MRSA - rationale und rationelle Diagnostik

DIAGNOSTIK
MRSA - rationale und rationelle Diagnostik
Klaus Oberdorfer, Hygiene-Institut der Universität Heidelberg (jetzt Labor Limbach und Kollegen, Heidelberg)
Constanze Wendt, Hygiene-Institut der Universität Heidelberg
Vortrag gehalten von Frau Prof. Constanze Wendt anlässlich der Frühjahrstagung des Berufsverbandes der Ärzte
für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie 7.4.2006 im Sparkassen Kongresszentrum am Templiner See in
Potsdam
Einleitung
Die zunehmende Ausbreitung von MRSA in den letzten 8
Jahren, besonders in Deutschland, veranlasste das RobertKoch Institut zu konkreteren Empfehlungen bezüglich
eines MRSA-Screenings [1]. Dafür ist eine schnelle und
sensitive Diagnostik erforderlich. Auf zwei interessante
Entwicklungen der letzten Jahre, die sich diesbezüglich
ergänzen, soll im weiteren genauer eingegangen werden.
Es sind dies das Screening mittels PCR direkt vom Tupfer
(Teil 1) und die Anzucht mittels chromogener Selektivmedien (Teil 2). Zu beiden Neuerungen wurden eigene
Untersuchungen durchgeführt.
Teil 1:
MRSA-Aufnahmescreening mittels Single-Locus
Real-Time PCR bei Intensivpatienten
Einleitung
Einer der effektivsten Wege die Ausbreitung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) zu vermindern ist der schnelle Nachweis des Keimes in klinischen Proben, wodurch die sofortige Umsetzung von
Hygienemaßnahmen erfolgen kann [3,4]. Ein Screening
mittels kultureller Anzucht und Differenzierung dauert
jedoch 2 bis 3 Tage, daher wird eine schnellere Methode,
wie die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) benötigt [5].
Am schnellsten erhält man ein Ergebnis durch eine PCR
direkt vom Abstrichtupfer ohne vorangehenden Anzuchtschritt. Die ersten PCR Teste zum direkten MRSANachweis aus klinischen Proben wiesen zwei unterschiedliche Genlokalisationen nach, das mecA Gen, welches für
das Penicillin-bindende Protein 2a kodiert und ein
S. aureus-spezifisches Genomfragment, wie z.B. nuc,
welches für die Thermonuklease kodiert. In Proben, die
eine Mischung aus Methicillin-sensiblen S. aureus
(MSSA) und mecA tragenden Methicillin-resistenten
koagulase negativen Staphylokkken enthalten, können
jedoch falsch positive Ergebnisse in der PCR auftreten [6].
Durch Erweiterung mit spezifischen Primern für Koagulase-negative Staphylokokken ist es möglich abzuschätzen
wie häufig die oben genannte Mischung auftritt und zu
uneindeutigen Ergebnissen führt. In einer Studie fand
Eigner et al. [7], dass in bis zu 27 % (167 von 619) der
untersuchten Tupfer ein S. aureus-spezifisches Gen, ein
Staphylococcus epidermidis-spezifisches Gen und das
mecA-Gen nachweisbar waren. Davon bestätigte sich ein
MRSA jedoch mittels Anzucht nur in 29 % (49 von 167)
der Abstriche. Um dieses Problem zu umgehen, nutzten
einige Autoren eine selektive Übernacht-Anreicherung mit
anschließendem Nachweis von mecA. Diese Methode
zeigte gute Werte für Sensitivität und Spezifität, ist jedoch
zeitaufwändig, und die Ergebnisse liegen nicht am gleichen Tag vor [8-10]. Francois et al stellte ein interessantes
Verfahren mit immunmagnetischem Anreicherungsschritt
vor, aber bis jetzt wurde diese Methode nur mit vergleichsweise wenigen Abstrichen durchgeführt [11].
Auf der Basis von Sequenzstudien des mecA tragenden
Genelementes, bekannt unter dem Namen Staphylococcal
cassette chromosome mec (SCCmec) [12], wurde eine
neue MRSA-spezifische single-locus PCR entwickelt
(IDI-MRSA; Infectio Diagnostic, Sainte-Foy, Québec,
Canada) [13]. Dieser Test wurde auf ein Real-Time Cycler
Gerät angepasst (Smart-Cycler II; Cepheid, Sunnyvale,
CA, USA) und wurde im Mai 2004 von der U.S. Food and
Drug Administration (FDA) zugelassen. Dieser Test wurde zertifiziert durch die Europäische Kommission (CEKennzeichnung) und ist seit Januar 2005 in Europa erhältlich, mittlerweile unter dem Namen BD GeneOhm™
MRSA Test. Initial wurde der Test nur in Patientenpopulationen mit relativ hoher MRSA-Prävalenz von 18-25 %
angewendet [14 und IDI-MRSA Testanleitung, 2005,
DMR03-S5-M02, S. 11-13, www.geneohm.com]. Solch
hohe Raten treten jedoch in Deutschland in den meisten
Hochrisiko-Populationen nicht auf. Das Ziel der Studie
war es, den neuen IDI-MRSA Test in einer Patientenpopulation mit niedrigerer MRSA-Prävalenz zu evaluieren und
die Real-Time PCR mit der direkten Anzucht aus klinischem Material als konventionelle Screening-Methode zu
vergleichen.
Material und Methoden
Es wurden Abstriche von Patienten von drei Intensivstationen (Fachbereiche : Herzchirurgie, Bauchchirurgie mit
Lebertransplantation, Innere Gastroenterologie) und einer
Intermediate Care Station (Gastroenterologie) untersucht.
Die Vorgabe für den Studienzeitraum war, alle neu aufgenommenen und von anderen Stationen zuverlegten Patienten zu untersuchen. Das Screening bestand aus einem
Nasenabstrich für die Untersuchung mittels Real-Time
PCR. Hierzu wurden Tupfer mit flüssigem Stuart Medium
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als Transportmedium verwendet (Venturi Transsystem;
Copan Diagnostics, Corona, CA, USA). Zusätzlich wurden Tupfer mit festem Amies Medium (Medical Wire &
Equipement, Corsham, Bath, England, oder MEUS, Piove
di Sacco, Italien) für Abstriche von Nase, Rachen und
falls vorhanden von Wunden entnommen. Diese Proben
wurden für das MRSA-Screening mittels kultureller Anzucht verwendet. Wundabstriche wurden nur von chronischen Wunden oder vorbestehenden Hautläsionen entnommen und nicht von frischen chirurgischen Wunden.
