genetik war man oft darauf angewiesen die Effekte von ungerichteten und
zufälligen Mutationen auf den Phänotyp eines Organismus zu untersuchen. Bei vielen
Fragestellungen in der modernen Genetik dagegen interessiert man sich für die Auswirkungen,
die ganz definierte Änderungen des Expressionsmusters eines Gens (lokal und temporär) oder
definierte Änderungen der Struktur eines Gens (Punktmutationen, Deletionen, Insertionen etc.)
und somit des abgeleiteten Proteins auf den Phänotyp eines Organismus haben. Hierfür
werden die entsprechenden Gene in vitro manipuliert und wieder in den Organismus
zurückgebracht. Seit 1982 ist dies auch für Drosophila melanogaster über die P-Element
vermittelte Keimbahntransformation möglich. P-Elemente sind Transposons aus D.
melanogaster, die hier als Vektoren für den Gentransfer benützt werden. Der interessierende
Genabschnitt wird in spezielle Plasmide einkloniert, die die für eine Transposition wichtigen
P-Element Enden besitzen. Zwischen den P-Element Enden liegt eine multiple
Klonierungsstelle und ein Markergen, das eine erfolgreiche Transformation erkennen läßt. In
unserem Fall ist dies das white+-Gen, das in white-mutanten Fliegen (weiße Augen) zur
Ausprägung von roten Augen führt. Diesen P-Element-Vektoren fehlt allerdings das Gen für
die Transposase, die für einen erfolgreichen Transpositionsvorgang essentiell ist. Die
Transposase wird bei der Keimbahntransformation in trans bereitgestellt, und ist auf einem
zweiten Plasmid kodiert, das keine P-Element-Enden enthält. Das Transposasegen kann sich
somit also nicht selbst mobilisieren. Eine Mischung aus den beiden Plasmiden (P-Element
enthaltendes Plasmid und Transposase-kodierendes Plasmid) wird dann mit einer dünnen
Glaskapillare in den posterioren Bereich syncytialer Drosophila-Embryonen injiziert, wo die
Vorläufer der späteren Keimbahnzellen lokalisiert sind. Das Transposase-Gen wird im
Embryo abgelesen, und die neu synthetisierte Transposase mobilisiert das künstliche PElement vom anderen Plasmid. Der Integrationsort des P-Elementes im Drosophila-Genom ist
allerdings mehr oder weniger zufällig. Es gibt zwar „hot spots“ für eine Integration, man kann
aber nicht steuern wo das P-Element integriert. Insofern sind mit dieser Technik auch keine
gezielten „knock-out“-Experimente wie in der Maus oder der Bäckerhefe möglich.
Die Fliegen, die von den injizierten Embryonen abstammen, haben noch weiße Augen
(warum?). Man kreuzt nun einzelne Männchen aus dieser Gruppe mit weißäugigen Weibchen.
Erst ein Teil der Nachkommen dieser Fliegen hat das integrierte P-Element in allen
Körperzellen und somit auch rote Augen. Die Ausprägung des Merkmals „rote Augen“ hängt
sehr vom Integrationsort des P-Elements ab. Das Spektrum der erhaltenen Augenfarben kann
deshalb von hellgelb bis dunkelrot variieren. Weiterhin beeinflusst auch das Alter (jüngere
Fliegen haben hellere Augen als ältere Fliegen), das Geschlecht (Dosiskompensation Männchen haben dunklere Augen als Weibchen mit derselben P-Element-Integration) und die
Kopienzahl des P-Elementes (Gendosiseffekt - homozygote Individuen haben dunklere Augen
als heterozygote Individuen) die Intensität der roten Augenfarbe.
In jüngerer Zeit werden auch vermehrt andere Transposons zur Erzeugung transgener Fliegen
verwendet. Hier ist insbesondere das piggyBac-Element hervorzuheben, das ursprünglich aus
dem Nachtfalter Trichoplusia ni stammt. Da auch dieses Transposon ungerichtet integriert, ist
hier ebenfalls eine Kartierung der Integrationen notwendig. Gewöhnlich wird zunächst eine
einfache genetische Kartierung durchgeführt, die eine Aussage über das Chromosom zulässt, in
das das Transposon integriert ist. Für viele Experimente ist es ausreichend zu wissen, auf
welchem der 5 Chromosomen (Koppelungsgruppen: Y, X(=I), II, III, IV) von Drosophila
32
Versuch 5
melanogaster das Transposon integriert ist. Integrationsereignisse auf dem hauptsächlich aus
Heterochromatin bestehenden Y-Chromosom sind genauso wie auf dem sehr kleinen IV.
Chromosom sehr selten. Eine solche chromosomale Kartierung können wir im Rahmen der zur
Verfügung stehenden Zeit nicht durchführen.
Will man wissen, wo ein Transposon auf dem Chromosom lokalisiert ist, so können prinzipiell
drei methodische Ansätze verfolgt werden. Zunächst kann über Ermittlung der meiotischen
Rekombinationshäufigkeit mit verschiedenen Markern bekannter Position der genetische
Abstand zu diesen Markern ermittelt werden. Alternativ kann über in situ-Hybridisierung an
Polytänchromosomen aus larvalen Speicheldrüsen und anschließender mikroskopischer
Analyse der gefärbten Chromosomen die Integrationsposition im Vergleich mit den
verfügbaren Karten des Chromosomen-Bänderungsmusters ermittelt werden.
Schließlich kann über die so genannte inverse PCR der Integrationsort basengenau bestimmt
werden. Die inverse PCR ist der Bestandteil dieses Praktikumsversuches.
Bei der Lokalisation von Transposon-Integrationen über inverse PCR wird zunächst die
genomische DNA von transgenen Individuen präpariert. Anschließend wird die DNA mit
ausgewählten Restriktionsendonukleasen hydrolysiert. Diese Restriktionsendonukleasen
schneiden an bekannten Positionen innerhalb des Transposons und in der flankierenden
genomischen DNA, wobei der Abstand letzterer Schnittstellen zum Ende des Transposons
zunächst nicht bekannt ist. Da die folgenden Schritte besser mit kürzeren DNA-Fragmenten
funktionieren, versucht man diesen Abstand nicht zu groß werden zu lassen. Deshalb wählt
man mit Vorteil Enzyme mit Erkennungssequenzen die häufig vorkommen
(Erkennungssequenz aus 4 Nukleotiden zusammengesetzt). Der Restriktionsansatz wird
anschließend stark verdünnt und ligiert. Aufgrund der Verdünnung wird eine intramolekulare
Zirkularisierung gegenüber einer intermolekularen Verknüpfung von Fragmenten favorisiert.
Mit geeigneten Primern kann nun in einer PCR die flankierende DNA amplifiziert werden. Das
gereinigte Amplifikat dient schließlich als Matrize für eine DNA-Sequenzierungsreaktion. Die
erhaltene Sequenz wird mit der gesamten genomischen Sequenz von Drosophila melanogaster
verglichen, die seit März 2000 bekannt ist. In den meisten Fällen ist auf diese Weise eine
eindeutige Zuordnung möglich. In der Regel versucht man die flankierenden Sequenzen auf
beiden Seiten des Transposons zu bestimmen. Die erhaltenen Sequenzen sollten denselben
Integrationsort ergeben. Das Vorgehen bei der inversen PCR ist schematisch in Abb. 5-1
zusammengefasst.
Selbstverständlich ist diese Methode nicht nur auf die Bestimmung des Integrationsortes von
Transposons im Genom von Drosophila melanogaster beschränkt. Sie kann für die
Bestimmung des Integrationsortes eines jeglichen Transposons mit bekannter Sequenz in der
genomischen DNA eines jeden Organismus, dessen genomische Sequenz ebenfalls bekannt ist,
verwendet werden. Die Zahl der sequenzierten Genome wächst ständig. Es wurden bis 05.
Januar 2015 6649 Projekte komplett abgeschlossen, und die Sequenzen von 23552 weiteren
Organismen wurden als so genannte „permanent drafts“ in den Datenbanken hinterlegt. Dies
sind hauptsächlich prokaryontische Genome, aber auch viele Eukaryontengenome inklusive
natürlich neben dem Menschen die Sequenzen der etablierten Modellorganismen, wie S.
cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster, Arabidopsis thaliana und Maus (https://gold.jgipsf.org/).
Versuch 5
33
5.2 Versuchsziel
Molekulare Bestimmung des Integrationsortes eines Transposons.
genomische DNA
5'
Transposon
PlinksF
IR
PrechtsF SPrechts
?
PrechtsR
SPlinks PlinksR
RErechts
RElinks
RElinks
IR
?
3'
RErechts
Schnitt mit RElinks und Ligation
PlinksF
RElinks
RElinks
PlinksR
PCR
PlinksF
SPlinks
genomische DNA
SPlinks PlinksR
IR
DNA-Sequenzierung mit SPlinks
Abb. 5-1. Schematische Darstellung der Arbeitsschritte bei der inversen PCR. RE, Restriktionsenzym; P, Primer; SP,
Sequenzierprimer
5.3 Material
Folgende Materialien werden zur Verfügung gestellt:
- Futterröhrchen mit a) transgenen Fliegen und b) w1-Fliegen als Kontrolle.
