hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test

hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test
®
Gebrauchsanweisung
In-vitro-Nukleinsäure-Hybridisierungsassay mit Signalverstärkung mittels MikrotiterplattenChemilumineszenz zum qualitativen Nachweis von 13 High-Risk-Typen des humanen
Papillomavirus DNA (HPV-DNA) in Zervixproben.
Zum Gebrauch mit:
DNAPap™ Cervical Sampler
HC Cervical Sampler™
Specimen Transport Medium™
Cytyc ThinPrep® Pap Test PreservCyt® Solution
TriPath Imaging® SurePath® Preservative Fluid
WICHTIGSTE VERÄNDERUNGEN IM VERGLEICH ZUR LETZTEN REVISION DES
BEIPACKZETTELS
1. Aktualisierte Informationen für Hersteller und Vertreter in der Europäischen Gemeinschaft.
Nur zum Laboratoriumsgebrauch durch ausgebildetes und geprüftes Laborpersonal. Vor
Anwendung dieses Tests die Anleitungen sorgfältig durchlesen.
QIAGEN Gaithersburg, Inc.
1201 Clopper Road
Gaithersburg, MD 20878 USA
96
QIAGEN GmbH
QIAGEN Str. 1
D-40724 Hilden
Germany
©
2008 QIAGEN Gaithersburg, Inc.
5197-1330
L2127DE Rev. 3
Durch das CE-Zeichen wird bestätigt, dass der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test den Anforderungen
der Richtlinie 98/79/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 27. Oktober 1998 über
In-vitro-Diagnostika entspricht.
INHALT
NAME UND VERWENDUNGSZWECK .........................................................................................................................1
ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG ................................................................................................................2
VERFAHRENSPRINZIP ................................................................................................................................................3
MITGELIEFERTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN................................................................................................4
WARN- UND SICHERHEITSHINWEISE .......................................................................................................................6
SICHERHEITSHINWEISE ...............................................................................................................................6
INFORMATIONEN ZU SICHERHEITS- UND GESUNDHEITSRISIKEN .........................................................7
VORSICHTSMASSNAHMEN ..........................................................................................................................7
VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN ...........................................................................................9
PROBENENTNAHME UND HANDHABUNG..............................................................................................................11
ZERVIXPROBEN IN STM..............................................................................................................................11
ZERVIXBIOPSIEN .........................................................................................................................................11
ZERVIXPROBEN IN CYTYC PRESERVCYT LÖSUNG................................................................................12
ZERVIX-PROBEN IN SUREPATH PRESERVATIVE FLUID.........................................................................12
TESTVERFAHREN......................................................................................................................................................12
TESTS MIT GROSSEM PROBENDURCHSATZ MITTELS RAPID CAPTURE SYSTEMGERÄTEANWENDUNG .........................................................................................................................12
DENATURIERUNG........................................................................................................................................13
Verfahren zur Vorbereitung von Kalibratoren, Qualitätskontrollen und STM-Proben.......................14
Verfahren zur Vorbereitung von PreservCyt Solution-Proben .........................................................15
MISCHEN UND DENATURIEREN ................................................................................................................17
Manuelles Vortexverfahren..............................................................................................................17
Vortexer 2-Verfahren mit Multi-Specimen Tubes (MST)..................................................................17
Vorbereitungsverfahren für SurePath Proben .................................................................................18
HYBRIDISIERUNG ........................................................................................................................................19
Hybridisierungsverfahren mittels Hybridisierungsplatte und Mikrotiterplatteninkubator I .................20
Hybridisierungsverfahren mittels Mikroröhrchen und Wasserbad....................................................20
HYBRID CAPTURE .......................................................................................................................................21
HYBRIDNACHWEIS ......................................................................................................................................22
SPÜLEN ........................................................................................................................................................23
Automatisches Plattenspüler I-Verfahren: .......................................................................................23
Manuelles Spülverfahren: ................................................................................................................24
SIGNALVERSTÄRKUNG ............................................................................................................................................24
VERIFIKATIONSKRITERIEN FÜR DIE ASSAY-KALIBRIERUNG .............................................................................25
BERECHNUNG DER GRENZWERTE ........................................................................................................................27
QUALITÄTSKONTROLLE ..........................................................................................................................................28
INTERPRETATION DER PROBENERGEBNISSE .....................................................................................................29
LEISTUNGSMERKMALE ............................................................................................................................................29
KLINISCHE LEISTUNG BEIM SCREENING VON PATIENTINNEN MIT NORMALEN PAPABSTRICHERGEBNISSEN ALS EIN HILFSMITTEL BEI DER RISIKOBEURTEILUNG FÜR DAS
PATIENTENMANAGEMENT ..................................................................................................................29
KLINISCHE LEISTUNG BEIM SCREENING VON PATIENTINNEN MIT ASC-US PAPABSTRICHERGEBNISSEN ZUR ERMITTLUNG DER NOTWENDIGKEIT EINER ÜBERWEISUNG
ZUR KOLPOSKOPIE..............................................................................................................................32
KLINISCHE EMPFINDLICHKEIT UND SPEZIFITÄT FÜR DIE ERMITTLUNG DES RISIKOS FÜR EINE
HIGH-GRADE-ERKRANKUNG BEI FRAUEN MIT LSIL- ODER HSIL-PAP-ABSTRICHEN ..................33
ANALYTISCHE EMPFINDLICHKEIT.............................................................................................................36
ÄQUIVALENZ ZWISCHEN DEN PROBEN IN SPECIMEN TRANSPORT MEDIUM (STM) UND DEN
PROBEN IN PRESERVCYT (PC) LÖSUNG ..........................................................................................36
KORRELATION ZWISCHEN SUREPATH-PROBENERGEBNIS UND QIAGEN STM PROBEN IN EINER
KLINISCHEN POPULATION ..................................................................................................................37
REPRODUZIERBARKEIT .............................................................................................................................37
KREUZREAKTIVITÄT .................................................................................................................................................39
KREUZREAKTIVITÄTSPANEL .....................................................................................................................39
KREUZHYBRIDISIERUNG............................................................................................................................40
EFFEKT VON BLUT UND ANDEREN SUBSTANZEN AUF STM-PROBEN .................................................40
i
EFFEKT VON BLUT UND ANDEREN SUBSTANZEN AUF PROBEN IN PRESERVCYT LÖSUNG ............40
REPRODUZIERBARKEIT DES HC2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS MIT IN STM GEGEBENEN
KLINISCHEN PROBEN ..........................................................................................................................40
REPRODUZIERBARKET DES HC2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS MIT IN PRESERVCYT LÖSUNG
GEGEBENEN KLINISCHEN PROBEN ..................................................................................................41
REPRODUZIERBARKEIT EINES HC2 HIGH-RISK HPV DNA-TESTS MIT PROBEN IN SUREPATH
KONSERVIERUNGSFLÜSSIGKEIT.......................................................................................................42
REPRODUZIERBARKEIT DER SUREPATH-ERGEBNISSE UNTER VERWENDUNG DES HALBAUTOMATISCHEN QIAGEN RAPID CAPTURE SYSTEM FOR ASSAY PROCESSING......................43
GRENZEN DES VERFAHRENS..................................................................................................................................44
LITERATUR.................................................................................................................................................................45
HC2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TEST LEITFADEN ZUR FEHLERSUCHE .....................................................................48
KONTAMINATIONSTEST .............................................................................................................................53
QIAGEN KONTAKTINFORMATIONEN ......................................................................................................................54
ZUSAMMENFASSUNG DES HC2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS.............................................................................55
ii
NAME UND VERWENDUNGSZWECK
In-vitro-Diagnostikum
®
Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test® unter Verwendung der Hybrid Capture 2 (hc2)-Technologie ist ein
Nukleinsäure-Hybridisierungsassay mit Signalverstärkung mittels Mikrotiterplatten-Chemilumineszenz
zum qualitativen Nachweis der DNA von dreizehn High-Risk-Typen des humanen Papillomavirus (HPV)
in Zervixproben.
Zervixproben, die mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test getestet werden können, schließen folgende
ein:
•
•
•
•
Mit dem DNAPap™ Cervical Sampler oder dem HC Cervical Sampler™ entnommene Proben.
Mit einer Entnahmevorrichtung des Besentyps oder einer Bürsten-/Spatelkombination
®
entnommene und in Cytyc PreservCyt Solution gegebene Proben (nähere Einzelheiten sind der
Packungsbeilage des hc2-Probenkonversionskits zu entnehmen).
Proben in TriPath Imaging® SurePath® Preservative Fluid.
In Specimen Transport Medium™ (STM) gegebene Biopsien.
Die Verwendung dieses Tests ist angezeigt:
1. Zum Nachweis der High-Risk-HPV-Typen 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68, von denen
gezeigt wurde, dass sie den primären kausalen Faktor bei der Entwicklung des Zervixkarzinoms
darstellen.
2. Als initialer Screening-Test der Allgemeinbevölkerung, zur Verwendung mit oder ohne PapAbstrich, um Frauen mit erhöhtem Risiko für die Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder dem
Vorliegen einer High-Grade-Erkrankung der Zervix zu identifizieren. Die HPV-Diagnose ist mit
zunehmendem Alter verstärkt indikativ für eine Zervixerkrankung.
3. Als Follow-up-Test für Patientinnen nach abnormen Pap-Abstrichergebnissen oder einer
Zervixerkrankung zur Ermittlung, ob eine Überweisung zur Kolposkopie oder zu anderen Followup-Verfahren erforderlich ist.
4. Als Follow-up-Test für Patientinnen mit leichter Dysplasie, d. h. einer Low-Grade Squamous
Intraepithelial Läsion (LSIL), oder schwerer Dysplasie, d. h. High-Grade Squamous Intraepithelial
Läsion (HSIL), in den Pap-Abstrichergebnissen vor der Kolposkopie. Bei diesen Patientinnen hilft
ein hc2 HPV-Ergebnis dem Arzt bei der Behandlung der betreffenden Patientin durch
Risikobeurteilung von Frauen zum Ausschluss des Vorliegens einer High-Grade-Erkrankung.
Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test sollte zusammen mit anderen von diagnostischen und von ScreeningTests hergeleiteten klinischen Informationen, körperlichen Untersuchungen und einer vollständigen
Erhebung der Anamnese im Rahmen angemessener Patienten-Management-Verfahren eingesetzt
werden. Die hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testergebnisse sollten jedoch nicht als alleinige Basis bei der
klinischen Beurteilung und Behandlung von Patientinnen eingesetzt werden.
1
ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG
Das Vorliegen bestimmter HPV-Typen im weiblichen Genitaltrakt ist von einer Reihe verschiedener
Erkrankungen begleitet, einschließlich Kondylomen, bowenoider Papulose, zervikaler, vaginaler und
1-3
vulvarer intraepithelialer Neoplasien und Karzinomen. Es ist allgemein anerkannt, dass die Übertragung
dieser Viren überwiegend sexuell erfolgt und dass es sich bei den High-Risk-HPV-Typen um den
4-8
wichtigsten anerkannten Risikofaktor für die Entwicklung eines Zervixkarzinoms handelt.
Humane Papillomaviren sind aus einem Ikosaeder-Viruspartikel (Virion) aufgebaut, das ein
doppelsträngiges zirkuläres DNA-Molekül mit 8000 Basenpaaren enthält und von einem Proteinkapsid
umgeben ist. Im Anschluss an eine Infektion der Epithelzellen breitet sich die virale DNA über die
gesamte Dicke des Epithels aus, während intakte Virionen nur in den oberen Gewebeschichten zu finden
sind. Demzufolge kann virale DNA, abhängig von dem Typ und dem Grad der Läsion, entweder in
Virionen oder als episomale oder integrierte HPV-Sequenz vorliegen.
Bisher ist die Kultivierung von HPV in vitro nicht gelungen, und die immunologischen Tests zur
Bestimmung des Vorliegens einer durch HPV verursachten Zervixinfektion sind unzulänglich. Indirekte
Hinweise auf eine anogenitale HPV-Infektion ergeben sich allerdings aus der körperlichen Untersuchung
sowie durch die Anwesenheit der mit der viralen Replikation im Pap-Abstrich oder in Biopsieproben
einhergehenden charakteristischen Zellveränderungen. Als Alternative können Biopsien mittels
Nukleinsäure-Hybridisierung im Direktnachweis auf das Vorliegen von HPV-DNA eingesetzt werden.
Historisch wurden HPV 16 und HPV 18 als mit hohem Karzinomrisiko assoziierte HPV-Typen
8-10
Für die HPV-Typen 31, 33 und 35 wurde der Nachweis erbracht, dass sie einen
eingestuft.
2,11-14
intermediären Zusammenhang mit einem Karzinom aufweisen.
Dieser intermediäre Zusammenhang
ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass diese Typen häufiger in High-Grade Squamous Intraepithelial
Läsionen (HSIL) als in Karzinomen nachgewiesen werden. Infolge dessen ist die Induktion von
Karzinomen aufgrund des Vorliegens dieser Typen weniger wahrscheinlich als wenn High-Risk-HPV38
DNA-Typen anwesend sind. Diese fünf HPV-Typen machen zusammen ca. 73 % der HPV-Infektionen
21,34
aus.
Weitere HPV-DNA-Typen, einschließlich der Typen 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68, wurden als
15-20,30-34
die in den übrigen Läsionen nachweisbaren wichtigsten HPV identifiziert.
Diese HPV-Typen
lassen sich basierend auf ihrer relativen Verteilung auf verschiedene histopathologische
21, 30-35
Diagnosekategorien außerdem auch in Gruppen mit intermediärem und hohem Risiko einteilen.
Es wurde gezeigt, dass HPV-DNA bei ca. 10 % der Frauen mit normalem Zervixepithel vorliegt, obwohl
die tatsächliche Prävalenz bei Frauen spezifischer Gruppen stark vom Alter und anderen demografischen
2,10,21,29
Aus prospektiven Studien ist ersichtlich, dass im Vergleich zu nur 1 Variablen beeinflusst wird.
3 % HPV-DNA-negativen Frauen 15 - 28 % HPV-DNA-positive Frauen innerhalb von 2 Jahren SIL
22,23
(Squamous Intraepithelial Lesions) entwickelten.
Im Vergleich zu anderen HPV-Typen war
22
insbesondere das Risiko einer Progression für HPV-Typen 16 und 18 größer (ca. 40 %).
2
VERFAHRENSPRINZIP
Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test unter Verwendung der Hybrid Capture 2-Technologie ist ein
Nukleinsäure-Hybridisierungsassay mit Signalverstärkung, der sich den MikrotiterplattenChemilumineszenznachweis zunutze macht. Die in den Proben enthaltene Ziel-DNA hybridisiert mit einer
spezifischen HPV-RNA-Sonde. Die sich ergebenden RNA:DNA-Hybride werden an die Oberfläche einer
mit für RNA:DNA-Hybriden spezifischen Antikörpern beschichteten Mikrotiterplatten-Vertiefung fixiert
(capturing). Immobilisierte Hybride werden dann mit alkalischer Phosphatase-konjugierten Antikörpern,
die für die RNA:DNA-Hybride spezifisch sind, zur Reaktion gebracht und mit einem ChemilumineszenzSubstrat nachgewiesen. An jeden Antikörper werden mehrere alkalische Phosphatasemoleküle
konjugiert. Mehrfach konjugierte Antikörper binden an jedes fixierte (captured) Hybrid, was zu einer
erheblichen Signalverstärkung führt. Wird das Substrat durch die gebundene alkalische Phosphatase
gespalten, erfolgt die Abgabe von Licht, die als relative Lumineszenzeinheiten (RLU) an einem
Luminometer gemessen wird. Die Intensität des abgegebenen Lichts zeigt die An- oder Abwesenheit von
Ziel-DNA in der Probe an.
Eine RLU-Messung, die gleich oder größer als der Grenzwert ist, zeigt das Vorliegen von High-Risk-HPVDNA-Sequenzen in der Probe an. Eine unter dem Grenzwert liegende RLU-Messung weist auf die
Abwesenheit der getesteten spezifischen High-Risk-HPV-DNA-Sequenzen oder HPV-DNAKonzentrationen unter der Nachweisgrenze des Assays hin.
Tests mit großem Probendurchsatz mittels des hc2 HPV-DNA-Tests können unter Verwendung des
Rapid Capture® Systems (RCS) durchgeführt werden. Dieses Instrument verarbeitet bis zu 352 Proben in
acht Stunden. Damit Tests mit großem Probedurchsatz getätigt werden können, werden alle
Verfahrensschritte des Assays vom RCS übernommen, mit Ausnahme von Probendenaturierung,
Chemilumineszenzsignalnachweis und Ausgabe der Ergebnisse.
3
MITGELIEFERTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN
In einem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test-Kit (
5197-1330) sind 96 Tests enthalten. Die Anzahl der
Patientenergebnisse variiert abhängig von der Anzahl der Anwendungen pro Kit:
1 Anwendung = 88 Patientenergebnisse
2 Anwendungen = 80 Patientenergebnisse
3 Anwendungen = 72 Patientenergebnisse
4 Anwendungen = 64 Patientenergebnisse
1 x 0,35 ml Indikator-Farbstoff
Enthält 0,05 % m/V Natriumazid.
1 x 50 ml
Denaturierungsreagenz
Verdünnte Natriumhydroxid-Lösung (NaOH).
1 x 5 ml
Sonden-Verdünnungsmittel
Gepufferte Lösung mit 0,05 % m/V Natriumazid.
1 x 200 µl
High-Risk-HPV-Sonde
HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 RNA-Sonde in gepufferter Lösung (roter
Verschlussdeckel).
1 x 1 ml
Low-Risk-HPV-Qualitätskontrolle
5 pg/ml (500.000 Kopien/ml) klonierte HPV-6-DNA und Träger-DNA in STM mit 0,05 % m/V
Natriumazid.
1 x 1 ml
High-Risk-HPV-Qualitätskontrolle
5 pg/ml (500.000 Kopien/ml) klonierte HPV-16-DNA und Träger-DNA in STM mit 0,05 % m/V
Natriumazid.
1 x 2,0 ml
Negativkalibrator
Träger-DNA in Specimen Transport Medium mit 0,05 % m/V Natriumazid.
1 x 1,0 ml
.
High-Risk-HPV-Calibrator
1 pg/ml klonierte HPV-16-DNA und Träger-DNA in STM mit 0,05 % m/V Natriumazid.
1x1
.
Capture-Mikrotiterplatte
Beschichtet mit Anti-RNA:DNA-Hybridantikörpern.
1 x 12 ml
.
Nachweisreagenz 1
Alkalische Phosphatase-konjugierte Antikörper an RNA:DNA-Hybriden in gepufferter Lösung
mit 0,05 % m/V Natriumazid.
1 x 12 ml
.
Nachweisreagenz 2
®
CDP-Star mit Emerald II (Chemilumineszenz-Substrat).
1 x 100 ml Waschpuffer-Konzentrat
Enthält 1,5 % m/V Natriumazid.
C
.
4
T
ERFORDERLICHE, ABER NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN
A
In-vitro-Diagnostika – Geräte und Zubehör für das Hybrid Capture System
Digene Mikrotiterplatten-Luminometer 2000 Instrument (DML
Rapid Capture® System (optional für Tests mit großem
E
™
Probendurchsatz)
2000 ), PC-System mit Druckerkabel und
Spülapparat
Tintenstrahldrucker, Gebrauchsanweisung für das DML
Mikrotiterplatte zur Hybridisierung
2000™-Instrument und für die Software, Version 2, sowie
interaktives Bedienerhandbuch für die Digene Hybrid Capture
Mikrotiterplattendeckel
System Version 2 (DHCS V.2) Software (DML 2000
Leere Mikrotiterplattenstreifen (erhältlich von Costar, Modell Nr.