Real-Time PCR für den MRSA-Nachweis mittels IDIMRSA Test
Die Proben, welche für die PCR vorgesehen waren, wurden täglich, von Montag bis Freitag, ab 11 Uhr verarbeitet. Die Ergebnisse wurden den Intensivstationen zwischen
14 bis 17 Uhr am gleichen Tag mitgeteilt. Die PCR Untersuchung wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt [www.geneohm.com,14]. Nach dem Vortexen des
Tupfers in 1ml eines Probenpuffers, kamen nach Zwischenschritten 50 µl zur Lyse und davon nach weiteren
Schritten 2,8 µl zum Einsatz in Smart-Cycler spezifische
PCR Reaktionsgefäße. Die Laufzeit der PCR Komponente
des Tests betrug 60 min (45 Zyklen). Die PCR wurde für
einzelne Proben wiederholt, wenn die interne Kontrolle
aufgrund von Inhibitoren ungültig war oder wenn die
Positiv- oder Negativkontrollen des Laufes nicht entsprechend ausfielen.
MRSA-Screening mittels kultureller Anzucht
Die Proben für die MRSA-Anzucht wurden sofort nach
Ankunft im Labor angelegt. Die Ergebnisse wurden innerhalb von 3 Tagen weitergegeben. Die Tupfer wurden
auf Columbia Agar mit 5% Schafblut und auf KochsalzMannit Agar (beide Medien von Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) angelegt und bei 36°C für 48 h
bebrütet. Zusätzlich wurde mit jedem Tupfer eine Anreicherungsbouillon ohne Selektivantibiotika (CaseinpeptonSojamehlpepton-(CASO-) Bouillon, Merck, Darmstadt,
Deutschland) beimpft und bei 36° für 48 h bebrütet. Eine
Identifizierung verdächtiger Kolonien erfolgte mittels
Latex-Agglutination (Pastorex Staph Plus; bioMérieux,
Marcy l´Etoile, Frankreich) und dem Nachweis der freien
Koagulase (Kaninchenplasma, bioMérieux). Die Oxacillin-Testung erfolgte, wie vom Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, vormals NCCLS) vorgegeben,
auf Mueller-Hinton Agar mit 6 mg/l Oxacillin und 4%
NaCl, bei einer Inkubation über 24 h bei 30°C [15].
Nachweis von mecA und nuc Gen mittels PCR
Bei diskrepanten Fällen zwischen Real-Time PCR und
kultur-basiertem Screening, wurde das angezüchtete Isolat
mittels Multiplex-PCR auf das Vorhandensein von mecA
und nuc Gen untersucht. Für den Nachweis des mecA
Gens wurden folgende Primer benutzt: mecA1, 5′GTTGTAGTTGTCGGGTTTGG-3′, und mecA2, 5′CGGACGTTCAGTCATTTCTAC-3′ [16]. Die eingesetzten Primer für den Nachweis des nuc Gens waren 5′AATCTTTGTTCCTACACGATATTC-3′ für Sa442-1
und 5′-CGTAATGAGATTTCAGTAGATAATACAACA3′ für Sa442-2 [17]. Der Nachweis von PCR-Produkten
erfolgte nach Elektrophorese im Agarosegel.
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Statistische Auswertung
Die Sensitivität, Spezifität, der positive prädiktive Wert
und der negative prädiktive Wert der Real-Time PCR von
Nasenabstrichen wurden errechnet im Vergleich zu den
Ergebnissen des kultur-basierten Screenings von der
Kombination aus Nasen-, Rachen und falls vorhanden von
Wundabstrichen und von Nasenabstrichen alleine.
Ergebnisse
Während des Studienzeitraums vom 11 Wochen wurden
Nasenabstriche von 320 Patienten mittels IDI-MRSA
gescreent. Zusätzlich wurden Nasen-, Rachenabstriche
von allen Patienten mittels kultureller Anzucht untersucht.
Wundabstriche waren von 12 (3,9%) der Patienten verfügbar. Es wurden 101 Patienten von der herzchirurgischen Intensivstation, 84 Patienten der bauchchirurgischen
Intensivstation, 95 Patienten der gastroenterologischen
Intermediate Care Station und 40 Patienten der gastroenterologischen Intensivstation untersucht. Zum Zeitpunkt der
Aufnahme bzw. Zuverlegung auf die Intensivstation, war
von 2 Patienten bekannt, dass sie mit MRSA kolonisiert
waren. Einer dieser Patienten bekam Mupirocin Nasensalbe, und die Abstriche wurden 4 Tage nach Beginn der
Behandlung durchgeführt. Im IDI-MRSA zeigte sich ein
positives Ergebnis, es konnte jedoch kein MRSA angezüchtet werden. Dieser Patient wurde aus der Auswertung
ausgeschlossen, da der Test nicht für das Monitoring von
Patienten unter Behandlung indiziert ist. Um die Sensitivität und Spezifität des Tests zu ermitteln, wurden nur die
Patienten mit auswertbarem Ergebnis in der Real-Time
PCR einbezogen. Bei 28 (8,8 %) der Nasenabstriche war
das Ergebnis der Real-Time PCR im ersten Lauf ungültig.
Dies wurde hervorgerufen durch die Anwesenheit von
Inhibitoren, da die internen Kontrollen negativ ausfielen.
Alle Proben mit ungültigen PCR Ergebnissen wurden auf
-20°C tiefgefroren und am nächsten Tag nachgetestet. Bei
13 von 28 Proben ergab sich dabei dann ein auswertbares
Ergebnis, wobei dies in allen Fällen negativ war. Für 15
Proben konnte auch bei der Nachtestung kein gültiges
PCR Ergebnis ermittelt werden. Es wurde jedoch bei keinem dieser Patienten ein MRSA mittels kultureller Anzucht nachgewiesen. Die Inhibitionsrate war abhängig von
der Testcharge. In der ersten Testcharge waren dies 23
von 207 (11,1%), während es in der zweiten Testcharge
nur 5 von 113 (4,4%) waren.