- Homogenisator zum Zermörsern
- Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase, Taq-Polymerase sowie zugehörige Puffer
- RNase A (100 µg/ml)
- Primer (forward und reverse; je 10 µM)
- dNTP-Lösung (2 mM)
- PCR Thermocycler
- 6 x Gelauftragslösung ( Gel-Load)
- DNA-Längenstandard
34
Versuch 5
- Apparaturen und Spannungsquellen für die Agarose-Gelelektrophorese
- Stocklösungen (Tris/HCl pH 7,5; NaCl, EDTA, SDS)
Herzustellende Puffer:
(die angegebenen Volumina sind für 12 Gruppen konzipiert)
Puffer A
(12 ml)
100 mM EDTA
100 mM NaCl
0,5% (w/v) SDS
--> aus Stammlösungen mischen
LiCl/KAc Lösung
(35 ml)
10 ml 5 M KAc
25 ml 6 M M LiCl
(mischen und steril filtrieren)
5.4 Vorgehen
Jede Gruppe versucht den Integrationsort eines Transposons zu bestimmen. Die Verteilung der
Stämme wird im Praktikumssaal vorgenommen. Zur Kontrolle wird von jeder Gruppe auch die DNA
von w1-Fliegen präpariert und analog behandelt.
I) DNA-Präparation
1. 30 betäubte Fliegen werden in einem 1,5 ml Eppendorf-Gefäß gesammelt und für mindestens 20
min bei -20°C eingefroren
2. Fliegen in 200 µl Puffer A mit dem Homogenisator zermahlen
3. weitere 200 µl Puffer A zugeben und weitermahlen bis nur Kutikulareste übrig bleiben (ca. 1 min)
4. 30 min bei 65°C inkubieren
5. 900 µl LiCl/KAc-Lösung zugeben und mischen. Mindestens 10 min auf Eis inkubieren
6. 15 min bei RT zentrifugieren (14.000 rpm)
7. 900 µl des Überstandes in neues Gefäß überführen, möglichst ohne Gewebsstücke (falls doch
Partikel mitgenommen werden, nochmals zentrifugieren)
8. 540 µl Isopropanol zum Überstand zugeben, mischen, 15 min bei RT zentrifugieren (14.000 rpm)
9. Überstand abziehen, kurz zentrifugieren (1x auf Höchstdrehzahl kommen lassen), Überstand
vollständig abziehen. Aufpassen, dass das Präzipitat nicht verloren geht!
10. 1 ml 70% Ethanol zugeben, 5 min zentrifugieren, Überstand möglichst vollständig abziehen
11. Gefäß mit offenem Deckel in den 37°C Heizblock stellen und Pellet für 10 min trocknen
12. DNA in 100 µl TE lösen (~ 1 h bei RT oder 15’ 37°C, dann 5 mal mit der Mikroliterpipette
(eingestellt auf 100 µl) auf- und ab pipettieren)
Versuch 5
35
II) Restriktionshydrolyse
genomische DNA (~ 2 Fliegen)
10x Puffer
RNase A (100 µg/ml)
ddH2O
Restriktionsenzym (ca.10 U/µl)
10,0 µl
2,5 µl
2,0 µl
9,5 µl
1,0 µl
1. 1,5 h bei 37°C inkubieren
2. Hitzeinaktivierung: 20 min bei 65°C
III) Ligation
Hydrolysierte genomische DNA (~ 0,4 Fliegen)
10x Ligase Puffer (+ATP)
ddH2O
T4 DNA Ligase
5,0 µl
20,0 µl
174,0 µl
1,0 µl
1. üN bei 4°C inkubieren
2. 20 µl LiCl/KAc-Lösung zugeben
3. 0,5 ml 100% Ethanol zugeben, mischen, mind. 10 min -20°C, 15 min bei 4°C zentrifugieren
4. Überstand abziehen, kurz zentrifugieren (1x auf Höchstdrehzahl kommen lassen), Überstand
abziehen,
5. 0,5 ml 70% Ethanol zugeben, 5 min bei 4°C zentrifugieren, Überstand abziehen
6. Reaktionsgefäß in den 37°C Heizblock stellen und das eventuell kaum sichtbare Pellet für 10 min
trocknen
7. In 30 µl TE lösen (~ 1/75 Fliege pro µl)
IV) PCR
ligierte genomische DNA (1/7 Fliege)
2 mM dNTPs
10 µM Forward Primer
10 µM Reverse Primer
10 x PCR Puffer
25 mM MgCl2
ddH2O
Taq-Polymerase (2 units)
10,0 µl
4,0 µl
1,0 µl
1,0 µl
5,0 µl
3,0 µl
25,0 µl
1,0 µl
Die geeigneten Primerpaare werden im Praktikumssaal für jede Gruppe bekannt gegeben.
Als Kontrolle werden wir einen Teil des cid-Gens aus Drosophila mit den Primern DW4 und DW10
mit ungeschnittener genomischer DNA sowie einer Plasmid-DNA als Matrize amplifizieren. Hier
wird eine Bande der Größe 780 bp erwartet. Die ungeschnittene genomische DNA muss vorher
36
Versuch 5
entsprechend verdünnt werden (2 µl DNA + 28 µl H2O).
Es empfiehlt sich einen Mastermix mit denjenigen Komponenten anzusetzen, die allen Reaktionen
gemein sind (also alles außer Primer und Matrize). Um sicherzustellen, dass dieser Mastermix auch
für alle Reaktionen ausreicht werden wir ihn für 8 Reaktionen konzipieren. Das Enzym TaqPolymerase wird als letztes zugegeben, der Mix wird vorsichtig mit der Mikroliter- Pipette (100 µl
oder 200 µl) gemischt und dann auf Eis gehalten. Auch die fertigen Reaktionsansätze werden auf Eis
bis zum Start der PCR gehalten.
PCR Parameter:
95°C
3 min
1 Zyklus
95°C
53°C
72°C
30 sec
35 Zyklen
1 min
1 min 50 sec
V) Analytisches Agarosegel
Gele vorbereiten
Aus 50 x TAE Elektrophoresepuffer 2 Liter 1 x TAE herstellen. Pro Minigel 0,4 g Agarose in
40 ml 1 x TAE (→ 1% (w/v)) im Mikrowellenherd lösen, bis eine homogene Lösung
entstanden ist. Die Lösung auf ca. 50 °C abkühlen lassen und in vorbereitete
Minigelapparaturen mit positionierten Kämmen gießen. Die Gele erstarren lassen, vorsichtig
die Kämme entfernen, die Gele in die Elektrophoreseapparaturen einsetzen und mit 1 x TAE
bedecken (ca. 3 - 5 mm Puffer über der Geloberfläche).
Von jedem PCR-Ansatz werden 10 µl mit 2 µl Gelauftragslösung („Gel-load“) vermischt und nach
Anweisung auf die Agarosegele aufgetragen. Als Längenstandard dient der Längenstandard VII
(siehe S. 56). Die Elektrophorese erfolgt bei 5 V/cm bis das Bromphenolblau ca. 2/3 der Gellänge
erreicht hat.
Vorsicht: Vor Manipulation an der Elektrophoreseapparatur immer
Spannungsquelle abschalten und Kabel entfernen, Spannungsquelle und
Arbeitsplatz trocken halten!
Die Gele werden danach mit Ethidiumbromid angefärbt:
- 15 min langsam in Ethidiumbromidlösung (0,5 µg/ml H2O) schwenken
- 15 min langsam in H2O schwenken
- Gele unter UV-Licht fotografieren
Versuch 5
37
VI) Probenaufreinigung
Für die DNA-Sequenzanalyse müssen die PCR-Primer entfernt werden (warum?). Wenn ein
einzelnes PCR-Produkt in der Gelanalyse sichtbar ist, werden die restlichen 40 µl der PCR-Ansätze
mittels „GeneJet PCR purification“-Säulchen (Thermo Scientific) nach folgendem Protokoll
aufgereinigt.
—————————————————————————————————————
30 µl
38
Versuch 5
Falls mehrere deutliche Banden zu sehen sind, werden die einzelnen Banden über präparative
Agarose-Gelelektrophorese aufreinigt. Zur Elution der Banden aus der Gelmatrix werden wir den
QIAquick Gelextraktionskit Kit (Qiagen; siehe Seite 43f.) verwenden.
VII) DNA-Sequenzanalyse
Ausgewählte Proben werden wir zur DNA-Sequenzanalyse an eine Firma schicken.
Hierzu werden 5 µl der eluierten DNA mit 2 µl einer 10 µM Lösung eines geeigneten
Sequenzierprimers in einem 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäß mit flachem Deckel vereinigt. Die
gesammelten Proben eines Kurses werden in einem wattierten Umschlag verschickt.
Die erhaltenen Sequenzinformationen werden gemeinsam am Computer ausgewertet. Der Vergleich
der erhaltenen Sequenzen mit der genomischen Drosophila-Sequenz erfolgt mit dem Programm
BLASTn (http://flybase.org/blast/).
Zeitplan:
Tag 1:
Tag 2:
Tag 3:
Tag 9 (ca.):
Isolierung der Fliegen-DNA, Restriktionshydrolyse, Ligation üN
PCR und analytisches Gel
Fragmentaufreinigung, Einschicken zum Sequenzieren
Auswertung der Sequenzinformation
5.5 Protokoll:
Wurde ein PCR-Produkt erhalten? Welche Größe hat (haben) das (die) PCR-Produkt(e)? Falls kein
PCR-Produkt erhalten wurde – woran könnte das liegen? Hat sich das PCR-Produkt sequenzieren
lassen? Falls keine Sequenz erhalten wurde oder diese schlechter Qualität ist – woran könnte das
liegen? Wie sehen die w1-Kontrollansätze aus? Gibt es hier auch ein PCR-Produkt? Ist ein Auftreten
eines PCR Produktes bei dem w1-Ansatz erwartet? Falls sich die DNA-Sequenz auswerten lässt – wo
hat das P-Element integriert? Die Integrationsstelle soll definiert werden durch Angabe von 1)
Chromosom, 2) Chromosomenarm, 3) zytologische Bande, 4) In welchem Gen/in der Nähe welchen
Gens, stromaufwärts/stromabwärts, in der 5‘-UTR/3‘-UTR, im kodierenden Bereich, in einem
Intron, im intergenen Bereich? 5) Nukleotidposition. Ist das Ergebnis im Einklang mit der bekannten
chromosomalen Lokalisation des P-Elements?
