Interaktion von bovinem PrP mit Plasminogen bzw

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Interaktion von bovinem PrP mit Plasminogen bzw.
Plasminogen-Fragmenten
Inauguraldissertation
der Philosophisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität Bern
vorgelegt von
Monika C. Schermbach
von Ingenbohl (SZ)
Leiter der Arbeit:
Prof. Dr. Christoph Kempf
Departement für Chemie und Biochemie, Universität Bern
Die vorliegende Arbeit wurde von der ZLB Behring AG unterstützt und von Dezember 2001
bis November 2004 unter der Leitung von Prof. Dr. Christoph Kempf am Departement für
Chemie und Biochemie der Universität Bern durchgeführt.
Speziellen Dank gebührt Prof. Dr. Christoph Kempf für die Ermöglichung der
Forschungsarbeit und die Betreuung und Unterstützung während meiner Dissertation.
Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei Prof. Dr. Johann Schaller, dessen Infrastruktur und
Know-how einen grossen Teil zum Gelingen meiner Arbeit beigetragen hat.
Einen herzlichen Dank an Dr. Fabian Käsermann, der für die Sorgen und Nöte einer
Doktorandin immer ein offenes Ohr (und oft auch eine passende Problemlösung) hatte.
Herrn Urs Kämpfer möchte ich für die zahllosen durchgeführten Analysen, die Unterstützung
beim Entdecken neuer Methoden und Tricks der Proteinchemie und die interessanten
Diskussionen danken.
Ein „Merci“ auch an Rita, Carlos, Mani, Claudia, Christian, Michael, Simon und Selina für
die gute Zusammenarbeit und die anregenden Gespräche während der letzten drei Jahre.
Last but not least möchte ich mich ganz herzlich bei meiner Familie bedanken, welche mich
zu jeder Zeit unterstützt und motiviert hat.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen.............................................................VIII
1. Zusammenfassung................................................... 1
2. Einleitung................................................................ 4
2.1 Prion............................................................................ 4
2.1.1 TSE im Menschen…………………………………………... 4
2.1.1.1 Kuru………………………………………………………….. 4
2.1.1.2 Creutzfeld-Jakob-Krankheit
(Creutzfeld-Jakob Disease, CJD)……………………………. 5
2.1.1.2.1 Sporadische CJD............................................................. 5
2.1.1.2.2 Familiale CJD................................................................. 7
2.1.1.2.3 Iatrogene CJD................................................................. 7
2.1.1.2.4 Variante der Creutzfeld-Jakob-Krankheit
(variant Creutzfeld-Jakob Disease, vCJD)……………..7
2.1.1.3 Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS)................... 8
2.1.1.4 Fatale Familiale Insomnie (FFI)............................................... 8
2.1.2 TSE im Tier.......................................................................9
2.1.2.1 Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE).......................... 9
2.1.2.1.1 Entstehung...................................................................... 9
2.1.2.1.2 Transmission................................................................... 10
2.1.2.1.3 Epidemiologie................................................................. 11
2.1.2.2 TSE in anderen Tieren.............................................................. 12
2.1.2.2.1 Scrapie............................................................................ 12
2.1.2.2.2 Chronisch zehrende Krankheit
(Chronic Wasting Disease, CWD)…………………….. 12
2.1.2.2.3 Feline Spongiforme Enzephalopathie (FSE).................. 13
2.1.2.2.4 Transmissible Nerz-Enzephalopathie
(Transmissible Mink Encephalopathy, TME)................ 13
2.1.2.2.5 TSE im übrigen Tierreich............................................... 13
2.1.3 BSE und vCJD.................................................................. 14
2.1.4 Prion.................................................................................. 15
2.1.4.1 Die Prion-Hypothese................................................................ 15
2.1.4.2 Das Prion-Protein..................................................................... 16
2.1.4.2.1 Die Zellbiologie des Prion-Proteins................................18
2.1.4.2.2 Replikation von PrPSc..................................................... 19
2.1.4.2.3 Physiologische Funktion des
zellulären Prion-Proteins.................................................20
2.1.4.2.4 Das Prion-Protein-Gen.................................................... 21
2.1.4.2.5 Doppel............................................................................. 22
2.1.5 Diagnose von TSE.............................................................22
2.1.6 Prävention und Therapie von TSE.................................... 24
I
Inhaltsverzeichnis
2.1.6.1 Prävention von TSE.................................................................. 24
2.1.6.2 Therapie von TSE...................................................................... 25
2.2 Plasminogen................................................................ 27
2.2.1 Hämostase......................................................................... 27
2.2.1.1 Blutgerinnung........................................................................... 27
2.2.1.2 Fibrinolyse und das Plasminogen-System................................ 32
2.2.2 Plasminogen...................................................................... 35
2.2.2.1 Struktur und Charakteristika von Plasminogen........................ 36
2.2.2.2 Aktivierung von Plasminogen.................................................. 40
2.2.2.3 Angiogenese und Angiostatin.................................................. 41
2.3 Interaktion Plasminogen-Prion.................................... 43
2.4 Zielsetzung.................................................................. 45
3. E. coli Material und Methoden............................... 47
3.1 Molekularbiologie....................................................... 47
3.1.1 Material............................................................................. 47
3.1.1.1 Stämme..................................................................................... 47
3.1.1.2 Plasmide................................................................................... 48
3.1.1.3 Nährmedien.............................................................................. 48
3.1.1.4 Antibiotika................................................................................ 49
3.1.1.5 Enzyme..................................................................................... 49
3.1.1.6 Marker...................................................................................... 50
3.1.1.7 Primer....................................................................................... 50
3.1.1.8 Kits........................................................................................... 51
3.1.1.9 Reagenzien, Puffer, Lösungen................................................. 52
3.1.1.10 Weiteres Zubehör................................................................... 53
3.1.1.11 Geräte..................................................................................... 53
3.1.2 Methoden...........................................................................54
3.1.2.1 Plasmidisolation aus E. coli..................................................... 54
3.1.2.2 PCR.......................................................................................... 54
3.1.2.2.1 DNA-Amplifikation mit PCR......................................... 54
3.1.2.2.2 PCR WHOPS
(Whole Plasmid Site-directed Mutagenesis)…………...55
3.1.2.3 DNA-Restriktionsverdau mit Enzymen................................... 57
3.1.2.3.1 Linearisierung von Plasmiden........................................ 57
3.1.2.3.2 Restriktionsanalyse von Plasmiden................................ 57
3.1.2.3.3 Verdau von PCR-Produkten........................................... 57
3.1.2.4 Dephosphorylierung von Plasmiden........................................ 58
3.1.2.5 Agarose-Gelelektrophorese...................................................... 58
3.1.2.6 Isolation von DNA aus Agarose-Gelen.................................... 59
3.1.2.7 Ligation……………………………………………………… 59
3.1.2.7.1 Ligation in pQE-8……………………………………... 59
3.1.2.7.2 Ligation in pET100/D-TOPO®………………………... 60
II
Inhaltsverzeichnis
3.1.2.7.3 Ligation mit dem “Perfectly Blunt Cloning Kit”……… 61
3.1.2.8 Transformation von E. coli…………………………………... 62
3.1.2.8.1 Herstellung kompetenter Zellen......................................62
3.1.2.8.2 Transformation kompetenter Zellen............................... 62
3.1.2.8.3 Transformation kommerziell
erhältlicher kompetenter Zellen...................................... 62
3.1.2.9 DNA-Sequenzierung................................................................ 62
3.1.2.10 Expression in E. coli............................................................... 63
3.1.2.10.1 Starterkultur (5 ml) und Herstellung
von Stammkulturen....................................................... 63
3.1.2.10.2 Testexpression LB (100 ml)…………………………. 63
3.1.2.10.3 Grossansatz LB (6 l)..................................................... 63
3.2 Proteinchemie E. coli……………………………….. 64
3.2.1 Material............................................................................. 64
3.2.1.1 Antikörper................................................................................ 64
3.2.1.2 Kits........................................................................................... 64
3.2.1.3 Marker...................................................................................... 64
3.2.1.4 Reagenzien, Lösungen, Puffer................................................. 65
3.2.1.5 Weiteres Zubehör..................................................................... 66
3.2.1.6 Geräte....................................................................................... 67
3.2.2 Methoden...........................................................................68
3.2.2.1 Zellaufschluss........................................................................... 68
3.2.2.1.1 Denaturierender Zellaufschluss von Proben
aus Testexpression für SDS-PAGE................................ 68
3.2.2.1.2 Denaturierender Zellaufschluss von Proben aus
Testexpression für Proteinisolation mit Ni-NTA
Spin Kit........................................................................... 68
3.2.2.1.3 Denaturierender Zellaufschluss von Grossansätzen....... 68
3.2.2.2 Western Blot............................................................................. 69
3.2.2.2.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.......................... 69
3.2.2.2.2 Blotting........................................................................... 69
3.2.2.3 Proteindetektion....................................................................... 70
3.2.2.3.1 Coomassie-Färbung........................................................ 70
3.2.2.3.2 Ponceau S-Färbung……………………………………. 71
3.2.2.3.3 Immunologischer Nachweis........................................... 71
3.2.2.4 Proteinisolation durch Ni-NTAAgarose-Affinitätschromatografie........................................... 72
3.2.2.4.1 Proteinisolation mit dem Ni-NTA Spin Kit.................... 72
3.2.2.4.2 Proteinisolation mit Ni-NTA-Säulen.............................. 73
3.2.2.5 Protein-Rückfaltung................................................................. 74
3.2.2.5.1 Rückfaltung nach Proteinisolation mit
Ni-NTA-Affinitätschromatografie…………………….. 74
3.2.2.5.2 Rückfaltung im Lysat......................................................75
3.2.2.6 Affinitätschromatografie mit Lys-Bio-Gel............................... 75
3.2.2.7 Gelfiltration………………………………………………….. 75
3.2.2.8 Reversed-phase HPLC………………………………………. 76
3.2.2.9 Aminosäureanalyse.................................................................. 76
III
Inhaltsverzeichnis
3.2.2.10 Sequenzanalyse nach Edman................................................. 77
3.2.2.11 Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie....................... 78
3.2.2.12 Fluoreszenzspektroskopie...................................................... 78
4. Prion Material und Methoden................................. 80
4.1 Material....................................................................... 80
4.1.1 Hirnhomogenat..................................................................80
4.1.2 Plasminogen und Plasminogenfragmente......................... 80
4.1.3 Enzyme..............................................................................81
4.1.4 Marker...............................................................................81
4.1.5 Antikörper......................................................................... 81
4.1.6 Kits.................................................................................... 82
4.1.7 Reagenzien, Lösungen, Puffer.......................................... 82
4.1.8 Weiteres Zubehör..............................................................85
4.1.9 Geräte................................................................................ 85
4.2 Methoden..................................................................... 86
4.2.1 Aufbereitung von BSE-negativem und –positivem
Hirnhomogenat von Rindern.............................................86
4.2.1.1 Verarbeitung ohne Zusatz........................................................ 86
4.2.1.2 Verarbeitung ohne Zusatz, mit Homogenisation...................... 87
4.2.1.3 Verarbeitung mit DOC/NP-40................................................. 87
4.2.1.4 Verarbeitung mit DOC/NP-40, mit Homogenisation............... 87
4.2.1.5 Mit Homogenisationspuffer..................................................... 87
4.2.1.6 Verarbeitung mit Homogenisationspuffer,
mit Homogenisation................................................................. 88
4.2.2 Probenvorbereitung...........................................................88
4.2.2.1 Probenvorbereitung mit/ohne Proteinase K-Verdau................ 88
4.2.2.2 Probenvorbereitung mit der High Dynamic
Range (HDR)-Methode……………………………………… 89
4.2.2.3 Pull Down-Assay mit beschichteten Dynabeads...................... 89
4.2.2.3.1 Beschichtung der Dynabeads.......................................... 89
4.2.2.3.2 Pull Down-Assay……………………………………… 91
4.2.2.4 Pull Down-Assay mit Inhibition durch 6-AHA……………... 91
4.2.2.5 Pull Down-Assay mit beschichteten Dynabeads
mit Elution durch 6-AHA......................................................... 91
mit Zugabe von EDTA............................................................. 92
4.2.2.7 Pull Down-Assay mit Anionenaustauscher-/
Kationenaustauscher-Beads..................................................... 92
aus grösseren Volumina........................................................... 92
IV
Inhaltsverzeichnis
4.2.2.9 Pull Down-Assay mit Ni-NTA-Beads………………………. 93
4.2.2.10 Pull Down-Assay mit Metall-beschichteter
chelierender Sepharose.......................................................... 93
4.2.2.10.1 Beschichtung der Sepharose mit Metall-Ionen
(Cu2+, Ni2+, Co2+)…………………………………….. 93
4.2.2.10.2 Pull Down-Assay…………………………………….. 94
4.2.3 Western Blot……………………………………………..94
4.2.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)……… 94
4.2.3.2 Blotting………………………………………………………. 95
4.2.3.2.1 PVDF-Membran………………………………………. 95
4.2.3.2.1 Nitrozellulose-Membran………………………………. 95
4.2.3.3 Proteindetektion……………………………………………... 95
4.2.3.3.1 Coomassie-Färbung........................................................ 95
4.2.3.3.2 Immunologischer Nachweis........................................... 96
4.2.4 Dot Blot…………………………………………………. 97
4.2.5 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)……….97
4.2.5.1 Ermittlung der Sättigungskonzentration von
Mikrotiterplatten....................................................................... 98
4.2.5.1.1 Unbeschichtete Mikrotiterplatten................................... 98
4.2.5.1.2 Ni-NTA-HisSorb™-Plates............................................... 99
4.2.5.2 ELISA mit Hirnhomogenat...................................................... 99
4.2.5.2.1 Unbeschichtete Mikrotiterplatten................................... 99
4.2.5.2.2 Ni-NTA-HisSorb™-Plates............................................... 100
5. E. coli Resultate……………………………….…. 101
5.1 Kringel 2+3 und Kringel 2+3mut................................ 101
5.1.1 Molekularbiologie K23mut...............................................102
5.1.1.1 WHOPS K23mut...................................................................... 102
5.1.1.2 Transformation von K23mut in M15(pREP4)......................... 104
5.1.2 Proteinchemie....................................................................104
5.1.2.1 Testexpression von K23 und K23mut...................................... 104
5.1.2.2 Isolation von K23 und K23mut aus Grossansätzen................. 105
5.2 Kringel1FXa und Kringel1FXamut.............................108
5.2.1 Molekularbiologie.............................................................109
5.2.1.1 PCR K1FXa.............................................................................. 109
5.2.1.2 Ligation, Transformation von K1FXa in TOP10..................... 110
5.2.1.3 PCR WHOPS, Transformation von K1FXamut in TOP10...... 110
5.2.1.4 Transformation von K1FXa und K1FXamut
in M15(pREP4)........................................................................ 112
5.2.2 Proteinchemie....................................................................112
5.2.2.1 Testexpression von K1FXa und K1FXamut............................ 112
5.2.2.2 Isolation von K1FXa und K1FXamut aus Grossansätzen........ 113
5.3 K4FXa und rK4........................................................... 117
V
Inhaltsverzeichnis
5.3.1 Molekularbiologie K4FXa................................................ 117
5.3.1.1 PCR K4FXa.............................................................................. 118
5.3.1.2 Ligation von K4FXa in pET100/D-TOPO™
und Transformation in TOP10-Zellen...................................... 119
5.3.1.3 Transformation von K4FXa pET100/D-TOPO™
in BL21 Star™ (DE3)................................................................ 119
5.3.2 Proteinchemie K4FXa.......................................................119
5.3.2.1 Proteinchemie K4Fxa in BL21 Star™ (DE3)............................ 119
5.3.2.2 Transformation von K4FXa pET100/D-TOPO™
in Rosetta(DE3)……………………………………………… 120
5.3.2.3 Proteinchemie von K4FXa in Rosetta(DE3)………………… 121
5.3.2.3.1 Testexpression von K4FXa……………………………. 121
5.3.2.3.2 Grossexpression von K4Fxa…………………………... 122
5.3.3 Molekularbiologie rK4…………………………………..123
5.3.3.1 PCR rK4................................................................................... 124
5.3.3.2 Ligation von rK4 in pETBlue™-1 und
Transformation in TOP10…………………………………… 125
5.3.3.3 Transformation von rK4 in Rosetta2(DE3).............................. 125
5.3.4 Proteinchemie rK4............................................................ 125
5.4 K13FXa und rK13....................................................... 126
5.4.1 Molekularbiologie K13FXa.............................................. 126
5.4.1.1 PCR K13FXa............................................................................ 127
5.4.1.2 Ligation von K13FXa in pET100/D-TOPO®
und Transformation in TOP10................................................. 127
5.4.1.3 Transformation von K13FXa in Rosetta(DE3)........................ 127
5.4.2 Proteinchemie K13FXa.....................................................128
5.4.3 Molekularbiologie rK13....................................................129
5.4.3.1 PCR rK13................................................................................. 130
5.4.3.2 Ligation von rK13 in pETBlue™-1 und
Transformation in TOP10…………………………………… 131
5.4.3.3 Transformation von rK13 in Rosetta2(DE3)............................ 131
5.4.4 Proteinchemie rK13.......................................................... 131
5.5 Bestimmung der Bindungskonstanten
durch Fluoreszenzmessung..........................................132
6. Prion Resultate........................................................ 135
6.1 Pull Down-Assay mit beschichteten Dynabeads......... 135
6.1.1 Optimierung des Pull Down-Assays................................. 136
6.1.1.1 Aufbereitung des Homogenats................................................. 136
6.1.1.2 Blotten auf verschiedene Membranen...................................... 138
6.1.1.3 Verschiedene Antikörper.......................................................... 139
VI
Inhaltsverzeichnis
6.1.1.4 Andere Massnahmen................................................................ 141
6.1.1.5 Vergleich mit anderen Probenvorbereitungsmethoden............ 142
6.1.1.6 Vergleich BSE-Scrapie............................................................ 143
6.2.2 Pull Down-Assay mit Plasminogen
von verschiedenen Spezies.................................................144
6.2.3 Pull Down-Assay mit verschiedenen
Fragmenten von Plasminogen...........................................144
6.2.4 Pull Down-Assay mit Zusatz von EDTA..........................147
6.2.5 Pull Down-Assay mit Inhibition durch 6-AHA………… 148
6.2.5.1 Vorinkubation der Beads mit 6-AHA...................................... 149
6.2.5.2 Zusatz von 6-AHA zum Assaypuffer....................................... 150
6.2.6 Pull Down-Assay mit Elution durch 6-AHA…………… 150
6.2.7 Pull Down-Assay mit beschichteten Dynabeads
aus grösseren Volumina………………………………… 151
6.3 Pull Down-Assay mit Anionenaustauscher-/
Kationenaustauscher-Beads........................................152
6.4 Pull Down-Assay mit Ni-NTA-Beads......................... 153
6.5 Pull Down-Assay mit Metall-beschichteter
chelierender Sepharose................................................ 156
6.6 Dot Blot....................................................................... 157
6.7 ELISA.......................................................................... 160
6.7.1 Ermittlung der Sättigungskonzentration
von Mikrotiterplatten.........................................................160
6.7.2 ELISA mit Hirnhomogenat............................................... 162
7. Diskussion………………………………………... 166
7.1 E. coli………………………………………………...166
7.2 Prion………………………………………………… 168
8. Anhang: Isolierung von Plasminogen..................... 172
8.1 Material und Chemikalien........................................... 172
8.1.1 Reagenzien, Lösungen, Puffer.......................................... 172
8.2 Methoden..................................................................... 172
8.2.1 Isolation von Plasminogen................................................ 172
8.2.2 Elastasespaltung von Plasminogen................................... 173
8.3 Resultate und Diskussion............................................ 173
9. Literaturverzeichnis................................................ 175
VII
Abkürzungen
Abkürzungen
6-AHA
ABTS
Amp
AP
AS
ATP
ATZ
BPg
BSE
Cam
Carb
CIP
CJD
CMCPg
CWD
Da
DEAEDNA
dNTP
DTT
E. coli
EDTA
ELISA
EPg
ESI-MS
FFI
FPg
FSE
FXa
GSS
GuHCl
HPg
HRP
IgG
IPTG
K
K1FXa
K1FXamut
K13FXa
K23
K23mut
K4FXa
Kana
kb
kDa
LB
LBS
6-Aminohexansäure
2.2’-Azino-bis-(3-ethylbenzthioazoline)-6-Sulfonsäure
Ampicillin
Alkaline Phosphatase
Aminosäure
Adenosintriphosphat
2-Anilino-5-thiazolinon
Rinder-Plasminogen
Bovine Spongiform Encephalopathy
Chloramphenicol
Carbenicillin
Calf Intestinal Phosphatase
Creutzfeld-Jakob Disease
CarboxymethylHunde-Plasminogen
Chronic Wastind Disease
Dalton
DiethylaminoethylDeoxyribonucleic Acid; Deoxyribonukleinsäure
Desoxyribonukleoisdtriphosphat
1,4-Dithio-DL-threitol
Escherichia coli
Ethylendiaminotetraessigsäure
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Pferde-Plasminogen
Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie
Fatal Familial Insomnia
Katzen-Plasminogen
Feline Spongiform Encephalopathy
aktivierter Faktor X
Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom
Guanidin-Hydrochlorid
humanes Plasminogen
Horse Radish Peroxidase
Immunglobulin G
Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid
Kringel
Protein: His-Tag + Kringel 1
Protein: His-Tag + Kringel 1 mit der Mutation D139A
Protein: His-Tag + Kringel 1+2+3
Protein: His-Tag + Kringel 2+3
Protein: His-Tag + Kringel 2+3 mit den Mutationen C169G und C297S
Protein: His-Tag + Kringel 4
Kanamycin
Kilobase
Kilodalton
Luria Bertani-Medium
Lysinbindungsstelle
VIII
Abkürzungen
rK4
rK13
MOPS
Ni-NTA
NMR
NTP
OD
Opg
PBS
PBST
PCR
PITC
PK
PPg
PrP
PrP27-30
PrPC
PrPSc
PVDF
RP-HPLC
SAP
SDS-PAGE
TAE
TBST
Tet
TFA
TME
Tris
U
vCJD
WHOPS
Protein: Kringel 4
Protein: Kringel 1+2+3
3-Morpholino-propansulfonsäure
Nickel-Nitrilotriessigsäure
Nuclear Magnetic Resonance
N-terminales Peptid
Optische Dichte
Schaf-Plasminogen
Phosphate Buffered Saline
Phosphate Buffered Saline with Tween-20®
Polymerase Chain Reaction
Phenylisothiocyanat
Proteinase K
Schweine-Plasminogen
Prion-Protein
verkürztes Scrapie-Prion-Protein mit einer Masse von 27-30 kDa
zelluläres Prion-Protein
Scrapie-Prion-Protein (pathogenes Prion-Protein)
Kaninchen-Plasminogen
Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography
Shrimp Alkaline Phosphatase
Natriumdodecylsulfat-Polyamid-Geleletrophorese
Tris-Essigsäure-EDTA
Tris Buffered Saline mit Tween-20®
Tetracyclin
Trifluoressigsäure
Transmissible Mink Encephalopathy
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Unit (Einheit)
Variante der Creutzfeld-Jakob Disease
whole plasmid site-directed mutagenesis
IX
Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
Fischer et al. (2000) demonstrierten, dass das Zymogen Plasminogen, welches in Blutserum
vorkommt, unter bestimmten Bedingungen PrPSc spezifisch bindet. Die Isolation von PrPSc
wurde in Form eines PullDown-Assays mit Plasminogen-beschichteten, paramagnetischen
Beads durchgeführt.
In dieser Arbeit soll die Interaktion zwischen Plasminogen und dem Prion-Protein untersucht
und genauer charakterisiert werden. Ausserdem soll geprüft werden, ob diese Eigenschaft von
Plasminogen eventuell für einen sensitiven diagnostischen Test zur Detektion von Prionen aus
TSE-infiziertem Hirn ausgenützt werden kann.
E. coli
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Konstrukte von verschiedenen PlasminogenFragmenten, welche später bei Interaktionsstudien mit dem Prion-Protein verwendet werden
sollten, kloniert und in E. coli exprimiert.
Die Konstrukte K23 pQE-8 und K23 Cys169Gly waren schon vorgängig hergestellt worden
(Söhndel, 1995; Schermbach 2001). Das Konstrukt K23mut mit den Mutationen Cys169Gly
und Cys297Ser entstand durch Mutation von K23 Cys169Gly mit der WHOPS-Methode. Die
beiden Konstrukte K23 pQE-8 und K23mut pQE-8 wurden in E. coli im Grossansatz
exprimiert. K23 wurde nach der Rückfaltung im Lysat durch native Ni-NTAAffinitätschromatografie gereinigt, während das Protein K23mut durch denaturierende NiNTA-Affinitätschromatografie mit anschliessender Renaturierung mit einer veränderten
Methode im zweistelligen Milligramm-Bereich isoliert werden konnte. K23 und K23mut
wurden durch G75sf-Gelfiltration aufgereinigt und durch ESI-MS, Aminosäure- und
Sequenzanalyse charakterisiert.
Für spätere Interaktions-Experimente mit PrP sollte ein Plasminogen-Fragment hergestellt
werden, dessen Lysinbindungsstelle (LBS) durch Mutation inaktiviert worden war. Da die
LBS von Kringel 1 (K1) die höchste Lysinaffinität aufweist, wurden zwei Konstrukte von K1,
jeweils mit aktiver sowie mit inaktivierter LBS hergestellt. Das Konstrukt K1FXa pQE-8
entstand durch PCR-Amplifikation der cDNA von K1 und anschliessende Klonierung in
pQE-8. K1FXamut pQE-8 wurde generiert, indem mit der WHOPS-Methode die Mutation
Asp139Ala eingeführt wurde, wodurch die LBS im späteren Protein keine Lysinaffinität mehr
besitzen sollte. Die beiden Konstrukte wurden in E. coli im Grossansatz exprimiert. Die
beiden Proteine K1FXa und K1FXamut wurden nach der denaturierenden Ni-NTAAffinitätschromatografie mit der modifizierten Rückfaltungsmethode renaturiert. K1FXa
wurde durch Lys-Bio-Gel-Affinitätschromatografie, K1FXAmut durch G75 sf-Gelfitration
gereinigt. Die Ergebnisse der Charakterisierung durch ESI-MS, Aminosäure- und
Sequenzanalyse stimmten gut mit den theoretischen Werten überein.
Um die Bindungseigenschaften von PrP mit rekombinantem und durch Elastase-Spaltung
generiertem Kringel 4 (K4) vergleichen zu können, wurde ein Konstrukt dieser
Plasminogendomäne hergestellt. Die mittels PCR-Reaktion amplifizierte DNA von K4 wurde
in den Vektor pET100/D-TOPO® eingefügt, der dem exprimierten Protein einen N-terminalen
His-Tag anfügt. Nach der Grossansatz-Expression von K4FXa pET100/D-TOPO® in E. coli
wurde das Protein im Gesamtlysat zurückgefaltet und mittels Lys-Bio-GelAffinitätschromatografie isoliert. Das Protein wurde mittels ESI-MS, Sequenz- und
1
Zusammenfassung
Aminosäureanalyse charakterisiert. Da die Ausbeute von K4FXa mit nur 5 mg Rohprotein
gering war, wurde die K4-cDNA in den Vektor pET-Blue™-1 umkloniert. Bei der
Testexpression des Konstrukts rK4 pET-Blue™-1 konnte keine Überexpression detektiert
werden, weshalb von einer Expression im Grossansatz abgesehen wurde.
Auch zwischen dem durch Elastase-Spaltung von HPg generierten Fragment Kringel 1-3
(K13) und einem rekombinanten Gegenstück sollten Vergleiche in Bezug auf PrPBindungseigenschaften gemacht werden. Dazu wurde die PCR-amplifizierte cDNA von K13
in pET100/D-TOPO® kloniert. Vom Konstrukt K13FXa pET100/D-TOPO® wurde eine
Testexpression in E. coli durchgeführt. Im ESI-Massenspektrum von K13FXa wurden neben
dem Massenpeak des korrekt exprimierten Proteins noch weitere Peaks detektiert, welche auf
Glutathion-Addukte von K13FXa zurückzuführen waren. Nachfolgende Versuche, K13FXa
zur erneuten Massenbestimmung und weiteren Charakterisierung zu isolieren, scheiterten.
Aus zeitlichen Gründen wurde die Expression dieses Konstrukts nicht weiterverfolgt.
Die cDNA von K13 wurde auch in pET-Blue™-1 kloniert. Proben einer Test-Expression von
rK13 pET-Blue™-1 in E. coli wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF geblottet.
Der Coomassie-gefärbte Blot zeigt eine deutliche Überexpression eines Proteins der
erwarteten Grösse. rK13 muss aber vor einer Expression im Grossansatz erst noch
charakterisiert werden.
Prion
Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Interaktion zwischen Plasminogen und dem PrionProtein untersucht werden. Als erstes wurde versucht, die Resultate des Assays von Fischer et
al. (2000) mit HPg-beschichteten Dynabeads und BSE-negativem und BSE-positivem RinderHirnhomogenat nach Anleitung zu reproduzieren. Die erhaltenen Resultate waren aber in
zweierlei Hinsicht unbefriedigend. Zwar konnte eine starke Interaktion zwischen Plasminogen
und PrPSc aus BSE-positivem Hirnhomogenat festgestellt werden, es band aber auch ein
kleiner Anteil PrPC an die HPg-gekoppelten Beads. Die Signale der mittels Western Blot
analysierten Proben waren schwach und nicht eindeutig. Durch Variation von verschiedenen
Parametern des Assays (z.B. verwendete Blotmembran, Antikörper etc.) konnte die Qualität
des Western Blots verbessert und die Detektionslimite um zwei Verdünnungsstufen gesenkt
werden. Die Bindung einer Restmenge PrPC an die beschichteten Beads konnte aber nur durch
vorherige Inkubation mit Proteinase K (PK) verhindert werden. Auch eine Veränderung der
Assaydauer, stringentere Waschbedingungen oder die Kopplung einer grösseren Menge HPg
an die Dynabeads® brachte keinen Erfolg. Versuche mit Pull Down-Assays in grösseren
Volumina zeigten, dass es nicht möglich war, unter den gegebenen Bedingungen alles
eingesetzte PrP-Material wieder aus der Lösung zu isolieren.
Es wurden Pull Down-Assays mit Beads durchgeführt, an welche Plasminogen von
verschiedenen Spezies und die im ersten Teil der Arbeit hergestellten Plasminogenfragmente
gekoppelt waren. Die Auswertung der erhaltenen Werte zeigte, dass die Sequenzvarationen
zwischen den verschiedenen Spezies keinen Einfluss auf die Affinität von Plasminogen für
PrPC und PrPSc hatte. Die Ausnahme bildete Ziegen-Plasminogen, an welches deutlich
weniger Prion-Protein band. Dies deutete vermutlich auf eine Degenerierung von GPg hin.
Aufgrund von ungleichmässiger Kopplung der Plasminogen-Fragmente an die magnetischen
Beads war kein quantitativer, sondern nur ein qualitiativer Vergleich zwischen den
verschiedenen Fragmenten möglich. Es zeigte sich, dass PrPC und PrPSc an alle Fragmente
banden, wenn auch in unterschiedlichen Mengen. Die Proteine HPg, K13, K4, K1FXamut und
2
Zusammenfassung
K23mut banden etwa gleichviel PrPC, während die Affinität von K1FXa und K23 zum
zellulären Prion-Protein etwas höher resp. geringer zu sein schien als diejenige von HPg. Bei
der Interaktion der Fragmente mit PrPSc zeigten sich bei K1FXamut und K23mut intensivere
Signale als bei den anderen getesteten Proteinen. Vor allem die erhöhte Affinität von
K1FXamut erstaunte, da dieses Protein keine funktionelle Lysinbindungsstelle mehr aufwies.
Vermutlich verändern die eingeführten Mutationen die Ladungsverteilung auf der Oberfläche
dieser HPg-Fragmente, so dass PrPSc bevorzugt an diese Proteine bindet.
PrPC hat eine hohe Affinität für Nickel. Unter Ausnützung dieser Eigenschaft wurde
versucht, das in der Homogenat-Assaylösung vorhandene PrPC mittels Ni-NTA-Beads zu
depletieren, so dass beim Pull Down-Assay nur noch gebundenes PrPSc detektiert wird. Es
konnte durch mehrmalige Inkubation der Assaylösung mit Ni-NTA-Beads auch der
überwiegende Teil von PrPC entfernt werden, ein Teil des vorhandenen PrPSc band jedoch
auch an die Beads. Die Entfernung von PrPC mit dieser Methode würde also die Sensitivität
des Assays reduzieren.
In Versuchen von Pull Down-Assays mit chelatierender Sepharose, die mit Kupfer-, Nickeloder Kobalt-Ionen beschichtet worden war, konnte gezeigt werden, dass PrPC in allen drei
Fällen eine höhere Affinität aufweist als PrPSc. Die Affinität nahm für beide Prion-Proteine in
der Reihenfolge Nickel - Kobalt - Kupfer ab.
PrPC ist in vivo ein Kupfer-bindendes Protein. Durch Zusatz des Chelators EDTA zur
Assaylösung wurden allfällig von PrP gebundene Kupferionen entfernt. Es waren aber keine
Unterschiede in der Affinität von PrPC oder PrPSc festzustellen.
In Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Bindung des Prion-Proteins an Plasminogen
und Plasminogenfragmente durch 6-Aminohexansäure (6-AHA, ein Lysin-Analogon)
inhibiert werden kann. Bereits gebundenes Protein konnte mit einer 6-AHA-Lösung
zumindest teilweise wieder abgelöst werden. Die Resultate wiesen auf einen stärkeren 6AHA-Einfluss auf PrPSc als auf PrPC hin. Dies weist darauf hin, dass die Interaktion zwischen
PrPSc und Plasminogen durch die LBS vermittelt wird, während PrPC auf andere Art an
Plasminogen bindet.
Durch Dot Blots mit BSE-negativem und –positivem Hirnhomogenat wurde die Affinität von
verschiedenen Antikörpern und HPg für natives PrPC und PrPSc untersucht. Die intensivsten
Signale erzeugen die Antikörper 6H4 und 6G4, mit denen schon mit denaturiertem PrionProtein die besten Ergebnisse erzielt worden waren. Die Bindung von HPg an PrP war
abhängig von der Lösung, in welcher HPg verdünnt wurde. HPg in Blocking Buffer
interagierte vor allem mit unverdautem PrPSc, in Assaypuffer war die Affinität von HPg für
PK-verdautes PrPSc am grössten.
Es wurden sogenannte Sandwich-ELISAs auf Polystyrol- und Ni-NTA-beschichteten
Mikrotiterplatten durchgeführt. Dabei dienten HPg und Plasminogenfragmenten als FängerMolekül für PrP aus BSE-negativem und -positivem Homogenat. Es war aber keine
spezifische Interaktion zwischen PrP und einem der Fänger-Moleküle feststellbar.
Möglicherweise kann dies durch Optimierung der Versuchsparameter verbessert werden.
Unter Einbezug aller erzielten Ergebnisse muss davon ausgegangen werden, dass die
Interaktion zwischen dem Prion-Protein und Plasminogen nicht spezifischer Natur ist und
vermutlich auch keine physiologische Bedeutung hat. Vielmehr wird die Bindung vermutlich
durch elektrostatische Wechselwirkungen verursacht.
3
Einleitung
2. Einleitung
2.1 Prion
CJD
BSE
Scrapie
Kuru
Bild 2.1: Neuropathologische Veränderungen im Gehirn, verursacht durch verschiedene TSE-Erkrankungen
2.1.1 TSE im Menschen
Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) sind eine Gruppe schnell
voranschreitender, neurodegenerativer Krankheiten mit stets tödlichem Verlauf, welche
sowohl Mensch als auch Tier befallen. Die meisten TSE sind charakterisiert durch eine lange
Inkubationsperiode und neuropathologische Erscheinungsformen wie multifokale
spongiforme Veränderungen, Astrogliose, Verlust von Neuronen und Abwesenheit einer
Entzündungsreaktion. TSE in Menschen beinhalten Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJD), Kuru,
Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS), Fatal Familial Insomnia (FFI) und die
Variante der Creutzfeld-Jakob-Krankheit (nvCJD).
2.1.1.1 Kuru
Der Fore-Stamm ist eine ethnische Gruppe von etwa 37000 Mitgliedern, die in den Bergen
des östlichen Hochlands von Papua-Neuguinea leben. Im letzten Jahrhundert wurde die
Region von einer Kuru-Epidemie heimgesucht, die bis heute mindestens 3000 Menschenleben
gefordert hat (Gadjusek, 1996). Mehr als 80 % der Todesfälle wurden innerhalb eines eng
begrenzten Gebiets registriert, welches vom Fore-Stamm bewohnt wird (Gadjusek und Zigas,
4
Einleitung
1957). Der Ursprung von Kuru kann auf Anfang des 20. Jahrhunderts datiert werden. Der
erste Fall von Kuru, an den sich die Fore-Angehörige erinnern konnten, ereignete sich um
1920; von da an nahm die Zahl der Erkrankungen ständig zu; in den 50er Jahren nahm Kuru
epidemische Ausmasse an (Gadjusek et al., 1961). Als Übertragungsweg wurden
kannibalistische Trauerrituale ermittelt, welche schon über mehrere Dekaden von den Fore
praktiziert worden waren. Da nur die Frauen und Kinder das Gehirn und die Eingeweide ihrer
verstorbenen Angehörigen verspeisten, machten diese beiden Bevölkerungsgruppen mehr als
80 % der Infizierten aus. In den späten Fünfzigerjahren wurde der Kannibalismus endgültig
aufgegeben und die Bevölkerung war keiner weiteren Kuru-Infektivität ausgesetzt; kein nach
1960 geborenes Individuum ist bis jetzt an Kuru erkrankt. Da die Inkubationszeit aber
mehrere Jahrzehnte dauern kann, werden auch heute noch einige wenige Krankheitsfälle
gemeldet.
2.1.1.2 Creutzfeld-Jakob-Krankheit (Creutzfeld-Jakob Disease, CJD)
Die ersten Patienten mit dieser rasch fortschreitenden neurodegenerativen Krankheit wurden
erstmals von den Neurologen Creutzfeld und Jakob gemeldet (Richardson und Masters,
1995). CJD ist die am häufigsten vorkommende TSE-Form beim Menschen und ist weltweit
verbreitet mit einer geschätzten Erkrankungswahrscheinlichkeit von einem Fall pro Million
Einwohner. Die Krankheit befällt beide Geschlechter mit beinahe gleicher Häufigkeit, obwohl
ältere Männer (≥ 60 Jahre) eine erhöhte Anfälligkeit für CJD zu haben scheinen; Angehörige
der kaukasischen Rasse erkranken häufiger als Menschen afrikanischer und
afroamerikanischer Abstammung (Holman et al., 1994). Die Auftrittswahrscheinlichkeit von
CJD erreicht zwischen 55 und 75 Jahren ein Maximum (Durchschnitt: 61.5 Jahre) (Brown et
al., 1986). Das Gen für das menschliche Prion-Protein, welches verantwortlich für Auslösung
und Übertragung von TSE-Erkrankungen ist (siehe Kapitel 2.1.3), weist einen
Polymorphismus des Codons 129 für Methionin oder Valin auf. Mehrere Studien haben
Hinweise darauf gefunden, dass dieser Polymorphismus eine wichtige Rolle bei der
Bestimmung der Anfälligkeit einer bestimmten Person für CJD und der phänotypischen
Expression von familialer, sporadischer oder iatrogener CJD spielen könnte. Es zeigte sich,
dass Menschen, welche homozygot für Methionin oder Valin sind, eine Prädisposition für die
Erkrankung an sporadischer oder iatrogener CJD besitzen. Im Gegensatz dazu scheinen
heterozygote Allele mit Methionin/Valin an Codon 129 vor sporadischer und iatrogener CJD
zu schützen. Zusätzlich hat der Polymorphismus in Kombination mit einer Mutation an Codon
178 einen Einfluss auf die Expression des Phänotyps der erblichen Form von CJD (Goldfarb
et al., 1992). Die Kombination Valin129/Aparagin178 erzeugt ein normales CJD-Muster; sind
die Mutationen Methionin129/Asparagin178 gleichzeitig vorhanden, gleicht der Phäntotyp
demjenigen, der bei Erkrankungen durch Fatal Familial Insomnia (FFI) entsteht.
2.1.1.2.1 Sporadische CJD
Die auftretenden Krankheitsfälle können in sporadische, familiale und iatrogene CJD
unterteilt werden. Die sporadische Form macht 85 % aller CJD-Fälle aus. Die
Durchschnittsdauer der Krankheit bis zum Tod des Patienten beträgt 8 Monate. Die genaue
Ursache von sporadischer CJD ist unbekannt; zwei Hypothesen wurden vorgeschlagen: Die
erste ist die Möglichkeit einer altersbedingten somatischen Mutation im Prion-Protein-Gen,
was zur Bildung von PrPSc (die missgefaltete Form des zellulären Prion-Proteins PrPC, welche
5
Einleitung
vermutlich für die TSE-Erkrankungen verantwortlich ist; siehe Kapitel 1.2) führen könnte.
Die zweite ist die spontane Konversion von PrPC zu PrPSc in einem einzelnen Neuron oder
einer Neurongruppe, möglicherweise nach einem Fehler bei der Expression des PrionProteins. PrPSc löst dann eine Kettenreaktion aus, wodurch die Krankheit auf andere anfällige
Neuronen übertragen wird. Aufgrund des klinisch-pathologischen Profils, der
Polymorphismen des Codons 129 im Prion-Protein-Gen und der molekularen Charakteristika
von PrPSc können die Fälle der sporadischen CJD in unterschiedliche Gruppen eingeteilt
werden (Parchi et al., 1998).
TSEErkrankung
Kuru
CJD
Klinische Symptome
Verlust des Gleichgewichtssinns
Defekte der Feinmotorik
Zittern
Disarthrie, Sprachstörungen
Demenz erst im letzten Stadium der
Krankheit
Rasch voranschreitende Demenz
Cerebellare Disfunktion
Verhaltensänderungen
Typisches EEG
Pyramidale und extrapyramidale
Disfunktionen
Neuropathologische
Merkmale
Neuronaler Verlust
Astrozytose
Amyloid-Plaques
Myelindegeneration
Spongiforme Veränderungen
Gliose
Neuronaler Verlust
-Persönlichkeitsveränderungen
Parkinson-Syndrom
-Ataxie
Unauffälliges EEG
---
GSS
Cerebellare Ataxie
Demenz
Disarthrie
Anormale Reflexe der unteren
Extremitäten
Anomalien des Gangs
Amyloid-Plaques
- Mutation in
Codon 102
(„Ataxie-GSS“)
- Mutation in
Codon 105
- Mutation in
Codon 117
(„Demenz-GSS“)
FFI
Spastische Paraparesie
Cerebellare Disfunktion
--
--
Neurofibrilläre Knäuel
Pyramidale und extrapyramidale
Disfunktionen
--
Schlaflosigkeit
Autonome Disfunktion
Verlust des zirkadischen Rhythmus
Neuronale Degeneration
Astrozytose
-sporadische
CJD
- familiale CJD
- iatrogene CJD
- vCJD
-Amyloid-Plaques (Kuruähnlich)
Tabelle 2.1: Klinische Symptome und neuropathologische Merkmale von TSE beim Menschen
6
Einleitung
2.1.1.2.2 Familiale CJD
Die familiale Form von CJD macht 5-15% aller Fälle aus. Wegen seines autosomalen
dominanten Vererbungsmusters sind meistens mehrere Betroffene in der Familie des
Patienten nachweisbar. Familiale CJD ist meistens mit Mutationen des Codons 200 und
weniger häufig mit Mutationen der Codons 178, 208 oder 210 des Gens des Prion-Proteins
verbunden. In Familien mit Veränderungen des Codons 200 erkranken ca. 56 % der Träger an
CJD (Goldfarb et al., 1991). Das Alter des Patienten bei Ausbruch der Krankheit
(durchschnittlich 55 Jahre), das Auftreten von charakteristischen Mustern im EEG und die
Dauer der Krankheit (8 Monate) weisen eine grosse Ähnlichkeit mit sporadischer CJD auf
(Brown et al., 1991; Meiner et al., 1997). Die Untersuchung des Stammbaums einer
finnischen Familie lässt darauf schliessen, dass die Mutation des Codons 178 eine CJD-Form
mit einer Durchbruchsrate von nahezu 100 % hervorruft (Goldfarb et al., 1994). Im Vergleich
zur sporadischen CJD erkranken Patienten mit dieser Krankheitsform früher (46 Jahre) mit
einer längeren Krankheitsdauer (23 Monate) und weisen unauffällige EEGs auf (Brown et al.,
1992). Kürzlich wurde in einer brasilianischen Familie eine CJD-Variante entdeckt, welche
durch eine Mutation des Codons 183 verursacht wird (Nitrini et al., 1997).
2.1.1.2.3 Iatrogene CJD
Die Übertragbarkeit von CJD wurde erstmals 1968 beschrieben, nachdem Hirngewebe aus der
Biopsie eines CJD-Patienten in das Hirn eines Schimpansen verpflanzt worden war (Gibbs et
al., 1968). Eine Mensch-zu-Mensch-Übertragung wurde aber erst 1974 gemeldet, als ein 55jähriger Patient nach der Transplantation einer von einem CJD-Patienten stammenden AugenHornhaut 18 Monate später ebenfalls an CJD erkrankte. In der Folge wurden weitere Wege
der iatrogenen Transmission von CJD gefunden, so z.B. durch den Gebrauch kontaminierter
EEG-Tiefenelektroden, durch neurochirurgische Instrumente, Gonadotropin aus der
Hirnanhangdrüse von Verstorbenen, menschliches Wachstumshormon (hGH) und
Hirnhautverpflanzungen. Die Länge der Inkubationsperiode und die jeweiligen klinischen
Symptome von Patienten mit iatrogener CJD scheinen vom „Eingangsportal“ abzuhängen. In
hGH-assoziierten CJD-Fällen, bei denen die Infektion über den peripheralen Weg geschieht,
kann die Inkubationszeit 12 Jahre oder länger dauern (Bandner et al., 1996). Diese Patienten
manifestieren Abnormalitäten des Gangs und Ataxie. Im Gegensatz dazu dauert bei Fällen
von Induktion von CJD durch Hirnhaut-Verpflanzungen, bei denen das infektiöse Gewebe
direkt im Schädel plaziert wurde, die Inkubationszeit nur etwa sechs Jahre. Obwohl die
Patienten bei Hirnhautverpflanzungs-assoziierter CJD bei Ausbruch der Krankheit wesentlich
jünger als Patienten mit sporadischer CJD sind (38.5 Jahre resp. 60 Jahre), sind die
auftretenden Symptome beinahe identisch (Esmonde et al., 1993).
2.1.1.2.4 Variante der Creutzfeld-Jakob-Krankheit (variant Creutzfeld-Jakob Disease,
vCJD)
vCJD wurde erstmals 1996 durch ein Komitee der britischen Regierung gemeldet, welches
aufgrund von Untersuchungsergebnissen an 10 Patienten mit einer bisher unbekannten Form
von CJD zum Schluss gekommen war, dass BSE möglicherweise auf den Menschen
übertragen werden kann. Die erkrankten Menschen wiesen im Vergleich zu CJD ein früheres
Erkrankungsalter (durchschnittlich 29 Jahre; sporadische CJD: 66 Jahre) und eine längere
Krankheitsdauer (durchschnittlich 14 Monate; sporadische CJD: 4.5 Monate) auf und waren
in Hinsicht auf bekannte CJD-Risikofaktoren und Anormalitäten des Prionprotein-Gens
7
Einleitung
unauffällig. Interessanterweise sind die meisten vCJD-Patienten, bei denen der
Polymorphismus von Codon 129 untersucht wurde, homozygot für Methionin (Zeidler et al.,
1997). Erst in 2004 wurde ein vCJD-Fall bekannt, bei dem der betroffene Patient
Methionin/Valin-heterozygot war (Peden et al., 2004).
Durch epidemiologische und experimentelle Studien erhaltene Ergebnisse erhärten die
Hypothese, dass zwischen BSE und vCJD eine kausale Verbindung besteht (siehe auch
Kapitel 2.1.3).
2.1.1.3 Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS)
GSS wird autosomal dominant vererbt und wurde erstmals 1936 durch Gerstmann, Sträussler
und Scheinker beschrieben (Richardson und Masters, 1995). Mit dem Begriff GSS wird eine
heterogene Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen mit familialem Ursprung, sich selten
manifestierenden anormalen EEGs und der neuropathologischen Erscheinung von zahlreichen
Amyloid-Plaques bezeichnet. GSS wird als eine Variante der familialen CJD betrachtet, ist
aber vor allem mit Mutationen des Codons 102 und weniger häufigen Mutationen der Codons
105, 117, 145, 198 oder 217 im Gen des Prion-Proteins assoziiert (Doh-ura et al., 1989;
Gadjusek, 1996). Die Krankheit tritt mit einer Häufigkeit von 5 Fällen pro 100 Millionen
Einwohner auf. Die verschiedenen Mutationen des Prion-Protein-Gens führen zu
Unterschieden in klinischen Krankheitsbild, Alter zum Zeitpunkt des Krankheitsausbruchs
und Krankheitsdauer. Die Mutation an Codon 102 ist die häufigste Genveränderung bei GSS.
2.1.1.4 Fatale Familiale Insomnie (FFI)
Die Bezeichnung wurde 1986 erstmals verwendet, um das Krankheitsbild eines 52-jährigen
zu beschreiben, der an fortgeschrittener Schlaflosigkeit und autonomer Disfunktion, gefolgt
von Disarthrie und Zittern, litt. Zwei Schwestern und weitere Familienmitglieder des
Patienten waren an einer ähnlichen Krankheit gestorben (Lugaresi et al., 1986). Eine
neurologische Untersuchung zeigte neuronale Degeneration und Astrozytose in den anterioren
und dorsomedialen Nuklei des Thalamus; spongiforme Veränderungen oder Entzündungen
fehlten völlig. Eine Studie kam zum Ergebnis, dass FFI autosomal dominant vererbt wird. Das
Durchschnittsalter bei Ausbruch der Krankheit war 49.3 Jahre, die Krankheit dauerte 12.5
Monate. Die vorherrschende Eigenschaft von FFI ist der Befall des Thalamus, was mit
schweren Schlafstörungen, oft mit unbehandelbarer Schlaflosigkeit und autonomer
Disfunktion (z.B. Bluthochdruck, Herzrhythmusstörungen, Hyperthermie) einhergeht
(Manetto et al., 1992). Der zirkadische Rhythmus bei der Produktion von Wachstumshormon,
Prolaktin und Melatonin kann verloren gehen. Im Vergleich zu anderen TSE hat das mit FFI
assoziierte PrPSc eine anderes Glykosylierungs- und Grössenmuster (Monari et al., 1994).
8
Einleitung
2.1.2 TSE im Tier
Auch Tiere könne an TSE erkranken. In ätiologischer, klinischer und anatomischpathologischer Sicht sind sie den TSE-Erkrankungen beim Menschen ähnlich. Experimentell
sind zwar die meisten Säugetiere infizierbar, auf natürlichem Weg sind aber nur einzelne
Vertreter der Ordnungen Artiodactyla (Paarhufer), Carnivora (Fleischfresser) und Primates
(Affen) von TSE betroffen.
TSEErkrankung
Klinische Symptome
Neuropathologische
Merkmale
BSE
Ängstlichkeit
Ataxie
Niederstürzen
Festliegen
Überempfindlichkeit auf Berührungen
Vakuolisierung
Neuronale Degeneration
Gliose
Scrapie
Juckreiz
Hyperästhesie
Ataxie
Ängstlichkeit
Aggressivität
CWD
Chronische Abmagerung
Apathie
Zwangsbewegungen
Zittern
Ataxie
FSE
Verhaltensänderungen
Bewegungsstörungen
Hyperästhesie
Koordinationsstörungen
Vakuolisierung
Neuronaler Verlust
Gliose
TME
Hyperästhesie
Aggressivität
Schwäche
Somnolenz
Gliose
Neuronaler Verlust
Gliose
Neuronaler Verlust
Amyloid-Plaques
Tabelle 2.2: Klinische Symptome und neuropathologische Merkmale von TSE beim Tier
2.1.2.1 Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE)
2.1.2.1.1 Entstehung
Die ersten bestätigten Fälle von BSE wurden 1986 in Grossbritannien gemeldet;
möglicherweise gab es jedoch schon Erkrankungen in den 80er oder sogar 70er Jahren, die
aber nicht als TSE erkannt wurden (Philipps et al., 2000; Horn et al., 2001). Die klinischen
Symptome und neuropathologischen Eigenschaften waren mit keiner anderen Rinder9
Einleitung
Erkrankung zu vergleichen; die histologischen Veränderungen wiesen aber grosse Ähnlichkeit
mit denen von Scrapie-infizierten Schafen auf. In der Folge wurden immer mehr neue Fälle
gemeldet, so dass vom Ausbruch einer grösseren Epidemie ausgegangen werden musste.
Seither wurden in Grossbritannien mehr als 180´000 Fälle diagnostiziert. Eine Serie von
epidemiologischen Untersuchungen wurde durchgeführt, um zu ergründen, wie die Krankheit
entstanden sein könnte. Diese Studien zeigten, dass der Gebrauch von Mehl tierischen
Ursprungs (Meat-and-Bone Meal, MBM) als Futterzusatzstoff das verbindende Element
zwischen den Betrieben war, in denen die BSE-Fälle aufgetreten waren (Wilesmith et al.,
1988; Wilesmith et al., 1991), und dass dadurch die Infektion verbreitet worden sein könnte.
Ein Anhaltspunkt dafür war die Häufung von BSE-Fällen in Milchkuh-Herden im Gegensatz
zum Schlachtvieh. Erstere werden oft schon in den ersten Lebenswochen mit Futterzusätzen
wie MBM gefüttert, während letztere lange vom Muttertier gesäugt werden. MBM wird aus
aufbereitetem Abfall von Schlachthöfen hergestellt. Dafür werden nicht für den Verzehr
freigegebene Teile von geschlachteten Tieren verschiedener Spezies (Schaf, Rind etc.)
verwendet; in einem „Rendering“ genannten Prozess wird das Abfallfleisch in Protein und
Fett aufgetrennt. Es wird angenommen, dass Veränderungen des „Rendering“-Prozesses
(Absenken der Temperatur, Verkürzung des Prozesses) in den späten siebziger und frühen
achtziger Jahren dazu geführt haben, dass der BSE-Erreger nicht mehr effizient genug
inaktiviert wurde, so dass das Vieh einer erhöhten Dosis des Agens im MBM ausgesetzt war
(Wilesmith et al., 1988). Warum BSE zuerst in Grossbritannien auftrat, ist unklar; eine
mögliche Ursache ist das hohe Schaf/Rind-Verhältnis, was zu einem höheren Anteil an
Schaffleisch im MBM und demzufolge zu einer höheren Wahrscheinlichkeit von einer
Scrapie-Kontamination führt. Eine andere Möglichkeit ist die Tatsache, dass in
Grossbritannien in den siebziger Jahren die Verfütterung von MBM auch an Kälber
eingeführt wurde; da junge Rinder besonders anfällig für eine BSE-Infektion sind (Anderson
et al., 1996; Horn et al., 2001), könnte dies ein Auslöser für die Epidemie gewesen sein.
Über die Entstehung von BSE gibt es mehrere Hypothesen. Weil das neuropathologische
Auftreten von BSE dem von Scrapie ähnlich ist, könnte angenommen werden, dass der BSEUrsprung bei einem Scrapie-ähnlichen Erreger aus Schafen oder bei Rindern, welche mit
einem Scrapie-ähnlichen Erreger infiziert waren, zu suchen ist (Wilesmith et al., 1988;
Wilesmith et al., 1991). Dagegen spricht, dass der BSE-Erreger sich von den vielen Stämmen
des Scrapie-Erregers stark unterscheidet. Eine andere Hypothese für die Entstehung von BSE
sagt aus, dass die Krankheit schon immer sporadisch in sehr geringer Häufigkeit im Rind
aufgetreten ist; durch eine Verkettung von unglücklichen Umständen kann Fleisch von einem
erkrankten Tier ins MBM geraten sein und die Epidemie verursacht haben.
2.1.2.1.2 Transmission
Die Fragestellung, ob BSE ausser über kontaminiertes MBM auch anderweitig vertikal oder
horizontal übertragen werden kann, wurde in mehreren Studien untersucht. Da BSE in
betroffenen Herden nur mit einer Häufigkeit von 5% auftritt, kann angenommen werden, dass
horizontale Übertragung wahrscheinlich nur selten oder gar nicht stattfindet. Eine Fallstudie
(Hoinville et al., 1995) beobachtete zwei Gruppen von Rindern, wovon die eine aus
Nachkommen von BSE-befallenen Kühen zusammengesetzt war. Die Kontrollgruppe
erkrankte um 10 % weniger an BSE als die Testgruppe. Dies wies auf einen maternellen
Risikofaktor in Hinsicht auf eine BSE-Erkrankung hin; ob dieser Faktor wirklich auf eine
maternelle Übertragung, eine genetische Prädisposition oder eine Kombination von beiden
zurückzuführen ist, konnte nicht endgültig aufgeklärt werden (Donnelly et al., 1997; Gore et
al., 1997; Curnow et al., 1997). Zusätzliche Untersuchungen kamen zum Schluss, dass Kälber,
die zeitnahe zum Auftreten von klinischen Symptomen geboren wurden, die grösste
10
Einleitung
Ansteckungswahrscheinlichkeit aufwiesen. Eine Hypothese besagt, dass maternelle
Übertragung nur eine Rolle spielt, wenn das Risiko der Ansteckung über kontaminiertes
Futter sehr hoch ist.
BSE kann experimentell auf parenteralem Weg vom Rind auf Mäuse (Fraser et al., 1992),
andere Rinder (Dawson et al., 1990a), Schweine (Wells et al., 2003), Schafe und Ziegen
(Foster et al., 1993), Nerz (Robinson et al., 1994), Makaken (Lasmézas et al., 1996) und
Meerschweinchen (Dawson et al., 2004) übertragen werden. Es gibt ausserdem viele
Hinweise darauf, dass BSE über Futtermittel auf andere Tierarten und auf den Menschen
übertragen worden ist. Es war auch möglich, BSE durch Verfütterung von infiziertem
Rinderhirn an Mäuse, Schafe, Ziegen, Rinder und Lemuren zu übertragen (Barlow und
Middleton, 1990; Robinson et al., 1994; Foster et al., 1993; Wells et al., 1994, 1998; Bons et
al., 1999). Es besteht also kein Zweifel daran, dass verschiedene Säugerarten bei
Verabreichung von infiziertem Material auf oralem Weg eine Anfälligkeit für BSE aufweisen.
Ausnahmen scheinen Schweine, Hunde und domestiziertes Wild, von denen bisher keine
BSE-Fälle gemeldet wurden, obwohl sie in Grossbritannien mit grosser Sicherheit ebenfalls
mit kontaminiertem MBM gefüttert wurden.
2.1.2.1.3 Epidemiologie
Sobald die vermutliche Ursache der BSE-Epidemie bekannt war, wurde 1988 in
Grossbritannien ein Verbot erlassen, welches die Verfütterung von aus Wiederkäuern
gewonnenes Protein an andere Wiederkäuer untersagte. Dieses MBM durfte aber immer noch
an Schweine und Geflügel verfüttert werden, da man diese Tiere als resistent betrachtete. Das
MBM-Fütterungsverbot beeinflusste den Verlauf der BSE-Epidemie in England, aber nicht im
erhofften Ausmass. Trotz des Verbots traten aber immer noch BSE-Erkrankungen bei Tieren
auf, die nach dem Erlass des Gesetzes (born after the ban, BAB) geboren worden waren.
Epidemiologische Untersuchungen an mit BSE infizierten BAB-Rindern ergab, dass die Fälle
am häufigsten in Ostengland auftraten, wo am meisten Schweinefarmen zu finden waren.
Weitere Untersuchungen führten zur Hypothese, dass diese BSE-Fälle durch WiederkäuerFutter verursacht wurden, welches durch für die Hühner- und Schweinmast bestimmtes MBM
kreuzkontaminiert wurde (Hoinville et al., 1995).
Die Zahl der BSE-Fälle ist seit 1992 um 40% pro Jahr gesunken. Obwohl BSE zuerst in
Grossbritannien identifiziert wurde, haben seither viele andere, meist europäische Länder
BSE-Fälle gemeldet. Wahrscheinlich wurde die Epidemie durch Importe von britischen, mit
BSE infizierten Rindern oder kontaminiertem MBM auf das europäische Festland
verschleppt. Da dort angewandten „Rendering“-Prozesse waren die gleichen wie in
Grossbritannien. Sobald die Rinder einmal mit BSE infiziert waren, wurde BSE vermutlich
wie in England durch Zufütterung von kontaminiertem MBM verbreitet. In Grossbritannien
wurde 1996 die Verfütterung von aus Säugetieren gewonnenem Protein verboten; in der EU
und in der Schweiz trat ein entsprechendes Gesetz erst 2001 in Kraft. Deshalb erreichte BSE
seinen Höhepunkt in jedem betroffenen Land zu einem anderen Zeitpunkt.
In der Schweiz wurde der erste BSE-Fall 1990 gemeldet; bis heute ist die Krankheit bei 433
Rindern diagnostiziert worden. MBM durfte ab 1990 nicht mehr an Rinder verfüttert werden.
Dies führte nach einer stetigen Zunahme ab 1995 zu einer drastischen Reduktion von BSEErkrankungen. Allerdings konnte diese Massnahme die Infektionskette nicht unterbrechen.
Ab 1995 erkrankten vermehrt BAB-Rinder; in der Folge wurde 1996 beschlossen,
Risikomaterial wie Gehirn, Augen und Rückenmark von Rindern zu verbrennen. Da auch
nach 1996 geborene Rinder BSE-Infektionen aufwiesen, wurde 2001 die Zugabe von MBM
zum Nutztier-Futter vollständig verboten. Die Verteilung der BSE-Fälle in der Schweiz wurde
mittels epidemiologischen Studien untersucht. Dabei zeigten sich in der Westschweiz zwei
11
Einleitung
Cluster von BSE-Erkrankungen von Tieren, die vor dem Fütterungsverbot (born before the
ban, BBB) geboren worden waren. Die BAB-Fälle konzentrierten sich auf den Kanton Luzern
und die beiden Appenzell. Als Risikofaktor für das Auftreten einer BAB-Erkrankung wurde
ein hohes Verhältnis Schweine-/Rindermastbetriebe ermittelt.
2.1.2.2 TSE in anderen Tieren
2.1.2.2.1 Scrapie
Scrapie, auch als Traberkrankheit oder Tremblante bezeichnet, ist beim Schaf schon seit über
250 Jahren bekannt (Comber, 1772), bei der Ziege ist Scrapie seit 1942 beschrieben (Chelle,
1942). Diese TSE-Erkrankung ist weltweit verbreitet, mit Ausnahme von Australien und
Neuseeland. In Grossbritannien, Irland, Frankreich und Island ist Scrapie endemisch, in
Deutschland, Norwegen und der Tschechoslowakei kommen sporadische Erkrankungen vor.