Assayprotokolle für HPV Version 4.01 oder höher sind
2581); optional zum Gebrauch mit dem automatischen
erforderlich)
Hybrid Capture System Rotary Shaker I (Kreisschüttler I)
Plattenspüler I
Hybrid Capture System Microplate Heater I
Extralange Pipettenspitzen zum Probentransfer
(Mikrotiterplatteninkubator I)
Probenentnahmeröhrchen
Hybrid Capture System Automated Plate Washer I
Probenentnahmeröhrchen-Gestell (passend zu den
(Automatischer Plattenspüler I)
Probenentnahmeröhrchen)
Hybrid Capture System Multi-Specimen Tube (MST)-Vortexer I
Probenröhrchengestell
B
oder 2 (Optional)
Schraubdeckel für Probenentnahmeröhrchen
C
Einweg-Reagenzbehälter
Konversionsgestell und Gestellabdeckung (optional)
®
DuraSeal -Röhrchenabdeckungsfolie
Digene Probengestell und Gestellabdeckung (optional)
C
Mikroröhrchen
zur Hybridisierung
™
EXPAND-4 Dispenser und Gestell (optional)
Mikroröhrchengestelle
Hybrid Capture Cervical Sampler oder DNAPap Cervical
D
Plattenabdeckungen
Sampler
Spender für Röhrchenabdeckungsfolie und -Schneidegerät
(optional, zur Verwendung mit dem MST-Vortexer I oder 2)
Geräte und zubehör für den allgemeinen Laborgebrauch
Zusätzliche Geräte und Zubehörteile für die Behandlung
von Proben in PreservCyt-Solution
Ausschwingrotor-Zentrifuge bis zu 2900 ± 150 x g, geeignet für
konische 10-ml- oder 15-ml-PolypropylenZentrifugenröhrchen
Wasserbad (65 ±2 °C) ausreichender Menge zur Aufnahme
eines Gestells (36 x 21 x 9 cm) oder von Probenstativen
Mikrozentrifuge (optional zum Zentrifugieren der SondenFläschchen zum Erhalt des maximalen Sondenvolumens)
Vortex-Mischer mit Becheraufsatz
1-Kanal-Mikrodispenser; variabel einstellbar für Volumina von
20-200 µl und 200-1000 µl
Direktverdrängungssystem-Dispenser, wie z. B. die Eppendorf
®
Repeater Multipette- oder ein entsprechender
8-Kanal-Dispenser: variabel einstellbar für Volumina von 25 200 µl
Stoppuhr
Natriumhypochlorit-Lösung, 5 % (V/V) (oder Haushaltsbleiche)
®
Parafilm oder entsprechende Folie
Einweg-Filterspitzen für den 1-Kanal-Dispenser (20 bis 200 µl
und 200-1000 µl)
®
Einwegspitzen für die Eppendorf Repeater Multipette (25 und
500 µl)
Einwegspitzen für den 8-Kanal-Dispenser (25 bis 200 µl )
®
Kimtowels -Wischtücher oder entsprechende fusselfreie
Papiertücher
Einweg-Arbeitstischabdeckung
Ungepuderte Handschuhe
5 ml und/oder 15 ml Polypropylenröhrchen mit Schnappdeckel
und rundem Boden (für die Sondenverdünnung)
2,0-ml-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen mit
Verschlussdeckeln
5-ml serologische oder Vollpipetten
A
hc2 Probenkonversionskit
®
Einwegspitzen für den Eppendorf Repeater Multipette (50 und
100 µl)
Für manuelles Vortexverfahren:
F
hc2 Probenkonversionsröhrchen (15 ml, konisch) , konische 10ml-Sarstedt-Röhrchen mit Deckeln oder 15-ml RundbodenPolypropylenröhrchen mit Deckeln von VWR oder der Marke
Corning®
Röhrchengestell für konische 10- oder 15-ml- Röhrchen
Für Vortexer 2-Verfahren mit Multi-Specimen Tubes:
F
hc2 Probenkonversionsröhrchen (15 ml, konisch)
Vortexer 2 für Multi-Specimen Tubes (MST)
Konversionsgestell und Deckel (für konische 15-ml-Röhrchen)
Spender für Röhrchenabdeckungsfolie und Schneidevorrichtung
®
DuraSeal Film zum Verschließen der Röhrchen (zum
Gebrauch mit MST Vortexer 2)
Zusätzliche Geräte und Zubehörteile für die Behandlung von Proben in Surepath Preservative Fluid
Ausschwingrotor-Zentrifuge bis zu 800 ± 15 x g, geeignet für konische 15-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen
F
hc2 Probenkonversionsröhrchen (15 ml, konisch)
7-ml Transferpipetten mit Standardspitze oder entsprechende Pipetten
QIAGEN Specimen Transport Medium
Einwegspitzen für die Eppendorf Repeater® Pipette (100 µl)
A
B
C
D
E
F
Bei QIAGEN sind nur hc2 CT/GC DNA-Tests validierte Ausrüstungsgegenstände und Zubehörteile erhältlich. Wenden Sie sich an
Ihren QIAGEN-Vertreter.
Ist bei halbautomatischer RCS-Anwendung ebenfalls erforderlich.
Kundenanfertigung. Es können auch andere kundenspezifische expandierbare Mehrkanalpipetten verwendet werden, sofern im
expandierten Zustand noch ein Abstand von 3,2 cm zwischen den Spitzen möglich ist. Alternativ kann eine Einkanalpipette mit
einem Pipettiervolumen von 75 µl eingesetzt werden.
Die Leistungsmerkmale des hc2 CT-ID DNA-Tests wurden ausschließlich mit den beiden genannten Entnahme-Kits ermittelt.
Anweisungen zum Einsatz dieses Systems für Tests mit großem Probendurchsatz finden Sie im Rapid Capture System BenutzerAnwendungshandbuch.
Die bei QIAGEN erhältlichen hc2-Probenkonversionsröhrchen (von VWR oder der Marke Corning®) müssen benutzt werden,
damit bei Anwendung des Vortexverfahrens mit Multi-Specimen Tubes eine saubere Assay-Durchführung gewährleistet ist.
5
WARN- UND SICHERHEITSHINWEISE
VOR ANWENDUNG DIESES TESTS ALLE ANLEITUNGEN SORGFÄLTIG DURCHLESEN.
Sehen Sie auch das Glossar auf dieser CD-ROM zwecks Erläuterungen der für die Etikettierung
verwendeten Symbole ein.
SICHERHEITSHINWEISE
ALLE PROBEN sind als potenziell infektiös anzusehen. Keine bekannte Testmethode kann absolute
Gewähr dafür bieten, dass die Proben keine Infektion übertragen können. Es wird empfohlen, dass
Proben menschlicher Herkunft unter Beachtung der entsprechenden nationalen/lokalen
Sicherheitsrichtlinien für den Umgang mit biologischem Material gehandhabt werden. Befolgen Sie diese
Sicherheitsrichtlinien beim Umgang mit biologischem Material, das infektiöse oder vermutlich infektiöse
Materialien enthält. Diese Vorsichtsmaßnahmen schließen Folgendes ein, sind aber nicht beschränkt
darauf:
1. Nicht mit dem Mund pipettieren.
2. In Bereichen, in denen Reagenzien oder Proben gehandhabt werden, nicht rauchen, essen oder
trinken.
3. Bei der Handhabung von Reagenzien oder Proben sind ungepuderte Einweg-Handschuhe zu
tragen. Nach Durchführung des Tests die Hände gründlich waschen.
4. Verschüttete Proben unter Verwendung eines tuberkuloziden Desinfektionsmittels, wie zum
Beispiel 0,5 % (V/V) Natriumhypochlorit oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel
40,41
reinigen und desinfizieren.
5. Alle Proben, Reagenzien und andere potenziell kontaminierte Materialien unter Einhaltung
nationaler und lokaler Bestimmungen dekontaminieren und entsorgen.
Einige Reagenzien enthalten Natriumazid. Natriumazid kann Berichten zufolge in den Laborrohrleitungen
Blei- und Kupferazid bilden. Diese Azide können bei Erschütterung, wie z. B. Hämmern usw.,
explodieren. Zur Verhinderung von Blei- oder Kupferazidbildung sind die Ausgüsse nach der Entsorgung
natriumazidhaltiger Lösungen gründlich mit Wasser zu spülen. Zur Entfernung von Kontamination aus
alten Abflüssen mit vermuteter Azidansammlung empfiehlt die US-amerikanische Occupational Safety
and Health Institution (OSHI) Folgendes: (1) Flüssigkeit vollständig mit einem Gummi- oder
Kunststoffschlauch aus dem Siphon heben, (2) mit 10 %iger v/v Natriumhydroxid-Lösung füllen, (3) 16
Stunden stehen lassen und (4) mit reichlich Wasser spülen.
6
INFORMATIONEN ZU SICHERHEITS- UND GESUNDHEITSRISIKEN
Die nachstehenden Materialien wurden gemäß den EU-Richtlinien 2001/59/EG und 99/45/EG beurteilt.
Achtung! Das Sonden-Verdünnungsmittel kann eine reversible Augenreizung verursachen.
Bei Kontakt mit den Augen, sofort mit reichlich Wasser ausspülen und ärztlichen Rat
einholen. Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. Im Fall eines Unfalls oder wenn Sie sich
unwohl fühlen, sollten Sie sofort den Arzt aufsuchen (wenn möglich, dieses Etikett
vorzeigen).
T
C
Das Waschpuffer-Konzentrat enthält Natriumazid und wird nach den zutreffenden Richtlinien
der Europäischen Union (EU) als: Toxisch (T) bezeichnet. Bei Nachstehendem handelt es
sich um die entsprechenden Hinweise auf besondere Gefahren (R-Sätze) und
Sicherheitsratschläge (S-Sätze).
R25: Giftig beim Verschlucken.
R32: Entwickelt beim Berühren mit Säuren sehr giftige Gase.
S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und
Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
S45: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich dieses Etikett
vorzeigen).
Das Denaturierungsreagenz enthält Natriumhydroxid und wird nach den zutreffenden
Richtlinien der Europäischen Union (EU) als: Ätzend (C) bezeichnet. Nachstehend sind die
entsprechenden Hinweise auf besondere Gefahren (R-Sätze) und Sicherheitsratschläge (SSätze) zu finden.
R35: Verursacht schwere Verätzungen.
S26: Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser ausspülen und Arzt
konsultieren.
S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und
Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
S45: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich dieses Etikett
vorzeigen).
Bei Tests mit großem Probendurchsatz mit diesem Assay beachten Sie bitte die zusätzlichen
Warnhinweise im Rapid Capture System Benutzer-Anwendungshandbuch.
VORSICHTSMASSNAHMEN
1. In-vitro-Diagnostikum.
2. Die Zervixbürste ist nur zum Gebrauch bei nicht schwangeren Frauen bestimmt.
3. Die Reagenzien nicht über das neben dem Symbol
angegebene Verfallsdatum hinaus verwenden.
auf dem Etikett der Außenverpackung
4. Das Durchführen des Assays außerhalb der vorgesehenen Zeit- und Temperaturbereiche kann
zu ungültigen Ergebnissen führen. Assays, die nicht in die festgelegten Zeit- und
Temperaturbereiche fallen, müssen wiederholt werden.
5. Das hc2 HPV-DNA-Testverfahren, die Verifikationskriterien für die Assaykalibrierung, die
Qualitätskontrolle und die Interpretation der Probenergebnisse sind zum Erhalt zuverlässiger
Testergebnisse genau zu befolgen.
6. Es ist wichtig, das genaue Reagenzvolumen zu pipettieren und nach jeder Reagenzzugabe
gründlich zu mischen. Nichtbeachtung könnte zu falschen Testergebnissen führen. Die Gewähr,
dass die angegebenen Farbumschläge auftreten, dient der Bestätigung, dass diesen
Bedingungen entsprochen wurde.
7. Die Kit-Bestandteile wurden als eine Einheit getestet. Bestandteile anderer Herkunft oder aus
anderen Chargen dürfen nicht verwendet werden.
8. Nukleinsäuren sind sehr empfindlich gegenüber Nukleaseabbau. Nukleasen kommen auf der
menschlichen Haut und auf Oberflächen oder Materialien vor, die von Personen gehandhabt
7
werden. Die Arbeitsflächen reinigen, mit Einweg-Arbeitstischabdeckungen abdecken und bei der
Durchführung aller Assay-Schritte ungepuderte Handschuhe tragen.
9. Darauf achten, dass eine Kontamination der Capture-Mikrotiterplatte und des
Nachweisreagenzes 2 mit exogener alkalischer Phosphatase während der Assay-Durchführung
vermieden wird. Zu Substanzen, die gegebenenfalls alkalische Phosphatase enthalten könnten,
zählen das Nachweisreagenz 1, Bakterien, Speichel, Haar und Öle der Haut. Das Abdecken der
Capture-Mikrotiterplatte nach dem Spülschritt und während der Inkubation des
Nachweisreagenzes 2 ist besonders wichtig, da exogene alkalische Phosphatase mit dem
Nachweisreagenz 2 reagieren und zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann.
10. Das Nachweisreagenz 2 vor längerer direkter Lichteinwirkung schützen. Das Reagenz sofort
nach der Aufteilung in Aliquote verwenden und direktes Sonnenlicht vermeiden.
11. Der Direktverdrängungssystem-Dispenser sollte vor der Reagenzabgabe geprimt und periodisch
auf das Auftreten großer Luftbläschen kontrolliert werden. Exzessive Mengen großer
Luftbläschen in der Dispenser-Spitze können zur ungenauen Abgabe führen. Dies lässt sich
durch das Füllen des Dispensers, die Abgabe der gesamten Flüssigkeit und erneutes Befüllen
vermeiden. Spezifische Hinweise zur Anwendung sind der Dispenser-Gebrauchsanweisung des
Lieferanten zu entnehmen.
12. Das Mehrkanal-Pipettieren sollte unter Verwendung der reversen Pipettiertechnik zur Abgabe der
Nachweisreagenzien 1 und 2 durchgeführt werden. Überprüfen, dass jede Pipettenspitze
vorschriftsmäßig auf dem Mehrkanal-Dispenser sitzt und sich füllt. Die Gebrauchsanweisung des
Herstellers für Mehrkanal-Pipetten einsehen.
13. Darauf achten, dass jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte, wie in den Spülanweisungen
angegeben, gründlich gespült wird. Unzureichendes Spülen führt zu einem erhöhten Hintergrund
und kann folglich zu falsch-positiven Ergebnissen führen. In den Vertiefungen zurückbleibender
restlicher Waschpuffer kann zu reduzierten Signalen oder schlechter Reproduzierbarkeit führen.
14. Den Hybrid Capture System-Mikrotiterplatteninkubator I vom Kaltstart an mindestens 60 Minuten
auf 65 °C ±2 °C äquilibrieren lassen. Nichteinhaltung dieser Anwärmungsperiode könnte zum
Schmelzen der Mikrotiterplatte zur Hybridisierung führen. Nähere Einzelheiten sind in der
Bedienungsanleitung für den Mikrotiterplatteninkubator I zu finden.
8
VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN
1. Nach Erhalt das Kit bei 2 - 8 °C lagern. Waschpufferkonzentrat, Denaturierungsreagenz und
Indikator-Farbstoff können gegebenenfalls bei 2 - 30 °C gelagert werden.
auf dem Verpackungsetikett angegebene Verfallsdatum
2. Nicht über das neben dem Symbol
oder das Verfallsdatum der vorbereiteten Reagenzien hinaus verwenden (siehe nachstehend).
3. Alle Reagenzien außer dem Denaturierungsreagenz, der High-Risk-HPV-Sonde und dem
Waschpufferkonzentrat sind gebrauchsfertig.
Lesen Sie zur Vorbereitung der HPV-Sondenmischungen, des Waschpuffers, sowie der
Nachweisreagenzien 1 und 2 das Benutzer-Anwendungshandbuch zum Rapid Capture System, da
die darin enthaltenen Anweisungen speziell für den Einsatz dieses Systems bei Tests mit großem
Probendurchsatz abgestimmt sind.
REAGENZ
VORBEREITUNGSVERFAHREN
Denaturierungsreagenz
Zuerst vorbereiten:
Der Flasche mit dem Denaturierungsreagenz 5 Tropfen Indikator-Farbstoff zufügen und
gründlich mischen. Das Denaturierungsreagenz sollte eine gleichmäßige, dunkel-purpurrote
Farbe aufweisen.
Nach der Vorbereitung ist das Denaturierungsreagenz bei einer Lagerung von 2 - 8 °C drei
Monate stabil. Das Reagenz mit dem neuen Verfalldatum kennzeichnen. Bei Verblassen der
Farbe vor Gebrauch 3 weitere Tropfen Indikator-Farbstoff zufügen und gründlich mischen.
Vorsicht: Das Denaturierungsreagenz ist ätzend. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung,
Schutzhandschuhe, Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. Bei der Handhabung vorsichtig
vorgehen.
High-Risk-HPVSondenmischung
(Vorbereitung
aus High-RiskHPV-Sonde und
Sondenverdünnungsmittel)
Vorbereitung während der Proben-Denaturierungsinkubation:
Wichtig: Manchmal befindet sich die Sonde in dem Verschlussdeckel des
Fläschchens.
Hinweis: Dieser Schritt ist zur Verhinderung der Kontamination von Sonde und SondenCocktail mit RNase mit äußerster Vorsicht durchzuführen. Zum Pipettieren der Sonde
Filterspitzen verwenden. Das Sonden-Verdünnungsmittel ist viskos.
Bei der Vorbereitung der High-Risk-HPV-Sondenmischung ist unbedingt auf
gründliches Mischen zu achten. Während des Mischschrittes muss sich in der
Flüssigkeit ein sichtbarer Wirbel bilden. Unvollständiges Mischen kann zu einem
reduzierten Signal führen.
•
•
•
Das Fläschchen mit der High-Risk-HPV-Sonde kurz zentrifugieren, damit die
Flüssigkeit auf den Boden des Fläschchens gebracht wird. Durch vorsichtiges Klopfen
mischen.
Die Menge der erforderlichen Sondenmischung (25 µl/Test) ermitteln. Es wird
empfohlen, zur Kompensation für das in den Pipettenspitzen oder an den Seiten des
Fläschchens verloren gegangene Volumen etwas mehr Sondenmischung anzusetzen.
Vorgeschlagene Volumina sind nachstehend aufgelistet. Die für jede Anwendung
empfohlene kleinste Anzahl an Vertiefungen ist 24. Sind weniger als 24 Vertiefungen
pro Assay erwünscht, kann die Gesamttestzahl pro Kit aufgrund der begrenzten
Sonden- und Sondenverdünnungsvolumina reduziert sein.
Die erforderliche Sondenverdünnungsmittelmenge in einen neuen Einweg-Behälter
überführen. Abhängig von der Anzahl der Tests wird entweder ein 5-ml- oder 15-mlPolypropylenröhrchen mit Schnappdeckel und rundem Boden empfohlen. Zur
Vorbereitung der Sondenmischung eine Verdünnung von 1:25 aus High-Risk-HPVSonde in Sonden-Verdünnungsmittel ansetzen.
9
Anzahl der Tests/Streifen
Volumen des Sondenverdünnungsmittels*
96/12
4,0 ml
72/9
3,0 ml
48/6
2,0 ml
24/3
1,0 ml
pro Vertiefung
0,045 ml
* Diese Werte enthalten das empfohlene zusätzliche Volumen.
•
•
Waschpuffer
Volumen der Sonde*
160,0 µl
120,0 µl
80,0 µl
40,0 µl
1,8 µl
Die High-Risk-HPV-Sonde in das Sondenverdünnungsmittel pipettieren, indem die
Pipettenspitze gegen die Innenwand des Röhrchens knapp über dem Meniskus
platziert und der Inhalt abgegeben wird. Die Spitze nicht in das
Sondenverdünnungsmittel eintauchen.
Zum gründlichen Mischen mindestens 5 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit
vortexen. Es muss ein sichtbarer Wirbel entstehen. Mit „High-Risk-HPVSondenmischung“ kennzeichnen und bis zur Gebrauchsfertigkeit in einem sauberen,
geschlossenen Behälter aufbewahren. Nicht aufgebrauchte Sondenmischung
verwerfen.
Vorbereitung während des Capture-Schrittes:
Für das Hybrid Capture System mit dem automatischen Plattenspüler I kann der
Waschpuffer wie nachstehend beschrieben vorbereitet und in einem abgedeckten Behälter
gelagert oder zur Vorbereitung von jeweils 1 l und Platzieren in die Waschbehälter des
automatischen Plattenspülers I hergestellt werden. Aus der nachstehenden Tabelle gehen die
Mischvolumina hervor:
Weitere Pflege- und Wartungsanleitungen sind den Bedienungs- und Wartungsanweisungen
für den automatischen Plattenspüler I zu entnehmen.
Vorsicht: Das Waschpufferkonzentrat ist bei Verschlucken toxisch. Es sind geeignete
Schutzkleidung, geeignete Schutzhandschuhe und ein geeigneter Augen- / Gesichtsschutz zu
tragen. Um die Exposition so gering wie möglich zu halten, ist das Waschpufferkonzentrat bei
der Vorbereitung mit Wasser zu verdünnen.
Mengen des Waschpuffer- Menge destillierten oder
Konzentrats
entionisierten Wassers
33,3 ml
66,6 ml
100 ml
966,7
1933,4
2900,0
ml
ml
ml
Endvolumen des
Waschpuffers
1l
2l
3l
Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass der automatische Plattenspüler I jederzeit
eingeschaltet bleibt. Hierdurch wird die Durchführung der Wartungsspülung
ermöglicht, wenn das Gerät acht Stunden nicht in Gebrauch war.
Vor jedem Assay sicherstellen, dass der Abwassertank des automatischen
Plattenspülers I leer und sein Spülwassertank mit destilliertem oder entionisiertem
Wasser gefüllt ist.
Für das manuelle Plattenspülverfahren:
• Das Waschpuffer-Konzentrat gut mischen.
• 100 ml Waschpuffer-Konzentrat mit 2,9 l destilliertem oder entionisiertem Wasser in dem
Spülapparat verdünnen und gut mischen (das Endvolumen sollte 3 l betragen).
• Den Behälter zur Verhinderung von Kontamination oder Verdunstung fest verschließen.
Nach der Vorbereitung ist der Waschpuffer drei Monate bei 2 - 30 °C stabil. Mit dem neuen
Verfallsdatum kennzeichnen. Wenn der Waschpuffer im Kühlschrank aufbewahrt wurde, ist er
vor Gebrauch auf 20 - 25 °C zu bringen.
Es wird empfohlen, dass der Spülapparat und die Schläuche zur Verhinderung einer möglichen
Kontamination durch in Bakterien und Schimmelpilzen vorhandener alkalischer Phosphatase
alle drei Monate mit 0,5 % Natriumhypochlorit-Lösung gereinigt und mit destilliertem oder
entionisiertem Wasser gründlich gespült werden.