Von den 304 auswertbaren Proben, waren 288 PCR negativ und 16 PCR positiv. Mittels kultureller Anzucht konnte
bei 13 Patienten MRSA nachgewiesen werden, 12 davon
waren auch positiv im IDI-MRSA. Bei dem einen verbleibenden MRSA-positiven Patienten konnte MRSA nur im
Rachen- aber nicht im Nasenabstrich angezüchtet werden.
Die 13 MRSA-positiven Patienten waren folgendermaßen
besiedelt: 3 waren nur in der Nase MRSA-positiv, 8 waren
positiv in Nase und Rachen, einer in Nase, Rachen und
Wunde und einer war, wie erwähnt, nur im Rachen positiv.
S. aureus konnte in 90 Nasenabstrichen isoliert werden. 12
von diesen 90 Proben ergaben positive Ergebnisse im IDIMRSA und wurden als Methicillin-resistent mittels Oxacillin-Testung von den angezüchteten Kolonien bestätigt.
Von den verbleibenden 78 Proben waren 4 (5,1%) positiv
im IDI-MRSA, aber kulturell zeigten sich MSSA-Isolate.
Diese Isolate zeigten keine PCR-Banden bei der Untersuchung auf das mecA Gen. Resuspendierte Kolonien ergaben
Tabelle 1: Klinische Wertigkeit des IDI-MRSA Real-Time PCR Tests (durchgeführt mit Nasenabstrichen) im Vergleich zur
Kultur für den Nachweis von MRSA bei 304 Patienten
IDI-MRSA (Nasenabstriche)
Kultur von Nasen-, Rachen-,
und Wundabstrichen a
Kultur von Nasenabstrichen
alleine
Positiv
Negativ
Positiv
(MRSA)
12
1b
Negativ
4
287
Positiv
(MRSA)
12
0
Negativ
4
Sensitivität
Spezifität
PPV
NPV
92.3%
98.6%
75.0%
99.6%
100%
98.6%
75.0%
100%
288
PPV positiver prädiktiver Wert, NPV negativer prädiktiver Wert
a
Wundabstriche wurden untersucht, wenn verfügbar (n=12)
b
Wachstum von MRSA nur aus Rachenabstrich
jedoch ein positives Testergebnis mit dem IDI-MRSA
Test. Die Ergebnisse des IDI-MRSA für diese Patienten
wurden daher als falsch positiv gewertet.
Obwohl der IDI-MRSA Test nur aus Nasenabstrichen
durchgeführt wurde, zeigte er im Vergleich mit der kulturellen Anzucht von Nasen-, Rachen- und falls vorhanden
Wundabstrichen eine Sensitivität von 92,3%, eine Spezifität von 98,6%, einen negativen prädiktiven Wert von
99,6% und einen positiven prädiktiven Wert von 75%.
Wenn man nur die Ergebnisse der Nasenabstriche berücksichtigt, ergeben sich für den IDI-MRSA Test eine Sensitivität und ein negativer prädiktiver Wert von 100% und
eine Spezifität von 98,6% (Tabelle 1).
Diskussion
Die MRSA-spezifische single-locus PCR ist eine vor kurzem beschriebene Methode für den schnellen MRSANachweis direkt von Nasenabstrichproben. Bisher wurde
die klinische Wertigkeit dieses Tests an selektierten Patientenpopulationen aus der USA und aus Kanada mit relativ hohen MRSA-Prävalenzen untersucht [13 und IDIMRSA Testanleitung, 2005, DMR03-S5 –M02, S.11-13,
www.geneohm.com]. Die Ergebnisse unserer Studie,
welche bei Intensivpatienten aus Deutschland mit einer
geringeren MRSA-Prävalenz durchgeführt wurde, zeigte
weiterhin gute Daten für Sensitivitä, Spezifität und negativem prädiktivem Wert. Vor allem die hohe Sensitivität
dieses Tests ist hervorzuheben. In der Erstbeschreibung
des Tests erwähnt Huletsky et al [13] eine analytische
Sensitivität von ca. 25 KBE pro Nasenabstrich. Bei Verwendung einer Anzuchtmethode mit Anreicherungsschritt
als Vergleichsmethode fanden wir kein falsch negatives
Ergebnis mit dem IDI-MRSA. Sogar für einen Abstrich,
bei dem MRSA erst aus der Anreicherung nach 24 h anzüchtbar war, zeigte der IDI-MRSA ein positives Ergebnis. Dieser Test ist daher sehr gut geeignet, um eine
MRSA-Besiedlung zumindest in der Nase auszuschließen.
Einige Studien weisen darauf hin, dass die Untersuchung
verschiedener Körperstellen notwendig ist, um eine höhere Sensitivität beim Screening auf MRSA zu erreichen
[25-27]. In einer umfangreichen Studie zeigte Coello et al
[27], dass von den untersuchten 789 MRSA Patienten, nur
61% mit einem einzigen Nasenabstrich als positiv identifiziert worden wären. Bis jetzt wurde der IDI-MRSA Test
nur für Nasenabstriche zugelassen. Richtlinien zum
MRSA-Screening, wie diejenige welche kürzlich vom
Robert-Koch Institut herausgegeben wurde [1], empfehlen
jedoch, Nasen-, Rachen und Wundabstriche zu untersuchen. Daher entschieden wir uns, die Probenahmeorte zu
erweitern und auch Rachen- und wo möglich auch Wundabstriche für das MRSA-Aufnahmescreening zu verwenden. Wie wichtig die Untersuchung mehrerer Körperstellen ist, zeigte sich dadurch, dass bei einem der 13 MRSApositiven Patienten in unseren Studie, MRSA nur im Rachenabstrich nachzuweisen war. Die erhöhte Sensitivität
von ca. 8% (1 von 13) entspricht ziemlich gut den bisher
veröffentlichten Daten [27]. Für Wunden kann keine verwertbare Aussage getroffen werden, da die Anzahl der
Abstriche zu gering war.