In der Schweiz wurden vom ersten Auftreten 1981 bis heute acht Scrapie-Fälle gemeldet. Bei
Scrapie ist im Gegensatz zu BSE bisher kein Zusammenhang mit der menschlichen
Erkrankung vCJD bekannt (Detwiler, 1992; SSC, 1998). Bei Experimenten, bei denen BSEkontaminiertes Futter verabreicht wurde, erkrankten Schafe und Ziegen an einer Krankheit,
die nicht von Scrapie unterschieden werden konnte. Es gibt aber bis heute keine Hinweise auf
eine Vorkommen der für den Menschen gefährlichen BSE in Schafpopulationen. Es wird
angenommen, dass die Übertragung von Scrapie innerhalb einer Population sowohl vertikal
(intrauterin auf eigene Nachkommen) als auch horizontal (auf andere Schafe in der
Umgebung) geschehen kann. Die Ansteckungsempfindlichkeit und die Ausprägung der
klinischen Symptome wird durch den Genotyp beeinflusst. Der jeweilige Scrapie-Stamm hat
grossen Einfluss auf die Krankheitsdauer, welche zwischen 2 Wochen und 6 Monaten
variieren kann. Für die Scrapie-Resistenz von Schafen sind hauptsächlich die verschiedenen
Allele der Codons 136, 154 und 171 im Schaf-PrP-Gen verantwortlich (Belt et al., 1995;
Clouscard et al., 1995; Hunter et al., 1997). Je nach Kombination der Allele variiert das TSERisiko und die Inkubationszeit.
2.1.2.2.2 Chronisch zehrende Krankheit (Chronic Wasting Disease, CWD)
CWD wurde bisher ausschliesslich bei vier verschiedenen Hirscharten (Maultierhirsch,
Schwarzwedelhirsch, Weisswedelhirsch und Wapiti) in den USA und Kanada festgestellt.
Erste Fälle von CWD wurden bereits 1967 im amerikanischen Bundesstaat Colorado
beschrieben, der Zusammenhang mit der Gruppe der TSE-Erkrankungen wurde jedoch erst
1978 durch histologische Untersuchungen aufgezeigt (Williams und Young, 1980). Sowohl in
Gefangenschaft lebende wie auch freilebende Tiere können betroffen sein; grobe Schätzungen
ergaben, dass ca. 1–6% des Bestandes an Weisswedelhirschen, bestimmten Gebieten sogar
11% der Tiere erkrankt sind sind. Von CWD sind meist erwachsene Tiere betroffen, die
Krankheit dauert von einigen Wochen bis zu einem Jahr. Zum Ursprung und zur Übertragung
von CWD ist noch wenig bekannt. Aufgrund von Studien muss aber davon ausgegangen
werden, dass die Krankheit horizontal übertragen werden kann (Miller et al., 1998). Bis heute
gibt es noch keinen Hinweis, dass die Krankheit in direktem Zusammenhang mit Scrapie im
Schaf oder mit einer anderen TSE steht. Ausserdem konnte der CWD-Erreger als eigener
Prionen-Stamm typisiert werden (Bruce et al., 1997), der sowohl zu den Scrapie-Stämmen
wie auch zum BSE-Stamm Unterschiede zeigt.
12
Einleitung
2.1.2.2.3 Feline Spongiforme Enzephalopathie (FSE)
Vier Jahre nach der Entdeckung von BSE wurde in England im Jahre 1990 bei einem
Siamkater erstmals FSE diagnostiziert (Wyatt et al., 1990). Bald darauf wurden weitere Fälle
beschrieben, und bis heute entdeckte man in Grossbritannien 97 Fälle bei Hauskatzen; auch
18 Raubkatzen erkrankten bisher in englischen Zoos an FSE. Die histopathologischen,
geografischen und zeitlichen Zusammenhänge sowie strain-typing Experimente (Bruce et al.,
1994) führten zum Schluss, dass der Erreger der FSE mit demjenigen der BSE identisch ist.
Man nimmt an, dass der Erreger durch den hohen BSE-Infektionsdruck, der zu Beginn der
neunziger Jahre in Grossbritannien herrschte, die Speziesbarriere überwinden konnte.
Nachdem die Beimischung der Risikoorgane Hirn und Rückenmark zum Tierfutter 1990
verboten wurde, gingen die FSE-Fälle deutlich zurück. Von den Tieren, die in den Jahren
nach dem Verbot geboren wurden, sind bisher nur acht an FSE erkrankt. FSE tritt nur bei
erwachsenen Tieren auf; das mittlere Alter liegt bei sechs Jahren. Die klinischen Symptome
entwickeln sich progressiv über mehrere Wochen und Monate. Die Symptome der an FSE
erkrankten Zoo-Feliden unterscheiden sich nicht von den klinischen Befunden der betroffenen
Hauskatzen.
2.1.2.2.4 Transmissible Nerz-Enzephalopathie (Transmissible Mink Encephalopathy,
TME)
TME ist eine sehr seltene Erkrankung, die nur bei in Farmen gehaltenen Nerzen beobachtet
worden ist. Sie wurde erstmals 1947 auf zwei US-amerikanischen Farmen beobachtet
(Hartsough und Burger, 1965). Weitere Ausbrüche wurden in den 60er- und 80er-Jahren in
den USA, Finnland, Russland, Kanada und Deutschland beschrieben (Marsh und Hadlow,
1992). Die Krankheit tritt nur bei Tieren ab einem Alter von neun Monaten auf, betroffen sind
vor allem erwachsene Tiere. Als Infektionsursache wird kontaminiertes Futter angesehen,
allerdings konnte nie nachgewiesen werden, welcher Futterbestandteil der Auslöser ist. Es
existieren verschiedene Hypothesen, nach denen die Verfütterung von BSE-infizierten
Rindern oder von mit Scrapie infizierten Schafkadaver an die Nerze die Krankheit ausgelöst
hat (Hadlow et al., 1987; Marsh et al., 1991).
2.1.2.2.5 TSE im übrigen Tierreich
Exotische wiederkäuende Paarhufer wie Antilopen oder Kudus können an BSE erkranken.
Alle bisher betroffenen Tiere sind in britischen Zoos aufgewachsen. Diese Erkrankung
unterscheidet sich aber von „klassischer“ BSE durch eine kürzere Inkubationszeit und eine
klinische Phase von nur einigen wenigen Tagen. Die betroffenen Spezies zeigen sehr varaible
Symptome, die sich von der BSE beim Hausrind und Scrapie bei Schaf und Ziege
unterscheiden (Wells und McGill, 1992). Eine Stamm-Typisierung zeigte aber praktisch
vollständige Übereinstimmung mit dem BSE-Erreger (Bruce et al., 1994). Deshalb kann
davon ausgegangen werden, dass die Tiere wahrscheinlich durch mit BSE kontaminiertes
Futter infiziert wurden.
Es gibt einige wenige TSE-Fälle bei Primaten (z.B. Lemuren) in französischen und britischen
Zoos, die vermutlich über kontaminiertes Futter angesteckt wurden.
Bei nicht wiederkäuenden Paarhufern wie Schweinen oder Flusspferden konnte bisher kein
TSE gefunden werden; auch Kamele und Giraffen scheinen von der Erkrankung nicht
betroffen zu sein. Ausser bei Katzen und Nerzen sind bisher bei keinen anderen
Fleischfressern TSE-Fälle gemeldet worden. Dies ist vor allem im Fall der Hunde interessant,
13
Einleitung
da sie weitgehend das selbe Futter wie Katzen erhielten. Auch Vögel sind gegen eine
Infektion mit TSE resistent, sogar Geflügel, das bis vor kurzem mit Tiermehl enthaltenden
Futtermitteln gefüttert wurde. Auch experimentell konnte keine Übertragung des Erregers auf
Vögel festgestellt werden.
2.1.3 BSE und vCJD
1996 wurde in Grossbritannien ein neuer Typ von CJD, genannt Variante von CJD (vCJD),
gemeldet (Will et al., 1996). Besorgniserregend war, dass das Erscheinen von vCJD zeitlich
und geografisch mit demjenigen von BSE zusammenfiel. Deshalb ist ein kausaler
Zusammenhang zwischen den beiden Krankheiten nicht ausgeschlossen. Die Zunahme an
gemeldeten vCJD-Fällen und eine Reihe wissenschaftlicher Studien, welche verstärkt auf eine
Verbindung von vCJD und BSE hinweisen, haben das Interesse und die Besorgnis der
Öffentlichkeit in Hinsicht auf CJD und andere Prionen-Erkrankungen geweckt.
Trotz aller eingeleiteten Massnahmen sind bis heute ungefähr 150 Menschen an vCJD
gestorben, die meisten davon in England. Während die meisten der bisher diagnostizierten
Fälle durch Infektion in Grossbritannien entstanden zu sein scheinen, gibt es auch in
Frankreich und Italien vCJD-Patienten, die sich die Erkrankung offenbar aber im eigenen
Land zugezogen haben. Zusätzlich gibt es mehrere Länder, die keine indigene vCJD
aufweisen, aber durch Einreise von an dieser Krankheit Leidenden trotzdem mit dieser
Problematik konfrontiert wurden, z.B. Irland, Hong Kong, Kanada und die USA. In der
Schweiz sind bisher keine vCJD-Fälle aufgetreten.
In Experimenten wurden BSE und vCJD auf transgene Mäuse übertragen. Dabei wurde eine
starke Ähnlichkeit zwischen BSE und vCJD nachgewiesen, da beide Krankheiten
Mäusestamme mit gleichem Genotyp befallen, das Läsionsmuster in den Mäusegehirnen
gleich ist und das PrPSc-Bandenmuster nach der Elektrophorese und die neuropathologischen
Befunde nach Übertragung in Makaken bei beiden Erkrankungen übereinstimmen (Bruce et
al., 1997; Hill et al., 1997; Lasmézas et al., 1996; Lasmézas et al., 2001). Offensichtlich
werden BSE und vCJD durch den gleichen PrP-Stamm verursacht (Collinge et al., 1996; Scott
et al., 1999). Die genaue Ursache der BSE-Übertragung auf den Menschen ist nach wie vor
unklar. Da die betroffenen Personen durch ihre berufliche Tätigkeit weder mit Schlachthöfen
noch mit Bauernhöfen etwas zu tun hatten, muss die Krankheit durch Konsum von BSEkontaminiertem Fleischerzeugnis (z.B. Wurst, Hamburger) zurückzuführen sein. Im Moment
kann die Anzahl der zu erwartenden vCJD-Fälle nicht vorausgesagt werden, da weder die
Inkubationszeit noch die zur Erkrankung führende Dosis an BSE-kontaminiertem Material
bekannt ist. Während die BSE-Fälle seit der Einführung des MBM-Fütterungsverbots an
Nutztiere rückläufig sind, stagniert vCJD unverändert auf niedrigem Niveau. Eine Analyse
der Daten von Neuerkrankungen und Todesfällen weist darauf hin, dass vCJD zwischen
Dezember 1998 und Juni 2001 seinen Höhepunkt überschritten hat; es ist aufgrund der
jährlich abnehmenden Anzahl von vCJD-Fällen anzunehmen, dass sich die Krankheit im
Moment zumindest in einer Plateau-Phase befindet. Es ist nun 12 Jahre her, seit in
Grossbritannien der Höhepunkt der BSE-Epidemie in 1992 überschritten wurde. Die lange
Zeitperiode ohne klares Auftreten eines Höhepunkts der vCJD-Fälle könnte ein Hinweis
darauf sein, dass Menschen gegenüber dem vCJD-Erreger teilweise resistent sind und/oder
die Dosis der BSE-Infektivität, welcher die Bevölkerung ausgesetzt war, relativ niedrig war.
Auf jeden Fall scheint es so, als ob mehr Menschen einer Infektionsquelle ausgesetzt waren
als wirklich an vCJD erkrankt sind. Interessant ist auch die Verteilung der vCJD-Fälle in
Grossbritannien. Während BSE vor allem in Süden auftrat, war die Häufigkeit von vCJD im
14
Einleitung
Norden höher und trat in Clustern auf (Cousens et al., 2001). Diese Variation könnte auf
geografisch bedingte Unterschiede in Ernährung oder Nahrungszubereitung zurückzuführen
sein.
Die Befürchtungen konzentrieren sich jetzt darauf, dass einzelne vCJD-Erkrankte
asymptomatische Träger der Infektion sein könnten (Race und Chesebro, 1998; Hill et al.,
2000; Race et al., 2001); diese Menschen könnten dann ihrerseits ein Risiko hinsichtlich der
Übertragung auf andere Menschen darstellen. Deshalb wird nun vermehrt darauf geachtet,
dass chirurgische Instrumente entsprechend gereinigt werden. Dies kann durch Autoklavieren
bei hohen Temperaturen und durch Behandlung mit Natriumhydroxid geschehen; diese
Massnahmen sind aber nicht bei allen Instrumenten anwendbar. Instrumente, welche bei
Patienten benutzt worden sind, welche später mit vCJD diagnostiziert worden sind, müssen
aus dem Verkehr gezogen und zerstört werden. Ausserdem besteht die Möglichkeit, dass
vCJD auch über Blut übertragen werden kann. Diese Annahme wurde durch die Tatsache
untermauert, dass BSE durch Bluttransfusion von Schaf zu Schaf übertragen werden kann
(Houston et al., 2000). Deshalb verwenden viele Länder keine Blutkonserven von Spendern,
die sich zwischen 1980 und 1996 länger als sechs Monate in Grossbritannien aufgehalten
haben, da sie unter Umständen von Spendern stammen könnten, welche während des
Höhepunkts der BSE-Epidemie mit BSE/vCJD in Berührung gekommen sind. In
Grossbritannien wurde 1998 die Depletion der weissen Blutkörperchen (Leukodepletion) von
allen Blutkonserven angeordnet. Während PrPSc mit Immuno- und Bioassays bisher in
Mandeln, Milz, Thymus, Lymphknoten und Darm-assoziierten Geweben (z.B. Blinddarm)
detektiert wurde, konnte bis heute keine Infektivität im Blut von vCJD-Patienten
nachgewiesen werden.
2.1.4 Prion
2.1.4.1 Die Prion-Hypothese
Im Jahr 1936 wurde entdeckt, dass Scrapie übertragbar ist. Der Erreger hatte eine lange
Inkubationszeit und eine bemerkenswerte Resistenz gegen konventionelle chemische und
physikalische Sterilisation aufwies. Diese ungewöhnlichen Eigenschaften führten zu einer
Vielzahl an Theorien. Ursprünglich wurde angenommen, dass die Krankheit durch einen
langsamen Virus verursacht würde. Das Virino-Modell beschrieb ein durch die Wirtzelle
exprimiertes, Protease-resistentes Protein, welches eine kurze DNA-Sequenz umhüllt. Doch
die Unempfindlichkeit gegenüber UV-Bestrahlung und ein Aktionsspektrum, welches das
Fehlen von Nukleinsäure nahe legte, führte schliesslich zur Hypothese, dass der TSEVerursacher ausschliesslich aus Protein besteht.
Das zelluläre Prion-Protein wurde erstmals in Experimenten identifiziert,
welche
durchgeführt wurden, um den exogenen Nukleinsäure-Komponenten des Verursachers von
TSE zu finden. Dieser infektiöse Erreger wurde aus dem Hirn von betroffenen Tieren isoliert.
Ein unlösliches Protein von 33-35 kDa genannt PrPSc (Prion Scrapie) wurde als wichtigster
Bestandteil des Erregers identifiziert. Prion ist eine Abkürzung für PROteinaceous INfectious
particle (Protein-artiges, infektiöses Partikel). Frühe Studien zeigten, dass das Protein,
welches man für den Erreger der TSE hielt, sich in seiner Aminosäuresequenz nicht von
derjenigen eines normalen Proteins unterschied, welches in Zellmembranen im ganzen
Zentralnervensystem vorkommt (Lansbury und Caughey, 1996). Es wurde deshalb
vorgeschlagen, dass dieses Protein in zwei verschiedenen strukturellen Formen vorkommt.
Die erste, die zelluläre Isoform PrPC, hat einen grossen α-Helix-Anteil (40%) und besteht nur
15
Einleitung
zu 3% aus β-Faltblättern. Die pathogene Variante, PrPSc, ist hingegen zum grösseren Teil aus
β-Faltblättern aufgebaut. Die Prion-Theorie besagt, dass ein erstes ins Zentralnervensystem
gelangendes PrPSc-Molekül die Transformation von normalem zellulären Prion-Protein zur
pathogenen Form durch Umwandlung von α-Helix zu β-Faltblatt katalysiert. Dabei findet
keine Aminosäure- oder kovalente posttranslationelle Modifikation statt. Das endogene PrPSc
ist danach Katalysator für weitere Umwandlungen von PrPC zu PrPSc. Es ist noch nicht klar,
ob TSE durch den toxischen Effekt von PrPSc oder durch einen Mangel an PrPC ausgelöst
werden.
Immer mehr Forschungsergebnisse stützen die Prion-Theorie. Z.B. sind PrP-Knock OutMäuse (PrP-/-) resistent gegen Scrapie, also ist die Expression von PrPC für eine TSEErkrankung absolut notwendig. Mäuse, welche PrPC überexprimieren, erkranken häufiger an
TSE (Melton und Moore, 1997). Die Transmission von TSE zwischen Spezies, deren PrPSequenzen sehr homolog sind, ist im allgemeinen höher als diejenige zwischen
unterschiedlicheren Spezies (Prusiner, 1997). In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte
gezeigt werden, dass Mäuse nach Inokulation mit Fibrillen aus rekombinant in E. coli
exprimiertem, β-Faltblatt-reichem Prion-Protein eine neurodegenerative Krankheit
entwickelten, deren neuropathologische Eigenschaften denjenigen von TSE entsprachen
(Legname et al., 2004). Dazu wurden Aggregate von N-terminal verkürztem Maus-PrP
(recMoPrP89-230; entspricht PrP27-30) generiert und in Mäuse transferiert, welche MoPrP89231 überexprimierten. Nach 530 Tagen waren fünf von sieben mit recMoPrP89-230
inokulierte Mäusen erkrankt, während das Kontrolltier (inokuliert mit PBS) immer noch
gesund war. Histopathologische Untersuchungen ergaben TSE-typische Befunde wie
Vakuolen in Cerebellum, Hirnstamm und Hippocampus, Astrozytose und PrPScAkkumulation in der grauen Hirnmasse. Das aus den Gehirnen der erkrankten Mäuse isolierte
PrPSc wies ausserdem auch eine Resistenz gegenüber einer Proteolyse mit Proteinase K auf.
Wurden gesunde Mäuse mit dem isolierten PrPSc inokuliert, so erkrankten auch diese an der
neurodegenerativen Krankheit. Die erhaltenen Ergebnisse weisen verstärkt darauf hin, dass
PrP sowohl notwendig als auch ausreichend für eine TSE-Infektion ist.
Es gibt aber auch Punkte, die gegen diese Theorie sprechen. Skeptiker halten es für möglich,
dass ein sehr kleiner Virus der Zerstörung durch UV-Bestrahlung entgehen und so die
Information für die Krankheit übertragen könnte. Einige Elemente der PrPStrukturinformation wiesen auf die Fähigkeit zur Nukleinsäure-Bindung hin. Ausserdem
wurde gezeigt, dass der Erreger durch Chemikalien inaktiviert wird, welche Partikel aus
Nukleinsäure und Protein aufbrechen. Eine Behandlung von Scrapie-infizierten Hamstern mit
Amphotericin B bewirkt zwar eine Reduktion der PrPSc-Produktion, aber keine Änderung der
Infektivität des Hamsterhirns.
2.1.4.2 Das-Prion-Protein
Das Prion-Protein existiert, wie schon oben erwähnt, in den zwei Isoformen PrPC und PrPSc
(siehe Bild 2.2). PrPC ist ein lösliches, monomeres Protein, welches in unglykosylierter,
mono- und diglykosylierter Form mit einer Masse zwischen 33 und 35 kDa, je nach
Glykosylierung, vorkommt. Das Protein hat nach der Expression eine Länge von 254
Aminosäuren (siehe Bild 2.3); durch Abspaltung des Signalpeptids (Aminosäuren 1 – 22)
wird das Protein posttranslational verkürzt. Bei der Befestigung von PrPC an der Zellmembran
durch einen GPI-Anker werden die letzten 23 Aminosäuren des C-Terminus abgespalten. Das
reife Protein enthält also die Aminosäuren 23-231.
16
Einleitung
Bild 2.2: Isoformen des Prion-Proteins; links: PrPC (NMR-Struktur); rechts: PrPSc (Modell); grün: α-Helices;
blau: β-Faltblätter; gelb: unstrukturierter Anteil
Die Proteinstruktur von PrPC, welche aus NMR-Messungen berechnet wurde, enthält drei αHelices; der Rest wird durch unstrukturierte Regionen, welche auch ein langes OktapeptidWiederholungsregion zwischen den Aminosäuren 51 – 91 beinhalten, und ca. 3% β-FaltblattAnteil gebildet. Andere wichtige Strukturmerkmale sind eine einzelne Disulfidbrücke
zwischen den Aminosäuren 179 und 214 und zwei Glykosylierungsstellen an den
Aminosäuren 181 und 197; letztere sind die Basis für die Bildung von GlykoformVerhältnissen, welche für die jeweilige TSE-Form charakteristisch sind.
Die pathogene Isoform des Prion-Proteins, PrPSc, besteht aus derselben Abfolge aus
Aminosäuren. Im Gegensatz zu PrPC besteht PrPSc hauptsächlich aus β-Faltblättern (40%); die
restliche dreidimensionale Konformation des Proteins wird durch α-Helices (30%) und
unstrukturierte Regionen gebildet. PrPSc unterscheidet sich nicht nur in der Struktur vom
zellulären Prion-Protein. Während PrPC durch Proteinase K vollständig abgebaut wird, Enhält
PrPSc eine Region, genannt PrP27-30, welche Protease-resistent ist und die letzten 142
Aminosäuren von PrPSc beinhaltet. Bei PrPSc sind die hydrophoben Regionen des Proteins
exponiert, so dass PrPSc-Moleküle miteinander Aggregate bilden.
Bild 2.3: Aufbau des Prion-Proteins
17
Einleitung
Die PrP-Sequenzen von verschiedenen Spezies zeigen mit Ausnahme von Hühner-PrP eine
erstaunliche Übereinstimmung mit der Sequenz des menschlichen Prion-Proteins (siehe Bild
2.4); dies weist darauf hin, dass das Protein eine wichtige Funktion einnimmt, welche deshalb
während der Evolution konserviert wurde.
Die aminoterminale Domäne von Säugetier-PrP enthält fünf oder mehr Kopien einer
P(H/Q)GGG(G)WGQ-Sequenz (Octarepeats). Diese Wiederholungen sind bemerkenswert
konserviert zwischen den verschiedenen Spezies. Das Hühner-Prion-Protein enthält eine
andere Wiederholungssequenz, PGYP(H/Q)N (Harris et al., 1989). Eine Deletion einzelner
Octarepeats scheint zu keiner Erkrankung zu führen, und die Entfernung aller Repeats kann
die Umwandlung von PrPC in PrPSc nicht verhindern (Rogers et al., 1993; Fischer et al.,
1996). Es wurde gezeigt, dass diese Oktarepeats Metallionen binden; diese Eigenschaft wurde
für die Purifikation von rekombinantem PrP ausgenützt (Pan et al., 1992). Die grösste
Affinität weisen die Oktarepeats für Kupfer aus. Dies könnte ein Hinweis auf eine Funktion
von PrPC als Kupfer-bindendes Protein sein (Requena et al., 2001).
Interessanterweise wurden Prion-ähnliche Proteine auch in Hefe und anderen Pilzen gefunden
(Wickner, 1994; Deleu et al., 1993, Coustou et al., 1997).
Bild 2.4: Vergleich zwischen den PrP-Sequenzen verschiedener Spezies; schwarz unterlegt: Aminosäuren, die an
dieser Stelle im Prion-Protein in drei oder mehr PrP-Sequenzen konserviert sind
2.1.4.2.1 Die Zellbiologie des Prion-Proteins
PrPC ist ein normales zelluläres Protein und wird in Neuronen und Glia-Zellen von Gehirn
und Rückenmark sowie in verschiedenen peripheralen Geweben und in Leukozyten
exprimiert. von Glia-Zellen Wie andere Membranproteine wird PrPC im rauhen
Endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert und durchwandert auf seinem Weg zur
Zelloberfläche den Golgi-Apparat. Während seiner Synthese wird das Prion-Protein auf
verschiedene Arten posttranslational modifiziert, u.a. durch Abspaltung eines N-terminalen
Signalpeptids, Addition von zwei Oligosaccharid-Ketten, Bildung einer einzelnen
Disulfidbrücke und Anheftung eines
GPI-Ankers. Moleküle, bei denen beide
18
Einleitung
Glykosylierungsstellen durch Mutation entfernt wurden, hatten ähnliche biochemische
Eigenschaften wie PrPSc (Lehmann und Harris, 1997). Während des PrPC-Metabolismus wird
das zelluläre Prion-Protein zweimal posttranslational gespalten. Bei der ersten Spaltung wird
der GPI-Anker abgetrennt und das Protein in das extrazelluläre Medium entlassen. Die zweite
Spaltung ist proteolytischer Art und geschieht in einem konservierten Segment von 16
hydrophoben Aminosäuren. Die Bedeutung dieser zweiten Spaltung ist unbekannt.
Es gibt Hinweise darauf, dass PrPC in Neuronen entlang der Axone zu den Nervendungen
transportiert wird. In Experimenten mit Zellinien konnte gezeigt werden, dass PrPC nach der
Expression nicht an der Zelloberfläche bleibt, sondern ständig zwischen der Plasmamembran
und einem endozytischen Kompartiment pendelt (Shyng et al., 1993). Dieser Vorgang ist
insofern interessant, als dass auf diesem Weg die Umwandlung von PrPC zu PrPSc stattfinden
könnte. Ausserdem könnte dieses Wandern zwischen zwei Kompartimenten ein Hinweis
darauf sein, dass PrPC als Rezeptor für einen extrazellulären Liganden, z.B. Kupferionen,
dienen könnte. Die Endozytose von PrPC findet in Clathrin-bedeckten Vertiefungen statt
(Shyng et al., 1994). Nach der Bindung von PrPC an Clathrin wird im Innern der Zelle eine
Membranvesikel abgeschnürt, welches dann das Clathrin-gebundene Protein zu
intrazellulären Organellen transportiert. Ein Rezeptor für PrPC an der Zelloberfläche konnten
bisher nicht identifiziert werden.
Bisher ist nicht bekannt, wie PrPSc an der Zelloberfläche verankert ist. Da auch die pathogene
Isoform des Prion-Proteins einen GPI-Anker besitzt, wird angenommen, dass das Protein
gleich wie PrPC mit dieser Struktur an der Zellmembran befestigt ist.
Es wird angenommen, dass die Konversion von PrPC zu PrPSc posttranslational erfolgt. PrPSc
hat eine wesentlich längere Lebensdauer als PrPC (48 h resp. 4-6 h). Wo diese Konversion
stattfindet, ist nach wie vor unbekannt. Möglicherweise findet die Umwandlung in den
Endosomen auf dem Weg zu den intrazellulären Organen statt. Eine andere Hypothese
postuliert, dass die Konversion bereits bei der Faltung der exprimierten Proteine im ER
stattfindet (Daude et al., 1997).
Bei PrPSc wird nach der Expression durch eine proteolytische Spaltung ein Teil des NTerminus abgetrennt, so dass PrP27-30 entsteht. Diese Spaltung geschieht vermutlich in den
Endosomen oder Lysosomen. Die genaue Lokalisierung der Konversion von PrPC zu PrPSc
könnte wichtige Hinweise auf eine mögliche therapeutische Behandlung von TSEErkrankungen geben.
2.1.4.2.2 Replikation von PrPSc
Der Mechanismus der PrPSc-Replikation, d.h. der Umformung von PrPC in die pathogene
Isoform PrPSc, konnte bis heute nicht aufgeklärt werden. Zwei Hypothesen werden favorisiert:
1) Der Nukleations-Polymerisations-Prozess
Bei diesem Modell bindet PrPC an einen Kern aus PrPSc-Molekülen. Das zelluläre Protein
wird dabei zu PrPSc umgeformt und bleibt an den PrPSc-Kern gebunden, wodurch dieser
wächst und schliesslich eine sogenannte Plaque entsteht
2) Die Protein X-assistierte Bildung von PrPSc
Im ersten Schritt bindet PrPC an ein Protein X, so dass ein PrP*-Protein X-Komplex
geformt wird (PrP* bezeichnet ein PrPC-Molekül mit leicht veränderter Konformation). Als
nächstes bindet PrPSc an diesen Komplex und transformiert PrP* in ein neues PrPScMolekül. Dabei wird das Protein X freigesetzt, das PrPSc-Dimer bleibt zurück. Durch dieses
Matrizen-Modell wird auch die Propagation von verschiedenen Prionen-Stämmen erklärt.
19
Einleitung
So bewirkt ein in Mäusehirn eingeschleustes Hamster-PrPSc-Molekül die Umwandlung von
Maus-PrPC zu Hamster-PrPSc- und nicht zu Mäuse-PrPSc-Molekülen.
Bild 2.5: Modelle der Konversion von PrPC zu PrPSc; a) Umwandlung durch Bildung eines Heterodimers aus je
einem PrPC- und PrPSc-Monomer; b) Umwandlung durch Bindung eines PrPC-Monomers an ein PrPSc-Aggregat
(Nukleations-Modell); c) spontane Umwandlung von PrPC in PrPSc mit anschliessender Bindung an ein PrPScAggregat
PrPC
PrP* / Protein X
PrPSc / PrP* / Protein X
Protein X + (PrPSc)2
Bild 2.6: Modell der Protein X-assistierten Konversion von PrPC zu PrPSc; rote Pfeile: Reaktionsweg, der zur
Bildung von PrPSc führt
2.1.4.2.3 Physiologische Funktion des zellulären Prion-Proteins
Die Konservierung von PrPC innerhalb verschiedenener Spezies weist auf eine Rolle in
physiologischen Prozessen hin. Während der letzten Jahren wurde in vielen Studien versucht,
die physiologische Funktion von PrPC zu verstehen. Vorgeschlagen wurde z.B. eine Rolle bei
der Ligandbindung, der Zelladhäsion oder der Signalübertragung innerhalb der Zelle, der
Neuroprotektion und bei metabolischen Funktionen in Zusammenhang mit der Kupferbindenden Eigenschaft des Proteins.
20
Einleitung
Verschiedenen Studien haben gezeigt, dass PrPC Kupfer über vier Histidin-enthaltende
Peptid-Wiederholungen in der N-terminalen Hälfte des Proteins bindet (Hornshaw et al.,
1995; Brown et al., 1997; Viles et al., 1999). In Gegenwart von Kupfer weist der sehr flexible
Aminoterminus von PrPC einen höheren Strukturierungsgrad auf. In einer Studie wurde
gezeigt, dass Zellen mit PrPC eine höhere Resistenz gegenüber oxidativem Stress aufweisen
als PrP-/--Zellen (Brown et al., 1997; Brown und Besinger, 1998); ausserdem scheint das
antioxidierende Enzym Cu/Zn Superoxid-Dismutase (SOD-1) in Gegenwart von hohen PrPCKonzentrationen eine verbesserte Aktivität zu haben. Es wurde deshalb vorgeschlagen, dass
PrPC eine Rolle bei der Übermittlung von Kupfer an Cuproenzyme wie SOD-1 spielt und so
zum Schutz der Zelle vor oxidativem Stress beiträgt. Eine andere Hypothese besagt, dass PrPC
durch seine Lokalisierung an der Synapse eine Funktion bei der synaptischen KupferHomöostase innehaben und durch die Beeinflussung des Kupfergehalts im synaptischen Spalt
die Transmission regulieren könnte (Brown et al., 1997; Herms et al., 1999). An der
Zelloberfläche dient das zelluläre Prion-Protein möglicherweise als Fänger für extrazelluläre
Kupferionen und als Transportprotein von Kupfer ins Zellinnere.
Ein anderer Vorschlag zur Funktion von PrPC ist die Protektion von Neuronen durch das
Prion-Protein. Mäuse, bei welchen das Prnp-Gen fehlte oder durch ein Intron unterbrochen
war, entwickelten fortschreitende Symptome von Ataxie (Sakaguchi et al., 1996; Moore et al.,
1999). Das Gehirn der betroffenen Mäuse wies eine geschrumpftes Cerebellum auf, was
durch einen ausgedehnten Verlust von Purkinje-Zellen verursacht wurde. Daraus wurde
abgeleitet, dass PrPC eine Rolle bei der langfristigen Erhaltung dieser Zellen hat.
Die Hypothese, dass PrPC ein Signaltransduktions-Protein ist, wird durch die Erkenntnis
gestützt, dass PrPC durch Erhöhung der Fyn-Phosphorylierung eine Signalkaskade auslöst;
Vermittler zwischen dem extrazellulären PrPC und Fyn im Zellinnern ist das Protein
Caveolin-1. Welcher Ligand von PrPC die Signalübertragung auslöst, ist aber nicht bekannt.
Man hatte gehofft, dass die Identifizierung von PrPC-bindenden Proteinen Hinweise auf die
Funktion von PrPC geben würde. Das zelluläre Prion-Protein bindet u.a. an Apolipoprotein 1,
Tyrosin-Phosphatase, Hitzeschock-Protein 60 und dem 37 kDa-Vorläufer des LamininRezeptors. Die physiologische Funktion dieser Interaktionen ist aber unklar und muss weiter
untersucht werden.
2.1.4.2.4 Das Prion-Protein-Gen
Das Prion-Protein (PrP)-Gen Prnp gehört zur Prn-Genfamilie. Das andere Mitglied dieser
Familie ist das Doppel (Dpl)-Gen Prnd (1.2.4.2.5). Die Lokalisierung des PrP-Gens beim
Menschen auf dem kurzen Arm von Chromosom 20 und bei der Maus in der analogen Region
von Chromosom 2 (Sparkes et al., 1986) spricht für eine Existenz des PrP-Gens vor der
Artentrennung der Säugetiere. Schon vor vielen Jahren wurde in Studien gezeigt, dass PrnpGene den typischen Intron-Exon-Aufbau von Säugetier-Kernproteinen aufweisen. Das
Hamster-Gen enthält zwei, diejenigen von Maus, Ratte, Schaf, Rind und Mensch drei Exons.
Das gesamte offene Leseraster (Open Reading Frame, ORF) aller bekannten Säuger- und
Vogel-PrP-Gene ist in einem einzelnen Exon enthalten, wodurch die Entstehung von PrPSc
durch alternatives Spleissen der mRNA ausgeschlossen werden kann (Basler et al., 1986;
Goldmann et al., 1988; Puckett et al., 1991). Gleichzeitig kann durch das Fehlen mehrerer
codierender Exons auch die Möglichkeit von gespleissten Formen von PrPC mit
unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften und/oder subzellulärer Lokalisierung
eliminiert werden. Die Promotor-Region von Prnp wird von einem Exon gefolgt, welches für
eine kurze, nicht transliierte 5´-Region (Untranslated Region, UTR) codiert. Daran
anschliessend findet sich ein kurzes Intron (ca. 2 kb) und eine zweites 5´-UTR-Exon; diese
Region fehlt beim Hamster. Auf ein grösseres Intron (ca. 10 kb) folgt dann ein Methionin,
21
Einleitung
welches den Translationsstart darstellt und sich nahe der Spleiss-Stelle des dritten, Proteincodierenden Exons befindet. Nach dem Stop-Codon bildet ein 3´-UTR-Exon mit je nach
Spezies variierender Länge das Ende des Gens.
2.1.4.2.5 Doppel
Bild 2.7: Vergleich zwischen den Protein-Strukturen von Prion und Doppel; links: Maus-PrP; Mitte: MausDoppel-Protein; rechts: Hamster-PrP; rot: α-Helix; grün: β-Faltblatt; grau: unstrukturierte Region
Doppel (Downstream Prion Protein-like Gene; Dpl) ist, wie der Name schon sagt, ein PrPähnliches Protein, dessen Gen Prnd ca. 19 kb unterhalb Prnp liegt. Die beiden Proteine sind
vermutlich durch Genverdopplung entstanden. Obwohl die Gensequenzen nur noch zu etwa
25% identisch sind, stimmen die Strukturen der beiden Proteine weitgehend überein (Mo et
al., 2001). Das 3´-UTR-Exon von Prnd ist durch ein Intron unterbrochen und wird auf
verschiedene Arten gespleisst, was zu einem Polymorphismus der mRNA führt (Moore et al.,
1999).
Die Expression von Prnd unterliegt stringenterer Kontrolle als Prnp. Die Dpl-mRNA und das
Protein konnten in Hoden und Herz von Erwachsenen, aber nicht im Zentralnervensystem
detektiert werden. Untersuchungen der Aminosäuresequenz ergaben, dass es sich bei Dpl um
eine N-terminal verkürzte Version von PrPC handelt; die Struktur besteht aus drei α-Helices
und zwei kurzen β-Faltblättern mit zwei Disulfidbrücken und zwei Glykosylierungsstellen.
Ausserdem wird vermutet, dass Dpl wie PrPC durch einen GPI-Anker an der Zelloberfläche
befestigt ist. Trotz aller Ähnlichkeit zwischen den beiden Proteinen ist es aufgrund von
Differenzen in Proteinsequenz, Struktur und Lokalisierung wenig wahrscheinlich, dass Dpl
ähnlich wie PrPC ebenfalls eine alternative pathogene Konformation einnehmen kann (Moore
et al., 1999; Mo et al., 2001). In Prnp-Knockout-Mäusen kann eine Überexpression von Dpl
zum Zelltod von Nervenzellen im Cerebellum führen; die eigentliche Funktion von Dpl ist
aber nach wie vor unbekannt.
2.1.5 Diagnose von TSE
Bei TSE kann die Diagnose nicht wie bei anderen Infektionskrankheiten mit konventionellen
Methoden wie PCR, Serologie oder Zellkultur-Assays durchgeführt werden. Der Grund dafür
ist die fehlende Nukleinsäure-Komponente des Prions; es besteht nur aus einem falsch
22
Einleitung
gefalteten Konformer und wird vom infizierten Organismus nicht als fremd erkannt, weshalb
auch keine Immun- oder Entzündungsreaktion erfolgt. Die höchste Priorität liegt nun bei der
Entwicklung eines zuverlässigen Tests, der mit leicht erhältlichen Proben (Urin, Speichel,
Blut) von lebenden Tieren oder Menschen durchgeführt werden und welcher die Krankheit
auch im frühen Stadium detektieren kann. Bis dahin wird die definitve TSE-Diagnose mit
bewährten, aber zeitaufwendigen Methoden mit post-mortem entnommenen Proben erstellt.
Der erste Schritt bei der Untersuchung eines möglichen TSE-Falls ist die Beurteilung der
auftretenden klinischen Symptome. Die diagnostischen Kriterien sind für jede TSEErkrankung festgelegt. Stimmen die klinischen Anzeichen mit denen überein, welche
üblicherweise bei einer bestimmten Prionen-Erkrankung als typisch angesehen werden, kann
im Allgemeinfall von einer Infektion mit dem TSE-Erreger ausgegangen werden. Ein
aufgrund von klinischen Symptomen allein bestehender TSE-Verdacht ist aber für eine
definitive Diagnose keinesfalls ausreichend.
Ist aufgrund der klinischen Symptome eine TSE-Erkrankung wahrscheinlich, muss die
Diagnose durch weitere Untersuchungen verifiziert werden. Die post-mortem durchgeführte
neuropathologische Examination von Hirngewebe humaner oder tierischer Herkunft ist noch
immer der „Gold-Standard“ der TSE-Diagnose. Die Analyse beinhaltet die Detektion von
Läsionen wie spongiforme Veränderungen der grauen Substanz, intraneuronale
Vakuolisierung und Gliose. Artefakte infolge Autolyse oder ungenügender Fixation können
spongiforme Veränderungen verursachen, die eine Ähnlichkeit zu echter TSE-bedingter
Vakuolisierung zeigen. Deshalb sind eine gute Fixation und sorgfältige histologische
Techniken essentiell, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erzielen.
Die Immunhistochemie (IHC) erlaubt den Nachweis von PrPSc in Mikrotom-Schnitten von
Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem Gewebe. Heute sind mehrere monoklonale und
polyklonale Antikörper kommerziell erhältlich, die ein oder mehrere Epitope von PrP
erkennen. Da diese Antikörper auch an PrPC binden, muss der Gehirnschnitt zuerst mit
Proteinase K vorbehandelt werden, so dass nur der proteaseresistente Kern von PrPSc, genannt
PrP27-30 oder PrPres, zurückbleibt. Dieser erscheint dann als fibrilläres und granuläres Material
im Neurophil, zwischen Nervenzellen und entlang der Axone, und kann dann mikroskopisch
erkannt werden. Ein weiteres typisches Merkmal der TSE ist die Anhäufung von PrPSc in
sogenannten „Scrapie Associated Fibrils“ (SAFs). Diese SAFs können isoliert und mittels
Elektronenmikroskopie untersucht werden. Bei bestimmten Formen von TSE bilden die SAFs
dichte Aggregate (Plaques), welche die physikalische Eigenschaften von Amyloid haben und
deshalb mit einer Kongorot-Färbung nachgewiesen werden können. Die IHC ist die
empfindlichere Methode als die Histophathologie, da PrPSc immunhistochemisch früher als
spongiforme Veränderungen nachgewiesen werden kann.
Eine Anzahl sensitiver und zuverlässiger diagnostischer Schnelltests für BSE-infizierte Tiere
sind heute auf dem Markt erhältlich. Obwohl noch alle auf die post mortem-Untersuchung
beschränkt sind, werden die Tests laufend weiterentwickelt und angepasst, so dass bald die
Detektion einer BSE-Infektion in präklinischen Tieren möglich sein sollte. Mit Hilfe von
Schnelltests kann eine grosse Anzahl Proben in kurzer Zeit analysiert werden. Ein positives
Ergebnis des Schnelltests muss aber in einem Referenzlabor durch histopathologische
Untersuchungen verifiziert werden. Bis jetzt sind fünf Schnelltests von der Europäischen
Gemeinschaft zugelassen: Enfer Scientific Test (Abbott), Prionics®-Check Western
(Prionics), Prionics®-Check LIA (Prionics), Platelia™ (CEA BioRad) und CDI (Inpro). Die
ersten vier Tests basieren auf der Detektion von PrPres nach einer Behandlung der
Gewebeprobe mit Proteinase K. Beim Enfer Scientific Test, Prionics®-Check LIA und
Platelia™ handelt es sich um sogenannte Sandwich-ELISAs (siehe 2.2.6); bei ersterem wird
eine Probe aus dem Rückenmark, bei den beiden anderen eine Gehirnprobe verwendet. Die
Durchführung der drei ELISAs dauert je etwa vier Stunden. Der Prionics®-Check WesternSchnelltest ist eine nach dem Prinzip des Western Blots funktionierende Methode, bei welcher
23
Einleitung
PrPres aus Hirngewebe nachgewiesen werden kann; die Dauer dieses Tests beträgt ca. 8 – 10
Stunden. Beim konformationsabhängigen Immunoassay (Conformation Dependent
Immunoassay, CDI) wird die unterschiedliche Bindungsaffinität von Antikörpern an natives
oder denaturiertes PrPSc untersucht. Die entsprechenden Signale werden quantifiziert und die
Differenz als diagnostisches Kriterium verwendet. Der klare Vorteil der Schnelltests ist das in
kurzer Zeit erhältliche Resultat; die Nachteile beinhalten die Anfälligkeit auf Variationen
innerhalb einer TSE und Veränderungen der PrPSc-Konzentration im Verlauf der Krankheit.
Eine zusätzliche Diagnosemethode ist der Bioassay in Versuchstieren; dabei werden normale
oder transgene Mäuse intrazerebral, intraperitonal, intramuskular oder subkutan mit dem
TSE-Erreger infiziert. Diagnosen werden aufgrund von klinischen Symptomen,
Krankheitsdauer und post-mortem Untersuchung des Gehirns gestellt. Der Bioassay ist die
sensitivste aller Prion-Detektionsmethoden und kann auch zwischen verschiedenen TSEStämmen unterscheiden. Seine Anwendung ist aber durch die langwierige Durchführung und
den Speziesbarrieren-Effekt limitiert.
2.1.6 Prävention und Therapie von TSE
2.1.6.1 Prävention von TSE
Durch die BSE-Epidemie und das Auftreten von vCJD sind die TSE in den Mittelpunkt des
öffentlichen Interesses gerückt. Besonders besorgniserregend ist die potentielle
Übertragbarkeit von Scrapie und CWD auf Tiere sowie BSE auf den Menschen. Um
bestehende Epidemien einzudämmen, weitere Erkrankungen zu vermeiden und das Auftreten
weiterer neuer TSE weitestgehend zu verhindern, müssen Richtlinien für das Verhalten im
Labor und Operationssaal, die Futter- und Nahrungsmittelfabrikation und die Herstellung
biologischer und medizinischer Produkte eingeführt und ihre Einhaltung kontrolliert werden.
Die Pflege eines an einer Prionen-Erkrankung leidenden Menschen stellt für das PflegePersonal keine ausserordentliche Gefährdung dar, da TSE-Krankheiten nicht ansteckend sind;
bisher wurde kein Hinweis auf eine Übertragung von Prionen durch Berührung oder Aerosol
gefunden. Trotzdem sollten Vorsichtsmassnahmen angewendet werden, wie sie bei AIDSoder Hepatitis-Patienten üblich sind. Bei chirurgischen Eingriffen an CJD-Erkrankten ist das
Risiko der iatrogenen Übertragung auf andere Patienten gross; deshalb sollten Operationen
an solchen Personen auf ein Minimum beschränkt werden. Um eine Infektion auf iatrogenem
Weg zu verhindern, müssen die Operationssäle und alle chirurgischen Instrumente
entsprechend sterilisiert werden. Der TSE-Erreger kann aber durch konventionelle
Sterilisations- und Dekontaminationsmethoden nicht inaktiviert werden; besonders resistent
ist er auf Oberflächen aus rostfreiem Stahl (Zobeley et al., 1999). Milde (vor allem nichtionische) Detergentien, Alkohole, Kaliumpermanganat, Wasserstoffperoxid, Aldehyde und
UV-Bestrahlung sind wirkungslos. Die empfohlenen Methoden zur Reduzierung der
Infektivität sind Dampf-Autoklavieren bei 134°C während mindestens 18 min und Eintauchen
der Instrumente in NaOH oder konzentriertes Natrium-Hypochlorit während 1 h (Rutala und
Weber, 2001). Flüssigkeiten müssen vor dem Autoklavieren mit NaOH versetzt werden.
Kontaminierte Oberflächen können durch wiederholtes Abwischen mit NaOH desinfiziert
werden. Auch bei der Autopsie und bei der Herstellung von Gewebeschnitten müssen
Vorsichtsmassnahmen getroffen werden.
Weltweit wird in vielen Laboratorien an der Aufklärung des TSE-Infektionswegs und an
Therapeutika und neuen diagnostischen Tests geforscht. Weil dabei auch TSE-infizierte
Gewebeproben als Test- oder Referenzmaterial verwendet werden, müssen die
24
Einleitung
Wissenschaftler deshalb entsprechende Schutzmassnahmen beachten. Dazu werden die
verschiedenen Prionen-Erkrankungen in Biosicherheits-Stufen (1: niedriges Risiko – 3: Hohes
Infektionsrisiko) eingeteilt, die jeweils mit einem Katalog von gesetzlichen Vorgaben
bezüglich der Laboreinrichtung und der anzuwendenden Schutzmassnahmen verbunden sind.
Prionen aus menschlichen TSE-Infektionen und aus BSE gehören unter den meisten
experimentellen Bedingungen der Biosicherheits-Stufe 3 an, da bei ersteren keine
Speziesbarriere mehr zu überwinden ist und letztere unter Verdacht stehen, Verursacher von
vCJD zu sein. In Affen und Menschenaffen propagierte Prionen werden je nach Studie unter
Stufe 2 oder 3 klassifiziert. Alle anderen Tier-Prionen gehören zur Biosicherheitsstufe 2. Zur
Sterilisierung können die Instrumente und Laboroberflächen mit denselben Prozeduren
behandelt werden, wie sie im Operationssaal angewendet werden.
Auch bei der Herstellung pharmazeutischer Produkte muss darauf geachtet werden, die
Prionen-Kontaminationsgefahr möglichst gering zu halten. Viele medizinische Produkte
werden aus menschlichem Blut gewonnen, so z.B. Albumin, Faktor VIII oder
Immunglobuline. Obwohl bis jetzt kein Fall einer Übertragung von CJD/vCJD über Blut und
Blutprodukte nachgewiesen wurde, besteht doch ein theoretisches Infektions-Risiko. Da bis
jetzt noch kein spezifischer und empfindlicher Test zum Nachweis von Prionen in Blut
erhältlich ist, wurden regulatorische Massnahmen zur Senkung der Kontaminationsgefahr
getroffen. Dazu gehört ein Blutspende-Verbot für alle Personen, die als theoretischer Träger
von infektiösen Prionen in Frage kommen, d.h. Menschen, welche durch ihren familiären
Hintergrund, ihre Krankengeschichte oder ihren Wohnort an vererbbarer und iatrogener CJD
oder an vCJD erkrankt sein könnten. Da häufig bovine Rohstoffe oder aktive Bestandteile
bovinen Ursprungs zur Herstellung von biologischen und pharmazeutischen Produkten
verwendet werden, wurden auch hier Massnahmen zur Wahrung der Produktsicherheit
eingeführt. Zu nennen sind z. B. Rückverfolgbarkeit der Rohstoffe bis zum Tier, Importverbot
für Tiere aus Ländern mit gemeldeten BSE-Fällen, Verwendung von Rohstoffen aus jüngeren
Tieren und Vermeidung von Geweben mit mittlerem und hohem Infektionsrisiko. Ausserdem
wurden die während des Pharmazeutika-Herstellungsprozesses verwendeten Fraktionierungsund Trennprozesse auf ihr Potential zur Verringerung der Prionen-Infektivität hin untersucht.
Strenge Richtlinien gelten in der Schweiz auch für die landwirtschaftliche Produktion, die
Herstellung von Futterstoffen oder Nahrungsmitteln aus Rohstoffen boviner Herkunft. Die
Verfütterung von MBM tierischen Ursprungs an Nutztiere sowie der Import und Export von
MBM ist nach wie vor verboten; die spezifischen Risikoorgane (SRM) wie Gehirn oder
Rückenmark müssen nach der Schlachtung des Tiers entfernt und vernichtet werden. Alle
Rinder über 30 Monate werden vor der Schlachtung einer vereinfachten klinischen
Untersuchung auf BSE unterzogen. Wird eine Infektion festgestellt, wird eine bestimmte
Gruppe der Herde ausgemerzt, nämlich die direkten Nachkommen und jene Rinder, welche
der Geburtskohorte des betroffenen Tiers angehören. Auf diese Weise hofft man, die BSEEpidemie endgültig in den Griff zu bekommen und eine weitere Ausbreitung zu verhindern.
2.1.6.2 Therapie von TSE
Bis jetzt gibt es keine erprobten Therapiemöglichkeiten für menschliche oder tierische PrionErkrankungen. An der Entwicklung möglicher Therapien für menschliche TSE wird aber
intensiv geforscht. Ein Fokus der Forschung liegt auf Verbindungen, welche direkt oder
indirekt die Umwandlung von PrPC in PrPSc verhindern, die Neurotoxizität verringern oder
den Abbau von schon vorhandenem PrPres fördern. Zu den bisher untersuchten Verbindungen
gehören Polyanionen (z.B. Pentosan-Polysulfat, Farquhar et al., 1999), sulfonierte Farbstoffe,
Tetrapyrrole, Antibiotika, verzweigte Polyamine (Supattapone et al., 1999), Cysteinproteasen25
Einleitung
Inhibitoren, Acridin-Derivate, Phenothiazine, synthetische Peptide (Brown, 2002) und small
interfering RNA (siRNA)-Duplexe. Letztere haben die Fähigkeit, die Expression des PrionProteins zu unterdrücken und vorübergehend die Ablagerung von PrPres in Scrapie-infizierten
Neuroblastom-Zellen zu verhindern (Daude et al., 2003). Auch viele bereits registrierte
Arzneimittel wurden auf mögliche anti-Prion-Effekte hin untersucht. Im Bereich der
Immunologie wird mit verschiedenen interessanten Ansätzen nach Möglichkeiten der Präund Postexpositionsprophylaxe durch Antikörper gesucht (Heppner und Aguzzi, 2002;
Heppner et al., 2001). Die am häufigsten eingesetzten Screening-Techniken zur
Identifizierung von potentiellen therapeutischen Verbindungen sind chronisch infizierte
Maus-Neuroblastom-Zellen und in vitro zellfreie Konversions-Assays.
Das Problem eines jeden Therapieansatzes besteht jedoch in der Tatsache, dass bei Ausbruch
einer TSE das Gehirn bereits fortgeschritten und irreversibel geschädigt ist und bislang
einfach einsetzbare Testmethoden zur Feststellung einer präklinischen TSE fehlen (Aguzzi et
al., 2001).
26
Einleitung
2.2 Plasminogen
2.2.1 Hämostase
Das vaskuläre System des Körpers versorgt das Gewebe mit Sauerstoff und Nährstoffen und
stellt den Abtransport von Abfallprodukten sicher; es hat ausserdem die Fähigkeit,
beschädigte Gefässwände zu reparieren. Blutgefässe können zum Beispiel durch
Verletzungen oder Entzündungen beschädigt werden. Der dabei entstehende Blutverlust
könnte ohne entsprechenden Schutzmechanismus rasch lebensbedrohende Ausmasse
annehmen. Die Aufrechterhaltung der Integrität des Gefässystems übernimmt die Hämostase;
sie ist das Ergebnis eines ausgewogenen Gleichgewichts zwischen Blutgerinnung und
Fibrinolyse.
Das hämostatische System erkennt die Gefässverletzung innert Sekunden und rekrutiert die
richtige Kombination von Zellen und Enzymen, welche dafür sorgen, dass der Blutverlust
durch einen unlöslichen Fibrin-Propfen gestoppt wird. Dabei sind nicht nur
Koagulationsenzyme,
sondern
auch
Proteasen
für
Entzündungsreaktionen,
Blutdruckregulierung und Aktivierung des Komplementsystems beteiligt. Sie sind Teil einer
Kaskade, bei welcher jede Protease das nachfolgende Enzym aktiviert, wodurch sich die
Wirkung vervielfacht. Die jeweilige Aktivierungsreaktion ist irreversibel, die Funktion der
Proteasen muss deshalb genau reguliert werden. Nach dem Verschluss der Wunde müssen die
aktivierten Proteasen beseitigt werden, so dass die Blutgerinnung rechtzeitig gestoppt wird,
denn Gerinnsel, die zu gross werden oder welche vom ursprünglichen Ort wegwandern,
können eine potentiell lebensgefährliche Verstopfung von Blutgefässen (Thrombose)
verursachen. Die Bildung des Wandverschlusses wird durch Gerinnungsinhibitoren
kontrolliert; danach wird der Verschluss durch Fibrinolyse wieder aufgelöst. Im Blut
zirkulierende Proteaseinhibitoren unterstützen die empfindliche Balance zwischen Gerinnung
und Antikoagulation.
Eine wichtige Rolle in der Hämostase spielen positive und negative Rückmeldungen; dabei
kann ein Enzym, das später in der Kaskade entsteht, seine eigene Produktion anregen oder
hemmen. Bei pathologischen Konditionen können ererbte oder erworbene Defekte zu
Blutungen oder Thrombose führen.
2.2.1.1 Blutgerinnung
Nach einer Verletzung sezernieren Blutplättchen und die verletzte Gefässwand
gefässverengende Substanzen wie ADP, Adrenalin und Serotonin. Die Zellen der glatten
Muskulatur in der Gefässwand kontrahieren sich etwa eine Minute lang und hemmen so den
Blutfluss, was den Ablauf der ersten Gerinnungsreaktionen unterstützt. Anschliessend heften
sich Blutplättchen an die Kollagenschichten des Subendothels an, die nach der Verletzung
offenliegen. Sie bilden über Proteinbrücken durch Thrombospondin und Fibrinogen zwischen
ihren Rezeptor-Komplexen GPIIb-IIIa Aggregate untereinander. An der verletzten Oberfläche
und den daran haftenden Thrombozyten setzen vernetzte Gerinnungskaskaden ein und führen
zur Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin, welches seinerseits den Faktor XIII aktiviert.
Dieser bewirkt eine kovalente Quervernetzung des Fibringerinnsels. Die einzelnen
Fibrinmoleküle werden mittels einer Isopeptidbindung über die Seitenketten spezifischer
Lysin- und Glutaminreste quervernetzt.
Es gibt zwei grundlegende Möglichkeiten, wie die Blutgerinnung ausgelöst werden kann: Der
Kontakt von Thromboplastin mit Blut („extrinsischer Weg“) oder die Kontaktaktivierung
27
Einleitung
(„intrinsischer Weg“). Die beiden Wege sind eng vernetzt und tragen in vivo beide zur
Koagulation bei, wobei der Hauptanteil dem extrinsischen Weg zugeschrieben wird.
Intrinsischer Weg
negativ geladene Oberfläche
Kallikrein
Extrinsischer Weg
Gefässverletzung
Präkallikrein
F XII
F XIIa
HMWK
F VIIa
F XI
F XIa
F VII
Ca2+
Antithrombin III
F III
Ca2+
F IX
Ca2+/PL
F IXa
Komplex
F VII/F III
Ca2+/PL
FX
F VIII
Komplex
F VIIa/ F III
F Xa
TFPI
F VIIIa
Ca2+/PL
FV
Prothrombin
F Va
Thrombin
Ca2+/PL
Fibrinogen
Thrombomodulin/
Thrombin
F XIII
Ca2+
Fibrin
Protein C/
Protein S
F XIIIa
Protein C-Inhibitor
quervernetztes Fibrin
Figur 2.8: Vereinfachte Darstellung der Blutgerinnungs-Kaskade; hellblau unterlegt: intrinsischer Weg; rosa
unterlegt: extrinsischer Weg; schwarze Pfeile: Aktivierungsweg eines Faktors oder Enzyms; blaue Pfeile: wirkt
als Aktivator oder Katalysator; rote Pfeile: wirkt als Inhibitor oder degradierendes Enzym; HMWK: High
Molecular Weight Kininogen; PL: Phopsholipide; TFPI: Tissue Factor Pathway Inhibitor
28
Einleitung
Extrinsischer Weg
Die Blutkoagulation auf dem „extrinsischen Weg“ wird initiiert, wenn subendotheles
Thromboplastin (engl. tissue factor, Gewebsfaktor) mit Blut in Kontakt kommt; dies kann
durch die Verletzung eines Blutgefässes oder durch Aktivierung des Endothels geschehen.
Während der Initiationsphase der Thrombinbildung bindet der freigesetzte Gewebsfaktor an
eine Serinprotease, den Faktor VIIa, der bereits in Spuren im Blut vorhanden ist (Morrissey et
al., 1993; Eichinger et al., 1995; Morrissey, 2001), und bildet den Faktor VIIa-GewebsfaktorKomplex (Extrinsic Factor Tenase). Dadurch wird die Aktivität von VIIa erhöht, und es wird
durch Autokatalyse noch mehr VIIa gebildet. Die Tenase aktiviert die Zymogene Faktor IX
und X zu IXa und Xa. Für die optimale Aktivität des Tenase-Komplexes ist die Gegenwart
von Ca2+ und bestimmter Phospholipide in der Umgebung des Gewebsfaktors unumgänglich.
Das Fortschreiten der Blutgerinnung hängt vor allem davon ab, ob durch die Tenase genug IX
zu IXa aktiviert wird, bevor die Inhibierung dieser Reaktion durch den Komplex Faktor Xa
(inaktiv)-TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) einsetzt.
Intrinsischer Weg
Auch auf dem intrinsischen Weg (Kontakt-System) kann Faktor IX aktiviert werden. Die
Bindung von Faktor XII an eine artifizielle oder negativ geladene Oberfläche führt zu einer
lokalen Konzentrationserhöhung und resultiert in der Autoaktivierung von Faktor XII zu XIIa.
Der im Blut vorkommende Komplex Präkallikrein, Hochmolekulares Kininogen (HMWK)
und Faktor XI bindet an XIIa. Dadurch wird die Konversion von Präkallikrein zu Kallikrein
und Faktor XI zu Faktor XIa ausgelöst (Colman et al., 2001); gleichzeitig wird HMWK
gespalten, wodurch Bradykinin entsteht. Diese Ereignisse kulminieren in der Aktivierung von
Faktor IX durch XIa (Scott et al., 1985).
Aktivierung von Thrombin, Bildung des Fibrinpropfens
Das gebildete IXa aktiviert Faktor X zu Xa und umgeht damit die Inhibierung durch TFPI. Der
nun in geringen Mengen vorhandene Faktor Xa generiert Thrombin im picomolaren Bereich,
welches seinerseits durch Spaltung der Zymogene Faktor V und Faktor VIII die aktiven
Kofaktoren Va und VIIIa bildet (Lawson et al., 1991; Rand et al., 1996; Butenas et al., 1997).
Faktor VIIIa bildet mit der Serinprotease Faktor IXa den Intrinsic Factor Tenase –Komplex;
dieser aktiviert Faktor X mit einer 50-100fach höheren Rate als die Extrinsic Factor Tenase,
so dass der Hauptanteil von Xa durch den Komplex aus IXa und VIIIa generiert wird (Lawson
und Mann, 1991; Ahmad et al., 1992). Der Faktor Xa formt dann mit dem Kofaktor Va den
Prothrombinase-Komplex, welcher der Hauptaktivator von Prothrombin ist (Papahadjopoulos
and Hanahan, 1964; Nesheim et al., 1979; Kalafatis et al., 1994) und eine 300 000-fach
stärkere Aktivität der Thrombin-Generierung aufweist als Faktor Xa. Das produzierte
Thrombin amplifiziert seine eigene Produktion durch Aktivierung von Faktor XI (Gailani und
Broze, 1991) und Vervollständigung der Aktivierung von Blutplättchen und Faktoren V und
VIII (Butenas et al., 1997; Pieters et al., 1989). Thrombin spaltet auch Fibrinogen und Faktor
XIII, so dass ein unlöslicher, quervernetzter Fibrinpfropfen entsteht (Shen und Lorand, 1983;
Brummel et al., 1999).