10
VOLUMINA FÜR GEBRAUCHSFERTIGE REAGENZIEN
Nachweisreagenz 1 und
Nachweisreagenz 2
UNMITTELBAR VOR GEBRAUCH:
Reagenz gründlich mischen, dann das entsprechende Volumen des Nachweisreagenzes 1
oder 2 unter Beachtung des nachstehenden Leitfadens vorschriftsmäßig in einen sauberen
Reagenzbehälter abmessen. Zur Kontaminationsverhinderung DÜRFEN diese Reagenzien
NICHT mehr in die Originalflaschen zurückgegeben werden. Nicht aufgebrauchtes Material
nach Gebrauch verwerfen. Anstelle eines 8-Kanal-Dispensers kann auch ein geeigneter
Direktverdrängungssystem-Dispenser verwendet werden. In diesem Fall sollten die unten
angegebenen Volumina in ein Polypropylenröhrchen von ausreichender Größe pipettiert
werden.
Anzahl der
Volumen des NachweisTests/Streifen
reagenzes 1 oder 2
96/12
Flascheninhalt
72/9
7,0 ml
48/6
5,0 ml
24/3
3,0 ml
1 Test
0,125 ml
PROBENENTNAHME UND HANDHABUNG
Im hc2 HPV DNA-Test dürfen nur Zervixproben verwendet werden, die mithilfe des DNAPap Cervical
Sampler oder des HC Cervical Sampler™ (beide bestehend aus Zervixbürste und
Probentransportmedium STM (Specimen Transport Medium™)) entnommen wurden oder Proben, die mit
einem besenähnlichen Entnahmegerät oder einer Bürsten-Spatel-Kombination entnommen und in Cytyc
PreservCyt Solution gegeben wurden. Mit anderen Entnahmevorrichtungen entnommene oder in anderen
Transportmedien transportierte Proben wurden nicht zur Verwendung mit diesem Assay getestet. Die
Leistungsmerkmale dieses Kits wurden ausschließlich auf Grundlage der genannten Kits aufgestellt. Bei
Durchführung einer kolposkopischen Untersuchung muss die Entnahme von Zervixproben vor Applikation
von Essigsäure oder Jod erfolgen. Weitere Probenentnahme- und Handhabungsverfahren sind der
Packungsbeilage für den DNAPap Cervical Sampler bzw. für den HC Cervical Sampler™ zu entnehmen.
ZERVIXPROBEN IN STM
Die STM-Proben können bis zu 2 Wochen bei Raumtemperatur aufbewahrt und ohne Kühlung zum
Testen in das Laboratorium transportiert werden. Die Proben werden mittels eines Kurierdienstes in
einem isolierten Behälter entweder über Nacht oder zur Lieferung innerhalb von 2 Tagen versandt. Bei
Durchführung des Assays innerhalb einer Woche sind die Proben im Testlaboratorium bei 2 - 8 °C zu
lagern. Erfolgt die Durchführung des Assays später als eine Woche, die Proben bis zu 3 Monate bei 20 °C lagern (vor dem Einfrieren siehe ‚Hinweise‘ unter ‚Zervixbiopsien‘). Zur Verzögerung von
Bakterienwachstum und zur Stabilisierung der DNA wurde dem Specimen Transport Medium ein
Konservierungsmittel zugesetzt. Die Erhaltung der Lebensfähigkeit von Organismen oder Zellen ist
jedoch nicht beabsichtigt.
ZERVIXBIOPSIEN
Frisch entnommene Zervixbiopsien (Querschnitt: 2 - 5 mm) lassen sich auch mit dem hc2 High-RiskHPV-DNA-Test analysieren. Die Biopsieprobe muss sofort in 1,0 ml Specimen Transport Medium
gegeben und bei -20 °C eingefroren gelagert werden. Die Biopsieproben können zur Lieferung an das
Testlabor über Nacht bei 2 - 30 °C versandt und bis zur Verarbeitung bei -20 °C gelagert werden.
Biopsien mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm sind nicht zu verwenden.
Hinweise: Um zu verhindern, dass die Verschlussdeckel während des Versands oder der Lagerung im
eingefrorenen Zustand abspringen:
•
•
Die Verschlussdeckel vor dem Versand der zuvor eingefrorenen Probenröhrchen mit Parafilm®
abdecken. Die Proben können im gefrorenen Zustand oder bei 20 - 25 °C versandt werden.
Wenn die Proben zum Testen aus dem Gefrierschrank genommen werden, die Verschlussdeckel
sofort durch Schraubdeckel für Probenentnahmeröhrchen ersetzen.
11
ZERVIXPROBEN IN CYTYC PRESERVCYT LÖSUNG
Mit einer Entnahmevorrichtung des Besentyps oder der Bürsten-/Spatelkombination entnommene und in
Cytyc PreservCyt Lösung gegebene Proben zur Herstellung von ThinPrep® Pap-Test™-Präparaten sind
zur Verwendung im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test geeignet. Die Proben sind wie üblich zu entnehmen,
und die Vorbereitung der ThinPrep Pap-Test-Präparate erfolgt gemäß den Cytyc-Anleitungen.
Für den hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test müssen mindestens 4 ml PreservCyt Lösung übrig bleiben.
Proben mit weniger als 4 ml nach Vorbereitung des Pap-Tests könnten gegebenenfalls nicht genügend
Material enthalten und im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test zu falsch-negativen Ergebnissen führen.
Proben in PreservCyt-Lösung können bis zu drei Monaten bei Temperaturen zwischen 2 °C und 30 °C,
nach Entnahme und vor Verarbeitung für den hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test aufbewahrt werden. Proben
in PreservCyt Lösung dürfen nicht eingefroren werden. Informationen zur Verarbeitung dieser Proben
finden Sie im Verfahren zur Vorbereitung von PreservCyt-Proben.
ZERVIX-PROBEN IN SUREPATH PRESERVATIVE FLUID
Nach Standardverfahren gehandhabte Proben in SurePath Preservative Fluid bieten eine Option, um
nach High-Risk HPV DNA an der gleichen Probe zu testen, die zur Vorbereitung von Präparaten zur
®
zytologischen Untersuchung anhand des TriPath Imaging PrepStain™ Slide Processors verwendet
wurde. Zervixproben sollten nach Routineverfahren entnommen und die dünnschichtigen zytologischen
Präparate gemäß den Anweisungen des Handbuchs „PrepStain Slide Processor System Operator’s
Manual” präpariert werden.
TESTVERFAHREN
PROBEN KÖNNEN INFEKTIÖSE BESTANDTEILE ENTHALTEN UND SIND ENTSPRECHEND ZU
HANDHABEN. Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test kann gemäß den Anweisungen in dieser
Packungsbeilage manuell bzw. bei Tests mit großem Probendurchsatz mithilfe des Rapid Capture
System–Instruments durchgeführt werden.
TESTS MIT GROSSEM PROBENDURCHSATZ MITTELS RAPID CAPTURE SYSTEMGERÄTEANWENDUNG
Das Rapid Capture System ist ein universelles automatisches Pipettier- und Verdünnungssystem, das mit
dem hc2 HPV DNA -Test bei Tests mit großem Probendurchsatz eingesetzt werden kann. Dieses System
verarbeitet bis zu 352 Proben in acht Stunden, wobei eine Zeitspanne von 3,5 Stunden enthalten ist,
während der keine Benutzerintervention erforderlich ist; bis zu 704 Probeergebnisse können so binnen 13
Stunden bereit gestellt werden. Die testvorbereitende Denaturierung der Proben wird unabhängig vom
RCS im Hauptprobeentnahmeröhrchen durchgeführt, wie es für die manuelle Methode des hc2 HighRisk-HPV-DNA-Tests weiter unten beschrieben wird, bevor die Proben auf die RCS-Plattform
aufgetragen
werden.
Außerdem
erfolgt
der
Chemilumineszenzsignalnachweis
und
die
Ergebnisberichterstattung mittels des Offline-Luminometersystems [Digene Microplate Luminometer 2000
(DML 2000TM) Instrument], das sowohl der manuellen Methode als auch der RCS-Methode eigen ist. Die
Verfahrensschritte des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests werden in exakt derselben Abfolge wie jene beim
manuellen Testverfahren ausgeführt. Die RCS-Anwendung ermöglicht eine gestaffelte Verarbeitung von
bis zu 4 Mikrotiterplatten, die Proben und die erforderlichen Kalibratoren und Qualitätskontrollen
enthalten. .
Die für die Benutzung des Rapid Capture System erforderliche verfahrensbezogene Beschreibung
befindet sich im Benutzer-Anwendungshandbuch zum Rapid Capture System, das zusammen mit
dem Instrument und zusätzlich zu dieser Packungsbeilage geliefert wird.
VORBEREITUNG
1. Wird der Mikrotiterplatten-Inkubator I verwendet, sollte er vom Kaltstart an mindestens
60 Minuten bis auf 65 ±2 °C äquilibriert werden. Nähere Einzelheiten sind in den
Bedienungsanleitungen für den Mikrotiterplatten-Inkubator I zu finden.
12
2. Darauf achten, dass das Wasserbad auf 65 °C beheizt und der Wasserspiegel zum Eintauchen
des gesamten Volumens in den Probenröhrchen hoch genug ist.
3. Die Proben herausnehmen, und alle erforderlichen Reagenzien vor Beginn des Assays aus
dem Kühlschrank nehmen. Die Reagenzien in 15 bis 30 Minuten auf 20 - 25 °C bringen.
Hinweis: PreservCyt- und SurePath-Proben vorbereiten, bevor bereits denaturierte Proben oder
Kitreagenzien auf Raumtemperatur äquilibriert werden.
4. Mit Hilfe der Digene Hybrid Capture System-Software, Version 2 (DHCS V.2), oder der Digene
Qualitative Software eine Plattenanordnung erstellen. Nähere Einzelheiten zur Erstellung von
Plattenanordnungen sind den entsprechenden Software-Gebrauchsanweisungen zu entnehmen.
5. Zu testende Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben in der gleichen Reihenfolge, in der sie
getestet werden, in ein Teströhrchengestell bringen. Der Negativkalibrator und der High-RiskHPV-Kalibrator sind ZUERST zu testen. Negativkalibrator (NC), High-Risk-HPV-Kalibrator
(HRC), Low-Risk-Qualitätskontrolle (QC1-LR), High-Risk-Qualitätskontrolle (QC2-HR) und
Proben sollten in einer Spalte mit 8-Mikrotiterplatten-Vertiefungen angeordnet laufen. Siehe
Beispielhafte Anordnung nachstehend.
Beispielhafte Anordnung für einen Durchlauf mit 24 Mikrotiterplatten-Vertiefungen:
Spalte
Reihe
1
2
3
NC
Probe 1
Probe 9
A
NC
Probe 2
Probe 10
B
NC
Probe 3
Probe 11
C
HRC
Probe 4
Probe 12
D
HRC
Probe 5
Probe 13
E
HRC
Probe 6
Probe 14
F
QC1-LR
Probe 7
Probe 15
G
QC2-HR
Probe 8
Probe 16
H
6. Die NC und der HRC werden in Dreifachbestimmung und die QC1-LR und QC2-HR mit der HighRisk-HPV-Sondenmischung in Einzelbestimmung getestet. Die Digene-Software bestimmt die
Kalibrator- und Qualitätskontrollpositionen in der Mikrotiterplatte. Zum vorschriftsmäßigen
Kalibrator-/Qualitätskontroll-/Proben-Setup in der Software ist die Gebrauchsanweisung für das
DML 2000 Instrument und die Software, Version 2, sowie das interaktive Bedienerhandbuch für
die Digene Hybrid Capture System, Version 2 (DHCS V.2) bzw. die Gebrauchsanweisung für die
Digene Qualitative Software einzusehen.
DENATURIERUNG
Hinweise:
• Vorsicht: Das Denaturierungsreagenz ist ätzend. Bei der Handhabung vorsichtig vorgehen und
ungepuderte Handschuhe tragen.
• Wichtig: Einige Zervixproben können Blut oder anderes biologisches Material enthalten, welche
nach Zufügen des Denaturierungsreagenzes gegebenenfalls die Farbumschläge maskieren
können. Proben, die vor Zufügen des Denaturierungsreagenzes eine dunkle Farbe aufweisen,
könnten bei diesem Schritt möglicherweise keinen vorschriftsmäßigen Farbumschlag ergeben. In
den Fällen, in denen kein vorschriftsmäßiger Farbumschlag auftritt, werden die Ergebnisse
dieses Assays nicht negativ beeinflusst. Vorschriftsmäßiges Mischen kann durch Beobachtung
des Farbumschlags der Kontrollen und Kalibratoren bestätigt werden.
• Während der Denaturierungs- und Hybridisierungsschritte ist darauf zu achten, dass der
Wasserspiegel im Wasserbad zum Eintauchen des gesamten Probenvolumens in dem Röhrchen
ausreichend ist.
• Die Kalibratoren, Kontrollen und Proben können bis zum Denaturierungsschritt vorbereitet und
über Nacht bei 2 - 8 °C oder bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert werden. Maximal können
3 Gefrier-/Auftauzyklen in maximal 2 Stunden bei Raumtemperatur während jedem Auftauzyklus
durchgeführt werden. Vor Gebrauch gut mischen.
26
• Nach der Denaturierung und Inkubation werden die Proben nicht mehr als infektiös angesehen.
Das Laborpersonal sollte jedoch jederzeit die nationalen/lokalen Vorsichtsmaßnahmen beachten.
13
•
•
Die Probenentnahmevorrichtung darf vor der Denaturierung nicht entfernt werden.
Zur Vermeidung falsch-positiver Ergebnisse ist es wichtig, dass das gesamte Kalibrator-,
Qualitätskontroll- und STM-Probenmaterial mit dem Denaturierungsreagenz in Berührung kommt.
Ein weiterer kritischer Schritt ist das Mischen nach Zugabe des Denaturierungsreagenzes: Es ist
darauf zu achten, dass der Multi-Speciman Tube Vortexer auf 100 (maximale
Geschwindigkeit) eingestellt ist und während des Mischens ein sichtbarer
Flüssigkeitswirbel dergestalt beobachtet wird, dass die Flüssigkeit die gesamte
Innenfläche des Röhrchens bespült. Bei Durchführung von manuellem Vortexen
sicherstellen, dass jeder Kalibrator, jede Qualitätskontrolle und Probe jeweils mindestens
5 Sekunden bei voller Geschwindigkeit mittels Vortexen individuell gemischt werden,
damit der Flüssigkeitswirbel die gesamte Innenfläche des Röhrchens bespült, gefolgt von
einmaligem Invertieren des Röhrchens.
Verfahren zur Vorbereitung von Kalibratoren, Qualitätskontrollen und STM-Proben
1. Die Verschlussdeckel von Kalibrator, Qualitätskontrollen und STM-Probenröhrchen abnehmen
und verwerfen.
Hinweis: Von Probenröhrchen entfernte Verschlusskappen sind als potentiell infektiös zu
betrachten. Sie sind gemäß den nationalen/lokalen Bestimmungen zu entsorgen.
2. Das Denaturierungsreagenz mit dem Indikator-Farbstoff mit Hilfe eines
Direktverdrängungssystem- oder einstellbaren Dispensers in jeden Kalibrator, jede Kontrolle oder
STM-Probe pipettieren. Darauf achten, dass die Seiten des Röhrchens nicht berührt werden, um
das Auftreten einer Kreuzkontamination der Proben zu verhindern. Das Volumen des benötigten
Denaturierungsreagenzes entspricht der Hälfte des Probenvolumens. Das genaue Volumen für
jeden Kalibrator-, Qualitätskontroll- und Probentyp ist in der nachstehenden Tabelle aufgelistet.
Das restliche Denaturierungsreagenz in der Flasche vor der Entsorgung gemäß
nationaler/lokaler Laboratoriumsverfahren verdünnen.
Kalibrator, Qualitätskontrolle oder Probe
Negativkalibrator
High-Risk-HPV-Calibrator
Low-Risk- oder High-Risk-Qualitätskontrollen
Zervixprobe
Erforderliche Volumina des
Denaturierungsreagenzes
1000 µl
500 µl*
500 µl*
500 µl*
3. Die Proben unter Verwendung eines der beiden nachstehenden Verfahren mischen.
Hinweis: Der MST-Vortexer I darf nur mit Proben in Specimen Transport Medium (STM)
verwendet werden, die mit dem DNAPap Cervical Sampler oder dem HC Cervical
Sampler entnommen wurden. Proben in PreservCyt Solution müssen gemäß den unten
stehenden Anweisungen bearbeitet werden (siehe Verfahren zur Vorbereitung von
PreservCyt-Proben).
Vortexverfahren mit Multi-Specimen Tubes (MST)
Hinweis:
• Mit dem MST-Vortexer I gemischte DNAPap bzw. HC Cervical Sampler-Proben müssen unter
Verwendung des Hybridisierungsmikrotiterplatten- und des Mikrotiterplatteninkubator-IVerfahrens hybridisiert werden.
a) Die Kalibrator- Qualitätskontroll- und STM-Probenröhrchen mit DuraSeal® Abdeckungsfolie
abdecken, indem die Folie über die Röhrchen in dem Gestell gezogen wird.
b) Die Gestellabdeckung über die mit Folie abgedeckten Röhrchen bringen und mit den beiden
Seitenclips sicher befestigen. Die Folie mit der Schneidevorrichtung zurechtschneiden.
c) Das Gestell auf den Multi-Specimen Tube Vortexer stellen, und das Gestell mit der Klemme
befestigen. Verifizieren, dass sich die Geschwindigkeitseinstellung bei 100 (maximale
14
Geschwindigkeit) befindet und den Schalter des Vortexer in die „EIN“-Stellung drehen. Die
Röhrchen 10 Sekunden vortexen.
Manuelles Vortexverfahren von individuellen Röhrchen
a) Die Kalibrator-, Qualitätskontroll- und STM-Probenröhrchen mit sauberen Schraubdeckeln für
die Probenentnahmeröhrchen wieder verschließen.
b) Jedes Röhrchen durch individuelles Vortexen 5 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit
gründlich mischen.
c) Jedes Probenröhrchen zum Bespülen der Innenseite des Röhrchens, des Verschlussdeckels
und des Randes einmal invertieren.
d) Das Röhrchen wieder in das Gestell stellen.
Unabhängig von dem verwendeten Vortexverfahren muss ein sichtbarer Flüssigkeitswirbel
auf der Innenseite eines jeden Röhrchens während des Mischens dergestalt sichtbar
sein, dass die Flüssigkeit die gesamte Innenfläche des Röhrchens bespült. Die Farbe
der Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben sollte nach purpurrot umschlagen.
4. Die Röhrchen in dem Gestell in einem Wasserbad bei 65 ±2 °C 45 ±5 Minuten inkubieren
(denaturierte Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben können sofort getestet oder wie in den
vorstehenden Hinweisen beschrieben gelagert werden). Die High-Risk-HPV-Sondenmischung
während dieser Inkubation vorbereiten. Siehe Abschnitt Vorbereitung und Lagerung der
Reagenzien.
Verfahren zur Vorbereitung von PreservCyt Solution-Proben
Hinweise:
• Entnehmen Sie alle Einzelheiten der Packungsbeilage des hc2-Probenkonversionskits
•
Die Verarbeitung eines 4-ml-Aliquots der PreservCyt Solution ergibt genug Lösung für zwei
Tests, wenn manuell getestet wird. 4 ml ist das kleinste Volumen, das verarbeitet werden kann.
•
Die PreservCyt Solution in Chargen von 36 oder weniger zubereiten; sonst können sich die
Pellets beim Abdekantieren des Überstands verschieben. Dies ist wichtig, damit beim
Abdekantieren die vollständigen Zellpellets erhalten bleiben. Mit der Vorbereitung zusätzlicher
PreservCyt Solution Gefäße erst dann beginnen, wenn die Vorbereitung der ersten Charge
beendet ist.
Vorbereitung der Reagenzien
Verwenden Sie entweder das mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test mitgelieferte
Denaturierungsreagenz (DNR) (siehe Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien) oder das mit dem
hc2-Probenkonversionskit mitgelieferte DNR. Zur Vorbereitung des mit dem hc2-Probenkonversionskit
gelieferten DNR 3 Tropfen Indikatorfarbstoff in die DNR-Flasche geben und gründlich mischen. Die
Flüssigkeit sollte eine gleichmäßige, dunkle purpurrote Farbe aufweisen. Erforderliches Volumen mithilfe
von Tabelle 1 bestimmen.
Tabelle 1.
Erforderliche Mengen: Vorbereitung der Reagenzien.
Anzahl der Tests
Volumen der
Volumen des
PreservCyt
Konversionspuffe
Solution
rs
1-2
4 ml
0,4 ml
3
6 ml
0,6 ml
4
8 ml
0,8 ml
5
10 ml
1,0 ml
6
12 ml
1,2 ml
15
1. Ein hc2-Probenkonversionsröhrchen, ein konisches 10-ml-Sarstedt-Röhrchen oder ein 15-ml-VWRoder Corning-Röhrchen mit der entsprechenden Probenidentifikationsnummer beschriften.
2. Nur eine Probe auf einmal verarbeiten:
a. PreservCyt-Gefäß kräftig von Hand schütteln, bis die Zellen homogen verteilt sind.
b. Da sich die Zellen schnell absetzen, sofort das entsprechende Volumen der PreservCyt-Probe in
das beschriftete Röhrchen pipettieren. Die PreservCyt Solution ganz unten in ein konisches
Röhrchen geben, damit möglichst wenig Zellmaterial an den Wänden haften bleibt.