Versuch 6
39
6. Klonierung und Überexpression von EGFP/mRFP1 in E. coli
6.1 Einleitung
Die Neukombination von DNA-Molekülen in vitro und ihre anschließende Vermehrung in
Wirtsorganismen (Klonierung) ist aus modernen molekularbiologisch arbeitenden Laboratorien
nicht mehr wegzudenken. Durch diese Manipulationen können bestimmte DNA-Bereiche
isoliert werden, Mutationen in die DNA eingeführt werden, Gene mit unterschiedlichen
Kontrollregionen für ihre Expression verknüpft werden oder aber auch Gene so mit anderen
Genabschnitten verbunden werden, dass so genannte Fusionsproteine kodiert werden. Werden
solche Fusionsproteine im ursprünglichen Organismus gebildet, können sie verwendet werden
um Studien zur Funktion, Lokalisation und Dynamik der untersuchten Proteine durchzuführen.
Insbesondere für die beiden letztgenannten Anwendungen hat das grün fluoreszierende Protein
(GFP) aus der Qualle Aequorea victoria breite Anwendung gefunden. GFP ist ein sehr stabiles,
relativ kleines Protein von 26,9 kDa (238 Aminosäuren), das ohne weitere Kofaktoren oder
prosthetische Gruppen zur Fluoreszenz befähigt ist (maxAbsorption = 395 nm; maxEmission =
505 nm). So eignet sich GFP zur nicht-invasiven Beobachtung von Protein-Lokalisation und
Dynamik in lebenden Organismen. Es wurde eine Vielzahl von Varianten des GFP entwickelt,
die sich in ihren spektralen Eigenschaften [z. B. Y(ellow)FP, C(yan)FP, B(lue)FP]oder in ihrer
Toleranz gegenüber pH und Temperatur vom wildtypischen GFP unterscheiden. Das Enhanced
GFP (EGFP) bildet das Chromophor schneller aus, ist heller und dem menschlichen CodonGebrauch besser angepasst als das ursprüngliche GFP.
Für manche Anwendungen wie strukturelle Untersuchungen oder Antikörperproduktion ist es
notwendig große Mengen an reinem Protein zu produzieren. Für diesen Zweck sind eine Reihe
von Systemen für die Expression in Bakterien und verschiedenen Eukaryoten entwickelt
worden. Diesen Systemen ist gemein, dass nach Induktion im Wirtsorganismus in großer
Menge ein Fusionsprotein produziert wird, das aufgrund der speziell beschaffenen
Fusionssequenz biochemisch in wenigen Schritten leicht zu reinigen ist. Im Falle der Ni-NTAAffinitätschromatographie (Qiagen) wird das Zielprotein mit einer Hexahistidinsequenz
fusioniert. Nitrilotetraessigsäure (NTA) besetzt vier der sechs Liganden-Bindungsstellen von
Ni2+ -Ionen. Die beiden restlichen Bindungsstellen werden hoch affin von Stickstoffatomen der
Imidazolseitengruppen benachbarter Histidinreste besetzt.
In diesem Versuch soll mittels molekularbiologischer Standardverfahren ein Plasmid
konstruiert werden, mit dem die induzierbare Expression eines 6xHis-EGFP/6xHis-mRFP1
Fusionsproteins möglich ist. Die Expression nach Induktion soll überprüft werden. Die
Nachweissensitivität einer Coomassie-Färbung soll mit der eines Western-Blots verglichen
werden
6.2 Versuchsziele
1. Klonierung des EGFP-Gens bzw. des mRFP1-Gens in den Expressionsvektor pQE30
2. Induktion der Expression sowie Nachweis des überproduzierten Proteins
3. Vergleich der Nachweissensitivitäten von Coomassie-Färbung und Western-Blot
6.3 Material
- Plasmid-DNA pCaSpeR-gEGFP-cid bzw. pCaSpeR-gmRFP1-cid und pQE30.
- Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase, Shrimp alkalische Phosphatase sowie zugehörige
Puffer
- 6 x Gelauftragslösung („Gel-Load“)
40
Versuch 6
- DNA-Längenstandard (siehe S. 56)
- GeneJet Kit zur Reinigung von DNA aus Agarosegelen
- Platte mit Bakterien des Stammes E. coli XL1-blue
- Puffer TfBI und TfBII für die Präparation kompetenter Zellen (TfBI: 100 mM RbCl, 50 mM
MnCl2, 10 mM CaCl2, 30 mM KAc, 15% (w/v) Glycerin; pH 5,8 mit 0,2 M Essigsäure
einstellen; steril filtrieren. TfBII: 10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2, 15 % (w/v)
Glycerin; pH 7,0 mit 1 N NaOH einstellen; steril filtrieren)
- 1M IPTG
- 40% Acrylamid/Bisacrylamid (29:1)
- TEMED
- 10% APS
- Protein-Molekulargewichtsstandard SDS7; 1 µg jeder Bande pro 5 µl (siehe Anhang)
- PAGE-Apparaturen (BioRad)
- Western-Blot-Apparaturen (BioRad)
- Nitrozellulose-Membranen (Amersham Hybond ECL)
- Ponceau-S Lösung (0,1% (w/v) in 5% (v/v) Essigsäure)
- anti-EGFP/anti-mRFP1 Antikörper
- 10% (v/v) Tween 20
- ECL-Reagenzien (p.j.k.)
Folgende Medien und Lösungen müssen für diesen Versuch angesetzt werden:
Der Bedarf ist für einen Kurs mit 12 Gruppen berechnet.
Kulturmedium LB
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
(26 x 20 ml in 100 ml Erlenmeyer Kolben
2 x 100 ml in 500 ml Erlenmeyer Kolben
1,6 l als Platten (15 g/l Agar) mit 100 µg/ml Ampicillin; nach dem Autoklavieren zugeben)
SDS-Auftragspuffer:
(„3 x Lämmli“)
(12 ml)
2,4 ml
0,6 ml
2,4 ml
1,5 ml
4,35 ml
0,75 ml
Glycerin
ß-Mercaptoethanol (14 M)
10% (w/v) SDS
Bromphenolblau (0,5% (w/v) in H2O)
Aqua bidest.
1 M Tris-HCl pH 6,8
Versuch 6
41
Elektrophoresepuffer (10x):
(200 ml)
30 g
Tris
144 g Glycin
100 ml 10% (w/v) SDS (zum Schluß zugeben)
H2O (deionisiert) ad 1000 ml
Färbelösung:
(500 ml)
200 ml techn. Methanol ( 40% (v/v) Endkonzentration)
50 ml techn. Eisessig (10% (v/v) Endkonzentration)
0,5 g
Coomassie Blau R-250 (zuerst in MeOH lösen)
Blotting-Puffer:
(3 l)
3g
Tris
14,4 g Glycin
200 ml techn. Methanol
10 x PBS
(200 ml)
80 g
NaCl
2g
KCl
2g
KH2PO4
11,5 g Na2HPO4 x 2H2O (bzw. 9,2 g Na2HPO4 wasserfrei)
Milchpuffer:
(1,5 l)
5% (w/v) Trockenmilchpulver
1x
PBS
0,1% (v/v) Tween-20
PBS/Tween:
(250 ml)
1x
PBS
0,1% (v/v) Tween-20
Lösungen für SDS-PAGE: Volumina für 6 Mini-Gele
Trenngel (10%):
7,9 ml
7,9 ml
15,2 ml
40% Acrylamid/Bisacrylamid (29:1)
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
Aqua bidest
Unmittelbar vor dem Gießen erfolgt die Zugabe von:
315 µl
10% (w/v) SDS
15,8 µl TEMED
157,5 µl 10% (w/v) APS (Ammoniumpersulfat); mischen
Trenngelkante vorsichtig mit 150 µl 0,1% SDS überschichten. Polymerisation für ca. 1 h.
Vor dem Giessen des Sammelgels 0,1% SDS abgießen und restlos mit Filterpapier
entfernen.
42
Versuch 6
Sammelgel:
1,5 ml
40% Acrylamid/Bisacrylamid (29:1)
3,25 ml 1 M Tris-HCl, pH 6,8
10,65 ml Aqua bidest.
Unmittelbar vor dem Gießen erfolgt die Zugabe von:
150 µl
58 µl
30 µl
10% (w/v) SDS
TEMED
10% (w/v) APS; mischen
Zügig die Kämme einsetzen. Polymerisation für ca. 1 h.
6.4 Vorgehen
Die für EGFP kodierende Sequenz soll aus dem Plasmid pCaSpeR-gEGFP-cid (Abb. 6-1)
herausgeschnitten und in den Expressionsvektor pQE30 (Qiagen; Abb. 6-2) kloniert werden.
pCaSpeR-gEGFP-cid kodiert für ein Fusionsprotein aus EGFP und dem Zentromerprotein CID
aus Drosophila melanogaster. Das Fusionsgen steht unter Kontrolle der genomischen
Sequenzen, die das cid-Gen im Drosophila Genom flankieren. In diesem Fall befindet sich
EGFP an einer internen Position des markierten Proteins. Das Konstrukt ist von P-ElementEnden flankiert, und somit kann dieses Plasmid verwendet werden, transgene DrosophilaStämme herzustellen.
pQE30 ermöglicht eine mit IPTG induzierbare Expression von Proteinen, die an ihrem NTerminus mit 6 Histidin-Resten markiert sind.