Die Abarbeitung der Proben für die Real-Time PCR nach
den Herstellerangaben führte in eine Testcharge zu eine
Inhibitionsrate von bis zu 11 %. Dies trat häufiger bei
Abstrichen auf, welche makroskopisch mit Blut oder Nasensekret kontaminiert waren. Unserer Meinung nach
wäre es wünschenswert, die in der FDA-Zulassungsstudie
festgestellte und in der Testanleitung zitierte Inhibitionsrate von 4,5% noch weiter zu senken.
Es ist hervorzuheben, dass in der Population der 320 untersuchten Intensivpatienten, bei 4 von 16 positiven Ergebnissen im IDI-MRSA, MSSA isoliert werden konnte,
und damit 4 falsch positive Ergebnisse resultierten. In
unserer Studie stellt dies 5,1% (4 von 78) aller angezüchteten MSSA-Isolate dar. In der Erstbeschreibung des IDIMRSA Tests durch Huletsky et al [13], wurden ein Anteil
von 4,6% (26 von 569) an falsch positiven MSSA Isolaten
genannt. Dies wurde erklärt durch die Anwesenheit von
verbleibenden SCCmec right extremity Fragmenten nach
einer Deletion einer chromosomalen Region, welche
mecA enthält, oder durch das Vorhandensein anderer SCC
Elemente, welche kein mecA enthalten. In unserer Studie
hatte kein Patient mit einem im IDI-MRSA Test falsch
positiven MSSA Isolat Hinweise auf eine ehemalige
MRSA-Besiedlung. Weitere Untersuchungen sind bereits
im Gange um solche Isolate zu sammeln und zu charakterisieren [Schuett S, Frey M, Oberdorfer K, Eigner U, Jonas D, Regnath T, von Baum H, Heeg K, Wendt C. Prevalence of Mec right extremity junction (MREJ) in Methicillin-susceptible S. aureus (MSSA). Poster SYP11, 58.
DGHM-Jahrestagung (2006), Würzburg].
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Aufgrund der 4 falsch positiven Ergebnisse, lag der positive prädiktive Wert für den IDI-MRSA nur bei 75%. Dies
ist jedoch noch deutlich höher als die 40-60%, die für
PCR-Teste berichtet wurden, welche separate Genlokalisationen für S. aureus- und mecA Gene nachweisen
[6,28,29]. Dennoch empfehlen wir weiterhin positive IDIMRSA Ergebnisse durch die kulturelle Anzucht aus
Screening-Proben zu bestätigen. Im hiesigen Umfeld bevorzugten wir, Patienten mit IDI-MRSA positiven Ergebnissen so lange zu isolieren, bis die endgültige Bestätigung
der Ergebnisse erfolgte.
Zwischenzeitlich wurde ein Primer im IDI-MRSA Test
verändert. Dadurch soll ein Anteil falsch positiver Ergebnisse verhindert werden.
Die Kosten für das Screening mit der Real-Time PCR sind
vergleichsweise hoch, aber der Test hat eine kurze Abarbeitungszeit (ca. 90 min für 14 Proben), und die Ergebnisse sind sehr einfach zu interpretieren. In Anlehnung an die
Kosten-Nutzen Rechnung von Papia et al [30] und unseren eigenen krankenhaus-spezifischen Übertragungsdaten,
lag der finanzielle Nutzen ca. 5mal höher als die Kosten
des Screenings für die Intensivpatienten, auch wenn die
Kosten der zeitweisen Isolierung von Patienten mit falsch
positiven Ergebnissen miteinbezogen wurden.
Teil 2:
Vergleich von fünf Selektivmedien zum Nachweis
von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus
Einleitung
Die kulturelle MRSA-Diagnostik setzt sicht aus Anzucht,
Differenzierung und Resistenztestung zusammen. Es wurden immer wieder Versuche unternommen diese Schritte
zusammenzufassen, um deren Dauer zu verkürzen. Im
Jahr 2003 unternahmen Safdar et al eine prospektive Studie bezüglich des Nachweises von MRSA in Nasenabstrichen bei der sie 32 verschiedene kulturelle ScreeningMethoden verglichen [31]. Sie empfahlen, Abstrichproben
zur Anreicherung in eine CASO-Bouillon auszudrücken
und Kochsalz-Mannit basierte Agarplatten mit OxacillinPlättchen versehen zu beimpfen. Die gesamte Zeitdauer
für dieses Procedere lag bei 72 Stunden.
Seit kurzem wurden zwei interessante Verbesserungen in
die MRSA-Diagnostik eingeführt.
1. Es wurde festgestellt, dass chromogene Medien den
Nachweis und die Identifikation von S. aureus verbessern
können. Im Vergleich zu Kochsalz-Mannit-Agares zeigten
sie eine signifikant höhere Spezifität und Sensitivität vor
allem bei Abstrichen von Orten mit Mischflora [32, 33].
2. Es wurde nachgewiesen, dass Cefoxitin, ein Cephamycin, eine vielfach stärkere Induktion des mecA Regulator
Systems auslöst, als dies Penicilline tun [34]. Die Verwendung von Cefoxitin anstatt Oxacillin wurde initial von
Mugeot et al vorgeschlagen [35], weiter untersucht von
Felten et al [36] und wird nun von der amerikanischen
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, vormals NCCLS) für den Nachweis von mecA-vermittelter
Oxacillin-Resistenz bei S. aureus empfohlen.
Zurzeit bieten verschiedene Firmen Kombinationen von
S. aureus spezifischen chromogenen Medium mit Cefoxitin als Selektiv-Antibiotikum für den MRSA-Nachweis an.
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In Deutschland waren zu Beginn unserer Austestung fünf
solcher Medien verfügbar. Für einige der Kulturmedien
waren publizierte Daten zu Sensitivität und Spezifität
vorhanden [37-42], welche jedoch keinen direkten Vergleich all dieser Medien untereinander erlaubten. Das Ziel
unserer Austestung war es, die notwendige Inkubationszeit zu ermitteln sowie die Sensitivitäten und Spezifitäten
der verschiedenen Medien anhand von ScreeningAbstrichen zu vergleichen. Wir verglichen die neuen Medien mit unserer bisherigen diagnostischen RoutineVorgehensweise, welche bestand aus einer direkten Beimpfung von Blut- und Kochsalz-Mannit Agar in Kombination mit einer CASO-Anreicherungsbouillon, die auf
Kochsalz-Mannit Agar subkultiviert wurde.