3. Jedem Röhrchen das entsprechende Volumen Probenkonversionspuffer zufügen (siehe Tabelle 1).
4. Röhrchen wieder verschließen und den Inhalt mit einem Vortex-Mischer mit Zusatzschale mischen.
Hinweis: Das Verfahren mit dem MST-Vortexer 2 wurde nicht zum Vortexen von Proben in
PreservCyt Solution mit Probenkonversionspuffer vor der Zentrifugation validiert und darf
daher für diesen Schritt nicht benutzt werden.
5. Röhrchen im Ausschwingrotor 15 ±2 Minuten bei 2900 ±150 U/min. zentrifugieren.
6. Während der Zentrifugation Mischung aus Probentransportmedium und Denaturierungsreagenz
(STM/DNR) gemäß Tabelle 2 im Verhältnis 2:1 vorbereiten.
Hinweis: Die STM/DNR-Mischung muss an jedem Testtag frisch zubereitet werden.
a. Zur Berechnung des Gesamtvolumens der benötigten STM/DNR-Mischung Ausgangsvolumen der
Probe in PreservCyt Solution als Anhaltspunkt nehmen und dann die STM- und DNR- Volumina
„pro Röhrchen“ mit der Anzahl der zu testenden Proben multiplizieren (siehe Tabelle 2).
Tabelle 2.
Erforderliche Mengen: STM/DNR
Ins Röhrchen
STM-Volumen pro DNR-Volumen pro
Röhrchen für
gegebene
Röhrchen für
endgültige
STM/DNRendgültige
STM/DNRMischung
STM/DNR*
Mischung*
Mischung
1-2
4 ml
120 µl
60 µl
150 µl
3
6 ml
170 µl
85 µl
225 µl
4
8 ml
220 µl
110 µl
300 µl
5
10 ml
270 µl
135 µl
375 µl
6
12 ml
320 µl
160 µl
450 µl
*Die in diesen Spalten aufgelisteten Mengen dürfen den Probenröhrchen nicht direkt zugegeben werden
Anzahl Tests
Volumen der
PreservCyt
Solution
b. Lösung gründlich mit dem Vortexer mischen.
7. Röhrchen einzeln aus der Zentrifuge nehmen und in einen Halter oder ein Konversionsgestell stellen.
In jedem Röhrchen sollte am Grund ein pink-/orangefarbenes Pellet zu sehen sein.
Hinweis: Proben, die nach dem Zentrifugieren kein sichtbares Pellet aufweisen, können nicht für den
Test verwendet und müssen verworfen werden.
8. Individuelle Handhabung der Proben:
a. Verschlusskappe entfernen und auf ein sauberes, fusselfreies Papiertuch legen.
b. Überstand sorgfältig abdekantieren.
c. Röhrchen in ungekehrter Position halten und vorsichtig (ungefähr sechsmal) auf absorbierenden,
fusselfreien Papiertüchern abtupfen, bis keine Flüssigkeit mehr aus dem Röhrchen tropft. Jedes
Mal eine saubere Stelle auf dem Papiertuch benutzen. Das Pellet darf während des Abtupfens
nicht am Röhrchen herabrutschen.
d.
Hinweise:
•
Nicht mehrmals auf dieselbe Stelle des absorbierenden, fusselfreien Papiertuchs tupfen.
•
Es ist wichtig, dass die höchstmögliche Menge an PreservCyt durch Abtupfen entfernt wird.
Aber es ist normal, wenn nach dem Abtupfen noch ein Rest an PreservCyt-Lösung zu sehen
ist.
Röhrchen in einen Halter oder ins Konversionsgestell stellen.
16
MISCHEN UND DENATURIEREN
Manuelles Vortexverfahren
1. Zu jedem Pellet entsprechende Menge STM/DNR-Lösung geben (siehe Tabelle 2). Jedes Röhrchen
wieder verschließen und einzeln auf dem Vortexer mindestens 30 Sekunden lang auf der höchsten
Geschwindigkeitsstufe resuspendieren. Wenn sich ein Pellet schwer suspendieren lässt, nochmals
10 - 30 Sekunden oder solange, bis das Pellet sich vom Röhrchengrund löst, mischen. Wenn sich
das Pellet nach erneutem Mischen (insgesamt maximal 2 Minuten) immer noch nicht ablöst,
Probenkennnummer notieren und zum nächsten Schritt übergehen.
2. Röhrchen in ein Gestell stellen.
3. Gestell 15 ±2 Minuten in ein 65 ±2°C warmes Wasserbad stellen. Dabei ist darauf zu achten, dass
der Wasserspiegel im Wasserbad zum Eintauchen des gesamten Probenvolumens in den Röhrchen
ausreichend ist.
4. Gestell mit Proben aus dem Wasserbad nehmen und Proben einzeln auf dem Vortexer 15 - 30
Sekunden mischen.
Hinweis: Überprüfen, dass zu diesem Zeitpunkt alle Pellets vollständig resuspendiert sind. Proben,
die noch immer sichtbare Pellets aufweisen, sind für den Test ungeeignet und müssen
verworfen werden.
5. Gestell ins 65 ±2°C warme Wasserbad zurückstellen und Denaturierung 30 ±3 Minuten fortsetzen.
6. Zur unten beschriebenen Hybridisierung übergehen oder siehe Optionaler Haltepunkt für die
Aufbewahrung und Behandlung denaturierter Proben.
Vortexer 2-Verfahren mit Multi-Specimen Tubes (MST)
Hinweise:
•
•
•
•
•
Das Vortexer 2-Verfahren mit Multi-Specimen Tubes (MST) ist für die Behandlung von Proben in
PreservCyt Solution nach dem Zentrifugieren und Abdekantieren des Überstands validiert.
Für die Behandlung von Proben in PreservCyt Solution ist nur der MST Vortexer 2 geeignet. Der MultiSpecimen Tube (MST) Vortexer 1 ist für die Behandlung von Proben in PreservCyt-Lösung
ungeeignet, weil er mit dem Konversionsgestell und der Abdeckung nicht kompatibel ist. Daher darf
das Konversionsgestell nicht mit dem MST Vortexer I benutzt werden.
Das Konversionsgestell und die Abdeckung wurden speziell zur Aufnahme von hc2Probenkonversionsröhrchen (VWR oder Corning, konische 15-ml-Röhrchen) entwickelt. Der Nutzer
sollte nur einen Röhrchentyp zur selben Zeit verwenden. Andere Marken wurden nicht für den
Gebrauch validiert.
Die spezifizierten Mischzeiten für Konversionsgestell und Abdeckung sind genau einzuhalten.
Konversionsgestell und Abdeckung können nicht zum Mischen der Kalibratoren oder
Qualitätskontrollen des hc2-DNA-Testkits verwendet werden. Beim Gebrauch von Konversionsgestell
und Abdeckung verhindert die Höhe der STM-Röhrchen das richtige Vortexen.
1. Jedes beschriftete konische 15-ml-Röhrchen abtupfen und dann an seine Position ins
Konversionsgestell stellen.
2. Jedem Pellet das richtige Volumen an STM/DNR-Mischung hinzufügen (Tabelle 2)
3. Die konischen 15-ml-Röhrchen mit DuraSeal Verschlussfolie abdecken, indem die Folie über die
Röhrchen in dem Gestell gezogen wird.
4. Die Gestellabdeckung über die mit Folie abgedeckten Röhrchen bringen und mit den beiden
Seitenclips sicher befestigen. Die Folie mithilfe der Schneidevorrichtung zurechtschneiden, nachdem
die Abdeckung sicher befestigt wurde.
5. Den Hebel mit rotem Griff in die waagerechte Position bringen.
6. Konversionsgestell und Abdeckung auf den MST Vortexer 2 stellen, so dass sich die größte
abgeschrägte Ecke des Konversionsgestells in der vorderen rechten Ecke befindet. Gestell und
Abdeckung so auf der Plattform des MST Vortexer 2 positionieren, dass es sicher in den Schienen
sitzt. Gestell befestigen, indem der Hebel mit rotem Griff nach unten in die senkrechte Position
bewegt wird. Dadurch wird das Gestell festgehalten.
7. Vergewissern Sie sich, dass die Geschwindigkeit auf 100 (maximale Geschwindigkeit) eingestellt ist
und bringen Sie den Kippschalter des Pulsers auf Position „AUS“.
8. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „EIN“. Die Röhrchen 30 Sekunden vortexen.
17
9. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „AUS“.
10. Entfernen Sie Konversionsgestell und Abdeckung vom MST Vortexer 2, indem Sie den Hebel mit
rotem Griff anheben.
11. Das Gestell in einem Wasserbad bei 65 ±2°C 15 ±2 Minuten inkubieren. Dabei ist darauf zu achten,
dass der Wasserspiegel im Wasserbad zum Eintauchen des gesamten Probenvolumens in den
Röhrchen ausreichend ist.
12. Nach 15-minütiger Inkubation Gestell mit den Röhrchen aus dem Wasserbad nehmen.
13. Zur Vermeidung von Spritzern überschüssiges Wasser am Gestell abtrocknen, bevor dieses auf den
MST Vortexer 2 gestellt wird.
14. Konversionsgestell und Abdeckung auf dem MST Vortexer 2 wie in Schritt 6 beschrieben befestigen.
15. Vergewissern Sie sich, dass die Geschwindigkeit auf 100 (maximale Geschwindigkeit) eingestellt ist
und bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „EIN“. Die Röhrchen 1 Minute vortexen.
16. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „AUS“
Hinweis: Bei dem Verfahren mit dem MST Vortexer 2 sind Mischgeschwindigkeit, Zeiten und
Verfahren standardisiert. Daher ist keine visuelle Kontrolle auf Zellpellets erforderlich, wie es beim
manuellen Vortexverfahren der Fall ist.
17. Stellen Sie das Gestell erneut ins Wasserbad und setzen Sie die Denaturierung bei 65 ±2°C 30 ±3
Minuten fort.
18. Gestell aus dem Wasserbad nehmen, abtrocknen und auf dem Vortexer befestigen.
19. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „EIN“. 10 Sekunden bei maximaler
Geschwindigkeit vortexen.
20. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „AUS“. Gestell entfernen.
21. Sofort Gestellabdeckung abnehmen und DuraSeal Verschlussfolie von den Proben entfernen.
22. Zur unten beschriebenen Hybridisierung übergehen, oder siehe Optionaler Haltepunkt für die
Lagerung und Behandlung denaturierter Proben.
Vorbereitungsverfahren für SurePath Proben
Nach der zytologischen Analyse können SurePath-Proben bis zu 4 Wochen bei 2-30ºC aufbewahrt
werden.
Nach zytologischem Verfahren folgendermaßen vorgehen:
1. Sicherstellen, dass Proben auf Raumtemperatur äquilibriert werden und das Flüssigkeitsvolumen ca.
2,8 ml beträgt.
VORSICHT: Wenn die Probe weniger als 1ml Flüssigkeit enthält, ist es möglich, dass nach der
zytologischen Vorbereitung SurePath Preservative Fluid nicht hinzugefügt wurde.
Die Probe ist in dem Fall NICHT geeignet für einen High-Risk HPV DNA-Test.
2. Die Probe im Ausschwingrotor 10 ± 1 Minuten bei 800 ± 15 x g zentrifugieren.
3. Die Röhrchen aus der Zentrifuge nehmen.
4. Den Überstand sofort nach der Zentrifugation sorgfältig abdekantieren und Röhrchen vorsichtig
(ungefähr dreimmal) auf absorbierenden, fusselfreien Papiertüchern abtupfen, bis keine Flüssigkeit
mehr aus dem Röhrchen tropft. In jedem Röhrchen sollte ein Pellet zu sehen sein. Das Pellet darf
während des Abtupfens nicht am Röhrchen herabrutschen.
5. Röhrchen in den Halter stellen.
6. Zu jedem Pellet 200 μl hc2 Specimen Transport Medium (STM) mittels eines
Direktverdrängungssystem- oder einstellbaren Dispensers geben.
Hinweis: Röhrchen können ohne Verschlusskappe gemischt werden.
7. Jedes Röhrchen einzeln auf dem Vortexer 15 Sekunden lang auf der höchsten Geschwindigkeitsstufe
resuspendieren. Wenn sich ein Pellet schwer suspendieren lässt, nochmals 5 - 30 Sekunden oder
solange, bis das Pellet sich vom Röhrchengrund löst, mischen.
8. In jede Probe mittels eines Direktverdrängungssystem- oder einstellbaren Dispensers 100 μl
vorbereitetes Denaturierungsreagenz (mit Indikatorfarbstoff) pipettieren.
18
VORSICHT: Darauf achten, dass die Seiten des Röhrchens nicht berührt werden, um das
Auftreten einer Kreuzkontamination zu verhindern.
Das restliche Denaturierungsreagenz in der Flasche vor der Entsorgung gemäß nationaler/lokaler
Laborverfahren verdünnen.
9. Jedes Röhrchen durch individuelles Vortexen 5 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit gründlich
mischen.
Hinweis: Röhrchen können ohne Verschlusskappe gemischt werden.
Das konische 15-ml Röhrchen mit der entsprechenden Probenidentifizierung kennzeichen (Bsp.:
„SP” für den Probentyp SurePath) und in den Halter zurückstellen.
Hinweis: Bei Verwendung des QIAGEN Rapid Capture® Systems zur halbautomatischen
Probenverarbeitung müssen konische 15-ml Röhrchen des Typs VWR or Corning® verwendet
werden, um eine korrekte Platzierung im Digene Konversionsgestell (silbernes Gestell) zu
gewährleisten.
10. Das Volumen des gesamten Röhrchens anhand einer 7-ml standard-tipped Transferpipette (oder
entsprechenden Pipette) in ein konisches 15-ml Röhrchen mit Drehverschluss transferierenfn. Die
1
konischen 15-ml Röhrchen verschließen .
11. 90 ± 5 Minuten in einem Wasserbad von 65 ± 2°C inkubieren.
VORSICHT: Diese Inkubationszeit ist länger als die für andere genehmigte Probentypen
erforderliche Inkubationszeit.
12. Wird ein HPV-Test am selben Tag durchgeführt, hc2 High-Risk Kalibratoren 45 Minuten in einem
Wasserbad von 65ºC gemäß der hc2 HPV DNA Testanweisungen denaturieren.
13. Probengestell aus dem Wasserbad nehmen.
Optionaler Haltepunkt
Nach der Denaturierung können STM-Proben und konvertierte PreservCyt- und SurePath-Proben bei 2 8°C über Nacht oder bei -20°C bis zu drei Monaten aufbewahrt werden. Über Nacht können die Proben
im Konversionsgestell gekühlt werden. Die DuraSeal Verschlussfolie und die Abdeckung müssen dann
wieder angebracht werden. Vor der Lagerung bei -20°C müssen Abdeckung und DuraSeal
Verschlussfolie entfernt und die Röhrchen mit Deckeln verschlossen werden. In beiden Fällen müssen
die Proben vor der Hybridisierung auf 20 - 25°C äquilibriert und sorgfältig gemischt werden.
Hinweis: Denaturierte Proben nicht auf Trockeneis aufbewahren oder versenden.
Die Proben können maximal dreimal eingefroren/aufgetaut werden und dürfen zwischen den Tauzyklen
maximal 2 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
HYBRIDISIERUNG
Hinweise:
•
•
•
1
Die High-Risk-HPV-Sondenmischung ist viskos. Gründliches Mischen ist wichtig; darauf achten, dass
in jedes Mikroröhrchen bzw. jede Mikrotiterplatten-Vertiefung die erforderliche Menge vollständig
abgegeben wird. Siehe Abschnitt Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien.
Wenn die denaturierte Probe bei -20°C gelagert wurde, muss sie zum Auftauen auf 20 -25°C
gebracht und vor der Hybridisierung gründlich gevortext werden.
Den Mikrotiterplatteninkubator I 60 Minuten vor Gebrauch auf 65 +2° C vorwärmen. Weitere
Einzelheiten sind bei Bedarf in den Bedienungsanweisungen für den Mikrotiterplatteninkubator I zu
finden.
Bei den bei QIAGEN zur Verifizierung durchgeführten Tests wurden konische 15-ml-Teströhrchen der Marke VWR verwendet.
19
Hybridisierungsverfahren mittels Hybridisierungsplatte und Mikrotiterplatteninkubator I
Hinweis: Mit dem DNAPap Cervical Sampler oder dem HC Cervical Sampler in Specimen Transport
Medium (STM) entnommene und mit dem MST Vortexverfahren verarbeitete Proben dürfen
nur mittels des Mikrotiterplatteninkubator I-Verfahrens hybridisiert werden.
1. Eine Mikrotiterplatte zur Hybridisierung nehmen und beschriften.
2. Die Kontrollen, Kalibratoren und Proben nach der Inkubation aus dem Wasserbad nehmen. Bei
Verwendung des Multi-Specimen Tube Vortexers das gesamte Gestell mit STM-Proben
mindestens 5 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeitseinstellung vortexen. Wenn sich die
Proben in PreservCyt Solution befinden, das gesamte Konversionsgestell mindestens 10
Sekunden bei maximaler Geschwindigkeitseinstellung vortexen. Als Alternative kann jedes
Röhrchen mindestens 5 Sekunden individuell gevortext werden.
3. Jeweils 75 µl Kontrolle, Kalibrator oder Probe unter Beachtung der unter Vorbereitung erstellten
Plattenanordnung unten auf den Boden einer leeren Vertiefung einer Mikrotiterplatte zur
Hybridisierung pipettieren. Dabei nicht die Seiten der Vertiefungen berühren und möglichst die
Bildung von Luftbläschen verhindern. Zur Vermeidung einer Kreuzkontamination von Kontrollen,
Kalibratoren oder Proben ist für jeden Transfer eine saubere, extralange Pipettenspitze zu
verwenden. Das Entfernen der Probenentnahmevorrichtung aus dem Probentransportröhrchen
ist nicht notwendig. Denaturierte Proben können mit den Schraubdeckeln für die
Probenentnahmeröhrchen verschlossen und gelagert werden, wobei die
Probenentnahmevorrichtungen in den Röhrchen bleiben. Denaturierte PreservCyt-Proben
können mit Ihren Originaldeckeln verschlossen werden.
Hinweis: Falsch-positive Ergebnisse können auftreten, wenn die Proben-Aliquoten nicht
sorgfältig überführt werden. Während der Probenüberführung darf die Pipettenspitze
bei der Entnahme von 75 µl Aliquot die Innenseite des Röhrchens nicht berühren.
4. Nach dem Überführen der letzten Probe die Platte mit einer Plattenabdeckung verschließen und
die Mikrotiterplatte zur Hybridisierung 10 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren.
5. Die vorbereitete und gründlich gevortexte High-Risk-HPV-Sondenmischung in einen EinwegReagenzbehälter aliquotieren. Mit einem 8-Kanal-Dispenser und frischen Spitzen für jede Reihe
in jeweils jede die Kontrolle, Kalibratoren und Proben enthaltende Vertiefung der Mikrotiterplatte
zur Hybridisierung sorgfältig 25 µl der High-Risk-HPV-Sondenmischung pipettieren. In jede
Hybridisierungsvertiefung ohne Verspritzen das Sondenvolumen abgeben. Dabei dürfen die
Seiten der Vertiefungen nicht berührt werden.
6. Die Mikrotiterplatte zur Hybridisierung mit einem Plattendeckel abdecken und auf einem auf
1100 ±100 U/min eingestellten Hybrid Capture System-Kreisschüttler I 3 ±2 Minuten schütteln.
Die Kontrollen, Kalibratoren und Proben sollten nach dem Schütteln nach gelb umschlagen.
Vertiefungen, die purpurrot bleiben, haben nicht die vorschriftsmäßige Menge der
Sondenmischung erhalten. Den purpurrot gebliebenen Proben zusätzliche 25 µl der
Sondenmischung zufügen und erneut schütteln. Wenn die Vertiefungen nach erneuter Zugabe
purpurrot bleiben, müssen die Proben erneut getestet werden.
Hinweise:
•
Nach dem Schütteln sollten die Proben in der PreservCyt-Lösung anstelle von gelb nach rosa
umschlagen.
•
Wenn die Mikrotiterplatte zur Hybridisierung in den Mikrotiterplatteninkubator I gebracht wird,
ist darauf zu achten, dass kein Material verspritzt wird.
7. Hybridisierungsmikrotiterplatte in einem auf 65 ±2 °C vorgewärmten und äquilibrierten
Mikrotiterplatteninkubator I 60 ±5 Minuten inkubieren.
Hybridisierungsverfahren mittels Mikroröhrchen und Wasserbad
Hinweise:
• Die Verarbeitung der mit dem HC Cervical Sampler in Specimen Transport Medium (STM)
entnommenen Proben mit Hilfe des MST-Vortexverfahrens zum Mischen und des
Wasserbadverfahrens zur Hybridisierung wurde nicht validiert. Mit dem DNAPap oder HC
20
Cervical Sampler in STM entnommene und mittels des MST-Vortexverfahrens verarbeitete
Proben dürfen nur mit dem Mikrotiterplatteninkubator I-Verfahren hybridisiert werden.
•
Wenn die denaturierte Probe bei -20 °C gelagert wurde, muss die Probe zum Auftauen auf
20 - 25 °C gebracht und vor der Weiterverarbeitung in der Hybridisierung gründlich gevortext
werden.
1. Kennzeichnen und die erforderliche Anzahl sauberer Hybridisierungsmikroröhrchen in das
Mikroröhrchengestell geben.