Durch die Klonierungsstrategie ist ein durchgehender Leserahmen nach Umsetzen der EGFPkodierenden Sequenz in pQE30 gewährleistet.
Anmerkung: 6 Gruppen werden statt dem Plasmid pCaSpeR-gEGFP-cid das Plasmid
pCaSpeR-mRFP-cid erhalten. Dieses Plasmid kodiert ein Fusionsprotein aus CID und dem rot
fluoreszierenden Protein mRFP1 aus der Qualle Discosoma sp. Das experimentelle Vorgehen
ist identisch wie im Protokoll für die Klonierung und Expression von EGFP angegeben. Die
einzigen Änderungen betreffen das Ausgangsplasmid, eine geringfügig andere Größe des zu
eluierenden DNA-Fragments (693 bp statt 741 bp) und dem im Western-Blot zu verwendenden
primären Antikörper (anti-mRFP1 statt anti-EGFP).
Versuch 6
43
HindIII (10153)
HindIII
(9246)
cid-3'
P3'
EGFP
BamHI
(8505)
10000
Amp-R
cid-5'
2000
8000
pCaSpeR-gEGFP-cid
10157 bps
6000
4000
P5'
HindIII
(3033)
white
├────────── ··· EGFP ··· ─────────┤
T G S G G G M V .......................... Y K G G G K L
...ACCGGATCCGGCGGCGGCATGGTG..........................TACAAGGGCGGCGGCAAGCTT...
BamHI
HindIII
Abb. 6-1. Das Plasmid pCaSpeR-gEGFP-cid. Die für den Versuch wichtigen Restriktionsschnittstellen sind
angegeben. Im unteren Teil der Abbildung sind die Sequenzen in der Umgebung der Schnittstellen BamHI und
HindIII abgebildet, die die EGFP-kodierende Sequenz flankieren.
M R G S H H H H H H G S A C E L G T P G R P A A K L N *
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCATGCGAGCTCGGTACCCCGGGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAG
BamHI
HindIII
Abb. 6-2. Das Plasmid pQE30. PT5, Promotor des Phagen T5, der von der E. coli RNA-Polymerase erkannt
wird; lacO, lac-Operator-Sequenzen (Bindungsstellen für den lac-Repressor); RBS, Ribosomenbindungsstelle;
ATG, Translationsinitiationscodon; MCS, multiple Klonierungsstelle. Im unteren Teil ist ein Ausschnitt der
DNA-Sequenz des Plasmids sowie der abgeleiteten Aminosäuresequenz dargestellt. Durch Fettdruck ist die
6xHis-kodierende Sequenz hervorgehoben. Die beiden für den Versuch relevanten Restriktionsschnittstellen sind
unterstrichen.
44
Versuch 6
1. Tag
I) Restriktion von pCaSpeR-gEGFP-cid mit HindIII und BamHI
pCaSpeR-gEGFP-cid (1 µg/µl)
H2O (bidest)
10 x Puffer “Tango”
BamHI
HindIII
5 µl
36 µl
5 µl
2 µl
2 µl
1. vorsichtig mit der 200 µl Pipette mischen und 2 h bei 37°C inkubieren
2. 10 µl Gelauftragslösung („Gel-Load“) zupipettieren und Ansatz für 20 min bei 65°C
inkubieren (Hitzeinaktivierung); kurz zentrifugieren.
3. gesamten Ansatz auf ein präparatives Agarosegel auftragen (1 x TAE). Hierfür werden je
zwei Zacken des Kamms mit Tesafilm zusammengeklebt; pro Gel wird 2 x DNALängenstandard VII aufgetragen
4. Elektrophorese wie auf S. 8f beschrieben.
Es werden 4 Restriktionsfragmente der Größen 5472 bp, 3037 bp, 907 bp und 741 bp
erwartet. Das kleinste Fragment enthält die für EGFP kodierende Sequenz. Die entsprechende
Bande wird ausgeschnitten und die DNA mit dem GeneJet Gelextraktionskit Kit
(Thermo/Fermentas) aus der Gelmatrix gereinigt. Dabei werden wir nach dem Protokoll der
Herstellerfirma vorgehen:
—————————————————————————————————————
GeneJet Gel Extraction Kit Protocol
This protocol is designed to extract and purify DNA of 25 bp to 10 kb from standard or lowmelt agarose gels in TAE or TBE buffer. Up to 1 g agarose can be processed per spin column.
Important points before starting
■ The yellow color of the Binding Buffer indicates a pH ≤7.5.
■ Check whether ethanol (96–100%) has been added to the Wash Buffer before use (see bottle
label for volume).
■ All centrifugation steps are carried out at > 12,000 x g (13,000 rpm = maximum speed) in a
conventional table-top microcentrifuge at room temperature.
Versuch 6
45
Procedure
1. Excise the DNA fragment from the agarose gel with a clean, sharp scalpel. Minimize the
size of the gel slice by removing extra agarose.
2. Weigh the gel slice in a colorless tube. Add 1 volume of Binding Buffer to 1 volume of gel
(100 mg ~ 100 μl). For example, add 300 μl of Binding Buffer to 300 mg of gel. The
maximum amount of gel slice per 1.5 ml tube is 700 mg. Wear gloves as the Binding
Buffer contains an irritant (guanidinium thiocyanate)
3. Incubate at 55°C for 10 min (or until the gel slice has completely dissolved). To help
dissolve gel, mix by inverting the tube every 2–3 min during the incubation.
IMPORTANT: Solubilize agarose completely.
4. After the gel slice has dissolved completely, check that the color of the mixture is yellow
(similar to Binding Buffer without dissolved agarose). If the color of the mixture is orange
or violet, add 10 μl of 3 M sodium acetate, pH 5.2, and mix. The color of the mixture will
turn to yellow. The adsorption of DNA to the silica membrane is efficient only at pH
≤7.5.Binding Buffer contains a pH indicator which is yellow at pH ≤7.5 and orange or
violet at higher pH, allowing easy determination of the optimal pH for DNA binding.
5. Place a GeneJet spin column in a provided 2 ml collection tube.
6. To bind DNA, apply up to 800 µl of the sample to the GeneJet column, and centrifuge for 1
min. For sample volumes of more than 800 μl, simply load and spin again (after step 8).
7. Discard flow-through and place GeneJet column back in the same collection tube. Collection
tubes are reused to reduce plastic waste.
8. Add 100 µl of Binding Buffer to the GeneJet column and centrifuge for 1 min. This step will
remove all traces of agarose.
9. To wash, add 700 µl of Wash Buffer to the GeneJet column, let the column stand 1 min after
addition of Wash Buffer and centrifuge for 1 min.
10. Discard the flow-through and centrifuge the GeneJet column for an additional 1 min. This
step removes residual ethanol, which may inhibit downstream enzymatic reactions.
IMPORTANT: Residual ethanol from Wash Buffer will not be completely removed unless
the flow-through is discarded before this additional centrifugation.
11. Place GeneJet column into a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.
12. To elute DNA, add 30 μl of Elution Buffer (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) to the center of the
GeneJet column membrane, let the column stand for 1 min and centrifuge the column for 1
min.
IMPORTANT: Ensure that the elution buffer is dispensed directly onto the GeneJet column
membrane for complete elution of bound DNA. The average eluate volume is 28 μl from 30
μl.
—————————————————————————————————————
46
Versuch 6
Die eluierte DNA wird über Nacht eingefroren.
II) Restriktion von pQE30 mit HindIII und BamHI
pQE30 (0,2 µg/µl)
H2O (bidest)
10 x Puffer ”Tango”
BamHI
HindIII
2 µl
23 µl
3 µl
1 µl
1 µl
1. vorsichtig mit der 200 µl Pipette mischen und mindestens 1 h bei 37°C inkubieren
2. Inaktivierung der Restriktionsenzyme, 20 min bei 65°C; kurz zentrifugieren
3. 3,4 µl 10 x Dephosphorylierungspuffer (SAP-Puffer) und 1 µl alkalische Phosphatase aus
Shrimp (SAP) zugeben und 10 min bei 37°C inkubieren  dadurch werden die
endständigen Phosphatgruppen entfernt und somit eine Religation des Vektors im nächsten
Schritt verhindert.
4. Inaktivierung der SAP, 15 min bei 65°C; Ansatz einfrieren
2. Tag
III) Abschätzung der DNA-Konzentrationen auf einem analytischen Agarosegel (1%).
Es werden aufgetragen:
- 5 µl (+ 1 µl Gel-Load) pQE30 x BamHI/HindIII/SAP
- 5 µl (+ 1 µl Gel-Load) isoliertes EGFP-Fragment
- 3 µl (500 ng) DNA-Längenstandard VII (2 x pro Gel);
Aus dem Vergleich der Bandenintensitäten der eigenen DNA-Präparationen und des DNALängenstandards VII sollen die DNA-Konzentrationen in den Proben abgeschätzt werden. Der
Längenstandard VII wird durch Restriktionshydrolyse der DNA des Bacillus-Bakteriophagen
SPP1 mit EcoRI hergestellt (siehe Versuch 3). Die entstehenden Restriktionsfragmente liegen
demnach in äquimolaren Mengen vor und man kann bei bekannter eingesetzter Gesamtmenge
an DNA die Menge jeder einzelnen Bande berechnen (siehe S.47). Wenn nun z.B. die
Intensität der Bande Ihrer Vektor-DNA der Intensität der 1164 bp-Bande des Längenstandards
entsprechen sollte, können Sie annehmen, dass Sie 14 ng Vektor-DNA auf das Gel geladen
haben.