Patienten und Methode
Die Abstriche wurden von Hochrisiko-Patienten des Universitätsklinikum Heidelberg gemäß den lokalen Screening-Empfehlungen entnommen, sowie von Patienten mit
bekannter MRSA Kolonisation. Die Screening Abstriche
der Patienten beinhalteten Abstriche von Nase, Rachen,
Leiste, Perineum und infizierten Orten.
Vier der Medien wurden von den Herstellern als Fertigplatten geliefert:
-
MRSASelect (BioRad, Marnes-la-Coquette, Frankreich)
- MRSA ID (bioMérieux, Marcy-l´Etoile, Frankreich)
- BBL CHROMagar MRSA (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) und
- MRSA-Ident-Agar Entwicklungscharge (heipha, Dr.
Müller GmbH, ein Mitglied der Biotest Gruppe, Eppelheim, Deutschland, nach einer persönlichen Information von heipha wurde das Rezept im Jahr 2006 optimiert um die Sensitivität zu steigern).
Ein Medium wurde selbst hergestellt anhand von dehydrierten
CHROMagar MRSA Pulver (CHROMagar Microbiology, Paris, Frankreich, lizensiert von MAST Diagnostika, Reinfeld, Deutschland) unter Zugabe von
cephamycinhaltigen Supplement (SU625).
Columbia Blutagar und Kochsalz-Mannit Aagar (beide
von Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) wurden
als Referenzmedien benutzt. Die Anreicherung erfolgte in
einer nichtselektiven CASO-Bouillon (Merck, Darmstadt,
Deutschland).
Es wurden für jedes der verschiedenen Testmedien zwei
Testmethoden durchgeführt, eine direkte Beimpfung der
Medien mit dem Tupfer und eine Beimpfung mittels Öse
aus der Anreicherungsbouillon. Die für die Anreicherungsmethode verwendete Charge des Testmediums von
bioMérieux wurde später von der Firma aufgrund eines
Herstellungsfehlers zurückgerufen. Daher sind die Ergebnisse nicht vergleichbar und im weiteren nicht dargestellt.
Direktbeimpfung mit Tupfer
Insgesamt wurden 829 konsekutive MRSA-Screeningabstriche ausgetestet. Um gleiche Chancen für jedes Testmedium aufrechtzuerhalten, wurde nur jeweils ein Testmedium zusätzlich zum Routine-Procedere beimpft. Die
Reihenfolge der Inokulation für die MRSA Screeningabstriche war wie folgt: zunächst wurde die Anreicherungsbouillon beimpft durch manuelles Ausschütteln für ca. 2-3
Sekunden und Ausdrücken des Tupfers am Rand des
Röhrchens, dann wurden der Tupfer auf den Blutagar, auf
das Testmedium und schließlich auf Kochsalz-Mannit
Agar ausgestrichen. Für jedes zu untersuchende Testmedium wurde eine Testreihe von mindestens 160 aufeinanderfolgenden MRSA-Screeningabstrichen angelegt. Das
Wachstum von verdächtigen Kolonien wurde nach Übernacht-Inkubation bei 36°C nach einem und nach zwei
Tagen beurteilt. Üblicherweise kamen die Screeningabstriche zwischen 14 und 17 Uhr im Labor an und die bebrüteten Platten wurden morgens zwischen 8 und 11 Uhr
beurteilt. Dies ergibt eine Inkubationszeit von 15 bis 18
Stunden für den ersten Tag und von 39 bis 42 Stunden für
den zweiten Tag. Für jeden Tupfer wurde die Anreicherungsbouillon übernacht bei 36°C bebrütet und bei Trübung am ersten Tag auf Kochsalz-Mannit Agar ausgesät.
Die ausgesäten Kochsalz-Mannit-Platten wurden für weitere zwei Tage bebrütet.
Beimpfung aus der Anreicherungsbouillon
Insgesamt wurden für 300 aufeinanderfolgende Tupfer,
10 µl von trüber Anreicherungsbouillon mit einer Öse auf
jede der fünf Testmedien und auf Kochsalz-Mannit Agar
ausgebracht. Alle Medien wurden bei 36°C inkubiert und
nach 24 Stunden und nach 48 Stunden beurteilt.
Identifikation von MRSA
Malvenfarbige Kolonien auf den Medien MRSASelect,
BBL CHROMagar MRSA, CHROMagar MRSA, MRSAIdent und grüne Kolonien auf MRSA ID wurden als mögliche MRSA Isolate gewertet. Auf Blutagar wurden typische weiß-gelbe creme pigmentierte Kolonien mit oder
ohne ß-Hämolyse und gelbe Kolonien auf KochsalzMannit Agar als mögliche S. aureus Isolate betrachtet.
Eine Bestätigung von allen verdächtigen Kolonien wurden
mittels Latex-Agglutination (Pastorex Staph-Plus, BioRad, Marne-la Coquette, Frankreich) direkt von der Platte
durchgeführt. Die Oxacillin-Testung erfolgte mittels
Mueller Hinton Agar mit 6 mg/l Oxacillin und 4% NaCl
(Oxacillin Screen Agar) gemäß Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, vormals NCCLS) [43]. Kolonien mit einer positiven Latex-Reaktion und Wachstum
auf Oxacillin Screen Agar wurden als MRSA gewertet.
Für jeden Patienten mit MRSA-Erstnachweis, wurde die
Diagnose mit einer positiven Koagulasereaktion (Kaninchenplasma, bioMérieux) und mit dem Ergebnis des kombinierten Panels zur Identifikation und zur Resistenztestung PMIC/ID-21 im BD Phoenix System (Becton Dickinson, Pont de Claix, Frankreich) bestätigt. MRSAverdächtige Kolonien auf einem der neuen Testmedien mit
negativer Latex-Reaktion wurden weiteruntersucht durch
Subkultur auf Blutagar und mittels Gramfärbung. Wenn
eine MRSA-verdächtige Kolonie nicht auf dem Oxacillin
Screen Agar (CLSI) wuchs, erfolgte eine Nachtestung mit
dem Phoenix Panel PMIC/ID-21.