Fibrinogen besteht aus zwei gleichen Dreifachhelices mit je einer Aα-, Bβ- und γ-Kette, die
in der Mitte durch Disulfidbrücken symmetrisch verbunden sind. Um eine Gerinnung
hervorzurufen, muss Thrombin vier stark negativ geladene Peptide aus diesem Zentralbereich
29
Einleitung
Faktor
Gebräuchlichster Name
I / Ia
Fibrinogen / Fibrin
II / IIa
(Pro-)Thrombin
III
Gewebsfaktor
V / Va
Activated protein C cofactor
VII / VIIa
Serum prothrombin
conversion accelerator
VIII / VIIIa
Antihämophiles Globulin A
IX / IXa
Molmasse
(kDa)
Konzentration
(µmol/l)
340 / 333
7
72 / 37
1.4
45
(membrangebunden)
330 / 180
0.02
50 / 50
0.01
285 / 165
0.0007
Christmas-Faktor
57 / 46
0.09
X / Xa
Stuart-Faktor
59 / 46
0.17
XI / XIa
Plasma-ThromboplastinAntecedent
160 / 160
0.04
XII / α-XIIa / βXIIa
Hagemann-Faktor
80 / 80 / 30
0.4
XIII / XIIIa
Transglutaminase
320 / 160
0.1
HMK
Hochmolekulares Kininogen
110
0.7
PK / KK
Plasma (Prä-)Kallikrein
86 / 86
0.6
α1PI
α1-Proteinase-Inhibitor
55
50
α2 M
α2-Makroglobulin
772 (Tetramer)
0.003
Pg / Pn
Plasminogen / Plasmin
90 / 78
20
uPa
Urokinase
54 / 32
tPa
Gewebsspezifischer
Plasminogenaktivator
70
XIV
Protein C
62
0.06
PS
Protein S
75
0.3
Tabelle 2.3: Faktoren der Blutgerinnung/Fibrinolyse und ihre Eigenschaften; aktivierte Formen sind mit einem
tiefgestellten “a“ bezeichnet; Faktor IV (Ca2+) und PL (Phospholipid) wurden weggelassen, da sie nicht zu den
Protein-artigen Faktoren gehören
herausschneiden (je zwei A- und B-Peptide). Auf diese Weise wird die elektrische
Abstossung beseitigt, und es entstehen an den neuen N-Termini hochaffine Liganden für die
beiden Bindungsepitope an beiden Enden des Fibrinogen-Moleküls. Dies ermöglicht die
Selbstassemblierung von Fibrin zu einem Polymer, wobei die am Anfang vorhandenen
Protofibrillen seitliche Interaktionen eingehen, so dass Bündel von Fibrinsträngen entstehen
(Mosesson, 1998; Mosesson et al., 2001). Der thrombinaktivierte Faktor XIIIa katalysiert
dann die Quervernetzung spezifischer Lysin- und Glutaminreste an den Carboxyltermini der
γ-Ketten (Weisel, J., 1986). Das Gerinnsel wird so in eine unlösliche Form überführt und zieht
sich zusammen (Retraktion). Über die Bindungsepitope von Fibrin und Fibrinogen für andere
30
Einleitung
Proteine kommt es zu einer Quervernetzung mit Blutplättchen und anderen Zellen.
Kontraktion und Quervernetzung stellen den zentralen Mechanismus für die schnelle Stillung
einer Blutung dar.
Blutgerinnungs-Inhibitoren
Die Regulation der Koagulation ist notwendig, um eine generalisierte Aktivierung des
Systems und eine übermässige Fibrinablagerung zu verhindern. Ein effizientes System darf
nur an der Stelle der Gefässverletzung Wirkung zeigen und darf nur genau so lange aktiv sein,
wie es braucht, um genug Fibrin für den Wundverschluss zu generieren. Mehrere
Mechanismen zur Regulation der Blutgerinnung sind vorhanden. Jedes Koagulationsprotein
wird im Lauf der Kaskade aktiviert, so dass nur eine kleine Menge jeder aktiven Serinprotease
zu einer gegebenen Zeit vorhanden ist. Ausserdem können die Gerinnungsprozesse nur an der
Oberfläche aktivierter Zellen und Blutplättchen ablaufen, und der Gewebsfaktor, welcher die
Koagulationskaskade auslöst, ist nur an der Oberfläche von Zellen zu finden, welche
ausschliesslich bei Gefässverletzungen mit Blut in Berührung kommen. Die wichtigsten
Regulatoren sind aber verschiedene Inhibitoren, welche die Koagulation abschwächen , indem
sie Serinproteasen oder Kofaktoren inaktivieren. Der wichtigste stöchiometrische Inhibitor ist
Antithrombin III. Antithrombin III kann effizient alle Serinproteasen neutralisieren, die
während des Blutgerinnungsprozesses entstehen (Olson et al., 1993). TFPI ist ein anderer
stöchiometrischer Inhibitor der Koagulation. Er ist im Blut in relativ niedrigen
Konzentrationen vorhanden (Nowotny et al., 1991) und ist ebenfalls ein wichtiger
Serinprotease-Inhibitor. TFPI bildet einen Komplex mit Faktor Xa und kann dann an den
Faktor VIIa-TF-Faktor Xa-Komplex binden (Girard et al., 1989; Rapaport, 1991; Broze et al.,
1988), wodurch ein quarternärer Komplex entsteht (Broze, 1995). Dies führt zu einer raschen
Inhibition der extrinsischen Kaskadenaktivierung. Zusätzlich fördert TFPI den Abbau des
quarternären Komplexes (Hamik et al., 1999) und entzieht dem System so die wichtigen
Faktoren VIIa und Xa. Ein anderes wichtiges Rückkopplungs-Kontrollsystem für die
Blutgerinnung wird durch Thrombin selbst ausgelöst: Die Bindung an seinen Kofaktor
Thrombomodulin, der konstitutiv im Gefässystem vorhanden ist, wandelt Thrombin in einen
Gerinnungshemmer um. Es aktiviert proteolytisch das Protein C zum Serinproteaseaktivierten Protein C (Esmon et al., 1982; Esmon et al., 1993). Aktiviertes Protein C schwächt
die Blutgerinnungsreaktion ab, indem es Faktor V/Va und VIII/VIIIa proteolytisch spaltet und
dadurch inaktiviert. Diese Spaltung wird von Protein S noch etwas beschleunigt (Esmon,
1987); die Hauptfunktion dieses Proteins in der Regulation der Thrombin-Generierung ist
noch unbekannt. Die Inaktivierung von Faktor VIIIa kann auch durch Dissoziation der A2Domäne erfolgen, ein Prozess, der unabhängig vom aktivierten C-Protein abläuft. Die
Verfügbarkeit von aktiviertem Protein C wird seinerseits durch Komplexbildung mit dem
Protein C-Inhibitor, dem α1-Proteinase-Inhibitor oder dem α2- Makroglobulin begrenzt.
Die Blutgerinnung kann auch durch Antikoagulantien gehemmt oder sogar vollständig
inhibiert werden. Am bekanntesten ist Heparin, welches die Aktivität von Antithrombin
verstärkt und die Bindung und Inaktivierung von Thrombin durch Heparin-Cofaktor II
vermittelt. Direkte Thrombin-Inhibitoren wie Hirudin, eine aus dem Speichel von Blutegeln
isolierte Verbindung, können auch in Abwesenheit von Antithrombin und anderer Kofaktoren
direkt an Thrombin binden und den „positive feedback“-Prozess unterbrechen, durch den
ständig neues Thrombin gebildet wird (Fox et al., 1993). Indirekt wirkende Antikoagulatien
sind z. B. Vitamin K-Antagonisten. Sie entziehen dem System Vitamin K und inaktivieren
dadurch die Vitamin K-abhängigen Faktoren II, VII, IX und X. Ausserdem kann die
Blutgerinnung in vitro auch durch kalziumkomplexierende Verbindungen wie EDTA oder
31
Einleitung
Citrat inhibiert werden, da die Aktivierung der Faktoren VII, IX, X und XI sowie von
Prothrombin vom Vorhandensein von Ca2+-Ionen abhängig ist.
2.2.1.2 Fibrinolyse und das Plasminogen-System
Durch die Fibrinolyse sollen Fibrinablagerungen und thrombo-embolische FibrinVerklumpungen in Blutgefässen beseitigt werden. Das fibrinolytische System erfüllt wichtige
Kontrollfunktionen und bildet ein dynamisches Gleichgewicht mit der Blutkoagulation. Es
besteht aus dem Proenzym Plasminogen, Enzymen, die Plasminogen proteolytisch aktivieren,
und mehreren Inhibitoren, welche die Plasminogenaktivierung, die Aktivität von Plasmin und
den schrittweisen Abbau von Fibrin regulieren.
Spezifische Aktivatoren wandeln das Zymogen Plasminogen in die aktive Serinprotease
Plasmin um, welche die Fibringerinnsel abbaut. An der physiologischen Aktivierung sind
hauptsächlich die beiden Aktivatoren tPA und uPA beteiligt.
quervernetztes Fibrin
Streptokinase
Staphylokinase
Plasmin
Plasminogen
α2-Antiplasmin
Fibrinfragmente
PAI
tPA
Bradykinin
uPA
Präurokinase
α2-Makroglobulin
Kallikrein
HMWK
Figur 2.9: Vereinfachte Darstellung der Fibrinolyse; schwarze Pfeile: Aktivierungsweg eines Faktors oder
Enzyms; blaue Pfeile: wirkt als Aktivator oder Katalysator; rote Pfeile: wirkt als Inhibitor oder degradierendes
Enzym; HMWK: High Molecular Weight Kininogen; tPA: Tissue Plasminogen Activator (Gewebsfaktor); uPA:
Urokinase-type Plasminogen Activator (Urokinase); PAI: Plasminogenaktivator-Inhibitor
Gewebsspezifischer Plasminogenaktivator (tissue-type plasminogen activator, tPA)
Der gewebsspezifische Plasminogenaktivator (tPA) spielt eine essentielle Rolle beim
Auslösen des fibrinolytischen Systems. tPA wird in endothelialen Zellen als einkettiges
32
Einleitung
aktives Molekül mit einem Molekulargewicht von 70 kDa synthetisiert und sekretiert. Es
besteht aus der N-terminalen Fibronectin Typ I-Domäne, einer C-terminalen Serinprotease,
zwei Kringel-Domänen und einer Domäne, welche homolog zur Domäne des epidermalen
Wachstumsfaktor (EGF) ist. Das aktive Zentrum besteht aus den Aminosäuren His322, Asp371
und Ser478 (Pennica et al., 1983). Die Finger-ähnliche und die Kringel 2-Domäne besitzen je
eine Fibrinbindungsstelle. Im ganzen bei der Blutgerinnung entstehenden Fibrinpfropfen ist
Plasminogen vorhanden. Der grössere Teil befindet sich in Plasma, welches im Pfropfen
enthalten ist, eine kleine Menge Plasminogen ist spezifisch an Fibrin gebunden und wird dort
vom ebenfalls an Fibrin gebundenen tPA aktiviert. Die Aktivität von tPA ist in Abwesenheit
von Fibrin sehr gering (Rijken et al, 1982); durch die Bildung des ternären Komplexes Fibrin
– Plasminogen – tPA wird die katalytische Effizienz von tPA um ein Tausendfaches
gesteigert. Die Aktivierung von Plasminogen durch tPA kann aber nicht nur durch Fibrin
vermittelt werden; auch Zellmembranen und Proteine der extrazellulären Matrix wie
Thrombospondin und Kollagen IV können die Aktivierungsrate erhöhen; sie sind aber
weniger effizient als Fibrin (Stack et al., 1990). Die aktivierte Serinprotease Plasmin spaltet
die Polypeptidkette von Fibrin vor allem nach Lysinresten, so dass immer neue
carboxyterminale Lysinreste als Bindungsstellen für die Kringel von Plasminogen zur
Verfügung stehen. So wird das meiste Plasminogen, das im Pfropfen vorhanden ist, an Fibrin
gebunden und der fibrinolytische Prozess auf diese Weise wesentlich beschleunigt (Suenson
et al., 1984). Plasmin, Kallikrein und Faktor Xa können die Peptidbindung Arg275-Ile276 von
tPA spalten, sodass eine zweikettige Form des Enzyms entsteht. Dies erhöht die
Aktivierungsrate von Plasminogen in Abwesenheit von Fibrin. Ist aber Fibrin vorhanden, so
aktivieren beide tPA-Formen Plasminogen mit ähnlicher Geschwindigkeit (Tate et al., 1987).
Urokinase (urokinase-type plasminogen activator, uPA)
Eine Trypsin-ähnliche Protease mit der Fähigkeit, Plasminogen zu aktivieren, wurde erstmals
aus Urin isoliert und deshalb Urokinase-Plasminogenaktivator (uPA) genannt (MacFarlane
und Pilling, 1947; Williams, 1951; Sobel et al., 1952). uPA kommt im Blutkreislauf nur in
einer wenig aktiven einkettigen Form (scu-PA oder Präurokinase) vor. Plasmin und Kallikrein
wandeln scu-PA in die zweikettige Form tcu-PA um, die eine wesentlich stärkere Aktivität
besitzt. scu-PA und tcu-PA reagieren nur mit Plasminogen, wenn es an Fibrin gebunden ist.
Wahrscheinlich wird der intravaskuläre uPA-Weg aktiviert, sobald durch den tPA-Weg etwas
Plasmin entstanden ist. Der uPA-Weg wirkt vermutlich als Amplifizierungssystem für den
essentiellen tPA-Weg. Darüber hinaus ist die Urokinase an vielen extravaskulären Vorgängen
beteiligt, z.B. an der Wundheilung, der Organentwicklung, der Invasion/Metastasenbildung
durch Tumore und dem Abbau der extrazellulären Matrix durch Plasmin.
Exogene Plasminogen-Aktiviatoren
Es gibt auch exogene Faktoren, welche die Fibrinolyse beeinflussen können.
1933 wurde ein aus β-hämololytischen Streptokokken isolierter exogener
Plasminogenaktivator erstmals beschrieben und in der Folge Streptokinase genannt (Tillet und
Garner, 1933; Christensen und MacLeod, 1945). Dieser stöchiometrische Aktivator (Ratnoff,
1948) ist ein einkettiges Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 45 – 50 kDa und
besteht hauptsächlich aus „random coil“ (Taylor und Botts, 1968; Castellino et al., 1976). Im
Gegensatz zu anderen Plasminogenaktivatoren ist Streptokinase kein Enzym. Es bildet mit
Plasminogen einen Komplex, welcher die Peptidbindung Arg560-Val561 freier und
33
Einleitung
komplexierter Plasminogenmoleküle spalten und Plasminogen in aktives Plasmin umwandeln
kann.
Staphylokinase hat ein Molekulargewicht von 15.5 kDa und stammt aus dem lysogenen
Stämmen des Bakteriums Staphylococcus aureus. Auch die Staphylokinase bildet einen
Komplex mit Plasminogen (Parry et al., 1998), wobei ein N-terminales Peptid der
Staphylokinase abgespalten wird. Der Staphylokinase-Plasminogen-Komplex bildet dann mit
einem weiteren Plasminogenmolekül einen ternären Komplex und konvertiert es zu Plasmin.
Staphylokinase bindet und spaltet vorwiegend an Fibrin gebundenes Plasminogen, wodurch
der Plasminogen-Aktivator im Plasma-Milieu eine ausserordentlich hohe Fibrin-Spezifität
aufweist (Sakharov et al., 1996).
Bei der Thrombosetherapie kommen auch rekombinant hergestellte Proteine wie Amediplase
(enthält die funktionellen Domänen von tPA und uPA; Dogrell, S. A., 2004), Reteplase
(rekombinanter tPA mit Deletion) und Tenecteplase (rekombinanter tPA) zum Einsatz.
Inhibitoren der Fibrinolyse
Das zirkulierende freie Plasmin (Halbwertszeit: ca. 0.1 sec) und die freien Aktivatoren, mit
Ausnahme von scu-PA, stehen unter unmittelbarer Kontrolle der entsprechenden Inhibitoren,
welche alle zur Familie der Serpine (Serin-Protease-Inhibitor) gehören. Dazu zählt man die
Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren (PAI) 1 – 4, α2-Antiplasmin und α2-Makroglobulin.
Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren
Die zwei wichtigsten Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren (PAI) sind PAI-1 und PAI-2. Das 52
kDa-Glykoprotein PAI-1 wird im Endothel synthetisiert; es inhibiert sowohl tPA wie auch
tcu-PA (Collen et al., 1995) und wird durch eine enge Bindung an das Protein Vitronectin
stabilisiert (Wiman et al., 1988). PAI-2 existiert in zwei verschiedenen Formen mit
vergleichbaren kinetischen Eigenschaften. Der Inhibitor ist nur während der Schwangerschaft
im Blutplasma detektierbar (Kruithof et al., 1987), kann aber zu jeder Zeit in geringen
Konzentrationen in Blutzellen gefunden werden (Haj et al., 1995). PAI-2 wird in der Placenta,
den Monocyten und den Makrophagen hergestellt und inaktiviert tcu-PA mit hoher Rate.
α2-Antiplasmin
α2-Antiplasmin (α2-PI, α2-Plasmininhibitor) wird in der Leber als einkettiges Glykoprotein
mit einem Molekulargewicht von 67 kDa und einem Kohlenhydratgehalt von 13%
synthetisiert (Moroi und Aoki, 1976). Das reife, von den Zellen sezernierte Protein besteht
aus 464 Aminosäuren mit einem N-terminalen Methioninrest; diese Form wird deshalb auch
Met-α2-PI genannt (Bangert et al., 1993). Im Blut kommt α2-PA in den zwei Formen Met-α2PI und Asn-α2-PI, eine N-terminal um 12 Aminosäuren verkürzte Form, vor (Koyama et al.,
1994); beide inhibieren Plasmin mit einer ähnlichen Rate, Met-α2-PI hat aber eine geringere
Affinität zu Fibrin als Asn-α2-PI (Bangert et al., 1993). Plasmin wird im Blutplasma sehr
rasch von α2-PI inhibiert; dabei handelt es sich wie bei allen Serpinen um eine sogenannte
„suicide inhibition“, da α2-PI nur jeweils ein Molekül Plasmin inhibieren kann. Die
Inaktivierung besteht aus zwei Schritten, wovon der erste sehr schnell, der zweite aber
langsamer abläuft: Zuerst wird ein stöchiometrischer, reversibler Komplex mit Plasmin
gebildet, danach wird die Peptidbindung Arg364-Met365 im aktiven Zentrum von α2-PI
gespalten und eine kovalente Bindung zwischen dem Serin741 des aktiven Zentrums von
34
Einleitung
Plasmin und der Arg376-Carboxylgruppe von α2-PI gebildet. Das C-terminale Fragment von
α2-PI bleibt vermutlich mit der Kringel 1-Domäne von Plasmin assoziiert. An Fibrin
gebundenes Plasmin ist gegen Angriffe von α2-PI geschützt, seine Halbwertszeit wird
wesentlich erhöht (Favier et al., 2001). Zusätzlich zur Inhibition der Plasminaktivität hat α2PI noch zwei weitere charakteristische Funktionen: die Inhibition der Plasmin(ogen)-Bindung
an Fibrin und die Quervernetzung mit Fibrin durch Gln2 von α2-PI, was dem Fibrinpfropfen
erhöhte Resistenz gegen den Abbau durch Plasmin verleiht (Sakata und Aoki, 1982; Jansen et
al., 1987; Lee et al., 1999).
α2-Makroglobulin
α2-Makroglobulin ist ein 772 kDa-Protein, welches hauptsächlich von Hepatozyten, aber auch
von anderen Zellen (z.B. Fibroblasten und Makrophagen) exprimiert wird (Travis und
Salvesen, 1983). Es besteht aus vier beinahe identischen Domänen mit je 1451 Aminosäuren,
welche durch Disulfidbrücken und nichtkovalente Interaktionen verbunden sind. α2Makroglobulin kann fast jede Protease der extrazellulären Matrix einfangen und isolieren. Die
Inhibition von Plasmin und anderen Proteasen geschieht durch einen Mechanismus, bei dem
von α2-Makroglobulin eine spaltbare „Köder“-Region präsentiert wird, an den das PlasminMolekül reversibel bindet. Die Spaltung der „Köder“-Region durch die gebundene Protease
löst eine Konformationsänderung von α2-Makroglobulin aus, wodurch Plasmin festgehalten
wird. Danach wird die Protease durch Transacylierung kovalent an α2-Makroglobulin
gebunden; der Komplex wird durch Lysosomen internalisiert und abgebaut, wobei die
Protease im Gegensatz zu anderen Inhibitionsmechanismen erst beim lysosomalen Abbau
inaktiviert wird.
2.2.2 Plasminogen
Humanes Plasminogen
190
380
280
420
270
180
230
K2
320
K3
220
K4
370
310
390
410
290
200
430
170
260
240
330
360
210
120
110
400
300
250
130
160
140
350
340
80
K1
440
690
700
680
90
730
150
450
740
S
710
40
770
750
70
100
760
650
670
660
580
790
30
460
720
50
1
630
550
D
60
470
530
780
540
NTP
570
640
480
590
510
610
10
620
20
Protease
600
K5
500
H
560
520
490
Figur 2.10: Darstellung von humanem Plasminogen; blau: Disulfidbrücken; violett: Glykosylierungsstellen;
hellgrün: Phosphaorylierungsstelle; blaugrün: Spaltstellen von Plasmin, Elastase, V8-Protease und Pepsin; rot:
katalytische Triade; gelb: Aktivierungsstelle
35
Einleitung
2.2.2.1 Struktur und Charakteristika von Plasminogen
Plasminogen ist der inaktive Vorläufer des proteolytischen Enzyms Plasmin, welches im
fibrinolytischen System eine Schlüsselrolle einnimmt. Der Serinproteasevorläufer, der zur
Familie der β-Globuline gehört, wird vor allem in den Hepatozyten der Leber synthetisiert
und zirkuliert im Blut mit einer Konzentration von bis zu 200 mg/l. Das Gen, welches für
HPg codiert, liegt auf Strang 1 von Chromosom 16 und hat eine Länge von 51055 Basen,
verteilt über 19 Exons. Das unreife Protein wird nach der Expression ins Endoplasmatische
Retikulum exportiert, wo die N-terminale Exportsequenz abgespalten wird. Nach
posttranslationalen Modifikationen im Golgi-Apparat wird das reife Plasminogen sezerniert.
Der Serinproteasevorläufer ist ein einkettiges, aus 791 Aminosäuren bestehendes
Glykoprotein mit einem Kohlenhydratanteil von ca. 1.8 %. Plasminogen besteht aus
insgesamt sieben Domänen: N-terminales Peptid (NTP), fünf Kringelstrukturen und die
Serinproteasedomäne. Bei der Aktivierung von Plasminogen wird die Peptidbindung Arg561Val562 gespalten. Das dadurch entstandene aktive Enzym Plasmin besteht aus einer leichten
(B) und einer schweren (A) Kette. Die leichte Kette hat ein Molmasse von 25 kDa und
umfasst die Aminosäuren Val562-Asn791; sie enthält die Serinprotease-Domäne mit dem
aktiven Zentrum, welches aus der katalytischen Triade Ser741, Asp646 und His603 besteht. Die
schwere Kette von Lys78 bis Arg561 setzt sich aus den fünf Kringeldomänen zusammen. Sie
hat, je nach Art der Glykolsylierung, ein Molekulargewicht von 64.3 bis 66.5 kDa. Die
Tertiärstruktur wird in Plasminogen und Plasmin von 24 Disulfidbrücken stabilisiert.
Plasminogen kommt in zwei unterschiedlichen Varianten vor, die sich in der Art ihrer
Glykosylierung unterscheiden. Variante I ist diglykosyliert, N-glykosidisch an Asn289 und Oglykosidisch an Thr346, und hat ein Molekulargewicht von 91.5 kDa ; Variante II ist an Ser249
(Pirie-Shepherd et al., 1997) und Thr346 O-glykosidisch modifiziert mit einer Molmasse von
89.3 kDa (Hayes und Castellino, 1979, b + c). Beide Typen zeigen Heterogenität in Bezug auf
den Sialinsäuregehalt, wodurch mehrere Isoformen des Glykoproteins auftreten, welche sich
in ihren IEPs (6.2 – 6.6) unterscheiden. Die Affinität von Variante II für Lysin, Fibrin und α2Antiplasmin ist wesentlich höher, da die Kohlenhydrat-Kette an Asn289 fehlt ( Hayes und
Castellino, 1979, a; Lijinen et al., 1981). Die Variante I hingegen lässt sich leichter zu
Plasmin aktivieren als Variante II (Collen und De Maeyer, 1975; Takada und Takada, 1983).
Des weiteren ist der Aminosäurerest Ser578 in der Serinprotease-Domäne durch
Phosphorylierung modifiziert (Wang et al., 1997).
Das NTP des humanen Plasminogens
Das NTP umfasst die Aminosäuren Glu1-Lys77; es bindet vermutlich an die
Lysinbindungsstelle von Kringel 5 und führt damit zur α-Konformation von GluPlasminogen. Aktiviertes Plasmin kann das NTP in einer autokatalytischen Reaktion von
anderen Plasmin- und Plasminogen-Molekülen abspalten. Durch zwei Disulfidbrücken mit
dem Cystein-Verknüpfungsmuster 1-4 und 2-3wird ein „loop-in-a-loop“-Motiv gebildet.
Glu-Plasminogen kommt in drei Konformationen vor: α (tense), β (relaxed) und γ. Die
kompakte α-Konformation, bei der Plasminogen die Form einer rechtshändigen Spirale
einnimmt, wird bei der Abspaltung von NTP in die offene β-Konformation umgewandelt. Es
konnte gezeigt werden, dass die Aminosäure Lys50 des NTP an die LBS von Kringel 5 bindet
(Cockell et al., 1998; An et al., 1998) und so wahrscheinlich zur Aufrechterhaltung der αKonformation von Plasminogen beiträgt.
36
Einleitung
40
70
30
50
1
60
NTP
10
20
Figur 2.11: Darstellung des N-terminalen Peptides (NTP) von humanem Plasminogen: blau: Disulfidbrücken;
grün: Cyanbromid-Spaltstelle
Die Kringel-Domänen
Die Fähigkeit von Plasminogen, mit Fibrin(ogen), extrazellulären Matrixproteinen sowie
Säuger- und Bakterienzellen zu interagieren, wird hauptsächlich durch Interaktionen mit den
Kringeldomänen des Serinprotease-Vorläufers vermittelt. Diese Kringelstrukturen bestehen
aus homologen, durch drei Disulfid-Brücken stabilisierten Peptidregionen mit einer Länge
von 78 - 80 Aminosäuren (Sottrup-Jensen et al., 1978). Die fünf Domänen in Plasminogen
umfassen die Aminosäuren Cys84-Cys162 (Kringel 1), Cys166- Cys243 (Kringel 2), Cys256Cys333 (Kringel 3), Cys358-Cys435 (Kringel 4) und Cys462-Cys541 (Kringel 5). Die Kringel sind
vermutlich durch „gene shuffling“ verbreitet worden, da sehr ähnliche Strukturen auch in
anderen Proteinen, z.B. tPA (Pennica et al., 1983), uPA (Steffens et al., 1982), Faktor XII
(McMullen und Fujikawa, 1985), Prothrombin (Magnussen et al., 1975) und
Apolipoprotein(a) (McLean et al., 1987), gefunden wurden. Die Mehrfach-Kringel-Domänen
haben sich danach wahrscheinlich durch Genverdopplung oder Fusion individuell
entstandener Domänen entwickelt.
Die Kringel 2 und 3 von Plasminogen nehmen innerhalb des Moleküls eine Sonderstellung
ein, da sie neben den bei allen Kringeln vorhandenen drei Disulfidbrücken durch eine weitere
Brücke zwischen Cys169 und Cys297 zu einem Supermodul verbunden sind. Durch NMRMessungen konnte belegt werden, dass die Beweglichkeit der einzelnen Kringel dadurch
wesentlich eingeschränkt wird. Die zusätzliche Disulfidbrücke führt vermutlich auch zur
reduzierten antiangiogenen Aktivität von Kringel 2 + 3 im Vergleich zu einem Gemisch der
einzelnen Kringel (siehe 1.3.2.1). Auch der Hepatozyten-Wachstumsfaktor/Streufaktor
(hepatocyte growth factor/ scatter factor, HGF/SF) und das Hepatozyten-Wachstumsfaktorähnliche/Makrophagen-stimulierende Protein (hepatcyte growth factor like/ macrophage
stimulating protein, HGFI/MSP), welche vermutlich aus demselben Vorläufer-Protein wie
Plasminogen entstanden sind und vier Kringel enthalten, weisen eine InterkringelDisulfidbrücke zwischen ihren Kringeln 2 +3 auf. Die funktionelle Bedeutung dieser
Disulfidbrücke ist noch unbekannt; ihre starke Konservierung während der Evolution weist
aber darauf hin, dass sie wichtig für die Erhaltung der Molekülstruktur ist und folglich auch
Einfluss auf die Funktion des Proteins hat.
37
Einleitung
190
380
280
420
270
180
230
K2
320
K3
220
K4
370
310
390
410
200
290
430
170
260
240
330
360
210
120
110
400
300
250
130
160
140
350
340
80
K1
440
450
90
150
100
460
470
530
540
480
510
K5
500
520
490
Figur 2.12: Darstellung der Kringeldomänen von humanem Plasminogen: blau: Disulfidbrücken; grün:
Spaltstellen von V8-Protease, Elastase und Pepsin; violett: Glykosylierungsstellen
Durch proteolytische Spaltung von humanem Plasminogen mit Elastase und Pepsin können
die Fragmente Kringel 1+2+3, Kringel 4, Kringel 5, Miniplasminogen (Kringel 5 +
Serinprotease-Domäne) und Microplasminogen (Serinprotease-Domäne) gewonnen werden.
Mehrere einzelne Kringeldomänen von HPg wurden bereits rekombinant in E. coli exprimiert:
Kringel 1 (Menhart et al., 1991), Kringel 2 (Marti et al., 1994), Kringel 3 (Marti et al., 1994),
Kringel 4 (McCance et al., 1994) und Kringel 5 (McCance et al., 1994). Des weiteren wurden
die Fragmente Kringel 2+3 (Söhndel et al., 1996), NTP (Lewis et al., 1999), NTP + Kringel 1
(Douglas et al., 2002) und Kringel 3 mit aktiver Lysinbindungsstelle (Bürgin und Schaller,
1999) exprimiert und charakterisiert. Von den meisten rekombinant hergestellten Proteinen
sind die Eigenschaften bezüglich Lysinbindung, von einzelnen auch die dreidimensionale
Struktur bekannt.
190
280
270
180
230
K2
320
K3
220
310
290
200
170
260
240
330
210
250
300
Figur 2.13: Darstellung des Kringel 2+3-Moduls von humanem Plasminogen; blau: Disulfidbrücken: grün: V8Protease-Spaltstelle; violett: Glykosylierungsstellen
38
Einleitung
Die Interaktion von Plasminogen mit anderen Proteinen wird durch Lysin und seine Analoga
(z.B. 6-AHA) inhibiert. Nicht alle Lysinbindungsstellen (LBS) haben eine gleich starke
Affinität für ihre Liganden. Die Assoziationskonstanten nehmen in der Reihe K1 > K4 > K5 >
K4 >> K3 ab. In der Aminosäuresequenz des Kringels 3 von HPg findet sich anstelle von
Asp57 ein Lysinrest, wodurch in der Lysinbindungsstelle eine negative durch eine positive
Ladung ersetzt wird. Die LBS wird durch diesen Austausch völlig inaktiviert. Bei einem
rekombinant hergestellten Kringel 3-Konstrukt, welches die Mutation von Lys57 zu Asp
enthält, konnte eine Assoziationskonstante gemessen werden, welche zwischen der von
Kringel 2 und Kringel 5 liegt. So konnte gezeigt werden, dass Asp57 eine wichtige Rolle in
der Interaktion mit dem Liganden einnimmt. Die LBS ist im allgemeinen so geformt, dass
zwei positiv ( Arg34/Lys35, Arg71) und zwei negativ geladene Aminosäuren (Asp55, Asp/Glu57)
mit den gegensätzlich geladenen Regionen des Liganden in elektrostatische Interaktion treten;
zusätzlich wird der Ligand durch hydrophobe Wechselwirkungen mit einer aus aromatischen
Aminosäureresten (Phe36, Trp62, Phe/Tyr64, Trp/Tyr72, Tyr74) gebildeten Tasche stabilisiert.
(22)
379
418
(63)
K4
430
(75)
358
(1)
407
(51)
435
(80)
400
440
Figur 2.14: Darstellung einer Kringeldomäne von humanem Plasminogen am Beispiel von Kringel 4; die an der
Lysinbindungsstelle beteiligten Aminosäuren sind eingefärbt; blau: positiv geladene Aminosäuren; rot: negativ
geladene Aminosäuren; grün: hydrophobe Aminosäuren
Serinprotease
Plasminogen gehört zu den Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen; es spaltet Proteine nach
Lysin- und Arginin-Resten. Da beinahe alle Proteine diese Aminosäuren enthalten, ist die
Auswahl an möglichen Substraten für Plasmin gross und die Substratspezifität
dementsprechend klein.
Die weitgehend homologen aktiven Zentren der verschiedenen Serinproteasen weisen darauf
hin, dass alle ihre Substrate über denselben katalytischen Mechanismus spalten. Das aktive
Zentrum wird durch die katalytische Triade in der Serinprotease-Domäne gebildet; in
Plasminogen besteht diese aus den Aminosäuren Ser741, Asp646 und His603. Durch das
Eindringen des N-terminalen Val562 von aktiviertem Plasmin in die Tasche des aktiven
Zentrums und die nachfolgende Bildung einer Salzbrücke mit Asp740 wird die Anordnung der
an der Spaltung beteiligten Aminosäuren neu ausgerichtet; dies ist für die optimale Aktivität
des Enzyms essentiell (Wang et al., 1995).
39
Einleitung
Die Spaltung eines Proteins durch Plasmin geschieht in vier Schritten. Nachdem das Enzym
sein Substrat gebunden hat, geschieht ein nukleophiler Angriff von Ser741 auf die
Carbonylgruppe von Lys/Arg im zu spaltenden Protein; dabei wird ein tetraedrales
Intermediat gebildet. Dieses wird anschliessend durch Protonenabgabe von His603 in ein AcylEnzym-Intermediat umgewandelt. Die abgehende N-terminale Amingruppe des Substrats
wird vom Enzym freigegeben und durch ein Wassermolekül ersetzt. Im dritten Schritt wird
das Acyl-Enzym-Intermediat in einer Umkehrreaktion deacyliert. Durch die darauf folgende
Freigabe des entstandenen Carboxylat-Produkts, welches den neuen C-Terminus der
gespaltenen Polypeptidkette darstellt, wird das aktive Enzym regeneriert.
690
700
680
730
740
S
710
770
750
760
650
660
580
790
670
720
630
D
780
570
640
590
610
620
H
600
Figur 2.15: Darstellung der Serinprotease-Domäne von humanem Plasminogen; blau: Disulfidbrücken; rot:
katalytische Triade
2.2.2.2 Aktivierung von Plasminogen
Die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin geschieht durch die Spaltung der
Peptidbindung Arg561-Val562 des Zymogens. Dadurch entsteht ein Plasmin-Molekül mit einer
leichten und einer schweren Kette, welche über zwei Disulfidbrücken miteinander verbunden
sind. Durch die Interaktion des neu gebildeten N-Terminus von Plasmin mit Asp740 erfährt die
katalytische Domäne eine leichte Konformationsänderung, wodurch die Aminosäuren der
katalytischen Triade optimal ausgerichtet werden.
Die Aktivierung kann auf zwei Wegen erfolgen:
Durch Glu- oder Lys-Plasmin wird das NTP abgespalten, wodurch die kompakte αKonformation geöffnet wird und Lys-Plasminogen (Lysin78 – Asn791) entsteht (Violand und
Castellino, 1976). Die vorher geschützte Peptidbindung Arg561-Val562 ist nun für die
Aktivatoren besser zugänglich und wird proteolytisch gespalten. Dadurch entsteht ein
Plasmin-Molekül mit einer leichten und einer schweren Kette, welche über zwei
Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Die Peptidbindung Arg561-Val562 kann aber
auch zuerst gespalten werden, wodurch Glu-Plasmin gebildet wird. Durch anschliessende
Abspaltung des NTP entsteht danach das aktive Enzym Plasmin. Dieser Aktivierungsweg
wird aber durch die kompakte Form von Plasminogen und die dadurch geschützte
Peptidbindung Arg561-Val562 behindert; die Aktivierungsrate von Lys-Plasminogen ist deshalb
wesentlich höher als diejenige von Glu-Plasminogen. Am Fibringerinnsel wird gebundenes
40
Einleitung
Glu-Plasminogen durch bereits im Pfropfen vorhandenes Plasmin rasch zu Lys-Plasminogen
umgesetzt. Dieses hat eine höhere Affinität für Fibrin und wird deshalb vom ebenfalls an
Fibrin gebundenen Aktivator tPA rasch zu enzymatisch aktivem Plasmin umgesetzt
(Hoylaerts et al., 1982).
Glu-Plasminogen
Glu1
Asn791
Glu- oder Lys-Plasmin
tPA, uPA, Kallikrein
Lys78
Glu1
Asn791
Lys-Plasminogen
Asn791
Glu-Plasmin
tPA, uPA, Kallikrein
Arg561
Val562
Glu- oder Lys-Plasmin
Lys78
Asn791
Lys-Plasmin
Arg561
Val562
Figur 2.16 : Physiologische Aktivierung von Plasminogen ; rote Pfeile : höhere Reaktionsrate; schwarze Pfeile:
niedrige Reaktionsrate
2.2.2.3 Angiogenese und Angiostatin
Angiogenese, das Wachstum von neuen Kapillaren aus existierenden Blutgefässen (Folkman
und D´Amore, 1996), ist essentiell für Wundheilung, Embryoentwicklung, Organbildung,
Geweberegeneration und Gewebeumformung (Griffioen und Molema, 2000).
Die Angiogenese ist ein komplizierter, mehrschrittiger Prozess, welcher endotheliale
Zellproliferation, -migration und -differentation, den Abbau von extrazellulären Matrices,
Gefässbildung und Wachstum von neuen Kapillarzweigen beinhaltet. Blutkapillaren sind
hauptsächlich aus endothelialen Zellen aufgebaut, welche beim Erwachsenen unter
physiologischen Bedingungen keine Aktivität zeigen (Hanahan und Folkman, 1996). Sind
entsprechende Stimuli vorhanden, werden diese Zellen aktiviert und können die umgebende
Basalmembran abbauen, ihre Morphologie ändern, proliferieren, neues Lumen formen und
Mikrogefässe formen (Folkman und Shing, 1992). Dieser Prozess unterliegt strengen
Kontrollmechanismen. Unter pathologischen Bedingungen kann das unkontrollierte
Wachstum von neuen Blutgefässen zur Entstehung und Ausbreitung von Krankheiten wie
Tumorwachstum, Diabetes-Retinopathie, Gewebe- und Organmissbildungen und
kardiovaskulären Störungen führen (Folkman, 1995). Mehrere Studien haben gezeigt, dass
Tumorwachstum und Metastasierung von der Angiogenese abhängen. Tumoren weisen häufig
eine Überexpression von Angiogenese-stimulierenden Molekülen wie den FibroblastWachstumsfaktoren (FGF) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor
(VEGF)/Vaskulären Permeabilitätsfaktor auf. Zusätzlich zu Überproduktion dieser Faktoren
41
Einleitung
muss die Expression sogenannter Angiogenese-Inhibitoren heruntergefahren werden, um die
Angiogenese im Tumor auszulösen (Good et al., 1990; Van Meir et al., 1994).
Eine Anzahl Fragmente oder Unterdomänen von grossen Proteinmolekülen sind als
Angiogenese-Inhibitoren identifiziert worden. Endostatin (ein proteolytisches Fragment von
Kollagen XVIII (O´Reilly et al., 1997), das 16 kDa N-terminale Fragment von Prolactin
(Clapp et al., 1993), ein N-terminal verkürzter Blutplättchen-Faktor 4 (Gupta et al., 1995) und
PEX (Brooks et al., 1998), ein C-terminales Fragment der Metalloprotease 2, sind wirksame
Angiogenese-Inhibitoren. In neuen Studien wurde ausserdem gezeigt, dass einige Domänen
von Kollagen Typ IV (Canstatin, Arrestin und Tumstatin) anti-angiogene Aktivität aufweisen.
Der wichtigste Inhibitor ist aber wohl Angiostatin, ein proteolytisches Fragment von
Plasminogen (O´Reilly et al., 1994). Angiostatin beinhaltet die ersten drei oder vier
Kringeldomänen von Plasminogen und ist ein starker Inhibitor von tumorinduzierter
Angiogenese in Tiermodellen. Das Protein verhindert die Proliferation und Migration und
erhöht die Apoptose von endothelialen Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass Angiostatin an
die ATP-Synthase an der Zelloberfläche bindet; diese Interaktion zwischen den beiden
Molekülen löst vermutlich die anti-angiogenen Effekte von Angiostatin und die
Downregulation der Zellproliferation und –migration aus (Moser et al., 1999). Ausserdem
binden Angiostatin und Plasmin (im Gegensatz zu Plasminogen) via Lysinbindungsstellen
auch an das Integrin αvβ3 (Tarui et al., 2002). Dieses Protein wird in endothelialen Zellen, die
mit Wachstumsfaktoren in Kontakt waren, oder die an der Tumor-Angiogenese beteiligt sind,
in grosser Menge exprimiert; Integrin αvβ3 hat möglicherweise eine wichtige Funktion bei
der Neubildung von Blutgefässen. Plasmin und Angiostatin erzielen durch ihre Bindung an
das Integrin gegensätzliche Effekte: Während Angiostatin die Zellmigration blockiert, wird
sie durch Plasmin induziert. Es wird vermutet, dass Plasmin nach der Kopplung an αvβ3 der
Signalübermittlung dient; indem Angiostatin mit Plasmin um die Bindungsstellen am Integrin
konkurriert, blockiert es auch die nachfolgende Signalübertragung, die wahrscheinlich der
Induktion der Zellmigration dient.
Kleinere Fragmente von Angiostatin haben unterschiedliche Effekte auf die Unterdrückung
des Wachstums von endothelialen Zellen (Cao et al., 1996). Kringel 1 und Kringel 2 sind
starke Wachstumsinhibitoren, während Kringel 4 nur eine schwache Wirkung zeigt. Das
Kringel-Supermodul Kringel 2+3 zeigt die gleiche inhibitorische Wirkung wie Kringel 2
alleine. Werden aber individueller Kringel 2 und Kringel 3 zu den endothelialen Zellen
gegeben, kann eine deutliche Erhöhung der Inhibition beobachtet werden. Das Fragment
Kringel 1-3 zeigt im Vergleich zum vollständigen Angiostatin eine erhöhte InhibitorAktivität. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Lysinbindungsfähigkeit nicht mit der
relativen inhibitorischen Wirkung der einzelnen Kringel-enthaltenden Konstrukte
zusammenhängt.
Des weiteren weisen auch die Plasminogen-Fragmente Kringel 1-5 (Sumariwalla et al., 2002)
und Kringel 5 (Cao et al., 1997) eine antiangiogene Wirkung auf. Die verschiedenen
Fragmente von Plasminogen und Angiostatin haben als Angiogenese-Inhibitoren viel
therapeutisches Potential. Doch der Mechanismus, durch welchen sie die Angiogenese
unterdrücken, ist immer noch unklar und ist Grundlage weiterer Forschung.
42
Einleitung
2.3 Interaktion Plasminogen-Prion
Schon seit einiger Zeit wird nach einem Molekül gesucht, welches spezifisch zwischen PrPSc
und PrPC unterscheidet. Im Jahr 2000 wurde eine Publikation veröffentlicht (Fischer et al.,
2000), in welcher die Entwicklung eines Affinitäts-Assays für PrPSc- oder PrP27-30-bindende
Proteine beschrieben wurde. Dazu wurden paramagnetische Beads mit Maus- oder
menschlichem Blutserum und einzelnen Serumproteinen beschichtet und in Lösungen
inkubiert, welche PrPC, PrPSc oder PrP27-30 enthielten. Die gebundenen Proteine wurden
eluiert und mittels Western Blot oder Bioassay mit Scrapie-infizierbaren Mäusen analysiert.
Dabei stellte sich heraus, dass Plasminogen unter bestimmten Bedingungen spezifisch an
PrPSc und PrPC, nicht aber an PrPC bindet. Die Interaktion ist aber auf die in der Publikation
erwähnten Bedingungen beschränkt; wird die Zusammensetzung des Assaypuffers verändert
oder die Detergentien bei der Homogenat-Aufbereitung weggelassen, findet keine Bindung
von PrPSc an Plasminogen mehr statt. Die physiologische Bedeutung der Plasminogen-PrPScInteraktion darf deshalb angezweifelt werden (Shaked et al., 2002). Die Korrelation zwischen
Prion-bindenden Beads und Infektivität wurde getestet, indem die Beads nach der Inkubation
in infektiösem Hirnhomogenat in die Gehirne transgener Mäuse implantiert wurden; alle
Tiere, denen mit Plasminogen gekoppelte Beads eingepflanzt wurden, erkrankten an Scrapie.
Die Denaturierung von Plasminogen oder PrPSc/PrP27-30 hatte den Verlust der
Bindungsfähigkeit zur Folge, was den Schluss zuliess, dass die Nativkonformation beider
Proteine eine zwingende Bedingung für das Zustandekommen der Interaktion ist. Eine
Konzentration von 1M NaCl im Assaybuffer hatte keinen Einfluss auf die Affinität von PrPSc
zu Plasminogen, so dass die Möglichkeit einer Interaktion elektrostatischer Art
ausgeschlossen werden konnte. Die Kringeldomänen des Protease-Vorläufers binden mit
hoher Affinität an die Lysinresten von interagierenden Proteinen (z.B. Fibrin; siehe Kapitel
1.3). Die Präzipitation von PrPSc durch Plasminogen konnte durch Zugabe von Lysin, nicht
aber durch Arginin inhibiert werden; deshalb kann davon ausgegangen werden, dass die
Bindung von Plasminogen an PrPSc durch die Lysinbindungsstellen der Kringeldomänen,
vermutlich durch die Kringel 1 – 3, vermittelt wird. Mögliche Bindungspartner von
Plasminogen sind die Lysincluster 1 (Lysin23, Lysin27) und 2 (Lysin101, Lysin104, Lysin106,
Lysin110) im N-terminalen Teil des Prion-Proteins. Des weiteren konnte die Interaktion von
Plasminogen-beschichteten Beads mit PrPSc und PrP27-30 aus den Hirnhomogenaten von BSEerkrankten Rindern, Scrapie-infizierten Schafen und CJD-Patienten nachgewiesen werden
(Maissen et al., 2001).
Das Prion-Protein interagiert auch mit anderen Kringel-tragenden Proteinen wie uPA,
DSPAα1 (ein Plasminogen-Aktivator aus der Vampir-Fledermaus) und tPA. Es konnte
gezeigt werden, dass das Prion-Protein durch Bindung an tPA die spezifische Aktivierung von
Plasminogen zu Plasmin stimuliert; durch Zugabe von PrP wurde die Aktivierungsrate von
Plasminogen um das 50-fache erhöht (Epple et al., 2004a). Die Plasminogen-Aktivierung
konnte aber nur mit rekombinant exprimiertem Prion-Protein PrP23-231 ohne koordinierte
Cu2+-Ionen (apoPrP, entspricht PrPSc) erreicht werden. Mit rekombinantem holoPrP, welches
dem zellulären Prion-Protein PrP23-231 mit gebundenem Kupfer entspricht, konnte kein
entsprechender Effekt beobachtet werden (Ellis et al., 2002). Die Interaktion zwischen PrP
und tPA konnte durch Zugabe von Lysin gestört werden, was auf die wichtige Rolle der
Lysinbindungsstelle des Kringels 2 von tPA hinweist (Epple et al., 2003). Für die
Stimulierung scheint hauptsächlich der N-terminale Teil des Prion-Proteins, PrP23-110,
verantwortlich zu sein (Praus et al., 2003). Dieses Fragment wird durch die Spaltung des
Prion-Proteins durch Plasmin generiert. Für die Bindung von PrP an tPA und die
nachfolgende Aktivierung von Plasminogen ist das Vorhandensein beider Lysin-Clusters in
PrP23-110 notwendig (Epple et al., 2004b). Der Cofaktor Heparin spielt vermutlich bei der
43
Einleitung
Generierung von PrP23-110, bei dem die beiden Lysin-Cluster für die Bindung an
Plasminogen und tPA besser zugänglich sind, eine wichtige Rolle und stimuliert auf diese
Weise die Aktivierung von Plasminogen.
Es wurde nachgewiesen, dass die Bindung von Plasminogen an PrPSc nicht vollständig
spezifisch ist und eine gewisse Restmenge an PrPC präzipitiert wird (vorliegende Arbeit; Ellis
et al., 2002). Kann die Spezifität des Assays aber durch Veränderung der experimen-tellen
Bedingungen oder Optimierung der PrP-Bindungseigenschaften von Plasminogen, z.B. durch
Mutation der Lysinbindungsstellen erhöht werden, könnte dies für die Entwicklung eines
diagnostischen Tests ausgenützt werden. Dies hätte den Vorteil, dass die zu analysierende
Probe vor der Isolation und Detektion von PrPSc nicht mehr enzymatisch behandelt werden
müsste. Ausserdem könnten durch Kopplung von Plasminogen an eine geeignete SäulenMatrix grössere Probenmengen (z.B. Blutplasma) mittels Affinitätschromatografie auf das
Vorkommen von PrPSc hin untersucht werden. Zusätzlich bietet sich die Möglichkeit, durch
die Entfernung von Plasminogen aus dem Blutplasma mit geeigneten Methoden im gleichen
Schritt auch eventuell vorhandene Prionen aus der Lösung zu entfernen und so die Sicherheit
von aus Plasma gewonnenen Produkten zu erhöhen.
Wie oben erwähnt, war in Experimenten nur eine Interaktion zwischen apoPrP und
Plasminogen festzustellen, nicht aber zwischen dem Cu2+-koordinierenden holoPrP und dem
Proteasevorläufer. Falls Änderungen der Kupferbindungseigenschaft von PrP einer
Konversion von PrPC zu PrPSc vorangehen, könnten die Interaktion von PrPSc mit tPA und die
Stimulierung der Plasminogen-Aktivierung wichtige Marker einer TSE-Infektion im ersten
Stadium darstellen, noch bevor PrPSc-Ablagerungen im Gehirn auftreten.
44
Einleitung
2.4 Zielsetzung
Nach dem Auftreten der BSE-Epidemie und durch die Besorgnis über die wahrscheinliche
Übertragbarkeit von BSE auf den Menschen ist die Forschungstätigkeit im Bereich TSE
intensiviert worden. Höchste Priorität hat die Entwicklung von möglichst sensitiven
diagnostischen Tests zum Nachweis von präklinischen TSE-Erkrankungen, die am lebenden
Tier durchgeführt werden können. Die bisher zugelassenen Schnell-Tests lassen eine
zuverlässige Diagnose nur post mortem zu. Ausserdem müssen alle Gewebeproben erst durch
Inkubation mit Proteinase K vom zellulären Prion-Protein befreit werden, da bisher noch kein
Antikörper gefunden werden konnte, welcher ausschliesslich PrPSc-spezifisch ist.
Deshalb waren die von Fischer et al. (2000) und Maissen et al. (2001) publizierten
Forschungsergebnisse von grossem Interesse. Sie zeigten, dass der Serinprotease-Vorläufer
Plasminogen unter bestimmten Bedingungen ausschliesslich an die pathogene Form des
Prion-Proteins der TSE-Erkrankungen BSE, Hamster-adaptiertes Scrapie und CJD bindet.
Der Nachweis von PrPSc wurde durch einen Assay mit Plasminogen-beschichteten,
paramagnetischen Beads und anschliessendem Western Blot durchgeführt.
Das für den Assay verwendete Plasminogen ist ein Blutserum-Protein, welches die
Hauptkomponente bei der Auflösung von Blutgerinnseln während der Fibrinolyse darstellt.
Plasminogen besteht u.a. aus fünf weitgehend homologen Domänen, den sogenannten
Kringeln. Diese Kringel zeigen eine hohe Affinität für Lysin; die Interaktion zwischen den
Proteindomänen und Lysin wird von den Lysinbindungsstellen der Kringel vermittelt.
Plasminogen interagiert über diese Bindungsstellen mit Lysinseitenketten von Fibrin und
anderen Proteinen.
In der vorliegenden Arbeit soll der von Fischer entwickelte Assay reproduziert und die
Detektionslimite der Isolation von PrPSc mit beschichteten Beads aus Hirnhomogenat von
BSE-infizierten Rindern ermittelt werden. Die Methode kann dabei durch Variieren
verschiedener Parameter, z.B. verwendete Antikörper, Membranen etc. optimiert werden.
Anschliessend soll die Interaktion zwischen Plasminogen und dem Prion-Protein genauer
charakterisiert werden. In der Publikation von Fischer wurde darauf hingewiesen, dass die
Interaktion von PrPSc mit HPg vermutlich an den HPg-Domänen Kringel 1 – Kringel 3
stattfindet. Um dies genauer zu untersuchen, werden verschiedene Konstrukte von HPgFragmenten kloniert und in E. coli exprimiert. Andere Fragmente können durch limitierte
Elastase-Spaltung von aus Blutserum isoliertem HPg generiert werden. Mit diesen Proteinen
sowie Plasminogen von verschiedenen Spezies werden Pull Down-Assays durchgeführt, um
eventuelle Veränderungen in der Affinität von PrPSc zum jeweiligen Interaktionspartner
feststellen zu können.
Es wurde gezeigt, dass die Bindung von PrPSc an Plasminogen durch Zugabe von Lysin
inhibiert werden kann. Dies weist darauf hin, dass die Lysinbindungsstelle der
Kringeldomänen für die Vermittlung der Interaktion Prion-Protein/HPg verantwortlich ist.
Um dies zu verifizieren, wird ein Konstrukt des Plasminogen-Fragments Kringel 1
rekombinant exprimiert, dessen Lysinbindungsstelle durch Mutation inaktiviert worden ist.
Inhibitions- und Elutions-Experimente mit 6-AHA, einem Analogon von Lysin, sollen
weiteren Aufschluss darüber geben, ob das Prion-Protein tatsächlich mit der
Lysinbindungsstelle interagiert, oder ob die Bindung auf anderen, unspezifischen
Wechselwirkungen beruht.
PrPC hat eine grosse Affinität zu Ni2+-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA). Es hat sich gezeigt, dass
beim Assay mit HPg-gekoppelten Beads trotz Optimierungsversuchen eine geringe Menge
PrPC mitisoliert wird. Deshalb soll untersucht werden, ob die Affinität für Ni-NTA zur
vollständigen Entfernung von PrPC ausgenützt werden kann. Ausserdem sollen die
45
Einleitung
Interaktionseigenschaften von PrPC/PrP und Nickel mit denjenigen von anderen Metallionen
verglichen werden. Anhand der Resultate der durchgeführten Experimente sollen passende
Bedingungen für die Entwicklung einer anderen Nachweis-Methode von PrPSc mit HPg, z.B.
mit dem Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), gewählt werden.
46
E. coli Material und Methoden
3 E. coli Material und Methoden
3.1 Molekularbiologie
3.1.1 Material
3.1.1.1 Bakterienstämme
Stamm
Genotyp, Beschreibung
Lieferant
TOP10
F- mcr A ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)
Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 deoR
araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK
rpsL (StrR) endA1 nupG
Klonierstamm
Invitrogen
XL1-Blue
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17,
supE44, relA1, lac, [F’ : proAB,
lacIqZ∆M15, Tn10 (TetR)]
Klonierstamm
Stratagene
M15(pREP4)
F-, thi-1, lac, mtl-1, [pREP4: KanR]
Expressionsstamm
enthält das Plasmid pREP4, das für den
lacIq-Repressor codiert
Qiagen
BL21 Star™(DE3)
F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131
(DE3)
Expressionsstamm
Invitrogen
Rosetta(DE3)
F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)
pRARE (CamR)
Expressionsstamm; BL21-Derivat;
stellt mittels pRARE-Plasmid tRNAs
für sechs in E. coli selten verwendete
Codons zur Verfügung
Novagen
Rosetta2(DE3)pLacI
F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)
pLacIpRARE2 (CamR)
liefert ein siebtes seltenes Codon zusätzlich zu den sechs in Rosetta(DE3)
vorhandenen; trägt lac-Repressor-Gen
Novagen
Tuner(DE3)pLacI
F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm lacY1
(DE3) pLacI (CamR)
lacZY-Mutante von BL21; Grad der
Proteinexpression kann durch die Konzentration von IPTG gesteuert werden;
trägt lac-Repressor-Gen
Novagen
47
Stamm
Genotyp, Beschreibung
Lieferant
LR2/168
Genotyp nicht bekannt
Wirt des Plasmids pQE-8
DCB, Uni Bern
3.1.1.2 Plasmide
Plasmid
Beschreibung
Lieferant
pET100/D-TOPO®
5764 bp, AmpR, T7lac-Promotor
geeignet für Proteinexpression in BL21(DE3)
und Derivaten; Insert benötigt CACC-Anfangssequenz;
erleichtertes Klonieren durch Verknüpfung der
Cloning Site mit Topoisomerase; fügt dem Protein
einen N-terminalen Hexahistidin-Tag und eine
Enterokinase-Schnittstelle an
Invitrogen
pETBlue™-1
3476 bp, AmpR, T7lac Promotor
geeignet für Proteinexpression in BL21(DE3)pLacI
und Derivaten
ermöglicht die Expression von Proteinen ohne
Affinitäts-Tag; Insert muss mit ATG beginnen
Novagen
pPLGKG
6515 bp, TetR
enthält cDNA von HPg
Hedén Lab,
Lund (S)
pQE-8
3427 bp, AmpR, T5-Promotor
geeignet für Proteinexpression in M15(pREP4);
fügt dem Protein einen N-terminalen HexahistidinTag an
Qiagen
pREP4
3740 bp, KanR
in M15(pREP4) enthalten; codiert für den lacIq –
Repressor
Qiagen
3.1.1.3 Nährmedien
Nährmedium
Herstellung
Lieferant
LB
20 g LB-Fertigmischung
in 1 l dH2O lösen; autoklavieren
Becton Dickinson
LB Agar
20 g LB-Fertigmischung
15 g Bacto™ Agar
in 1 l dH2O lösen; autoklavieren
Becton Dickinson
Becton Dickinson
48
3.1.1.4 Antibiotika
Antibiotikum
Konzentrationen
Lieferant
Ampicillin
Natriumsalz
Stammlösung: 100 mg/ml dH20
Endkonzentration: 100 µg/ml Medium
(1 µl/ml)
Applichem
Carbenicillin
Natriumsalz
Stammlösung: 50 mg/ml dH20
(1 µl/ml)
Serva
Chloramphenicol
Stammlösung: 34 mg/ml Ethanol
(1µl/ml)
Fluka
Kanamycin
Monosulfat
Stammlösung: 50 mg/ml dH2O
(0.5 µl/ml)
Sigma
Tetracyclin
Stammlösung: 5 mg/ml Ethanol
Endkonzentration: 12.5 µg/ml Medium
(2.5 µl/ml)
Sigma
3.1.1.5 Enzyme
Enzym
Beschreibung
Lieferant
BamH I
Restriktionsenzym;
G↓GATCC
20 U/µl; BamH I-Puffer
New England Biolabs
BstX I
Restriktionsenzym;
CCANNNNN↓NTGG
10 U/µl; Puffer 3
New England Biolabs
Dpn I
Restriktionsenzym
GA(meth.)↓TC
10 U/µl; Puffer 4
New England Biolabs
Hind III
Restriktionsenzym
A↓AGCTT
10 U/µl; Puffer B
Roche
Nco I
Restriktionsenzym
C↓CATGG
10U/µl; Puffer 4
New England Biolabs
49
Enzym
Beschreibung
Lieferant
Pst I
Restriktionsenzym
CTGCA↓G
10 U/µl; Puffer H
Roche
pfu-DNA-Polymerase
DNA-Polymerase
3 U/µl
Promega
SAP
Phosphatase
1 U/µl
Promega
T4-DNA-Ligase
DNA-Ligase
3 U/µl
Promega
T4-Polynukleotid-Kinase Polynukleotid-Kinase
10 U/µl
Promega
3.1.1.6 Marker
Marker
Grösse der DNA-Fragmente
Lieferant
1 kb plus DNA Standard
100, 200, ...,500, 650, 850, 1000, 1650,
2000, 3000, ..., 12000 bp
Invitrogen
3.1.1.7 Primer
Der Lieferant war in allen Fällen die Firma Microsynth, Balgach (SG). Wenn nicht anders
vermerkt, wurden die Primer entsalzt geliefert. Mit dH2O wurden 100 µM Lösungen der
Primer hergestellt. Die Lösungen wurden jeweils 5 Minuten bei 65°C inkubiert, kurz mit dem
Vortex gemischt und anschliessend 3 Minuten bei 65°C inkubiert. Die gelösten Primer
wurden bei –20°C gelagert..
Konstrukt
Primername, Sequenz (5’ → 3’)
K23mut
K3 upper primer
CAT AAC AGG ACA CCA GAA AAC TTC CCC TCC AAA AAT TTG
GAT GAA AAC
K3 lower primer
GTT TTC ATC CAA ATT TTT GGA GGG GAA GTT TTC TGG TGT CTT
GTT ATG
K1FXa
HisMetK1 5’
GCG GAT CCA TCG AGG GTA GAA TGA AAG TGT ATC TCT CAG
AGT
50
Konstrukt
Primername, Sequenz (5’ → 3’)
HisMetK1 3’
GCG GAT CCC TAT TAC TCT TCA CAC TCA AGA ATG TC
K1FXa mut HisMetK1mut for2
AGG AAT CCA GAC AAC GCT CCG CAG GGG CCC TGG TG
HisMetK1mut rev2
CAC CAG GGC CCC TGC GGA GCG TTG TCT GGA TTC CT
K4FXa
TOPO K4 2
CAC CAT CGA GGG TAG AGT CCA GGA CTG CTA C
TOPO K4 3
ATG CTA TTA CGC TTC TGT TCC TGA
K4Blue-1
K4 pETBlue-1
ATG GTC CAG GAC TGC TAC CAT GGT
TOPO K4 3
siehe bei K4FXa
K13FXa
K13pET100 for
CAC CAT CGA GGG TAG ATC AGA GTG CAA GAC TGG GAA TGG
AAA G
HPg K13 P2
GCC GGA TCC TCA CTA GGA GTC ACA GGA CGG TAT CTT ACA G
K13Blue-1
K13 pETBlue-1
ATG TCA GAG TGC AAG ACT GGG AAT GGA AAG
HPg K13 P2
siehe bei K13FXa
3.1.1.8 Kits
Kit
Anwendung
Lieferant
MinElute™ Gel
Extraction Kit
Isolation von DNA aus Agarosegels
Entfernen von Enzymen, Proteinen, Nukleotiden
aus Reaktionsansätzen (mit Puffer PB)
Qiagen
51
Kit
Anwendung
Lieferant
Perfectly Blunt
Cloning Kit
Ungerichtetes Klonieren von ungeschnittenen
PCR-Produkten in pETBlue-1
Novagen
pET Directional
TOPO Expression Kit
Gerichtetes Klonieren von ungeschnittenen
PCR-Produkten in pET100/D-TOPO
Invitrogen
QIAprep® Spin
Miniprep Kit
Isolation von Plasmiden aus 5 ml Kulturen
Qiagen
3.1.1.9 Reagenzien, Lösungen, Puffer
Reagens/Lösung/Puffer
Beschreibung
Lieferant
Agarose
Electrophoresis Grade
Invitrogen
BamH I-Puffer
10x: 150 mM NaCl, 10 mM TrisHCl, 10 mM MgCl2, 1mM DTT;
pH 7.9
New England Biolabs
CaCl2 Dihydrat
p.A.
Merck
DNA-Ladepuffer
6x: 0.8 %o Bromphenolblau, 0.8 %o
Xylancyanol FF, 40 % Saccharose
Merck, Fluka, Fluka
Essigsäure (Eisessig)
100 %, p.A.
Merck
Ethanol
absolut; 99,8 %, ohne Zusatz
DCB, Uni Bern
Ethidiumbromid-Lösung
wässrige Lösung; 10 mg/ml
Sigma
Glyzerin
ca. 87 %, p.A.