Für die Ligation soll ein molares Verhältnis (Rmol ) Fragment: Vektor von 3:1 bis 5:1 bei einer
Gesamtmenge an DNA von ca. 5-40 ng eingesetzt werden. Für die Berechnung müssen neben
Versuch 6
47
den Konzentrationen auch die Größen von Fragment (Grö[F]; hier 741 bp) und Vektor
(Grö[V]; hier 3420 bp) berücksichtigt werden.
Berechnungsbeispiel für gewünschtes molares Verhältnis F:V Rmol = 3
Annahmen:
Konzentration der geschnittenen pQE30-DNA:
Konzentration des eluierten EGFP-Fragments:
c[V] = 5 ng/µl
c[F] = 2 ng/µl
Pro µl Vektor-DNA-Lösung müssen
Rmol  c[V ]  Grö[ F ]
=
cF   Grö[V ]
3  5 ng µl  741bp
= ca. 1,6 µl
2 ng µl  3420bp
Fragment-DNA-Lösung eingesetzt werden. Dies ergäbe in der Summe 5 ng + 3,2 ng = 8,2 ng
DNA.
IV) Ligation:
pQE30 x BamHI/HindIII
EGFP-Fragment
H2O (bidest)
10 x Ligase-Puffer
T4 DNA-Ligase
x µl
y µl
12,5- (x+y) µl
1,5 µl
1 µl
Es wird auch eine Kontrollligation ohne EGFP-Fragment angesetzt.
 Inkubation für 1 h bei RT, dann einfrieren.
Für den nächsten Tag eine Vorkultur E. coli XL1-Blue in 20 ml LB-Tet (12,5 µg/ml) animpfen
und LB vorwärmen
48
Versuch 6
3. Tag
V) Herstellung kompetenter Zellen
Der folgende Ansatz ist für ca. 24 Transformationsansätze konzipiert. Er wird von einer
Gruppe durchgeführt.
1. Zu 100 ml LB (auf 37°C vorgewärmt) Tetracyclin zugeben (12,5 µg/ml) und mit 2 ml der
E. coli XL1-Blue Vorkultur animpfen; 500 ml Erlenmeyerkolben verwenden
2. Wachstum bis OD578 = 0,3 – 0,4, dann Kolben für 2 min auf Eis stellen
3. Kultur in zwei 50 ml Schraubdeckelgefäße überführen und zentrifugieren (Heraeus oder
große Eppendorf-Zentrifuge, 10 min, 4000 rpm 4°C)
4. Bakteriensedimente in insgesamt 30 ml kaltem TfBI suspendieren, 30 min auf Eis
inkubieren
5. Zentrifugieren (Heraeus, 10 min, 4000 rpm 4°C)
6. Bakteriensediment in 2,8 ml TfBII suspendieren, 15 min auf Eis inkubieren
VI) Transformation
Jede Gruppe arbeitet nun mit ihren eigenen Ligationsansätzen weiter.
1. Je 100 µl kompetenter Zellen zum gesamten Ligationsansatz (15 µl) pipettieren
[Eine Gruppe transformiert zusätzlich 0,1 ng ungeschnittenen pQE30 um die Kompetenz
der präparierten Zellen abschätzen zu können]
2. 30 min auf Eis inkubieren
3. 90 sec Hitzeschock bei 42°C
4. 1 ml LB zugeben und 45 min bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubieren (Becherglas im
Schüttelwasserbad).
5. 100 µl der Suspension auf eine LB/Amp-Platte (100 µg/ml) ausplattieren. Restlichen Ansatz
für 30 sec abzentrifugieren (RT, 14.000 rpm), überstehendes Medium bis auf ca. 100 µl
abpipettieren und Bakterien in restlichem Medium suspendieren. Diese Suspension auf eine
weitere LB/Amp-Platte ausplattieren. Inkubation bei 37°C
Versuch 6
49
B) EGFP-Expression und Nachweis des überexprimierten Proteins
4. Tag:
1. Identifizierung positiver Klone über GFP-Fluoreszenz. Auch ohne Induktion wird soviel
Protein produziert, dass positive Klone selbst bei normalem Tageslicht leicht grünlich
erscheinen. Im Zweifelsfall kann die Identifizierung auch durch Betrachtung mit einem
Fluoreszenz-Binokular im Lehrstuhlbereich erfolgen. Eine isolierte Kolonie markieren.
2. Je 5 ml Vorkultur mit einem positiven Klon E. coli XL1blue/pQE30-EGFP und einem Klon
XL1blue/pQE30 in LB + Amp (100 µg/ml) animpfen. Inkubation bei lediglich 30°C, um
ein zu dichtes Anwachsen der Kultur zu vermeiden.
5. Tag:
VII) Kultur und Probenentnahme
1. je 20 ml LB + Amp (100 µg/ml) + 2% (w/v) Glucose in zwei 100 ml Kolben mit je 400 µl
der ÜNKs beimpfen und die Kulturen im Schüttler bei 37°C inkubieren. OD578 verfolgen.
Zunächst im Ein-Stunden-Abstand messen bis eine OD578 von 0,15 oder mehr erreicht ist.
Dann im 30 min-Abstand messen. Wenn eine OD578 = 0,4-0,6 erreicht ist, wird eine 1 ml
Probe der Kultur entnommen (Punkt 2.) und die restliche Kultur induziert (Punkt 3.).
2. Das entnommene 1 ml-Aliquot der Kultur zentrifugieren (14.000 rpm, 5 min, 4°C), den
Überstand verwerfen, das Eppendorfgefäß nochmals kurz zentrifugieren (14.000 rpm,
1 min, RT), Restflüssigkeit sofort abpipettieren. Das Bakterien-Sediment wird mit der
Pipette in 3x SDS-Auftragspuffer (3x ‘Lämmli-Puffer’) gut suspendiert (10 µl pro 0,1
gemessener OD578). Probe zum Aufschluss der Zellen 5 min bei 95°C im Heizblock
inkubieren. Eppendorfgefäß für 1 min auf Eis stellen. Zentrifugation bei 14.000 rpm, 1 min,
RT. Probe bei -20°C einfrieren.
3. Zur Induktion 1M IPTG zu den beiden Kulturen in den 100 ml Kolben geben
(Endkonzentration 1 mM). Dadurch wird der Lac-Repressor inaktiviert.
4. Weitere Proben à 1 ml nach t = 0,5 h und t = 2 h entnehmen und wie unter 2. beschrieben
aufarbeiten. Gleichzeitig die OD578 der Kulturen bestimmen! (notwendig zur Berechnung
der benötigten Menge an „3 x Lämmli“ für den Zellaufschluss).
5. Von der in „3 x Lämmli“ aufgekochten Probe pQE30-EGFP (2h) nach dem Zentrifugieren
eine serielle 1:5 Verdünnungsreihe anfertigen: 10 µl Probe + 40 µl „1x Lämmli“  1:5,
daraus äquivalent die Verdünnung 1:25, dann 1:125, 1:625, 1:3.125 und schließlich
1:15.625 herstellen. Analog von der Probe pQE30 (2h) eine Verdünnungsreihe bis 1:625
herstellen. Alle Verdünnungsstufen bei -20°C einfrieren. Wichtig: bei jedem
Verdünnungsschritt gut mit der Pipette mischen und jeden Verdünnungsschritt mit einer
frischen Spitze pipettieren.
50
Versuch 6
6. Tag
VIII) SDS-PAGE:
1.
10%ige diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gele nach Anleitung (S. 41 f)
vorbereiten. Es werden Mini-Gelapparaturen der Firma BioRad verwendet und für 12
Gruppen 18 Gele (7 x 8 cm; 1 mm Spacer) mit je 10 Taschen gegossen.
Vorsicht: Acrylamid (Neurotoxin!) ist giftig, Handschuhe benutzen,
verschüttete Lösung mit Zellstofftüchern aufsaugen und im Acrylamid-Abfall
entsorgen.
Pro Kammer werden 2 Gele beladen. Es ist darauf zu achten, dass in einer Kammer nicht
die Gele für die Coomassie-Färbung und für den Western-Blot kombiniert werden,
sondern jeweils nur Gele, die entweder für die Coomassie-Färbung oder den Western
Blot bestimmt sind.
2. Die Gele für die Coomassie-Färbung werden wie folgt beladen (ein Gel pro Gruppe):
- 5 µl Molekulargewichtsstandard SDS7; 1 Bande enthält 1 µg Protein
- 10 µl pQE30 (vor Induktion)
- 10 µl pQE30 (30 min Induktion)
- 10 µl pQE30 (2 h Induktion)
- 10 µl pQE30-EGFP (vor Induktion)
- 10 µl pQE30-EGFP (30 min Induktion)
- 10 µl pQE30-EGFP (2 h Induktion)
- 10 µl pQE30-EGFP (2 h Induktion) 1:5
Wichtig: bei den unverdünnten Proben vom Flüssigkeitsmeniskus abpipettieren, damit nicht
bakterielle DNA mit beladen wird.