2. Die Kontrollen, Kalibratoren und Proben nach der Inkubation aus dem Wasserbad nehmen.
Jedes Röhrchen unmittelbar vor der Entnahme von Aliquoten individuell mindestens 5 Sekunden
vortexen.
3. Nach der unter Vorbereitung erstellten Plattenanordnung jeweils 75 µl Kontrolle, Kalibrator oder
Probe auf den Boden des entsprechenden Hybridisierungsmikroröhrchens pipettieren. Dabei die
Seiten des Mikroröhrchens nicht berühren und die Bildung von Luftbläschen möglichst
verhindern. Zur Vermeidung einer Kreuzkontamination von Kontrollen, Kalibratoren oder Proben
für jeden Transfer eine saubere, extralange Pipettenspitze verwenden. Das Entfernen der
Probenentnahmevorrichtung aus dem Probentransportröhrchen ist nicht notwendig. Denaturierte
Proben können mit den Schraubdeckeln für die Probenentnahmeröhrchen verschlossen und
gelagert werden, indem die Probenentnahmevorrichtungen in den Röhrchen bleiben
4. Nach dem Überführen der letzten Probe die Mikroröhrchen zur Hybridisierung 10 Minuten
bei 20 - 25 °C inkubieren.
5. Die vorbereitete und gründlich gevortexte Sondenmischung in einen Einweg-Reagenzbehälter
aliquotieren. Mit einem 8-Kanal-Dispenser und frischen Spitzen für jede Reihe in jedes die
Kontrollen, Kalibratoren und Proben enthaltende Mikroröhrchen sorgfältig 25 µl der
Sondenmischung pipettieren. In jedes Hybridisierungsmikroröhrchen ohne Verspritzen das
Sondenmischungsvolumen abgeben. Dabei dürfen die Seiten der Röhrchen nicht berührt werden.
Das Gestell zur Verifizierung, dass alle Röhrchen die entsprechende Sondenmenge erhalten
haben, von unten prüfen.
6. Die Mikroröhrchen mit einer Plattenabdeckung abdecken. Die Gestellabdeckung oben auf das
Gestell geben. Das Mikroröhrchengestell auf einem bei 1100 ±100 U/min eingestellten
Kreisschüttler I 3 ±2 Minuten schütteln. Die Kontrollen, Kalibratoren und Proben sollten nach dem
Schütteln nach gelb umschlagen. Röhrchen, die purpurrot bleiben, haben nicht die
vorschriftsmäßige Menge der Sondenmischung erhalten. Den purpurrot gebliebenen Proben
zusätzlich 25 µl der Sondenmischung zufügen und erneut schütteln. Wenn die Röhrchen nach
erneuter Zugabe purpurrot bleiben, sind die Proben erneut zu testen.
Hinweis: Nach dem Schütteln sollten die Proben in der PreservCyt-Lösung von gelb nach rosa
umschlagen.
7. Das Mikroröhrchengestell in einem auf 65 ±2 °C vorgewärmten Wasserbad 60 ±5 Minuten
inkubieren. Sicherstellen, dass der Wasserspiegel in dem Wasserbad zur Bedeckung des
gesamten Volumens des Hybridisierungsgemischs ausreichend ist. Das Mikroröhrchengestell
schwimmt dann im Wasserbad.
Hinweis: Mit der DHCS-Software, V.2 oder Digene Qualitative Software eine
Plattenanordnungsdatei erstellen, sofern dies nicht bereits früher vorgenommen
wurde.
HYBRID CAPTURE
1. Alle, außer der erforderlichen Anzahl der Capture-Mikroplatten-Vertiefungen, aus der Platte
herausnehmen. Nicht gebrauchte Mikrotiterplatten-Vertiefungen in den Originalbeutel
zurückgeben und wieder verschließen. Die Spalten mit einem Markierungsstift mit 1, 2, 3. . .
nummerieren, und die Mikroplatte mit dem entsprechenden Kennzeichen beschriften. Die Proben
werden den Vertiefungen nach der unter ‚Vorbereitung‘ erstellten beispielhaften Anordnung
zugefügt.
21
2. 85Die Mikrotiterplatte zur Hybridisierung mit Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben
vorsichtig aus dem Mikrotiterplatteninkubator I nehmen. Sofort den Plattendeckel abnehmen und
ihn auf eine saubere Oberfläche legen. Als Alternative wird das Mikroröhrchengestell aus dem
Wasserbad genommen. Sofort die Abdeckung von dem Gestell nehmen und die
Plattenabdeckung langsam nach oben vom Gestell abziehen.
3. Mit einem 8-Kanal-Dispenser den gesamten Inhalt (ca. 100 µl) der Kontrollen, Kalibratoren und
Proben aus den Hybridisierungs-Mikrotiterplatten-Vertiefungen oder Mikroröhrchen auf den
Boden der entsprechenden Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefung überführen. Für jede überführte
Reihe sind auf dem 8-Kanal-Dispenser neue Pipettenspitzen zu verwenden, und jede
Pipettenspitze muss zur Gewährleistung einer vollständigen Probenüberführung gut auslaufen.
Gegebenenfalls kann der Dispenser ruhig gehalten werden, indem die Mitte der Pipettenspitzen
gegen die obere Kante der Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen gelehnt wird (siehe
Abbildung 1).
ABBILDUNG 1: RICHTIGES PIPETTIEREN
RICHTIG
Nicht vertikal
pipettieren.
Verspritzen
vermeiden.
Die Spitze darf die
Seite der
Vertiefung nicht
berühren.
4. Die Mikrotiterplatte mit dem Plattendeckel oder der Plattenabdeckung abdecken und auf dem
Kreisschüttler I bei 1100 ±100 U/min, 60 ± 5 Minuten bei 20 - 25 °C schütteln.
5. Den Waschpuffer vorbereiten. Die Spül und Abwassertanks des automatischen Plattenspülers I
während dieser Inkubation überprüfen. Siehe Abschnitt Vorbereitung der Reagenzien.
6. Wenn der Capture-Schritt abgeschlossen ist, die Capture-Mikrotiterplatte aus dem Kreisschüttler I
nehmen, und den Plattendeckel oder die Plattenabdeckung vorsichtig entfernen. Die Flüssigkeit
aus den Vertiefungen entfernen und sie im Ausguss verwerfen; die Platte über dem Ausguss
umdrehen und mit einer Bewegung kräftig nach unten schütteln. Vorsichtig vorgehen, damit beim
Dekantieren zu dicht am Boden des Ausgusses kein Material verspritzt wird. Die Platte nicht
wieder umdrehen; mit sauberen Kimtowels®-Wischtüchern oder entsprechenden fusselfreien
Papiertüchern 2 bis 3 Mal kräftig abtupfen. Darauf achten, dass alle Flüssigkeit aus den
Vertiefungen entfernt und die Oberseite der Platte trocken ist.
HYBRIDNACHWEIS
Hinweise:
• Alle Zugaben über die gesamte Platte mit einem 8-Kanal-Dispenser von links nach rechts
vornehmen.
• Zwecks Konsistenz der Reagenzabgabe wird die reverse Pipettiertechnik empfohlen. Bei
dieser Technik werden die Pipettenspitzen unter Verwendung des zweiten Anschlags an der
Aspirier-/Abgabekontrolle (Kolben) initial überfüllt. Siehe nachstehendes Verfahren. Die
Spitzen vor Abgabe an die Platte an dem Einweg-Reagenzbehälter abstreifen.
• Gegebenenfalls kann der Dispenser ruhig gehalten werden, indem man die Mitte der
Pipettenspitzen gegen die obere Kante der Mikrotiterplatten-Vertiefungen lehnt. Darauf
achten, dass die Seiten der Mikrotiterplatten-Vertiefungen nicht berührt werden, weil
andernfalls eine Kreuzkontamination der Proben auftreten könnte. Bitte die vorstehende
Abbildung 1 beachten.
22
1. Das entsprechende Volumen des Nachweisreagenzes 1 in einen Einweg-Reagenzbehälter
aliquotieren (weitere Anweisungen sind dem Abschnitt Vorbereitung der Reagenzien zu
entnehmen). 75 µl des Nachweisreagenzes 1 mit einem 8-Kanal-Dispenser und der reversen
Pipettiertechnik vorsichtig in jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte pipettieren.
Reverses Pipettierverfahren:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Die Spitzen auf einen 8-Kanal-Dispenser setzen; sicherstellen, dass alle Spitzen fest
aufsitzen.
Den Dispenser-Kolben an dem ersten Anschlag vorbei auf den zweiten Anschlag drücken.
Die Spitzen in die Nachweisreagenzlösung 1 eintauchen.
Den Kolben langsam freigeben und die Spitzen mit Flüssigkeit füllen lassen.
75 µl der Lösung durch Drücken des Kolbens auf den ersten Anschlag in die
Mikrotiterplatten-Vertiefungen abgeben. Den Kolben nicht freigeben, bis die Pipettenspitzen
erneut in die Lösung von Nachweisreagenz 1 getaucht wurden.
Die Spitzen erneut füllen, und diesen Vorgang wiederholen, bis alle Vertiefungen gefüllt sind.
Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte von links nach rechts befüllen. Verifizieren, dass alle
Vertiefungen gefüllt wurden, indem die Intensität der rosa Farbe beobachtet wird. Alle
Vertiefungen sollten eine ähnliche Intensität aufweisen.
2. Die Platten mit einem Plattendeckel oder sauberem Parafilm (oder einem ähnlichen Material)
abdecken und 30 - 45 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren.
SPÜLEN
Die Capture-Platte nach einem der beiden nachstehenden Verfahren spülen.
Automatisches Plattenspüler I-Verfahren:
Hinweis: Den automatischen Plattenspüler I immer eingeschaltet lassen. Darauf achten, dass der
Spülwassertank gefüllt und der Abwassertank leer ist. Der automatische Plattenspülapparat I
spült das System zu Reinigungszwecken routinemäßig. Siehe gegebenenfalls die Bedienungsund Wartungsanleitungen für den automatischen Plattenspülapparat I.
VOR JEDEM GEBRAUCH:
• Verifizieren, dass der Wassertank mindestens bis zur 1-l-Marke mit Waschpufferlösung gefüllt ist.
Wenn nicht, Waschpuffer-Lösung vorbereiten. Siehe den Abschnitt Vorbereitung der Reagenzien.
• Verifizieren, dass der Spülwassertank mit entionisiertem oder destilliertem Wasser gefüllt ist.
• Verifizieren, dass der Abwassertank leer und der Verschlussdeckel sicher befestigt ist.
• Der automatische Plattenspülapparat I füllt sich vor jedem Spülvorgang automatisch von selbst und
führt nach jedem Spülvorgang eine Pflegespülung durch.
1. Den Plattendeckel abnehmen und die Platte auf die Plattform des automatischen
Plattenspülapparates I geben.
2. Verifizieren, dass der Strom eingeschaltet und auf dem Display „Digene Wash Ready“ erscheint.
Hinweis: Wenn nur ein Teil einer Reihe der Capture-Vertiefungen gebraucht wird, müssen die
leeren Mikrotiterplatten-Vertiefungen in die Capture-Platte gegeben werden, um die
Reihe vor dem Spülen zu vervollständigen.
3. Die Zahl der zu spülenden Reihen durch Drücken der Taste „Rows“ [Reihen] und dann zum
Einstellen „+“ oder „-“ wählen. Die Taste „Rows“ [Reihen] drücken, um auf „Digene Wash Ready“
zurückzukehren.
4. Zum Beginn „Start/Stop“ drücken.
5. Der Spülapparat führt sechs ca. 10 Minuten dauernde Füll- und Absaugzyklen durch. Während
des Programmablaufs tritt eine kurze Pause ein; darauf achten, dass die Platte nicht frühzeitig
entfernt wird. Wenn der automatische Plattenspüler I das Spülen beendet hat, erscheint die
Anzeige „Digene Wash Ready“.
23
6. Wenn das Programm beendet ist, die Mikrotiterplatte aus dem Spülapparat nehmen. Die Platte
sollte weiß aussehen, und es sollte keine rosa Flüssigkeit in den Mikrotiterplatten-Vertiefungen
zurückbleiben.
Manuelles Spülverfahren:
1. Das Nachweisreagenz 1 aus den Vertiefungen entfernen, indem saubere Kimtowels-Wischtücher
oder entsprechende fusselfreie Papiertücher oben auf die Platte gelegt und die Platte vorsichtig
umgedreht wird. Vor dem Umdrehen gewährleisten, dass sich das Papier mit der gesamten
Oberfläche der Platte in Kontakt befindet. Die Platte 1 - 2 Minuten ablaufen lassen. Auf sauberen
Kimtowels-Wischtüchern oder entsprechenden fusselfreien Papiertüchern gut abtupfen. Die
gebrauchten Papiertücher vorsichtig entsorgen, um eine Kontamination der späteren Schritte mit
alkalischer Phosphatase zu vermeiden.
2. Die Platten unter Verwendung des Spülapparates 6 Mal manuell spülen. Jede Vertiefung wird zur
Entfernung von Nachweisreagenz 1 von den Oberseiten der Vertiefungen bis zum Überfließen
gespült. Das Spülen beginnt bei Vertiefung A1 und wird in einer Schlangenlinie nach rechts und
unten fortgesetzt. Nachdem alle Vertiefungen gefüllt wurden, die Flüssigkeit mit einer kräftigen
Bewegung nach unten in den Ausguss dekantieren. Der zweite Spülvorgang beginnt bei
Vertiefung H12 und verläuft in einer Schlangenlinie nach links und oben. Diese aus
2 Spülvorgängen bestehende Sequenz wird zwei weitere Male für insgesamt 6 Spülvorgänge pro
Vertiefung wiederholt.
3. Nach dem Spülen wird die Platte umgedreht auf sauberen Kimtowels-Wischtüchern oder
entsprechenden fusselfreien Papiertüchern abgetupft und 3 bis 4 Mal kräftig ausgeklopft. Die
Papiertücher austauschen und erneut abtupfen. Die Platte umgedreht 5 Minuten ablaufen lassen.
Die Platte nochmals abtupfen.
4. Die Platte sollte weiß aussehen, d. h. es sollte keine restliche rosa Flüssigkeit in den
Mikrotiterplatten-Vertiefungen zurückbleiben.
SIGNALVERSTÄRKUNG
Hinweise:
• Zur Handhabung des Nachweisreagenzes 2 ein neues Paar Handschuhe verwenden.
• Zur Vermeidung einer Kontamination von Nachweisreagenz 2 nur die zur Durchführung des
Assays erforderliche Reagenzmenge in den Einweg-Reagenzbehälter aliquotieren. Siehe den
Abschnitt ‚Vorbereitung des Reagenzes‘. Das Nachweisreagenz 2 darf nicht in die
Originalflasche zurückgegeben werden. Nach dem Gebrauch nicht aufgebrauchtes
Material verwerfen.
• Die Zugabe von Nachweisreagenz 2 sollte ohne Unterbrechung erfolgen. Die Inkubationszeit
aller Vertiefungen muss so dicht wie möglich beieinander liegen.
• Darauf achten, dass die Seiten der Mikrotiterplatten-Vertiefungen nicht berührt werden oder
Reagenz zurück auf die Spitzen gespritzt wird, da eine Kreuzkontamination der Proben
auftreten könnte (siehe Abbildung 1).
1. 75 µl des Nachweisreagenzes 2 unter Verwendung eines 8-Kanal-Dispensers, wie zuvor
beschrieben, sorgfältig in jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte pipettieren. Alle
Mikrotiterplatten-Vertiefungen sollten in eine gelbe Farbe umschlagen. Durch Beobachtung der
Intensität der gelben Farbe verifizieren, dass alle Vertiefungen gefüllt wurden. Alle Vertiefungen
sollten eine ähnliche Intensität aufweisen.
2. Die Mikrotiterplatte mit einem Plattendeckel, sauberem Parafilm (oder entsprechendem Material)
abdecken und 15 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Direkte Sonnenlichteinwirkung vermeiden.
3. Die Mikrotiterplatte nach 15-minütiger Inkubation (und nicht später als 30 Minuten nach der
Inkubation) im Digene Mikrotiterplatten-Luminometer 2000 (DML 2000™) messen.
4. Das Assay-spezifische Software-Protokoll des DML 2000-Instrumentes erlaubt die Eingabe von
relevanten Assayinformationen direkt in die Software.
24
5. Wenn eine Mikrotiterplatte nicht vollständig verwendet wurde, die verwendeten MikrotiterplattenVertiefungen aus dem Mikrotiterplattenhalter entfernen, das Gestell gründlich mit destilliertem
oder entionisiertem Wasser spülen, trocknen und für den nächsten Assay bereithalten.
VERIFIKATIONSKRITERIEN FÜR DIE ASSAY-KALIBRIERUNG
Die Verifikation der Assay-Kalibrierung wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Reagenzien und
bereitgestellten Kalibrator- und Kontrollmaterialien vorschriftsmäßig funktionieren und den
Assay-Grenzwert genau ermitteln. Für den hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test ist die Kalibrierung bei jedem
Assay erforderlich. Deshalb ist es notwendig, jeden Assay unter Verwendung der folgenden Kriterien zu
verifizieren. Dieses Verifikationsverfahren ist nicht als Ersatz der internen Qualitätskontrollprüfung
bestimmt. Die DHCS, Version 2, und die Qualitative Software von Digene mit den DML-Assayprotokollen
für HPV, Version 4.01 oder höher, verifizieren automatisch nachfolgende Kriterien.
1.
Negativkalibrator
Der Negativkalibrator muss bei jedem Assay in dreifacher Ausführung getestet werden. Um mit
dem Test fortfahren zu können, muss der Mittelwert des Negativkalibrators ≥10 und ≤250 RLU
sein. Die vom Negativkalibrator erhaltenen Ergebnisse sollten einen Variationskoeffizienten (VK
(%)) von ≤25 % ergeben. Liegt der VK (%) bei >25 %, wird der Kontrollwert mit einem RLU-Wert,
der sich am weitesten von dem Mittelwert befindet, als ein Ausreißer verworfen und der Mittelwert
unter Verwendung der beiden verbleibenden Kontrollwerte erneut berechnet. Wenn der
Unterschied zwischen dem Mittelwert und jedem der beiden Werte ≤25 % beträgt, mit Schritt 2
fortfahren. Andernfalls ist die Assay-Kalibrationsverifikation ungültig, und der Assay muss für alle
Patientenproben wiederholt werden. In diesem Fall dürfen die Ergebnisse der Patientenproben
nicht berichtet werden.
2.
Kalibrator
Der High-Risk-HPV-Calibrator (HRC) muss bei jedem Assay in dreifacher Ausführung getestet
werden. Die Kalibratorergebnisse sollten einen Variationskoeffizienten (VK (%)) von ≤15 %
ergeben. Liegt der VK (%) > 15% muss der Kalibratorwert mit einem am weitesten von dem
Mittelwert liegenden RLU-Wert als ein Ausreißer verworfen und der Mittelwert unter Verwendung
der verbleibenden beiden Kalibratorwerte erneut berechnet werden. Wenn der Unterschied
zwischen dem Mittelwert und jedem der beiden Werte ≤ 15% beträgt, mit Schritt 3 fortfahren.
Andernfalls ist die Assay-Kalibrationsverifikation ungültig, und der Assay muss für alle
Patientenproben wiederholt werden. In diesem Fall dürfen die Patientenergebnisse nicht berichtet
werden.
Die oben beschriebene Assay-Kalibrationsverifikation für den Negativkalibrator und den
Kalibrator wird von der DHCS, V.2 und der Digene Qualitative Software automatisch durchgeführt
und auf dem Datenanalysenbericht ausgedruckt. Die DHCS-Software, V.2 und die Digene
Qualitative Software mit den DML 2000 Assayprotokollen für HPV, Version 4.01 oder
höher, verifizieren automatisch, dass der VK (%) für den High-Risk-HPV-Calibrator ≤ 15 %
liegt. Die Digene Qualitative Software (V1.0.2 und V1.0.3) macht den Assay jedoch NICHT
ungültig, es sei denn, dass der VK (%) für den High-Risk-HPV-Calibrator >25 % liegt. Der
Anwender muss deshalb manuell verifizieren, dass der durch die DML 2000 Instrument Software
berechnete VK (%) ≤15% beträgt, und wie für Situation 1 aus der nachstehenden Tabelle
ersichtlich ist, fortfahren. Wenn der VK (%) der Kalibrator-Wiederholungstests zwischen 15 % und
25 % fällt, sind die Anleitungen für Situation 2 oder 3 in der nachstehenden Tabelle einzusehen,
und es ist wie unter Aktion des Anwenders angegeben fortzufahren.
25
Situation
1
Wert des VK (%) für
die HRCWiederholungstests
≤15 %
Aktion mittels der
Digene Qualitative
Software
Aktion des Anwenders
Assay als „gültig“
berichtet
Ergebnisse können berichtet werden, es ist keine
weitere Aktion erforderlich.
2
Zwischen 15 % und
25 %
Keine Bereinigung der
Ausreißer; der Assay wird
als „gültig“ berichtet
Den am weitesten vom Mittelwert entfernt liegenden
Kalibrator-RLU-Wert bereinigen. Den VK (%) des
Kalibrators mit den beiden verbleibenden Werten
erneut berechnen. Wenn der VK (%) der beiden
verbleibenden RLU-Werte >15 % liegt, ist der Assay
ungültig. Die Ergebnisse dürfen nicht berichtet
werden. Wenn der VK (%) der verbleibenden RLUWerte ≤15 % liegt, den Assay-Grenzwert erneut
berechnen und dann den RLU/GrenzwertQuotienten von jeder Probe mittels dieses
Grenzwertes erneut berechnen. Diese erneut
berechneten Werte können berichtet werden.