Merck
IPTG
> 99 %
Applichem
PCR Nukleotid Mix
je 10 mM dATP, dCTP, dGTP,
DTTP in H2O; pH 7.5
Promega
pfu DNA Polymerasepuffer
10x: 200 mM Tris-HCl, 100 mM
KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM
MgSO4, 1 % Triton® X-100, 1 mg/ml
BSA; pH 8.8
Promega
Puffer 3
10x: 10 mM NaCl, 50 mM TrisHCl, 10 mM MgCl2, 1mM DTT;
pH 7.9
New England Biolabs
Puffer 4
10x: 50 mM K-Acetat, 20 mM TrisAcetat, 20 mM Mg-Acetat, 1mM
DTT; pH 7.9
New England Biolabs
Puffer B
10x: 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2,
100 mM NaCl, 1mM 2-MercaptoEthanol; pH 8.0
Roche
52
Beschreibung
Lieferant
Puffer D
10x: 6 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2,
150 mM NaCl, 1mM DTT; pH 7.9
Roche
Puffer H
MgCl2, 100 mM NaCl, 1mM DTE;
pH 7.5
Roche
SAP-Puffer
MgCl2; pH 8.5
Roche
T4 DNA Ligase-Puffer
10x : 300 mM Tris-HCl, 100 mM
MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP;
pH 7.8
Promega
TAE-Puffer (10x)
50x: 2 M Tris, 1 M Eisessig; 50 mM
EDTA; pH 8.0
Sigma, Merck, Fluka
3.1.1.10 Weiteres Zubehör
Zubehör
Beschreibung
Lieferant
Sterilfilter
Millex® GP, 0.22 µm Porengrösse
Millipore
Sorvall-Zentrifugen
RC3B Plus, RC5Bplus
Heraeus
Eppendorf-Zentrifuge
Centrifuge 5417c
Vaudaux-Eppendorf
Microphotometer
GeneQuant
Amersham
PCR Cycler
Mastercycler Gradient
Vaudaux-Eppendorf
Power Supply
EPS 3500
Amersham
UV-Photografie
MultiImage™ Light Cabinet
AlphaImager™ 2200 Documentation
and Analysis System
Witec AG
Wasserbad
Julabo VC
R.C. Kuhn
3.1.1.11 Geräte
53
3.1.2 Methoden
3.1.2.1 Plasmidisolation aus E. Coli
Zur Isolation von Plasmiden aus E. coli-Kleinkulturen wird das „QIAprep® Spin Miniprep
Kit“ verwendet. Darin sind alle notwendigen Puffer und die QIAquick-Säulen enthalten. Bei
einer Miniprep-Isolation können aus einer 5 ml E. coli-Kultur bis zu 20 µg Plasmid-DNA
gewonnen werden.
Eine während 16 h inkubierte Starterkultur (siehe 2.1.2.9.1) wird während 10 min bei 5000
rpm und 4°C zentrifugiert. Aus dem Pellet wird dann nach Vorschrift (QIAprep® Miniprep
Handbook, Seite 22, März 2003) die Plasmid-DNA isoliert. Die mit EB-Puffer aus dem Kit
oder mit H20 eluierte DNA kann bis zur Weiterverwendung bei –20°C gelagert werden.
3.1.2.2 PCR
Mit PCR kann mit geeigneten Primern und einem gut angepassten PCR-Programm in kurzer
Zeit ein beliebiges DNA-Segment amplifiziert werden. Das Programm besteht aus folgenden
drei Schritten:
Denaturierung
die Templat-DNA wird für Primer und Polymerase zugänglich gemacht
Hybridisierung
die Primer binden ans Templat
Elongation
Nukleotide werden durch die Polymerase ans 3`-Ende der Primer angehängt
Die verwendete pfu-Polymerase (aus Pyrococcus furiosus) ist eine hitzestabile, DNAabhängige Polymerase mit „proofreading“-Aktivität. Dies verringert die Häufigkeit von falsch
inkorporierten Nukleotiden im vervielfältigten DNA-Stück erheblich.
3.1.2.2.1 DNA-Amplifikation mit PCR
Reagens
H20
pfu-Puffer (10x)
PCR Nukleotid Mix
Plasmid pPLGKG (100 ng)
Primer 1 (50 pmol)
Primer 2 (50 pmol)
Pfu-Polymerase (1.5 U)
Totalvolumen
Volumen
41.5 µl
5 µl
1 µl
1 µl
0.5 µl
0.5 µl
0.5 µl
50 µl
Der Ansatz wird vorsichtig gemischt. Das PCR-Röhrchen wird in den Probenhalter des PCR
Cyclers gestellt und das Programm gestartet.
54
Programm
Anzahl Zyklen
1
30
1
Zeit
3 min
1 min
1 min
2 min
5 min
Temperatur
94°C
94°C
je nach Konstrukt:
K1FXa:
50°C K4Blue-1: 60°C K4FXa: 42°C
K13Blue-1: 60°C K13FXa: 60°C
72°C
72°C
Nach Beendigung des Programms kann der PCR-Ansatz bis zur Weiterverwendung bei –20°C
gelagert werden.
3.1.2.2.2 PCR WHOPS (Whole Plasmid Site-directed Mutagenesis)
Diese Methode stellt eine Alternative zur konventionellen PCR-Reaktion dar; sie erlaubt die
Einführung von Mutationen in beinahe jedes doppelsträngige Plasmid, ohne dabei spezielle
Vektoren, Einführung von Restriktionsschnittstellen oder mehrfache Transformationen zu
benötigen.
Als Templat dient ein supercoiled doppelsträngiges Plasmid mit dem zu mutierenden Insert.
Es werden zwei Primer konstruiert, welche in ihrer Mitte die gewünschte Mutation enthalten
und komplementär zur jeweils gleichen Sequenz auf den beiden Strängen der Templat-DNA
sind. Während der PCR-Reaktion hybridisieren die Primer mit dem Vektor und werden von
der pfu-Polymerase verlängert. Dadurch entsteht ein mutiertes Plasmid mit gestaffelten
Strangöffnungen. Der Ansatz wird nun mit DpnI verdaut, so dass die parentale, methylierte
DNA geschnitten wird. Die verbleibenden Plasmidstränge mit der Mutation lagern sich zu
doppelsträngigen Vektoren zusammen. Die DNA kann nun in E. coli transformiert werden,
wo die von der Amplifikationsreaktion zurückgebliebenen Strangöffnungen repariert werden.
Synthese des mutierten Strangs:
a) Denaturierung des mutierten Strangs
b) Hybridisieren der Mutationsprimer
c) Primerverlängerung durch pfu
Polymerase
DpnI-Restriktion des Templats:
Methylierte und hemimethylierte DNA
wird verdaut
Transformation:
Transformation des mutierten Moleküls in
kompetente Zellen zur Reparatur der
Strangöffnungen
Bild 3.1: Einführung einer Mutation in ein Plasmid durch WHOPS
55
PCR-Reaktion
Damit die Primer auf beiden Seiten der einzuführenden Mutation genügend stark mit der
Templat-DNA hybridisieren, müssen auf beiden Seiten des Mismatches mindestens 15
Nukleotide folgen, die der Originalsequenz entsprechen. Die Mutationsprimer werden jeweils
PAGE-gereinigt bezogen, um Störeinflüsse durch Verunreinigungen und falsch synthetisierte
Oligonukleotide zu vermeiden.
Reagens
Volumen
H20
pfu-Puffer (10x)
PCR Nukleotid Mix
Plasmid mit Insert (25ng)
Mutationsprimer 1 (25 pmol)
Mutationsprimer 2 (25 pmol)
Pfu-Polymerase (3 U)
Totalvolumen
37 µl
5 µl
1 µl
1 µl
2.5 µl
2.5 µl
1 µl
50 µl
Programm
Anzahl Zyklen
1
30
Zeit
2 min
1 min
1 min
8 min
Temperatur
94°C
94°C
je nach Konstrukt:
K23mut: 65°C K1mut: 55°C
72°C
Verdau des parentalen Plasmids
Das Plasmid, welches als Templat für die Amplifikation der mutierten DNA gedient hat, muss
nun vor der Transformation aus dem Ansatz entfernt werden. Da die parentale DNA in der
supercoiled Form vorliegt und somit bevorzugt von den kompetenten Zellen aufgenommen
wird, würde ein hoher „Background“ an Kolonien auftreten, deren Plasmid die gewünschte
Muation nicht trägt.
Beim Verdau wird der Umstand ausgenützt, dass das vorgängig aus E. coli isolierte TemplatPlasmid methyliert ist, die neu amplifizierte DNA hingegen nicht. Da DpnI ausschliesslich
methylierte DNA schneidet, bleibt nur das mutierte Produkt in der Lösung zurück.
Reagens
PCR-Ansatz
DpnI
Totalvolumen
Volumen
40 µl
1 µl
41 µl
Der Reaktionsansatz wird vorsichtig gemischt und während 1 h bei 37°C inkubiert. Danach
wird mittels Agarose-Gelelektrophorese das Vorhandensein von amplifizierter, nicht
methylierter DNA in der richtigen Grösse kontrolliert. 1 µl des Ansatzes wird anschliessend
bei der Transformation eingesetzt, der Rest kann bei –20°C gelagert werden.
56
3.1.2.3 DNA-Restriktionsverdau mit Enzymen
3.1.2.3.1 Linearisierung von Plasmiden
Reagens
Plasmid aus Miniprep (ca. 150 ng/µl)
Enzympuffer (10x)
Enzym (10 U)
H2O
Totalvolumen
Volumen
8.5 µl
1 µl
0.25-0.5 µl
ad 10 µl
10 µl
Der Ansatz wird vorsichtig gemischt und während 45 min bei 37°C inkubiert. Das Plasmid
kann sofort anschliessend dephosphoryliert werden.
3.1.2.3.2 Restriktionsanalyse von Plasmiden
Bei der Restriktionsanalyse werden meistens zwei Enzyme eingesetzt. Deshalb muss ein
Reaktionspuffer verwendet werden, in dem beide Enzyme ausreichende Aktivität (50-75%)
zeigen. Ist dies in keinem der beiden Enzympuffer möglich, wird „Multi Core Reaction
Buffer“ verwendet.
Reagens
Volumen
Plasmid aus Miniprep (ca. 150 ng/µl)
8 µl
Enzympuffer (10x)
1 µl
Enzym 1 (10 U)
0.25-0.5 µl
Enzym 2 (10 U)
0.25-0.5 µl
H2O
ad 10 µl
Totalvolumen
10 µl
Der Ansatz wird vorsichtig gemischt und während 1 h bei 37°C (55°C für BstX I) inkubiert.
Nach Zugabe von 2 µl 6x DNA-Ladepuffer kann die DNA mittels Gelelektrophorese
aufgetrennt werden.
3.1.2.3.2 Verdau von PCR-Produkten
Da PCR-Produkte meist hochkonzentriert sind und damit viele zu verdauende Enden
aufweisen, muss dementsprechend länger und mit einer höheren Enzymkonzentration verdaut
werden.
57
Reagens
PCR-Produkt (ca. 300-500 ng/µl)
Enzympuffer (10x)
Enzym (10 U)
H2O
Totalvolumen
Volumen
8.5 µl
1 µl
0.25-0.5 µl
ad 10 µl
10 µl
Der Ansatz wird vorsichtig gemischt und während 3 h bei 37°C inkubiert. Nach 1.5 h werden
erneut 10 U (0.25-0.5 µl) Enzym zugegeben. Nach Zugabe von 2 µl 6x DNA-Ladepuffer kann
die DNA mittels Gelelektrophorese gereinigt werden.
3.1.2.4 Dephosphorylierung von Plasmiden
Vor der Ligation muss das linearisierte Plasmid noch dephosphoryliert werden. Dies
verringert nach der Transformation die Anzahl der auf der Agarplatte gebildeten Kolonien,
die auf Selbstligation des Plasmids zurückzuführen sind.
Die Dephosphorylierung kann gleich im Anschluss an die Linearisierung durchgeführt
werden; die entsprechenden Enzyme und Puffer sind kompatibel. Die verwendete Shrimp
Alkaline Phosphatase (SAP) hat den Vorteil, dass sie im Gegensatz zu Calf Intestinal
Phosphatase (CIP) durch die Inkubation bei 65°C vollständig inaktiviert werden kann.
Reagens
Volumen
Linearisierungsansatz
H20
SAP-Puffer (10x)
SAP
Totalvolumen
10 µl
7 µl
2 µl
1 µl
20 µl
Der Ansatz wird vorsichtig gemischt, während 15 min bei 37°C inkubiert und danach
während 15 min bei 65 °C inaktiviert. Nach Zugabe von 4 µl 6x DNA-Ladepuffer kann die
DNA mittels Gelelektrophorese gereinigt werden.
3.1.2.5 Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine gute Methode zur Trennung, Identifizierung und
Reinigung von zirkulärer und linearer DNA. Der Trennbereich kann dabei durch Variieren der
Agarose-Konzentration eingestellt werden.
58
Konzentration
Verwendung
0.7 % Agarosegel
Kontrolle der Plasmidisolation
1.0 % Agarosegel
Restriktionsanalyse von Plasmiden, Reinigung des
Dephosphorylierungsansatzes
2.0 % Agarosegel
Analyse der PCR-Reaktion, Reinigung des Verdauansatzes von
PCR-Produkten
Die gewünschte Menge Agarose wird eingewogen und mit 70 ml 1x TAE-Puffer in der
Mikrowelle erwärmt, bis die Lösung klar ist. Nach Abkühlen auf ca. 60°C werden 7 µl
Ethidiumbromid (Endkonzentration: 1 µg/ml) zugegeben und das Gel in die ElektrophoreseKammer gegossen. Sobald das Gel erstarrt ist, kann die DNA aufgetrennt werden.
Laufpuffer 1xTAE
Stromstärke 120 mA
Dauer
ca. 30-40 min
Die DNA kann danach unter UV-Licht visualisiert werden.
3.1.2.6 Isolation von DNA aus Agarose-Gelen
Falls gewünscht, können aus dem Agarosegel Banden ausgeschnitten und die darin enthaltene
DNA mittels „MinElute Gel Extraction Kit“ extrahiert werden. Die Extraktion wird nach
Vorschrift durchgeführt (MinElute Handbook, April 2001, Seite 16) und die DNA mit 10 µl
EB-Puffer (im Kit enthalten) eluiert. Sie kann danach bis zur weiteren Verwendung bei –20°C
gelagert werden.
3.1.2.7 Ligation
Die Ligation von glatten (engl. blunt ends) wie auch von überhängenden (engl. sticky ends)
wird von der T4 DNA-Ligase katalysiert. Dieses Enzym erzeugt eine Phosphodiesterbindung
zwischen der 3`-Hydroxylgruppe des einen und der 5`-Phosphatgruppe des anderen DNAStranges. Die Ligase benötigt dazu ATP, das im Ligasepuffer gelöst vorliegt.
3.1.2.7.1 Ligation in pQE-8
Durch die Restriktion mit BamH I besitzen nun sowohl das Plasmid pQE-8 als auch das PCRProdukt überhängende Enden. Werden Plasmid und Insert zusammen mit T4 DNA Ligase
inkubiert, kann durch Verbinden der kompatiblen Endstücke ein zirkuläres Molekül
entstehen.
59
Reagens
Verdautes PCR-Produkt (1 µg)
Steriles Wasser
pQE-8 linearisiert/dephosphoryliert (0.25 µg)
T4 DNA Ligase-Puffer (10x)
T4 DNA Ligase (1.5 U)
Totalvolumen
Volumen
Ligationsansatz
0.5 – 5 µl
ad 5 µl
2.5 µl
0.88 µl
0.5 µl
8.88 µl
Kontrolle
0.5 – 5 µl
ad 7.5 µl
0.88 µl
0.5 µl
8. 88 µl
Die beiden Ansätze werden vorsichtig gemischt und während 3 h bei RT oder über Nacht bei
16°C inkubiert. Danach ist die DNA bereit zur Transformation; dabei wird jeweils der ganze
Ansatz verwendet.
3.1.2.7.2 Ligation in pET100/D-TOPO®
Mit dem pET Directional TOPO® Cloning System können PCR-Produkte ohne vorgängige
Restriktion in kurzer Zeit gerichtet in den pET100/D-TOPO®-Vektor ligiert werden. Dabei
wird die Eigenschaft von Topoisomerase I (ein Enzym aus dem Vaccinia-Virus),
doppelsträngige DNA an bestimmten Stellen nur in einem Strang zu öffnen und dabei selber
an das 3`-Phosphat des gespaltenen Strangs zu binden, ausgenützt. Diese Bindung zwischen
Enzym und DNA ist reversibel und kann durch die 5`-Hydroxylgruppe des freigesetzten
DNA-Strangs angegriffen werden. Der doppelsträngige Zustand der DNA wird dabei
wiederhergestellt und die Topoisomerase freigesetzt.
Um den Insert in der gewünschten Orientierung in den Vektor einfügen zu können, wurde
pET100/D-TOPO® am 5`-Ende des antisense-Strangs mit dem Überhang GTGG versehen.
Das PCR-Produkt muss am 5`-Ende des sense-Strangs zwingend mit CACC beginnen; diese
vier Basen sind komplementär zum Vektorüberhang. Bei der Ligationsreaktion verdrängt der
Überhang den antisense-Strang des 5´-Endes des Inserts und bindet an CACC. Das PCRProdukt wird so in der gewünschten Richtung im Vektor stabilisiert. Nach der Transformation
werden die verdrängten Basen durch die E. coli-Zelle entfernt und der Einzelstrangbruch
geschlossen.
Vektor, Salt Solution und steriles Wasser sind im Kit enthalten.
Reagens
Volumen
Gereinigtes PCR-Produkt
Salt Solution
Steriles Wasser
pET100/D-TOPO®-Vektor
Totalvolumen
0.5 – 4 µl
1 µl
ad 5 µl
1 µl
6 µl
Der Ansatz wird vorsichtig gemischt, während 15 min bei RT inkubiert und dann in Eis
transferiert. Die ligierte DNA ist nun bereit zu Transformation in One Shot® TOP10 E. coliZellen. Dafür werden 3 µl des Ligationsansatzes verwendet.
60
3.1.2.7.3 Ligation mit dem „Perfectly Blunt Cloning Kit“
Bei dieser Ligation handelt es sich um das Herstellen einer Bindung zwischen zwei DNAFragmenten (Insert und Vektor) mit glatten Enden. Das PCR-Produkt muss deshalb nicht mit
Restriktionsenzymen vorbehandelt werden.
Im Kit sind der “End Conversion Mix”, die T4 DNA-Ligase und das mit EcoR V linearisierte,
dephosphorylierte Plasmid pETBlue™-1 enthalten sowie Kontrollinsert und Kontrollplasmid
zur Überprüfung von Ligation und Transformation.
Phosphorylierung des PCR-Produkts
Phosphorylierte 5`-Enden sind eine Voraussetzung für die erfolgreiche „blunt end“-Ligation
in einen Vektor. Da ungeschnittene PCR-Produkte aber keine entsprechende
Phosphorylierung aufweisen, muss durch die T4-Polynukleotid-Kinase zuerst eine
Phosphatgruppe angehängt werden. Ausserdem müssen überhängende Enden des Inserts
aufgefüllt werden, da diese die Effizienz der Phosphorylierung und damit auch diejenige der
Ligation deutlich herabsetzen würde. Dies wird durch Inkubation des PCR-Produkts mit dem
Klenow-Fragment (Fragment der DNA-Polymerase I) erreicht. Sowohl T4-PolynukleotidKinase als auch Klenow-Fragment sind im „End Conversion Mix“ enthalten.
Vom PCR-Produkt werden ca. 50 nmol eingesetzt; dies entspricht 16.5 ng eines 500 bpFragments.
Reagens
Volumen
Gereinigtes PCR-Produkt (50 nmol)
Steriles Wasser
End Conversion Mix (Novagen)
Totalvolumen
0.5 – 2 µl
ad 5 µl
5 µl
10 µl
Der Ansatz wird vorsichtig gemischt, während 15 min bei 37°C inkubiert. Danach wird er
während 5 min bei 75°C erhitzt, um die im End Conversion Mix enthaltenen Enzyme zu
inaktivieren. Anschliessend wird der Phosphorylierungsansatz auf Eis abgekühlt.
Ligation in pETBlue™-1
Reagens
Phosphorylierungsansatz
pETBlue™-1 (50 ng/µl)
T4 DNA-Ligase ( 4 U/µl)
Totalvolumen
Volumen
10 µl
1 µl
5 µl
12 µl
Der abgekühlte Ligationsansatz wird vorsichtig gemischt und dann während 15 min bei 22°C
inkubiert. Die DNA ist jetzt bereit zur Transformation; dafür können bis zu 5 µl eingesetzt
werden.
61
3.1.2.8 Transformation von E. coli
3.1.2.8.1 Herstellung kompetenter Zellen
50 ml LB-Medium werden mit 0.5 ml einer 16 h-Starterkultur inokuliert. Die Zellen werden
bis zu einer OD600 wachsen gelassen, was je nach Zellstamm 2-4 h dauert. Die Kultur wird
zentrifugiert (10 min, 2000 rpm, 4°C) und das Pellet in 25 ml eiskaltes 50 mM CaCl2
aufgenommen. Nach 20 min Lagerung auf Eis und erneuter Zentrifugation (10 min, 200 rpm,
4°C) wird das Pellet in 4 ml eiskaltes 50 mM CaCl2 aufgenommen. Nach einer 30-minütigen
Ruhephase auf Eis werden die nun kompetenten Zellen in 200 µl-Aliquots aufgeteilt. Sie
können nun je nach Bedarf sofort transformiert oder mit Flüssigstickstoff schockgefroren und
bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert werden.
3.1.2.8.2 Transformation kompetenter Zellen
Ein 200 µl-Aliquot CaCl2-kompetente Zellen (frisch hergestellt oder auf Eis aufgetaut) wird
mit DNA aus einem Ligationsansatz oder mit 1 µl „supercoiled“ Plasmid versetzt und
vorsichtig gemischt. Der Transformationsansatz wird während 30 min auf Eis gelagert und
dann während 45 sec bei 42°C erwärmt („Hitzeschock“). Die Zellen werden sofort wieder ins
Eis transferiert und fünf Minuten ruhen gelassen. Danach werden 800 µl LB-Medium
zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37°C/220 rpm wird der Ansatz
zentrifugiert (2 min, 4000 rpm, RT), 800 µl vom Überstand entfernt und das Zellpellet mit
dem Rest des Überstands auf eine Agarplatte mit den entsprechenden Antibiotika
ausgestrichen. Die Platte wird über Nacht bei 37°C inkubiert.
3.1.2.8.3 Transformation kommerziell erhältlicher kompetenter Zellen
Ein Aliquot gekaufte chemisch-kompetente Zellen (20 µl für Rosetta2(DE3)pLacI und
Tuner(DE3)pLacI, 50 µl für One Shot® TOP10 und BL21 Star™(DE3)) wird auf Eis aufgetaut.
1 µl „supercoiled“ Plasmid oder DNA aus einem Ligationsansatz wird zugegeben und
vorsichtig mit den Zellen gemischt. Der Ansatz wird während 30 min in Eis ruhen gelassen,
dann während 45 sec bei 42°C inkubiert und sofort wieder ins Eis transferiert. Dort wird er
während 5 min auf Eis gelagert. Danach werden 200 µl LB-Medium zugegeben und die
transformierten Zellen während einer Stunde bei 37°C/220 rpm wachsen gelassen. 50 µl des
Ansatzes werden dann auf Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika ausgestrichen und
die Platte über Nacht bei 37°C inkubiert.
3.1.2.9 DNA-Sequenzierung
Um die Konstrukt-DNA auf unerwünschte Mutationen, Insertionen oder Deletionen zu
überprüfen, muss das Plasmid in der Insert-Region sequenziert werden. Die Sequenzanalysen
wurden jeweils durch die Firma Microsynth (Balgach, SG) durchgeführt.
Aus einer Starterkultur wird mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit das Plasmid isoliert. Die
DNA-Konzentration wird mit dem Microphotometer (1 OD260 = 50 µg doppelsträngige DNA)
62
bestimmt und wenn notwendig mit H2O auf 100 ng/µl eingestellt. Ein 20 µl-Aliquot wird
dann zum Sequenzieren an Microsynth gesandt.
3.1.2.10 Expression in E. coli
Nach erfolgreichem Klonieren wird das Konstrukt mittels einer Probeexpression kontrolliert
und dann, je nach Verwendungszweck, in 6 l LB-Medium oder 15N-M9-Minimalmedium
exprimiert.
Dem Medium müssen die entsprechenden Antibiotika zugegeben werden; im Fall von
Konstrukten in pETBlue-1 wird das LB-Medium noch mit 1 % Glukose ergänzt, wodurch die
Basalexpression minimiert wird; dies verhindert, dass potentiell toxische Konstrukte schon
vor der Induktion exprimiert werden.
3.1.2.10.1 Starterkultur (5 ml) und Herstellung von Stammkulturen
Von einer frisch ausgestrichenen Agarplatte wird eine einzelne Kolonie gepickt und 5 ml LBMedium damit angeimpft. Die Kultur wird je nach Bedarf während 8 - 16 h bei 37°C/220 rpm
inkubiert.
Für die Herstellung einer Stammkultur wurden 850 µl einer Starterkultur mit 150 µl Glyzerin
vermischt und während 8 h in Eis gelagert. Danach kann die Stammkultur bei –80°C
aufbewahrt werden. Bei Bedarf wird eine Öse dieser Stammkultur auf einer Agarplatte mit
den entsprechenden Antibiotika ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
3.1.2.10.2 Testexpression LB (100 ml)
100 ml LB-Medium werden mit 2 ml einer Starterkultur angeimpft und bei 37°C/220 rpm
inkubiert, bis die OD600 0.6-1.0 (je nach Zellstamm) beträgt. Nun wird eine 10 ml-Probe
entnommen. Die Kultur wird mit IPTG (Endkonzentration 2 mM) induziert und während
weiteren 3 h bei 37°C/220 rpm inkubiert. Nach jeweils einer Stunde wird zur Überprüfung der
Proteinexpression eine 10 ml-Probe entnommen. Alle Proben werden gleichzeitig mit 50 ml
der verbleibenden induzierten Kultur zentrifugiert (10 min, 5000 rpm, 4°C). Die Pellets
werden bis zur Weiterverwendung bei –80°C gelagert.
Als Alternative kann die Kultur vor der Induktion in zwei 50 ml-Ansätze gesplittet werden.
Nur eine Hälfte der Zellen wird mit IPTG induziert; nach einer Inkubationszeit von 3 h wird
von beiden Kulturen eine 10 ml-Probe entnommen und wie oben zentrifugiert und gelagert.
3.1.2.10.3 Grossansatz LB (6 l)
300 ml LB-Medium werden mit einer Starterkultur inokuliert und über Nacht bei 37°C/220
rpm inkubiert. 6x 1 l LB-Medium werden mit je 30 ml der Übernachkultur angeimpft und bei
37°C/220 rpm wachsen gelassen, bis die OD600 0.6-1.0 (je nach Zellstamm) beträgt. Nach der
Induktion mit 477 mg IPTG (Endkonzentration 2 mM) wurden die Zellen weitere 5 h bei
37°C/220 rpm inkubiert. Danach werden die Kulturen zentrifugiert (Sorvall RC3B plus, 5000
rpm, 30 min, 4°C), die Pellets gewogen und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C
gelagert.
63
3.2 Proteinchemie E. coli
3.2.1 Material
3.2.1.1 Antikörper
Antikörper
Beschreibung
Lieferant
Sheep anti-HPg
HRP-gekoppelt
polyklonaler Antikörper; 5 mg/ml
Anawa
Kit
Anwendung
Lieferant
Ni-NTA Spin Kit
Isolation von Proteinen mit 6xHis-Tag
aus Kulturen bis 50 ml (∼ 0.15 mg/Säule)
Qiagen
ECL plus™ Western
Blotting Detection Kit
enthält ECL plus A- und B-Lösung; basiert
auf Lumigen™ PS-3 Technologie; Gebrauchslösung: A+B im Verhältnis 1:40 (ca. 2.5 ml
pro Blot)
Amersham
3.2.1.2 Kits
3.2.1.3 Marker
Marker
Banden
Lieferant
Precision Plus Protein™
Standard, Dual Color
10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa,
37 kDa, 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa,
150 kDa, 250 kDa;
Banden 25 kDa und 75 kDa:pink
gefärbt; Bande 50 kDa: 3x so intensiv wie die anderen Proteinbanden
Bio-Rad Laboratories, Inc.
MagicMark™ Western
Protein Standard
20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa,
60 kDa, 80 kDa, 100 kDa, 120 kDa;
Proteine enthalten eine IgG-Bindungsstelle und können durch einen
AP-/ HRP-gekoppelten Antikörper
mit chromogenen, chemilumineszenten und fluoreszierenden
Substraten visualisiert werden
Invitrogen
64
3.2.1.4 Reagenzien, Lösungen, Puffer
Beschreibung
Lieferant
Acetonitril
LiChrosolv
Merck
Ameisensäure
98-100%, p.a.
Merck
6-AHA
zur Synthese
Merck
AS-EDTA-Lösung
7 mM EDTA
Merck
AS-HCl-Lösung
6 M HCl + 0.1% Phenol
Romil, Merck
AS-Puffer A
40% MeOH, 20% TEA
Merck, Pierce
AS-Puffer B
77% MeOH, 11% TEA,
1% PITC
Merck, Pierce, Fluka
AS-RP-HPLCLaufmittel A
4% Acetonitril, 0.14 M AmmoniumAcetat, 13 µM DTT, 575 ppm TEA ;
pH 6.4
Merck, Fluka, Fluka,
Pierce
AS-RP-HPLCLaufmittel B
60% Acetonitril
Merck
Complete EDTA-free
Proteaseninhibitoren (Tabletten)
Roche
Coomassie-Färbelösung
1x Coomassie R-250 Staining
Solution
Bio-Rad Laboratories,
Inc.
CoomassieEntfärbelösung
50% MeOH, 10% Eisessig
Merck, Merck
DTT
1,4- Dithio-DL-threitol; ≥ 99% (RT)
Fluka
Glutathion
oxidiert: approx. 98%
reduziert: Minimum 99%
Sigma
GuHCl-Lysepuffer
6 M GuHCl, 0.1 M NaH2PO4,
10 mM Tris ; pH 8.0, 6.3, 5.9, 4.5
Fluka,Merck, Sigma
Harnstoff-Lysepuffer
8 M Harnstoff, 50 mM NaH2PO4;
pH 8.0, 6.3, 5.9, 4.5
Fluka, Merck
Imidazolpuffer
20 mM Tris, 0.3 M NaCl, 0.5 M
Imidazol; pH 8.5
Sigma, Merck
Fluka
Lys-Bio-Gel
Bio-Gel® P-300 mit daran gekoppeltem Lysin
Bio-Rad, Merck
2-Mercaptoethanol
Bio-Rad
NapSure Blocking Buffer
Geno Technology Inc.
NuPAGE® Transfer
Buffer
20x: 25 mM Bicin, 25 mM Bis-Tris
(freie Base), 1mM EDTA; pH 7.2
Invitrogen
Nativpuffer
20 mM Tris, 0.3M NaCl, 5 mM
Imidazol ; pH 8.5
Sigma, Merck
Fluka
65
Beschreibung
Lieferant
NuPAGE® MOPS SDS
Running Buffer
20x: 1 M MOPS, 1 M Tris,
2 % SDS, 20.5 mM EDTA; pH 7.7
Invitrogen
NuPAGE® MES SDS
Running Buffer
20x: 1 M MES, 50mM Tris,
2 % SDS, 20.5 mM EDTA; pH 7.3
Invitrogen
NaCl
p.a.
Fluka
Natriumazid
reinst
Merck
Natriumphosphatpuffer
50 mM Na2PO4; pH 8.0
Merck
Nickel(II)sulfat
Hexahydrat
p.a.
Merck
PBS
10 mM Phosphate Buffered Saline
(Dulbecco A); 138 mM NaCl,
2.7 mM KCl ; pH 7.3 (approx.) ;
Tabletten, 1/100 ml H2O
Oxoid
PBST
10 mM Phosphate Buffered Saline +
Tween®-20; 138 mM NaCl, 2.7 mM
KCl, 0.05% Tween®-20; pH 7.4;
Sachets, 1/1000 ml H2O
Sigma
PITC
Fluka
Ponceau S
10x: 2% Ponceau S, 30% TCA,
30% Sulfosalicylsäure
Sigma
Regenerationspuffer
6 M GuHCl, 0.2 M Essigsäure
Fluka, Merck
RP-HPLC-Laufmittel A
0.1% TFA
Fluka
RP-HPLC Laufmittel B
0.1% TFA, 80% Acetonitril
Fluka, Merck
SDS
> 98% (GC)
Fluka
Tris-Glycine SDS Sample
Buffer (2x)
63 mM Tris-HCl, 10 % Glycerol,
2% SDS, 0.0025% Bromphenolblau;
pH 6.8
Invitrogen
Tris-GuHCl-Lysepuffer
6 M GuHCl, 50 mM Tris; pH 8.0
Fluka, Sigma
Tris-Puffer
50 mM Tris; pH 8.0
Sigma
3.2.1.5 Weiteres Zubehör
Zubehör
Beschreibung
PVDF-Membran Invitrolon PVDF Filter Paper
Sandwich 0.45 µm Porengrösse
SDS-PAGE-Gel
NuPAGE® Novex 10% Bis Tris Gel
1,0 mm 10 well/15 well
Lieferant
Invitrogen
Invitrogen
66
Zubehör
Beschreibung
Lieferant
AutoradiografieFilm
Hyperfilm™ ECL
Amersham
3.2.1.6 Geräte
Gerät
Beschreibung
Lieferant
AS-RP-HPLC-System
Summit® HPLC System
Nova-Pak-Säule C18, 60 A,
3.9 x 150 mm
Software: Chromeleon® 6.50
Dionex
ChromatografierSystem
Äkta™ prime
HiTrap™ Chelating HP Säule 5 ml
HiPrep™ 26/10 Desalting Säule
Amersham
ESI-MS
VG-Plattform
Single Quadrupol Mass Spectrometer
Software: MassLynx™ 3.2
Micromass
Centrifuge 5417c
Vaudaux-Eppendorf
Film-Entwickler
FPM-100A
Fuji
Fluoreszenzspektrometer
LS 50 B
Software: FLWINLAB
Küvette: Quarz, Fassungsvermögen
1 ml, Weglänge 1 cm
Perkin Elmer
Fraktionier-System
GradiFrac
LKB pump P-1
LKB optical unit UV-1
Amersham
PAGE/Blot-System
XCell SureLock™ Mini Cell und
XCell II™ Blot Module Kit
Invitrogen
PAGE/BlotStromquelle
Power Ease™ 500 Power Supply
Invitrogen
RP-HPLC-System
HP 1090
Aquapore Butyl-Säule: 7 µm,
2.1 x 100 mm
Agilent Technologies
Scanner
FLA-3000
Fuji
Sequenator
Procise™ 492 cLC
PTH-Säule: 5 µm, 0.8 x 250 mm
Software: Procise™ 1.1
Applied Biosystems
Sorvall-Zentrifuge
RC5Bplus
Heraeus
67
Gerät
Beschreibung
Lieferant
Speed Vac
Concentrators
VAP 5
Faust
Savant
3.2.2 Methoden
3.2.2.1 Zellaufschluss
3.2.2.1.1 Denaturierender Zellaufschluss von Proben aus Testexpression für SDS-PAGE
Die Pellets der bei der Testexpression (2.1.2.10.2) entnommenen 10 ml-Proben werden in 500
µl eiskalte Tris-Puffer aufgenommen und zentrifugiert (Eppendorf-Zentrifuge, 30 sec, 13000
rpm, RT). Die Pellets werden in 97.5 µl 1xTris Glycine SDS Sample Buffer und 2.5 µl 2Mercaptoethanol resuspendiert. Die Proben werden danach 5 min bei 95°C gekocht, 2 min im
Ultraschallbad inkubiert und zentrifugiert (Eppendorf-Zentrifuge, 10 min, 13000 rpm, RT).
Die Überstände werden in frische Eppendorf-Röhrchen transferiert und können bis zur
weiteren Verwendung beim SDS-PAGE (2.2.2.2.1) bei –20°C gelagert werden.
3.2.2.1.2 Denaturierender Zellaufschluss von Proben aus Testexpression für
Proteinisolation mit Ni-NTA Spin Kit
Das Zellpellet aus 50 ml der induzierten Testexpression wird während 15 min aufgetaut und
in 1 ml GuHCl-Lysepuffer pH 8.0 aufgenommen. Die Zellsuspension wird in ein EppendorfRöhrchen transferiert und während 1 h lysiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (EppendorfZentrifuge, 30 min, 13000 rpm, RT) kann der Überstand für die Proteinisolation mit dem NiNTA Spin Kit (2.2.2.4.1) weiterverwendet werden.
3.2.2.1.3 Denaturierender Zellaufschluss von Grossansätzen
a) Zellaufschluss für Proteinisolation über Ni-NTA-Säulen
Die gewünschte Anzahl Pellets eines 6 l-Grossansatzes werden während 5 min aufgetaut. Pro
Gramm nasses Pellet werden 5 ml GuHCL-Lysepuffer pH 8.0 zugegeben und die Zellen über
Nacht bei 4°C lysiert. Das Lysat wird zentrifugiert (Sorvall RC5B plus, GSA-Rotor, 30 min,
10000 rpm, 4°C) und der Überstand bei der Proteinisolation über Ni-NTA-Säulen (2.2.2.4.2a)
weiterverwendet.
b) Zellaufschluss für Proteinrückfaltung im Total-Lysat
Die gewünschte Anzahl Pellets eines 6 l-Grossansatzes werden während 15 min aufgetaut.
Pro Gramm nasses Pellet werden 5 ml GuTris-Lysepuffer pH 8.0 zugegeben und kurz gerührt;
danach wird der pH auf 8.0 justiert. Nach Zugabe von DTT (Endkonzentration 5 mM) werden
68
die Zellen während 2 h bei RT lysiert. Das Lysat wird zentrifugiert (Sorvall RC5B plus, GSARotor, 30 min, 10000 rpm, 4°C) und der Überstand bei der Proteinrückfaltung im Lysat
(2.2.2.5.2) weiterverwendet.
3.2.2.2 Western Blot
3.2.2.2.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
SDS-PAGE ist eine Methode, bei der die Proteine in einem elektrischen Feld nach ihrer
Grösse aufgetrennt werden. Durch Variieren der Acrylamid-Konzentration kann das
Trennvermögen des Gels beeinflusst werden. Die Eigenladung der Proteine muss neutralisiert
werden, damit die Wandergeschwindigkeit des Moleküls bei der einzig von der Grösse
abhängt. SDS ist ein starkes, anionisches Detergens, welches an die Proteine bindet (1.4 g
SDS/g Protein). Dies bewirkt, dass die aufzutrennenden Moleküle ein konstantes Ladungs-/
Grössenverhältnis aufweisen. Die negativ geladenen Proteine wandern zu Anode und werden
dabei durch das Gel aufgetrennt.
Die SDS-PAGE wird mit der XCell SureLock™ Mini Cell durchgeführt.
Für die Gelelektrophorese werden NuPAGE® Novex 10% Bis Tris Gele von Invitrogen
verwendet. Diese werden aus der Plastikhülle gelöst und mit H2O gespült. Der Kamm wird
vorsichtig aus dem Gel entfernt und die Geltaschen mit 1x NuPAGE® MOPS SDS Running
Buffer gespült. Der untere Abdeckstreifen wird entfernt und das Gel in die ElektrophoreseApparatur eingesetzt. Sowohl die innere wie auch die äussere Pufferkammer wird mit 1x
NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer gefüllt. In die Taschen werden nun die vorbereiteten
Proben (2.2.2.1.1) und die Standards eingefüllt.
10 Well Gel: bis zu 30 µl Probe
4 µl Precision Plus Protein Standard, Dual Color
2 µl MagicMark™ Western Protein Standard
Das Gel wird bei einer Spannung von 200 V während 50 min entwickelt. Die Gelkassette
wird aufgebrochen und die obere Kassettenplatte entfernt, während das Gel auf der unteren
Platte bleibt. Nach Entfernen des Sammelgels und der Lippe am unteren Ende kann das
Trenngel für das Blotting (2.2.2.2.2) weiterverwendet werden.
Statt MOPS SDS Running Buffer wird für Proteine ≤ 15 kDa 1x MES SDS Running Buffer
verwendet, da so eine bessere Auflösung im unteren Massenbereich erreicht werden kann.
3.2.2.2.2 Blotting
Beim Blotten werden die bei der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine elektrophoretisch auf
eine Nitrozellulose- oder PVDF-Membran übertragen. In diesem Fall wurden PVDFMembranen verwendet, da sie stabiler sind und sich bei der nachfolgenden Analyse mittels
69
immunologischem Nachweis mit dem gewählen Detektionsystem nur wenig störende
Hintergrund-Signale manifestieren. Geblottete Proteine können durch Färbung und/oder
Behandlung mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen oder ausgeschnitten und sequenziert
werden.
Für das Blotting wird das XCell SureLock™ Mini Cell und XCell II™ Blot Module Kit
verwendet.
Die PVDF-Membran wird zuerst während 15 sec in Methanol, während 2 min in H2O und
während 5 min in 1x NuPAGE® Transfer Puffer eingelegt. Die Blotting Pads und die
Filterpapiere werden ebenfalls mit 1x NuPAGE® Transfer Puffer befeuchtet. Die BlottingApparatur wird dann wie folgt zusammengebaut:
+Polplatte
Blotting Pads
Filterpapier
PVDF-Membran
Gel
Filterpapier
Blotting Pads
-Polplatte
Bild 3.2: Aufbau des Transfer-Systems beim Blotting
Die beiden Polplatten werden bis zum Anschlag zusammengepresst und das „Blot-Sandwich“
in die Apparatur eingespannt. Zwischen den beiden Polplatten wird bis zur Pad-Obergrenze
1x NuPAGE® Transfer Puffer zugegeben und auf der Aussenseite der Apparatur H2O zur
Kühlung eingefüllt. Bei einer Spannung von 30 V wird während 1 h 15 min geblottet. Die
Membran wird danach während einiger Minuten mit H2O gewaschen. Der Blot kann nun für
die Proteindetektion (2.2.2.3) weiterverwendet werden.
3.2.2.3 Proteindetektion
3.2.2.3.1 Coomassie-Färbung
Diese Färbung ist irreversibel und deshalb nicht geeignet, wenn die Membran später noch
mittels Western Blot analysiert werden soll. Sie ist aber kompatibel mit der Sequenzanalyse
nach Edman, so dass Banden aus der mit Coomassie gefärbten Membran ausgeschnitten und
sequenziert werden können
Die PVDF-Membran wird während 3 min in Coomassie-Färbelösung inkubiert.
Anschliessend wird der Blot mit H2O gewaschen und mit Coomassie-Entfärbelösung entfärbt,
bis der Hintergrund wieder weiss erscheint. Die Membran kann nun getrocknet und analysiert
werden.
70
3.2.2.3.2 Ponceau S-Färbung
Die Ponceau S-Färbung ist reversibel und deshalb zur Kontrolle des Proteintransfers auf die
Membran vor dem Western Blotting geeignet. Sie ist allerdings nicht so empfindlich wie die
Coomassie-Färbung; ausserdem verblassen die Banden bei längerer Exposition im Licht.
Die PVDF-Membran wird während 5 min in Ponceau S-Lösung inkubiert. Danach wird der
Blot mit H2O gewaschen, bis der Hintergrund wieder weiss erscheint. Die Membran kann nun
getrocknet und analysiert oder mit 3 mM NaOH-Lösung oder PBST entfärbt und beim
Western Blot weiterverwendet werden.
3.2.2.3.3 Immunologischer Nachweis
Mit dem immunologischen Nachweis können Proteine einer bestimmten Spezies oder sogar
einzelne Proteine nachgewiesen werden. Dabei werden Antikörper eingesetzt, die spezifisch
an das gesuchte Protein binden. Der verwendete Antikörper ist mit Horse Radish Peroxidase
gekoppelt, einem Enzym, welches zusammen mit Peroxid die Oxidation des in der ECL plusLösung enthaltenen Lumigen PS-3 Acridan-Substrats zum Acridiniumester katalysiert. Dieses
Intermediat reagiert mit Peroxid unter leicht alkalischen Bedingungen und emittiert durch
Chemilumineszenz Licht mit einem Emissionsmaximum bei 430 nm. Beim Licht
produzierenden Reaktionsweg entsteht ein fluoreszierendes Intermediat; diese
Chemifluoreszenz wird bei 430 nm angeregt und emittiert bei 503 nm. Die Signale können
durch Scannen mit dem FLA-3000 (Anregung bei 473 nm, Emissionsmessungen bei 520 und
580 nm) oder durch Exposition auf einem Autoradiografie-Film festgehalten detektiert
werden.
F
F
F
O
O
H
N
F
F
O
O
F
Peroxid + HRP
+
H
N
CH3
H
CH3
Acridiniumester
Puffer
Peroxid
O*
F
+
Licht
N
CH3
H
+
HO
CO2
F
F
angeregtes Produkt
Bild 3.3: Reaktionsmechanismus von ECL plus
Die PVDF-Membran wird über Nacht bei 4°C mit NapSure Blocking Buffer:PBST 1:1
geblockt. Danach wird der Blot während 1 h bei 4°C mit 2.5 ml NapSure Blocking
Buffer:PBST 1:1 + goat anti-HPg Antikörper (HRP-gekoppelt) 1:5000 inkubiert. Die
Membran wird 3x 1 min mit 15 ml PBST und 3x 10 min mit 20 ml PBST gewaschen. Nach
fünf Minuten Inkubation mit ECL Plus-Lösung (2.5 ml ECL Plus A + 62.5 µl ECL Plus B)
71
kann der Blot auf Autoradiografie-Film exponiert werden. Der Film wird im FPM-100AGerät entwickelt und kann anschliessend analysiert werden.
3.2.2.4 Proteinisolation durch Ni-NTA-Agarose-Affinitätschromatografie
Nitrilotriessigsäure (NTA) ist ein tetradentates chelatierendes Adsorbent. Es besetzt vier der
sechs Ligandenbindungsstellen in der Koordinationssphäre des Nickelions, wodurch zwei
Bindungsstellen für die Interaktion mit dem Hexahistidin-Tag eines rekombinanten Proteins
zur Verfügung stehen. NTA bindet Metallionen sehr stark, so dass bei der Proteinreinigung
stringente Waschkonditionen angewendet werden können. Die gebundenen Proteine können
entweder durch ein Absenken des Puffer-pH´s auf 4.5 – 5, wodurch Histidin protoniert wird,
oder durch Verdrängen des Histidins von den Nickel-Koordinationsstellen durch das
Strukturanalogon Imidazol eluiert werden.
NTA kann an verschiedene Matrices gekoppelt werden, so zum Beispiel Silikat (Ni-NTA
Spin Kit), Sepharose® CL-6B (Ni-NTA-Agarose) oder Chelating Sepharose® High
Performance (HiTrap™ Chelating HP Säule).
R
O
HN
O
CH
CH2
O
N
CH2
N
NH
Ni
O
2+
N
CH
NH
CH2
N
H2
C
N
CH2
CH
C
H2
H2
C
OH
C
H2
H
N
C
C H CH2
H2
O
O
O
O
O
R
Bild 3.4: Darstellung des Ni-NTA-Chelats
3.2.2.4.1 Proteinisolation mit dem Ni-NTA Spin Kit
Dieses Kit eignet sich für die Isolation von analytischen Mengen bis zu 150 µg. Dabei wird
nach Anleitung (Ni-NTA Spin Handbook, Seite 18, Februar 2003) vorgegangen.
Auf die zuvor mit GuHCl-Lysepuffer pH 8.0 konditionierte Ni-NTA Spin Säule werden 600
µl des vorbereiteten Lysats (2.2.2.1.2) gegeben. Nach dreimaligem Waschen mit GuHClLysepuffer pH 6.3 wird das gebundene Protein mit 2x150 µl GuHCl-Lysepuffer pH 4.5
eluiert. Das Protein kann nun durch RP-HPLC (2.2.2.7) gereinigt und danach durch ESI-MS
(2.2.2.10), Aminosäureanalyse (2.2.2.8) und Sequenzanalyse nach Edman (2.2.2.9)
Sollen die Proben für ein SDS-PAGE verwendet werden, werden die GuHCl-Lysepuffer pH
6.3 und 4.5 durch Harnstoff-Lysepuffer pH 6.3 und 4.5 ersetzt.
72
3.2.2.4.2 Proteinisolation mit Ni-NTA Säulen
a) Proteinisolation mit selbst gepackter Ni-NTA Agarose-Säule
Für die präparative Proteinisolation wird das GradiFrac-System und als Säulenmaterial NiNTA Agarose verwendet. Diese Methode eignet sich für die Reinigung von Proteinmengen
im Milligramm-Bereich. Pro Milliliter Matrix können ca. 5-10 mg Protein gebunden werden.
Zuerst werden pro lysiertem 1 l-E. coli-Pellet 2 ml Ni-NTA Agarose (50% Slurry) in eine
Kunststoffsäule (Höhe 10 cm, ∅ 1 cm) gegeben. Nach der Sedimentation des Säulenmaterials
wird die Säule mit GuHCl-Puffer pH 8.0 konditioniert und das vorbereitete Lysat (2.2.2.1.3a)
auf die Säule geladen. Die Flussrate beträgt während der gesamten Isolation 1ml/min. Die
Säule wird nacheinander mit GuHCl-Puffer pH 8.0, 6.3 und 5.9 gewaschen, bis die gemessene
Absorption bei 280 nm einen konstanten Wert annimmt. Das an die Ni-NTA Agarose
gebundene Protein wird mit GuHCl-Puffer pH 4.5 eluiert. Das gesammelte Eluat kann nun für
die Rückfaltung (2.2.2.5.1) weiterverwendet werden.
b) Proteinisolation mit ÄKTA prime System und HiTrap™ Chelating HP Säule
Das zurückgefaltete und lyophilisierte Protein (2.2.2.5.2) wird in möglichst wenig Nativpuffer
aufgenommen und anschliessend zentrifugiert (Sorvall RC5B plus, GSA-Rotor, 20 min,
10000 rpm, 4°C), um aggregiertes Protein aus der Lösung zu entfernen.
Eine HiTrap™ Chelating HP Säule wird mit Ni2+-Ionen belegt. Dazu dient folgendes
Programm auf dem Äkta prime System:
Volumen [ml]
0
10
35
50
75
100
125
130
155
185
195
200
210
250
Fluss [ml/min]
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
End
%B
0
0
0
0
100
100
0
0
0
0
0
0
0
End
Ventilposition
5
1
2
1
1
1
1
3
1
4
1
5
1
End
Laufmittel
Regenerationspuffer
H2O
2% SDS-Lösung
H2O-/Ethanol-Gradient
Ethanol
Ethanol-/H2O-Gradient
H2O
EDTA-Lösung
H2O
Nickel-Lösung
H2O
Regenerationspuffer
H2O
End
Die Säule wird anschliessend mit Nativ-Puffer konditioniert. Anschliessend wird die
Proteinlösung auf die Säule geladen, mit Nativpuffer gewaschen, bis die OD280 konstant
bleibt. Das Protein wird mit einem Imidazolpuffer-Gradienten von 0-100% in 20 min eluiert.
Die Säule wird mit Regenerationspuffer und anschliessend mit H2O gespült. Nach fünf
Proteinisolationen muss die Säule mit obenstehendem Programm neu belegt werden. Das
Eluat kann nun mittels Dialyse (48 h gegen 50 mM Tris, 4x Pufferwechsel) entsalzt und
danach lyophilisiert werden. Das Protein wird durch chromatografische Auftrennung auf einer
73
G75 sf-Säule (2.2.2.7) oder Affinitätschromatografie mit Lys-Bio-Gel (2.2.2.6) weiter
aufgereinigt. Dazu wird das Lyophilisat in möglichst wenig 0.13 M Ameisensäure (G75 sfSäule) oder 50 mM Tris pH 8.0 (Lys-Bio-Gel) aufgenommen und zentrifugiert, um
aggregierte Proteine durch Pelletierung zu entfernen. Der Überstand kann zur weiteren
Reinigung weiterverwendet werden.
3.2.2.5 Protein-Rückfaltung
3.2.2.5.1 Rückfaltung nach Proteinisolation mit Ni-NTA-Affinitätschromatografie
Methode 1
Das Eluat aus der Proteinisolation mittels Ni-NTA Affinitätschromatografie (2.2.2.4.2) wird
auf pH 8.0 eingestellt und DTT zugegeben (Endkonzentration 5 mM). Danach wird die
Proteinlösung über Nacht bei 4°C gerührt, um alle Disulfidbrücken zu reduzieren.
Anschliessend werden dem Eluat während 4 h bei 4°C 4 Volumina 50 mM
Natriumphosphatpuffer pH 8.0 + 1.25 mM oxidiertes/reduziertes Gluthathion unter stetigem
Rühren zugetropft. Die Proteinlösung wird während 3 Tagen gegen 5 l 50 mM
Natriumphosphatpuffer pH 8.0 dialysiert, wobei alle 12 h der Dialysepuffer ausgetauscht
wird. Das Dialysat wird zur Entfernung des ausgefallenen Proteins zentrifugiert (Sorvall
RC5B plus, GSA-Rotor, 20 min, 10000 rpm, 4°C). Der Überstand wird lyophilisiert und
anschliessend durch ESI-MS (2.2.2.10), Aminosäureanalyse (2.2.2.8) und Sequenzanalyse
nach Edman (2.2.2.9) charakterisiert.
Methode 2
Das Eluat aus der Proteinisolation mittels Ni-NTA-Affinitätschromatografie (2.2.2.4.2) wird
auf pH 8.5 eingestellt und DTT zugegeben (Endkonzentration 5mM). Danach wird die
Proteinlösung über Nacht bei 4°C gerührt, um alle Disulfidbrücken zu reduzieren.
Anschliessend werden dem Eluat während 24 h 16 Volumina 100 mM Tris Acetat-Puffer pH
8.5 + 5 mM oxidiertes/reduziertes Glutathion unter stetigem Rühren zugetropft. Eventuell
vorhandenes präzipitiertes Protein wird durch Zentrifugation (Sorvall RC5B plus, GSA-Rotor,
30 min, 10000 rpm, 4°C) entfernt. Die Lösung wird danach gegen 5 l 100 mM Tris AcetatPuffer + 0.33 M GuHCl pH 8.5 dialysiert. Nach zwei Stunden werden in 20 min-Intervallen
jeweils 250 ml der Dialyselösung durch 100 mM Tris Acetat-Puffer pH 8.5 ersetzt (insgesamt
20 x). Anschliessend wird die gesamte Dialyselösung gegen 100 mM Tris Acetat-Puffer pH
8.5 ausgetauscht. Nach zwei weiteren Dialyseschritten mit 50 mM Tris Acetat-Puffer pH 8.5
wird das Protein lyophilisiert. Es kann dann wird durch chromatografische Auftrennung auf
einer G75 sf-Säule (2.2.2.7) oder Affinitätschromatografie mit Lys-Bio-Gel (2.2.2.6) weiter
aufgereinigt werden. Dazu wird das Lyophilisat in möglichst wenig 0.13 M Ameisensäure
(G75 sf-Säule) oder 50 mM Tris Acetat pH 8.0 (Lys-Bio-Gel) aufgenommen und
zentrifugiert, um aggregierte Proteine durch Pelletierung zu entfernen. Der Überstand kann
zur weiteren Reinigung weiterverwendet werden.
74
3.2.2.5.2 Rückfaltung im Lysat
Dem vorbereiteten Lysat (2.2.2.1.3b) werden während 4 h bei 4°C 4 Volumina 50 mM Tris
pH 8.0 + 1.25 mM oxidiertes/reduziertes Gluthathion unter stetigem Rühren zugetropft.
Danach wird die Proteinlösung während 12 h gegen 5 l 1M GuHCl + 50 mM Tris pH 8.0
dialysiert. Danach wird 1.5 l der Dialyselösung durch 1.5 l 50 mM Tris pH 8.0 ersetzt und 12
h weiterdialysiert. Dieser Vorgang wird noch zweimal wiederholt. Anschliessend wird die
gesamte Dialyselösung gegen 50 mM Tris pH 8.0 ausgetauscht und während 36 h
weiterdialysiert. Alle 12 h wird der Tris-Puffer ersetzt. Das Dialysat wird zur Abtrennung des
ausgefallenen Proteins zentrifugiert (Sorvall RC5B plus, GSA-Rotor, 20 min. 10000 rpm,
4°C) und entweder für die Affinitätschromatografie mit Lys-Bio-Gel (2.2.2.6)
weiterverwendet oder (bei Proteinen mit 6xHis-Tag) lyophilisiert und danach mit dem Äkta
prime System und HiTrap™ Chelating HP Säule gereinigt (2.2.2.4.2b).
3.2.2.6 Affinitätschromatografie mit Lys-Bio-Gel
Durch die Vermittlung der Lysinbindungsstellen der Kringel 1, 2, 4 und 5 hat Plasminogen
eine grosse Affinität zu ω-Aminosäuren, z.B. Lysin. Dies wird bei der Reinigung von
Plasminogenfragmenten mit Lys-Bio-Gel ausgenützt. Bei Lys-Bio-Gel handelt es sich um
eine aus Polyacrylamid-Resten bestehende, mit CNBr aktivierte Matrix, an welche Lysin
gekoppelt wird. Das Lys-Bio-Gel wird jeweils in grösseren Batches (ca. 600 ml fertiges Gel)
hergestellt und danach bei 4°C gelagert; es hat eine Kapazität von ca. 10 mg/ml. Die
Füllmenge der Säule kann an die zu isolierende Proteinmenge angepasst werden. Die Elution
des Proteins erfolgt mit 6-Aminohexansäure (6-AHA), einem Lysin-Analogon, welches das
Lysin von der Bindungsstelle der Kringel verdrängt.
Lys-Bio-Gel wird in eine Kunststoffsäule (Höhe ca. 10 cm, ∅ 2.5 cm) gepackt, bis das
Säulenbett ca. 5 cm hoch ist. Die Säule wird mit 100 ml 50 mM Tris pH 8.0 konditioniert.
Anschliessend wird die Proteinlösung auf die frei fliessende Säule geladen und mit 50 mM
Tris pH 8.0 gewaschen, bis die bei 280 nm gemessene Absorption konstant bleibt. Das
gebundene Protein kann mit 50 mM Tris pH 8.0 + 0.2 M 6-AHA eluiert werden. Das Eluat
wird danach zur Entfernung von 6-AHA während 48 h gegen H20 pH 3.5 (pH mit
Ameisensäure eingestellt) dialysiert, wobei alle 12 h die Dialyselösung ausgewechselt wird.
Das Protein wird lyophilisiert und kann anschliessend durch ESI-MS (2.2.2.10),
Aminosäureanalyse (2.2.2.8) Sequenzanalyse nach Edman (2.2.2.9) charakterisiert werden.
Das Gel wird mit 100 ml 0.9% NaCl-Lösung gewaschen und bis zum nächsten Gebrauch in
0.9% NaCl-Lösung + Natriumazid bei 4°C gelagert.
3.2.2.7 Gelfiltration
Gelfiltration mit G75 sf-Sepharose wird benutzt, um Proteine nach der Affinitätschromatographie weiter aufzureinigen. Die Komponenten der Proteinlösung werden dabei nach ihrem
Molekulargewicht aufgetrennt. Die stationäre Phase besteht aus einer Matrix mit einer
bestimmten Porengrösse. Während kleine Moleküle ganz und mittelgrosse teilweise in die
Matrixporen eindringen können, werden grosse Moleküle mit dem Totvolumen der Säule
75
eluiert. Nach und nach werden alle Moleküle eluiert, die kleinsten in dem Volumen, welches
dem Totvolumen + dem Volumen der Matrixporen entspricht.
Eine G75 sf-Säule (Länge 0.9 m, ∅ 5 cm) wird mit 0.13 M Ameisensäure konditioniert. Die
Proteinlösung (2.2.2.4.2b) wird auf die Säule geladen und bei einer Flussrate von 0.4 ml/min
und Fraktionenvolumen 4 ml chromatografiert; die Detektion erfolgt bei 280 nm. Die
relevanten Fraktionen werden gepoolt und lyophilisiert. Das Protein kann danach mittels
Aminosäureanalyse (2.2.2.8), Sequenzanalyse nach Edman (2.2.2.9) und ESI-MS (2.2.2.10)
3.2.2.8 Reversed-phase HPLC
Bei der „high performance liquid chromatography (HPLC) werden Peptide und Proteine
durch ihre unterschiedlichen Adsorptionseigenschaften an die stationäre Phase aufgetrennt. Ist
die Säulenmatrix apolar und die mobile Phase polar, spricht man von RP („reversed phase“)HPLC. Da die Eigenladung der Moleküle die Trennleistung der Säule negativ beeinflussen
könnten, gibt man der mobilen Phase das Ionenpaarreagens TFA zu. Dieses bindet an die
protonierten Seitenketten der basischen Aminosäuren, so dass das Protein keine Ladung mehr
aufweist. Auf diese Weise ist die Auftrennung der Proteinmoleküle nur von ihrer
Wechselwirkung mit der hydrophoben Matrix abhängig.
Für die Auftrennung wird der HPLC HP 1090 mit Autosampler und einer Aquapore ButylSäule verwendet. Die Säule wird mit RP-HPLC-Laufmittel A konditioniert. Von einer Probe
werden 50 µl eingespritzt und mit einem Gradienten von 0-100% RP-HPLC-Laufmittel B in
60 min bei einer Flussrate von 0.3 ml/min aufgetrennt. Die Detektion wurde bei 210 nm und
280 nm durchgeführt. Die den einzelnen Proteinpeaks entsprechenden Fraktionen können
gesammelt, mit dem Speed Vac getrocknet und mittels Aminosäureanalyse (2.2.2.8),
Sequenzanalyse nach Edman (2.2.2.9) und ESI-MS (2.2.2.10) charakterisiert werden.
3.2.2.9 Aminosäureanalyse
Durch die Aminosäureanalyse kann, bei bekannter Aminosäure-Zusammensetzung und Masse
des zu analysierenden Proteins, die relative AS-Zusammensetzung und der Proteingehalt der
Probe ermittelt werden. Das Protein wird zuerst hydrolysiert und die freigesetzten
Aminosäuren mit PITC derivatisiert, so dass PTC-Aminosäuren entstehen. Diese werden
mittels HPLC aufgetrennt und durch Vergleich mit einer Referenzprobe quantifiziert. Die
Aminosäureanalyse wird mit dem Summit® HPLC System durchgeführt.
Von einer Probe (1 mg/ml H2O) werden 10 µl in ein Hydrolyseröhrchen pipettiert und mit 5
µl AS-EDTA-Lösung versetzt. Nach Trocknung im Speed Vac wird das Röhrchen in ein
Hydrolysegefäss gegeben, in welchem sich schon 200 µl AS-HCl-Lösung befinden. Das
Röhrchen wird dreimal evakuiert und anschliessend mit Stickstoff belüftet. Dann wird ein
Vakuum von 20-40 mm Hg eingestellt. Die Hydrolyse erfolgt während 22 h bei 115°C. Die
Probe wird im Speed Vac getrocknet und in 10 µl AS-Puffer A gelöst. Nach einem weiteren
Trocknungsschritt wird die Probe in 10 µl AS-Puffer B gelöst und während 20 min bei RT
inkubiert. Die nun derivatisierten Aminosäuren werden während 45 min getrocknet und in 50
µl AS-RP-HPLC-Laufmittel A aufgenommen. 20 µl werden auf die mit AS-RP-HPLC76
Laufmittel A konditionierte Säule geladen und mit einem Gradient von 1-45% AS-RP-HLPCLaufmittel B in 13 min bei einer Flussrate on 1 ml/min aufgetrennt. Detektiert werden die
PTC-AS bei 247 nm. Die Quantifizierung geschieht durch Vergleich mit einem ebenfalls
derivatisierten AS-Standard (Pierce).