Statistische Auswertung
Für die Direktbeimpfung wurde Sensitivität und Spezifität
für jedes Medium berechnet in Bezug auf die Ergebnisse
von Direktbeimpfung von Blutagar, Kochsalz-Mannit
Agar und des jeweils verwendeten cefoxitin-enthaltenden
Testmediums in Kombination mit dem Ergebnis der Anreicherung (Subkultur auf Kochsalz-Mannit Agar).
Für die Anlage aus der Anreicherungsbouillon wurden die
Ergebnisse der vier auswertbaren Medien verwendet. Die
Analyse wurde stratifiziert nach der Inkubationszeit. Das
95% Konfidenz-Intervall (CI95) wurde berechnet nach der
efficient-score Methode [44, Newscombe] mittels VassarStats (http://faculty.cassar.edu/lowry/clin1.html, 25.10.05).
Ergebnisse und Diskussion
Im Zeitraum zwischen Juli bis August 2005 wurden 829
Abstriche von 177 Patienten ausgewertet. Die MRSAPrävalenz bei den untersuchten Abstrichen betrug 16%
(CI95: 12,1 -20.7%). Die Prävalenz schwankte zwischen
14,3 % und 24,4 % zwischen den Testreihen der verschiedenen Testmedien, dennoch ergab sich kein signifikanter
Unterschied. Von den 829 untersuchten Abstrichen in der
Direktbeimpfung, waren 194 Nasenabstriche, 152 Rachenabstriche, 133 Leistenabstriche, 132 Abstriche der
Perinealregion, 23 Achselabstriche und 195 Abstriche
von Wunden oder anderen Orten. Die Verteilung der
Abstrichorte unterschied sich nicht signifikant zwischen
den Testreihen.
Sensitivität
Für die Direktbeimpfung sind in Tabelle 2 die Sensitivitäten von allen Testmedien nach einem (Inkubation für 15
bis 18 Stunden) und nach zwei Tagen (39 bis 42 Stunden)
dargestellt. Obwohl sich einige der Medien nach 15 bis 18
Stunden signifikant unterschieden, waren in unserer Austestung nach einer Inkubationszeit von 39 bis 42 Stunden
keine signifikanten Unterschiede zwischen den Testmedien mehr feststellbar, wie auch die sich überlappenden
95% Konfidenzintervalle zeigen. Da die Hersteller keine
genauen Informationen über die Inhaltsstoffe angeben,
sind die Gründe für die dennoch beobachteten Unterschiede hypothetisch. Sensititvitätsunterschiede zwischen den
Medien können entweder bedingt sein durch Wachstumsinhibitoren für MRSA Stämme oder wie durch Perry et al
[37] gezeigt wurde, durch die verschiedenen Eigenschaften der selektiven Inhaltsstoffen (außer Cefoxitin) das
Überwuchern der Begleitflora zu verhindern. Nach unseren Erfahrungen zeigen die Testmedien mit den höchsten
Sensitivitäten, nämlich MRSASelect (Bio-Rad) und
MRSA ID (bioMérieux), auch den Vorteil der besten
Unterdrückung der Begleitflora. Wie bereits von Stoakes
et al [42] erwähnt, ist dies vor allem bei der Untersuchung
von perianalen Abstrichen wichtig.
Die Beimpfung aus der Anreicherungsbouillon wurde
durchgeführt, um einen direkten Vergleich aller Testmedien nach definierten Bebrütungszeiten zu ermöglichen.
Die Sensitivitäten der verschiedenen Platten mit dieser
Methode sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die besten
Sensitivitäten zeigte MRSASelect.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die meisten der neuen
chromogenen Medien bessere oder zumindest gleiche
Sensitivitäten aufweisen als Kochsalz-Mannit Agar oder
Blutagar in Kombination mit Kochsalz-Mannit Agar (siehe auch Tabelle 2 und 3). In einigen Fällen konnte MRSA
leicht auf den Screening-Medien jedoch nicht auf den
direkt beimpften Blut und Kochsalz-Mannit-Agares nachgewiesen werden. Dies war in der Testreihe mit MRSASelect dreimal und in der Testreihe mit MRSA ID zweimal
der Fall. Ein MRSA war selbst nach Subkultur aus der
Anreicherungsbouillon nicht nachweisbar, sondern nur auf
dem direkt beimpften Selektivmedium MRSASelect.
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101
Tabelle 2: Sensitivitäten der verschiedenen Testmedien (Direktbeimpfung)
Medium
Anzahl an
getesteten Tupfern
Anzahl an
Tupfern mit MRSA
Sensitivät in %
95 % CI in %
MRSASelect (BR) Tag 1 *
166
21
84.0
63-95
MRSASelect (BR) Tag 2 †
166
23
92.0
73-99
Blut + KM Agar Tag 2
166
20
80.0
Blut + KM Agar + CASO auf KM Agar
166
24
96.0
Gesamt ‡
166
25
100
MRSA ID (BM) Tag 1
166
31
75.6
59-87
MRSA ID (BM) Tag 2
166
39
95.1
82-99
Blut + KM Agar Tag 2
166
37
90.2
Blut + KM Agar + CASO auf KM
Agar
166
41
100
Gesamt
166
41
100
BBL CHROMagar MRSA (BD) Tag 1
167
11
32.4
18-51
BBL CHROMagar MRSA (BD) Tag 2
167
27
79.4
82-99
Blut + KM Agar Tag 2
167
31
91.2
Blut + KM Agar + CASO auf KM
Agar
167
34
100
Gesamt
167
34
100
CHROMagar MRSA (MA) Tag 1
167
20
60.6
42-77
CHROMagar MRSA (MA) Tag 2
167
32
97.0
83-100
Blut + KM Agar Tag 2
167
32
97.0
Blut + KM Agar + CASOauf KM Agar
167
33
100
Gesamt
167
33
100
MRSA-Ident (HE) Tag 1