3
Zwischen 15 % und
25 %
Bereinigung eines
Ausreißers; der Assay
wird als „gültig“ berichtet
Der Assay ist ungültig. Die Ergebnisse dürfen nicht
berichtet werden. Der Assay muss wiederholt
werden.
4
>25 %
Bereinigung eines
Ausreißers; der Assay
wird als „ungültig“
berichtet
Der Assay ist ungültig. Die Ergebnisse dürfen nicht
berichtet werden. Der Assay muss wiederholt
werden.
Zur manuellen Berechnung des VK (%), wie in der vorstehenden Situation 2 erforderlich, sollte
der Anwender die Standardabweichung (n-1) der verbleibenden RLU-Werte aus dem
Wiederholungstest durch den Mittelwert der verbliebenen RLU-Werte (HRC) aus dem
Wiederholungstest dividieren und dieses Ergebnis mit 100 multiplizieren.
Zur Berechnung des VK (%) mit Microsoft® Excel (mit der Digene Qualitative Software geliefert)
kann der Anwender die Standardabweichung von den Kalibrator-Wiederholungstests mit der
Formel Standardabweichung (STDEV) berechnen und den RLU-Mittelwert des Kalibrators mit der
Formel Mittelwert (AVERAGE) ermitteln. Sobald diese beiden Werte vorliegen, die
Standardabweichung durch den Mittelwert dividieren und das Ergebnis zum Erhalt des VK (%)
mit 100 multiplizieren.
(STDEV/AVERAGE) * 100 = VK (%)
Bei auf die Berechnung der VK (%), die erneute Berechnung des Assay-Grenzwertes oder
die erneute Berechnung des RLU/Grenzwertes der Proben bezogenen Fragen setzen Sie
sich bitte mit Ihrem lokalen QIAGEN-Vertreter in Verbindung.
Zur Ermittlung der Kalibrator-Reproduzierbarkeit und der Schätzung der Frequenz, mit der die
manuellen Neuberechnungen erforderlich sein könnten, wurden die Ergebnisse aus drei
klinischen Evaluationen der mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test durchgeführten 152 AssayDurchläufe gesammelt. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass der durchschnittliche VK (%)
für diese 152 Durchläufe 8,1 % betrug. Unter Berücksichtigung aller drei Wiederholungstests des
Kalibrators pro Testdurchlauf wurde eine Kalibrator-Reproduzierbarkeit des VK (%) von > 15 %
für nur 17 der 152 Durchläufe (11,2 %) beobachtet, wobei 10 dieser 17 Testdurchläufe einen
VK (%) zwischen 15 % und 25 % ergaben (Situation 2). Für die 17 Testdurchläufe, die einen VK
(%) von >15 % ergaben, wurde für einen einzelnen Ausreißer bereinigt und der VK (%) erneut
berechnet. Nach der ‚Aktion des Anwenders‘ für Situation 2 blieb nur einer der VK (%) für die
Testdurchläufe >15 % und machte folglich den Testdurchlauf ungültig. Die VK (%) der übrigen
151 Testdurchläufe wurden mit einem durchschnittlichen VK (%) von 6,0 % berechnet.
3.
Die Ergebnisse des Kalibrator-Mittelwertes (HRC ) und des Mittelwertes des
Negativkalibrators (NC ) werden zur Berechnung des HRC /NC -Quotienten verwendet.
Bevor die Probenergebnisse interpretiert werden können, müssen diese Quotienten den
folgenden Kriterien entsprechen, um die Assay-Kalibration zu verifizieren:
26
Verifikation der Assay-Kalibration – zulässige Bereiche
2,0 ≤ HRC / NC ≤ 15
4.
Den HRC /NC -Quotienten berechnen. Wenn der Quotient ≥2,0 und ≤15 ist, auf den nächsten
Schritt übergehen. Wenn der Quotient <2,0 oder >15 ist, ist der Assay ungültig und muss
wiederholt werden. Alle Patientenproben in dem Durchlauf wiederholen.
Hinweis: Zulässige Bereiche für den Negativkalibrator und den Kalibrator wurden nur für das DML
2000-Instrument ermittelt.
BERECHNUNG DER GRENZWERTE
Sobald ein Assay nach den vorstehenden Kriterien validiert wurde, ist der Grenzwert zur Bestimmung der
positiven Proben HRC .
Beispiel einer Grenzwert-Berechnung:
NC-RLU-Werte
97
101
91
96
Mittlerer RLU-Wert
VK (%)
4,9
HRC /NC
Nicht zutreffend
Folglich ist der positive Grenzwert (HRC ) = 318.
HRC-RLU-Werte
312
335
307
318
4,7
3,31
Alle von den Proben erhaltenen RLU-Werte sollten in einen Quotienten des entsprechenden Grenzwertes
umgewandelt werden. So sollten zum Beispiel alle Assays als Proben-RLU/Grenzwert ausgedrückt
werden.
Hinweis:
Die RLU/Grenzwerte und positiven/negativen Ergebnisse für alle Proben werden in dem
Datenanalyse-Bericht für DML 2000 berichtet.
Für die Anwendung des Rapid Capture System Geräts wurde das Protokoll der RCS
HPV Software so programmiert, dass der mittlere RLU-Wert gültiger positiver KalibratorWiederholungstests durch einen Kalibrierungsanpassungsfaktor (Calibration Adjustment
Factor, CAF) von 0,8 korrigiert wird. Dieser CAF ist notwendig, damit die
Leistungsmerkmale des Assays denen des manuellen Testverfahrens entsprechen.
Diese Änderung wird nur bei Assays eingesetzt, die unter Anwendung des Rapid Capture
Geräts durchgeführt wurden. Daher ist es entscheidend, für jedes Testverfahren das
richtige Software-Protokoll zu wählen, um genaue Testergebnisse zu erzielen. Sämtliche
Proben-RLU-Werte sollten in ein Verhältnis zu dem entsprechenden Cutoff- (CO) Wert
umgewandelt werden. So sollten zum Beispiel alle Assays als Proben-RLU/CO
ausgedrückt werden.
27
QUALITÄTSKONTROLLE
Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test wird mit Qualitätskontrollproben geliefert. Nähere Anleitungen, wie
beispielsweise die Chargen-Bezeichnungen oder die Verfalldaten der Qualitätskontrollen einzugeben
sind, gehen aus den Gebrauchsanweisungen des Digene Hybrid Capture Systems Version 2, dem
interaktiven Bedienerhandbuch für die DHCS V.2 Software oder den Gebrauchsanweisungen der Digene
Qualitative Software hervor. Diese Qualitätskontrollen müssen bei jedem Testdurchlauf eingeschlossen
werden, und der RLU/Grenzwert Quotient von jedem Assay muss in die folgenden zulässigen Bereiche
fallen, damit der Durchlauf als gültig eingestuft werden kann. Wenn die Qualitätskontrollen nicht in
diese Bereiche fallen, ist der Assay ungültig und muss wiederholt werden. Demzufolge dürfen für
einen ungültigen Durchlauf keine Patientenergebnisse berichtet werden.
Qualitäts
kontrolle
Erwartetes Ergebnis
(RLU/Grenzwert)
High-Risk HPV-Sonde
HPV-Typ
QC1-LR
Low-Risk (HPV 6)
QC2-HR
High-Risk (HPV
16)
Minimum
Maximum
Durchsch
nitt
%CV
0,001
0,999
0,5
25
2
8
5,0
25
1. Die im Kit bereitgestellten Qualitätskontrollen sind klonierte HPV-DNA-Sequenzen, die sich nicht
von HPV des Wildtyps herleiten. Hierbei handelt es sich um die gleiche Material wie für die
Kalibratoren verwendete Materialart, die mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test geliefert wird.
2. Dieses Qualitätskontrollmaterial ist keine geeignete Kontrolle für die Behandlung von Specimen
Transport Medium, PreservCyt Solution oder SurePath Preservative Fluid.
3. Die mit diesem Testkit bereitgestellten Qualitätskontrollen sind für die interne Qualitätskontrolle
zu verwenden. Zusätzliche Kontrollen können nach den Leitfäden oder Anforderungen der
jeweiligen lokalen, und/oder Landesbestimmungen oder der Akkreditierungsorganisationen
getestet werden.
28
INTERPRETATION DER PROBENERGEBNISSE
Hinweis: Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test-Grenzwert von 1 pg/ml entspricht 100.000 HPV-Kopien/ml
oder 5.000 HPV-Kopien pro Assay.
1. STM-Proben mit RLU/Grenzwert-Quotienten ≥1,0 werden als „positiv“ eingestuft.
2. Proben mit RLU/Grenzwert-Quotienten <1,0 werden für die getesteten 13 HPV-Typen als „negativ“
oder „nicht nachweisbar“ eingestuft. Es sind entweder keine High-Risk-HPV-DNA-Sequenzen
vorhanden oder die HPV-DNA-Konzentration liegt unter der Nachweisgrenze des Assays.
3. Wenn Proben in PreservCyt Solution getestet werden und der RLU/CO-Quotient einer Probe ≥1,0
und <2,5 ist, wird von QIAGEN empfohlen, die Proben erneut zu testen. Wenn das Ergebnis des
ersten Wiederholungstests positiv ist (≥1,0 RLU/CO), kann die Probe als positiv registriert werden,
und es sind keine weiteren Wiederholungstests erforderlich. Wenn aber das Ergebnis des ersten
Wiederholungstests negativ ist, (<1,0), muss ein zweiter Wiederholungstest (drittes Ergebnis)
durchgeführt werden, um das endgültige Ergebnis zu erzeugen. Das Ergebnis des zweiten
Wiederholungstests wird als Endergebnis betrachtet und ist zu berichten.
4. Wenn der RLU/Grenzwert-Quotient einer Probe dicht bei oder unter 1,0 liegt und eine High-RiskHPV-Infektion vermutet wird, sind alternative Testverfahren und/oder eine Wiederholungsprobe in
Betracht zu ziehen.
5. Da mit diesem Assay nur die High-Risk-HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und
68 nachgewiesen werden, muss man sich bewusst sein, dass in der Probe auch Low-Risk-HPVTypen vorliegen können. Wird speziell auf das Vorliegen sexuell übertragener Low-Risk-HPV
getestet, ist die Verwendung des hc2 HPV-DNA-Tests erforderlich, mit dem Low- und High-RiskHPV-DNA-Typen nachgewiesen werden können.
LEISTUNGSMERKMALE
KLINISCHE LEISTUNG BEIM SCREENING VON PATIENTINNEN MIT NORMALEN PAPABSTRICHERGEBNISSEN ALS EIN HILFSMITTEL BEI DER RISIKOBEURTEILUNG FÜR DAS
PATIENTENMANAGEMENT
Nachstehend werden die Ergebnisse von acht unabhängigen klinischen Studien beschrieben, die von
namhaften medizinischen, akademischen und Regierungseinrichtungen in Zentren in den USA und
anderen Ländern durchgeführt wurden. In diese Studien wurden etablierte Pap-Methoden einbezogen,
die in den Ländern Verwendung finden, in denen die Studie durchgeführt wurde. In allen bis auf zwei
Fälle wurden zur Interpretation der Pap-Ergebnisse das Bethesda Grading-System verwendet. Die für
das Screening auf ein Zervixkarzinom entsprechende Terminologie in der Europäischen Union ist in den
42
European Guidelines for Quality Assurance in Cervical Cancer Screening [Europäische Leitlinien für
Qualitätssicherung beim Screening auf ein Zervixkarzinom] einzusehen. Außerdem wurde für jede Studie
mittels Einsatz der Kolposkopie geführten Biopsie High-Grade-Zervixerkrankungen diagnostiziert. Anhand
dieser Studien wurde die klinische Brauchbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests im Vergleich zum
Pap-Abstrich für ältere Frauen (im Allgemeinen im Alter über 30-35 Jahren) beurteilt. Außer in einer
Studie führten alle auch prospektiven HPV-Tests unter Verwendung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests
durch.
Bei den Studien handelte es um Screening-Studien an einem Querschnitt der Allgemeinbevölkerung
unter Verwendung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests sofern nachstehend nicht anderweitig angegeben
wird. Wie bereits zuvor angeführt, wurden 2 der 8 Screening-Studien in den USA, 2 in Europa, 2 in
Lateinamerika, 1 in Afrika und 1 in Asien durchgeführt.
Die Leistung des anhand der sechs Querschnittsstudien beobachteten hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests
wird in Tabellen 3 und 4 für Frauen im Alter von 30 Jahren und älter, die mit einer histologisch bestätigten
High-Grade-Zervixneoplasie (definiert als CIN3 oder schwerwiegender) diagnostiziert wurden,
zusammengefasst.
29
Tabelle 3
Bestimmungen der Leistung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests –
Empfindlichkeit und Spezifität
Population
n
Empfindlichkeit (%)
PAP allein
HPV allein
Spezifität y(%)
HPV + PAP
PAP allein
51,6
96,3
100
98,5
(14/27)
(26/27)
(27/27)
(7453/7565)
95 % KI
32,0-71,3
81,0-99,9
87,2-100
98,2- 98,8
58,4
94,8
97,4
98,7
Lateinamerika 1
(45/77)
(73/77)
6115
(75/77)
(5962/6038)
95 % KI
46,68-69,6
87.2-98.6
90,9-99,7
98,4-99,0
77,9
89,7
94,1
94,1
Lateinamerika 2†
(53/68)
(61/68)
6176
(64/68)
(5745/6108)
95 % KI
66,2-87.1
79,9-95,8
85,6-98,4
93,4-94,6
84.1
89.7
92,5
86,4
Afrika
(90/107)
(96/107)
(99/107)
(2436/2818)
2925
95 % KI
75,8-90,5
82,4-94,8
85,8-96,7
85,1-87,7
97,6
100
100
76,3
1936
Asien
(41/42)
(42/42)
(42/42)
(1445/1894)
95 % KI
87,4-99,9
91,6-100,0
91,6-100,0
74,3-78,2
50.0
100
100
97,6
1040
USA 1
(1/2)
(2/2)
(2/2)
(1013/1038)
95 % KI
1,26-98,7
15,8-100,0
15,8-100,0
96,5-98,4
hc2-Daten, sofern verfügbar, andernfalls Verwendung von HCS-Daten; kombinierte Daten.
Westeuropa 1
7592
HPV allein
HPV + PAP
96,2
(7275/7565)
95,7-96,6
93,9
(5669/6038)
93,3-94,5
94,0
(5742/6108)
93,4-94,6
80,0
(2253/2818)
78,4-81,4
83,0
(1572/1894)
81,2-85,0
96,2
(999/1038)
94,9-97,3
95,1
(7193/7565)
94,6-95,6
93,4
(5637/6038)
92,7-94,0
89,9
(5490/6108)
89,1-90,6
76,4
(2152/2818)
74,8-77,9
68,0
(1287/1894)
65,8-70,1
95,5
(991/1038)
94,0-96,7
Tabelle 4
Bestimmungen der Leistung des hc2 High-isk-HPV-DNA-Tests –
positiver und negativer Vorhersagewert
Population
n
Prävalenz (%)
Positiver Vorhersagewert (%)
PAP allein
HPV allein
HPV + PAP
CIN 3
0,36
11,1
8,23
6,77
West7592
(27/399)
(27/7592)
(14/126)
(26/316)
europa 1
95 % KI
0,23-0,52
6,21-17,9
5,45-11,8
4,51-9,69
1,26
37,2
16,5
15,8
Latein6115
(75/476)
(77/6115)
(45/121)
(73/442)
amerika 1
95 % KI
0,99-1,57
28,6-46,4
13,2-20,3
12,6-19,4
1,10
12,7
14,3
9,4
Latein(64/682)
6176
(68/6176)
(53/416)
(61/427)
amerika 2†
95 % KI
0,86-1,39
9,69-16,3
11,1-18,0
7,30-11,8
3,66
19,1
14,5
12,9
2925
(99/765)
(107/2925)
(90/472)
(96/661)
Afrika
95 % KI
3,01-4,40
15,6-22,9
11,9-17,4
10,6-15,5
2,17
8,37
11,5
6,47
1936
(42/649)
(42/1936)
(41/490)
(42/364)
Asien
95 % KI
1,57-2,92
6,07-11,2
8,44-15,3
4,70-8,65
0,19
3,85
4,88
4,08
1040
(2/49)
(2/1040)
(1/26)
(2/41)
USA 1
95 %KI
0,02-0,69
0,10-19,6
0,60-16,5
0,50-14,0
hc2-Daten, sofern verfügbar, andernfalls Verwendung von HCS-Daten; kombinierte Daten.
Negativer Vorhersagewert (%)
PAP allein
99,83
(7453/7466)
99,70-99,91
99,47
(5962/5994)
99,25-99,63
99,74
(5745/5760)
99,57-99,85
99,31
(2436/2453)
98,89-99,60
99,93
(1445/1446)
99,62-100,0
99,90
(1013/1014)
99,45-100,0
HPV allein
99,99
(7275/7276)
99,92-100,0
99,93
(5669/5673)
99,82-99,98
99,88
(5742/5749)
99,75-99,95
99,51
(2253/2264)
99,13-99,76
100,0
(1572/1572)
99,77-100,0
100.0
(999/999)
99,63-100,0
HPV + PAP
100,0
(7193/7193)
99,95-100,0
99,96
(5637/5639)
99,87-100,0
99,93
(5490/5494)
99,81-99.,98
99,63
(2152/2160)
99,27-99,84
100,0
(1287/1287)
99,71-100,0
100,0
(991/991)
99,63-100,0
In allen Studien fand sich eine gleichmäßige und häufig sehr signifikante Verbesserung der
Empfindlichkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests im Vergleich zum Pap allein. Wie bereits bei der
Empfindlichkeit festgestellt, übertrifft auch der negative Vorhersagewert (NPW) von HPV in allen Fällen
den von Pap allein, und nähert sich 100 %. Dieser NPW weist mit hoher Wahrscheinlichkeit die
Abwesenheit einer High-Grade-Zervixerkrankung oder eines -karzinoms bei zytologisch normalen Frauen
nach, die an keiner HPV-Infektion leiden.
Obwohl die Spezifität des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests niedriger als für den Pap allein war, hat die
Wahrscheinlichkeitsverhältnisanalyse nachgewiesen, dass die beobachtete Spezifizitätsabnahme nicht
signifikant genug ist, um sich auf die klinische Brauchbarkeit des Tests bei der Identifikation von Frauen
auszuwirken, die ein geringes oder kein Risiko für die Entwicklung einer Zervixerkrankung aufweisen.
Dennoch ist es wichtig, dass die Entscheidung zur Überweisung einer Patientin zur Kolposkopie auf allen
klinischen und Risikoinformationen und der dem Arzt verfügbaren Anamnese der jeweiligen Patientin
basiert. Zu wichtigen Variablen zählen anamnestisch eine HPV-Infektion und/oder abnorme Pap30
Abstriche, das Alter beim ersten Koitus, die Anzahl der Geschlechtspartner und gleichzeitig vorliegende
27,28
sexuell übertragene Krankheiten.
Obwohl die Prävalenz einer High-Grade-Erkrankung nicht signifikant unter den einer Leistungsermittlung
unterzogenen Studien variiert, kann sich die Prävalenz einer HPV-Infektion in einer Population auf die
Leistung auswirken und variiert typischerweise mit der Patientenpopulation. Außerdem wurde gezeigt,
28-37
Positive
dass die Prävalenz einer HPV-Infektion mit zunehmendem Alter sehr stark abnimmt.
Vorhersagewerte nehmen beim Testen von Populationen mit einer geringen Prävalenz oder bei
individuellen Patientinnen mit einem geringen Infektionsrisiko ab.
Longitudinalanalysen wurden unter Verwendung der Ergebnisse aus zwei Studien, einer in den USA von
dem National Cancer Institute (NCI) in Portland, Oregon und der anderen in Frankreich, im Laboratoire
Pol Bouin C.H.U. de Reims durchgeführten, angestellt. Diese Longitudinalanalysen sollten dem Nachweis
dienen, dass Pap-negative/HPV-negative Patientinnen im Vergleich zu den herkömmlich als Low-Risk
definierten Frauen, deren HPV-Status unbekannt ist und verglichen mit Pap-negativen/HPV-positiven
Patientinnen ein geringeres Risiko für eine Zervixerkrankung aufweisen. Die Ergebnisse dieser
Longitudinaldatenanalysen sind Tabellen 5 und 6 nachstehend zu entnehmen.