3.2.2.10 Sequenzanalyse nach Edman
Die gebräuchlichste Methode zur Bestimmung der Aminosäureabfolge eines Proteins ist die
N-terminale Sequenzierung nach Edman. Dabei wird in jedem Zyklus die endständige
Aminosäure an PITC gekoppelt, vom Rest des Proteins abgespalten und zur PTH-Aminosäure
konvertiert. Diese wird dann mittels RP-HPLC aufgetrennt und bei 269 nm detektiert. Die
Retentionszeit der PTH-Aminosäure wird mit einem Standard verglichen und die
abgespaltene Aminosäure dadurch identifiziert.
Die Sequenzierungen werden mit dem PE 492 cLC Sequenator durchgeführt. Dieses Gerät
führt die Analysen völlig automatisiert durch; es können sowohl Flüssigproben als auch auf
PVDF-Membranen geblottete Proteine analysiert werden.
Für Flüssigproben werden zuerst 7.5 µl Biobrene auf den Glasfilter gegeben und getrocknet.
Anschliessend werden mit dem Programm „Filter Precycle“ 5 Zyklen durchgeführt. 7.5 µl der
Proteinlösung (1-20 pmol in flüchtigem Lösungsmittel) werden auf den Filter gegeben,
getrocknet und mit dem Programm „Pulsed Liquid“ sequenziert. Für geblottete Proteine wird
die entsprechende Bande aus der Membran ausgeschnitten und in die Sequenzierzelle
eingelegt. Danach kann die Probe ebenfalls mit dem „Pulsed Liquid“-Programm sequenziert
werden. Die abgespaltenen Aminosäuren werden auf einer PTH-Säule aufgetrennt, bei 269
nm detektiert und durch Vergleich mit einem Standard identifiziert.
H
N
C
S
+
H
O
N
H
PTC-Protein
H
O
S
N
R1
H
Kupplung
R2
PITC
H
N
R'
H
O
H
N
H
Protein
H
H
S
N
H
O
N
R1
R2
R'
Spaltung
O
N
H
Konversion 2
- H2O
O H
R1
R1
OH
+ H2O
H
N
R1
O
Konversion 1
H
H
S
H N
+
O
N
H
R2
R'
Protein-Rest
N H
N
S
PTH-Aminosäure
ATZ-Aminosäure
Bild 3.5: Reaktionsmechanismus der Edman-Degradation
77
3.2.2.11 Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie
Neben MALDI-MS ist Elektrospray-Ionisations-Massenpektrometrie eine geeignete Methode
zur Massenbestimmung von Proteinen. Die Messungen werden mit einem VG Plattform
Single Quadrupol Mass Spectrometer durchgeführt, die Auswertung geschieht mit der Mass
Lynx™ Software.
Die gelösten Analyten (Protein oder Oligonukleotid) werden durch das Rheodyne-Ventil
eingespritzt und in einem konstanten Strom (10 µl/min, Laufmittel CH3CN/H2O (1:1, v/v)
unter Atmosphärendruck an die Spitze einer leitfähigen Kapillare geleitet. Das zwischen
Kapillarenende und Massenspektrometer angelegte elektrische Feld führt zu einer
Auftrennung der Ionen in der Analytenlösung. Dabei werden positive Ionen (positive mode,
für Proteine) oder negative Ionen (negative mode, für Oligonukleotide) an die
Flüssigkeitsoberfläche und weiter in Richtung Gegenpol gezogen. Der Lösungsstrom zerfällt
dann in kleine, aneinandergereihte Tröpfchen, deren Oberfläche durch Verdampfen des
Lösungmittels mittels einem Stickstoff-Trocknungsgas stetig schrumpft. Unterschreitet der
Radius des Tröpfchens einen bestimmten Radius (Rayleigh-Radius), entstehen daraus durch
die Abstossung gleichnamiger Ladungen viele noch kleinere Tröpfchen mit wenigen
Nanometer Durchmesser, die nur noch ein Analyt-Molekül enthalten (Coulomb-Explosion).
Die desolvatisierten freien Ionen werden durch zwei Linsen und einen Hexapol gebündelt und
mittels eines Quadrupols analysiert. Die Ionen werden durch ein Dynolite Detektor-System
detektiert und das Signal mit einem Photomultiplier verstärkt. Eine charakteristische
Eigenschaft des ESI-Prozesses ist, dass es zur Bildung mehrfach geladener Ionen kommt; bei
Proteinen zeigt sich deshalb häufig eine Serie von Massenpeaks („Envelope“), die sich jeweils
um eine Ladung unterscheiden.. Die Anzahl Ladungen eines Molekülions und damit auch das
Molekulargewicht berechnet der Computer aus den gemessenen Masse-Ladungsverhältnissen
(m/z) aufeinanderfolgender Molekülionen.
Das zu analysierende Protein wird in CH3CN/H2O (1:1, v/v) + 0.5% Ameisensäure
aufgenommen (ca. 1-5 pmol/µl). 10 µl der Proteinlösung werden eingespritzt, gemessen und
mit der Software ausgewertet.
3.2.2.12 Fluoreszenzspektrometrie
Die intrinsische Fluoreszenz von Proteinen wird oft für Struktur- und DynamikUntersuchungen herangezogen. Tryptophan, das dominante intrinsische Fluorophor, macht ca.
1mol% der Proteine aus. Das Fluoreszenzsignal dieser Aminosäure reagiert sehr empfindlich
auf Veränderungen in ihrem Umfeld. Veränderungen des Emissionsspektrums können z.B.
bei Konformationsänderungen, Substratbindung und Denaturierung des Proteins beobachtet
werden. Die Tryptophan-Fluoreszenz kann selektiv bei 295 – 305 nm angeregt werden.
Aus dem gemessenen Fluoreszenzsignal kann mit der Mehtode von Scatchard (1948) die
Assoziations- und Dissoziationskonstante (Ka resp. Kd) ermittelt werden.
Die intrinsische Fluorezenz wird mit dem Fluoreszenzspektrometer in einer auf 25°C
thermostatisierten Quartzküvette mit Magnetrührer gemessen. Dabei werden folgende
Einstellungen verwendet: Anregung 296 nm, Emission 340 nm, Scan Start 330 nm, Scan
Ende 350 nm, „Excitation Slit“ 10 nm, „Emission Slit“ 10 nm, Scangeschwindigkeit 240
nm/min.
Für die Fluoreszenztitration werden 600 µl einer Lösung von 5 µM Protein in 50 mM
Natriumphosphatpuffer pH 8.0 verwendet.Als Blank-Wert dient der Natriumphosphatpufer
78
ohne Protein. In 10 Schritten werden jeweils 2 µl der 5 µM Ligandlösung zugegeben. Nach
dem Mischen der Probe durch mehrmaliges Aufziehen und Ausstossen mit der Pipette wird
die Fluoreszenzintensität dreimal gemessen. Aus dem Ergebnis werden dann Assoziationsund Dissoziationskonstante bestimmt.
79
Prion Material und Methoden
4. Prion Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Hirnhomogenat
Homogenat
Beschreibung
Lieferant
Scrapie-negatives
10% Hirn in
Hamster-Hirnhomogenat TBS
R. G. Rohwer, Molecular
Neurovirology Laboratory,
Medical Research Service,
VA Maryland Health Care
System, Baltimore, USA
Scrapie-positives
Strain: 263K; 10% Hirn in
Hamster-Hirnhomogenat TBS
R. G. Rohwer, Molecular
Neurovirology Laboratory,
Medical Research Service,
VA Maryland Health Care
System, Baltimore, USA
BSE-negatives
Rinder-Hirnhomogenat
Aliquots von verschiedenen
Rindern; 10% Hirn in 320 mM
Saccharose
Tierspital Bern
BSE-positives
Rinder-Hirnhomogenat
Aliquots von verschiedenen
Rindern; 10% Hirn in 320 mM
Saccharose
Tierspital Bern
4.1.2 Plasminogen und Plasminogenfragmente
Protein
Beschreibung
Lieferant
HPg
isoliert aus menschlichem
Blutplasma
Eigenproduktion
Opg, PPg, RPg, EPg
FPg, CPg, BPg
isoliert aus Blutplasma der
entsprechenden Spezies
J. Schaller,
Universität Bern
K1-3, K4, MiniPlasminogen
erhalten aus Elastasespaltung
von HPg
Eigenproduktion
K1FXa, K1FXamut,
K23, K23mut, K4FXa
erhalten aus rekombinanter
Expression in E. coli
Eigenproduktion
80
4.1.3 Enzyme
Enzym
Beschreibung
Lieferant
Proteinase K
15.1 mg/ml in 10 mM Tris-HCl,
pH 7.5
Roche
Marker
Grösse der DNA-Fragmente
Lieferant
Precision Plus Protein™
Standard, Dual Color
10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa,
37 kDa, 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa,
150 kDa, 250 kDa;
Banden 25 kDa und 75 kDa:pink
gefärbt; Bande 50 kDa: 3x so intensiv wie die anderen Proteinbanden
Bio-Rad Laboratories, Inc.
MagicMark™ Western
Protein Standard
20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa,
60 kDa, 80 kDa, 100 kDa, 120 kDa;
Proteine enthalten eine IgG-Bindungsstelle und können durch einen
AP-/ HRP-gekoppelten Antikörper
mit chromogenen, chemilumineszenten und fluoreszierenden
Substraten visualisiert werden
Invitrogen
4.1.4 Marker
4.1.5 Antikörper
Antikörper
Beschreibung
Lieferant
6H4
monoklonaler Antikörper gegen Aminosäuren 144 – 152 von allen Säuger-PrPs;
IgG1-Typ; 1mg/ml, 95% rein
Prionics
3F4
purified; monoklonaler Antikörper gegen
Aminosäuren 109 – 112 von PrP aus Mensch,
Hamster und Katze; IgG2a-Typ; 1mg/ml,
Signet
2D10
monoklonaler Antikörper gegen PrP;
IgG2a-Typ; 5 µg/ml
ARCBS
6G4
IgG2b-Typ; 40 µg/ml
ARCBS
81
Antikörper
Beschreibung
Lieferant
2E7
IgG2b-Typ; 40 µg/ml
ARCBS
7C1
IgG2b-Typ; 1 µg/ml
polyklonaler Antikörper; 1,1 mg/ml
ARCBS
Dako
goat anti-mouse IgG2a
AP-gekoppelt
polyklonaler Antikörper
Southern Biotech
sheep anti-HPg
HRP-gekoppelt
polyklonaler Antikörper; 5 mg/ml
Anawa
goat anti-mouse IgG1
HRP-gekoppelt
4.1.6 Kits
Kit
Anwendung
Lieferant
Ni-NTA Spin Kit
Pull Down-Assay für Prionen
Qiagen
ECL plus™ Western
Blotting Detection Kit
enthält ECL plus A- und B-Lösung; basiert
auf Lumigen™ PS-3 Technologie; Gebrauchslösung: A+B im Verhältnis 1:40 (ca. 2.5 ml
pro Blot)
Amersham
QuickPick™ DEAE
mit schwachem Anionenaustauscher beschichtete paramagnetische Beads
Bio-Nobile
QuickPick™ CM
mit schwachem Kationenaustauscher beschichtete paramagnetische Beads
Bio-Nobile
4.1.7 Reagenzien, Lösungen, Puffer
Beschreibung
ABTS
2.2’-Azino-bis-(3-ethylbenzthioazoline- Applichem
6-Sulfonsäure; HRP-Substrat
6-AHA
zur Synthese
Assay-Puffer
3% NP-40 + 3% Tween-20®
Oxoid, Sigma,
Applichem
Beads-Block-Lösung
0.2 M Tris pH 8.5
Sigma
Beads-Detergenslösung
1% Triton X-100
Lieferant
Merck
®
Fluka
82
Beschreibung
Lieferant
BeadsKupplungspuffer
0.1 M Boratpuffer, pH 9.5
Sigma
Beads-Waschpuffer
PBS + 0.1% (w/v) BSA
Oxoid, Fluka
Borat
Minimum 99.5%
Sigma
BSA
> 98% (GE)
Fluka
Chelating Sepharose®
Fast flow
in 20% Ethanol
Pharmacia Biotech
CDP-Star® Western
Blot Chemiluminescence
Reagent
enthält das AP-Substrat CDP-Star®;
gebrauchsfertig
Applied Biosystems
CoomassieEntfärbelösung
50% MeOH, 10% Eisessig
Merck, Merck
Coomassie-Färbelösung
1x Coomassie R-250 Staining
Solution
Bio-Rad Laboratories,
Inc.
Deoxycholat
Natriumsalz
Minimum 97%
anionisches Detergens
Sigma
Dynabeads® M-280
tosylaktiviert
supermagnetische Polystyrol- Beads;
Polyurethan-Beschichtung, durch
p-Toluol-sulfonylchlorid; Durchmesser 2.8 µm
Dynal® Biotech
EDTA
MicroSelect, > 99% (KT)
Fluka
ELISAReaktionspuffer
0.1 M Citratpuffer + 0.03% H2O2:
9.802 g Zitronensäure-Monohydrat +
14.4 g Tri-Natriumcitrat-Dihydrat, auf
pH 4.2 einstellen, + 1 ml H2O2, auf
1 l mit MilliQ auffüllen; kurz vor
Gebrauch 500 mg ABTS zugeben
Merck, Fluka,
Applichem
Hypochlorit
14%-Lösung
Hänseler AG
Kobaltsulfat
Heptahydrat
Minimum 99%
Sigma
Kupfer(II)sulfat
Pentahydrat
ca. 99%
Sigma
MgCl2-Tris-Assaypuffer
10X: 11.5 mM MgCl2, 200 mM Tris,
pH 10.0
Fluka, Sigma
Microplate Blocking
Buffer
0.9% NaCl; 2% Saccharose,
0.1% BSA
Merck, Fluka
NapSure Blocking Buffer
NaCl
Geno Technology Inc.
p. a.
Merck
83
Beschreibung
Lieferant
Na-Thiosulfat
Fluka
Nickel(II)sulfat
Hexahydrat
Sigma
Ni-NTA Magnetic
Agarose Beads
5% (v/v) Suspension in 30% Ethanol
Qiagen
Nitroblock™ II
Substrat-Enhancer; wird dem
CDP-Star® Substrat im Verhältnis
1:20 zugegeben; verringert die
unspezifischen Hintergrundsignale
Tropix
NuPAGE® LDS Sample
Buffer
4x:141 mM Tris, 2% LDS, 10%
Glyzerin, 0.51 mM EDTA, 0.22 mM
SERVA® Blue G250, 0.175 mM
Phenolrot; pH 8.5
Invitrogen
NuPAGE® MOPS SDS
Running Buffer
20x: 1 M MOPS, 1 M Tris,
2 % SDS, 20.5 mM EDTA; pH 7.7
Invitrogen
NuPAGE® MES SDS
Running Buffer
20x: 1 M MES, 50mM Tris,
2 % SDS, 20.5 mM EDTA; pH 7.3
Invitrogen
NuPAGE® Transfer
Buffer
20x: 25 mM Bicin, 25 mM Bis-Tris
(freie Base), 1mM EDTA; pH 7.2
Invitrogen
Pefabloc SC (AEBSF)
Serinprotease-Inhibitor; weniger
toxisches Substitut für PMSF
Roche
PBS
(Dulbecco A); 138 mM NaCl,
2.7 mM KCl ; pH 7.3 (approx.) ;
Tabletten, 1/100 ml H2O
Oxoid
PBS/BSA-Puffer
+ 0.2% BSA
Oxoid, Fluka
PBST
KCl, 0.05% Tween®-20; pH 7.4;
Sachets, 1 pro1000 ml H2O
Sigma
Prionics®-Check Western 5x Konzentrat
Homogenisation Buffer
Prionics
Saccharose
für die Mikrobiologie
Merck
TBST
0.05 M Tris Buffered Saline +
KCl, 0.05% Tween®-20; pH 8.0;
Sachets, 1 pro 1000 ml H2O
Sigma
Tergitol (NP-40)
nichtionisches Detergens
Sigma
Tri-Natriumcitrat
Dihydrat
p. a.
Merck
84
Beschreibung
Lieferant
Tris
Minimum 99.9%
Sigma
Tris-Glycine SDS Sample
Buffer (2x)
63 mM Tris-HCl, 10 % Glycerol,
2% SDS, 0.0025% Bromphenolblau;
pH 6.8
Invitrogen
Triton X-100®
Fluka
Tween-20®
nichtionisches Detergens
Applichem
Wasch-Puffer
2% NP-40 + 2% Tween-20®
Oxoid, Sigma,
Applichem
Wasserstoffperoxid
puriss. p. a. Ph. Eur. > 30%
Fluka
ZitronensäureMonohydrat
p. a.
Merck
4.1.8 Weiteres Zubehör
Zubehör
Beschreibung
Lieferant
AutoradiografieFilm
Hyperfilm™ ECL
Amersham
PVDF-Membran Invitrolon PVDF Filter Paper Sandwich
0.45 µm und 0.2 µm Porengrösse
Invitrogen
Ni-NTAHisSorb™ Plates
mit Ni-NTA beschichtete 96-WellMikrotiter-Platten
Qiagen
NitrozelluloseMembran
Nitrozellulose Filter Paper Sandwich;
0.45 µm Porengrösse
Invitrogen
SDS-PAGE-Gel
NuPAGE® Novex 10% Bis Tris Gel
1,0 mm 10 well/15 well
Invitrogen
UltraBind™Membran
modifiziertes Polyethersulfon; 0.45 µm
Porengrösse; bindet Proteine kovalent
Pall
Unbeschichtete
Falcon® 96-Well Mikrotiterplatten für die
Mikrotiterplatten Zellkultur; nicht vorbehandelt; Polystyrol
Becton-Dickinson
4.1.9 Geräte
Gerät
Beschreibung
Lieferant
Centrifuge 5804 R
Vaudaux-Eppendorf
Film-Entwickler
FPM-100A
Fuji
85
Gerät
Beschreibung
Lieferant
Heizblock
LS 1
VLM
Dispersionsgerät
Miccra D-8 Antrieb und DS-8/P
Dispersionsstab
Art Labortechnik
Laminar-Flow
Arbeitstisch
LF MRF B 1300
Prettl
Microplate-Reader
SpectraMAX 250; Software:
SOFTmax PRO 3.1.1
Molecular Devices
PAGE/Blot-System
XCell SureLock™ Mini Cell und
XCell II™ Blot Module Kit
Invitrogen
PAGE/BlotStromquelle
Power Ease™ 500 Power Supply
Invitrogen
Phosphoimager
FLA-3000
Fuji
Thermomixer
Thermomixer comfort
Vaudaux-Eppendorf
Tischzentrifuge
Microzentrifuge SD Fisherbrand®
Fisher Scientific
4.2 Methoden
4.2.1 Aufbereitung von BSE-negativem und –positivem Hirnhomogenat aus Rindern
Die Gehirnproben von gesunden und an BSE erkrankten Rindern wurden bereits im Tierspital
in einer 320 mM Saccharose-Lösung homogenisiert, so dass ein 10% Hirnhomogenat
entstand. Das Homogenat enthält aber noch unlösliche Proteine, Verklumpungen und
Gewebeteile, durch welche Pipettierfehler entstehen oder welche die Interaktion PrionPlasminogen stören und unspezifische Signale erzeugen könnten. Deshalb muss das
Hirnhomogenat vor der Verwendung im Experiment vorbehandelt werden; dies geschieht
durch Zusatz von Detergentien und erneute Homogenisation mit einem Dispersionsgerät.
4.2.1.1 Verarbeitung ohne Zusatz
1 ml Hirnhomogenat wird aus dem –20°C-Tiefkühlfach entnommen und auf Eis aufgetaut.
Danach wird das Homogenat zentrifugiert (30 min, 500xg, 4°C) und der Überstand einem
erneuten Zentrifugationsschritt unterworfen (30 min, 500xg, 4°C). Der abgetrennte Überstand
kann danach bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert werden.
86
4.2.1.2 Verarbeitung ohne Zusatz, mit Homogenistation
Danach wird das Homogenat mit dem Dispersionsgerät während 2 min auf Einstellung B
(17´800 Umdrehungen/min) homogenisiert. Das Homogenat wird anschliessend zentrifugiert
(30 min, 500xg, 4°C). Nach einer weiteren Zentrifugation (30 min, 500xg, 4°C) kann der
Überstand bei –20°C gelagert werden.
4.2.1.3 Verarbeitung mit DOC/NP-40
Nach der Zugabe von DOC und NP-40 (Endkonzentration: 0.5%) wird das Hirnhomogenat so
lange auf dem Vortex gemischt, bis sich die Detergentien aufgelöst haben. Danach wird das
Homogenat zentrifugiert (30 min, 500xg, 4°C) und der Überstand einem erneuten
Zentrifugationsschritt unterworfen (30 min, 500xg, 4°C). Der abgetrennte Überstand kann
danach bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert werden.
4.2.1.4 Verarbeitung mit DOC/NP-40, mit Homogenisation
Nach der Zugabe von 0.5% DOC und 0.5% NP-40 wird das Hirnhomogenat so lange auf dem
Vortex gemischt, bis sich die Detergentien aufgelöst haben. Das Homogenat wird
anschliessend mit dem Dispersionsgerät während 2 min auf Einstellung B homogenisiert und
solange auf Eis gelagert, bis sich die Schaumbildung reduziert hat. Danach wird das
Homogenat zentrifugiert (30 min, 500xg, 4°C) und der Überstand einem erneuten
Zentrifugationsschritt unterworfen (30 min, 500xg, 4°C). Der abgetrennte Überstand kann
danach bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert werden.
4.2.1.5 Mit Homogenisationspuffer
800 µl Hirnhomogenat werden mit 200 µl 5x Homogenisationspuffer auf dem Vortex
gemischt. Danach wird das Homogenat zentrifugiert (30 min, 500xg, 4°C) und der Überstand
einem erneuten Zentrifugationsschritt unterworfen (30 min, 500xg, 4°C). Das Pellet wird
verworfen; der abgetrennte Überstand kann danach bis zur weiteren Verwendung bei –20°C
gelagert werden.
87
4.2.1.6 Verarbeitung mit Homogenisationspuffer, mit Homogenisation
800 µl Hirnhomogenat werden mit 200 µl 5x Homogenisationspuffer auf dem Vortex
gemischt. Das Homogenat wird anschliessend mit dem Dispersionsgerät während 2 min auf
Einstellung B homogenisiert und solange auf Eis gelagert, bis sich die Schaumbildung
reduziert hat. Danach wird das Homogenat zentrifugiert (30 min, 500xg, 4°C) und der
Überstand einem erneuten Zentrifugationsschritt unterworfen (30 min, 500xg, 4°C). Der
abgetrennte Überstand kann bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert werden.
4.2.2 Probenvorbereitung
Durch Zugabe von Proteinase K zum Hirnhomogenat wird PrPC vollständig verdaut, während
von PrPSc der resistente Kern (PrP27-30) zurückbleibt. Dadurch kann auch ohne Pull DownAssay zwischen BSE/Scrapie-negativem und –positivem Homogenat unterschieden werden.
Proteinase K ist eine Subtilisin-verwandte Serinprotease. Das Enzym spaltet peptidische
Bindungen X-Y, wobei X eine aromatische, aliphatische oder hydrophobe Aminosäure und Y
jede Aminosäure sein kann. Wird Proteinase K im Überschuss und mit langen
Inkubationszeiten eingesetzt, so werden die Proteine bis hin zu den Aminosäuren abgebaut.
Die optimale Aktivität erreicht Proteinase K bei 55-65°C und Zugabe von 0.5% SDS. Da der
PrP-Titer in Hamster viel höher als derjenige im Rind ist und die Proteinase K-Sensitivität
von PrPC unterscheidlich ausgeprägt ist , muss die Probe entsprechend länger verdaut werden,
um alle Spuren von PrPC zu beseitigen.
Durch den Zentrifugationsschritt der HDR-Methode können die suspendierten Proteine
aufkonzentriert werden und so in einem kleineren Sample Buffer-Volumen aufgenommen
werden. Diese Methode eignet sich auch vorzüglich zur Probenvorbereitung von in grösseren
Volumina suspendierten Homogenatproben.
4.2.2.1 Probenvorbereitung mit/ohne Proteinase K-Verdau
10 µl BSE-negatives oder -positives Rinder-Hirnhomogenat (oder Scrapie-negatives HamsterHirnhomogenat und Scrapie-negatives Hamster-Hirnhomogenat) werden mit 1,2 µl Proteinase
K (verdünnte Stammlösung; 1 mg/ml) oder PBS vermischt und im Thermomixer während 30
min (Rind) oder 1 h (Hamster) bei 37°C/1400 rpm inkubiert. Danach werden 10 µl H2O und
20 µl 2x Tris Glycine SDS Sample Buffer zugegeben und die Probe im Heizblock während 5
min bei 95°C erhitzt. Die Probe kann bis zum weiteren Gebrauch bei –20°C gelagert werden.
88
4.2.2.2 Probenvorbereitung mit der High Dynamic Range (HDR)-Methode
10 µl BSE-negatives oder -positives Rinder-Hirnhomogenat (oder Scrapie-negatives HamsterHirnhomogenat und Scrapie-negatives Hamster-Hirnhomogenat) werden mit 1 ml MilliQH2O gemischt. Danach wird 100 µl Proteinase K (1mg/ml) oder PBS zugegeben. Die Probe
wird anschliessend im Thermomixer während 30 min (Rind) oder 1 h (Hamster) bei 37°C
inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (Eppendorf-Zentrifuge, 60 min, 20’600xg, 4°C)
wird der Überstand vorsichtig entfernt und das Pellet in 40 µl 1x Tris Glycine SDS Sample
Buffer aufgenommen. Die Probe wird im Heizblock während 5 min bei 95°C erhitzt und kann
bis zur Weiterverwendung bei –20°C gelagert werden.
Tosylaktivierte Dynabeads® M-280 sind gleichförmige (Durchmesser 2.8 µm, Oberfläche 4-8
m2/g; 2x109 Beads/ml), superparamagnetische Polystyrol-Beads mit einer PolyurethanBeschichtung. Diese Beschichtung ist mit P-Toluol-sulfonylchlorid aktiviert, so dass reaktive
Gruppen für die Kopplung von Proteinen und anderen Liganden mit primären Amino- oder
sulfhydryl-Gruppen bereitstehen. Sie können grundsätzlich mit jedem Protein, Peptid oder
Glykoprotein beschichtet werden. Die Beads binden die Proteine physikalisch und chemisch,
wobei die Menge an gekoppeltem Ligand bei höherem pH/höherer Temperatur zunimmt.
Die Dynabeads® M-280 dienen als solide Phase bei biomagnetischen Trennungen; z. B. bei
der Reinigung von Proteinen,bei Immunoassays oder Zelltrennungen. Die Beads sind durch
einen Magneten in kurzer Zeit vom Überstand abzutrennen, das Volumen der Probelösung
und die Menge an zugegebenen Beads kann an die Versuchsbedingungen angepasst werden.
Ausserdem sind die Kopplungsbedingungen für das Protein sehr schonend, so dass die native
Konformation grösstenteils erhalten bleibt. Dies ist vor allem bei Pull Down-Assays wichtig,
bei denen die Interaktion zwischen Fänger-Protein oder –Antikörper und Antigen oft durch
die Konformation des gekoppelten Proteins vermittelt wird.
4.2.2.3.1 Beschichtung der Dynabeads
Es wird eine Proteinlösung von Plasminogen oder Plasminogen-Fragmenten in BeadsKupplungspuffer vorbereitet; die verwendeten Proteinkonzentrationen liegen je nach Bedarf
zwischen 100 und 500 µg/ml Kupplungspuffer. Die Dynabeads werden im Original-Behälter
durch auf- und Abpipettieren gut resuspendiert; von dieser Lösung wird 1 ml in ein
Reaktionsgefäss gegeben. Dieses wird in die Magnetapparatur gestellt und der Überstand
nach ca. 1 min vorsichtig abgesaugt. Die Beads werden mit 1 ml Beads-Waschpuffer
gewaschen und 1 ml der vorbereiten Proteinlösung zugegeben. Nach sorgfältiger
Resuspension durch Vortexen werden das Protein unter Schütteln während 24 h bei 37°C an
die Beads gekoppelt. Nach zweimaligem Spülen mit je 1 ml Waschpuffer werden die nicht
belegten Bindungsstellen der Dynabeads mit Beads-Blockpuffer unter Schütteln während 4 h
bei 37°C geblockt. Die Beads werden erneut zweimal mit Beads-Waschpuffer und
anschliessend einmal während 10 min mit Beads-Detergenspuffer gewaschen, um die
Adhäsion zwischen den einzelnen Beads zu minimieren. Nach einem Waschschritt mit BeadsWaschpuffer werden die nun beschichteten Beads in 1 ml dieses Puffers suspendiert; sie
können in dieser Lösung bis zur Weiterverwendung bei 4°C gelagert werden.
89
1. Beschichten der Dynabeads mit Plasminogen
oder Plasminogenfragmenten
2. Inkubieren der beschichteten Dynabeads in
PrP enthaltender Lösung
3. Elution des gebundenen PrP
4. Auftrennung des eluierten PrPs und Analyse
mittels Western Blot
Bild 4.1: Darstellung des Pull Down-Assays mit beschichteten Dynabeads; grau: Dynabeads; blau: Plasminogen;
rot: PrP; pink, grün: andere Proteine
90
4.2.2.3.2 Pull Down-Assay
10 µl Hirnhomogenat (mit/ohne Proteinase K-Verdau) wird mit 1 ml Assaypuffer und 50 µl
Dynabeads in einem 1.5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäss vermischt. Der Ansatz wird während
1 h 30 min bei 20°C inkubiert. Die Lösung wird in die Magnetapparatur gestellt; der
Überstand kann nach ca. 1 min abgesaugt werden, während die Beads im Reaktionsgefäss
bleiben. Die Beads werden 3x mit 1 ml Waschpuffer und 1x mit 1 ml PBS durch
Resuspension durch Vortexen gespült; bei Spülen mit PBS sollte der Durchmischungsvorgang
mindestens 15 sec dauern; zwischen den einzelnen Reinigungsschritten wird der Ansatz
immer wieder in die Magnetapparatur gestellt und der Überstand abgesaugt. Nach dem letzten
Absaugen wird der Reaktionsansatz kurz in der Tischzentrifuge zentrifugiert und alle
Lösungsreste entfernt. Danach werden 40 µl 1x Tris Glycine SDS Sample Buffer zugegeben
und die Probe im Heizblock während 5 min bei 95°C erhitzt. Die Probe wird in die
Magnetapparatur gestellt und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäss transferiert und bis
zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Die Beads werden verworfen.
4.2.2.4 Pull Down-Assay mit Inhibition durch 6-AHA
10 µl Hirnhomogenat wird mit 1 ml Assaypuffer + 6-AHA (verwendete Konzentrationen:
0.05 – 2M) und 50 µl Dynabeads in einem 1.5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäss vermischt. Der
Pull-Down-Assay und das Waschen der Beads wird wie unter 2.2.3.3.2 beschrieben
durchgeführt und die Probe im Heizblock während 5 min bei 95°C erhitzt. Die Probe wird in
die Magnetapparatur gestellt und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäss transferiert und
bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Die Beads werden verworfen.
4.2.2.5 Pull Down-Assay mit beschichteten Dynabeads mit Elution durch 6AHA
10 µl Hirnhomogenat wird mit 1 ml Assaypuffer und 50 µl Dynabeads in einem 1.5 mlEppendorf-Reaktionsgefäss vermischt. Der Pull-Down-Assay und das Waschen der Beads
wird wie unter 2.2.3.3.2 beschrieben durchgeführt. Die gebundenen Proteine werden mit 40 µl
0.15 M Phosphatpuffer + 6-AHA (verwendete 6-AHA-Konzentrationen: 0.05 – 2M) im
Thermomixer während 5 min bei 20°C unter Schütteln von den Dynabeads eluiert. Die Probe
wird anschliessend in die Magnetapparatur gestellt und der Überstand in ein neues
Reaktionsgefäss transferiert. Die Beads werden verworfen. Anschliessend
werden
dem
Überstand 20 µl 2x Tris Glycine SDS Sample Buffer zugegeben. Die Probe wird im
Heizblock während 5 min bei 95°C erhitzt.
91
4.2.2.6 Pull Down-Assay mit beschichteten Dynabeads mit Zugabe von
EDTA
10 µl Hirnhomogenat wird mit 1 ml Assaypuffer + EDTA (Konzentrationen: 5-50 mM) und
50 µl beschichteten Dynabeads in einem 1.5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäss vermischt. Der
Pull-Down-Assay und das Waschen der Beads wird wie unter 2.2.3.3.2 beschrieben
durchgeführt. Den Proben werden 40 µl 1x Tris Glycine SDS Sample Buffer zugegeben. Die
Probe wird im Heizblock während 5 min bei 95°C erhitzt und anschliessend in die
Magnetapparatur gestellt Der Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäss transferiert und bis
zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Die Beads werden verworfen.
4.2.2.7 Pull Down-Assay mit Anionenaustauscher-/KationenaustauscherBeads
Es wurde bobachtet, dass PrP auch durch chromatografische Prozesse aus Lösungen entfernt
werden kann, z.B. durch Anionen-Austauscher bei der Reinigung von Fibrinogen, Faktor VIII
und Faktor IX oder durch Kationen-Austauscher bei der Präparation von Thrombin.
Entsprechende Untersuchungen wurden mit PrP aus Hamster-adaptiertem Scrapie gemacht.
Durch einen Pull-Down-Assay mit schwachen Anionen- (Diethylaminoethyl-, DEAE-) und
Kationen- (Carboxymethyl-, CM-) Austauscher-Beads kann überprüft werden, ob bei PrP aus
BSE-Material auch dieselbe Eigenschaft nachgewiesen werden kann. Die Beads und
Regenerations-, Reinigungs- und Elutionspuffer sind im Kit enthalten.
100 µl DEAE- oder CM-Beads werden in einem Reaktionsgefäss vorgelegt. Die Beads
werden mit dem Magnetstift aus der Lösung geholt und in 400 µl Regenerationspuffer
resuspendiert. Danach werden die Beads wiederum am Magnetstift gesammelt und in 400 µl
Reinigungspuffer gewaschen. Die Beads werden in 300 µl Assay-Puffer + 10 µl BSEnegatives oder –positives Hirnhomogenat resuspendiert. Nach 2 min Inkubation in der
Probenlösung werden die Beads erneut in 400 µl Reinigungspuffer gewaschen und die
gebundenen Proteine anschliessend mit 20 µl Elutionspuffer eluiert. Dem Eluat werden 20 µl
2x Tris Glycine SDS Sample Buffer zugegeben. Nachdem die Probe im Heizblock während 5
min bei 95°C erhitzt worden ist, kann sie bis zur weitern Verwendung bei –20°C gelagert
werden. Die Beads werden verworfen.
4.2.2.8 Pull Down-Assay mit beschichteten Dynabeads aus grösseren Volumina
10 µl Hirnhomogenat wird in einem 15 ml-Falcon-Reaktionsgefäss mit Assaypuffer
(verwendete Volumina: 1 – 10 ml) und beschichteten Dynabeads (verwendete Mengen: 50 –
100 µl) vermischt. Der Ansatz wird während 1 h 30 min auf einem End-over-end-Shaker bei
20°C inkubiert. Das Reaktionsgefäss wird in die Magnetapparatur gestellt; die Beads werden
wie unter 2.2.3.3.2 beschrieben gewaschen. Danach werden 40 µl 1x Tris Glycine SDS
Sample Buffer zugegeben und die Probe im Heizblock während 5 min bei 95°C erhitzt. Die
92
Probe wird in die Magnetapparatur gestellt und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäss
transferiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Die Beads werden
verworfen.
4.2.2.9 Pull Down-Assay mit Ni-NTA-Beads
Es ist bekannt, dass PrP mit divalenten Metallionen wie Cu2+ und Ni2+ interagiert. Um diese
Eigenschaft in einem Pull Down-Assay untersuchen zu können, wurden im Assay statt
Plasminogen-beschichtete Beads Ni-NTA Magnetic Agarose Beads verwendet. Diese Beads
haben einen durchschnittlichen Durchmesser von 50 µm und enthalten magnetische Partikel.
An ihre Oberfläche sind chelierende Nitriloessigsäure (NTA)-Gruppen gebunden, welche
schon mit Nickel beladen geliefert werden. Die Ni-NTA Magnetic Agarose Beads sind in
Bezug auf ihre Adaption an verschiedene Versuchsbedingungen ähnlich flexibel wie die
Dynabeads® M-280.
10 µl Hirnhomogenat wird mit 1 ml Assaypuffer und 50 µl Ni-NTA Magnetic Agarose Beads
in einem 1.5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäss vermischt. Der Pull Down-Assay und das
Waschen der Beads wird wie unter 2.2.3.3 beschrieben durchgeführt. Danach werden 40 µl 1x
Tris Glycine SDS Sample Buffer zugegeben und die Probe im Heizblock während 5 min bei
95°C erhitzt. Die Probe wird in die Magnetapparatur gestellt und der Überstand in ein neues
Reaktionsgefäss transferiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Die Beads
werden verworfen.
4.2.2.10 Pull Down-Assay mit Metall-beschichteter chelierender
rose
Sepha-
Um nicht nur die Interatkion von PrP mit Ni2+, sondern auch mit anderen divalenten
Metallionen untersuchen zu können, wurde chelatierende Sepharose als solide Phase
eingesetzt.
Diese Sepharose besteht aus einer quervernetzten Agarose mit einer
Teilchengrösse von ca. 90 µm und einer Kapazität von 24-30 µM Zn2+/ml sedimentiertes Gel.
Die Sepharose kann entweder als solide Phase in einer Säule oder im Pull Down-Assay
verwendet werden.
4.2.2.10.1 Beschichtung der Sepharose mit Metall-Ionen (Cu2+, Ni2+, Co2+)
Die Sepharose wird bis zur vollständigen Sedimentation des Gels stehen gelassen. Danach
wird der Überstand abdekantiert und mit destilliertem Wasser ersetzt, so dass ein Verhältnis
Gel/ Wasser von 75%/25% entsteht.
Das Gel wird resuspendiert und 1 ml davon in ein Reaktionsgefäss pipettiert. Das Gel wird
durch kurzes Zentrifugieren mit der Tischzentrifuge sedimentiert und der Überstand
abgesaugt. Anschliessend wird das Gel zweimal mit 1 ml destilliertem Wasser gewaschen.
Danach wird 1 ml einer 0.3 M Metallionenlösung in 0.15 M Phosphatpuffer pH 7.4
zugegeben und die Gelsuspension während 15 min auf einem End-over-end-Shaker gemischt.
93
Nach dem Sedimentieren des Gels durch Zentrifugiation und Absaugen des Überstands wird
5x mit je 1 ml destilliertem Wasser gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wird das nun
metallbeschichtete Gel in einer 20%-Ethanol-Lösung resuspendiert. Das Gel kann bis zur
weiteren Verwendung bei 4°C gelagert werden.
4.2.2.10.2 Pull Down-Assay
10 µl Hirnhomogenat wird mit 1 ml Assaypuffer und 50 µl beschichteter Sepharose in einem
1.5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäss vermischt. Der Ansatz wird während 1 h 30 min bei 20°C
inkubiert. Die Sepharose wird durch kurzes Zentrifugieren in der Tischzentrifuge sedimentiert
und der Überstand sorgfältig abgesaugt. Die Sepharose werden 3x mit 1 ml Waschpuffer und
1x mit 1 ml PBS durch Resuspension durch Vortexen gespült; bei Spülen mit PBS sollte der
Durchmischungsvorgang mindestens 15 sec dauern; zwischen den einzelnen
Reinigungsschritten wird der Ansatz immer wieder kurz zentrifugiert und der Überstand
abgesaugt. Nach dem letzten Absaugen wird der Reaktionsansatz kurz in der Tischzentrifuge
zentrifugiert und alle Lösungsreste entfernt. Danach werden 40 µl 1x Tris Glycine SDS
Sample Buffer zugegeben und die Probe im Heizblock während 5 min bei 95°C erhitzt. Die
Sepharose wird durch kurzes Zentrifugieren sedimentiert und der Überstand in ein neues
Reaktionsgefäss transferiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Die
Sepharose wird verworfen.
4.2.3 Western Blot
4.2.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Für die Gelelektrophorese werden die vorbereiteten Proben entweder unverdünnt oder in
Verdünnungsreihen (1/2 -Verdünnungsreihe, 1/4-Verdünnungsreihe, 1/2log-Verdünnungsreihe) verwendet.
Für die Gelelektrophorese werden NuPAGE® Novex 10% Bis Tris Gele von Invitrogen
verwendet. Diese werden aus der Plastikhülle gelöst und mit H2O gespült. Der Kamm wird
vorsichtig aus dem Gel entfernt und die Geltaschen mit 1x NuPAGE® MOPS SDS Running
Buffer gespült. Der untere Abdeckstreifen wird entfernt und das Gel in die ElektrophoreseApparatur eingesetzt. Sowohl die innere wie auch die äussere Pufferkammer wird mit 1x
NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer gefüllt. In die Taschen werden nun die vorbereiteten
Proben und die Standards eingefüllt.
Das Gel wird bei einer Spannung von 200 V während 50 min entwickelt. Die Gelkassette
wird aufgebrochen und die obere Kassettenplatte entfernt, während das Gel auf der unteren
94
Platte bleibt. Nach Entfernen des Sammelgels und der Lippe am unteren Ende kann das
Trenngel für das Blotting (2.2.4.2) weiterverwendet werden.
4.2.3.2 Blotting
Für das Blotting wird das XCell SureLock™ Mini Cell und XCell II™ Blot Module Kit
verwendet.
4.2.3.2.1 PVDF-Membran
Die PVDF-Membran wird zuerst während 15 sec in Methanol, während 2 min in H2O und
während 5 min in 1x NuPAGE® Transfer Puffer eingelegt. Die Blotting Pads und die
Filterpapiere werden ebenfalls mit 1x NuPAGE® Transfer Puffer befeuchtet. Die BlottingApparatur wird dann wie folgt zusammengebaut: Die beiden Polplatten werden bis zum
Anschlag zusammengepresst und das „Blot-Sandwich“ in die Apparatur eingespannt.
Zwischen den beiden Polplatten wird bis zur Pad-Obergrenze 1x NuPAGE® Transfer Puffer
zugegeben und auf der Aussenseite der Apparatur H2O zur Kühlung eingefüllt. Die PVDFMembran wird bei einer Spannung von 30 V während 1 h 15 min geblottet. Die Membran
wird danach während einiger Minuten mit H2O gewaschen. Der Blot kann nun für die
Proteindetektion (2.2.2.3) weiterverwendet werden.
4.2.3.2.1 Nitrozellulose-Membran
Die Nitrozellulose-Membran wird während 5 min in 1x NuPAGE® Transfer Puffer eingelegt.
Die Blotting Pads und die Filterpapiere werden ebenfalls mit 1x NuPAGE® Transfer Puffer
befeuchtet. Die Blotting-Apparatur wird dann wie oben beschrieben zusammengebaut. Die
Membran wird bei einer Spannung von 30 V während 1 h geblottet. Die Membran wird
danach während einiger Minuten mit H2O gewaschen. Der Blot kann nun für die
Proteindetektion (2.2.2.3) weiterverwendet werden.
4.2.3.3 Proteindetektion
4.2.3.3.1 Coomassie-Färbung
Die Membran wird während 3 min in Coomassie-Färbelösung inkubiert. Anschliessend wird
der Blot mit H2O gewaschen und mit Coomassie-Entfärbelösung entfärbt, bis der Hintergrund
wieder weiss erscheint. Die Membran kann nun getrocknet und analysiert werden.
95
4.2.3.3.2 Immunologischer Nachweis
Beim immunologischen Nachweis von PrP werden Nitrozellulose- und PVDF-Membranen
eingesetzt. Die unterschiedlichen Eigenschaften der Membranen bedingen den Einsatz eines
auf die jeweiligen Bedingungen zugeschnittenen Detektionssystems. Während bei
Nitrozellulose-Blots ein Alkaline Phosphatase (AP)-gekoppelter Sekundärantikörper in
Verbindung mit CDP-Star, welches das Substrat für die AP liefert, optimale Resultate liefert,
wurden für Blots auf PVDF Horseradish Peroxidase (HRP)-gekoppelte Sekundärantikörper
und das ECL plus Detektionssystem verwendet. Die Chemilumineszenz-Emissionsmaxima
der bei der Substratumsetzung gebildeten Produkte liegen bei 430 nm (ECL plus) und 461466 nm (CDP-Star).
Nitrozellulose-Membran
Die Membran wird über Nacht bei 4°C mit NapSure Blocking Buffer:TBST 1:3 geblockt.
Anschliessend wird der Blot während 1 h bei 4°C mit 2.5 ml NapSure Blocking Buffer:TBST
1:4 + Primär-Antikörper 3F4 1:5’000 inkubiert. Die Membran wird 3x 1 min mit 15 ml TBST
und 3x 10 min mit 20 ml TBST gewaschen. Danach wird der Blot während 1 h bei 4°C mit
2.5 ml NapSure Blocking Buffer:TBST 1:4 + Sekundär-Antikörper goat anti-mouse APgekoppelt 1:15´000 inkubiert. Die Membran wird erneut während 3x 1 min mit 15 ml TBST
und 3x 10 min mit 20 ml TBST gewaschen. Nach dem Waschen der Membran mit 1x MgCl2Tris-Assaypuffer wird der Blot mit 2 ml CDP-Star® Western Blot Chemiluminescence
Reagent + 50 Nitroblock II während 5 min inkubiert. Anschliessend kann der Blot auf
Autoradiografie-Film exponiert werden. Der Film wird im FPM-100A-Gerät entwickelt und
kann anschliessend analysiert werden.
PVDF-Membran
Die Membran wird über Nacht bei 4°C mit NapSure Blocking Buffer:PBST 1:2 geblockt.
Anschliessend wird der Blot während 1 h bei 4°C mit 2.5 ml NapSure Blocking Buffer:PBST
1:2 + Primär-Antikörper (Bezeichnungen und Konzentrationen siehe Tabelle 4.1) inkubiert.
Die Membran wird 3x 1 min mit 15 ml PBST und 3x 10 min mit 20 ml PBST gewaschen.
Danach wurde der Blot während 1 h bei 4°C mit 2.5 ml NapSure Blocking Buffer:PBST 1:2 +
Sekundär-Antikörper inkubiert. Die Membran wird erneut während 3x 1 min mit 15 ml PBST
und 3x 10 min mit 20 ml PBST gewaschen. Nach fünf Minuten Inkubation mit ECL PlusLösung (2.5 ml ECL Plus A + 62.5 µl ECL Plus B) kann der Blot auf Autoradiografie-Film
exponiert werden. Der Film wird im FPM-100A-Gerät entwickelt und kann anschliessend
analysiert werden.
Primär-Antikörper; Konzentration
Sekundär-Antikörper; Konzentration
6H4; 1:10´000
goat anti-mouse HRP-gekoppelt; 1:20´000
6G4, 2E7, 2D10, 7C1; 1:20 – 1:10’000
goat anti-mouse HRP-gekoppelt; 1:20´000
HPg; 1:5000 (Stammlösung 2 mg HPg/ml)
sheep anti-HPg HRP-gekoppelt; 1:5000
Tabelle 4.1: Beim immunologischen Nachweis auf PVDF-Membranen verwendete Antikörper und ihre
Verdünnungen
96
4.2.4 Dot Blot
Von BSE-negativen und -positiven Hirnhomogenaten wird eine ½ -Verdünnungsreihe in PBS
hergestellt, ausgehend von einer Konzentration von 0.5 µl Homogenat/µl (entspricht 5%
reinem Hirn/µl). Je 2 µl der Lösungen werden im Abstand von ca. 5 mm auf die UltraBindMembran aufgetragen und trocknen gelassen. Die Membran wird anschliessend für den
immunologischen Nachweis wie ein gewöhnlicher Blot weiterbehandelt.
Danach wird die Membran über Nacht mit NapSure Blocking Buffer:PBST 1:1 geblockt.
Anschliessend wird der Blot während 1 h bei 4°C mit 2.5 ml NapSure Blocking Buffer:PBST
1:1 + Antikörper 6H4 (1:10´000), + Antikörper 6G4 (1:20 – 1:1000) oder mit HPg (1:5000
einer 2mg/ml Lösung) inkubiert. Die Membran wird 3x 1 min mit 15 ml PBST und 3x 10 min
mit 20 ml PBST gewaschen. Danach wurde der Blot während 1 h bei 4°C mit 2.5 ml NapSure
Blocking Buffer:PBST 1:1 + Antikörper goat anti-mouse HRP-conjugated (1:20´000, für 6H4
und 6G4) oder Antikörper sheep anti-HPg HRP-conjugated (1:5000, für HPg) inkubiert. Die
Membran wird erneut während 3x 1 min mit 15 ml PBST und 3x 10 min mit 20 ml PBST
gewaschen. Nach fünf Minuten Inkubation mit ECL Plus-Lösung (2.5 ml ECL Plus A + 62.5
µl ECL Plus B) kann der Blot auf Autoradiografie-Film exponiert werden. Der Film wird im
FPM-100A-Gerät entwickelt und kann anschliessend analysiert werden.
4.2.5 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Die Enzymimmunoassay-Methode vereint die hohe Spezifität der Antikörper mit der
Empfindlichkeit einfacher spektrophotometrisch ausgewerteter Enzymtests. Man benutzt
Antikörper oder Antigene, welche an einfach zu bestimmende Enzyme mit hohem
Substratumsatz kovalent gebunden sind.
Bei den ELISA-Methoden unterscheidet man zwischen einfachem und Sandwich-ELISA. Ein
Standard-Sandwich-ELISA umfasst folgende Schritte:
1) Ein Antikörper gegen das zu untersuchende Protein wird auf einer inerten Oberfläche (z.B.
Polystyrol) immobilisiert
2) Die Lösung mit dem zu untersuchenden Protein wird auf die beschichtete Oberfläche aufgetragen; der Antikörper bindet an das Protein; das nicht gebundene Protein wird
weggewaschen.
3) Der resultierende Antikörper-Protein-Komplex wird mit einem zweiten proteinspezifischen Antikörper behandelt, an welchen ein Enzym kovalent gebunden ist.
4) Nachdem der nicht gebundene Enzym-Antikörper weggewaschen wurde, wird die Menge
an gebundenem Enzym untersucht, indem Enzym-Substrat zugegeben wird. Das
entstehende Produkt kann anschliessend detektiert werden.
Bei der hier verwendeten Methode wird der Antikörper in Schritt 1 durch Plasminogen oder
Plasminogenfragmente ersetzt. In Schritt 3 wird zuerst ein nicht Enzym-gekoppelter PrimärAntikörper gegen PrP verwendet. Als Sekundär-Antikörper wird ein HRP-gekoppelter
Antikörper gegen den Primärantikörper verwendet.
97
Schritt 1
FangAntikörper
Schritt 2
Protein
Schritt 3
Schritt 4
Substrat Produkt
Substrat Produkt
Enzym
SekundärAntikörper
Bild 4.2: Darstellung eines Sandwich-ELISAs
4.2.5.1 Ermittlung der Sättigungskonzentration von Mikrotiterplatten
4.2.5.1.1 Unbeschichtete Mikrotiterplatten
Von HPg und HPg-Fragmenten wird eine ½ -Verdünnungsreihe in PBS hergestellt,
ausgehend von einer Konzentration von 0.5 µg Protein/µl. Je 200 µl der Lösungen wird in
eine der Plattenvertiefungen der Polystyrol-Mikrotiterplatte gegeben. Die Platte wird
98
anschliessend über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen werden 4x mit je 200 µl PBS
gewaschen und danach während 2 h mit je 200 µl Microplate Blocking Buffer bei RT
geblockt. Nach erneutem Waschen mit 4x 200µl PBS werden 200 µl PBS/BSA-Puffer +
sheep anti-HPg-Antikörper (HRP-gekoppelt) 1:5000 zugegeben und die Platte während 1 h
bei RT inkubiert. Nach dem Waschen mit 4x 200 µl PBS werden 200 µl ELISAReaktionspuffer zugegeben. Nach 1 h hat sich die Farbentwicklung (grün) stabilisiert und die
Absorption kann bei 405 nm im Microplate-Reader gemessen werden.
Als Sättigungskonzentration wird die höchste Proteinkonzentration bezeichnet, bei der sich
die Absorption im Vergleich zur Vorgängerkonzentration nicht verändert. Ist für ein
bestimmtes Protein keine solche zu ermitteln, wird diejenige Konzentration als sättigend
bezeichnet, welche bei einem vergleichbaren Protein oder Proteinfragment mit dem gleichen
Absorptionswert eine Sättigung der Plattenoberfläche erreicht hat.
4.2.5.1.2 Ni-NTA-HisSorb™ Plates
Von HPg und HPg-Fragmenten wird eine ½ -Verdünnungsreihe in PBS/BSA-Puffer
hergestellt, ausgehend von einer Konzentration von 0.05 µg Protein/µl. Je 200 µl der Lösung
wird in eine der Plattenvertiefungen gegeben. Die Platte wird anschliessend über Nacht bei
4°C inkubiert. Die Vertiefungen werden 4x mit je 200 µl PBST gewaschen. Danach werden
200 µl PBS/BSA-Puffer + sheep anti-HPg-Antikörper (HRP-gekoppelt) 1:5000 zugegeben
und die Platte während 1 h bei RT inkubiert. Nach dem Waschen mit 4x 200 µl PBST werden
200 µl ELISA-Reaktionspuffer zugegeben. Nach 1 h hat sich die Farbentwicklung (grün)
stabilisiert und die Absorption kann bei 405 nm im Microplate-Reader gemessen werden.
Als Sättigungskonzentration wird die höchste Proteinkonzentration bezeichnet, bei der sich
die Absorption im Vergleich zur Vorgängerkonzentration nicht verändert. Ist für ein
bestimmtes Protein keine solche zu ermitteln, wird diejenige Konzentration als sättigend
bezeichnet, welche bei einem vergleichbaren Protein oder Proteinfragment mit dem gleichen
Absorptionswert eine Sättigung der Plattenoberfläche erreicht hat.
4.2.5.2 ELISA mit Hirnhomogenat
4.2.5.2.1 Unbeschichtete Mikrotiterplatten
Von HPg und HPg-Fragmenten werden Lösungen in der zuvor ermittelten
Sättigungskonzentration in PBS hergestellt. Je 200 µl der Lösungen wird in eine der
Plattenvertiefungen der Polystyrol-Mikrotiterplatte gegeben. Die Platte wird anschliessend
über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen werden 4x mit je 200 µl PBS gewaschen und
danach während 2 h mit je 200 µl Microplate Blocking Buffer bei RT geblockt. Danach
werden 200 µl Assay-Puffer + BSE-negatives oder –positives Hirnhomogenat (maximal 4
µl/Vertiefung) zugegeben und die Platte während 1 h bei RT inkubiert. Nach erneutem
Waschen mit 4x 200µl PBS werden 200 µl PBS/BSA-Puffer + 6H4-Antikörper 1:10´000
zugegeben und die Platte während 1 h bei RT inkubiert. Die Vertiefungen werden 4x mit je
200 µl PBS gewaschen und danach während 40 min mit je 200 µl PBS/BSA-Puffer + goat
anti-mouse-Antikörper (HRP-gekoppelt) 1:10´000 bei RT inkubiert. Nach dem Waschen mit
4x 200 µl PBS werden 200 µl ELISA-Reaktionspuffer zugegeben. Nach 1 h hat sich die
99
Farbentwicklung (grün) stabilisiert und die Absorption kann bei 405 nm im MicroplateReader gemessen werden.
4.2.5.2.2 Ni-NTA-HisSorb™ Plates
Von HPg und HPg-Fragmenten werden Lösungen in der zuvor ermittelten
Sättigungskonzentration in PBS/BSA-Puffer hergestellt. Je 200 µl der Lösungen wird in eine
der Plattenvertiefungen der Polystyrol-Mikrotiterplatte gegeben. Die Platte wird über Nacht
bei 4°C inkubiert und anschliessend 4x mit je 200 µl PBST gewaschen. Danach werden 200
µl Assay-Puffer + BSE-negatives oder –positives Hirnhomogenat (maximal 4 µl/Vertiefung)
zugegeben und die Platte während 1 h bei RT inkubiert. Nach erneutem Waschen mit 4x 200
Antikörper oder Antigene, welche an einfach zu bestimmende Enzyme mit hohem
Substratumsatz kovalent gebunden sind.
PBST werden 200 µl PBS/BSA-Puffer + 6H4-Antikörper 1:10´000 zugegeben und die Platte
während 1 h bei RT inkubiert. Die Vertiefungen werden 4x mit je 200 µl PBST gewaschen
und danach während 40 min mit je 200 µl PBS/BSA-Puffer + goat anti-mouse-Antikörper
(HRP-gekoppelt) 1:10´000 bei RT inkubiert. Nach dem Waschen mit 4x 200 µl PBST werden
200 µl ELISA-Reaktionspuffer zugegeben. Nach 1 h hat sich die Farbentwicklung (grün)
stabilisiert und die Absorption kann bei 405 nm im Microplate-Reader gemessen werden.
100
E. coli Resultate
5. E. coli Resultate
5.1 Kringel 2+3 und Kringel 2+3mut
K23 pQE-8
BamH I
pQE-8
ATG
stop stop
GGATCC
TAATAG GGATCC
MRGS HHHHHH GS IEGR TS E164
His-Tag
BamH I
K2 + K3
pQE-8
S335
FXa
K23
K23 C169G pQE-8
BamH I
pQE-8
ATG
stop stop
GGATCC
MRGS HHHHHH GS IEGR TS E164
His-Tag
BamH I
TAATAG GGATCC
K2 + K3
C169G
pQE-8
S335
FXa
K23 C169G
K23mut pQE-8
pQE-8
ATG
BamH I
BstX I
GGATCC
CCA(N5)NTGG
stop stop
BamH I
TAATAG GGATCC
pQE-8
MRGS HHHHHH GS IEGR TS E164 K2 + K3 C169G C297S S335
His-Tag
FXa
K23mut
Bild 5.1: Konstrukte von Kringel 2+3
K23 pQE-8: Gen von K2 + K3; K23: Protein von K2 + K3 mit His-Tag und FXa-Schnittstelle; K23(C169G)
pQE-8: Gen von K2 + K3 mit der Mutation TGC→GGC; K23(C169G): Protein von K2 + K3 mit der Mutation
C169G, His-Tag und FXa-Schnittstelle; K23mut pQE-8: Gen von K2 + K3 mit den Mutationen TGC→GGC und
GTA→GGA; K23mut: Protein von K2 + K3 mit den Mutationen C169G und C297S, His-Tag und FXaSchnittstelle
Das Plasminogenfragment K23 von Glu164-Ser335 wurde in der Gruppe Schaller kloniert und
charakterisiert (Söhndel, 1995). Dabei wurde die cDNA in den Vektor pQE-8 ligiert, der
bereits mehrfach für die Expression anderer Plasminogenkonstrukte verwendet worden war.
Durch das Plasmid pQE-8 wurde dem Protein eine N-terminale Polyhistidinsequenz („HisTag“) angefügt, wodurch es mittels Ni-NTA-Affinitätschromatografie gereinigt werden
konnte. Ausserdem wurde durch die verwendeten PCR-Primer die Faktor Xa (FXa)Erkennungssequenz Ile-Glu-Gly-Arg eingeführt, was bei Bedarf die Abspaltung des His-Tags
ermöglichen sollte. In vorhergehenden Versuchen (Marti, 1994; Söhndel, 1995) war
101
E. coli Resultate
festgestellt worden, dass die Nähe der FXa-Schnittstelle zur Disulfidbrücke Cys162–Cys243
eine effiziente Abspaltung des Tags verhinderten (Marti, 1994). Deshalb wurden die Codons
für Threonin und Serin N-terminal an die cDNA von K23 angefügt.
Um den Einfluss der Interkringel-Disulfidbrücke Cys169-Cys297 zwischen K2 und K3 zu
untersuchen, sollten die beiden Cysteine durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Serin
führte als Ersatz für Cys169 bei vorgängigen Experimenten an Kringel 2 zu einer schlechten
Proteinausbeute. Bei den Kringeln 1, 3, 4 und 5 nimmt Glycin die Position des zu
mutierenden Cys169 ein; deshalb wurde beschlossen, an dieser Stelle durch Punktmutation die
Aminosäure Glycin einzufügen. An der Position 297 wurde das Cystein durch Serin ersetzt,
da diese Aminosäuren sich chemisch am ähnlichsten sind und in den Sequenzen der anderen
Kringel keine eindeutige Präferenz für eine Aminosäure zu ermitteln war.
Das K23-Konstrukt mit der Mutation Cys169→Gly war schon während der Diplomarbeit
(Schermbach, 2001) hergestellt worden. Nun sollte die zweite Mutation Cys297→Ser
eingeführt werden. Mit der konventionellen „Site Directed-Mutationsmethode“ (zwei
Endprimer, eine Mutations- und ein Mismatch-Primer) konnte trotz vieler Versuche keine
doppelt mutierte K23-DNA (K23mut) hergestellt werden. Deshalb wurde neu die WHOPSMethode angewendet, bei der mit zwei Primern nicht nur die Mutation eingeführt, sondern
gleich das ganze Plasmid amplifiziert wurde. Dadurch entfiel auch die erneute Ligation des
PCR-Produkts in den Vektor. Die Mutationsprimer hatten eine Länge von 48 Basen, wovon
45 genau der Sequenz des Templats entsprachen. Die Primer waren komplementär zur
gleichen Sequenz jeweils auf sense- und antisense-Strang von K23(C169→G) pQE-8 und
trugen die gewünschte Punktmutation TAC→TCC bzw. GTA→GGA.
5.1.1 Molekularbiologie K23mut
5.1.1.1 WHOPS K23mut
Die als Templat dienende Einfachmutante K23(C169→G) pQE-8 wurde aus einer Starterkultur
von XL1-Blue-Zellen (Inkubation über Nacht) mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit isoliert.
Sense-Primer: K3 upper primer
5` – CATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCC TCC AAAAATTTGGATGAA
C297S
G C
AAC – 3`
Antisense-Primer: K3 lower primer
5 `– GTTTTCATCCAAATTTTT GGA GGGGAAGTTTTCTGGTGTCTTGTTATG – 3`
C297S
C G
Bild 5.2: Mutationsprimer für WHOPS von K23mut; rot:Punktmutation, die zum Austausch von Cystein297
gegen Serin führt
102
E. coli Resultate
Die K23mut-DNA wurde mit den Mutationsprimern 1 und 2 amplifiziert. Anschliessend
wurden zur Kontrolle ein Aliquot des PCR-Ansatzes auf einem 2% Agarosegel aufgetrennt.