3. Die Gele für den Western-Blot werden wie folgt beladen (je zwei Gruppen teilen sich ein
Gel):
- 5 µl Molekulargewichtsstandard SDS7
- 10 µl pQE30 (2 h Induktion) 1:625
- 5 µl Molekulargewichtsstandard SDS7
- 10 µl pQE30 (2 h Induktion) 1:625
z. B. Gruppe A
z. B. Gruppe B
Versuch 6
51
4. Bis zum Erreichen der Trenngelkante eine Spannung von 100 V anlegen, dann auf 140 V
stellen. Wenn die Bromphenolblau Bande die untere Gelkante erreicht, Elektrophorese
beenden. Die Glasplatten werden aus der Gellaufapparatur entfernt und vorsichtig
aufgehebelt (KEINE metallischen Gegenstände wie z. B. Spatel verwenden).
Das Sammelgel wird entfernt (z. B. mit einem Skalpell).
IX) Coomassie Färbung
1. Gel für 1 h in die Coomassie-Färbelösung legen
2. Die Färbelösung wird in die Originalflasche zurückgegeben. Vorsicht, dass keine
Färbelösung verkleckert wird! Das Gel wird dann zum Entfärben in einer Kristallisierschale
mit H2O ca. 3-4 mal in der Mikrowelle aufgekocht. Zugegebene Schaumstoffteile
absorbieren den Coomassie-Farbstoff und beschleunigen die Entfärbung. Die
Entfärbelösung kann verworfen werden.
3. Auswertung des Gels; Foto bzw. Scan. Das EGFP-Fusionsprotein ist bedingt durch LinkerAminosäuren aus dem EGFP-CID Konstrukt und Sequenzen abgeleitet von pQE30
(Hexahistidin-Markierung) aus 260 Aminosäuren (29 kDa) zusammengesetzt.
X) Western Blot
Es wird ein so genannter Tank Blot durchgeführt, bei dem ein „Sandwich“ aus Schwämmchen,
Filterpapier, Nitrozellulosemembran und Gel in einen Puffertank mit Elektroden eingehängt
wird (Abb. 6-3).
1. Nitrocellulose-Membran (NC-Membran; Amersham Hybond ECL) kurz in Blotting-Puffer
äquilibrieren; zurechtgeschnittenes Filterpapier kurz mit Blotting-Puffer befeuchten
2. auf die Kathodenseite (Minus-Pol) der Halterung der Blot-Apparatur (schwarzgrau) von
unten nach oben folgende Schichten legen (unbedingt die Reihenfolge einhalten):
a) Schwamm (gut mit Blotting-Puffer anfeuchten)
b) befeuchtetes Filterpapier
c) Gel
d) befeuchtete NC-Membran (Die Membran nach dem Auflegen möglichst nicht
mehr verrücken; Luftblasen sollen vermieden werden. Falls Luftblasen
zwischen NC-Membran und Gel eingeschlossen werden, diese durch
vorsichtiges Streifen mit dem flachen Finger (Handschuhe!) von innen nach
außen herausdrücken)
e) Filterpapier
f) Schwamm (gut mit Blotting-Puffer anfeuchten)
52
Versuch 6
Membran
Filterpapier
Gel
Schwamm
Halterung
+
Halterung
-
Abb. 6-3. Schema des Aufbaus eines Western-Blot-„Sandwichs“ in einer Tankblot-Apparatur
4. die Halterung zuklammern und in den gefüllten Puffertank (mit kleinem Rührfisch am
Boden) einschieben
5. für ca. 1 h eine Spannung von 50-100 V anlegen (auf Polung achten!).
6. die Apparatur auseinanderbauen und die NC-Membran 3 min in Ponceau-S-Lösung
schwenken. Hierdurch werden die Proteine auf der Membran reversibel angefärbt. Die
Ponceau-S Lösung wieder in die Flasche zurückgeben; sie kann mehrmals wieder
verwendet werden. Überschüssiges Ponceau-S durch kurzes Schwenken (ca. 5-10 sec) in
deionisiertem Wasser entfernen. Die Markerbanden vorsichtig mit Kugelschreiber
markieren. Die Blots werden in der Mitte zerschnitten und jede Gruppe arbeitet mit ihrer
Hälfte weiter.
XI) Immunochemischer Nachweis von EGFP
alle folgenden Schritte unter leichtem Schütteln durchführen
1. Blockierung der freien Bindungsstellen auf der NC-Membran: für mindestens 1 h bei RT in
ca. 20 ml Milchpuffer (5% (w/v) Milchpulver/1 x PBS/0,1% Tween-20) schwenken
2. NC-Membran mit geeigneter Verdünnung des primären Antikörpers (anti-EGFP: 1:5.000)
in 15 ml Milchpuffer inkubieren (üN bei 4°C schwenken).
7. Tag
1. NC-Membran dreimal für je 10 min bei RT in je ca. 20 ml Milchpuffer waschen
2. Alle NC-Membranen des Kurses zusammen mit dem sekundären Antikörper (goat-antirabbit-antibodies, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, Firma Jackson Laboratories,
1:3.000 verdünnt in 20 ml Milchpuffer) inkubieren (2h bei RT auf dem Schüttler)
Versuch 6
53
3. zum Entfernen unspezifisch-gebundener Antikörper anschließend dreimal für je 10 min mit
je ca. 20 ml Milchpuffer waschen (jede Gruppe für sich).
4. mindestens 10 min in 1 x PBS/0,1%Tween-20 waschen
5. Nachweis der immunreaktiven Banden über digitale Detektion von Chemolumineszenz
(HRP-Juice, p.j.k., Abb. 6-4) mit dem Fuji LAS-4000 Imaging System. Dabei wie folgt
vorgehen:
a) NC-Membran aus 1 x PBS/0,1%Tween-20 nehmen, abtropfen lassen und auf eine
zurechtgeschnittene Kopierfolie legen.
b) gleiche Volumina von „HRP Juice Component A“, „HRP Juice Component B“
und Wasser mischen; es werden pro Membran ca. 2-3 ml der Mischung benötigt.
Die Mischung auf die Membran pipettieren und dabei gleichmäßig verteilen. Die
Lösung für ca. 1 min auf der Membran belassen.
c) Überschüssige Lösung mit einem saugfähigen Papier abnehmen. Zweite Lage
Kopierfolie auf die NC-Membran legen und eventuelle Luftblasen vorsichtig
nach außen herausstreichen. Die gesamte Anordnung mit der Proteinseite nach
oben in die Kammer der Fuji LAS-4000 Apparatur legen.
d) Die Länge der Belichtung sowie die zu verwendende Sensitivität richten sich
nach der Intensität der Lumineszenz. Erfahrungsgemäß werden in diesem
Experiment gute Resultate mit ca. 4 min Belichtung und der Einstellung
„Standard“ erhalten.
Zeitplan
1. Tag: Schnitt der Plasmide, präparative Gelelektrophorese, Reinigung des EGFP-Fragmentes
2. Tag: Analytische Gelelektrophorese, Ligation
3. Tag: Herstellung kompetenter Zellen, Transformation
6. Tag: Identifizierung positiver Klone
7. Tag: Induktion und Expression
8. Tag: SDS-PAGE, Coomassie-Färbung, Western-Blot
9. Tag: Chemolumineszenz-Nachweis
54
Versuch 6
A
B
Abb. 6-4. Das Peroxidase-Chemolumineszenz-System. (A) Prinzip des Systems bei einem Western-Blot. (B)
Struktur von Luminol und Reaktion mit H2O2.
6.5 Protokoll
Wie hoch war die Ausbeute an geschnittenem pQE30 und eluiertem EGFP-Fragment?
Konnten positive Klone identifiziert werden? Wie können Bakterienkolonien nach der
Transformation erklärt werden, die offensichtlich nicht grün fluoreszieren? Konnte eine
Überproduktion von EGFP in E. coli induziert werden? Wieviel Fusionsprotein (in µg/ml
Bakterienkultur) wurde überschlägig produziert? Um ca. welchen Faktor war der Nachweis des
überproduzierten Proteins mittels Western Blot sensitiver als mittels Coomassie-Färbung? Die
Berechnungen müssen nachvollziehbar gestaltet werden.
Versuch 6
55
Anhang: SDS Protein-Molekulargewichtsstandard/DNA-Längenstandard
SDS7 PAGE Standard
66 kDa
45 kDa
36 kDa
29 kDa
24 kDa
20 kDa
14 kDa
Serum Albumin aus Rind (BSA)
Ovalbumin
Glyzerinaldehyd-3-Phosphat DH
Carboanhydrase
Trypsinogen
Trypsin-Inhibitor aus Soja
-Lactalbumin
Bei einem Auftragsvolumen von 5 µl sind pro Bande 1 µg Protein enthalten.
56
Versuch 6
DNA-Längenstandard VII (SPP1-DNA geschnitten mit EcoRI). Bei Auftragung von 500 ng
sind pro Bande des Standards folgende Mengen an DNA enthalten:
94 ng
84 ng
70 ng
95 ng
56
95
41 ng
ng
32 ng
95 ng
23 ng
95 ng
22 ng
18 ng
17 ng
14 ng
95 ng
12
8 ng
6 ng
4 ng
Versuch 7
57
7. Untersuchung von Protein-Protein Wechselwirkungen im Hefe Two-Hybrid System
7.1 Einleitung
Das Two-Hybrid System in der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird oftmals eingesetzt um ProteinProtein Interaktionen zwischen bekannten Faktoren nachzuweisen, bzw. neue Interaktionspartner
aufzuspüren. Es wird hierbei der modulare Aufbau eukaryontischer Transkriptionsfaktoren
ausgenützt, die aus physikalisch trennbaren und funktionell unabhängigen Domänen bestehen.