Tabelle 5
Zusammenfassung der Ergebnisse: NCI- und in Frankreich durchgeführte Studien –
relatives Risiko für eine High-Grade-Erkrankung
Alter
Low-RiskKlassifikation
n
CIN 3+ Fälle
Pap normal, HPV
negativ
Konsekutive normale
Paps*
Pap normal, HPV
negativ
Konsekutive normale
Paps*
Pap normal, HPV
negativ
Konsekutive normale
Paps**
Pap normal, HPV
negativ
Konsekutive normale
Paps**
12 054
28
Rate (pro 100
Patientenjahre)
0,043
9 429
19
0,048
17 594
48
0,056
13 392
44
0,082
1 690
3
0,084
2 026
4
0,099
2 180
3
0,066
2 650
7
0,136
Studiengruppe
30 Jahre und
älter
NCI
Alle
30 Jahre und
älter
Frankreich
Alle
Relatives
Risiko
(95 %-KI)
0,897
(0,596; 1,348)
1,000
0,678
(0,514; 0,894)
1 000
0,849
(0,307; 2,35)
1,000
0,491
(0,221; 1,09)
1,000
*Drei normale Paps über ca. 2 Jahre
**Zwei normale Paps über ca. 2 Jahre
Tabelle 6
Zusammenfassung der Ergebnisse: NCI- und in Frankreich durchgeführte Studien –
durch den HPV-Status zur Baseline stratifizierte Erkrankungsraten
Alter
Baseline-Status
n
CIN 3+ Fälle
Rate (pro 100
Patientenjahre)
Pap normal,
HPV positiv
Pap normal,
HPV negativ
Pap normal,
HPV positiv
Pap normal,
HPV negativ
Pap normal,
HPV positiv
Pap normal,
HPV negativ
Pap normal,
HPV positiv
Pap normal,
HPV negativ
1 078
24
0,451
12 054
28
0,043
2 561
63
0,096
17 594
48
0,056
419
14
2,346
1 696
3
0,084
619
22
2,520
2 180
3
0,066
Studiengruppe
30 Jahre und
älter
NCI
Alle
30 Jahre und
älter
Frankreich
Alle
31
Relatives
Risiko
(95 %-KI)
10,50
(6,13; 18,0)
1,00
10,64
(7,33 – 15,5)
1,00
27,3
(8,41; 88,3)
1,00
37,0
(11,8; 116)
1,00
Die klinische Brauchbarkeit des HPV-Testergebnisses wird weiter durch das erhöhte Risiko für eine
Zervixerkrankung bei HPV-positiven Frauen im Vergleich zu HPV-negativen Frauen nachgewiesen.
KLINISCHE LEISTUNG BEIM SCREENING VON PATIENTINNEN MIT ASC-US PAPABSTRICHERGEBNISSEN ZUR ERMITTLUNG DER NOTWENDIGKEIT EINER ÜBERWEISUNG ZUR
KOLPOSKOPIE
In den USA wurde 1996 unter der Leitung des Kaiser Foundation Research Institute und der Kaiser
Permanente Medical Group eine Studie unter dem Titel „Utility of HPV DNA Testing for Triage of Women
with Borderline Pap Smears“ [Nützlichkeit des HPV-DNA-Testens für eine Triage von Frauen mit
Borderline-Pap-Abstrichen] durchgeführt. Bei Frauen, die verschiedene klinische Kaiser-Einrichtungen
aufsuchten, wurden Zervixproben für Routine-Pap-Abstriche und zum hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testen
entnommen. Die Bewertung der initialen Pap-Abstriche erfolgte nach der Bethesda-Klassifikation. Die für
das Screening auf ein Zervixkarzinom entsprechende Terminologie in der Europäischen Union ist in den
42
European Guidelines for Quality Assurance in Cervical Cancer Screening [Europäische Leitlinien für
Qualitätssicherung beim Screening auf ein Zervixkarzinom] einzusehen. Frauen (im Alter von 15 Jahren
oder älter) mit Pap-Abstrichergebnissen von ASC-US (atypical cells of undetermined significance;
atypischen Plattenepithelzellen unklarer Signifikanz) wurden zur Kolposkopie und Biopsie erneut
einbestellt. Kolposkopisch gewonnene histologische Proben wurden zur initialen Diagnosestellung von
Pathologen untersucht. Jede histologische Probe wurde auch von einem unabhängigen Pathologen
überprüft, und Diskrepanzen zwischen der initialen Überprüfung und der unabhängigen Überprüfung
wurden von einem dritten Pathologen schlüssig beurteilt.
hc2 HPV-DNA-Tests wurden an der initialen Probe durchgeführt, und es wurde nur die High-Risk-HPVSonde verwendet. Die HPV-DNA-Tests wurden mit einem Prototyp des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests
durchgeführt, der Sonden für 11 der 13 High-Risk-HPV-Typen, aber keine Sonden für die HPV-Typen 59
und 68 enthielt. Es ist nicht zu erwarten, dass dieser Unterschied zu signifikant unterschiedlichen
Leistungsprofilen der beiden Assays führt.
High-Risk-HPV-Testergebnisse und histologische Diagnosen standen von 885 Frauen mit ASC-US-PapAbstrichen zur Verfügung. Die Tests an den meisten Patientinnen wurden mit Proben durchgeführt, die
sowohl in STM als auch in PreservCyt Lösung (PC) überführt wurden. Aufgrund der Ähnlichkeiten
zwischen den Leistungsmerkmalen des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests für STM- und PC-Medien wird nur
die Assay-Leistung für die PreservCyt Lösung dargestellt.
Tabelle 7 zeigt, dass unter den Frauen, die aufgrund von ASC-US im Pap-Abstrich überwiesen wurden,
der negative Vorhersagewert des hc2 High-Risk-HPV DNA-Tests auf das Vorliegen von HSIL oder einer
fortgeschritteneren Erkrankung bei der Kolposkopie 99 % beträgt.
Tabelle 7
Vergleich des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests im Vergleich zu Konsens-Histologie
bei einer Population mit Überweisung nach einem ASC-US-Pap
Kaiser-Studie, Proben in PreservCyt Lösung
hc2 High-RiskHPV
HSIL oder fortgeschrittenere Erkrankung zum Zeitpunkt der Kolposkopie
+
Insgesamt
+
66
317
383
5
497
502
Insgesamt
71
814
885
Empfindlichkeit [TP/(TP+FN)] = 93,0 % (66/71)
95 % KI = 84,3 bis 97,7
Spezifität [TN/(TN+FP)] = 61,1 % (497/814)
95 % KI = 57,7 bis 64,4
Krankheitsprävalenz = 8,0 % (71/885)
Positiver Assay-Vorhersagewert = 17,2 % (66/383)
Negativer Assay-Vorhersagewert = 99,0 % (497/502)
32
Tabelle 8 zeigt theoretische positive und negative Vorhersagewerte basierend auf verschiedenen
Prävalenzen für initiale ASC-US, von denen ermittelt wurde, dass es sich basierend auf den hc2 HighRisk-HPV-Sondenergebnissen um HSIL oder eine fortgeschrittenere Erkrankung handelt.
Tabelle 8
Theoretischer positiver und negativer Vorhersagewert
hc2 High-Risk-HPV-Sonde
ASC-US Pap-Abstrichergebnisse
Theoretische
Prävalenz für HSIL
5
10
15
20
25
30
Initiales ASC-US-Pap-Abstrichergebnis
Positiver Assay-Vorhersagewert
Negativer Assay-Vorhersagewert
11,2
99,4
21,0
98,7
29,7
98,0
37,4
97,2
44,3
96,3
50,6
95,3
Tabelle 9 veranschaulicht die Variation zwischen den verschiedenen Altersgruppen in dieser Studie:
Tabelle 9
Kaiser-Studiendaten
hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testleistung im Vergleich zu Konsens-Histologie
Ergebnisse (HSIL)
Altersspezifische Merkmale
N
Krankheitsprävalenz (%)
Empfindlichkeit (%)
95%-Konfidenzintervall
Spezifität (%)
95%-Konfidenzintervall
Negativer Vorhersagewert (%)
Positiver Vorhersagewert (%)
Alter <30
287
12,2
100,00
(35/35)
90,0-100
31,4
(79/252)
25,7-37,5
100
(79/79)
16,83
(35/208)
Alter 30-39
233
11,2
88,46
(23/26)
69,9-97,6
66,2
(137/207)
59,3-72,6
97,86
(137/140)
24,73
(23/93)
Alter >39
365
2,7
80,00
(8/10)
44,4-97,5
79,15
(281/355)
74,6-83,3
99,29
(281/283)
9,76
(8/82)
KLINISCHE EMPFINDLICHKEIT UND SPEZIFITÄT FÜR DIE ERMITTLUNG DES RISIKOS FÜR EINE
HIGH-GRADE-ERKRANKUNG BEI FRAUEN MIT LSIL- ODER HSIL-PAP-ABSTRICHEN
Es wurde eine multizentrische klinische Studie unter Verwendung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests an
Proben durchgeführt, die in mehreren großen Kolposkopie-Kliniken (3 Zentren) an einem Krankenhaus
und medizinischen Zentren mit einer hohen Prävalenz zervikaler Erkrankungen und HPV im Westen und
Süden der USA entnommen wurden. Der HPV-Test wurde an 3 Studienzentren durchgeführt, die nicht an
die Kolposkopiekliniken, in denen die Proben entnommen wurden, angeschlossen waren. Die Population
für diese klinische Studie bestand aus Frauen mit entweder der LSIL- oder HSIL-Diagnose basierend auf
einem vor kurzem angefertigten Pap-Abstrich, die zur „Follow-up“-Kolposkopie überwiesen wurden. Bei
den 702 in die Studie aufgenommenen Patientinnen waren 327 Pap-Abstrichergebnisse
schwerwiegender als ASC-US, und die Patientinnen wurden angemessen informiert; 96 von diesen
wiesen einen Enderkrankungsstatus von HSIL oder schwerwiegender auf. Exfolierte Zervixzellproben
wurden entweder mit der QIAGEN Zervixbürste, die in STM gegeben wurde, oder mit einer besenartigen
Vorrichtung entnommen und in PreservCyt Lösung gespült. Die Proben wurden zum Zeitpunkt der
Kolposkopie entnommen und mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test untersucht und die Ergebnisse mit
dem für jede Patientin ermittelten Krankheitsstatus verglichen. Der Krankheitsstatus basierte auf den
Ergebnissen der histologischen Beurteilung. Wenn jedoch die Histologie negativ war oder bei
Abwesenheit eines histologischen Ergebnisses wurde der Krankheitsstatus mittels zytologischer
Untersuchung zum Zeitpunkt der Kolposkopie bestimmt (siehe Tabelle 10). Der hc2 High-Risk-HPV-DNATest wurde an 3 großen medizinischen Schwerpunktzentren, die nicht an die Zentren angeschlossen
waren, an denen die Proben anlässlich der Kolposkopie entnommen wurden, durchgeführt. Die
33
zytologischen Untersuchungen wurden in einem pathologischen Referenzlabor und die histologischen
Untersuchungen in den Einrichtungen, in denen die Kolposkopie stattfand, durchgeführt. Die
Testergebnisse wurden zur Beurteilung der Empfindlichkeit, der Spezifität des Tests sowie des negativen
und positiven Vorhersagewertes zum Nachweis einer High-Grade-Zervixneoplasie mit dem
Krankheitsstatus verglichen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den Leistungsmerkmalen zwischen
dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test für STM und PC-Medien wird nur die Assay-Leistung für PC
dargestellt.
Zwischen den Testergebnissen mit High-Risk-HPV-Sonden von Proben in STM und PreservCyt Lösung
wurde kein Unterschied festgestellt. Aus Tabelle 11 gehen die Ergebnisse bei Verwendung der hc2 HighRisk-HPV-Sonde in dieser Population hervor:
Tabelle 10
Algorithmus des Krankheitsstatus der Patientinnen
Zytologieergebnis
NEG
LSIL
HSIL
Karzinom
NEG
LSIL
LSIL
HSIL
Karzinom
NEG
LSIL
HSIL
HSIL
Karzinom
NEG
LSIL
HSIL
Karzinom
Karzinom
Histologieergebnis
NEG oder nicht
durchgeführt*
NEG
NEG
NEG
LSIL
Nicht durchgeführt*
LSIL
LSIL
LSIL
HSIL
HSIL
HSIL
Nicht durchgeführt*
HSIL
Karzinom
Karzinom
Karzinom
Nicht durchgeführt*
Karzinom
Krankheitsstatus
NEG
LSIL
HSIL
HSIL+
LSIL
LSIL
LSIL
LSIL
LSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL+
HSIL+
HSIL+
HSIL+
HSIL+
*Eine Biopsie und/oder endozervikale Kürettage (ECC) wurde nicht
durchgeführt, weil bei der Kolposkopie keine Auffälligkeiten festgestellt
wurden oder histologische Ergebnisse nicht zur Verfügung standen.
Tabellen 11 und 12 stellen die Leistung des an 327 PC-Proben bestimmten hc2 HPV-DNA-Tests dar, von
denen 96 Proben bei Frauen durchgeführt wurden, die mit einer High-Grade-Zervixerkrankung
diagnostiziert wurden. Die Vergleiche wurden an allen an der Studie teilnehmenden Patientinnen, die
nach abnormen Pap-Abstrichergebnissen überwiesen wurden, vorgenommen. Vergleiche für die mit der
High-Risk-Sonde getesteten PC-Proben sind dargestellt.
Aus Tabelle 12 geht hervor, dass der HPV-DNA-Test bei Verwendung der High-Risk-HPV-Sonde eine
Gesamtempfindlichkeit von ca. 93 % bei der Identifikation von Frauen mit einer High-Grade-Neoplasie in
einer Population aufwies, die auf der Basis einer LSIL-, HSIL- oder ähnlichen Diagnose anhand des PapAbstriches zur Kolposkopie überwiesen wurde. Es wurde außerdem nachgewiesen, dass dieser Test
auch einen negativen Vorhersagewert von nahezu 95 % bei dieser Population besaß.
34
Tabelle 11
Ergebnisse mit der hc2 High Risk-HPV-Sonde
Endgültiger Krankheitsstatus
Überweisung aufgrund
der Pap-AbstrichErgebnisse
High-Risk-HPVErgebnisse
LSIL
HSIL
Insgesamt
HSIL
LSIL
POS
NEG
44
45
89
4
3
7
POS
NEG
78
33
29
14
107
47
154
96
Negativ
POS
NEG
28
5
33
37
7
44
Insgesamt
224
103
327
77
Tabelle 12
Leistungsmerkmale
hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test bei Patientinnen, die mit einem
Pap-Abstrich mit LSIL oder fortgeschrittenerer Erkrankung und einem Enderkrankungsstatus von
HSIL überwiesen wurden
High-RiskHPVSondenErgebnis
Überweisung nach Pap mit LSIL oder HSIL → HSIL-Erkrankung
+
Insgesamt
89
140
+
229
7
91
98
Insgesamt
96
231
327
Empfindlichkeit [TP/(TP+FN)] = 92,7 % (89/96)
95 % KI = 85,6 bis 97,0
Spezifität [TN/(TN+FP)] = 39,4 % (91/231)
95 % KI = 33,1 bis 46,0
Krankheitsprävalenz von LSIL bei Überweisung bis zur endgültigen HSIL = 21,4 %
Krankheitsprävalenz von HSIL bei Überweisung bis zur endgültigen HSIL = 46,6 %
Positiver Gesamt-Vorhersagewert = 38,9 % (89/229)
Negativer Gesamt-Vorhersagewert = 92,8 % (91/98)
Obwohl die Spezifität des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests etwas niedrig zu sein schien, wird eine strikte
Korrelation zwischen der Abwesenheit einer Neoplasie und einem negativen HPV-Ergebnis nicht
erwartet. HPV-DNA kann bei Frauen vorliegen, bei denen sich keine Erkrankung eines höheren Grades
entwickelt hat. Wenn faktisch ein HPV-Polymerase Chain Reaction (PCR)-Test (ein nur zu
Forschungszwecken verwendeter Assay) an Proben mit positiven hc2 High-Risk-HPV-DNATestergebnissen durchgeführt wurde und deren entsprechender Krankheitsstatus geringer als eine LowGrade-Neoplasie war, waren fast 75 % positiv.
Aus Tabelle 13 gehen mit der theoretischen High-Risk-HPV-Sonde positive und negative
Vorhersagewerte für eine initiale LSIL oder HSIL hervor, von denen bei der Kolposkopie gefunden wurde,
dass es sich um eine HSIL oder schwerwiegendere Erkrankung handelte.
35
Tabelle 13
Theoretischer positiver und negativer Vorhersagewert
High-Risk-HPV-Sonde
Initiale LSIL- oder HSIL-Pap-Abstrichergebnisse
Theoretische Prävalenz für HSIL
Initiales LSIL- oder HSIL-Pap-Abstrichergebnis
Positiver Assay-Vorhersagewert
Negativer Assay-Vorhersagewert
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
7,4
14,5
21,2
27,6
33,7
39,6
45,1
50,4
55,5
60,4
99,0
97,9
96,8
95,5
94,1
92,6
90,9
89,0
86,8
84,3
ANALYTISCHE EMPFINDLICHKEIT
Ein nicht klinisches Panel klonierter HPV-Plasmid-DNA wurde zur Ermittlung, ob jeder der 13 HPV-Typen
mittels des hc2 HPV-DNA-Tests nachweisbar ist, sowie zur Ermittlung der analytischen Empfindlichkeit
des Assays für jeden der HPV-Typen getestet. Jede HPV-Zielkonzentration (100 pg/ml, 10 pg/ml,
2,5 pg/ml, 1 pg/ml, 0,5 pg/ml und 0,2 pg/ml) von jedem der 13 HPV-DNA-Typen (16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58, 59 and 68) wurde in Dreifachbestimmung getestet. Das mittlere Signal (in relativen
Lumineszenzeinheiten, RLU) für jede Konzentration von jedem HPV-Typ wurde berechnet und mit dem
positiven High-Risk-Calibrator verglichen.
Die Nachweisgrenze für jeden HPV-Typ in STM geht aus Tabelle 14 hervor. Die Nachweisgrenzen
variierten abhängig von dem getesteten HPV-Typ von 0,62 pg/ml bis 1,39 pg/ml. Die mittlere
Nachweisgrenze von allen 13 HPV-DNA-Typen betrug 1,08 pg/ml mit einer Standardabweichung von
0,05.
Table 14
Zusammenfassung der Nachweisgrenzen der Empfindlichkeit
für jeden HPV-DNA-Typ in STM im hc2 HPV-DNA-Test
HPV-DNATyp
Nachweisbare HPVDNA-Konzentration
Standardabweichung
(pg/ml)
16
18
31
33
35
39
45
51
52
56
58
59
68
Mittelwert (alle
Typen)
1,09
1,05
1,01
1,35
1,11
1,39
1,14
0,78
1,37
0,62
0,82
1,10
1,19
1,08
0,06
0,05
0,05
0,02
0,05
0,09
0,04
0,10
0,06
0,04
0,04
0,06
0,04
0,05
95 %Konfidenzbereich
0,94-1,29
0,88-1,29
0,91-1,15
1,26-1,45
0,95-1,31
1,16-1,71
0,99-1,35
0,70-0,88
1,21-1,58
0,58-0,67
0,73-0,94
1,00-1,21
1,03-1,39
0,95-1,25
ÄQUIVALENZ ZWISCHEN DEN PROBEN IN SPECIMEN TRANSPORT MEDIUM (STM) UND DEN
PROBEN IN PRESERVCYT (PC) LÖSUNG
Die Äquivalenz zwischen Proben in STM und PreservCyt Lösung wurde auf eine gleiche Wiederfindung
6
von HPV-18-DNA aus ca. 10 positiven HeLa-Zellen mit integrierten HPV-18-Genomen, die in STM und in
einem Pool negativer Zellen in PreservCyt Lösung gespickt waren, untersucht. Jeder Probentyp wurde
36
nach den in dieser Packungsbeilage beschriebenen Verarbeitungs-/Denaturierungsverfahren verarbeitet
und mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test mittels der High-Risk-HPV-Sonde getestet. Aus den
Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Wiederfindung der HPV-18-DNA aus humanen Karzinomzellen für
die beiden Medien äquivalent ist und dass sich das Vorbereitungsverfahren der PreservCyt Lösung nicht
auf die analytische Empfindlichkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests auswirkt.
KORRELATION ZWISCHEN SUREPATH-PROBENERGEBNIS UND QIAGEN STM PROBEN IN EINER
KLINISCHEN POPULATION
In den USA wurde eine zweiphasige Bewertung anhand von 6 Laborzentren und 3 Test-Sites
durchgeführt. Patienten von Abteilungen für sexuell übertragbare Krankheiten, Gynekologie,
Kolposkopie, eines Krankenhauses oder einer Familienplanungsstelle waren für die Teilnahme nach
vorbestimmten Ein- und Ausschlusskriterien qualifiziert. An der Feasibility-Phase, während der ein
passender hc2 High-Risk HPV DNA Assay-Cutoff für die Verwendung mit SurePath-Proben bestimmt
werden sollte, waren ca. 400 Patienten beteiligt. Die klinische Evaluierungssphase zur Bewertung des
gewählten Assay-Cutoff-Wertes, an der ca. 1500 Patienten beteiligt waren, begann, nachdem eine
Feasability-Interimanalyse gezeigt hatte, dass ein Assay-Cutoff-Wert von 1,0 RLU/CO unter Verwendung
von SurePath Proben, eine akzeptable Übereinstimmung mit den Probeergebnissen von QIAGEN’s STM
ergab.
Für beide Evaluierungsphasen wurden gepaarte SurePath und STM-Zervixproben von allen
einwilligenden Patientinnen genommen. Anschließend wurde die SurePath Probe zur Aufbereitung an
ein zytologisches Labor geschickt. Nach der zytologischen Präparation wurden die übrigen SurePathProben und die entsprechenden STM-Proben mit dem hc2 High-Risk HPV DNA-Test ahand eines AssayCutoffs von 1,0 RLU/CO getestet.