Es war eine deutliche Bande in der erwarteten Grösse von ungefähr 4 kb (Plasmid: 3427 bp,
Insert 543 bp) zu erkennen; somit konnte davon ausgegangen werden, dass K23mutpQE-8
erfolgreich amplifiziert worden war. Nun wurde dem Ansatz Dpn I zugegeben, um das
parentale Plasmid K23(C169→G) pQE-8 zu verdauen. Die Auftrennung eines Teils des
Restriktionsansatzes auf einem 2% Agarosegel ergab, dass das PCR-Produkt nach wie vor
vorhanden war. Ausserdem waren Banden von kleineren DNA-Fragmenten zu sehen, was auf
einen erfolgreichen Verdau des Templats schliessen liess. Anschliessend wurde ein Aliquot
kompetente TOP10-Zellen mit der K23mut-DNA transformiert. Von zehn der erhaltenen 300
Kolonien wurden Starterkulturen hergestellt, die Plasmid-DNA daraus isoliert und eine
Restriktionsanalyse durchgeführt. Durch Verdau mit BamH I konnte der Insert nachgewiesen
werden. Die während der WHOPS-Reaktion eingeführte Punktmutation erzeugte die einzige
Schnittstelle für BstX I, so dass das mutierte Plasmid durch Verdau mit diesem Enzym
linearisiert wurde (siehe Bild 5.3). Dies war bei allen zehn analysierten Plasmiden der Fall.
Ein Plasmid wurde sequenziert, um das Vorhandensein weiterer Sequenzveränderungen in der
DNA ausschliessen zu können.
unverdaut
1
2
3
mit BstX I verdaut
4
5
M
K
1
2
3
4
5
5000 bp
4000 bp
3000 bp
2000 bp
1650 bp
1000 bp
850 bp
600 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
Bild 5.3: Restriktionsanalyse von K23mut mit BstX I; 1-5: Plasmide aus verschiedenen Kolonien; linke Seite: zu
sehen ist nur die „offene“ Ringform der Plasmide; rechte Seite: durch Verdau mit BstX I werden die Plasmide
linearisiert, wodurch die Einführung der Mutation TAC→TCC nachgewiesen ist; Marker: 1kb plus
Grössenstandard; K: mit BstX I verdaute Lambda-DNA
103
E. coli Resultate
5.1.1.2 Transformation von K23mut in M15(pREP4)
Ein Aliquot kompetente M15(pREP4)-Zellen wurde mit K23mut pQE-8 transformiert. Von
10 der ca. 500 entstandenen Kolonien wurden Starterkulturen (Inkubation über Nacht)
hergestellt und daraus die Plasmid-DNA isoliert. Durch Restriktionsanalyse mit BamH I und
BstX I konnten sämtliche Plasmide als K23mut pQE-8 identifiziert werden. Von den
entsprechenden Kolonien wurden Stammkulturen angefertigt und bei –80°C gelagert.
5.1.2 Proteinchemie
Um die Eigenschaften von K23mut mit denen von K23 vergleichen zu können, wurden von
beiden Konstrukten sowohl Probeexpressionen wie auch Expressionen in Grossansätzen
durchgeführt. K23 pQE-8 lag, wie K23mut pQE-8, im Expressionsstamm M15(pREP4) vor.
5.1.2.1 Testexpression von K23 und K23mut
Von K23 pQE-8 M15(pREP4) und K23mut pQE-8 M15(pREP4) wurde je eine
Testexpression durchgeführt. Die dabei entnommenen Proben wurden aufgearbeitet, mittels
SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membranen geblottet. Durch Färbung der Blots mit
Coomassie-Blau konnte in beiden Fällen eine deutliche Überexpression nachgewiesen werden
(siehe Bild 5.4). Die Proteinbanden von K23 resp. K23mut lagen bei ca. 24 kDa; diese
Verschiebung der Bande zu einer leicht höheren Masse wurde schon bei anderen rekombinant
hergestellten HPg-Fragmenten beobachtet. Durch den immunologischen Nachweis mit einem
anti-HPg-Antikörper konnte gezeigt werden, dass es sich bei den überexprimierten Proteinen
tatsächlich um K23 und K23mut handelte.
M 0
1
K23
2 3
v
n
M
M
0 1
K23mut
2 3
v
n
M
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
20 kDa
15 kDa
Bild 5.4: Coomassie-gefärbte Blots von Proben aus Testexpressionen von K23 und K23mut; M: Marker; 0, 1, 2,
3: Zeitreihe von 0 – 3 h nach Induktion; v, n: Vergleich nicht induzierte (v)/ induzierte (n) Kultur nach 3 h
Inkubation; Pfeil: überexprimiertes Protein
Aus den Zellpellets von 50 ml der induzierten Testexpressionen wurden mit dem Ni-NTA
Spin Kit die Proteine K23 und K23mut isoliert. Jeweils 50 µl der Eluate wurden mittels
104
E. coli Resultate
HPLC aufgetrennt. In den Chromatogrammen konnten bei einer Retentionszeit von jeweils ca.
23 min mehrere einander überlagernde Peaks detektiert werden, welche durch die
inhomogene Rückfaltung der Proteine verursacht wurden. Die den Proteinpeaks
entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und mit dem Speed-Vac getrocknet und
anschliessend durch ESI-MS, Aminosäure- und Sequenzanalyse charakterisiert. Die
gemessenen Massen von 21756.3 Da (K23) resp. 21697.5 Da (K23mut) stimmten recht genau
mit den theoretischen Berechnungen (K23: 21753.1 Da; K23mut: 21692.9 Da) überein; die
Abweichungen waren eine Folge der nicht in allen Molekülen vollständig gebildeten
Disulfidbrücken. Die Sequenzierung des N-Terminus von K23 und K23mut ergab in beiden
Fällen die Folge Met-Arg-Gly-Ser-His-His, was den ersten sechs Aminosäuren des HistidinTags entsprach. Da sowohl Masse als auch Sequenz mit den Erwartungen übereinstimmten,
konnte angenommen werden, dass die Proteine korrekt exprimiert worden waren. Die
Aminosäureanalysen für beide rekombinanten Proteine zeigten eine ausgezeichnete
Übereinstimmung mit den theoretischen Werten bei einer mittleren prozentualen Abweichung
von 0.52 %. Aufgrund der Ergebnisse konnte erwartet werden, dass K23mut auch im
Grossansatz exprimierbar sein würde, wie das schon mit K23 gezeigt worden war (Söhndel,
1995).
5.1.2.2 Isolation von K23 und K23mut aus Grossansätzen
Es wurden Expressionen von K23 pQE-8 M15(pREP4) und K23mut pQE-8 M15(pREP4) im
6 l-Grossansatz durchgeführt. Aus den 6 l-Ansätzen konnten von beiden Stämmen je ca. 12 g
Zellen geerntet werden.
Als erstes wurde versucht, K23 und K23mut mittels Ni-NTA-Agarose zu isolieren und
anschliessend mit Rückfaltungsmethode 1 (2.2.2.5.1) zu renaturieren. Im Chromatogramm der
Isolation über Ni-NTA-Agarose zeigte sich bei der Elution mit GuHCl-Puffer pH 4.5 auch ein
Peak, der auf eine ausreichende Überexpression von beiden Proteinen schliessen liess. Bei der
Rückfaltung mit Methode 1, welches zuvor schon erfolgreich bei anderen Proteinen
angewendet worden war, während der Dialyse wurde aber eine ausgeprägte
Proteinpräzipitation beobachtet. Nach der Entfernung des ausgefallenen Proteins durch
Zentrifugation wurde der Überstand lyophilisiert und charakterisiert. Dabei stellte sich heraus,
dass es sich bei den isolierten Proteinen tatsächlich um K23 bzw. K23mut handelte, dass aber
Ausbeute und Proteingehalt sehr gering (K23: 2mg, 39% Proteingehalt; K23mut 2.5 mg 45%
Proteingehalt) waren.
Um die Ausbeute zu erhöhen, wurde als nächstes eine Rückfaltung im Lysat (2.2.2.1.3b) mit
anschliessender Ni-NTA-Affinitätschromatografie mit dem Äkta prime-System (2.2.2.4.2b)
durchgeführt. Bei K23 funktionierte diese Methode ausgezeichnet, es konnten aus 6 l
Expression 25 mg Protein mit einer Masse von 21754.06 ±1.5 Da (theoretische Masse:
21753.2 Da) und einem Gehalt von 49.7% isoliert werden. Auch K23mut wurde nach dieser
Methode renaturiert. Im RP-HPLC-Chromatogramm einer nach der Rückfaltung
entnommenen Probe erschien nach der Rückfaltung ein zusätzlicher Peak bei einer
Retentionszeit von 21.17 min (siehe Bild 5.5). Die Untersuchung mittels ESI-MS und
Sequenzanalyse ergab, dass es sich dabei um ein N-terminales Fragment von K23mut einer
Masse von 7022 Da handelte. Es war also davon auszugehen, dass K23mut bei der
Rückfaltung im Lysat durch Proteasen angegriffen wurde; dies konnte auch durch Zugabe von
Proteaseninhibitoren zum Lysat nicht verhindert werden. Die Proteinausbeute wurde
vermutlich durch diese Fragmentierung stark herabgesetzt und betrug 3 mg K23mut aus 3 l
mit einem Gehalt von 46% .
105
E. coli Resultate
DAD1 A, Sig=214,10 Ref=450,80 (MONIKA\K23MUT05.D)
23.211
mAU
1750
1500
1250
1000
750
4.912
250
21.172
500
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
min
Bild 5.5: RP-HPLC-Chromatogramm von K23mut nach der Rückfaltung im Lysat; Gradient: 0-100% RP-HPLCLaufmittel B in A in 60 min, Flussrate 0.3 ml/min; gut sichtbar ist der kleinere Peak, welcher durch ein
Abbauprodukt von K23mut verursacht wird; Retentionszeiten: 21.17 resp. 23.21 min
In einem dritten Ansatz wurde das Protein erneut mittels Ni-NTA-Affinitätschromatografie
isoliert; dabei wurde allen GuHCl-Puffern 10 mM β-Mercaptoethanol zugegeben, um das
Protein zu reduzieren und somit den Hexahistidin-Tag vollständig zugänglich zu machen.
Dadurch sollte die Grundausbeute an K23mut erhöht werden. Mit einer neuen
Renaturierungsmethode (2.2.2.5.1, Methode 2) konnte die Effizienz der Rückfaltung
dramatisch gesteigert werden. Während der 24-stündigen Inkubation mit Glutathion-haltigem
Puffer und der anschliessenden Dialyse war keinerlei Proteinpräzipitation sichtbar. Bei der
Auftrennung von während dieser Zeit entnommenen Proben mittels RP-HPLC konnte die
Rückfaltung von K23mut verfolgt werden (siehe Bild 5.6); die Retentionszeit des anfänglich
heterogen strukturierten Proteins wurde durch das Einnehmen der Nativkonformation
verkürzt. Es resultierte ein einzelner symmetrischer Peak mit Retentionszeit 23.42 min.
mAU
700
600
500
400
300
200
100
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
min
Bild 5.6: RP-HPLC-Chromatogramm bei 280 nm von K23mut in unterschiedlichen Phasen der Rückfaltung;
Bedingungen siehe Bild 5.5; durchgezogene Linie: nach 1 h Rühren im Rückfaltungspuffer; langgestrichelte
Linie: Nach 6 h Rühren im Rückfaltungspuffer; gepunktete Linie: nach 24 h Rühren im Rückfaltungspuffer
106
E. coli Resultate
Da aufgrund der schwachen Lysinaffinität der funktionellen LBS des Kringels 2 keine
Reinigung von K23 und K23mut mittels Lys-Bio-Gel möglich war, wurden die Proteine über
eine G75 sf-Säule chromatografiert. Die dem K23-/K23mut-Proteinpeak entsprechenden
Fraktionen wurden gesammelt, lyophilisiert und mittels ESI-MS (siehe Bild 5.7), Amino- und
Sequenzanalyse charakterisiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle xxx dargestellt.
Die Proteine K23 und K23mut wurden bei 4°C gelagert und anschliessend zur Untersuchung
der Interaktion von HPg-Fragmenten mit dem Prion-Protein verwendet.
20-Apr-2004
13:41:30
K23 nach G75 sf
K23 G75 1 (1.240) Sm (Mn, 2x40.89); Tr (300:1500,0.13,Low); Sb (11,33.00 )
100
Schaller
Proteinanalytik
Platform
Scan ES+
1.17e7
A
21754.63
A:
21754.06±1.51
%
22060.13
21264.75
0
16000
17000
18000
19000
20000
20-Apr-2004
14:02:18
21000
22370.75
22000
23000
24000
25000
26000
27000
K23mut Pool nach G75 sf
mass
28000
Schaller
Proteinanalytik
Platform
K23 POOL G75 1 (1.242) Sm (Mn, 2x27.53); Tr (300:1500,0.13,Low); Sb (11,33.00 )
A
100
21694.13
Scan ES+
2.75e7
A:
21693.70±1.81
%
21790.25
22307.50
21298.13
0
16000
17000
18000
19000
20000
21000
22000
23000
24000
25000
26000
27000
mass
28000
Bild 5.7: ESI-MS-Spektren von K23 (oben) und K23mut (unten) aus Grossansätzen; gemessene Massen:
21754.1 ± 1.5 Da (K23), 21693.7 ±1.8Da (K23mut); theoretische Werte: 21753.1 Da (K23), 21692.9 Da
(K23mut)
107
E. coli Resultate
Tabelle 5.1: Zusammenfassung der analytischen Resultate
K23
K23mut
Rohausbeute
Proteingehalt
Ausbeute an reinem Protein
25 mg
49.7%
11.43 mg
19 mg
46.6%
8.85 mg
RP-HPLC:
Retentionszeit der
gesammelten Proteinpeaks
23.17 min
24.85 min
ESI-MS:
theoretische Masse
gemessene Masse
21753.1 Da
21754.1 ± 1.5 Da
21692.9 Da
21693.7 ± 1.8 Da
Sequenzanalyse:
theoretische Sequenz
bestimmte Sequenz
MRGSHH
MRGSHH
MRGSHH
MRGSHH
Aminosäureanalyse:
Abweichung mol AA/mol Protein
prozentuale Abweichung
0.72
0.4%
0.58
0.3%
5.2 Kringel1FXa und Kringel1Fxamut
K1FXa pQE-8
BamH I
pQE-8
ATG
stop stop
GGATCC
MRGS HHHHHH GS IEGR M K78
His-Tag
BamH I
TAATAG GGATCC
K1
pQE-8
E163
FXa
K1FXa
K1FXamut pQE-8
BamH I
pQE-8
ATG
stop stop
GGATCC
TAATAG GGATCC
MRGS HHHHHH GS IEGR M K78
His-Tag
BamH I
K1
D139A
pQE-8
E163
FXa
K1FXamut
Bild 5.8: Konstrukte von Kringel 1
K1FXa pQE-8: Gen von K1; K1FXa: Protein von K1 mit His-Tag und FXa-Schnittstelle; K1FXamut pQE-8:
Gen von K1 mit der Mutation GAT→GCT; K1FXamut: Protein von K1 mit der Mutation D139A, His-Tag und
FXa-Schnittstelle
108
E. coli Resultate
Um untersuchen zu können, ob die Affinität von PrPSc auf einer Bindung des Prion-Proteins
an die Lysinbindungsstellen von HPg beruht, wurde ein Kringel 1-Konstrukt (Met-Lys78Glu164) hergestellt, bei dem die Lysinbindungsstelle durch die Mutation Asp139→Ala
inaktiviert worden war. K1 wurde deshalb ausgewählt, weil die Lysin-Affinität dieses
Kringels am grössten ist. Ein allfälliger Unterschied in der PrP-Bindungseingeschaft zwischen
nativem und mutiertem Protein würde deshalb möglichst gross ausfallen. Bei früheren
Expressionen von K1 ohne Affinitätstag (rK1, Marti, 1994) wurde dem Konstrukt ein Nterminales Methionin als Startcodon angehängt. Dieses wurde auch bei K1FXa belassen, um
einen eventuellen späteren Vergleich zwischen den rekombinant hergestellten Proteinen rK1,
K1FXa und K1FXamut möglich zu machen. Bei der Expression von rK1 ohne HexahistidinTag konnte gezeigt werden, dass diese zusätzliche Aminosäure keinen Einfluss auf die
Faltung und demzufolge auf die Lysinbindungsstellen des Proteins hat (Marti, 1994).
Dazu musste die cDNA von K1 zuerst in den Vektor pQE-8 kloniert werden, wodurch dem
Protein ein N-terminaler Hexahistidin-Tag angehängt wurde. Dies war deshalb notwendig,
weil der mutierte K1 wegen der nun inaktivierten LBS nicht mehr durch LysinAffinitätschromatografie isoliert werden konnte und deshalb auf Ni-NTAAffinitätschromatografie ausgewichen werden musste. Zwischen Affinitätstag und Protein
wurden ausserdem eine FXa-Erkennungssequenz eingeführt, wodurch nach der Expression der
Affinitätstag durch Verdau mit diesem Enzym entfernt werden kann. Anschliessend wurde die
Punktmutation GAT→GCT durch WHOPS eingeführt, was im exprimierten Protein zum
Austausch von Asp139 gegen Ala führte.
5.2.1 Molekularbiologie
5.2.1.1 PCR K1FXa
Sense-Primer: HisMetK1 5’
5` – GC GGATCC ATCGAGGGTAGA ATGAAAGTGTATCTCTCAGAGT – 3`
BamH I FXa-Schnittstelle
Met Lys Val Tyr Leu Ser Glu
Antisense-Primer: HisMetK1 3’
5 `– GC GGATCC CTATTA CTCTTCACACTCAAGAATGTC – 3`
BamH I stop stop Glu Glu Cys Glu Leu Ile Asp
Bild 5.9: PCR-Primer für K1FXa; schwarz unterstrichen: BamH I-Schnittstelle für die Klonierung in pQE-8;
blau: FXa-Erkennungssequenz; rot: Stopcodons
Das als Templat dienende Plasmid pPLGKG, welches die cDNA von HPg beinhaltet, wurde
aus einer Starterkultur von HB 101 –Zellen (Inkubation über Nacht) mit dem QIAprep® Spin
Miniprep Kit isoliert und mit Hind III linearisiert, um die DNA für die Primer zugänglicher zu
machen.
Die DNA von Kringel 1 wurde amplifiziert. Anschliessend wurde das Produkt auf einem 2%
Agarosegel analysiert (siehe Bild 5.10). Um Primerdimere und das Templat-Plasmid zu
109
E. coli Resultate
entfernen, wurde der gesamte PCR-Ansatz auf einem 2% Agarosegel aufgetrennt, die
gewünschte Bande ausgeschnitten und die amplifizierte DNA mit dem MinElute™ Gel
Extraction Kit aus dem Gelstück isoliert.
M
PCR
1650 bp
1000 bp
850 bp
600 bp
500 bp
400 bp
300 bp
PCR-Produkt
200 bp
100 bp
Bild 5.10: PCR-Produkt K1FXa, Länge 298 bp; Marker: 1 kb plus Grössenstandard
5.2.1.2 Ligation, Transformation von K1FXa in TOP10
Das Plasmid pQE-8 wurde aus einer Starterkultur von LR2/168-Zellen (Inkubation über
Nacht) mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit isoliert, mit BamH I linearisiert und
anschliessend dephosphoryliert. Der Ansatz wurde danach zur Reinigung auf einem
Agarosegel aufgetrennt und das Plasmid mit dem MinElute™ Gel Extraction Kit isoliert. Auch
das PCR-Produkt K1 wurde mit BamH I verdaut und anschliessend mittels AgaroseGelelektrophorese gereinigt. Der Ligationsansatz mit Plasmid und Amplifikat K1 wurde über
Nacht bei 16°C inkubiert, um der T4 DNA-Ligase Zeit zu geben, die beiden DNA-Fragmente
zu verbinden. Ein Aliquot kompetente TOP10-Zellen wurden mit dem Ligationsprodukt
transformiert. Von zehn der erhaltenen 110 Kolonien wurde eine Starterkultur angesetzt, die
Plasmide mittels QIAprep® Spin Miniprep Kit isoliert und eine Restriktionsanalyse
durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass zwar drei Plasmide den Insert enthielten, aber nur bei
einem die K1-DNA in der korrekten Richtung integriert worden war. Das Konstrukt K1FXa
pQE-8 wurde anschliessend von der Firma Microsynth (Balgach, SG) sequenziert, um das
Vorhandensein unerwünschter Mutationen ausschliessen zu können.
5.2.1.3 PCR WHOPS, Transformation von K1FXa mut in TOP10
Um das Konstrukt K1FXamut pQE-8 zu erhalten, musste eine Punktmutation in K1
eingeführt werden, die im exprimierten Protein zum Austausch Asp139→Ala führt; diese
Mutation soll die LBS in Kringel 1 inaktivieren. Die Mutationsprimer 1 und 2 hatten eine
Länge von jeweils 35 Basen, wovon 34 komplementär zur Matrize waren. Die Primer waren
komplementär zur gleichen Sequenz jeweils auf sense- und antisense-Strang von K1 pQE-8
110
E. coli Resultate
und trugen die gewünschte Punktmutation GAT→GCT bzw. ATC→AGC. Während der
Zyklen des PCR-Programms hybridisierten die Primer mit dem Templat und wurden durch
die Polymerase verlängert. Es entstand ein mutiertes Plasmid mit gestaffelten
Strangöffnungen, welche nach Entfernen des parentalen Plasmids und der Transformation in
E. coli durch die Zellen repariert wurden.
Sense-Primer: HisMetK1mut for2
5` – AGGAATCCAGACAAC GCT CCGCAGGGGCCCTGGTG – 3`
Arg Asn Pro Asp Asn D139A Pro Gln Gly Pro Trp
A C
Antisense-Primer: HisMetK1mut rev2
5 `– CACCAGGGCCCCTGCGG AGC GTTGTCTGGATTCCT – 3`
Trp Pro Gly Gln Pro D139A Asn Asp Pro Asn Arg
T G
Bild 5.11: : Mutationsprimer für WHOPS von K1FXamut; rot:Punktmutation, die zum Austausch von
Aspartat139 gegen Alanin führt
Als Templat diente das vorgängig hergestellte Konstrukt K1FXa pQE-8. Das
Temperaturzyklen-Programm wurde wie beschrieben durchgeführt. Nach dem Ende des PCRProgramms wurde ein Aliquot des Reaktionsansatzes auf einem Agarosegel aufgetrennt, um
den Erfolg der Amplifikation zu überprüfen, da ein Weiterfahren nur sinnvoll war, wenn das
PCR-Produkt in der erwarteten Grösse auf dem Gel vorhanden war. Tatsächlich war in der
Höhe von etwa 4 kb eine Bande zu sehen, was ungefähr der Grösse von Plasmid (3427 bp)
mit Insert (295 bp) entsprach. Nach Verdau des parentalen Plasmids mit Dpn I wurde
nochmals eine Probe mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die DNA-Bande bei 4kb
war nach wie vor vorhanden, zusätzlich dazu weitere Banden, verursacht durch kleinere
DNA-Fragmente. Dies liess darauf schliessen, dass sowohl die PCR-Reaktion wie auch der
Verdau des Templats erfolgreich waren.
Ein Aliquot kompetente TOP10-Zellen wurde mit der neu synthetisierten DNA transformiert.
Von zehn der erhaltenen 40 Kolonien wurde eine Starterkultur hergestellt, die Plasmid-DNA
daraus isoliert und mit Dpn I eine Restriktionsanalyse durchgeführt. Durch die Mutation
entstand im Plasmid eine zusätzliche Dpn I-Schnittstelle, so dass durch den Verdau der DNA
mit diesem Enzym nachgewiesen werden konnte, ob die Punktmutation vorhanden war oder
nicht (siehe Bild 5.12). Von den zehn analysierten Plasmiden enthielt nur einer die Mutation.
Die DNA wurde zur Überprüfung auf unerwünschte Mutationen hin durch die Firma
Microsynth (Balgach, SG) sequenziert.
111
E. coli Resultate
1
2
3
4
5
M
6
7
8
9
10
2000 bp
1650 bp
1000 bp
850 bp
600 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
Bild 5.12: Restriktionsanalyse von K1Fxamut aus verschiedenen Kolonien (1-10) mit Dpn I; Fragment ohne
Mutation GAT→GCT: 258 bp; Fragmente mit Mutation GAT→GCT: 233 bp, 258 bp; nur Plasmid 3 enthält
die gewünschte Mutation; Marker: 1 kb plus Grössenstandard
5.2.1.4 Transformation von K1FXa und K1FXamut in M15(pREP4)
Je ein Aliquot kompetente M15(pREP4)-Zellen wurden mit K1FXa pQE-8 resp. K1Fxamut
pQE-8 transformiert. Von jeweils vier der entstandenen Kolonien wurde eine Starterkultur
hergestellt, mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit die Plasmide daraus isoliert und die
erhaltene DNA durch eine Restriktionsanalyse überprüft, wodurch alle isolierten Plasmide als
K1FXamut pQE-8 identifiziert werden konnten.
5.2.2 Proteinchemie
5.2.2.1 Testexpression von K1FXa und K1FXamut
Von den beiden Konstrukten K1FXa pQE-8 und K1FXamut pQE-8 wurden Testexpressionen
durchgeführt. Die mittels Ni-NTA Spin Kit aus den Pellets von 50 ml induzierter Kultur
isolierten Proteine wurden durch RP-HPLC aufgetrennt. In den RP-HPLC-Chromatogrammen
von K1FXa und K1FXamut waren bei 23 min mehrere sich überlagernde Peaks zu sehen.
Dies war schon bei anderen rekombinant hergestellten HPg-Fragmenten der Fall gewesen und
wies auf eine Überexpression und inhomogene Rückfaltung der beiden Konstrukte hin. Um
die Proteine charakterisieren zu können, wurden die den Peaks bei Retentionszeit 23 min
entsprechenden Fraktionen gesammelt und im Speed-Vac getrocknet. Mittels ESI-MS wurde
für K1FXa eine Masse von 12021.2 Da, für K1FXamut eine Masse von 11976.7 Da bestimmt.
112
E. coli Resultate
Diese wichen nur geringfügig von den theoretischen Massen von 12021.2 Da resp. 11977.3
Da ab, so dass angenommen werden konnte, dass die Proteinexpression korrekt stattgefunden
hatte.
Die bei den Testexpressionen entnommenen Proben wurden aufgearbeitet, mittels SDS-PAGE
aufgetrennt und auf PVDF-Membranen geblottet. Durch Färbung der Blots mit CoomassieBlau konnte in beiden Fällen eine schwach ausgeprägte Überexpression nachgewiesen werden
(siehe Bild 5.13). Die apparente Masse von K1FXa und K1FXamut lag bei ca. 15 kDa; diese
Verlagerung zu höherer Masse ist bei HPg-Konstrukten schon mehrmals festgestellt worden.
Trotzdem konnte Aufgrund der Resultate von Blot, RP-HPLC und ESI-MS konnte davon
ausgegangen werden, dass die Proteine zwar in geringer Menge, aber korrekt exprimiert
wurden.
K1FXa
M
0
1
2
3
K1FXAmut
v
n
M M
0
1
2
3
v
n
M
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
20 kDa
15 kDa
10 kDa
Bild 5.13: Coomassie-gefärbte Blots von Proben aus Testexpressionen von K1FXa und K1FXamut; M: Marker;
0, 1, 2, 3: Zeitreihe von 0 – 3 h nach Induktion; v, n: Vergleich nicht induzierte (v)/ induzierte (n) Kultur nach 3
h Inkubation; Pfeil: überexprimiertes Protein
5.2.2.2 Isolation von K1FXa und K1FXamut aus Grossansätzen
Von K1FXa pQE-8 M15(pREP4) oder K1FXamut pQE-8 M15(pREP4) wurden Expressionen
im 2 l-Ansatz durchgeführt. Aus den 2 l-Ansätzen konnten von beiden Stämmen je ca. 5 g
Zellen geerntet werden.
Es wurde versucht, beide Proteine mittels Rückfaltung im Lysat zu renaturieren und
anschliessend
mittels
Lysin-Affinitätschromatografie
(K1FXa)
bzw.
Ni-NTAAffinitätschromatografie und Gelfiltration auf einer G75 sf-Säule (K1FXamut) zu reinigen.
Die K1FXamut-Ausbeute betrug 5 mg mit einem Proteingehalt von 54.1%; die mittels ESIMS bestimmte Masse betrug 1198.5 ± 2.4 Da. Die Abweichung von der theoretischen Masse
von K1FXamut 11977.3 Da war damit so gross, dass die korrekte Rückfaltung des Proteins
als nicht gesichert erschien. Die korrekte Konformation ist aber essentiell für die
Weiterverwendung von K1FXamut in anschliessenden Interaktionsassays mit Prionen.
Auch die Renaturierung von K1FXa im Gesamtlysat war nicht erfolgreich. Bei der Isolation
des zurückgefalteten Proteins mit Lys-Bio-Gel war bei der Elution mit 0.2 M 6-AHA im
Chromatogramm nur ein sehr kleiner Peak sichtbar. Die Proteinausbeute nach der
Lyophilisation der gesammelten Fraktion war derart gering (ca. 200 µg), dass von einer
113
E. coli Resultate
weiteren Analyse abgesehen wurde. Die erhaltenen Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die
Renaturierungsmethode ineffizient war und deshalb davon ausgegangen werden musste, dass
auch K1FXamut nicht in der gewünschten Nativkonformation vorlag.
Aufgrund dieser Resultate wurde beschlossen, die überexprimierten Proteine erneut mittels
denaturierender Ni-NTA-Affinitätschromatografie zu isolieren, aber die Bedingungen der
darauffolgenden Rückfaltung zu ändern. Die Zellen aus jeweils einem 6 l-Grossansatz von
K1FXa resp. K1FXamut (je 12 g Zellen) wurden in GuHCl-Puffer lysiert und anschliessend
zentrifugiert, um die Zelldebris abzutrennen. Der Überstand wurde auf eine vorbereitete NiNTA-Säule geladen und K1FXa/K1FXamut mit GuHCl-Puffer pH 4.5 eluiert. Die eluierten
Proteine wurden nach dem verbesserten Rückfaltungsprotokoll renaturiert. Dabei wurden die
Konzentrationen von oxidiertem und reduziertem Glutathion im Rückfaltungspuffer von je
1.25 mM auf 5 mM erhöht, ausserdem wurde das Volumen des zugetropften
Renaturierungspuffers vervierfacht. Dadurch konnte das denaturierende Agens stark verdünnt
werden, während das Protein in der Lösung stabilisiert wurde. Um die Proteinpräzipitation
während der Dialyse auf ein Minimum zu reduzieren, wurde die GuHCl-Konzentration im
Dialysepuffer langsam reduziert, indem jeweils ein kleiner Volumenanteil durch 50 mM Tris
Acetat-Puffer ersetzt wurde. Die optimale Lösung wäre die Verwendung von zwei Pumpen,
von denen die eine GuHCl-haltigen Dialysepuffer wegleitet und die andere Tris Acetat-Puffer
zupumpt, so dass eine kontinuierliche Absenkung des GuHCl-Gehalts gewährleistet ist. Trotz
dieser Massnahmen wurde eine geringe Proteinpräzipitation beobachtet. Ein Teil davon wurde
in GuHCl-Lysepuffer gelöst und mittels RP-HPLC analysiert (siehe Bild 5.14). Dabei stellte
sich heraus, dass nur wenig überexprimiertes Protein im Präzipitat vorhanden war; der
Hauptanteil an ausgefallenem Protein bestand aus mitisolierten E. coli-Proteinen.
Bild 5.14 : RP-HPLC-Chromatogramme bei 280 nm von Überstand (oben) und Präzipitat (unten) des
Rückfaltungsansatzes von K1FXa nach der Dialyse; Bedingungen siehe Bild 5.5
Nach Ende der Dialyse wurden die Proteinlösungen von K1Fxa und K1Fxamut zentrifugiert
und der Überstand lyophilisiert. Das Lyophilisat von K1FXa wurde in 50 mM Tris AcetatPuffer pH 8.0 gelöst und auf eine konditionierte Lys-Bio-Gel-Säule geladen. Das gebundene
114
E. coli Resultate
Protein wurde mit 50 mM Tris Acetat-Puffer pH 8.0 + 0.2 M 6-AHA eluiert. Aus dem
Chromatogramm war ersichtlich, dass zwar während des Ladens ein gewisser Anteil an
Protein nicht an das Säulenmaterial adsorbiert hatte, dass aber trotzdem ungleich mehr Protein
isoliert werden konnte als beim Ansatz mit Rückfaltung im Gesamtlysat. Je eine Probe von
Durchfluss und Eluat der Lys-Bio-Gel-Säule wurden mittels RP-HPLC analysiert (siehe Bild
5.15). Dabei stellte sich heraus, dass im Durchfluss kein K1FXa mehr vorhanden war;
offenbar waren alle K1FXa-Moleküle korrekt renaturiert worden. Das Eluat wurde gegen H20
pH 3.5 (eingestellt mit Ameisensäure) dialysiert und anschliessend lyophilisiert. Bei der
Aufnahme des Massenspektrums mit ESI-MS konnte ausser der Masse von 12019.2 ± 0.3 Da,
die dem renaturierten Protein entsprach, auch zwei weitere Massen, 11991.1 Da
(Proteinmasse – 28 Da, Anteil ca. 30%) und 11963.3 Da (Proteinmasse – 2x28 Da, Anteil ca.
10%) bestimmt werden. Diese stammten vermutlich von der Verunreinigung, die als Schulter
des K1FXa-Proteinspeaks im RP-HPLC-Chromatogramm sichtbar war. Es war zu vermuten,
dass es sich dabei um verkürzte, aber korrekt gefaltete K1FXa-Moleküle handelte, da sie
auch durch Affinitätschromatografie mit Ly-Bio-Gel nicht entfernt werden konnten. Die
Sequenzanalyse ergab die erwartete Folge MRGSHH, was den ersten sechs Aminosäuren des
Hexahistidin-Tags von K1FXa entsprach. Die Resultate der Aminosäureanalyse zeigten eine
gute Übereinstimmung mit den theoretischen Werten und ergaben einen Proteingehalt von
64.32%. Die Analysenergebnisse liessen darauf schliessen, dass das Protein die Nativstruktur
einnahm und in ausreichender Reinheit für die nachfolgenden Versuche mit Prion-Proteinen
vorlag.
Bild 5.15: RP-HPLC-Chromatogramme vbei 280 nm von Durchfluss (oben) und Eluat (unten) der Lys-Bio-GelSäule bei der Isolation von K1FXa; Bedingungen siehe Bild 5.5; Retentionszeit: 22.46 min; die Mehrfachpeaks
wurden durch eine Kapazitätsüberschreitung des Detektors verursacht,
Da K1FXamut aufgrund der disfunktionellen Lysinbindungsstelle nicht durch
Affinitätschromatografie mit Lys-Bio-Gel gereinigt werden konnte, wurde das Lyophilisat in
115
E. coli Resultate
0.13 M Ameisensäure gelöst und eine Gelfiltration mit G75sf-Sepharose durchgeführt. Die
dem Proteinpeak entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert.
Anschliessend wurde das Protein mit RP-HPLC (siehe Bild 5.16), ESI-MS (siehe Bild 5.17),
Aminosäure- und Sequenzanalyse charakterisiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5.2
dargestellt. Aufgrund der guten Übereinstimmung der Analysenresultate mit den
theoretischen Werten und der nachgewiesenen korrekten Struktur von K1FXa konnte davon
ausgegangen werden, dass auch K1FXamut richtig renaturiert worden war und somit für die
Untersuchung der Interaktion mit Prion-Proteinen weiterverwendet werden kann.
Die Proteine K1FXa und K1FXamut wurden bis zur Weiterverwendung bei –20°C gelagert.
A22.509
re
a:
26
84
6.
6
mAU
1000
800
600
400
200
0
5
10
15
20
25
30
35
min
Bild 5.16: RP-HPLC-Chromatogramm bei 280 nm von K1mut nach G75 Sf; Bedingungen siehe Bild 5.5;
Retentionszeit 22.509 min
K1FXa
K1FXamut
Rohausbeute
Proteingehalt
21 mg
64.32%
13.50 mg
30 mg
49.5%
14.85 mg
HPLC:
gesammelte Proteinpeaks
22.468 min
22.509 min
ESI-MS:
theoretische Masse
gemessene Masse
12021.2 Da
12019.2 ± 0.3 Da
11977.3 Da
11980.50 ± 2.4 Da
Sequenzanalyse:
bestimmte Sequenz
MRGSHH
MRGSHH
MRGSHH
MRGSHH
Aminosäureanalyse:
0.34
0.34
0.43
0.43
116
E. coli Resultate
1 4 -O c t-2 0 0 4
1 6 : 2 8 :0 6
K 1 in C H 3 C N /H 2 O 1 : 1 (v /v /) + 0 .5 % H C O O H
M O N IK A 3 1 (1 .2 5 6 ) S m (M n , 2 x 1 7 .8 2 ); T r (6 0 0 :2 0 0 0 ,0 .1 3 ,L o w )
100
S c h a lle r
P r o te in a n a ly tik
P la tfo r m
Scan ES+
5 .6 4 e 7
A
1 2 0 1 9 .1 3
A:
B:
1 2 0 1 9 .1 9 ± 0 .3 0
1 1 9 9 1 .2 4 ± 0 .3 4
%
B
1 1 9 9 1 .1 3
1 1 9 6 3 .3 8
0
10000
10250
10500
10750
11000
11250
11500
2 0 -A p r-2 0 0 4
1 5 :1 3 : 3 5
11750
12000
1 2 1 1 6 .7 5
12250
12500
12750
13000
13250
13500
13750
K 1m ut nach G 75 sf
K 1 M U T G 7 5 1 (1 .2 2 3 ) S m (M n , 2 x 3 4 .0 6 ); T r (6 0 0 :2 0 0 0 ,0 .1 3 ,L o w )
100
m ass
14000
S c h a lle r
P la tfo r m
S can E S +
5 .3 2 e 7
A
1 1 9 8 1 .3 8
A:
1 1 9 8 0 .5 0 ± 2 .3 6
%
0
10000
10250
10500
10750
11000
11250
11500
11750
12000
12250
12500
12750
13000
13250
13500
13750
m ass
14000
Bild 5.17: ESI-MS-Massenspektren von K1FXa (oben) und K1Fxamut aus Grossansätzen; gemessene Massen:
12019.1 ± 0.3 Da, 11991.1 ± 0.3 Da Da (Anteil 30%), 11963.3 Da± 0.3 Da (Anteil 10%) (K1FXa), 11980.5 ±
2.4 Da (K1Fxamut); theoretische Werte: 12021.2 Da (K1FXa),11977.3 Da (K1FXamut)
5.3 K4FXa und rK4
5.3.1 Molekularbiologie K4FXa
Schon mehrmals war erfolglos versucht worden, die cDNA von Kringel 4 in Vektoren wie
pET-9a oder pAR3038 zu klonieren. Die PCR-Amplifizierung des Genabschnitts konnte zwar
jedesmal problemlos durchgeführt werden, doch es war nicht möglich, das Reaktionsprodukt
anschliessend in ein Plasmid einzufügen, obschon dies bei anderen Konstrukten unter
gleichen oder ähnlichen Bedingungen auf Anhieb gelungen war. Deshalb wurde beschlossen,
das Champion™ pET Directional TOPO® Expression Kit zu verwenden. Das darin enthaltene
Plasmid pET100/D-TOPO® besitzt im Vergleich zu anderen pET-Vektoren einen optimierten
117
E. coli Resultate
T7-Promotor und eine verbesserte Ribosomenbindungsstelle. Des weiteren besitzt pET100/DTOPO die besondere Eigenschaft, dass es mit jedem ungeschnittenen PCR-Produkt ligiert
werden kann, wenn dieses an seinem N-Terminus die Nukleotidsequenz CACC aufweist.
Durch Ligation der cDNA in diesen Vektor wird dem rekombinanten Protein an seinem Nterminalen Ende ein Hexahistidin-Tag angefügt, wodurch das Expressionsprodukt
anschliessend durch Ni-NTA-Affinitätschromatografie isoliert werden kann. Das Plasmid
enthält ausserdem eine Enterokinase-Schnittstelle, mit welcher der His-Tag später entfernt
werden kann. Da dabei fünf konstruktfremde Aminosäuren am N-Terminus des Proteins
zurückbleiben und die Enterokinase Proteine oft auch an unspezifischen Stellen fragmentiert,
wurde zwischen His-Tag und K4-DNA eine Fxa-Schnittstelle eingefügt, wodurch diese
Probleme umgangen werden konnten.
K4FXa pET100/D-TOPO®
Pst I
pET100/ ATG
D-TOPO
M
CACC
HHHHHH
His-Tag
stop stop
CTGCAG
IEGR V355
K4
BamH I
TAATAG GGATCC
pET100/
D-TOPO
A440
FXa
K4FXa
Figur 5.18: Konstrukt von Kringel 4
K4FXa pET100/D-TOPO®: Gen von K4; K4FXa: Protein von K4 mit His-Tag und FXa-Schnittstelle
5.3.1.1 PCR K4FXa
Sense-Primer: TOPO K4 2
5` – CACC ATCGAGGGTAGAG TCCAGGACTGCTAC – 3`
TOPO FXa-Schnittstelle
Antisense-Primer: TOPO K4 3
5 `– ATG CTATTA CGCTTCTGTTCCTGA – 3`
stop stop
Figur 5.19: PCR-Primer für K4FXa; grün: Sequenz für Directional Cloning in pET100/D-TOPO®; blau: FXaErkennungssequenz; rot: Stopcodons
Das als Templat dienende Plasmid pPLGKG, welches die cDNA von Plasminogen enthält,
war schon vorgängig isoliert und linearisiert worden. Die K4-cDNA wurde mit den Primern
TOPO K4 2 und TOPO K4 3 amplifiziert. Zur Überprüfung der Reaktionseffizienz wurden
ein Aliquot des Ansatzes auf einem 2% Agarosegel aufgetrennt. Das PCR-Produkt war auf
der erwarteten Höhe von ca. 300 bp als intensive Bande zu sehen (siehe Bild 5.20). Die DNA
wurde aus dem Gel ausgeschnitten und mittels MinElute™ Gel Extraction Kit isoliert.
118
E. coli Resultate
M
PCR
3000 bp
2000 bp
1650 bp
1000 bp
850 bp
600 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
PCR-Produkt
Fehlbande
100 bp
Bild 5.20: PCR-Produkt von K4FXa; Länge 282 bp; Marker: 1 kb plus Grössenstandard
5.3.1.2 Ligation von K4FXa in pET100/D-TOPO® und Transformation in
Top10-Zellen
Die Ligation wurde nach TOPO Directional Cloning-Anweisung durchgeführt. Ein Aliquot
kompetente TOP-10-Zellen wurden mit 3 µl des Ligationsansatzes transformiert. Von acht der
entstandenen Kolonien wurden Starterkulturen hergestellt und die Plasmide mit dem
QIAprep® Miniprep Spin Kit daraus isoliert. Eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Pst I
ergab, dass alle Plasmide die K4-DNA in der korrekten Richtung enthielten. Anschliessend
wurde eines der Konstrukte sequenziert, um unerwünschte Mutationen ausschliessen zu
können.
5.3.1.3 Transformation von K4FXa pET100/D-TOPO® in BL21 Star™(DE3)
Ein Aliquot kompetente BL21Star-Zellen wurden mit 1 µl K4Fxa pET100/D-TOPO®
transformiert. Aus den Starterkulturen von vier der erhaltenen Kolonien wurden die Plasmide
isoliert und erneut mittels Restriktionsanalyse untersucht, wodurch alle Plasmide als K4Fxa
pET100/D-TOPO® identifiziert werden konnten.
5.3.2 Proteinchemie K4FXa
5.3.2.1 Proteinchemie K4FXa in BL21 Star™(DE3)
Von K4Fxa pET100/D-TOPO® BL21 Star wurde eine Kleinexpression durchgeführt. Die
entnommenen Proben wurden aufgearbeitet und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach dem
Proteintransfer auf eine PVDF-Membran wurde der Blot mit Coomassie gefärbt. Darauf war
119
E. coli Resultate
eine mit der Zeit intensiver werdende Bande auf der Höhe von ca. 16 kDa zu sehen, so dass
daraus auf eine erfolgreich verlaufene Überexpression von K4FXa geschlossen werden
konnte. Aus 50 ml der induzierten Testexpression wurde das Protein mit dem Ni-NTA Spin
Kit isoliert, ein Aliquot wurde mittels HPLC aufgetrennt. Im Chromatogramm waren die
erwarteten, sich überlappenden Proteinpeaks im für HPg-Fragmente typischen Bereich zu
sehen (siehe Bild 5.21). Allerdings schien die Expression sehr schwach zu sein. Die den
Proteinpeaks entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und analysiert. Die durch ESIMS bestimmte Masse von K4Fxa, 14272.3 ± 2.6 Da wich geringfügig von der theoretisch
berechneten Masse von 14275.6 Da ab; dies war durch den heterogenen Auffaltungszustand
des Kringels zu erklären. Die Aminosäureanalyse zeigte, dass die Zusammensetzung des
exprimierten Proteins sehr genau derjenigen von K4Fxa entsprach; die Abweichung betrug
lediglich 0.5%. Auch die N-terminale Sequenzierung lieferte die erwartete Folge MRGSHH,
was den ersten sechs Aminosäuren des Hexahistidin-Tags entsprach.
DAD1 A, Sig=210,10 Ref=450,80 (MONIKA\K4-2.D)
21.984
mAU
600
500
400
21.155
21.494
300
100
4.986
200
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
min
Bild 5.21: RP-HPLC-Chromatogramm bei 280 nm von K4FXa in BL21 Star™(DE3); Bedingungen siehe Bild
5.5; Retentionszeit 21.155 - 21.984 min; die Mehrfachpeaks werden durch unterschiedliche
Rückfaltungszustände von K4FXa verursacht
5.3.2.2 Transformation von K4FXa pET100/D-TOPO® in Rosetta(DE3)
Da die Proteinexpression in BL21 Star™ nicht ausreichend zu sein schien, sollte K4FXa pET100/D-TOPO® in Rosetta(DE3)-E. coli-Zellen transformiert werden. Dieser Stamm stellt der
Translationsmaschinerie tRNAs für in E. coli seltene, aber in Eukaryontengenen häufig
verwendete Codons zur Verfügung. So kann ein allfälliger Mangel, durch den die Translation
frühzeitig abgebrochen werden würde, verhindert werden. Dazu wurde aus einer Starterkultur
von K4Fxa pET100/D-TOPO® BL21 Star mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit das Plasmid
isoliert. Ein Aliquot kompetente Rosetta(DE3)-Zellen wurden mit 1 µl der DNA
transformiert, anschliessend wurde der Transformationsansatz auf einer Ampicillin und
Chloramphenicol enthaltenden Agarplatte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Von zwei der entstandenen 300 Kolonien wurden Starterkulturen hergestellt, aus denen die
Plasmide isoliert und mittels einer Restriktionsanalyse mit Pst I als K4FXa pET100/DTOPO® identifiziert wurden.
120
E. coli Resultate
5.3.2.3 Proteinchemie K4FXa in Rosetta(DE3)
5.3.2.3.1 Testexpression von K4FXa
Von K4FXa pET100/D-TOPO® Rosetta(DE3) wurde eine Kleinexpression durchgeführt. Die
entnommenen Proben wurden aufgearbeitet und auf mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach
dem Proteintransfer auf eine PVDF-Membran wurde der Blot mit Coomassie gefärbt. Darauf
war eine mit der Zeit intensiver werdende Bande auf der Höhe von ca. 16 kDa zu sehen, so
dass daraus auf eine erfolgreich verlaufene Überexpression von K4FXa geschlossen werden
konnte (siehe Bild 5.23). Aus 50 ml der induzierten Testexpression wurde das Protein mit
dem Ni-NTA Spin Kit isoliert und anschliessend mittels HPLC aufgetrennt. Im
Chromatogramm war zu sehen, dass die Proteinexpression im Kleinansatz durch
Transformation des Konstrukts in die Rosetta(DE3)-Zellen wesentlich erhöht werden konnte
(siehe Bild 5.22). Aufgrund der festgestellten Überexpression wurden beschlossen, eine
Grossexpression von K4FXa durchzuführen.
DAD1 A, Sig=214,10 Ref=450,80 (MONIKA\K4FXA002.D)
23.890
mAU
1750
1500
23.350
1250
1000
750
500
250
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
min
Bild 5.22: RP-HPLC-Chromatogramm bei 280 nm von K4FXa in Rosetta(DE3); Bedingungen siehe Bild 5.5;
Retentionszeit 23.350 - 23.890 min; die Mehrfachpeaks werden durch unterschieldiche Rückflautngszustände
von K4FXa verursacht
K4FXa
M
0
1
2
3
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
20 kDa
15 kDa
10 kDa
Bild 5.23: Coomassie-gefärbte Blots von Proben aus Testexpressionen von K4FXa; M: Marker; 0, 1, 2, 3:
Zeitreihe von 0 – 3 h nach Induktion; Pfeil: überexprimiertes Protein
121
E. coli Resultate
5.3.2.3.2 Grossexpression von K4FXa
Von K4FXa pET100/D-TOPO® Rosetta(DE3) wurde eine Expression im 5 l-Ansatz
durchgeführt. Die Rosetta(DE3)-Zellen brauchten mit 5 h Wachstumszeit im Vergleich zu
anderen Stämmen wie BL21 Star™ oder M15(pREP4) wesentlich länger, um die benötigte
Zelldichte zu erreichen Aus dem 5 l-Ansatz konnten 14,7 g Zellen geerntet werden.
Es wurde beschlossen, die Rückfaltung des Proteins im Gesamtlysat durchzuführen und
anschliessend K4FXa, welches eine starke Lysinbindungsstelle besitzt, durch
Affinitätschromatografie mit Lys-Bio-Gel zu isolieren. Diese Vorgehenswese hatte den
Vorteil, dass das Protein in sehr reiner Form vorliegen würde und zugleich die korrekte
Faltung von K4FXa durch Bindung an die Affinitätsmatrix gesichert wäre.
Die Zellen wurden lysiert und die enthaltenen Proteine im Lysat renaturiert. Dabei und
während der anschliessenden Dialyse war eine ausgeprägte Präzipitation zu beobachten. Die
Proteinlösung wurde zentrifugiert, um das ausgefallenene Protein abzutrennen, und
anschliessend lyophilisiert. Nach Resuspendierung des Lyophilisats in 50 mM Tris-Cl pH 8.0
und Abtrennung von unlöslichen Bestandteilen durch Zentrifugation wurde die Proteinlösung
auf eine konditionierte Lys-Bio-Gel-Säule geladen und das an die Säulenmatrix gebundene
Protein mit 50 mM Tris-Cl pH 8.0 + 0.2 M 6-AHA eluiert. Danach wurde das Eluat gegen
H20 pH 3.5 (eingestellt mit Ameisensäure) dialysiert und anschliessend erneut lyophilisiert.
Die Ausbeute an Rohprotein betrug 5 mg. Das Protein wurde mit ESI-MS, Sequenz- und
Aminosäureanalyse charakterisiert. Die gemessene Masse von 14276.3 ± 0.3 Da wich nur
geringfügig von der theoretischen Masse (14275.6 Da) für K4FXa ab (siehe Bild 5.24). Das
Spektrum liess ausserdem darauf schliessen, dass das Protein in sehr reiner Form vorlag, da
ausser vernachlässigbaren Adduktpeaks keine weiteren Verunreinigungen entdeckt werden
konnten. Die Aminosäureanalyse ergab einen Proteingehalt von 44.15% und eine
Abweichung von 0.73 mol Aminosäure pro mol Protein, was eine prozentuale Abweichung
von 0.88% bedeutet.
2 0 -A p r-2 0 0 4
1 5 : 0 5 :3 0
r e k o m b in a n te r K rin g e l 4 n a c h L y s -B io g e l-S ä u le
S c h a lle r
P la tfo rm
R K 4 L Y S B IO G E L 1 (1 .2 2 2 ) S m (M n , 2 x 2 1 .9 7 ); T r (6 0 0 :1 5 0 0 ,0 .1 3 ,L o w ); S b (1 1 ,3 3 .0 0 )
A
100
1 4 2 7 6 .1 3
Scan ES +
4 .5 7 e 7
A:
1 4 2 7 6 .3 3 ± 0 .2 8
%
1 4 3 3 8 .3 8
1 4 3 7 4 .0 0
0
10000
10500
11000
11500
12000
12500
13000
13500
14000
14500
15000
15500
16000
16500
17000
17500
18000
18500
m ass
19000
Bild 5.24: ESI-MS-Massenspektrum von K4FXa nach der Lys-Bio-Gel-Säule; gemessene Masse 14276.3 ± 0.3
Da; theoretischer Wert: 14275.6 Da
Trotz der ausgezeichneten Analyseergebnisse ist die Proteinausbeute gerade in Hinsicht auf
eine spätere Markierung mit 15N und Analyse mit NMR in keiner Weise ausreichend. Da
bekannt ist, dass der Hexahistidin-Tag die Löslichkeit eines Proteins stark herabsetzt und
122
E. coli Resultate
deshalb die Präzipitation und damit eine Verringerung der Ausbeute mit sich bringt, wurde als
neuer Ansatz die Expression von K4 ohne Affinitäts-Tag ins Auge gefasst.
Die gemessene Masse von 14276.33 ± 0.3 Da wich nur geringfügig von der theoretischen
Masse (14275.6 Da) für K4FXa ab. Das Spektrum liess ausserdem darauf schliessen, dass das
Protein in sehr reiner Form vorlag, da ausser vernachlässigbaren Adduktpeaks keine weiteren
Verunreinigungen entdeckt werden konnten. Die Aminosäureanalyse ergab einen
Proteingehalt von 44.15% und eine Abweichung von 0.73 mol Aminosäure pro mol Protein,
was eine prozentuale Abweichung von 0.88% bedeutet.
K4FXa
Rohausbeute
Proteingehalt
5 mg
44.15%
2.20 mg
HPLC:
gesammelte Proteinpeaks
23.89 min
ESI-MS:
theoretische Masse
gemessene Masse
14275.6 Da
14276.33 ± 0.3 Da
Sequenzanalyse:
bestimmte Sequenz
MRGSHH
MRGSHH
Aminosäureanalyse:
0.73 mol
0.88%
5.3.3 Molekularbiologie rK4
rK4 pETBlue-1
Ava I
pETBlue-1
C(T,C)CG(A,G)G
Pst I
ATG
M V355
stop stop
CTGCAG
K4
BamH I
TAATAG GGATCC
pETBlue-1
A440
rK4
rK4 pETBlue-1: Gen von K4; rK4: Protein von K4 mit angehängtem Met als Startcodon für Proteinexpression
Da bei vorgängigen Versuchen die Klonierung von K4 ohne Hexahistidin-Tag in vorhandene
Vektoren nicht geglückt war, wurde das Perfectly Blunt® Cloning Kit zur Hilfe genommen.
Dieses Kit ist für die vereinfachte, direkte Klonierung von PCR-Produkten ohne vorherige
Restriktion mit Enzymen gedacht. Dabei wird die amplifizierte DNA erst phosphoryliert und
123
E. coli Resultate
dann in kurzer Zeit in den linearisiert und dephosphoryliert vorliegenden Vektor ligiert. Ein
Nachteil dieser Methode ist, dass der Insert nicht gerichtet in das Plasmid eingebracht werden
kann. Dies wird aber durch die hohe Anzahl an Transformanten, welche den Vektor mit Insert
enthalten, und das zeitsparende, einfache Protokoll relativiert. Durch die Klonierung in
pETBlue-1 kann natives Protein generiert werden, da durch den Vektor keine weiteren
Aminosäuren, z.B. durch einen Affinitäts-Tag, hinzugefügt werden.
Um die Expression zu ermöglichen, muss am 5´-Ende der cDNA des Proteins das Codon
ATG (codiert für Methionin) angehängt werden, bei dem die Proteintranslation beginnt. Die
Addition dieser Aminosäure ans N-terminale Ende hat, wie bei der Klonierung und
Expression von K1 gezeigt, keinen Einfluss auf die spätere Renaturierung des Proteins. In
manchen Fällen wird das Methionin posttranslational wieder abgespalten.
5.3.3.1 PCR rK4
Sense-Primer: K4 pETBlue-1
5` – ATG GTCCAGGACTGCTACCATGGT – 3`
Met
Antisense-Primer: TOPO K4 3
5 `– ATG CTATTA CGCTTCTGTTCCTGA – 3`
stop stop
Figur 5.26: PCR-Primer für rK4; grün: Startcodon für Proteinexpression; rot: Stopcodons
M
PCR 1
PCR 2
PCR 3
3000 bp
2000 bp
1650 bp
1000 bp
850 bp
600 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
PCR-Produkt
100 bp
Bild 5.27: PCR-Produkt von rK4 aus drei Ansätzen; Länge 286 bp; Marker: 1 kb plus Grössenstandard
124
E. coli Resultate
Das als Templat dienende Plasmid K4FXa pET100/D-TOPO®, welches die cDNA von
Kringel 4 beinhaltet, war vorgängig kloniert worden. Für die PCR-Reaktion wurde das
Plasmid aus einer Starterkultur isoliert. Die K4-cDNA wurde mit den Primern K4 pETBlue-1
und TOPO K4 3 amplifiziert. Zur Überprüfung der Reaktionseffizienz wurde ein Aliquot des
Ansatzes auf einem 2% Agarosegel aufgetrennt. Das PCR-Produkt war auf der erwarteten
Höhe von ca. 300 bp als intensive Bande zu sehen (siehe Bild 5.27). Die DNA wurde aus dem
Gel ausgeschnitten und mittels MinElute™ Gel Extraction Kit isoliert.
5.3.3.2 Ligation von rK4 in pETBlue™-1 und Transformation in TOP10
Die End Conversion Reaction wurde nach Anleitung. Anschliessend wurde das PCR-Produkt
in pETBlue™-1 ligiert. Ein Aliquot kompetente TOP10-Zellen wurde mit einem Teil der DNA
transformiert. Am nächsten Morgen waren keine Kolonien gewachsen, was darauf schliessen
liess, dass entweder die Phosphorylierung des PCR-Produkts oder die Ligation nicht
erfolgreich verlaufen waren. Da die T4-Polynukleotid-Kinase bei 37°C ihre maximale
Aktivität erreicht, wurde ein zweiter End Conversion-Reaktionsansatz bei dieser Temperatur
inkubiert. Die Ligations- und Transformationsbedingungen wurden nicht verändert. Nachdem
die Agarplatte mit den ausgestrichenen Zellen über Nacht bei 37°C gelagert worden war,
konnten 85 Kolonien gezählt werden. Von 10 Kolonien wurden Starterkulturen hergestellt
und daraus mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit die Plasmide daraus isoliert. Durch eine
Restriktionsanalyse mit BamH I und Pst I konnte das Vorhandensein der K4-DNA in vier
Plasmiden nachgewiesen werden, zwei Plasmide enthielten den Insert in doppelter
Ausführung. Durch Verdau mit Ava I und Pst I wurde die korrekte Insertionsrichtung des
PCR-Produkts in pETBlue-1 kontrolliert. Ein Plasmid wurde sequenziert, um unerwünschte
Mutationen ausschliessen zu können.
5.3.3.3 Transformation von rK4 in Rosetta2(DE3)
Das Konstrukt rK4 pETBlue-1 wurde in Rosetta(DE3)-E. coli-Zellen transformiert. Dieser
Stamm stellt zusätzlich zu den im Rosetta(DE3)-Stamm vorhandenen seltenen tRNAs eine
zusätzliche tRNA zur Verfügung. Für die Transformation wurde aus einer Starterkultur von
rK4 pETBlue-1 mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit das Plasmid isoliert. Ein Aliquot
kompetente Rosetta2(DE3)-Zellen wurden mit 1 µl der DNA transformiert, anschliessend
wurde der Transformationsansatz auf einer Carbenicillin und Chloramphenicol enthaltenden
Agarplatte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Von zwei der entstandenen 300
Kolonien wurden Starterkulturen hergestellt, aus denen die Plasmide isoliert und mittels einer
Restriktionsanalyse mit Pst I als K4FXa pET100/D-TOPO® identifiziert wurden.
5.3.4 Proteinchemie rK4
Von rK4 pETBlue™-1 Rosetta2(DE3) wurde eine Kleinexpression durchgeführt. Die
Proteintransfer auf eine PVDF-Membran wurde der Blot mit Coomassie gefärbt. Auf der
Membran war keine Überexpression zu erkennen. Auch die Auftrennung der Proben mit
NuPAGE® MES SDS Running Buffer, um den unteren Massenbereich besser aufzulösen,
125
E. coli Resultate
brachte keine Verbesserung. Offenbar wurde rK4 nicht oder nicht in ausreichender Menge
exprimiert, so dass von einer Expression im Grossansatz abgesehen wurde.
5.4 K13FXa und rK13
5.4.1 Molekularbiologie K13FXa
K13FXa pQE-8
Pst I
pET100/ ATG
D-TOPO
M
CACC
HHHHHH
His-Tag
stop stop
CTGCAG
IEGR S82
K1 + K2 + K3
BamH I
TAATAG GGATCC
pET100/
D-TOPO
S335
FXa
K13FXa
Figur 5.28: Konstrukt von Kringel 1-3
K13FXa pET100/D-TOPO®: Gen von K1-3; K13FXa: Protein von K13 mit His-Tag und FXa-Schnittstelle
Nicht nur die rekombinante Expression von K4, sondern auch der Multikringeldomäne 1-3
(K1-3) stellte sich als unerwartet problematisch heraus. Zwar konnte ein Konstrukt von K1-3
in pQE-8 hergestellt und im Kleinansatz auch erfolgreich exprimiert werden, doch aus einer
Expression im Grossansatz konnte fast nur ein verkürztes Protein isoliert werden (Christen,
2003). Die Charakterisierung ergab, dass es sich beim verkürzten Protein um NTP + K1 von
Ser82-Glu165 handelte. Offenbar befindet sich zwischen Kringel 1 und Kringel 2 eine labile
Stelle, bei welcher die Translation in E. coli abbricht. Die Expression von K1-3 in der Hefe
Pichia pastoris war bisher ebenfalls nicht von Erfolg gekrönt.
Für Probleme bei der Expression von Säuger-Proteinen in Prokaryonten wird die Verwendung
des E. coli-Stammes Rosetta(DE3) empfohlen. Dieser Stamm stellt der Translationsmaschinerie tRNAs für in E. coli seltene, aber in Eukaryontengenen häufig verwendete
Codons zur Verfügung. So kann ein allfälliger Mangel, durch den die Translation frühzeitig
abgebrochen werden würde, verhindert werden. Für die Transformation in diese Zellen muss
K1-3 aber in einen pET-Vektor umkloniert werden. Analog zur Klonierung von K4FXa in
pET100/D-TOPO® wurde die Herstellung des Konstrukts K13FXa in Angriff genommen.
Dazu muss der cDNA von K1-3 durch die PCR-Primer, gleich wie bei K4FXa, an ihrem NTerminus die Nukleotidsequenz CACC angefügt werden. Durch Ligation der cDNA in
pET100/D-TOPO® wird dem rekombinanten Protein an seinem N-terminalen Ende ein
Hexahistidin-Tag angefügt, wodurch das Expressionsprodukt anschliessend durch Ni-NTAAffinitätschromatografie isoliert werden kann. Durch die PCR-Reaktion wurde ebenfalls eine
FXa-Schnittstelle ins Konstrukt eingefügt, um den Hexahistidin-Tag bei Bedarf später wieder
abtrennen zu können.