161
9
39.1
21-61
MRSA-Ident (HE) Tag 2
161
18
78.3
56-92
Blut + KM Agar Tag 2
161
18
78.3
Blut + KM Agar + CASO auf KM
Agar
161
23
100
Gesamt
161
23
100
* Tag 1: Bebrütungszeit 15-18 h, † Tag 2: Bebrütungszeit 39-42 h,
‡ Gesamt: Blut + KM Agar + CASO auf KM Agar + jeweilige Testmedium
KM Agar: Kochsalz-Mannit Agar, CASO: Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon
Tabelle 3: Sensitiväten der verschiedenen Testmedien (Beimpfung aus der Anreicherungsbouillon)
Medium
Anzahl an
getesteten Tupfern
Anzahl an
Tupfern mit MRSA
Sensitivät in %
95 % CI in %
MRSASelect (BR) 24 h
300
38
79.1
65-89
MRSASelect (BR) 48 h
300
41
85.4
72-93
BBL CHROMagar MRSA (BD) 24 h
300
30
62.5
47-76
BBL CHROMagar MRSA (BD) 48 h
300
32
66.6
52-79
CHROMagar MRSA (MA) 24 h
300
37
77.1
62-88
CHROMagar MRSA (MA) 48 h
300
40
83.3
69-92
MRSA-Ident (HE) 24 h
300
27
56.2
41-70
MRSA-Ident (HE) 48 h
300
28
58.3
43-72
KM Agar 24 h
300
31
64.6
49-77
KM Agar 48 h
300
32
66.7
51-79
Gesamt
300
48
100
102
MIKROBIOLOGE 18.Jg. 2008
Spezifität
Inkubationszeit
Alle neuen getesteten Medien waren hochspezifisch auf
MRSA. Dadurch werden die bisherigen Ergebnisse zu
MRSA ID, MRSASelect und CHROMagar MRSA [37,
42] ergänzt. Bei der Direktbeimpfungsmethode nach einem Tag bestätigten sich alle verdächtigen Kolonien als
MRSA, somit zeigten alle Testmedien eine Spezifität von
100%. Nach zwei Tagen lagen die Spezifitäten von
MRSASelect, MRSA ID, BBL CHROMagar MRSA,
CHROMagar MRSA und MRSA-Ident bei 99,3%, 97,6%,
99,3%, 99,3% und 100%. Insgesamt konnten nur 6 falsch
positive Kolonien auf allen getesteten Platten festgestellt
werden. Sogar nach Beimpfung aus der Anreicherungsbouillon zeigten sich Spezifitäten zwischen 97,6 und
100% ohne signifikante Unterschiede zwischen den Medien oder der Dauer der Inkubation. Die positiven prädiktiven Werte und die Differenzierungsergebnisse der falsch
positiven Kolonien für beide Beimpfungsmethoden sind in
Tabelle 4 dargestellt. Die Anzahl der falsch positiven
Kolonien ist sehr niedrig, sogar nach Beimpfung mit der
plurimikrobiellen Anreicherungsbouillon. Wenn ein weiterer Test wie z.B. eine Latex Agglutination zur Bestätigung von S. aureus verwendet wird, scheint es uns durchaus möglich, verdächtige Kolonien auf den neuen Testmedien als MRSA zu bezeichnen, zumindest bei
bekannten MRSA Trägern.
Es zeigte sich ein signifikanter Sensitivitätsanstieg bei
dem Vergleich der Ablesung nach einem Tag (Inkubationszeit 15 bis 18 Stunden) zur Ablesung nach zwei Tagen
(Inkubationszeit 39 bis 42 Stunden) für alle Medien bei
der Direktbeimpfung. Im Gegensatz dazu ergab sich nur
ein leichter Anstieg der Sensitivität von 2 bis 6 % für die
Ablesung von 24 h versus 48 h bei der Beimpfung aus der
Anreicherungsbouillon. Dies bestätigt die Empfehlung
von vielen Herstellern, eine Inkubationszeit von 20 bis 24
h für die Medien vor dem Ablesen einzuhalten. Dies dürfte jedoch für die meisten Laboratorien schwierig zu befolgen sein, ohne den üblichen Tagesablauf zu verändern.
Daher ist es unserer Meinung nach sinnvoll, die Medien
zwei Tage zu bebrüten. Wenn ein Anreicherungsschritt
verwendet wird, ist es durchaus möglich, die aus der
Bouillon beimpften Platten nur 24 h lang zu bebrüten.
Dadurch wird es möglich, die Zeitspanne der Abstrichauswertung auf zwei Tage zu reduzieren, selbst bei Einschluss eines Anreicherungsschrittes.
Im Gegensatz dazu waren 51% der verdächtigen Kolonien
auf Kochsalz-Mannit Agar bei der weiteren Testung
Methicillin-sensibel. Diese Beobachtung wurde schon
früher berichtet und führte zur Einführung von KochsalzMannit Agar mit Oxacillin-Supplementierung. Jedoch
berichtete Blanc et al [45], dass auch auf einer solchen
Platte fast die Hälfte aller verdächtigen Kolonien nicht
MRSA, sondern andere Spezies als S. aureus waren. Dadurch waren weitere zeitraubende Bestätigungsteste zur
Identifikation von S. aureus notwendig.
Dies ist die erste Studie, welche 5 verschiedene MRSA
Medien mit chromogenen Substanzen und Cefoxitin vergleicht. Aufgrund der hohen Anzahl an Medien entschlossen wir uns zu einer Austestung in Reihen. Wir verzichteten bewusst auf die häufig in Studien übliche Beimpfung
der Platten mittels gevortexter Bakteriensuspension, da
wir die in der Routinediagnostik übliche Direktbeimpfung
der Platten verwenden wollten. Zum Ausgleich der Variation zwischen den einzelnen Testreihen aufgrund von
unterschiedlichen MRSA-Prävalenzen nutzten wir Konfidenz-Intervalle. Jedoch zeigen auch andere Studien hohe
Sensitvitäten der Medien die unseren Ergebnissen vergleichbar sind (siehe auch Tabelle 5) [37, 41, 42].