Solche Transkriptionsfaktoren beinhalten eine DNA Bindungsdomäne, die an spezifische DNA
Sequenzen bindet. In der Hefe werden solche Sequenzen upstream activating sequences (UAS)
genannt. Um eine Transkription des benachbarten Gens zu ermöglichen, sind noch eine oder
mehrere Transaktivierungsdomänen erforderlich, die die RNA Polymerase II für die Transkription
rekrutieren. Auch der Gal4 Transkriptionsfaktor aus Hefe besitzt eine DNA-Bindungsdomäne und
eine Transaktivierungsdomäne. Wenn diese beiden Domänen getrennt in einer Hefezelle exprimiert
werden, so interagieren sie nicht direkt miteinander und können keine Transkriptionsaktivierung
vermitteln. Werden aber die DNA-Bindungsdomäne und die Transaktivierungsdomäne physikalisch
nahe zusammengebracht, so wird die transkriptionelle Aktivierungsfunktion wiederhergestellt.
Dieses Zusammenbringen kann zum Beispiel durch zwei andere Proteine bewerkstelligt werden, die
miteinander interagieren. Daher wird im Hefe Two-Hybrid-System das zu untersuchende Protein an
die Gal4 DNA Bindungsdomäne und die möglichen Interaktionspartner an die Gal4
Transaktivierungsdomäne fusioniert. Die rekombinanten Fusionsproteine werden dann in der Hefe
koexprimiert. Bei einer Interaktion dieser Fusionsproteine entsteht ein funktionsfähiger
Transkriptionsfaktor, der die Transkription eines Reportergens stromabwärts der GAL4 UAS
ermöglicht (Abb. 7.1). In der Hefe lässt sich so eine große Anzahl potentieller
Wechselwirkungspartner untersuchen, da sich dieser Organismus leicht handhaben und genetisch gut
manipulieren lässt.
Abb. 7-1. Prinzip des 2-Hybrid-Systems in Hefe
58
Versuch 7
7.2 Versuchsziele
Transformation von Saccharomyces cerevisiae; Überprüfung der Interaktion der Drosophila Proteine
dE2F und dDP im Hefe Two-Hybrid-System
7.3 Material
allgemein: Platten mit Hefemedien müssen etwas dicker gegossen werden als Platten für
E. coli-Medien, da sie sonst bei längerer Inkubation eintrocknen.
YPD-Vollmedium (Angaben pro Liter Medium)
Bacto Yeast Extract
Bacto-Peptone
Glukose
Adeninsulfat
10 g
20 g
20 g
40 mg
auf einen Liter mit deionisiertem Wasser auffüllen. Für Platten 20 g/l Agar zugeben und
autoklavieren.
Bedarf für 12 Gruppen:
0,4 l als Platten
0,4 l flüssig;
SC-Selektivmedium (Angaben pro Liter Medium)
Yeast Nitrogen Base 6,7 g
Ammoniumsulfat
5g
Aminosäuremix
1,35 g (dem Mix fehlen Leu, Trp, His und Ura)
pH mit NaOH auf 5,9 einstellen
auf 950 ml mit deionisiertem Wasser auffüllen. Für Platten 20 g/l Agar zugeben und autoklavieren.
Flaschen mit dem Medium nach dem Autoklavieren auf 50°C temperieren und pro Liter 50 ml einer
40%igen sterilfiltrierten Glukoselösung zugeben.
Je nach gewünschter Selektion pro Liter ebenfalls zum temperierten Medium zugeben:
10 ml 20 mM Uracil
10 ml 100 mM Histidin/HCl
Für ein Liter SC-Leu-Trp-Medium z.B. würde man also 10 ml 20 mM Uracil und 10 ml 100 mM
Histidin/HCl zugeben.
Benötigt für 12 Gruppen:
SC-Leu-Trp-Ura:
0,4 l
SC-Leu-Trp-His + 25 mM 3-AT (*): 0,4 l
SC-Leu-Trp:
2l
Versuch 7
59
(*) Trotz der Mutation im HIS3 Gen besitzt der Stamm Mav203 noch eine Restaktivität des
kodierten Enzyms (Imidazolglyzerinphosphat-Dehydratase) und kann langsam auch auf Medium
ohne Histidin wachsen. Deswegen wird den SC-Leu-Trp-His-Platten noch ein kompetitiver Inhibitor
der Imidazolglyzerinphosphat-Dehydratase zugesetzt, der diese Restaktivität unterdrückt. Bei
diesem Inhibitor handelt es sich um 3-Amino-Triazol (3-AT), das in unserem Versuch in einer
Endkonzentration von 25 mM zugesetzt wird (ebenfalls nach dem Autoklavieren zum temperierten
Medium). Die 3-AT-Stammlösung hat eine Konzentration von 1 M.
X-Gal-Puffer (70 ml benötigt):
70 mg X-Gal werden in 700 µl Dimethylformamid gelöst und zusammen mit 420 µl Mercaptoethanol auf 70 ml Z-Puffer gegeben (im Abzug arbeiten).
Z-Puffer (100 ml):
60 mM
40 mM
1 mM
10 mM
Na2HPO4
NaH2PO4
MgSO4
KCl
--> ein pH 7,0 ist durch diese
Mischung gewährleistet
1 M LiAc (50 ml benötigt) pH mit 1:10 verdünntem Eisessig auf 7,5 einstellen
50% (w/v) PEG 3350; steril filtrieren (12 ml benötigt)
7.4 Vorgehen
Wir möchten in diesem Praktikumsversuch das Prinzip der Two-Hybrid Methode in Saccharomyces
cerevisiae vermitteln. Wir werden versuchen die Interaktion zweier Drosophila-Proteine (dE2F und
dDP) in der Hefe nachzuvollziehen. dE2F/dDP ist ein heterodimerer Transkriptionsfaktor, der eine
wichtige Rolle bei der Kontrolle des G1 S Überganges im Zellzyklus spielt.
Wir werden zwei Plasmide in Hefe transformieren. Das eine Plasmid kodiert für eine translationelle
Fusion von der Gal4p Transaktivierungsdomäne und dE2F (pPC97AD-dE2F). Das andere Plasmid
kodiert für eine translationelle Fusion aus der Gal4p DNA-Bindungsdomäne und dDP (pPC86DBdDP). Der Hefestamm MaV203, der transformiert werden soll, ist auxotroph für die Biosynthese
von Leucin und Tryptophan (er hat Mutationen im TRP1-Gen und im LEU2-Gen). Da pPC97ADdE2F das LEU2-Gen und pPC86DB-dDP das TRP1 Gen enthält, können Transformanten, die beide
Plasmide erhalten, auf einem Medium wachsen dem Leucin und Tryptophan fehlen (SC-Leu-Trp;
siehe Punkt 7.3).
Im Hefestamm MaV203 kann eine Interaktion zweier Proteine durch die Aktivierung von drei
Reportergenen nachgewiesen werden, die alle unter der Kontrolle von GAL4-UAS-Sequenzen
stehen. Es sind dies das URA3 und das HIS3-Gen aus Hefe sowie das lacZ-Gen aus E. coli. Die
Aktivierung der URA3 und HIS3 Gene kann durch Ausplattieren auf entsprechenden Selektivmedien
überprüft werden, und die Aktivierung des lacZ-Gens kann über Bestimmung der ß-GalactosidaseAktivität nachgewiesen werden.
60
Versuch 7
Wir werden folgende Plasmidkombinationen transformieren und eine eventuelle Aktivierung der
Reportergene untersuchen (K1-K3 sind Kontrollen):
Test:
K1:
K2:
K3 :
pPC97AD-dE2F und pPC86DB-dDP
pPC97AD-dE2F und pPC86DB
pPC97AD und pPC86DB-dDP
pPC97AD und pPC86DB
I) Transformation von Saccharomyces cerevisiae
Wir werden die Hefezellen nach der Lithiumacetat-Methode transformieren (Gietz und
Schiestl 1995. Methods in Molecular and Cellular Biology 5:255-269). Die ersten Schritte der
Präparation von kompetenten Hefezellen (bis Punkt 9 des folgenden Protokolls) werden von
einer Gruppe für den gesamten Kurs durchgeführt. Dieses Protokoll ist für die Präparation von
kompetenten Zellen für bis zu 12 Gruppen ausgelegt.
1. Tag
Der Hefestamm MaV203 wird in 30 ml YPD-Vollmedium bei 30°C und 150 rpm im Schüttler
für ca. 16 h angezogen.
2. Tag
1. 250 ml YPD-Medium (1 l Schikane-Kolben) mit der üN-Kultur auf eine OD600 von 0,125
inokulieren
2. Bei 30°C und 150 rpm im Schüttler bis zu einer OD600 von 0,4-0,6 wachsen lassen (ca. 4 –
4,5 h)
3. Zellen im Beckman JA-14 Rotor bei RT mit 6000 rpm für 5 min abzentrifugieren.
Vorsicht: Sediment ist sehr weich  zügig arbeiten.
4. Zellsediment in 100 ml sterilem Wasser waschen.
5. Zellen bei RT mit 6000 rpm im Beckman JA-14 Rotor für 5 min abzentrifugieren.
Restflüssigkeit abpipettieren
6. Sediment in 12 ml 100 mM LiAc-Puffer pH 7,5 aufnehmen und in ein 15 ml
Zentrifugenröhrchen überführen
7. Zellen bei RT mit 2000 rpm in der Heraeus Varifuge (oder große Eppendorf-Zentrifuge)
für 5 min abzentrifugieren
8. Zellsediment in 1,4 ml 100 mM LiAc pH 7,5 suspendieren. Für die vier Transformationen
werden von jeder Gruppe von dieser Zellsuspension 100 µl benötigt.