126
E. coli Resultate
5.4.1.1 PCR K13FXa
Sense-Primer: K13pET100 for
5` CACC ATCGAGGGTAGA TCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAA G – 3`
TOPO FXa-Schnittstelle
Antisense-Primer: HPg K13 P2
5 `– GCCGGATCC TCACTA GGAGTCACAGGACGGTATCTTACAG – 3`
BamH I stop stop Ser Asp Cys Ser Pro Ile Lys Cys
Figur 5.29: PCR-Primer für K13FXa; grün: Sequenz für Directional Cloning in pET100/D-TOPO®; blau: FXaErkennungssequenz; rot: Stopcodons
Das als Templat dienende Konstrukt K1-3 pQE-8 (Christen, 2003) war schon vorgängig
isoliert und linearisiert worden. Die K13-cDNA wurde mit den Primern K13pET100 for und
HPg K13 P2 während 30 Zyklen amplifiziert. Zur Überprüfung der Reaktionseffizienz
wurden 5 µl des Ansatzes auf einem 2% Agarosegel aufgetrennt. Das PCR-Produkt war auf
der erwarteten Höhe von ca. 760 bp als intensive Bande zu sehen. Die DNA wurde aus dem
5.4.1.2 Ligation von K13FXa in pET100/D-TOPO® und Transformation in
TOP10
Die Ligation wurde nach TOPO Directional Cloning-Anweisung durchgeführt. Ein Aliquot
kompetente TOP10-Zellen wurden mit einem Aliquot des Ligationsansatzes transformiert
Von acht der entstandenen Kolonien wurden Starterkulturen hergestellt und die Plasmide mit
dem QIAprep® Miniprep Spin Kit daraus isoliert. Eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym
Pst I ergab, dass alle Plasmide die K4-DNA in der korrekten Richtung enthielten.
Anschliessend wurde eines der Konstrukte sequenziert, um unerwünschte Mutationen
ausschliessen zu können.
5.4.1.3 Transformation von K13FXa in Rosetta(DE3)
K13FXa pET-100/D-TOPO® wurde in Rosetta(DE3)-E. coli-Zellen transformiert. Dazu
wurde aus einer Starterkultur von K13Fxa pET100/D-TOPO® TOP10 mit dem QIAGEN Spin
Miniprep Kit das Plasmid isoliert. Ein Aliquot kompetente Rosetta(DE3)-Zellen wurden der
DNA transformiert. Von zwei der entstandenen 122 Kolonien wurden Starterkulturen
hergestellt, aus denen die Plasmide isoliert und mittels einer Restriktionsanalyse mit Pst I als
K4FXa pET100/D-TOPO® identifiziert wurden.
127
E. coli Resultate
5.4.2 Proteinchemie K13FXa
K13FXa
M
0
1
2
3
v
n
M
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
20 kDa
Bild 5.30: Coomassie-gefärbter Blot von Proben aus Testexpression von K13FXa; M: Marker; 0, 1, 2, 3:
Zeitreihe von 0 – 3 h nach Induktion; v, n: Vergleich nicht induzierte (v)/ induzierte (n) Kultur nach 3 h
Inkubation; Pfeil: überexprimiertes Protein
Von K13FXa pET100/D-TOPO® Rosetta(DE3) wurde eine Kleinexpression durchgeführt.
Die entnommenen Proben wurden aufgearbeitet und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach
dem Proteintransfer auf eine PVDF-Membran wurde der Blot mit Coomassie gefärbt. Darauf
war eine mit der Zeit intensiver werdende Bande auf der Höhe von ca. 35 kDa zu sehen, so
dass daraus auf eine erfolgreich verlaufene Überexpression von K13FXa geschlossen werden
konnte. Aus 50 ml der induzierten Testexpression wurde das Protein mit dem Ni-NTA Spin
Kit isoliert und anschliessend mittels HPLC aufgetrennt. Im Chromatogramm war ein breiter
Peak mit einer Retentionszeit von 24.7 min zu sehen (siehe Bild 5.31). Die dem Peak
entsprechenden Fraktionen wurden gepoolt und im Speed-Vac getrocknet. Eine Analyse
mittels ESI-MS ergab, dass zwar ein Protein mit der Masse 33677.3 ± 6.6 Da (theoretische
Masse: 33677.2 Da) exprimiert wurde (siehe Bild 5.32). Es zeigten sich aber noch weitere
Massenpeaks bei 33989.0 Da und 34296.0 Da. Die Massendifferenz zwischen den Peaks
betrug 306 resp. 307 Da; dies wies darauf hin, dass es sich bei den bedien Peaks mit höherer
Masse um Glutathion-Addukte von K13FXa handelte. Zusätzlich war in allen Massenspektren
ein Peak der Masse 7463.2 Da zu erkennen. Bei der N-terminalen Sequenzanalyse konnte nur
eine einzige Sequenz, nämlich MRGSHH (entspricht den ersten sechs Aminosäuren des HisTags), ermittelt werden. Deshalb musste davon ausgegangen werden, dass es sich bei dieser
Masse um ein verkürztes Fragment von K13FXa handelte. Trotz mehrerer Versuche konnte
aus Expressionen im Kleinansatz kein weiteres K13FXa-Protein zur weiteren
Charakterisierung mehr gewonnen werden. Deshalb wurde von einer Expression von K13FXa
im Grossansatz abgesehen.
128
E. coli Resultate
DAD1 A, Sig=210,10 Ref=450,80 (MONIKA\RK130002.D)
24.785
mAU
1000
800
600
400
200
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
min
Bild 5.31: RP-HPLC-Chromatogramm bei 280 nm von K13FXa; Bedingungen siehe Bild 5.5; Retentionszeit
24.7 min
1 1 -M a y -2 0 0 4
1 1 :1 6 : 3 8
K 13
2 .2
in
S T D -L M + 0 .5 % H C O O H
S c h a lle r
P la tfo r m
M O N IK A 2 6 1 (1 .2 7 1 ) M E [E v -1 3 9 8 1 0 ,It6 ] (G s ,1 .8 0 0 ,4 0 0 :2 0 0 0 ,1 .0 0 ,L 3 3 ,R 3 3 ); S b (1 1 ,3 3 .0 0 ); S b (1 1 ,3 3 .0 0 )
3 4 2 9 6 .0 0
100
S can E S +
7 .2 0 e 6
A:
B:
C:
D:
7 4 6 3 .1 4 ± 1 .1 9
3 4 2 9 0 .4 9 ± 4 .1 2
3 3 9 9 1 .2 2 ± 5 .3 2
3 3 6 8 1 .4 9 ± 3 .9 1
C
3 3 9 8 9 .0 0
D
3 3 6 8 3 .0 0
%
3 4 6 1 0 .0 0
3 4 1 1 1 .0 0
3 4 9 0 2 .0 0
3 3 5 6 1 .0 0
0
33300
33400
33500
33600
33700
33800
33900
34000
34100
34200
34300
34400
34500
34600
34700
34800
34900
m ass
35000
Bild 5.32: ESI-MS-Massenspektrum von K13FXa; gemessene Massen: 33677.3 ± 6.6 Da, 33989.0 Da ± 5.3
Da und 34296.0 ± 3.9 Da; theoretische Masse 33677.2 Da
5.4.3 Molekularbiologie rK13
rK13 pETBlue™-1
Ava I
pETBlue-1
C(T,C)CG(A,G)G
Pst I
ATG
M S82
CTGCAG
K1 + K2 + K3
stop stop
BamH I
TAATAG GGATCC
pETBlue-1
S335
rK13
rK13 pETBlue-1: Gen von K13; rK13: Protein von K4 mit angehängtem Met als Startcodon für
Proteinexpression
129
E. coli Resultate
Da die Expression von K13FXa pET-100/D-TOPO® in Rosetta(DE3)-E. coli-Zellen bisher
nicht den erwarteten Erfolg zeigte, mussten alternative Strategien aufgestellt werden. Eine
davon war die Klonierung der K1-3-cDNA in pETBlue™-1 mit dem Perfectly Blunt® Cloning
Kit und die Expression in Rosetta2(DE3). Auf diese Weise könnte natives K1-3-Protein ohne
Hexahistidin-Tag oder sonstige zusätzliche Aminosäuren generiert werden. Zur erfolgreichen
Expression muss aber am 5´-Ende der cDNA des Proteins wie bei rK4 das Codon ATG
(codiert für Methionin) als Translationsstart angehängt werden. Dies geschieht bei der PCRReaktion mit entsprechend konstruierten Primern.
Da das korrekt renaturierte rK13 aufgrund der Lysinbindungsstellen in Kringel 1 und 2 eine
grosse Lysinaffinität besitzen sollte, kann das Protein nach der Expression und der
Rückfaltung im Lysat durch Lys-Bio-Gel-Affinitätschromatografie isoliert werden.
5.4.3.1 PCR rK13
Sense-Primer: K13 pETBlue-1
5` – ATG TCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAG – 3`
Met
Antisense-Primer: HPg K13 P2
5 `– GCCGGATCC TCACTA GGAGTCACAGGACGGTATCTTACAG – 3`
BamH I stop stop Ser Asp Cys Ser Pro Ile Lys Cys
Figur 5.34: PCR-Primer für rK13; grün: Startcodon für Proteinexpression; rot: Stopcodons
M
1
2
3
4
5
4000 bp
3000 bp
2000 bp
1650 bp
1000 bp
850 bp
600 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
PCR-Produkt
Fehlbanden
100 bp
Bild 5.35: PCR-Produkt aus verschiedenen Ansätzen (1 – 5); Länge: 780 bp; Marker: 1 kb plus Grössenstandard
130
E. coli Resultate
Das als Templat dienende Plasmid K13FXa pET100/D-TOPO®, welches die cDNA von
Kringel 1-3 enthält, war vorgängig kloniert worden. Für die PCR-Reaktion wurde das Plasmid
aus einer Starterkultur isoliert. Die K13-cDNA wurde mit den Primern K13 pETBlue-1 und
HPg K13 P2 amplifiziert. Zur Überprüfung der Reaktionseffizienz wurde ein Aliquot des
Ansatzes auf einem 2% Agarosegel aufgetrennt (siehe Bild 5.35). Das PCR-Produkt war auf
der erwarteten Höhe von ca. 760 bp als intensive Bande zu sehen. Die DNA wurde aus dem
5.4.3.2 Ligation von rK13 in pETBlue™-1 und Transformation in TOP10
Mit der gereinigten K13-DNA wurde die End Conversion Reaction nach Anleitung
durchgeführt. Anschliessend wurde das PCR-Produkt in pETBlue™-1 ligiert und in ein
Aliquot kompetente TOP10-Zellen transformiert. Es konnten 200 Kolonien gezählt werden.
Von 10 Kolonien wurden Starterkulturen hergestellt und daraus mit dem QIAprep® Spin
Miniprep Kit die Plasmide daraus isoliert. Durch einer Restriktionsanalyse mit BamH I und
Pst I konnte das Vorhandensein der K13-DNA nachgewiesen werden; durch Verdau mit Ava I
und Pst I wurde die korrekte Insertionsrichtung des PCR-Produkts in pETBlue-1 kontrolliert.
Fünf Plasmide enthielten rK13 in der korrekten Richtung. Ein Plasmid wurde sequenziert, um
unerwünschte Mutationen ausschliessen zu können.
5.4.3.3 Transformation von rK13 in Rosetta2(DE3)
rK13 pETBlue™-1 wurde in Rosetta2(DE3)-E. coli-Zellen transformiert. Dazu wurde aus
einer Starterkultur von rK13 pETBlue™-1 TOP10 mit dem QIAprep® Spin Miniprep Kit das
Plasmid isoliert. Ein Aliquot kompetente Rosetta2(DE3)-Zellen wurden mit der DNA
transformiert. Von zwei der ungefähr 500 Kolonien wurden Starterkulturen hergestellt, aus
denen die Plasmide isoliert und mittels einer Restriktionsanalyse mit Pst I und BamH I als
rK13 pETBlue™-1 identifiziert wurden.
5.4.4 Proteinchemie rK13
Von rK13 pETBlue™-1 Rosetta2(DE3) wurde eine Kleinexpression durchgeführt. Die
Proteintransfer auf eine PVDF-Membran wurde der Blot mit Coomassie gefärbt. Darauf war
eine mit der Zeit intensiver werdende Bande auf der Höhe von ca. 33 kDa zu sehen, so dass
daraus auf eine erfolgreich verlaufene Überexpression von rK13 geschlossen werden konnte.
Dass es sich beim exprimierten Protein um ein HPg-Fragment handelte, konnte auch durch
den immunologischen Nachweis bestätigt werden.
Aufgrund des fehlenden Hexahistidin-Tags war keine Reinigung mittels Ni-NTAAffinitätschromatografie möglich. Auch eine Rückfaltung mit anschliessender Isolation über
Lys-Bio-Gel war wegen der geringen Proteinmenge in Kleinansätzen nicht durchführbar.
Deshalb wurde eine Testexpression von rK13 pETBlue™-1 Rosetta2(DE3) durchgeführt und
das Zell-Pellet von 50 ml der Expression in GuHCl-Puffer lysiert. 10 µl davon wurden mittels
RP-HPLC aufgetrennt, um zu überprüfen, ob auf diese Weise rK13 isoliert und die
entsprechenden Proteinfraktionen für eine Charakterisierung gepoolt werden könnten. Im
131
E. coli Resultate
Chromatogramm war aber kein Peak auszumachen, der eindeutig auf rK13 zurückgeführt
hätte werden können. Ein Grund dafür waren die grosse Anzahl anderer im Lysat
vorhandenen Proteine aus E. coli, welche die Isolation eines einzelnen Peaks unmöglich
machten. Aus Zeitgründen konnten keine weiteren Isolationsversuche oder
Charaktierisierungen mehr durchgeführt werden.
rK13
M
0
1
2
3
v
n
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
20 kDa
15 kDa
Bild 5.36: Coomassie-gefärbter Blot von Proben aus Testexpression von rK13; M: Marker; 0, 1, 2, 3: Zeitreihe
von 0 – 3 h nach Induktion; v, n: Vergleich nicht induzierte (v)/ induzierte (n) Kultur nach 3 h Inkubation; Pfeil:
überexprimiertes Protein
5.5 Bestimmung der Bindungskonstanten durch Fluoreszenzmessung
Die exprimierten und charakterisierten rekombinanten Proteine K1FXa, K1FXamut, K23 und
K23mut wurden für Bindungsstudien mittels Fluoreszenzmessung eingesetzt. Zusätzlich
wurde rK1, ein vorgängig in der Gruppe Schaller kloniertes und exprimiertes Protein,
verwendet. Die Ligandbindungseigenschaften der Plasminogenfragmente sollten durch
schrittweise Erhöhung der 6-AHA-Konzentration und Messung der Fluoreszenzveränderungen bestimmt werden.
Als Referenzwert wurde die Proteinlösung ohne Ligandzugabe gemessen. Findet eine
Interaktion zwischen Ligand und Protein statt, sollten die Messwerte eine Sättigungskurve
beschreiben, d.h. die Fluoreszenzänderung sollte sich einem Endwert annähern. Die
Messwerte der Fluoreszenztitrationen wurden auf 1 normiert und in einem Diagramm jeweils
in Reaktion zur entsprechenden Ligandenkonzentration gestellt (siehe Bild 5.37). Bei den
Fragmenten rK1, K1FXa, K23 und K23mut wurde dabei eine Sättigungskurve beobachtet.
Die Messung mit K1FXamut ergab keine Sättigungskurve, da anscheinend zwischen
K1FXamut und 6-AHA keine Interaktion stattfand.
132
E. coli Resultate
Zur Berechnung der Bindungskonstanten wurden die Fluoreszenztitrationskurven nach
Scatchard linearisiert (siehe Bild 5.38). Die Scatchardgleichung basiert auf der allgemeinen
Gleichung für reversible Bindungen:
Ligandakzeptor + Ligand
Ligandakzeptor-Ligand
Die Gesamtfluoreszenz F besteht aus der Fluoreszenz des freien Ligandakzeptors Ffrei und der
Fluoreszenz des Komplexes Ligandakzeptor-Ligand FKomplex:
F = Ffrei
.
[Ligandakzeptor] + FKomplex
.
[Lignadakzeptor-Ligand]
Die Fluoreszenzänderung ist deshalb proportional zur Konzentration des LigandakzeptorLigand-Komplexes. Weiter gilt:
[Ligandakzeptor-Ligand] / [Ligand] = k
.
(n - [Ligandakzeptor-Ligand] )
k entspricht der Bindungsreaktions-Konstante, n beschreibt die Anzahl Bindungsstellen des
Ligandakzeptors. Daraus folgt: Falls k konstant ist, ergibt sich für ein Plot von
[Ligandakzeptor-Ligand] / [Ligand] gegen [Ligandakzeptor-Ligand] eine Gerade.
Aus dem Bestimmtheitsmass R2 konnte abgeleitet werden, dass die Messungen von rK1,
K1FXa, K23 und K23mut recht genau sein mussten. Die Messung mit K1FXamut war jedoch
nicht zuverlässig. Beim Scatchard- Plot konnte aus den Steigungen der Trendlinien die
Assoziationskonstante Ka abgelesen werden. Die Dissoziationskonstante Kd ergibt sich aus
dem Kehrwert von Ka.
Die Ka-Werte von K1FXa und rK1 betrugen 40.67 mM-1 resp. 50.80 mM-1. Diese Werte
waren zwar etwas niedriger als die bei früheren Messungen mit K1 erreichten Werte, waren
aber in der gleichen Grössenordnung. Der Ka-Wert von 1.68 mM-1 für K1FXamut zeigte, dass
zwischen Protein und Ligand keine Interaktion stattfand. Deshalb kann davon ausgegangen
werden, dass die Lysinbindungsstelle von Kringel 1 durch die Mutation von Aspartat nach
Alanin inaktiviert wurde.
Die Ka-Werte für K23 und K23mut lagen mit 6.21 mM-1 resp. 4.35 mM-1 recht nahe bei den
Werten von früheren Messungen für Kringel 2. Die fehlende Interkringel-Disulfidbrücke
zwischen Kringel 2 und Kringel 3 von K23mut hat wahrscheinlich nur einen geringen
Einfluss auf die Ligandbindung von K23mut.
rK1
K1FXa
K1FXamut
K23
K23mut
-1
-1
-1
-1
50.80 mM
40.67 mM
1.68 mM
6.21 mM
4.35 mM-1
Ka
19 .69 mM
24.59 mM
595.24 mM
161.03 mM
229.89 mM
Kd
0.996
0.997
0.519
0.990
0.983
R2
Tabelle 5.4: Resultate der Fluoreszenztitrationen von rK1, K1FXa, K1FXamut, K23 und
K23mut
rK1
rK2
K23
-1
-1
2.1
mM-1
74.2 ± 8 mM 2.3 ± 0.2 mM
Tabelle 5.5: Referenzwerte von Fluoreszenztitrationen mit 6-AHA für rK1, rK2 und K23
133
E. coli Resultate
Fluoreszenztitration
gemessene Fluoreszenz (normiert)
1.000
0.995
0.990
rK1
K1FXamut
K1FXa
0.985
0.980
0.975
0.970
0.965
0
20
40
60
80
100
120
140
Ligandkonzentration [M]
Bild 5.37: Fluoreszenztitration von K1FXa, K1FXamut und rK1 mit 6-AHA; die gemessene Fluoreszenz wurde
auf 1 normiert.
Scatchard-Plot
(1. X,Y-Werte auf 0 gesetzt)
∆F/Ligandkonzentration[ l/µmol ]
45
40
35
y = -50.802x + 0.8006
R2 = 0.9957
30
25
20
rK1
y = -40.674x - 0.0998
R2 = 0.9965
K1FXamut
K1FXa
15
10
5
0
-0.9
-5
y = -1.675x + 0.4306
R2 = 0.5187
-0.8
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0
∆F
Bild 5.38: Scatchard-Plot der Fluoreszenztitration von K1FXa, K1FXamut und rK1; der erste X,Y-Wert der
linearisierten Kurven wurde auf 0 gesetzt.
134
Prion Resultate
6. Prion Resultate
6.1 Pull Down-Assay mit beschichteten Dynabeads
Der Pull Down-Assay mit Plasminogen-beschichteten Dynabeads wurde von Fischer (2000)
entwickelt. Dabei wird HPg kovalent an paramagnetische Dynabeads gebunden. Die
beschichteten Beads werden danach in einer 6%-Detergenslösung mit BSE-negativem oder
–positivem (BSE-, BSE+) Hirnhomogenat inkubiert. Die Beads werden anschliessend
gewaschen und die gebundenen Proteine durch Erhitzen in SDS-PAGE-Probenpuffer von den
Beads abgelöst. Die Probe kann danach mittels Western Blot analysiert werden.
Es sollte nun getestet werden, ob die von Fischer entwickelte Methode reproduzierbar war
und ob die dadurch erhaltenen Ergebnisse mit den publizierten Resultaten übereinstimmten.
In einem ersten Ansatz wurden tosylaktivierte Dynabeads® M-280 mit 200 µg HPg
beschichtet. Zum Schluss wurden die Beads in 1 ml Waschpuffer resuspendiert und bei 4°C
gelagert. Der Protein-Gehalt der HPg-Lösung vor und nach der Kopplung wurde mittels
Lowry-Assay bestimmt. Dabei stellte sich heraus, dass sämtliches Protein an die Dynabeads
gebunden hatte.
Aliquots von nicht aufbereitetem BSE-negativem und BSE-positivem Hirnhomogenat wurden
auf Eis aufgetaut. Anschliessend wurden Proben ohne/mit Proteinase K (PK)-Verdau und
ohne/mit Dynabeads-Pull Down-Assay hergestellt. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE
aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran (0.45 µm Porengrösse) geblottet. Nach der
Durchführung des Western Blots mit den Antikörpern 6H4/ goat anti-mouse HRP-gekoppelt
wurden die Signale durch Exposition auf Film festgehalten.
Die detektierten Signale manifestierten sich wie folgt:
Probe: BSE-/ ohne PK:
auf ganzer Länge des Blots verteiltes Signal; eine etwas intensivere Bande bei ca. 28 kDa
Probe: BSE-/ ohne PK/ mit Beads:
Bande bei ca. 28 kDa; schwächere Banden bei 36 kDa, 30 kDa
Probe: BSE-/mit PK:
kein Signal
Probe: BSE-/mit PK/ mit Beads:
kein Signal
Probe: BSE+/ ohne PK
auf ganzer Länge des Blots verteiltes Signal; etwas intensivere Banden bei ca. 36 kDa, 32
kDa, 28 kDa
Probe: BSE+/ ohne PK/ mit Beads
etwas stärkere Banden bei ca. 50-80 kDa, 36 kDa, 32 kDa, 28 kDa
Probe: BSE+/mit PK
Banden bei ca. 36 kDa, 32 kDa, 28 kDa
Probe: BSE+/mit PK/ mit Beads
Banden bei ca. 30 kDa, 23 kDa, 19 kDa
Die Signale der Proben ohne PK/ohne Beads zeigten auf dem Blot das aus Publikationen
bekannte Dreier-Bandenmuster. Dieses entsteht durch die di-, mono- und unglykosylierte
Form von PrP; sowohl PrPC als auch PrPSc weisen dieses Glykosylierungsmuster auf. Je nach
Homogenat kann aber das Verhältnis zwischen den drei Formen variieren; ausserdem
entstehen durch Unterschiede in der Länge der Kohlenhydratketten Varationen in der
135
Prion Resultate
apparenten Masse. Durch Verdau mit PK wurde PrPC wie erwartet eliminiert und die Banden
von PrPSc verschoben sich zu niedrigerer Masse.
Die Probensignale waren aber beinahe auf die ganze Länge des Blots verteilt. Dies wurde
vermutlich dadurch verursacht, dass die PrP-Aggregate im Homogenat immer noch
vorhanden waren. Da die Aggregate eine kontinuierliche Grössenverteilung haben, wurden
auch entsprechende Signale detektiert. Die Probensignale mit PK waren etwas klarer, da
durch den Verdau und/oder die Interaktion des Prion-Proteins schon ein Grossteil der anderen
Proteine eliminiert worden war. Die Signale der Proben mit Beads waren jedoch schwach
und etwas diffus. Ausserdem waren die störenden Hintergrundsignale, welche durch
unspezifische Interaktionen der Antikörper mit der Membran verursacht wurden, sehr
intensiv, so dass die Probensignale schon nach wenigen Minuten Filmexposition nicht mehr
vom Hintergrund unterschieden werden konnten. Deshalb wurden verschiedene
Möglichkeiten zu Methoden-Optimierung auf ihre Wirksamkeit hin untersucht.
Bei der Auswertung der Resultate muss beachtet werden, dass die unterschiedlichen BSEnegativen und BSE-positiven Hirnhomogenate unterschiedliche PrP-Titer aufweisen. Die
Detektionlimiten von mit verschiedenen Homogenaten durchgeführten Experimenten können
also nicht miteinander verglichen werden. Deshalb muss bei allen Experimenten eine
Standardprobe des verwendeten Homogenats mitanalysiert werden, um die Einflüsse der
während des Versuchs vorgenommenen Veränderungen mit der unveränderten Probe
vergleichen zu können.
Bei der Auswertung der detektierten Signale wurde die Annahme gemacht, dass 1 µl
Homogenat 1 mg wiegt. Die Aussage über niedrigste detektierbare Homogenatmenge wurde
immer aufgrund der Signale von 1 h Exposition auf Film gemacht.
6.1.1 Optimierung des Pull Down-Assays
6.1.1.1 Aufbereitung des Homogenats
BSE-- und BSE+-Hirnhomogenat-Aliquots wurden auf Eis aufgetaut. Anschliessend wurden
die Homogenate wie folgt aufbereitet:
Homogenat 1: ohne Zusatz
Homogenat 2: Zusatz von DOC/NP-40 (Endkonzentration je 0.5%); 2x Zentrifugieren
(500xg, 30 min, 4°C)
Homogenat 3: Zusatz von Prionics®-Check Western Homogenisation Buffer; 2x Zentrifugieren (500xg, 30 min, 4°C)
Homogenat 4: Zusatz von DOC/NP-40 (Endkonzentration je 0.5%); 2 min Rehomogenisieren
(Stufe B); 2x Zentrifugieren (500xg, 30 min, 4°C)
Homogenat 5: Zusatz von Prionics®-Check Western Homogenisation Buffer; 2 min Rehomogenisieren (Stufe B); 2x Zentrifugieren (500xg, 30 min, 4°C)
136
Prion Resultate
Von den aufbereiteten Homogenaten wurden anschliessend Proben ohne/mit Proteinase KVerdau und ohne/mit Pull Down-Assay mit vorbereitet. Die Proben wurden mittels SDSPAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran geblottet. Nach der Durchführung des
Western Blots mit den Antikörpern 6H4/ goat anti-mouse HRP-gekoppelt und Inkubation des
Blots in ECL plus™ Western Blotting Reagenz wurden die Signale durch Exposition auf Film
festgehalten (siehe Bild 6.2).
aufbereitete Homogenate
BSE
1
2
3
4
5 6 7
8
9 10 11 12
40 kDa
30 kDa
20 kDa
Bild 6.1: Aufbereitetes Homogenat 4 von BSE-negativen (1 – 3) und –positiven Rindern (4 – 12); je 15 µl Probe
(entspricht 3.75 µl Homogenat); PVDF-Membran; grüner Pfeil: Homogenat mit vermutlich schon z.T.
degeneriertem PrPSc; rote Pfeile: nicht aufgelöste PrPSc-Aggregate; blauer Pfeil: Abbauprodukt von PrPSc;
Expositionszeit: 1 min
Ein Vergleich zwischen den einzelnen Aufbereitungsmethoden zeigte, dass die zweimalige
Zentrifugation die grösste Auswirkung auf die Probe hatte. Durch die Abtrennung der
unlöslichen Homogenatbestandteile konnten die unspezifischen Probensignale zum Teil
eliminiert werden. Eine Verbesserung der Klarheit des Signals konnte auch durch den Zusatz
von Detergentien erreicht werden, wodurch die Prion-Protein-Aggregate im Homogenat
aufgelöst werden. Die Kombination DOC/NP-40 und der Prionics®-Check Western
Homogenisation Buffer hatten die gleiche Wirkung. Bei der Rehomogenisation mittels
Dispersionsgerät wurde ebenfalls eine geringe Verbesserung der Aggregats-Auflösung
beobachtet.
Die Detergentien-Kombination DOC/NP-40 ist wesentlich preisgünstiger als der Prionics®Check Western Homogenisation Buffer; ausserdem wird das Homogenat durch den Prionics®Check Western Homogenisation Buffer um 20% verdünnt; dies könnte bei Homogenaten mit
sehr geringem PrPSc-Titer zu einem falsch negativen Resultat führen. Deshalb wurde
beschlossen, die Homogenat-Proben zukünftig durch Zugabe von 0.5% DOC/0.5% NP-40, 2
min Rehomogenisation (Stufe B) und 2x Zentrifugieren (500xg, 30 min, 4°C) aufzubereiten.
137
Prion Resultate
unterschiedlich vorbereitete Proben von verschiedenen Homogenaten
BSE+
1
2 3 4
5
6
BSE7 8 9 10 11 12 13 14 15
nicht
aufbereitete
Homogenate
30 kDa
20 kDa
aufbereitete
Homogenate 4
30 kDa
20 kDa
aufbereitete
Homogenate 4
mit PK
30 kDa
20 kDa
aufbereitete
Homogenate 4
mit HPg-Beads
30 kDa
20 kDa
aufbereitete
Homogenate 4
mit PK, mit
HP-Beads
30 kDa
20 kDa
Bild 6.2: Vergleich zwischen Proben unterschiedlichen Verarbeitungsgrades; Proben 1 – 10: BSE-positiv;
Proben 11 – 15: BSE-negativ; je 15 µl Probe; PVDF-Membran; Beads beschichtet mit 200 µg HPg; Antikörper
6H4/ goat anti-mouse HRP-gekoppelt; Expositionszeit 1 min
6.1.1.2 Blotten auf verschiedene Membranen
Es wurde geprüft, ob die Sensitivität des Assays durch die Verwendung einer anderen
Membran verbessert werden konnte.
Dazu wurden Proben von aufbereitetem Hirnhomogenat (BSE-, BSE+) ohne/mit PK
hergestellt. Jeweils 15 µl der Proben wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Danach wurden
die Proteine auf verschiedene Membranen geblottet. Für die PVDF-Membranen mit 0.22 µm
und 0.45 µm Porengrösse wurde nach der Blot-Methode für PVDF-Membranen vorgegangen,
für die Nitrozellulose-Membran nach der Nitrozellulose-Methode. Danach wurde ein
138
Prion Resultate
immunologischer Nachweis mit den Antikörpern 6H4/ goat anti-mouse HRP-gekoppelt
durchgeführt. Die Detektion geschah in allen Fällen durch Inkubation in ECL plus™ Western
Blotting Reagenz. Die Signale wurden durch Exposition auf Film festgehalten.
Es zeigte sich, dass die Probensignale auf der PVDF-Membran mit 0.45 µm Porengrösse am
besten detektierbar waren. Der unspezifische Hintergrund war auf der NitrozelluloseMembran am grössten. Alle weiteren Western Blot-Experimente wurden deshalb mit PVDFMembranen mit 0.45 µm Porengrösse durchgeführt.
6.1.1.3 Verschiedene Antikörper
Bisher war beim immunologischen Nachweis die Antikörper-Kombination 6H4/ goat antimouse HRP-gekoppelt verwendet worden. Da der Antikörper 6H4 aber nicht PrPSc-spezifisch
ist und beim Pull Down-Assay auch wenig PrPC an die mit HPg beschichteten Beads bindet,
muss das Homogenat für eine eindeutige Unterscheidung von BSE-negativen und –positiven
Proben noch mit PK verdaut werden. Um diesen Protease-Schritt eliminieren zu können,
sollte untersucht werden, ob ein anderer Antikörper PrPSc-spezifisch reagiert.
Dazu wurden Proben von aufbereitetem Hirnhomogenat (BSE-, BSE+) ohne/mit PK
hergestellt. Von den Proben wurden Western Blots mit den Primär-Antikörpern 6H4, 6G4,
7C1, 2D10 und 2E7 durchgeführt. Die Blots wurden in ECL plus™ Western Blotting Reagenz
inkubiert und die Signale durch Exposition auf Film festgehalten.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Antikörper 2E7, 2D10 und 7C1 für den Western Blot nicht
geeignet waren, da sie nur schwach oder gar nicht mit den Proteinen auf dem Blot
interagierten. Die Signale auf dem Western Blot von 6G4 in der Verdünnung 1:20 war mit
demjenigen von 6H4 vergleichbar. Allerdings war eine längere Exposition auf Film nicht
möglich, da nach ca. 15 min die unspezifischen Hintergrundsignale zu stark wurden. Um die
beiden Antikörper besser vergleichen zu können, wurden Proben von BSE- und BSE+Hirnhomogenat ohne/mit PK, ohne/mit Dynabeads® hergestellt. Von den Proben wurden ½Verdünnungsreihen hergestellt und mittels Western Blot (6G4: 1:20) analysiert (siehe Bild
6.3). Die niedrigsten detektierten Homogenatmengen waren dabei wie folgt:
Probe
BSE-, ohne Beads
BSE+, ohne Beads
BSE-, mit Beads
BSE+, mit Beads
6G4
29.3 µg Homogenat
7.3 µg Homogenat
1.88 mg Homogenat
14.6 µg Homogenat
6H4
14.6 µg Homogenat
29.3 µg Homogenat
0.94 mg Homogenat
58.6 µg Homogenat
Tabelle 6.1: Niedrigste detektierte Homogenatmengen von Western Blots mit den Antikörpern 6G4 (1:20) und
6H4
Es zeigte sich, dass 6G4 sogar eine etwas grössere Affinität und Spezifität als 6H4 aufwies.
Leider konnte das Potential von 6G4 nicht ganz ausgenützt werden, da bei längerer
Filmexposition das Verhältnis Signal/unspezifischer Hintergrund zu klein wurde. Wäre 6G4
aber in höherer Konzentration und in grösseren Mengen erhältlich, würde er eine brauchbare
Alternative zu 6H4 darstellen.
139
Prion Resultate
Vergleich 6G4 – 6H4
½-Verdünnungsreihen
6G4
6H4
40 kDa
BSEohne Beads
30 kDa
40 kDa
BSEmit Beads
BSE+
ohne Beads
30 kDa
40 kDa
30 kDa
BSE+
mit Beads
40 kDa
30 kDa
Bild 6.3: Qualitativer Vergleich zwischen Western Blots von BSE-negarivem und BSE-positivem Homogenat
mit den Primär-Antikörpern 6G4 (verwendete Konzentration 1:20) und 6H4 (verwendete Konzentration
1:10000); ½-Verdünnungsreihen; Startmenge der Verdünnungsreihe: 15 µl unverdünnte Probe; verwendete
Membran: PVDF-Membran; Beads mit 500 µg gekoppeltem HPg; Expositionszeit: 5 min
Der Western Blot von Proben aus BSE- und BSE+-Homogenat wurde auch mit dem
Antikörper 3F4 durchgeführt, der für die Detektion von PrP aus Scrapie-infiziertem
Hamstergehirn verwendet wird. Dazu wurden Proben ohne/mit PK hergestellt und mittels
Western Blot analysiert. Es konnte in keinem Fall eine Affinität von 3F4 mit PrP aus BSEMaterial festgestellt werden. Der Antikörper, der an Prionen von Mensch, Katze und Hamster
bindet, hat offenbar keine Kreuzreaktivität mit bovinem PrP.
Beim sogenannten Far Western Blot handelt es sich um einen immunologischen Nachweis,
bei dem statt eines Primärantikörpers ein Protein mit Affinität zu einem Bestandteil der
geblotteten Probe eingesetzt wird. Da HPg beim Pull Down-Assay an das Prion-Protein
bindet, wurde überprüft, ob HPg auch im Far Western Blot einsetzbar ist oder ob Plasminogen
nicht an das durch SDS denaturierte PrP bindet.
HPg wurde in der Konzentration 2mg/ml in PBS gelöst. Die Proben mit BSE- und BSE+Homogenat hergestellten Proben ohne/mit PK wurden auf einem SDS-PAGE aufgetrennt und
anschliessend auf eine PVDF-Membran geblottet. Der Western Blot wurde dann wie
beschrieben mit HPg als primärer Antikörper (verwendete Konzentrationen: 1:1, 1:5, 1:100,
140
Prion Resultate
1:500, 1:1000, 1:5000) und mit sheep anti-HPg HRP-gekoppelt 1:5000 als
Sekundärantikörper durchgeführt. Die Signale wurden durch Exposition auf Film detektiert.
Es konnte keine spezifische Interaktion mit PrP festgestellt werden (siehe Bild 6.4). Bei den
nicht mit PK-verdauten Proben wurde zwar ein Signal festgestellt; die sich zeigenden Banden
stimmten aber nicht mit denen durch 6H4 detektierten überein. Nach dem Verdau mit PK
konnte überhaupt keine Bindung von HPg an das Prion-Protein festgestellt werden. Auch eine
Erhöhung der HPg-Konzentration beim Western Blot brachte kein spezifisches Signal,
sondern erhöhte im Gegenteil den unspezifischen Hintergrund.
Far Western Blot mit HPg
BSE
PK
-
+
+
-
+
+
40 kDa
30 kDa
20 kDa
Bild 6.4: Far Western Blot mit HPg als primärer Antikörper; je 15 µl Probe; verwendete Membran: PVDFMembran; eingesetzte HPg-Verdünnung: 1:5000; Sekundärantikörper: sheep anti-HPg 1:5000; Expositionszeit: 5
min
6.1.1.4 Andere Massnahmen
Der unspezifische Hintergrund auf dem Blot war bisher stark und störte die Auswertung der
Analyse. Eine Möglichkeit, das Signal/Hintergrund-Verhältnis zu erhöhen, bestand in der
Verwendung eines effizienteren Blockers.
Der Pull Down-Assay wurde wie beschrieben mit BSE- und BSE+-Homogenat ohne PK
durchgeführt. Von den Proben wurden ½-Verdünnungsreihen hergestellt. Beim Western Blot
wurden drei verschiedene Blocker getestet: Milchpulver, ECL Block und NapSure Blocker.
Die Signale wurden danach durch Exposition auf Film detektiert.
Es stellte sich heraus, dass der unspezifische Hintergrund durch ECL Block und vor allem
durch NapSure Blocker massiv reduziert werden konnte. Der Assay wurde dadurch sensitiver
und die Auswertung der Signale eindeutiger. In allen weiteren Experimenten wurde nur noch
mit NapSure Blocker gearbeitet.
Möglicherweise wurde mit dem Erhitzen der Beads in nur 20 µl 1x Tris Glycine SDS Sample
Buffer nicht sämtliches Protein von den Beads abgelöst. Deshalb wurde der Pull Down-Assay
141
Prion Resultate
je zweimal mit BSE- und BSE+-Homogenat ohne PK durchgeführt und die Proteine einmal
mit 20 µl und einmal mit 40 µl 1x Tris Glycine SDS Sample Buffer eluiert. Der Western Blot
wurde wie gewohnt durchgeführt. Die Signale wurden auf Film detektiert.
Durch das Erhitzen der Beads im doppelten Sample Buffer Volumen konnte die Menge an
abgelöstem Protein erhöht werden. Auf dem Blot manifestierte sich dies durch Herabsetzung
des Detektionslimits um eine Lane; es wurde also doppelt so viel Protein eluiert. Bei allen
weiteren Experimenten wurden die Beads in 40 µl 1x Tris Glycine SDS Sample Buffer
erhitzt.
Um zu überprüfen, ob die an die Dynabeads® gekoppelten 200 µg Plasminogen ausreichend
für die Isolierung des gesamten sich in der Probelösung befindlichen PrP waren, wurde ein
Ansatz Dynabeads® mit 500 µg HPg beschichtet. Anschliessend wurde der Pull Down-Assay
je zweimal mit BSE- und BSE+-Homogenat ohne PK, einmal mit 200 µg-Beads sowie
einmal mit 500 µg-Beads durchgeführt. Der Western Blot wurde wie gewohnt durchgeführt.
Es wurde festgestellt, dass sich mit den 500 µg-Beads wesentlich mehr PrPSc isolieren liess;
gleichzeitig nahm aber auch die Menge an gebundenem PrPC zu. Es wurden bei den weiteren
Versuchen nur noch Beads verwendet, die mit 500 µg Plasminogen beschichtet waren, um
möglichst alles PrP binden und anschliessend detektieren zu können.
Durch die Zugabe von mehr (100 µl) HPg-gekoppelten Beads zur Assaylösung konnte nicht
mehr PrP isoliert werden. Da jedoch die unspezifische Bindung von anderen Proteinen im
Homogenat zunahm, wurde die einzusetzende Menge auf 50 µl beschichtete Dynabeads®
festgelegt.
6.1.1.5 Vergleich mit anderen Probenvorbereitungsmethoden
Durch diese Reihe von Optimierungsmassnahmen konnte die Sensitivität wesentlich
verbessert werden. Nun wurde die Detektionsgrenze des Pull Down-Assays mit derjenigen
von Proben verglichen, die nach der HDR-Methode oder direkt aus dem aufbereiteten
Homogenat vorbereitet worden waren.
Die Proben wurden wie beschrieben vorbereitet. Von den Proben wurden ½Verdünnungsreihen hergestellt. Der Western Blot wurde wie gewohnt durchgeführt.
Die Auswertung der Filme ergab folgende Resultate:
Probe
BSE- ohne PK
BSE+ ohne PK
BSE- mit PK
BSE+ mit PK
direkt
3.6 µg Homogenat
3.6 µg Homogenat
-7.3 µg Homogenat
HDR
7.3 µg Homogenat
14.6 µg Homogenat
-14.6 µg Homogenat
Pull Down
0.94 mg Homogenat
7.3 µg Homogenat
-14.6 µg Homogenat
Tabelle 6.2: Niedrigste detektierte Homogenatmengen unterschiedlich vorbereiteter Proben
Der Pull Down-Assay kann also, was die niedrigste detektierte Homogenatmenge betrifft,
ohne weiteres mit den anderen beiden Probenvorbereitungsmethoden mithalten. Leider ist die
Interaktion Plasminogen-PrPSc nicht vollständig spezifisch, so dass immer eine kleine Menge
PrPC an die Beads bindet.
142
Prion Resultate
6.1.1.6 Vergleich BSE-Scrapie
Der Pull Down-Assay mit HPg-beschichteten Dynabeads® wurde auch mit Homogenat aus
normalem und Scrapie-infiziertem Hamstergehirn durchgeführt. Dabei muss beachtet werden,
dass der PrP-Titer in Hamsterhirn 1000 mal höher ist als in Rinderhirn. Die Proben müssen
deshalb in einer ½ log-Reihe verdünnt werden.
Der Pull Down-Assay wurde wie beschrieben mit Scrapie- und Scrapie+-Homogenat ohne PK
durchgeführt. Von den Proben wurden ½-Verdünnungsreihen hergestellt und mittels Western
Blot analysiert.
Wie die Auswertung zeigte, haben auch PrPC und PrPSc von Scrapie eine unterschiedliche
Affinität zu Plasminogen (siehe Bild 6.5). Da aber im Hamstergehirn viel mehr PrP
vorhanden ist, sind die Beads gesättigt, das heisst, es kann mit den Beads nicht alles PrPSc
isoliert werden. Dies könnte aber durch Zugabe von mehr Dynabeads® oder durch Einsetzen
einer geringeren Menge Hirnhomogenat erreicht werden.
Isolierung von PrP aus Scrapie mit HPg-Beads
½-Verdünnungsreihe
40 kDa
30 kDa
40 kDa
30 kDa
Scrapienegativ
Scrapiepositiv
Bild 6.5: Isolation von PrP aus Scrapie-negativem und –positivem Hamster-Hirnhomogenat; ½-Verdünnungsreihen; Startmenge der Verdünnungsreihe: 15 µl unverdünnte Probe; Beads mit 500 µg gekoppeltem HPg;
verwendete Membran: Nitrozellulose-Membran; Antikörper: 3F4 (1:5000)/ goat anti-mouse AP-gekoppelt
(1:15000); Expositionszeit: 5 min
143
Prion Resultate
6.2.2 Pull Down-Assay mit Plasminogen von verschiedenen
Spezies
Plasminogen aus verschiedenen Spezies ist in der Aminosäuresequenz zu grossen Teilen
(durchschnittlich 85%) homolog. Die grösste Übereinstimmung mit 94% besteht zwischen
bovinem und ovinem Plasminogen. Möglicherweise führen aber kleine Differenzen in der
Primärstruktur zu Unterschieden in der Affinität der verschiedenen Plasminogen-Arten zum
Prion-Protein. Dies könnte dann für einen verbesserten Pull Down-Assay ausgenützt werden.
Zur Überprüfung dieser Möglichkeit wurden Dynabeads® mit Plasminogen vom Rind (BPg),
Schaf (OPg), Pferd (EPg), Kaninchen (RPg), Schwein (PPg), Ziege (GPg), Hund (CPg) und
Menschen (HPg) beschichtet. Der Protein-Gehalt der Plasminogen-Lösungen vor und nach
der Kopplung wurde mittels Lowry-Assay bestimmt. Die Messung ergab, dass in allen Fällen
sämtliches Protein an die Beads gebunden hatten.
durchgeführt. Die an die Dynabeads gebundenen Proteine wurden durch Erhitzen in 1x Tris
Glycine SDS Sample Buffer eluiert. Von den Proben wurden ½-Verdünnungsreihen
hergestellt und der Western Blot wie beschrieben durchgeführt.
Die Auswertung der Signale auf Film ergab keinen erkennbaren Unterschied in der Affinität
von Plasminogen verschiedener Spezies zum Prion-Protein. Einzig GPg schien eine geringere
Affinität zu PrPC und PrPSc zu haben. Dies ist aber vermutlich auf eine Degenerierung des
Proteins zurückzuführen, da GPg schon vor längerer Zeit von Mitgliedern der Gruppe
Schaller isoliert worden waren.
Probe
HPg
BPg
OPg
PPg
EPg
CPg
RPg
GPg
BSE0.94 mg Homogenat
0.94 mg Homogenat
1.88 mg Homogenat
0.94 mg Homogenat
0.94 mg Homogenat
0.94 mg Homogenat
0.94 mg Homogenat
3.75 mg Homogenat
BSE+
7.3 µg Homogenat
7.3 µg Homogenat
7.3 µg Homogenat
7.3 µg Homogenat
14.6 µg Homogenat
14.6 µg Homogenat
7.3 µg Homogenat
58.6 µg Homogenat
Tabelle 6.3: Niedrigste detektierte Homogenatmengen der mit Plasminogen von unterschiedlichen Spezies
gekoppelten Beads
6.2.3 Pull Down-Assay mit verschiedenen Fragmenten von
Plasminogen
Plasminogen besteht aus fünf Kringeldomänen, die alle eine Lysinbindungsstelle mit
unterschiedlich ausgeprägter Lysinaffinität haben. In Experimenten konnte gezeigt werden,
dass die Zugabe von Lysin die Bindung des Prion-Proteins an Plasminogen verhindert.
Deshalb kann angenommen werden, dass PrP und Plasminogen über die Lysinbindungsstellen
der Kringel miteinander interagieren. Es wäre also möglich, dass Kringel mit verschiedener
Lysinaffinität auch unterschiedlich stark an PrP binden.
144
Prion Resultate
Verschiedene Fragmente von Plasminogen (K1FXa, K1mut, K23, K23mut, K13, K4) wurden
rekombinant in E. coli exprimiert oder durch limitierte Elastasespaltung von HPg generiert.
Die Dynabeads wurden nun mit diesen Proteinen beschichtet. Der Protein-Gehalt der
Plasminogen-Lösungen vor und nach der Kopplung wurde mittels Lowry-Assay bestimmt. Im
Gegensatz zu den Kopplungen mit vollständigem Plasminogen band bei weitem nicht alles
gelöste Protein an die Beads. Auch zwischen den verschiedenen Fragmenten gab es grosse
Unterschiede.
Protein
K1FXa
K1FXamut
K23
K23mut
K13
K4
Menge gebundenes Protein
170 µg
156 µg
194 µg
181 µg
204 µg, 236 µg
122 µg
Tabelle 6.4: Vergleich der an die Beads gebundenen Mengen der verschiedenen Fragmente
Vergleich zwischen Beads beschichtet mit HPg, K13, K4
¼-Verdünnungsreihen
1 2 3 4
5
6 7
8 9 10 11 12
40 kDa
BSE30 kDa
BSE+
40 kDa
30 kDa
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Bild 6.6: Vergleich zwischen HPg-, K13- und K4-gekoppelten Beads; 1 – 4: HPg-beschichtete Beads, BSEneagitves Homogenat; 5 – 8: K13-bschichtete Beads, BSE-negatives Homogenat; 9 – 12: K4-beschichtete Beads,
BSE-negatives Homogenat; 13 – 16: HPg-beschichtete Beads, BSE-Positives Homogenat; 17 – 20: K13beschichtete Beads, BSE-positives Homogenat; 21 – 24: K4-beschichtete Beads, BSE-positives Homogenat; ¼Verdünnungsreihen; Startmenge: 15 µl unverdünnte Probe; verwendete Membran: PVDF-Membran;
Expositionszeit: 1 h
145
Prion Resultate
durchgeführt. Die unverdünnten bzw. verdünnten Proben wurden mittels SDS-PAGE
aufgetrennt und der Western Blot wie beschrieben durchgeführt. Die Signale wurden durch
Exposition auf Film festgehalten (siehe Bilder 6.6, 6.7).
Da die Beads mit unterschiedlichen Mengen der Plasminogenfragmente beschichtet waren,
war kein quantitativer Vergleich möglich. Qualitative Unterschiede konnten insofern
festgestellt werden, als dass K23mut und K1FXamut eine höhere Affinität zu PrPSc
aufzuweisen schienen. Offenbar ermöglichte die durch die Mutationen Cys169Gly und
Cys297Ser veränderte Ladungsoberfläche von K23mut eine bessere Bindung von PrPSc an das
Plasminogenfragment. Mit K1Fxamut war ein Fragment eingesetzt worden, dessen
Lysinbindungsstelle durch Mutation inaktiviert worden war. Dass die Lysinbindungsstelle
nicht mehr funktionstüchtig war, konnte mittels Fluoreszenzspektroskopie festgestellt werden.
Da trotzdem eine Interaktion Prion-K1FXamut stattfand, musste also angenommen werden,
dass entweder die Interaktion zwischen Plasminogen und PrP doch nicht über die
Lysinbindungsstelle stattfindet, oder dass die Mutation zwar die Interaktion K1FXamut – 6AHA hemmt, nicht aber diejenige zwischen K1Fxamut und dem Prion-Protein.
Vergleich zwischen Beads beschichtet mit HPg, K1FXa, K1FXamut,
K23, K23mut
1 2 3 4 5
6
7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
40 kDa
30 kDa
40 kDa
30 kDa
25 26 27 28 29 30 31 32
33 34 35 36 37 38 39 40
Bild 6.7: Vergleich zwischen HPg-, K1FXa-, K1FXamut-, K23- undK23mut-gekoppelten Beads; 1 – 4: HPgbeschichtete Beads, BSE-negatives Homogenat; 5 – 8: K1FXa-bschichtete Beads, BSE-negatives Homogenat; 9
– 12: K1FXamut-beschichtete Beads, BSE-negatives Homogenat; 13 – 16: HPg-beschichtete Beads, BSEPositives Homogenat; 17 – 20: K1FXa-beschichtete Beads, BSE-positives Homogenat; 21 – 24: K1FXamutbeschichtete Beads, BSE-positives Homogenat; 25 – 28: K23-beschichtete Beads, BSE-negatives Homogenat;
29 – 30: K23mut-beschichtete Beads, BSE-negatives Homogenat; 33 – 36: K23-beschichtete Beads, BSEpositives Homogenat; 37 – 40: K23mut-beschichtete Beads, BSE-positives Homogenat; ¼-Verdünnungsreihen;
Startmenge: 15 µl unverdünne Probe; verwendete Membran: PVDF-Membran; Expositionszeit: 1 h
146
Prion Resultate
6.2.4 Pull Down-Assay mit Zusatz von EDTA
PrPC ist ein kupferbindendes Protein mit einer erhöhten Affinität auch für andere Metallionen,
während PrPSc so gut wie kein Kupfer bindet. Durch die Zugabe von EDTA, einem
Chelatbildner, können die Kupferionen entfernt werden. Durch das folgende Experiment
sollte der Einfluss von EDTA auf das Bindungsverhalten von PrP an Plasminogen untersucht
werden.
Vergleich Pull Down-Assay ohne/mit EDTA
BSE-
40 kDa
30 kDa
40 kDa
30 kDa
BSE+
ohne
EDTA
mit 50 mM
EDTA
Bild 6.8: Qualitativer Vergleich von Proben aus Pull Down-Assays ohne/mit EDTA; ½-Verdünnungsreihe;
Startmenge: 15 µl unverdünnte Probe; verwendete Membran: PVDF-Membran; Beads mit 500 µg gekoppeltem
HPg; Expositionszeit: 1 h
Dem Assaypuffer des Dynabeads®-Pull Down-Assays wurden verschiedene Mengen EDTA
zugegeben, so dass die Endkonzentrationen 5, 10, 20 und 50 mM EDTA betrugen. Der Pull
Down Assay wurde danach mit BSE- und BSE+-Homogenat ohne PK wie beschrieben
durchgeführt. Von den Proben wurden ½-Verdünnungsreihen hergestellt. Der Western Blot
wurde wie gewohnt durchgeführt und die Signale auf Film festgehalten.
Bei keiner der EDTA-Konzentrationen konnte ein Unterschied zu Standard-Probe ohne
Zusatz detektiert werden (siehe Bild 6.8). Möglicherweise ist der Effekt der durch EDTA
entfernten Kupferionen zu gering, als dass er auf diese Weise detektiert werden könnte.
147
Prion Resultate
Probe
ohne EDTA
5 mM EDTA
10 mM EDTA
20 mM EDTA
50 mM EDTA
BSE1.9 mg Homogenat
1.9 mg Homogenat
1.9 mg Homogenat
1.9 mg Homogenat
1.9 mg Homogenat
Tabelle 6.5: Niedrigste detektierte Homogenatmengen
Konzentrationen von EDTA
BSE+
29.3 µg Homogenat
29.3 µg Homogenat
29.3 µg Homogenat
29.3 µg Homogenat
29.3 µg Homogenat
von Proben mit Zusatz von verschiedenen
6.2.5 Pull Down-Assay mit Inhibition durch 6-AHA
Wie schon oben erwähnt, konnte in Experimenten gezeigt werden, dass Lysin die Interaktion
zwischen PrP und Plasminogen hemmt. Dies sollte eigentlich auch durch die Zugabe von 6AHA, einem Lysin-Analogon, möglich sein. 6-AHA wird als Ligand bei
Fluoreszenzmessungen mit Plasminogen-Kringeln und bei der Elution von Plasminogen von
der Lys-Bio-Gel-Säule verwendet.
Inhibition mit 6-AHA
0.2 M 6-AHA im Assaypuffer/ mit 0.2 M 6-AHA vorinkubierte Beads
¼-Verdünnungsreihe
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
40 kDa
30 kDa
40 kDa
30 kDa
6-AHA im
Assaypuffer
mit 6-AHA
vorinkubierte
Beads
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Bild 6.9: Effekt von 6-AHA auf die Interaktion zwischen PrP und Plasminogen; verwendete 6-AHAKonzentration: 0.2 M 6-AHA; 1 – 3: BSE-negatives Homogenat, ohne 6-AHA; 4 – 6: BSE-negatives
Homogenat, mit 6-AHA; 7 – 9: BSE-Positives Homogenat, ohne 6-AHA; 10 – 12: BSE-positives Homogenat,
mit 6-AHA; 13 – 15: BSE-negatives Homogenat, ohne 6-AHA; 16 – 18: BSE-positives Homogenat, ohne 6AHA; 19 – 21: BSE-negatives Homogenat, mit 6-AHA; 22 – 24: BSE-positives Homogenat, mit 6-AHA;
Startmenge: 15 µl unverdünnte Probe; Beads mit 500 µg gekoppeltem HPg; verwendete Membran: PVDFMembran; Expositionszeit: 1 h
148
Prion Resultate
Inhibition mit verschiedenen 6-AHA-Konzentrationen
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
40 kDa
BSE+
30 kDa
40 kDa
BSE30 kDa
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Bild 6.10: Zusatz von verschiedenen 6-AHA-Konzentrationen zum Assaypuffer; 1 – 3: BSE-positives
Homogenat, ohne 6-AHA; 4 - 6: BSE-positives Homogenat, mit 0.2 M 6-AHA im Assaypuffer; 7 – 9: BSEpositives Homogenat mit 0.5 M 6-AHA im Assaypuffer; 10 – 12: BSE-positives Homogenat mit 1.0 M 6-AHA
im Assaypuffer; 12 – 15: BSE-negatives Homogenat ohne 6-AHA; 16 – 18: BSE-negatives Homogenat mit 0.2
M 6-AHA m Assaypuffer; 19 – 21: BSE-negatives Homogenat mit 0.5 M 6-AHA im Assaypuffer; 22 – 24: BSEnegatives Homogenat mit 1.0 M 6-AHA im Assaypuffer; ¼-Verdünnungsreihen; Startmenge: 15 µl unverdünnte
Probe; verwendete Membran: PVDF-Membran; Beads mit 500 µg gekoppeltem HPg; Expositionszeit: 1 h
6.2.5.1 Vorinkubation der Beads mit 6-AHA
50 µl HPg-gekoppelte Beads wurden während 1 min in 15 mM Phosphatpuffer pH 7.4 + 0.2
M 6-AHA inkubiert. Nach Absaugen des Überstands in der Magnetapparatur wurde 1 ml
Assaypuffer und BSE- und BSE+-Homogenat zugegeben und der Pull Down-Assay
unmodifiziert durchgeführt. Die an die Dynabeads gebundenen Proteine wurden durch
Erhitzen in 1x Tris Glycine SDS Sample Buffer eluiert. Von den Proben wurden je 15 µl
mittels SDS-PAGE aufgetrennt und der Western Blot wie beschrieben durchgeführt. Der
Western Blot wurde unverändert durchgeführt und die Signale auf Film festgehalten.
Bei einem anderen Experiment wurden zu der Homogenat-Lösung erst mit 6-AHA
vorinkubierte HPg-gekoppelte Beads gegeben, diese nach 1 min entfernt und gewöhnliche
HPg-Gekoppelte Beads zugegeben. Der Assay wurde danach wie oben beschrieben
durchgeführt. Die Signale wurden durch Exposition auf Film detektiert.
Beim ersten Versuch zeigte sich, dass die Interaktion von PrPSc mit HPg durch 6-AHA fast
vollständig inhibiert wurde, während ein Teil von PrPC immer noch an Plasminogen band.
149
Prion Resultate
Beim zweiten Experiment hatte fast alles PrPSc, aber kein PrPC an die ersten, 6-AHA
vorinkubierten Beads gebunden. Es scheint, dass nicht nur Lysin, sondern auch sein Analogon
6-AHA die Interaktion zwischen PrPSc und Plasminogen inhibieren kann; die Interaktion
HPg-PrPC bleibt dabei weitgehend unbeeinflusst (siehe Bild 6.9 unten)
6.2.5.2 Zusatz von 6-AHA zum Assaypuffer
Um diesen Effekt weiter zu untersuchen, wurden dem Assaypuffer des Pull Down-Assay
verschiedene Mengen 6-AHA zugesetzt (siehe Bild 6.9 oben, Bild 6.10).
Es wurde Assaypuffer mit 6-AHA-Konzentrationen von 0.1, 0.2, 0.3,... 0.9 und 1.0 M 6-AHA
hergestellt. Mit BSE- und BSE+-Homogenat ohne PK wurde der Pull Down-Assay wie
beschrieben durchgeführt. Die an die Dynabeads gebundenen Proteine wurden durch Erhitzen
in 1x Tris Glycine SDS Sample Buffer eluiert. Von den Proben wurden ¼-Verdünnungsreihen
hergestellt. Von den unverdünnten bzw. verdünnten Proben wurden je 15 µl mittels SDSPAGE aufgetrennt und der Western Blot wie beschrieben durchgeführt. Die Signale wurden
durch Exposition auf Film festgehalten.
Der Zusatz von 6-AHA hatte unterschiedlichen Einfluss auf PrPC und PrPSc. Während PrPSc
bei Zugabe von 0.5 M 6-AHA zum Assaypuffer nicht mehr an die HPg-Beads band, ergab
PrPC auch noch bei 0.7 M 6-AHA ein Signal, obwohl das Anfangssignal im Vergleich zu
PrPSc ungleich schwächer war. Möglicherweise bindet PrPC nicht, wie PrPSc, an die
Lysinbindungsstelle und bleibt deshalb von 6-AHA unbeeinflusst.
6.2.6 Pull Down-Assay mit Elution durch 6-AHA
Elution von PrP mit 0.2 M 6-AHA
¼-Verdünnungsreihe
1
2
3
4
5
6 7
8 9 10 11 12
40 kDa
30 kDa
Bild 6.11: Elution von PrP mit 0.2 M 6-AHA; 1 – 3: BSE-negatives Homogenat, normale Elution; 4 – 6: BSEnegatives Homogenat, Elution mit 6-AHA; 7 – 9: BSE-positives Homogenat, normale Elution; 10 – 12: BSEpositives Homogenat, Elution mit 6-AHA; ¼-Verdünnungsreihen; Startmenge: 15 µl unverdünnte Probe;
verwendete Membran: PVDF-Membran; Beads mit 500 µg gekoppeltem HPg; Expositionszeit: 1 h
150
Prion Resultate
Während die Inhibition der Interaktion von PrPSc und HPg durch 6-AHA demonstriert werden
konnte, müsste eigentlich auch, im Falle einer Bindung von PrPSc an die Lysinbindungsstelle
von Plasminogen, eine Elution des Prion-Proteins mit 6-AHA möglich sein.
durchgeführt. Die an die Dynabeads gebundenen Proteine wurden durch Elution mit 15 mM
Phosphatpuffer pH 7.4 + 6-AHA (Konzentrationen: 0.1, 0.2,...0.9, 1.0 M) während 5 min bei
RT im Thermomixer abgelöst. Von den Proben wurden ¼-Verdünnungsreihen hergestellt. Die
unverdünnten bzw. verdünnten Proben wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und der
Western Blot wie beschrieben durchgeführt. Die Signale wurden durch Exposition auf Film
Die Auswertung der Signale ergab, dass PrPSc (und zu einem sehr kleinen Anteil auch PrPC)
durch Elution mit 6-AHA von den Beads abgelöst werden kann. Die Elution war aber nicht
vollständig, auch nach mehreren Elutionsvorgängen blieb immer noch ein Rest Prion-Protein
an die Beads gebunden. Offenbar ist nicht alles PrP zugänglich, oder es existiert ein
Gleichgewicht zwischen Bindung an und Ablösung von den Beads.
6.2.7 Pull Down-Assay
grösseren Volumina
mit beschichteten Dynabeads aus
Isolation von PrP aus grösseren Volumina
BSE-
BSE+
40 kDa
Standard
30 kDa
40 kDa
5 ml Puffer
30 kDa
40 kDa
10 ml Puffer
30 kDa
Bild 6.12: Qualitativer Vergleich zwischen Standardproben und Proben aus Pull Down-Assays aus grösseren
Volumina; ½-Verdünnungsreihen; Startmenge: 15 µl unverdünnte Probe; verwendete Membran: PVDFMembran; Beads mit 500 µg gekoppeltem HPg; Expositionszeit: 1 h
151
Prion Resultate
Eine praktische Anwendung für den Pull Down-Assay mit Plasminogen-beschichteten Beads
wäre die Überprüfung von pharmazeutischen Lösungen und Körperflüssigkeiten wie Blut,
Blutplasma oder Urin auf ihren Gehalt an Prionen. Dazu müssen die Beads aber in der Lage
sein, auch in grösseren Volumina alles in Lösung befindliches PrP zu binden.