Tabelle 4: Positive prädiktive Werte (PPW) und Differenzierungsergebnisse der falsch positiven Kolonien auf den verschiedenen Testmedien
Direktbeimpfung *
Beimpfung aus der Anreicherungsbouillon †
Medium
PPW
%
PPW
%
Falsch positive Kolonien
MRSASelect (BR) Tag 1
100
95.0
2x gram neg. Stäbchen
MRSASelect (BR) Tag 2
95.8
93.2
+ 1x KNS
MRSA ID (BM) Tag 1
100
MRSA ID (BM) Tag 2
92.9
BBL CHROMagar MRSA (BD) Tag 1
100
BBL CHROMagar MRSA (BD) Tag 2
96.4
CHROMagar MRSA (MA) Tag 1
100
CHROMagar MRSA (MA) Tag 2
97.0
Falsch positive Kolonien
1x Enterokokken
Nicht auswertbar
1xMSSA, 2xCNS
Nicht auswertbar
90.3
1x gram neg. Stäbchen
3x gram neg. Stäbchen
91.4
100
1x KNS
95.2
2x MSSA
MRSA-Ident (HE) Tag 1
100
96.4
1x MSSA
MRSA-Ident (HE) Tag 2
100
82.3
+5x MSSA
Gesamt Tag 1
100
0
95.6
6
Gesamt Tag 2
95.8
6
90.5
6
* Anzahl der getesteten Tupfer mit der Direktbeimpfung: 166, 168, 167, 167 und 161
† Anzahl der getesteten Tupfer mit Beimpfung aus der Anreicherungsbouillon: 300,
MSSA: methicillin-sensibler Staphylococcus aureus,
KNS: Koagulase-negative Staphylokokken
MIKROBIOLOGE 18.Jg. 2008
103
104
MIKROBIOLOGE 18.Jg. 2008
gemischt *
2
ORSAB, SMB
Tupfer in 750 μl
NaCl, 50 μl auf alle
Medien
22-24h
Nachweisorte
Anzahl chromogener Medien
Zusatzliche Medien (Vergleichsmedien) †
Beimpfungsmethode
Sensitivität nach:
59%
72%
89%
82%
1
Nase
95.2%
48 h
146 (7.2 %)
2015 (?)
82.9%
n.e.
97.3%
74.8%
48 h
>18 h
Tupfer 400 μl NaCl, 50
μl auf alle Medien
MSA-OXA, MSA-CFOX
2
Nase, perianal
111 (5.2%)
1243 (?)
2125
Stoakes et al. (2006)
97.0%
78.3%
39.1%
79.4%
95.1%
92.0%
60.6%
32.4%
75.6%
84.0%
15-18 h 39-42 h
Tupfer in
1. TSB 10ml, dann auf
2. Blut
3. ein chromogees Medium
4. KM Agar
TSB, Columbia Blutagar, KM Agar
5 in 5 Testreihen
gemischt *
Gesamt:156 (16.0%)
5 Testreihen mit
25, 41, 34, 33, 23
Gesamt:177
Gesamt:829, 5 Testreihen:
166,168,167,167,161
Eigene Austestung
Direktbeimpfung
56.2%
77.1%
62.5%
79.1%
24 h
58.3%
83.3%
66.6%
85.4%
48 h
Tupfer in TSB 10 ml, 10
μl von 18 bis 24 h bebrüteter TSB auf alle
Medien
MSA
4
Gemischt *
48 (16%)
300
Eigene Austestung
Anreicherung
* Nachweisort gemischt: Nase, Rachen, Axilla, Leiste, Perineum, Wunden
† Zusätzliche Medien: ORSAB (Oxacillin-Resistant Screening Agar Base, Oxoid), SMB: Selective mannitol broth with colistin, Aztreonam und Cipro-floxacin bebrüted für 22 bis 24 h und bei Farbumschlag,
Aussaat auf Columbia Blut Agar (Inkubation 22 bis 24 h),
TSA II: Tryptic soy Agar II (BD Diagnostics), MSA-OXA: Mannitol Salt agar mit Oxacillin (6 mg/l) (Oxoid), MSA-CFOX: Mannitol Salt agar mit Cefoxitin (2mg/l) (Oxoid), TSB: Tryptic Soja Bouillon
bebrütet für 15 to 18 h und bei Trübung, Aussaat auf KM Agar (Inkubation 2 Tage)
MRSA-Ident
CHROMagar MRSA
BBL CHROMagar MRSA
MRSA ID
80 %
24 h
85 (11.4 %)
Anzahl an nachgewiesenen MRSA
MRSASelect
Tupfer auf
1. TSA II
2. Chromogen es
Medium
205
Anzahl Patienten
48 h
TSA II
747
Anzahl Proben
2015
Perry et al. (2004)
Flayhart et al.
(2005)
Vergleichsstudien chromogener Medien zum Nachweis von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus aus klinischen Proben
Studie
Tabelle 5:
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die neuen
selektiven Medien entscheidende Vorteile gegenüber
Kochsalz-Mannit Agar und Blutagar bei dem Nachweis
von MRSA aufweisen. Obwohl wir leichte Unterschiede
in der Sensitivität der Medien feststellten, zeigten doch
alle von Ihnen eine sehr hohe Spezifität. Sie erlauben die
Nachweisdauer auf zwei Tage zu reduzieren sogar mit
Einschluss eines Anreicherungsschrittes.
Zusammenfassende Schlussfolgerungen
Die beiden hier vorgestellten neuen Entwicklungen im
Bereich des MRSA-Screenings, das direkte Screening
mittels PCR vom Tupfer und die selektive Anzucht mittels
chromogener Selektivmedien innerhalb von 2 Tagen,
stellen zwei Methoden dar, die die bisherige MRSADiagnostik erheblich beschleunigen können aber gleichzeitig eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweisen.
Nach Meinung der Autoren, sollte das MRSA-Screening
zukünftig ein chromogenes Medium einschließen. Ob die
zusätzliche Verwendung eines PCR-Verfahrens sinnvoll
ist, muß in Kosten-Nutzen-Analysen für einzelne Institutionen, bzw. einzelne Patientenpopulationen festgestellt
werden.
Danksagung
Wir möchten Frau A. Heller, K. Mortag, und H. Zyprian
für die hervorragende technische Durchführung der Austestungen danken. Die Medien von Bio-Rad, bioMérieux
und heipha wurden kostenlos von den Herstellern zur
Verfügung gestellt, die Medien von BD und MAST wurden zur Austestung für die Hälfe des Listenpreises überlassen.
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Korrespondenzadressen:
Dr. med. Klaus Oberdorfer
Labor Limbach und Kollegen
Im Breitspiel 15
69126 Heidelberg
Mail: [email protected]
Prof. Dr. med. Constanze Wendt
Hygiene-Institut der Universität Heidelberg
Im Neuenheimer Feld 324
69120 Heidelberg
Mail: [email protected]