9. Ab diesem Schritt arbeitet jede Gruppe mit ihren eigenen Ansätzen. In einem EppendorfGefäß folgende Komponenten vorlegen und durch vortexen vollständig mischen
800 µl 50% (w/v) PEG 3350 (sehr viskos  langsam pipettieren)
120 µl 1,0 M LiAc, pH 7,5
166 µl ssDNA (2 mg/ml Heringssperma carrier DNA; hitzedenaturiert)
Versuch 7
61
10. 100 µl Zellsuspension aus Schritt 8 zugeben und durch vortexen gut mischen
11. Plasmidkombinationen in sterile Eppendorf-Gefäße vorlegen (je Plasmid 4 µl einer Lösung
mit einer Konzentration von 100 ng/µl). Pro Ansatz 270 µl der Zellsuspension aus Schritt
10 zugeben. Kurz vortexen.
12. Für 30 min bei 30°C ohne Schütteln inkubieren (Heizblock)
13. Für 20 min bei 42°C Hitzeschock geben (Heizblock)
14. Bei RT mit 2000 rpm in der Eppendorf Tischzentrifuge für 2 min abzentrifugieren. Das
Zellsediment ist u. U. schwer zu sehen und zieht sich an der Gefäßwand nach oben
15. Überstand vorsichtig abpipettieren und Zellsediment vorsichtig durch Pipettieren (mit
blauer Pipettenspitze und P1000) in 0,1 ml sterilem H2O suspendieren.
16. gesamte Suspension vorsichtig auf einer SC-Leu-Trp Platte ausbringen (Zellen mit dem
Drygalski-Spatel nur verteilen und nicht bis zur Trockne einmassieren). Die Hefeplatten
werden bei 30°C inkubiert.
II) Test auf Aktivierung der Reportergene - Auxotrophiereporter
6. Tag
Wenn die Transformanten auf den Platten gewachsen sind, werden wir jeweils 2 Kolonien in einem
Einzelkolonieausstrich auf SC-Leu-Trp-Platten ausstreichen (2 Platten hierzu in jeweils vier
Sektoren einteilen).
8. Tag
Von diesen Verdünnungsausstrichen werden wir jeweils eine Kolonie großflächig auf folgende
Medien überstreichen (Platten in 8 Sektoren teilen):
1) SC-Leu-Trp-Ura: Test auf Aktivierung des URA3-Gens
2) SC-Leu-Trp-His +25 mM 3-AT: Test auf Aktivierung des HIS3-Gens
3) YPD-Vollmedium mit sterilem Nitrocellulosefilterpapier belegt: Für den ß-Galactosidase-Test
III) Test auf Aktivierung der Reportergene - ß-Galactosidase-Test
10. Tag
Wenn die Zellen auf der Vollmediumplatte gut angewachsen sind, wird der Nitrocellulosefilter
mit einer Pinzette von der YPD-Platte abgenommen und für eine Minute getrocknet.
Anschließend wird er für 30 Sekunden in flüssigen Stickstoff getaucht um die Hefezellen
aufzuschließen (beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff müssen Kittel, Handschuhe und
eine Schutzbrille getragen werden!). Zwei Whatman 3MM-Filterscheiben werden passend
geschnitten und in eine Petrischale gelegt. Darauf wird der Filter mit den aufgebrochenen
Hefezellen gelegt, und dann werden 5 ml X-Gal-Puffer zugegeben. Die Petrischale (mit
Deckel) wird mit Parafilm umwickelt und bei 37°C inkubiert. Dabei sollte der Verlauf der
Färbung nach ca. 15’, 30’ und nach ca. 1,5 h überprüft werden.
62
Versuch 7
Zeitplan
Tag 1: Saccharomyces cerevisiae Vorkultur
Tag 2: Transformation von S. cerevisiae
Tag 6: Einzelkolonieausstrich
Tag 8: Ausstrich auf Selektivmedien
Tag 10: ß-Galactosidase-Test
7.5 Protokoll
Entsprachen das Wachstum auf den Selektivmedien sowie der ß-Gal-Test für alle Ansätze den
Erwartungen? Konnte eine Interaktion von dE2F und dDP nachvollzogen werden?
Protokoll
63
Richtlinien für das Anfertigen des Protokolls
Jede Gruppe gibt ein Protokoll ab, wobei die beteiligten Gruppenmitglieder (normalerweise 2)
jeweils voll verantwortlich für den gesamten Text zeichnen. Das Protokoll muss auch als
pdf-Datei abgeliefert werden. Wer keine Möglichkeit hat pdf Dateien zu erstellen, kann dies
am Lehrstuhl erledigen (lassen). Zur Einhaltung der Abgabefrist reicht die zeitgerechte E-Mail
mit der Protokoll-Datei an [email protected] oder [email protected]. Eine identische gedruckte Version muss aber binnen 1 Woche nachgeliefert
werden.
1. Die Beschreibung eines jeden Experiments gliedert sich in folgende Teile:
- Einleitung
Darstellung der Theorie und der Zielsetzung des Versuches
- Experimentelle Durchführung
Hier werden nur etwaige Änderungen zum Skript angegeben
- Ergebnisse
der rote Faden des experimentellen Vorgehens muss nachvollziehbar dargestellt werden
- Diskussion
Die Ergebnisse werden im Hinblick auf die theoretischen Grundlagen und die zu
erwartenden Daten diskutiert. Da aus Zeitmangel (und zum Teil auch aus finanziellen
Gründen) oft keine statistisch abgesicherten Zahlen erhalten werden, ist dann die
Darstellung der Daten aller Gruppen notwendig.
2. Die Seiten des Protokolls sollten durchnummeriert werden.
3. Folgende und sinngemäße Schreibweisen sind zu vermeiden, da sie unwissenschaftlich sind:
- das Experiment hat geklappt
- der Bakterientiter war recht hoch, aber im Rahmen
- Zellen wuchsen in recht hohem Maße auf Minimalmedium
- dieses Ergebnis ist recht gut
- die Präparation der SPP1-DNA verlief mit akzeptabler Ausbeute
 keine Wertung der Experimente!
4. Auf ausreichende Größe der Abbildungen achten. Schwarze/Weiße Ränder bei Gelfotos im
Bildbearbeitungsprogramm wegschneiden. Markerbanden und Gelspuren müssen
64
Protokoll
beschriftet werden. Gegebenenfalls die Abbildungen ausrichten (keine „schiefen“ Gelfotos
abbilden)
5. Abbildungslegenden müssen ausreichen, das in der Abbildung dargestellte Experiment zu
verstehen. Legenden wie „Abb.3. Agarosegel“ sind völlig unzureichend. Alles was an
Sternchen, Pfeilen etc. auf/an einer Abbildung zu sehen ist, muss in der Legende erklärt
werden.
6. Abschreiben (Plagiarismus) ist kein Kavaliersdelikt und wird nicht geduldet. Es dürfen
keine Textpassagen aus ungenannten Quellen (Internet, andere Protokolle) per „copy
und paste“ oder Abtippen in das eigene Protokoll eingefügt werden. Plagiate führen zur
Abwertung; in ausgeprägten Fällen bis zur Vergabe der Note 5,0 für das Protokoll.
7. Schriftgröße 12 pt., 1,5 Zeilen Abstand, ca. 2,5 cm Rand;
Umfang: ca. 30 bis maximal 40 Seiten.
Korrekte Schreibweise
E. coli; S. cerevisiae (kursiv, Leerzeichen)
gyrA, lacZ (kursiv, keine Leerzeichen)
50 min, 20 kDa, 3 kb (immer Leerzeichen)
Lac-Repressor, Lac+-Phänotyp
dnaK-Gen, DnaK-Protein
Northern-Blot, E. coli-Stamm, B. subtilis-Knockout (Bindestrich)
wildtypische Allele von S. cerevisiae-Genen: z.B. URA3
mutante Allele von S. cerevisiae-Genen: z.B. ura3-1
Proteine aus S. cerevisiae: Ura3 (oder Ura3p)
Protokoll
65
Weitere Anmerkungen
- keine verwaisten Gliederungspunkte; wenn es 1.1.1 gibt, muss es auch 1.1.2 geben.
- strikt darauf achten was DNA und was Protein ist.
falsch: EGFP wurde in den Vektor pQE30 kloniert...
richtig: Die für EGFP kodierende DNA-Sequenz wurde in den Vektor pQE30 kloniert...
- DNA-Sequenzen: Schriftart Courier New verwenden. Dies ist keine Proportionalschrift und
deswegen geeignet für Sequenzalignments. Die meisten anderen Schriften sind
Proportionalschriften und räumen einzelnen Buchstaben unterschiedlichen Platz ein. Dann
sehen Sequenzalignments schrecklich aus.
Beispiel (doppelsträngige Sequenz; beide Sequenzen sind identisch):
1) Courier New
AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGGGGGG
2) Times New Roman
AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGGGGGG
- auf prägnante Schreibweise achten. Viele Sachverhalte können knapp und trotzdem
vollständig und verständlich dargestellt werden.
z.B.: „Die Restriktionshydrolyse des Vektors pQE30 und die Effizienz der Gelelution des
EGFP-kodierenden DNA-Fragmentes wurden über Agarosegelelektrophorese überprüft. Das
Ergebnis der Elektrophorese unserer Proben, zusammen mit den Proben der Gruppen B-D, ist
auf der folgenden Seite in Abb. 3 gezeigt“
schnörkellos und völlig ausreichend wäre:
„Die Restriktionshydrolyse des Vektors pQE30 und die Effizienz der Gelelution des EGFPkodierenden DNA-Fragmentes wurden über Agarosegelelektrophorese überprüft (Abb. 3)“.

Skript Praktikum Gentech 2014-15_1202

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