Dazu wurde der Pull Down-Assay mit BSE- und BSE+-Homogenat, 50 µl HPg-gekoppelten
Beads und verschiedenen Volumina Assaypuffer (1, 2, 5, 10 ml) durchgeführt. Die Proben
wurden während 1 h 30 min auf einem End-over-end-Shaker gemischt. Nach dem Absaugen
des Überstand in der Magnetapparatur wurden die Beads in 40 µl 1x Tris Glycine SDS
Sample Buffer erhitzt. Von den Proben wurden ½-Verdünnungsreihen hergestellt. Von den
unverdünnten und verdünnten Proben wurden je 15 µl mittels SDS-PAGE aufgetrennt und der
detektiert (siehe Bild 6.12).
Es musste festgestellt werden, dass sich die Menge an isoliertem PrP umgekehrt proportional
zum Probenvolumen verhielt, d.h. je grösser das Probenvolumen, desto weniger PrP band an
die HPg-Beads. Mögliche Gründe dafür sind eine niedrige Bindungskonstante, so dass in
dieser verdünnten Lösung nicht mehr alles PrP wiedergewonnen werden konnte, oder evtl.
auch eine ineffiziente Art der Durchmischung.
Probe
Standard 1 ml Assaypuffer
2 ml Assaypuffer
5 ml Assaypuffer
10 ml Assaypuffer
0.47 mg Homogenat
0.47 mg Homogenat
3.75 mg Homogenat
BSE+
29.3 µg Homogenat
58.6 µg Homogenat
0.18 mg Homogenat
0.23 µg Homogenat
Tabelle 6.6: Niedrigste detektierte Homogenatmengen von Proben aus grösseren Volumina
6.3 Pull Down-Assay mit Anionenaustauscher-/Kationenaustauscher-Beads
Es wurde nach einer Möglichkeit gesucht, entweder PrPC aus der Probelösung zu entfernen
oder ausschliesslich PrPSc zu binden. Da bekannt war, dass PrP auch durch chromatografische
Prozesse mit Anionen- oder Kationenaustauschern aus Lösungen entfernt werden kann, wurde
getestet, ob die Isolation von ausschliesslich einer der beiden Isoformen von PrP durch
DEAE- oder CM-Beads möglich war.
Der Pull Down-Assay wurde mit BSE- und BSE+-Homogenat ohne/mit PK durchgeführt.
Dabei wurde nach Kit-Anleitung vorgegangen. Zu den 20 µl Elutionspuffer wurden 20 µl 2x
Tris Glycine SDS Sample Buffer gegeben und die Probe im Heizblock während 5 min bei
95°C erhitzt. Von den Proben wurden je 15 µl mittels SDS-PAGE aufgetrennt und der
Die Auswertung zeigte, dass nur die Proben mit DEAE-Beads und unverdautem Homogenat
ein Signal ergab. Ob es sich dabei um PrP handelte, war nicht klar, da zwar das typische
Bandenmuster sichtbar war, dieses aber zu grösserer Masse hin verschoben war. Zwischen
dem Signal von PrPC und PrPSc konnte kein Unterschied festgestellt werden. Aus diesem
Grund wurde diese Variante des Pull Down-Assays nicht weiterverfolgt.
152
Prion Resultate
Pull Down-Assay mit DEAEund CM-Ionenaustauscher-Beads
BSE
PK
- - + +
- + - +
CM-Beads
- - + +
- + - +
DEAE-Beads
40 kDa
30 kDa
Bild 6.13: Pull Down-Assay mit Ionenaustauscher-Beads; schwache Anionenaustauscher: DEAE-Beads;
schwache Kationenaustauscher: CM-Beads; je 15 µl unverdünnte Probe; Expositionszeit: 1h
6.4 Pull Down-Assay mit Ni-NTA-Beads
Da PrPC (und zu einem geringen Anteil auch PrPSc) Kupfer bindet und rekombinantes PrP
über Ni-NTA-Agarose gereinigt werden kann, wurde versucht, das Prion-Protein mittels NiNTA-beschichteter Beads aus Hirnhomogenaten zu isolieren. Ni-NTA-Beads sind, wie
Dynabeads®, paramagnetisch und können deshalb auf gleiche Weise eingesetzt werden.
Im ersten Experiment wurde der geeignetste Puffer für die Inkubation der Beads in der
Homogenatlösung bestimmt. Dazu wurde der Pull Down-Assay wie beschrieben
durchgeführt. Als Puffer wurden Assay-Puffer und Imidazol-Puffer eingesetzt. Die an die
Beads gebundenen Proteine wurden entweder durch Erhitzen in 1x Tris Glycine SDS Sample
Buffer oder durch Elution mit Elutions-Puffer abgelöst. Die Proben wurden mittels SDSPAGE aufgetrennt. Nach der Durchführung des Western Blots mit den Antikörpern 6H4/ goat
anti-mouse HRP-gekoppelt und Inkubation des Blots in ECL plus™ Western Blotting Reagenz
wurden die Signale durch Exposition auf Film festgehalten.
Die detektierten Signale (siehe Bild 6.14) liessen einen grossen Unterschied zwischen Proben
in Assaypuffer oder in Imidazol-Puffer erkennen. Deshalb wurde auf die weitere Verwendung
von Imidazol-Puffer verzichtet. Die beiden Elutionsmethoden waren als gleichwertig zu
betrachten. Die Elution durch Erhitzen ist jedoch weniger aufwendig. Die Affinität von PrPC
für die Ni-NTA-Beads war, wie vorausgesagt, viel höher als diejenige von PrPSc.
Ein Vergleich von ½-Verdünnungsreihen von Proben aus Pull-Down-Assays mit Dynabeads®
und Ni-NTA-Beads ergab folgendes:
153
Prion Resultate
BSE- Homogenat
58.6 µg Homogenat
0.94 mg Homogeat
Ni-NTA-Beads
Dynabeads®
BSE+ Homogenat
0.23 mg Homogenat
14.6 µg Homogenat
Tabelle 6.7: Niedrigste detektierte Homogenatmengen von Proben aus Pull Down-Assays mit HPg- und NiNTA-beschichteten Beads
Pull Down-Assay mit Ni-NTA-Beads
Test Puffer, Elution
Imidazolpuffer
Assaypuffer + +
Elutionspuffer
Erhitzen + +
BSE + -
+
+
+ +
+ -
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
40 kDa
30 kDa
Bild 6.14: Vergleich von Proben aus Pull Down-Assay mit Ni-NTA-Beads; Assaypuffer vs. Imidazolpuffer;
Erhitzen vs. Elutionspuffer; je 15 µl unverdünnte Probe; verwendete Membran: PVDF-Membran;
Expositionszeit: 1 h
Die Durchführung des Assays mit der doppelten Menge Ni-NTA-Beads ergab dieselben
Werte wie mit 50 µl Ni-NTA-Beads. Offenbar ist nicht alles PrP gleichzeitig für die Beads
zugänglich, oder es existiert in der Assaylösung ein Gleichgewicht zwischen Bindung an und
Ablösung von den Beads.
Es wurde nun versucht, PrPC aus der Homogenat-Assaylösung zu entfernen. Danach sollte es
möglich sein, PrPSc ohne störende unspezifische Bindung des zellulären Proteins an die
Dynabeads® zu detektieren. Dazu wurde die Lösung 3x mit jeweils neuen Ni-NTA-Beads
inkubiert. Anschliessend wurden Dynabeads zur Homogenat-Assaylösung gegeben und wie
gewohnt inkubiert und die gebundenen Proteine eluiert. Von den Proben wurden ½Verdünnungsreihen hergestellt. Die unverdünnten und verdünnten Proben wurden mittels
SDS-PAGE aufgetrennt und der Western Blot wie beschrieben durchgeführt. Die Auswertung
der exponierten Filme ergab folgende Werte:
154
Prion Resultate
BSE58.6 µg Homogenat
0.23 mg Homogenat
0.47 mg Homogenat
3.75 mg Homogenat
1x Ni-NTA-Beads
2x Ni-NTA-Beads
3x Ni-NTA-Beads
Dynabeads®
BSE+
0.23 mg Homogenat
0.23 mg Homogenat
0.47 mg Homogenat
58.6 µg Homogenat
Tabelle 6.8: Niedrigste detektierte Homogenatmengen von Pull Down-Assays mit Ni-NTA-Vorinkubation
Offenbar kann PrPC durch Inkubation mit Ni-NTA-Beads bis auf einen kleinen Rest aus der
Homogenat-Assaylösung entfernt werden (siehe Bild 6.15). Weil dabei aber auch PrPSc an die
Beads bindet, würde bei der Elimination von PrPC auf diese Weise ein grosser Teil der
Sensitivität des Pull Down-Assays mit beschichteten Dynabeads verloren gehen.
Pull Down-Assay mit HPg-beschichteten Beads
Vorinkubation mit Ni-NTA-Beads
BSE40 kDa
30 kDa
40 kDa
BSE+
1x Ni-NTABeads
30 kDa
2x Ni-NTABeads
40 kDa
30 kDa
3x Ni-NTABeads
40 kDa
HPg-Beads
30 kDa
Bild 6.15: Qualitativer Vergleich von Proben aus Pull Down-Assay mit HPg-beschichteten Beads;
Vorinkubation mit Ni-NTA-Beads; ; ½-Verdünnungsreihen; Startmenge: 15 µl unverdünnte Probe; verwendete
Membran: PVDF-Membran; Beads mit 500 µg gekoppeltem HPg; Expositionszeit: 1 h
155
Prion Resultate
6.5 Pull Down-Assay mit Metall-beschichteter chelierender Sepharose
Durch den Pull Down-Assay mit Ni-NTA-Beads konnte gezeigt werden, dass das PrionProtein, vor allem PrPC, eine Affinität für Ni2+ hat. Um untersuchen zu können, ob die
Affinität zu anderen Übergangsmetall-Ionen gleich ist, wurde ein Pull Down-Assay mit
Metall-beschichteter chelatierender Sepharose durchgeführt.
Dazu musste die Sepharose erst mit den Metall-Ionen beschichtet werden. Dies wurde wie
beschrieben durchgeführt. Die zuvor farblose Matrix erschien nach der Bindung der Ionen
rosa (Kobalt), hellblau (Kupfer) und hellgrün (Nickel). Die Sepharose wurde in 20% Ethanol
bei 4°C gelagert.
Pull Down-Assay mit Metall-beschichteter Sepharose
BSE-
BSE+
40 kDa
30 kDa
40 kDa
30 kDa
40 kDa
30 kDa
HPg-Beads
KobaltSepharose
NickelSepharose
Bild 6.16: Vergleich von Proben aus Pull Down-Assay mit HPg-beschichteten Beads und aus Pull Down-Assay
mit Metall-beschichteter Sepharose; ½-Verdünnungsreihen; Startmenge: 15 µl unverdünnte Probe; verwendete
Membran: PVDF-Membran; Beads mit 500 µg gekoppeltem HPg; Expositionszeit: 1 h; nicht gezeigt: Assay mit
Kupfer-Sepharose
Der Pull Down-Assay wurde mit aufbereitetem Homogenat (BSE-/BSE+, ohne PK)
durchgeführt und die Proteine eluiert. Die Proben wurden entweder unverdünnt oder in einer
¼-Verdünnungsreihe weiterverwendet. Nach der Durchführung des Western Blots mit den
Antikörpern 6H4/ goat anti-mouse HRP-gekoppelt und Inkubation des Blots in ECL plus™
Western Blotting Reagenz wurden die Signale durch Exposition auf Film festgehalten.
Im direkten Vergleich zwischen den Metallionen wurde festgestellt, dass PrPC die höchste
Affinität für Nickel- und nicht wie erwartet für Kupfer-beschichtete Sepharose hatte (siehe
Bild 6.16). Am schwächsten band das Prion-Protein an Kupfer. PrPC band in allen drei Fällen
(Kupfer, Nickel, Kobalt) stärker an die Sepharose als PrPSc, vermutlich, weil bei PrPSc die
Metall-bindenden Motive im Innern verborgen sind.
156
Prion Resultate
0.47 mg Homogenat
29.3 µg Homogenat
0.94 mg Homogenat
HPg
Kobalt-Sepharose
Nickel-Sepharose
Kupfer-Sepharose
BSE+
29.3 µg Homogenat
0.47 mg Homogenat
0.23 mg Homogenat
0.94 mg Homogenat
Tabelle 6.9: Niedrigste detektierbare Homogenatmenge von Pull Down-Assays mit HPg-gekoppelten Beads und
Metall-beschichteter chelatierender Sepharose
6.6 Dot Blot
Der Dot Blot ist eine schnelle und unkomplizierte Methode, um die Interaktion zwischen
einem Antikörper und einem Antigen zu testen. Die Probenlösungen werden dabei direkt auf
eine Membran (in diesem Fall UltraBind™-Membran) aufgetropft. Der Vorteil dieser Methode
ist, dass die Proben nicht zuerst denaturiert werden müssen, wie dies bei SDS-PAGE der Fall
ist, so dass auch Proteine mit intakten Nativstrukturen untersucht werden können.
Dot Blot
Vergleich der Antikörper 6H4/6G4
BSE+
BSE-
6H4
BSE+
BSE-
6G4 1:20
BSE+
BSE-
6G4 1:100
BSE+
BSE-
6G4 1:1000
Bild 6.17: Qualitativer Vergleich von Dot Blots von BSE-negativem und –positivem Hirnhomogenat ohne PK
von 6H4 (Verdünnung 1:10000) und verschiedenen Verdünnungen von 6G4; ½-Verdünnungsreihen;
Startmenge: 1µl aufbereitetes Homogenat; verwendete Membran: UltraBind-Membran; Expositionszeit: 1h
157
Prion Resultate
Für das Experiment wurden Proben von aufbereitetem Hirnhomogenat (BSE-, BSE+)
ohne/mit PK hergestellt. Die ursprüngliche Probe und/oder die verdünnten Proben wurden auf
die UltraBind™-Membran aufgetropft. Die Membran wurde danach getrocknet. Danach wurde
der immunologische Nachweis wie beschrieben durchgeführt. Die Membran wurden in ECL
plus™ Western Blotting Reagenz inkubiert und die Signale durch Exposition auf Film
festgehalten.
Es wurden Dot Blots von BSE-negativem und BSE-positivem Hirnhomogenat mit 6H4 und
6G4 (Verdünnung: 1:20) durchgeführt. Beim Vergleich der Verdünnungsreihen fiel auf (siehe
Bild 6.17), dass 6G4 nur mit BSE-positivem Hirnhomogenat interagiert hatte. 6H4 hatte
ebenfalls eine höhere Affinität zu BSE-positivem als zuBSE-negativem Homogenat. Dieses
Resultat schien darauf hinzuweisen, dass 6G4 nur mit PrPSc interagierte.
Dot Blot
Vergleich verschiedene Antikörper
Vergleich verschiedene Homogenate
BSE
Scrapie
6H4
+
-
3F4
+
-
2E7
+
-
7C1
+
-
2D10
+
-
6G4
+
-
Bild 6.18: Vergleich von Dot Blots von verschiedenen Scrapie- und BSE-negativen und –positiven
Hirnhomogenaten ohne PK von 6H4, 3F4 und 2E7, 7C1, 2D10 6G4 (Verdünnungen: 1:20); Menge: je 1 µl
Homogenat; verwendete Membran: UltraBind Membran; Expositionszeit: 1h
158
Prion Resultate
Ein anschliessend durchgeführter Dot Blot mit Proben von verschiedenen BSE-negativen und
–positiven Homogenaten und unterschiedlichen Antikörpern (Verdünnung: 6H4 1:10000, 3F4
1:5000, alle anderen 1:20) zeigte aber, dass der vorherige Versuch zufällig mit einem
Homogenat mit niedrigem PrPC-Titer durchgeführt worden war, weshalb kein Signal
detektiert worden war (siehe Bild 6.18). Alle Antikörper reagierten sowohl mit Rind- wie
auch mit Hamster-Hirnhomogenat. Die höchste Affinität zeigten dabei die Antikörper 6H4
und 6G4.
Dot Blot
Vergleich zwischen 6H4 und HPg
BSE-
PK-
BSE-
PK+
BSE+
PK-
BSE+
PK+
BSE-
PK-
BSE-
PK+
BSE+
PK-
BSE+
PK+
BSE-
PK-
BSE-
PK+
BSE+
PK-
BSE+
PK+
6H4
HPg in Blocking
Buffer
HPg in
Assaypuffer
Bild 6.19: Qualitativer Vergleich von Dot Blots von 6H4, HPg in Blocking Buffer (1:5000) und HPg in
Assaypuffer (1:5000); ½-Verdünnungsreihen; Startmenge: 1 µl Homogenat: verwendete Membran: UltraBind
Membran; Expositionszeit: 1h
Mit der Dot Blot-Methode sollte auch untersucht werden, ob HPg beim immunologischen
Nachweis eine Affinität für natives PrP zeigt. Dazu wurden Proben von BSE-negativem und –
positivem Hirnhomogenat mit/ohne PK hergestellt. Von den Proben wurden Dot Blots mit
dem Antikörper 6H4 und mit HPg in der Verdünnung 1:5000 durchgeführt. HPg wurde
einmal in PBST:NapSure Blocking Buffer 1:1 und einmal in Assaypuffer gelöst.
Die Auswertung der Dot Blots ergab, dass 6H4 diesmal mit dem BSE-negativen Homogenat
besser interagierte (siehe Bild 6.19); offenbar war dort der PrP-Titer höher als im BSEpositiven Homogenat. Zwischen den beiden Dot Blots mit HPg waren Unterschiede zu
159
Prion Resultate
erkennen. Beim Dot Blot, bei dem HPg in Blocking Buffer gelöst verwendet worden war,
hatte das Protein am stärksten mit unverdautem BSE-positivem Hirnhomogenat reagiert.
Beim Dot Blot mit HPg in Assaypuffer war das stärkste Signal beim verdauten BSE-positiven
Hirnhomogenat zu sehen. Etwas weniger stark war die Affinität zu unverdautem BSEpositivem Hirnhomogenat. Offenbar war das Vorhandensein der beiden Detergentien NP-40
und DOC für eine Interaktion zwischen Plasminogen und PrPSc essentiell. Da HPg in beiden
Fällen auch mit verdautem BSE-negativem Homogenat interagiert hatte, ist anzunehmen, dass
ein grosser Anteil der detektierten Signale durch unspezifische Bindung von Plasminogen an
Membran und Homogenatbestandteile verursacht wurde.
6.7 ELISA
Bei der Kopplung von Plasminogen-Fragmenten an Dynabeads® wurde nicht alles Protein in
der Lösung an die Beads gebunden. Die jeweilige Menge variierte stark zwischen den
verschiedenen Fragmenten. Deshalb war mit dem Pull Down-Assay mit beschichteten
Dynabeads nur eine qualitative, nicht aber quantitative Analyse möglich. Es wurde deshalb
nach einer anderen Methode Ausschau gehalten, um die Menge des an PlasminogenFragmente bindenden Prion-Proteins quantifizieren und die Bindungseigenschaften der
verschiedenen Fragmente untereinander vergleichen zu können.
Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist eine sehr sensitive Methode zum
Nachweis von Antigenen in Lösung. Er wird schon als Nachweismethode von PrPSc in
Rindern verwendet (Enfer Scientific Test, Prionics®-Check LIA und Platelia™); allerdings
werden bei diesen Test Antikörper gegen PrP und nicht Plasminogen oder
Plasminogenfragmente als Fangantikörper eingesetzt.
Da sowohl Plasminogen-Fragmente mit als auch ohne Hexahistidin-Tag untersucht werden
sollten, wurden für den ELISA zwei verschiedene Microplates verwendet; einerseits
Polystyrol-Platten, andererseits Microplates, welche mit Ni-NTA beschichtet sind. Die
Polystyrolplatten werden routinemässig für ELISAs eingesetzt und bieten eine
Bindungsoberfläche für fast alle Proteine; die Ni-NTA-HisSorb™ Plates binden vor allem
Proteine, die eine hohe Affinität für Nickel haben, z.B. rekombinant hergestellte Proteine mit
einem Hexahistidin-Affinitäts-Tag. Die rekombinanten Plasminogen-Fragmente K1FXa,
K1Fxamut, K23, K23mut, K4FXa, die HPg-Fragmente aus der Elastasespaltung K13, K4 und
Miniplasminogen sowie vollständiges HPg wurden auf beiden Platten-Arten getestet.
6.7.1 Ermittlung der Sättigungskonzentration von Mikrotiterplatten
Zuerst musste diejenige Konzentration an Protein ermittelt werden, durch welche die
Innenseite der Plattenvertiefung abgesättigt wurde. Die Absättigung der Vertiefung ist deshalb
wichtig, damit bei allen Proteinen ein Überschuss an Bindungspartnern für das Prion-Proein
zur Verfügung steht, so dass alles PrP gebunden wird und die Signale der ELISAs der
einzelnen Plasminogenfragmente untereinander verglichen werden können. Als
Ausgangslösung wurden deshalb Proteinlösungen mit einer Konzentration von 0.05 µg/µl in
160
Prion Resultate
Absorption bei 405 nm
Sättigung Polystyrol-Platte
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Probe N°
Sättigung His-Platte
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Probe N°
Bild 6.20: ELISAs zur Bestimmung der Protein-Sättigungskonzentration der Mikrotiterplatten (für jedes
eingesetzte Protein (1-9) sind die Werte für die ½-Verdünnungsreihe von links nach rechts aufgetragen)
Probe 1: HPg
Probe 4: K23
Probe 7: K13
Probe 10: Blank
Probe 2: K1Fxa
Probe 5: K23mut
Probe 8: K4
Probe 3: K1FXamut
Probe 6: K4FXa
Probe 9: Miniplasminogen
PBS (Polystyrol-Platte) resp. PBS/BSA-Puffer (Ni-NTA-HisSorb™ Plate) hergestellt und
diese wiederum in ½-Reihen in PBS resp. PBS/BSA-Puffer verdünnt. Danach wurde der
ELISA wie beschrieben durchgeführt. Von diesen Lösungen wurden ½-Verdünnungsreihen
161
Prion Resultate
hergestellt. Die Farbreaktion wurde anschliessend im Microplate-Reader bei 405 nm
gemessen.
Es zeigte sich, dass die Anfangskonzentration von 0.05 µg/µl für eine Absättigung der NiNTA-HisSorb™ Plate, nicht aber für diejenige der Polystyrol-Platte ausreichend war. Für die
HPg-Fragmente aus der Elastasespaltung K4 und Miniplasminogen wurde ein viel tieferes
Signal gemessen als für die übrigen Fragmente. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass
das Epitop für den sheep anti-HPg-Antikörper verborgen ist.
Aufgrund der Ergebnisse wurde die Anfangs-Proteinkonzentration für die Polystyrol-Platte
auf 0.5 µg/µl erhöht und das Experiment erneut durchgeführt (siehe Bild 6.20). Die dabei
erhaltenen Resultate wiesen auf eine erfolgreiche Absättigung bei den meisten Proteinen hin.
Für die Fragmente, bei denen keine Absättigung festgestellt werden konnte (auf der
Polystyrol-Platte: K4, Miniplasminogen; auf der NTA-HisSorb™ Plate: K4FXa, K4 und
Miniplasminogen), wurde die Ausgangskonzentration von 0.5 µg/µl für weitere Versuche
verwendet.
6.7.2 ELISA mit Hirnhomogenat
Die Sättigungskonzentrationen wurden berechnet und entsprechend konzentrierte Lösungen
der Plasminogenfragmente in PBS resp. PBS/BSA-Puffer hergestellt. Je 200 µl der Lösungen
wurden in die Vertiefungen gegeben. Danach wurden die ELISAs wie beschreiben
durchgeführt. Die zugegebenen Mengen von aufbereitetem BSE- und BSE+-Homogenat
waren 1 µl und 4 µl/Vertiefung.
Wertete man die durchgeführten ELISAs (siehe Bilder 6.21, 6.22) zuerst ohne Einbezug der
Blanks aus, so kristallisierte sich ein bestimmtes Interaktionsmuster heraus. Es scheint, als
würde PrP bevorzugt an HPg und die Fragmente K1FXa, K13, K4 und Miniplasminogen
binden. Die Grösse des Proteins und die Anzahl enthaltener Kringel scheint dabei keine Rolle
zu spielen. Vor allem BSE-negatives Homogenat erzeugt Signale, während die Interaktion
von BSE-positivem Homogenat viel geringer ist. Eine Interpretationsmöglichkeit des
Ergebnisses ist, dass die Interaktion mit Fragmenten stattfindet, die stärkere
Lysinbindungsstellen (LBS von Kringel 1, 4, 5) beinhalten. Dies erklärt aber nicht, wieso die
Bindung an K4 (durch Elastasespaltung generiert) stärker zu sein scheint als an K4FXa,
obwohl beide aus Kringel 4 bestehen und die LBS von K4FXa durch Lys-Bio-GelAffinitätschromatografie als aktiv beurteilt werden konnte.
Vergleicht man aber die Signale der Blanks (je 2x ohne Protein, ohne Homogenat, ohne
Primär- und ohne Sekundärantikörper) (siehe Bild 6.23), so scheinen die gemessenen Werte
vor allem auf einer unspezifischen Wechselwirkung der Homogenat-Proteine mit der
Mikrotiterplatte selbst zu sein. Da PrPC mit grosser Affinität an Ni-NTA bindet und die NTAHisSorb™ Plate mit diesem Material beschichtet ist, könnte die Interaktion zwischen PrP und
dem Beschichtungsmaterial der Grund für die unspezifischen Signale sein. Dagegen spricht,
dass dasselbe Muster auch auf den Polystyrol-Platten erkennbar ist. Der Grund für den
Misserfolg der ELISA-Messungen ist nicht bekannt; die Bedingungen für den ELISA-Assay
wurden möglichst ähnlich denen des Pull Down-Assays mit HPg-gekoppelten Beads gewählt.
Möglicherweise kann der Assay durch die Verwendung einer anderen Plattenart (z.B. solche,
bei denen man das Protein durch UV-Bestrahlung kovalent an die Plattenoberfläche koppeln
kann), verbessert werden.
162
Prion Resultate
Polystyrol-Platte + 1 ul Homogenat
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
HPg
K1FXa
K1FXamut
K23
K23mut
K4FXa
K13
K4
Miniplasminogen
1
2
3
Homogenat N°
His-Platte mit + 1 ul Homogenat
HPg
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
K1FXa
K1FXamut
K23
K23mut
K1FXa
K13
K4
1
2
3
Miniplasminogen
Homogenat N°
Bild 6.21: ELISAs mit 1µl BSE-negativem (Homogenat N° 1) und BSE-positivem Homogenat (Homogenat N°
2); Homogenat N° 3: Blank
163
Prion Resultate
Polystyrol-Platte + 4 ul Homogenat
0.6
HPg
K1FXa
K1FXamut
K23
K23mut
K4FXa
K13
K4
Miniplasminogen
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1
2
3
Homogenat N°
His-Plate + 4 ul Homogenat
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
1
2
3
HPg
K1FXa
K1FXamut
K23
K23mut
K4FXa
K13
K4
Miniplasminogen
Homogenat N°
Bild 6.22: ELISAs mit 4 µl BSE-negativem (Homogenat N° 1) und BSE-positivem Homogenat (Homogenat
N° 2); Homogenat N° 3: Blank
164
Prion Resultate
Vergleich Blanks Polystyrol-Platte /His-Platte
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
ohne HPg, BSEohne HPg, BSE+
ohne Homogenat
ohne Homogenat
ohne prim. Antikörper
ohne prim. Antikörper
ohne sek. Antikörper
ohne sek. Antikörper
1
2
Platte N°
Bild 6.23: ELISAs mit Blanks (ohne Protein, ohne Homogenat, ohne Primäantikörper, ohne Sekundärantikörper)
Platte 1: Polystyrol-Platte; Platte 2: NTA-HisSorb™ Plate
165
Diskussion
7. Diskussion
7.1 E. coli
Bei der Klonierung wurden drei verschiedene Vektoren verwendet. Mit dem Plasmid pQE-8
wurde schon oft zur Herstellung von HPg-Konstrukten benutzt. Dem exprimierten Protein
wird durch pQE-8 ein Hexahistidin-Affinitätstag angefügt. Dasselbe gilt für den Vektor
pET100/D-TOPO®; die Besonderheit dieses Plasmids ist die Möglichkeit zur gerichteten,
Topoisomerase-unterstützten Ligation von DNA-Stücken mit geraden Enden. Der Vektor
pETBlue™-1 dient der Expression von nativem Protein, d.h. durch das Plasmid werden keine
zusätzlichen Aminosäuren an das klonierte Protein angehängt. Deshalb ist das Plasmid nur für
Konstrukte geeignet, deren proteineigene Bindung an Lysin- (im Fall von K13- und K4Konstrukten), GST- oder ähnlichen Affinitätsmatrices für die Isolation ausgenützt werden
kann. pQE-8 wurde für die Konstrukte K23mut, K1FXa und K1FXamut verwendet, während
die cDNA von K13FXa und K4FXa der Vektor pET100/D-TOPO® kloniert wurde. Für rK4
und rK13 wurde pETBlue™-1 benutzt.
Die Klonierung der Konstrukte K1FXa, K4FXa, K13FXa, rK4 und rK13 und Generierung
von K23mut und K1FXamut mit der WHOPS-Mutationsmethode verlief problemlos. Die
Transformation von Ligationsansätzen wurde durch die Verwendung von gekauften,
chemisch-kompetenten E. coli-Zellen erleichtert, welche eine viel höhere Transformationseffizienz als CaCl2-kompetente Zellen aufweisen. Für die Transformation von supercoiled
Plasmid sind letztere aber ausreichend.
Die beiden Kringelmodule 2 und 3 des humanen Plasminogens sind durch eine InterkringelDisulfidbrücke zwischen Cystein169 und Cystein297 miteinander verbunden. Während der
Diplomarbeit war versucht worden, die Interkringel-Disulfidbrücke durch die Einführung der
Mutationen TAC→TCC (Cys169Gly) bzw. GTA→GGA (Cys297Ser) zu eliminieren. Während
die erste Punktmutation problemlos eingeführt werden konnte, konnte in mehreren Versuchen
keine Doppelmutante hergestellt werden. Eine mögliche Erklärung dafür ist die KorrekturFunktion der pfu-DNA-Polymerase, welche den „Fehler“ jeweils wieder in die ursprüngliche
Basensequenz umwandelte. Mit der WHOPS-Methode konnte die Mutation aber ohne weitere
Probleme eingeführt werden.
Die Isolation der Proteine K23 und K23mut aus Expressionen im Grossansatz gestaltete sich
schwieriger als erwartet. Die Ausbeute an Protein nach der Isolation mit der StandardMethode (Lyse der Zellen in GuHCl-Puffer, Affinitätschromatografie mit Ni-NTA-Agarose,
Rückfaltung) war gering. Möglicherweise war die ausgeprägte Präzipitation während der
Dialyse Grund für das negative Resultat. Im nächsten Ansatz wurden beide Proteine zuerst
im Gesamtlysat zurückgefaltet, bevor sie über native Ni-NTA-Affinitätschromatografie
isoliert und mittels Gelfiltration gereinigt wurden. Von K23 konnte auf diese Weise mehrere
Milligramm gewonnen werden, während die Ausbeute an K23mut erneut nicht befriedigend
ausfiel. Ausserdem wurde K23mut während der Rückfaltung fragmentiert; das N-terminale
Fragment wurde bei der Reinigung von K23mut über Ni-NTA-Affinitätschromatografie
mitisoliert, da es ebenfalls einen Hexahistidin-Tag enthielt. Deshalb konnte es bei der
anschliessenden Analyse von K23mut mittels RP-HPLC im Chromatogramm detektiert
werden. Der dritte Ansatz von K23mut wurde wiederum denaturierend durchgeführt. Nach
der Isolation des Proteins mittels Ni-NTA-Chromatografie wurde aber eine modifizierte
Renaturierungsmethode verwendet, bei der die Proteinlösung mit einem grösseren Volumen
von Rückfaltungspuffer mit höherem Glutathion-Gehalt über längere Zeit gerührt wurde.
Dadurch konnte eine Ausbeute ähnlich derjenigen von K23 erzielt werden. Die bei der
166
Diskussion
Charakterisierung der Proteine mittels ESI-MS, Aminosäure- und Sequenzanalyse erhaltenen
Resultate zeigten eine gute Übereinstimmung mit den theoretischen Werten.
Bei der Isolation von Protein aus Grossansätzen von K1FXa und K1FXamut zeigten sich
ähnliche Probleme wie bei den K23-Konstrukten. Zuerst wurde versucht, die Proteine durch
Rückfaltung im Lysat zu renaturieren. Bei der anschliessenden Affinitätschromatografie von
K1FXa mit Lys-Bio-Gel band aber kein Protein an die Matrix, so dass davon ausgegangen
werden musste, dass K1FXa nicht korrekt renaturiert worden war. Dasselbe Bild ergab sich
für K1FXamut, welches nach der Rückfaltung über native Ni-NTA-Chromatografie isoliert
und mittels Gelfiltration gereinigt worden war. Dabei wurden zwar 5 mg K1FXamut erhalten,
ein ESI-Massenspektrum zeigte aber, dass die Abweichung von der theoretischen Masse zu
gross war, als dass von einem korrekt renaturierten Protein ausgegangen werden könnte. Beim
zweiten Isolationsversuch wurde die Methode verwendet, welche bei K23mut zum Erfolg
geführt hatte. Dieses Mal band K1FXa vollständig ans Lys-Bio-Gel, wie durch RP-HPLCChromatogramme der Durchfluss- und Eluatprobe kontrolliert werden konnte. K1FXamut
konnte augrund der inaktivierten Lysinbindungsstelle nicht mittels LysinAffinitätschromatografie gereinigt werden. Statt dessen wurde das Protein gelfiltriert. Ein
Massenspektrum von K1FXamut ergab eine gute Übereinstimmung mit dem theoretischen
Wert, so dass auch hier eine korrekte Rückfaltung angenommen werden konnte.
Das Konstrukt K4FXa pET100/D-TOPO® war zuerst in den Expressionsstamm BL21 Star™
(DE3) transformiert worden. Da das Expressionsniveau in diesen Zellen aber eher niedrig zu
sein schien, wurde das Konstrukt in Rosetta(DE3)-Zellen, welche zusätzliche tRNAs für in
Prokaryonten selten verwendete Codons anbietet, retransformiert. Bei der anschliessenden
Testexpression konnte eine Erhöhung der Menge an exprimiertem K4FXa beobachtet werden.
Die Isolation von K4FXa aus einem Grossansatz wurde nach der Methode der Renaturierung
im Gesamtlysat vorgenommen. Während der anschliessenden Reinigung über Lys-Bio-Gel
konnte bei der Elution mit 6-AHA ein kleiner Peak beobachtet werden. Die Ausbeute an
K4FXa betrug lediglich 5 mg. Vermutlich war der Grossteil des Proteins während der
Dialysephase der Renaturierung präzipitiert. Eine andere Erklärungsmöglichkeit für die
schlechte Ausbeute ist, dass möglicherweise nur ein grosser Teil des K4FXa-Proteins nicht
korrekt renaturiert worden war und deshalb aufgrund der inaktiven Lysinbindungsstelle nicht
an das Lys-Bio-Gel binden konnte.
Als Alternative zu K4FXa wurde das Konstrukt rK4 pETBlue™-1 hergestellt. Aufgrund des
fehlenden Affinitätstags konnte kein Protein aus einem Testansatz isoliert und charakterisiert
werden. Auf dem Coomassie-gefärbten Blot von Proben aus der Testexpression, die vor und
nach der Zugabe von IPTG genommen worden waren, war keine Überexpression zu sehen.
Trotz mehrfacher Wiederholung schien keine Expression von rK4 stattzufinden. Eine weitere
Beobachtung war, dass das Wachstum der Rosetta2(DE3)-Zellen extrem langsam war; sie
brauchten etwa doppelt so viel Zeit wie andere Expressionsstämme, um das Induktionsniveau
von OD650 0.6 zu erreichen. Dies wurde vermutlich durch das zusätzlich in den Zellen
vorhandene Plasmid für die seltenen tRNAs (pRARE2) verursacht. Dieses langsame
Wachstum war aber nicht der Grund für die nichtexistente Überexpression, wie bei rK13
gezeigt werden konnte. Auch ein toxischer Effekt von rK4 kann vermutlich ausgeschlossen
werden, da die Zellen nicht absterben, sondern zwar langsam, aber kontinuierlich
weiterwachsen.
Auch die Expression von K13FXa musste auf dem Niveau der Testexpression gestoppt
werden. Bei ersten Massenbestimmungen mit ESI-MS waren Peaks detektiert worden, die auf
Gutathion-Addukte zurückzuführen waren. Ausserdem war das Auswerten des
Massenspektrums von K13FXa äusserst schwierig, da das Protein-Signal kaum vom
Rauschen und den durch Salzaddukte verursachten Signalen unterschieden werden konnten.
167
Diskussion
Trotz mehreren Versuchen konnte kein weiteres K13FXa aus Kleinexpressionen für die
weitere Charakterisierung gewonnen werden, so dass die Expression dieses Konstrukts im
Moment nicht weiter verfolgt wurde.
Vom Konstrukt rK13 wurde eine Testexpression durchgeführt. Auch hier wurde beobachtet,
dass die Zellen ein nur sehr langsames Wachstum zeigten. Auf dem Coomassie-gefärbten Blot
der während der Expression entnommenen Proben ist aber trotzdem eine deutliche
Überexpression in der erwarteten Höhe zu sehen. Da rK13 keinen Affinitätstag besitzt und
somit nicht aus der Testexpression isoliert und anschliessend charakterisiert werden konnte,
sind bis jetzt keine weiteren Informationen über das Protein vorhanden. Der nächste Schritt
muss die Sequenzierung der aus dem Blot ausgeschnittenen Proteinbande sein. Die
Proteinmenge auf diesem Membranstreifen müsste eigentlich ausreichen, um die ersten paar
N-terminalen Aminosäuren identifizieren und mit der Sequenz von rK13 vergleichen zu
können. Weitere Charakterisierungsmöglichkeiten wie ESI-MS und Aminosäurenalayse
ergeben sich erst, wenn aus einem Grossansatz mittels Affinitätschromatografie mit Lys-BioGel eine (kleine) Menge Protein isoliert werden kann.
Mit den erhaltenen Proteinen wurden Fluoreszenzmessungen mit 6-AHA zur Untersuchung
der Ligandbindung durchgeführt. Zusätzlich wurde noch eine Messung mit rK1 durchgeführt.
Dieses Protein besteht aus der Kringel 1-Domäne von HPg; seine Assoziationskonstante ist in
früheren Messungen schon mehrfach bestimmt worden. rK1 diente deshalb als
Referenzprotein. Für die Konstrukte rK1, K1FXa, K23 und K23mut konnten
Sättigungskurven gemessen werden. Die für rK1 und K1FXa bestimmten
Assoziationskonstanten lagen mit 50.80 mM-1 und 40.67 mM-1 etwas unter den Werten von
früheren Fluoreszenzmessungen von K1 (74 mM-1: von Haller, 1999; 56 mM-1: Invernizzi,
2003), waren aber in der gleichen Grössenordnung. Die Assoziationskonstanten lagen mit
6.21 mM-1 resp. 4.35 mM-1 etwas über dem Wert, der für den einzelnen Kringel 2 gemessen
worden war (2.3 mM-1 : Marti et al., 1997).
7.2 Prion
Bei den Experimenten mit BSE- und Scrapie-Material mussten bestimmte Schutzmassnahmen
eingehalten werden. Beim Arbeiten im Biohazard-Labor (Stufe P3**) mussten zu jeder Zeit
Handschuhe getragen werden, um nicht direkt mit eventuell TSE-kontaminierten Oberflächen
in Berührung zu kommen. Das Tragen von Laborschuhen verhinderte das Verschleppen von
möglicherweise infektiösem Material. Bei dieser Biosafety-Stufe muss das Labor nicht mit
Unterdruckanlage und Luftfilterung durch HEPA-Filter ausgerüstet sein. Arbeiten, die das
direkte „Handling“ von Hirnhomogenat beinhalteten, mussten aber auf dem Laminar FlowArbeitstisch durchgeführt werden. Bei heiklen Manipulationen von BSE- und Scrapieinfiziertem Hirnhomogenat wie z.B. dem Rehomogenisieren, bei dem Aerosol-Bildung
stattfindet, ist das Tragen von Mundschutz angezeigt, obwohl bis jetzt keine TSEÜbertragung über Aerosol nachgewiesen werden konnte. Geräte und Oberflächen, die mit
TSE-Material kontaminiert sind oder sein könnten, können durch mehrmaliges Abwischen
mit konzentrierter NaOH-Lösung sterilisiert werden. Alles Wegwerfmaterial, welches mit
Hirnhomogenat in Kontakt gekommen ist, muss bei 134°C autoklaviert werden. Da man die
Übertragungwege von BSE auf den Menschen noch nicht in allen Einzelheiten kennt, sind
solche Massnahmen zum eigenen Schutz und dem anderer Menschen angebracht.
Die von Fischer (2000) publizierten Ergebnisse waren nicht in jeder Hinsicht reproduzierbar.
Zwar konnte auch schon bei ersten Versuchen durch den Pull Down-Assay mit HPg168
Diskussion
gekoppelten Beads PrPSc sowie das durch die Inkubation mit Proteinase K (PK) entstehende,
Protease-resistente Kernstück von PrPSc, PrP27-30 aus BSE-positivem Hirnhomogenat isoliert
werden. Entgegen den Erwartungen band aber auch PrPC zu einem kleinen Anteil an die
beschichteten Beads. Diese Interaktion von PrPC mit Plasminogen war reproduzierbar und
war nicht auf einen einzelnen Batch HPg-gekoppelte Dynabeads oder ein einzelnen
Hirnhomogenat beschränkt, sondern trat bei jedem Pull Down-Assay mit BSE-negativem
Hirnhomogenat auf. Das Signal des zellulären Prion-Proteins konnte nur durch Inkubation der
Probe mit Proteinase K, welche PrPC völlig und PrPSc bis auf das PK-resistente Kernprotein
PrP27-30 degradiert, eliminiert werden. Durch den Proteinase K-Verdau wurde auch das Signal
von pathogenem PrP reduziert. Ein Grund dafür ist die Degradation von PrPC, welches auch
in BSE-positivem Hinrhomogenat vorhanden ist. Ausserdem wurde gezeigt, dass es Formen
von PrPSc gibt, welche nicht PK-resistent sind. Das PrP27-30-Signal wird deshalb nach dem
Verdau um den Anteil von PK-sensitivem PrPSc reduziert.
Das detektierte Bandenmuster von PrPC und PrPSc entsprach grösstenteils dem aus
Publikationen bekannten Bild. PrPC zeigte Banden bei 36 kDa, 30 kDa und 28 kDa, wobei
letztere (entspricht der unglykosylierten Form) meist am ausgeprägtesten erschien. Auch
PrPSc erzeugte Signal bei 36 kDa, 30 kDa und 28 kDa, wobei bei dieser Isoform von PrP die
Bande der diglykosylierten und der nicht glykosylierten Form am intensivsten war. Es waren
aber auch BSE-positive Homogenate vorhanden, deren Bandenmuster zu tieferer Masse
verschoben war. Da die apparenten Massen dieser Banden genau denen von PrP27-30
entsprachen, kam diese Veränderung vermutlich durch proteolytischen Abbau der PrionProteine zustande.
Die Detektionslimite (gerade noch erkennbares PrPSc-Signal; entspricht ca. 3 ng
rekombinantem Prion-Protein) für PrPSc aus Pull Down-Assay mit BSE-positivem Material
ohne PK-Verdau war gleich derjenigen eines Western Blots ohne Pull Down-Assay. Der
PrPSc-Titer war von Homogenat zu Homogenat verschieden und deckte eine Bandbreite von
0.12 mg bis 3.6 µg Hirnhomogenat ab. Durch den Pull Down-Assay wurde die niedrigste
detektierbare Homogenatmenge auf 7.2 µg Hirnhomogenat verdoppelt. Diese niedrigste
detektierbare Homogenatmenge, welche für PrPC ohne Assay ebenfalls 3.6 µg betrug, wurde
durch die Inkubation mit HPg-gekoppelten Beads auf 0.94 mg reduziert. Diese Restmenge
PrPC konnte nicht weiter vermindert werden.
Durch die Aufbereitung des Homogenats konnten die meisten unlöslichen
Homogenatbestandteile abgetrennt und die PrP-Aggregate aufgelöst werden. Die
Zusammensetzung des Prionics®-Check Western Homogenisation Buffer war nicht bekannt.
Es kann aber angenommen werden, dass darin ebenfalls NP-40 und DOC enthalten sind, da
gezeigt werden konnte, dass die Interaktion von PrPSc mit Plasminogen nur in einem Puffer
stattfindet, der mit diesen Detergentien angereichert ist (Shaked et al., 2002). Die Färbung der
Homogenate reichte von farblos bis zu altrosa. Dies wurde durch die Herkunft der Probe und
das Alter der Probe beeinflusst; einen Rückschluss auf den PrPC- oder PrPSc-Titer konnte
daraus nicht gezogen werden. Es wurde aber beobachtet, dass die BSE-negativen Homogenate
im allgemeinen eher heller gefärbt waren als BSE-positive Homogenate.
Durch die Optimierung des Assays durch Erhöhung der HPg-Menge, welche an die Beads
gekoppelt wurde, durch die Erhöhung des Sample Buffer-Volumens und durch die Reduktion
der unspezifischen Hintergrund-Signale durch Verwendung eines besseren Blockers konnte
die Sensitivität für PrPSc verglichen mit den Anfangsbedingungen um 2 Verdünnungen einer
½-Verdünnungsreihe erhöht werden. Die Menge an gebundenem PrPSc wurde also theoretisch
vervierfacht.
Bisher ist kein PrPSc-spezifischer Antikörper kommerziell erhältlich. Auch die in dieser
Arbeit getesteten Antikörper erfüllen diese Bedingung nicht. Allerdings kann der Antikörper
6G4 als brauchbare Alternative zu 6H4 betrachtet werden, da die Sensitivität des Western
Blots durch seine Verwendung noch erhöht werden kann. Die Nachteile von 6G4 liegen in der
169
Diskussion
kurzen Zeitspanne, die als Expositionszeit für Filme genutzt werden kann und darin, dass er
nicht kommerziell erhältlich ist. Auch HPg wurde in einem Far Western Blot als Antikörper
gegen verdautes und unverdautes PrPC und PrPSc eingesetzt. Das Protein zeigte aber keine
spezifische Interaktion mit einer der Proben. Offenbar ist für eine Bindung von Plasminogen
an PrP die Nativstruktur beider Interaktionspartner notwendig.
Statt mit BSE-Material wurde der Pull Down-Assay mit Homogenat von normalen und
Scrapie-infizierten Hamstern durchgeführt. Auch hier zeigte sich, dass beide Isoformen des
Prion-Proteins mit den HPg-beschichteten Beads interagieren, wobei PrPSc eine grössere
Affinität aufweist als PrPC. Für eine vollständige Isolation aller PrPSc-Moleküle in der
Assaylösung müssten aber aufgrund des höheren PrP-Titers wesentlich mehr Beads eingesetzt
werden oder das Homogenat stark verdünnt werden. Interessanterweise unterscheidet sich das
Bandenmuster von Scrapie-PrP von demjenigen von BSE-PrP. Prion-Proteine von
verschiedenen TSE-Erkrankungen zeigen oft ein charakteristisches Glykosylierungsmuster,
welches auch als „Fingerabdruck“ der entsprechenden Krankheit gilt.
Der Pull Down-Assay wurde mit Beads durchgeführt, die mit Plasminogen verschiedener
Spezies beschichtet waren. Da die prozentuale Sequenzhomologie durchschnittlich 50%
beträgt, könnten Unterschiede in der Primärstruktur auch Unterschiede in der Affinität zu PrP
bedeuten. Es konnte aber kein Effekt der Plasminogen-Sequenz auf die
Bindungseigenschaften der jeweiligen Plasminogen-Spezies detektiert werden. Die
abweichenden Ergebnisse des Pull Down-Assays mit Ziegen-Plasminogen sind darauf
zurückzuführen, dass das Protein wohl schon teilweise degeneriert ist, womit ein weiteres Mal
die Wichtigkeit der Nativstruktur von Plasminogen und dem Prion-Protein für die Interaktion
zwischen den beiden Bindungspartnern gezeigt wurde.
Auch die im ersten Teil der Arbeit generierten Plasminogen-Fragmente wurden an Dynabeads
gekoppelt. Aufgrund der ungleichmässigen Kopplung war nur ein qualitativer Vergleich
zwischen den Ergebnissen der Pull down-Assays mit verschiedenen Fragmenten möglich.
Wodurch dieses Problem verursacht wurde, ist nicht bekannt. Die Lösungen, die zur
Kopplung der Fragmente an die Beads verwendet wurden, können als Verursacher
ausgeschlossen werden, da diese auch für die Kopplung von ganzem Plasminogen verwendet
wurden. Bei der Auswertung wurde bemerkt, dass die Fragmente K23mut und K1FXamut
eine erhöhte Affinität zu PrPSc aufzuweisen schienen. Dies erstaunte, da beim Pull DownAssay mit K1FXamut eigentlich kein Prion-Protein an die Beads hätte binden dürfen, da die
LBS dieses Fragments durch Mutation inaktiviert worden ist. Dieses Resultat könnte als
Hinweis darauf gewertet werden, dass die Interaktion von Plasminogen mit PrP nicht
spezifisch über die LBS stattfindet. Möglicherweise wurde durch die Einführung der
Mutationen in K23mut (Cys169Gly und Cys297Ser) und K1FXamut (Asp139Ala) die Verteilung
der Oberflächenladung dieser Plasminogenfragmente derartig verändert, dass daraus eine
erhöhte Bindungsfähigkeit an das pathogene Prion-Protein resultierte.
Die Entfernung von durch PrPC gebundenen Kupfer-Ionen durch Zugabe von EDTA hatte
keinerlei Auswirkungen auf die Signalstärke. Es ist anzunehmen, dass der durch EDTA
verursachte Effekt zu gering ist, um sich auf die Interaktion Plasminogen-PrP auszuwirken.
Die Ergebnisse des Experiments mit verschiedenen Plasminogen-Fragmenten hatten die
Hypothese, dass HPg über die Lysinbindungsstelle mit dem Prion-Protein wechselwirkt, eher
abgeschwächt. Es konnte aber gezeigt werden, dass durch Zugabe von 6-AHA zum
Assaypuffer die Detektion von PrPSc und zu einem geringeren Teil auch von PrPC verhindert
werden kann. Dies lässt sich dadurch erklären, dass 6-AHA in Kompetition mit dem PrionProtein um die Lysinbindungsstellen von Plasminogen steht. Wurden die
Lysinbindungsstellen von an Beads gekoppeltem HPg zuerst mit 6-AHA abgesättigt, bevor
die Beads in die Assay-Lösung gegeben werden, kann derselbe Effekt erzielt werden.
Auch die Elution von an Plasminogen gebundenem PrPSc (und wenig PrPC) konnte mit 6AHA erzielt werden. Jedoch konnte auch durch mehrmaliges Eluieren mit 6-AHA-haltigem
170
Diskussion
Puffer keine vollständige Elution von PrP erreicht werden. Offenbar liegt im Elutionspuffer
ein Gleichgewicht zwischen der Bindung von PrP an und der Elution von Plasminogen vor.
Die 6-AHA-Konzentration spielt dabei eine untergeordnete Rolle.
Dass die optimale Durchmischung der Probelösung für eine effiziente Isolation von PrP durch
Plasminogen-beschichtete Beads von grosser Wichtigkeit ist, konnte durch die Erhöhung des
Assaylösungs-Volumen von 1 ml auf 2, 5 und 10 ml gezeigt werden. Die Menge des isolierten
PrPSc nahm umso mehr ab, je grösser das Probenvolumen wurde. Für die Extraktion von
Prionen aus grösseren Volumina ist vermutlich ein Assay in Säulenform besser geeignet, da
auf diese Weise die ganze Lösung über die Affinitätsmatrix fliessen muss.
Die erhöhte Affinität von PrPC für Nickel wurde in einem weiteren Experiment untersucht.
Bei diesem Assay wurden die Plasminogen-gekoppelten Beads durch Beads ersetzt, welche
mit Ni-NTA beschichtet waren. Wie erwartet wurde mehr PrPC als PrPSc an die Nickel-Beads
gebunden. Auch hier scheint ein gewisses Gleichgewicht zwischen der Bindung und der
Ablösung des Prion-Proteins stattzufinden, da auch in mehreren Inkubationsschritten von NiNTA-Beads in einer Assaylösung mit Hirnhomogenat nicht alles PrP entfernt werden konnte.
Dass die Bindung von PrPC an Nickel höher ist als diejenige an andere Metallionen wie
Kobalt oder Kupfer, konnte durch den Pull Down-Assay mit Metall-beschichteter Sepharose
gezeigt werden. Während der Unterschied zwischen Kupfer und Kobalt nicht sehr gross ist,
scheint die Affinität von PrPC für Nickel grösser zu sein als die Affinität zu Plasminogen.
Die Bindungseigenschaften von Antikörpern und HPg an nicht denaturiertes Prion-Protein aus
Hirn-Homogenaten wurden durch Dot Blots auf UltraBind-Membran untersucht. Diese
Membran bindet Proteine kovalent, die Proben können ohne weitere Vorbehandlung der
Membran direkt aufgetropft werden. Die Auswertung ergab, dass die getesteten Antikörper
sowohl mit BSE-positivem als auch BSE-negativem Homogenat in unterschiedlicher
Intensität reagierten. Offensichtlich war die Denaturierung des Prion-Proteins der Grund, dass
die Antikörper 7C1, 2D10 und 2E7 zuvor nicht mit Proben von PrPC und PrPSc auf dem
Western Blot reagiert hatten.
Die Möglichkeit eines PrP-Nachweises durch Sandwich-ELISA mit HPg oder HPgFragmenten als Fangantikörper wurde untersucht. Das Homogenat, welches in die Proteinbeschichteten Vertiefungen gegeben wurde, war dabei in Assaypuffer suspendiert, da die
Detergentien DOC und NP-40 die Interaktion zwischen Plasminogen und dem Prion-Protein
erst möglich machten. Trotzdem konnte keine spezifische Interaktion irgendwelcher Art
festgestellt werden. Offenbar muss die Methode stark optimiert oder umgestellt werden, um
die gewünschten Ergebnisse erzielen zu können. Für weitere Verbesserungen war aber der
Zeitrahmen zu knapp.
Die Ergebnisse der Experimente ergeben ein uneindeutiges Resultat, was die Spezifität der
Bindung von Plasminogen an das Prion-Protein angeht. Einerseits scheint PrP sehr wohl mit
den LBS der Kringeldomänen zu interagieren, da diese Interaktion durch 6-AHA beeinflusst
werden kann. Andererseits hat aber die Inaktivierung der LBS in K1FXamut keinen Einfluss
auf die Wechselwirkung zwischen Plasminogen und PrP. Eine physiologische Funktion der
Plasminogen-PrP-Bindung scheint ausgeschlossen, da, wie gezeigt werden konnte, die
Interaktion nur in Anwesenheit der entsprechenden Detergentien zustande kommt. Es handelt
sich wohl eher um eine elektrostatische Wechselwirkung mit den positiv und negativ
geladenen Aminosäuren des gesamten Plasminogens. Könnte die Affinität von Plasminogen
oder Plasminogenfragmenten für PrPSc aber durch Einführung weiterer Mutationen noch
weiter erhöht werden, würde der Pull Down-Assay mit Protein-gekoppelten Beads gegenüber
konventionellen Western Blots den Vorteil bieten, dass die Probe nicht zuerst mit Proteinase
K verdaut werden muss. Die Beads könnten deshalb direkt zur Detektion von pathogenen
Prionen aus Medien wie Blut, Plasma etc. eingesetzt werden, natürlich nur unter vorherigem
Zusatz der im Assay verwendeten Detergentien.
171
Anhang
8. Anhang: Isolierung von Plasminogen
8.1 Material und Chemikalien
8.1.1 Reagenzien, Lösungen, Puffer
Beschreibung
Lieferant
Ameisensäure
98-100%, p.a.
Merck
6-AHA
zur Synthese
Merck
Ammoniumsulfat
p.a.
Merck
DinatriumhydrogenSulfat
p.a.
Merck
Elastase
porcine pancreatic elastase
Serva
Lys-Bio-Gel
Bio-Gel® P-300 mit daran gekoppeltem Lysin
Bio-Rad, Merck
Natriumchlorid
p.a.
Merck
Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat
reinst
Merck
Puffer A
0.15 M Phosphatpuffer pH 7.4: 234 g
NaH2PO4 + 52.5 g NaOH ad 10 l oder
709.8 g Na2HPO4 + 117.0 g NaH2PO4
ad 11.5 l, pH mit NaH2PO4 einstellen
Merck, Merck
Puffer B
0.2 M 6-AHA in Puffer A + Trasylol
20 (20 µl/l)
Merck, Bayer
Trasylol
20000 KIE/ml
Bayer
8.2 Methoden
8.2.1 Isolation von Plasminogen
150 ml Lys-Bio-Gel P-300 wurde mit 5 l Puffer A gewaschen. Anschliessend wurde es mit 5 l
zitriertem Blutplasma (human, ZLB Bioplasma AG) und 5 l Puffer A vermischt und
anschliessend über Nacht bei 4°C gerührt. Nach Absetzen des Gels wurde der Überstand
vorsichtig abdekantiert und mit 10 l Puffer A gewaschen, bis die OD280 weniger als 0.01
betrug. Daraufhin wurde das Gel in eine Säule gepackt (∅ 4.5 cm) und das gebundene
Plasminogen mit Puffer B eluiert. Das Gel wurde mit 20 l 0.9 % NaCl-Lösung regeneriert.
Um die Plasminogen-Ausbeute zu verbessern, wurde der ganze Isolationsvorgang wiederholt.
Die Eluate wurden mit Ammoniumsulfat versetzt (Endkonzentration 2 M) und das
172
Anhang
Plasminogen über Nacht bei 4°C gefällt. Nach einem Zentrifugationsschritt (15 min, 15´000xg,
4°C, Sorvall RC5B plus, GSA-Rotor) wurde die Pellets in je 15 ml H2O pH 3 (mit
Ameisensäure eingestellt) aufgenommen und während 2 Tagen gegen 5 l H2O pH 3 dialysiert.
Zum Schluss wurde das Plasminogen lyophilisiert und analysiert.
8.2.2 Elastasespaltung von Plasminogen
Aus Plasminogen können durch limitierte Elastasespaltung die Fragmente Kringel 1-3, Kringel
4 und Miniplasminogen (Kringel 5 + leichte Kette) gewonnen werden.
Plasminogen wurde in 0.2 M Tris-HCl pH 8.8 aufgenommen (10 mg reines HPg/ml). Elastase
wurde in einem Enzym-/Substratverhältnis 1:50 (w/w) zugegeben und die Lösung während 1.5
h bei RT gerührt. Die Spaltungsreaktion wurde durch Zugabe von 50 µl NPGB (1 g NPGB in
50 ml N,N-Dimethylformamid) gestoppt, wodurch eine Gelbfärbung eintrat. Die Proteinlösung
wurde auf die mit Puffer A äquilibrierte Lys-Biogel-Säule aufgetragen und mit Puffer A
nachgewaschen. Der Durchfluss mit dem nicht adsorbierten Miniplasminogen wurde wie oben
beschrieben dialysiert, lyophilisiert und anschliessend mittels Gelfiltration (Sephadex G-75)
gereinigt und erneut lyophilisiert. Die ans Lys-Biogel adsorbierten K1-3 und K4) wurden mit
Puffer B eluiert, die beiden Fragmente durch Gelfiltration (Sephadex G-75) voneinander
getrennt und lyophilisiert. Die Proteine wurden anschliessend analysiert (MS,
Aminosäureanalyse, Sequenzanalyse).
8.3 Resultate und Diskussion
SEC-Chromatogramm K13/K4
1.2
Absorption (Au)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
K4
K1-3
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Fraktion
Bild 8.1: Auftrennung der durch Elastasespaltung entstandenen HPg-Kringelfragmente mittels G75 sfGelfiltration
173
Anhang
HPg wurde aus 5 l Plasma isoliert. Die beiden Isolationsrunden ergaben eine Ausbeute von 152
mg (Gehalt 56.04%) resp. 210 mg (Gehalt 68.29%). Beim Edman-Abbau der ersten sechs Nterminalen Aminosäuren ergab sich eine einzige Sequenz: E-P-L-D-D-Y, welche derjenigen
von NTP1-6 entspricht.
Die limitierte Elastase-Spaltung wurde mit 210 mg HPg durchgeführt. Sie ergab 102 mg an
Lys-Biogel adsorbierende und 37 mg nicht an Lys-Biogel adsorbierende HPg-Fragmente
(entspricht Miniplasminogen). Die adsorbierenden Fragmente wurden durch SECChromatografie aufgetrennt; dies ergab 58 mg Kringel 1-3 (Gehalt 49.51 %) und 12 mg
Kringel 4 (Gehalt 63.48 %). Die Masse der Fragmente wurde anschliessend durch ESI-MS
bestimmt.
Abweichung
Aminosäureanalyse
HPg Batch 2
68.3 %
0.36 %
Kringel 1-3
49.5 %
0.52 %
Kringel 4
63.5 %
0.29 %
Miniplasminogen 41.2%
0.21 %
Fragment
Gehalt
ESI-MS-Masse
--29658.2 ± 3.1 Da
9694.2 ± 0.2 Da
37598 ± 4.6 Da
Menge Ausbeute
[mg] [mg/g Pg]
210 mg
--58 mg 200.1 mg
12 mg 53.0 mg
37 mg 106.0 mg
Tabelle 8.1: Durch Elastasespaltung erhaltene HPg-Fragmente; die theoretischen Massen der Fragmente sind
29742.9 Da (K1-3), 9694.6 Da (K4) und 37591.8 Da (Miniplasminogen); die Differenz zwischen der gemessenen
und der theoretischen Masse von K13 wird vermutlich durch nicht gebildete Disulfidbrücken und/oder zusätzlich
abgespaltene Aminosäuren verursacht
174
Literaturverzeichnis
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Curriculum Vitae
Monika Schermbach
Geburtsdatum: 20. November 1973 in Lauingen/Donau (D)
Nationalität: Schweizerin
Heimatort: Ingenbohl (SZ)
Zivilstand: ledig
Ausbildung
ab 2001
Zusatzausbildung in Proteinanalytik
Dezember 2001 – November 2004
Dissertation am Departement für Chemie und Biochemie der Universität Bern; Titel der Dissertation:
„Interaktion von bovinem PrP mit Plasminogen bzw.
Plasminogen-Fragmenten“; Leiter der Arbeit: Prof.
Dr. Christoph Kempf
Oktober 1997 – November 2001
Studium der Chemie am Departement für Chemie
und Biochemie der Universität Bern; Titel der
Diplomarbeit: „Rekombinante Expression und
Charakterisierung von Mutanten der
Kringeldomänen 2+3 des huma-nen Plasminogens“;
Leiter der Arbeit: Prof. Dr. Johann Schaller
1993 – Februar 2001
Stv. Geschäftsführerin eines Gastronomiebetriebs
Oktober 1992 – Juni 1993
Studium der Biologie an der Universität Bern
August 1989 – Juni 1992
Gymnasium St. Michel, Freiburg i. Üechtland
Matura Typus B

Interaktion von bovinem PrP mit Plasminogen bzw

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