In Tabelle 15 wird die Korrelation zwischen den SurePath-Ergebnissen und den gepaarten STM-Proben,
dargestellt, die sich aus dem für die Datenanalyse zulässigen Endergebnis aller Teilnehmerinnen ergab.
Tabelle 15
SurePath Ergebnisübereinstimmung mit QIAGEN’s STM
(alle Altersgruppen und zytologischen Klassifikationen)
(n = 1490)
Positive Übereinstimmung %
Negative Übereinstimmung %
95% CI
95% CI
(n/N)
(n/N)
Niedrig Negativ
Hoch positiv
Alle Negativ
Untergruppe
Alle Positiv
Untergruppe
(RLU/CO ≥ 2,5)
RLU/CO (<0,80)
93,5
96,4
95,3
96,0
90,7, 95,6
94,1, 98,0
93,8, 96,5
94,6, 97,1
(401/429)
(378/392)
(1011/1061)
(1002/1044)
Diese Ergebnisse zeigen, dass die relative Assay-Sensitivität und Spezifizität unter Verwendung von
SurePath-Proben eine hohe Korrelation mit dem durch die STM-Proben erzielten Ergebnis aufweist,
nachgewiesen durch den unteren Wert des Konfidenzintervalls von 95% für die positive und negative
Übereinstimmung.
REPRODUZIERBARKEIT
Es wurde eine multizentrische Reproduzierbarkeitsstudie bezüglich unterschiedlicher Tage und Orte und
der Gesamtreproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests mittels eines Panels von HPV-DNATargets und HPV-positiven und HPV-negativen in STM entnommenen klinischen Proben durchgeführt.
Drei externe Laboratorien führten die Tests mit der gleichen Charge der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testkits
an 3 verschiedenen Tagen mit einem identischen Reproduzierbarkeitspanel durch. Das
Reproduzierbarkeitspanel schloss folgende Proben ein: 12 denaturierte klinische STM-Proben-Pools; 3
nicht denaturierte klinische Proben-Pools in PreservCyt Lösung; einen Negativkalibrator und einen
positiven High-Risk-HPV-Calibrator, bei Konzentrationen von 1 pg/ml, 0,5 pg/ml, 2,5 pg/ml, 5 pg/ml und
37
10 pg/ml. Alle Panelproben wurden täglich in Dreifachbestimmung sowohl mit der High-Risk-HPV-Sonde
als auch den CPC-Verfahren getestet. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 16 hervor.
Tabelle 16
Zusammenfassung der Statistik insgesamt für die
multizentrische Reproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPVDNA-Tests
Statistische Erhebung
Anteil von erwarteten positiven
Ergebnissen mit einem
beobachteten positiven Ergebnis
Anteil von erwarteten negativen
Ergebnissen mit einem
beobachteten negativen Ergebnis
High-Risk-HPV-Sonde
100 %
(99,0-100,0)*
99,0 %
(97,49-99,73)*
Übereinstimmung
99,5%
(98,70-99,86)*
Kappa
0,990
*Die Zahlenangaben in Klammern zeigen die 95 %Konfidenzintervalle an. Die Gesamtdaten sind eine Kombination
aller Durchläufe an allen Orten.
Hieraus geht hervor, dass die Reproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests mit in STM
entnommenen klinischen Proben sehr gut ist.
38
KREUZREAKTIVITÄT
KREUZREAKTIVITÄTSPANEL
Eine Reihe von Bakterien, Viren und Plasmiden, die häufig im weiblichen Anogenitaltrakt vorkommen,
sowie eine Sammlung kutaneotropher HPV-Typen, für die Klone zur Verfügung standen, wurden getestet,
um festzustellen, ob eine Kreuzreaktivität mit den im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test verwendeten HPV5
7
Sonden auftritt. Alle Mikroorganismen wurden bei Konzentrationen von 1 x 10 und 1 x 10 Organismen
pro ml getestet. Gereinigte DNAs von Viren und Plasmiden wurden bei einer Konzentration von 4 ng/ml
untersucht.
Nachstehend folgt eine Liste der getesteten Bakterien. Alle Bakterien waren im hc2 High-Risk-HPV-DNATest negativ.
Acinetobacter anitratus
Acinetobacter lwoffi (ATCC 17908)
Bacteroides fragilis (ATCC 25285)
Bacteroides melaninogenicus
Candida albicans (ATCC 14053 or 10231)
Chlamydia trachomatis
Enterobacter cloacae
Escherichia coli (HB101)*
Escherichia coli
Fusobacterium nucleatum
Gardnerella vaginalis
Haemophilus ducreyi
Klebsiella pneumoniae
Lactobacillus acidophilus
Mobiluncus curtisii
Mobiluncus mulieris
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinis
Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424)
Neisseria lactamica (NRL 2118)
Neisseria meningitidis (ATCC 13077)
Neisseria sicca (ATCC 29256)
Peptostreptococcus anaerobius
Proteus vulgaris (ATCC 21117, 8427, 33420)
Serratia marcescens
Staphylococcus aureus (Cowan-Stamm)
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus faecalis (ATCC 14508)
Streptococcus pyogenes (ATCC27762)
Treponema pallidum
Trichomonas vaginalis
Ureaplasma urealyticum
* Sowohl der zum Wachsen von Plasmiden (HB101) verwendete E. coli-Stamm als auch ein klinisches
Isolat von E. coli wurden untersucht.
Nachstehend findet sich eine Liste der getesteten Virus- oder Plasmid-DNA oder des Humanserums:
Adenovirus 2
Cytomegalovirus
Epstein-Barr-Virus
Hepatitis-B-Surface-Antigen-positives Serum
Herpes simplex I
Herpes simplex II
Human Immunodeficiency Virus (HIV, RT-DNA)
Simian-Virus-Typ 40 (SV40)
Humanes Papillomavirus Typ 1
Humanes Papillomavirus Typ 2
Humanes Papillomavirus Typ 3
Humanes Papillomavirus Typ 4
Humanes Papillomavirus Typ 5
Humanes Papillomavirus Typ 8
Humanes Papillomavirus Typ 13
Humanes Papillomavirus Typ 30
pBR322
Bei dem einzigen Plasmid, das im hc2 High-Risk-HPV- DNA-Test Kreuzreaktivität aufwies, handelte es
sich um pBR322. Eine Kreuzreaktivität zwischen pBR322 und der hc2 High-Risk-HPV-Testsonde ist nicht
unerwartet, weil die Entfernung der gesamten Vektor-pBR322-DNA bei der Isolation des HPV-Inserts
schwierig ist. Das Vorliegen homologer Sequenzen von pBR322 in Proben aus dem menschlichen
Genitale wurde berichtet, und falsch-positive Ergebnisse könnten bei Vorliegen hoher bakterieller
Plasmid-Konzentrationen auftreten. Von den 298 klinischen Proben, die im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test
positiv waren, ließen jedoch keine auf positive Ergebnisse schließen, die – wenn mit einer pBR322Sonde getestet – auf pBR322 zurückzuführen waren. Folglich scheint die Wahrscheinlichkeit, im
hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test aufgrund homologer pBR322-Sequenzen in klinischen Proben falschpositive Ergebnisse zu erhalten, gering zu sein.
39
KREUZHYBRIDISIERUNG
Mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test wurden 18 verschiedene HPV-Typen (High- und Low-Risk) bei
Konzentrationen von 4 ng/ml HPV-DNA getestet. Alle High-Risk-HPV-Targets waren mit der High-RiskHPV-Sonde positiv. Aus dieser Studie ging auch hervor, dass im geringem Ausmaß eine
Kreuzhybridisierung zwischen HPV-Typen 6 and 42 und der High-Risk-HPV-Sonde auftrat.
Patientenproben mit hohen HPV-6- oder HPV-42-DNA-Spiegeln (4ng/ml oder höher) können mit dem hc2
High-Risk-HPV-DNA-Test falsch-positiv sein. Die klinische Signifikanz besteht darin, dass Patientinnen
mit 4 ng/ml oder mehr HPV-6- oder HPV-42-DNA unnötigerweise zur Kolposkopie überwiesen werden
könnten.
Es wurde auch gezeigt, dass der hc2-High-Risk-HPV-DNA-Test mit den HPV-Typen 40, 53 und 66
kreuzreagiert. Diese Typen sind selten, und es liegen nicht genügend Hinweise zur Ermittlung der
genauen Korrelation zwischen der Infektion mit diesen Typen und der Entstehung einer High-Grade38
Erkrankung vor . In der Literatur wurde zudem auch berichtet, dass komplexe Sonden, ähnlich den in
diesem Test verwendeten, aufgrund der Kreuzhybridisierung mit HPV-Typen 11, 53, 54, 55, 66, MM4,
39
MM7, MM8 oder MM9 zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnten. Obwohl mehrere dieser HPVTypen selten sind oder neuen Typen bei der High-Grade-Erkrankung häufig nicht begegnet wird, könnten
Patientinnen, in deren Proben nachweislich hohe Konzentrationen dieser HPV-DNA-Typen vorliegen,
unnötigerweise zur Kolposkopie überwiesen werden.
EFFEKT VON BLUT UND ANDEREN SUBSTANZEN AUF STM-PROBEN
Der Effekt von Blut und anderen potenziell störenden definierten und nicht definierten Substanzen wurde
im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test bewertet. Vollblut, Duschbad, antifungale Creme und
empfängnisverhütendes Gel (Mittel, die häufig in Zervixproben gefunden werden können) wurden den
STM-negativen und -positiven Proben (Pools klinischer Proben und nicht klinischer Proben) in
Konzentrationen zugefügt, die in Zervixproben gefunden werden können. Es wurden mit keinem der vier
Mittel bei keiner der Konzentrationen falsch-positive Ergebnisse beobachtet. Ein falsch-negatives
Ergebnis kann jedoch in klinischen Proben mit HPV-DNA-Konzentrationen dicht an denen des positiven
Grenzwerts für den Assay (1 pg/ml) gefunden werden, wenn hohe Konzentrationen einer antifungalen
Creme oder eines empfängnisverhütenden Gels vorlagen. Es ist jedoch sehr unwahrscheinlich, dass eine
klinische Probe fast vollständig aus einer dieser Substanzen besteht, weil die Zervix vor Entnahme von
Proben für den Pap-Abstrich und zum HPV-Testen routinemäßig gereinigt wird.
EFFEKT VON BLUT UND ANDEREN SUBSTANZEN AUF PROBEN IN PRESERVCYT LÖSUNG
Der Effekt von Blut und anderen potenziell störenden definierten oder nicht definierten Substanzen, die in
klinischen Proben in PreservCyt Lösung potenziell vorliegen können, wurde im hc2 High-Risk-HPV-DNATest bewertet. Vollblut, Duschbad, antifungale Creme und empfängnisverhütende Gele (Mittel, die in
Zervixproben häufig anzutreffen sind) wurden den Pools negativer und positiver klinischer Proben in
PreservCyt Lösung in Konzentrationen, die in der Zervixprobe gefunden werden können, zugefügt. Mit
keinem der vier Mittel und bei keiner der Konzentrationen wurden falsch-positive oder falsch-negative
Ergebnisse beobachtet. In einigen klinischen Proben inhärent vorkommende Substanzen inhibieren
ferner nicht den Nachweis der HPV-DNA im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test.
REPRODUZIERBARKEIT DES hc2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS MIT IN STM GEGEBENEN
KLINISCHEN PROBEN
Die Reproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests mit in STM gegebenen klinischen Proben
wurde in einer Studie unter Verwendung von 20 klinischen Pools (10 positiven und 10 negativen), die
durch Kombination zuvor denaturierter und getesteter in STM gegebener Bürsten-Zervixproben
vorbereitet wurden, bestimmt. Die Proben wurden in 4 Wiederholungsbestimmungen an jedem von
5 Tagen für insgesamt 20 Wiederholungsbestimmungen pro Probe getestet. Das Testen wurde unter
Verwendung eines Kombinationssonden-Cocktails durchgeführt, der aus der hc2 High-Risk-HPV-DNATestsonde und den Sonden des Low-Risk-HPV-Typs bestand. Mittelwerte, Standardabweichung und
95 %-Konfidenzintervalle um den Mittelwert (KI) wurden für jede Probe innerhalb eines Tages und über
5 Tage getestet und gehen aus Tabelle 17 hervor. Es wird nicht erwartet, dass die Reproduzierbarkeit
40
des Assays anders wäre, wenn nur die in diesem Kit enthaltende Sonde des High-Risk-HPV-Typs
verwendet wird.
Tabelle 17
Mittlere RLU/CO mit Konfidenzintervallen und prozentualen Anteilen positiver Proben
(absteigende Reihenfolge des mittleren RLU/CO)
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Probe
ID
10
20
11
12
15
13
16
17
14
18
19
7
4
9
1
2
8
3
6
5
Mittlere
RLU/CO
3,18
1,43
1,25
1,21
1,20
1,07
1,06
1,04
0,98
0,92
0,72
0,40
0,38
0,37
0,35
0,35
0,32
0,30
0,27
0,26
KI
3,02-3,35
1,36-1,50
1,20-1,28
1,15-1,27
1,14-1,25
1,01-1.,11
1,01-1,09
1,00-1,06
0,92-1,02
0,87-0,96
0,68-0,75
0,33-0,46
0,35-0,39
0,32-0,41
0,32-0,36
0,31-0,37
0,29-0,34
0,27-0,31
0,24-0,30
0,23-0,28
Positiv (%)
100 (20/20)
100 (20/20)
100 (20/20)
100 (20/20)
100 (20/20)
80 (16/20)
75 (15/20)
80 (16/20)
45 (9/20)
20 (4/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
Für die 5 Proben mit einem mittleren RLU/CO bei 20 % oder mehr über dem Grenzwert (Nr. 1-5), waren
100 von 100 Wiederholungsbestimmungen (100,0 %) positiv. Für die 5 Proben mit einem mittleren
RLU/CO innerhalb von 20 % über oder unter dem Grenzwert des Assays (Nr. 6-10) waren 60 von 100 der
Wiederholungsbestimmungen positiv, und 40 von 100 (40 %) waren negativ. Für die 10 Proben mit einer
mittleren RLU/CO bei mehr als 20 % unter dem Grenzwert des Assays waren 200 von 200
Wiederholungsbestimmungen (100 %) negativ.
Folglich waren Proben mit einer mittleren RLU/CO von 20 % oder mehr über dem Grenzwert die gesamte
Zeit über 100 % positiv, während Proben mit einer mittleren RLU/CO von 20 % oder mehr unter dem
Grenzwert die gesamte Zeit über 100 % negativ waren, was darauf hindeutet, dass von Proben, die 20 %
oder mehr vom Grenzwert entfernt liegen, erwartet werden kann, dass sie konsistente Ergebnisse
ergeben. Dicht am Grenzwert befindliche Proben ergaben annähernd die gleiche Anzahl positiver und
negativer Ergebnisse. Diese Daten deuten darauf hin, dass STM-Proben mit dem hc2 High-Risk-HPVDNA-Test reproduzierbare Resultate ergeben.
REPRODUZIERBARKET DES hc2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS MIT IN PRESERVCYT LÖSUNG
GEGEBENEN KLINISCHEN PROBEN
Die Reproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests mit in PreservCyt Lösung gegebenen
klinischen Proben wurden in einer Studie mit 24 Blindproben bei verschiedenen HPV-DNAKonzentrationen bestimmt. Die Proben bestanden aus PreservCyt Lösung und Leukozyten mit und ohne
HPV-16-Plasmid enthaltenden Bakterien.
Die Proben wurden in Wiederholungsbestimmungen von 4 an jedem von 5 Tagen für insgesamt
20 Wiederholungsbestimmungen pro Probe bestimmt. An jedem der 5 Tage der Studie wurde von jeder
Probe ein 8-ml-Aliquot verarbeitet und nach den in der Packungsbeilage enthaltenen Anweisungen für
das hc2-Probenkonversionskit getestet. Mittelwerte, Standardabweichungen und 95 %Konfidenzintervalle (KI) wurden für jede Probe innerhalb eines jeden Tages und über alle 5 Tage und
Wiederholungsbestimmungen berechnet. Die mittlere RLU/CO, das Konfidenzintervall um den Mittelwert
41
und der Prozentsatz positiver Wiederholungsbestimmungen gehen für jede Probe, in absteigender
Reihenfolge, basierend auf der mittleren RLU/CO, aus Tabelle 18 hervor.
Tabelle 18
Mittlere RLU/CO mit Konfidenzintervallen und prozentualen Anteilen positiver Proben
(absteigende Reihenfolge der mittleren RLU/CO)
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Probe
Nr.
21
12
13
17
18
15
23
16
20
19
22
11
14
24
3
1
7
2
5
4
9
8
10
6
Mittlere
RLU/CO
3,51
1,58
1,42
1,38
1,36
1,32
1,17
1,14
1,10
1,06
1,05
1,04
0,94
0,77
0,28
0,27
0,27
0,27
0,26
0,24
0,23
0,22
0,22
0,19
KI
3,19-3,83
1,48-1,69
1,32-1,52
1,23-1,53
1,23-1,48
1,16-1,49
1,06-1,27
1,07-1,20
0,96-1.,21
0,95-1,17
0,99-1,10
0,96-1,11
0,86-1,01
0,73-0,81
0,25-0,30
0,24-0,30
0,25-0,30
0,25-0,28
0,24-0,28
0,22-0,25
0,21-0,25
0,18-0,27
0,20-0,25
0,17-0,21
Positiv (%)
100 (20/20)
100 (20/20)
100 (20/20)
90 (18/20)
95 (19/20)
85 (17/20)
75 (15/20)
75 (15/20)
85 (17/20)
45 (9/19)
70 (14/20)
65 (13/20)
25 (5/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
Für die 6 Proben mit einer mittleren RLU/CO bei 20 % oder mehr über dem Grenzwert (Nr. 1-6), waren
114 von 120 Wiederholungsbestimmungen (95,0 %) positiv. Für die 7 Proben mit einer mittleren RLU/CO
innerhalb von 20 % über oder unter dem Assay-Grenzwert (Nr. 7-13), waren 88 von 139 (63,3 %) der
Wiederholungsbestimmungen positiv und 51 von 139 (36,7 %) waren negativ. Für die 4 Proben in den
10 % über oder unter dem Grenzwert (Nr. 10-13) waren 41 der 79 (51,9 %) der
Wiederholungsbestimmungen positiv und 38 (48,1 %) waren negativ. Für die 11 Proben mit der mittleren
RLU/CO bei mehr als 20 % unter dem Assay-Grenzwert waren 220 von 220
Wiederholungsbestimmungen (100 %) negativ.
Folglich waren Proben mit einer mittleren RLU/CO von 20 % oder mehr über dem Grenzwert mehr als
95 % der Zeit positiv, während Proben mit einer mittleren RLU/CO von 20 % oder mehr unter dem
Grenzwert 100 % der Zeit negativ waren, was erkennen lässt, dass von Proben, die 20 % oder mehr vom
Grenzwert entfernt liegen, erwartet werden kann, dass sie konsistente Ergebnisse ergeben. Proben dicht
am Grenzwert ergaben annähernd die gleiche Anzahl positiver und negativer Ergebnisse. Diese Daten
weisen darauf hin, dass Proben in PreservCyt Lösung im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test reproduzierbare
Ergebnisse ergeben.
REPRODUZIERBARKEIT EINES HC2 HIGH-RISK HPV DNA-TESTS MIT PROBEN IN SUREPATH
KONSERVIERUNGSFLÜSSIGKEIT
Es wurden Reproduzierbarkeitsbewertungen durchgeführt, um die Eignung von 3 Labors zu beschreiben,
ein ähnliches diagnostisches Ergebnis an verschiedenen Tagen und verschiedenen Durchläufen mit einer
identischen Gruppe von Proben mit bekanntem Positiv-/Negativ-HPV-Status unter Verwendung eines
Assay-Cutoff-Werts von 1,0 RLU/CO zu erzielen.
42
Panel-Proben wurden präpariert, indem eindeutige SurePath-Patientenproben mit einem bekannten
negativen und positiven HPV-Status kombiniert wurden, um die gewünschten RLU/CO-Zielwerte zu
erreichen. Alle Panel-Proben wurden in doppelter Ausfertigung, zweimal am Tag und 5 Tage lang in
jedem der drei beteiligten Labors getestet.
Tabelle 19
Reproduzierbarkeitsstudie SurePath-Proben
Qualitative Ergebnisse nach Panel-Proben
PanelProben
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Mittlere
RLU/CO
0,20
0,21
0,22
0,28
0,36
0,83
1,17
19,47
25,65
81,52
154,18
765,29
Erwartetes
Ergebnis
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
positiv
positiv
positiv
positiv
positiv
positiv
HPV-positiv
n (%)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
2 (3,3)
2 (3,3)
13 (21,7)
26 (43,3)
60 (100)
60 (100)
60 (100)
60 (100)
60 (100)
HPV-negativ
n (%)
60 (100)
60 (100)
60 (100)
58 (96,7)
58 (96,7)
47 (78,3)
34 (56,7)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
REPRODUZIERBARKEIT DER SUREPATH-ERGEBNISSE UNTER VERWENDUNG DES HALBAUTOMATISCHEN QIAGEN RAPID CAPTURE SYSTEM FOR ASSAY PROCESSING
Die Reproduzierbarkeit der SurePath Probenergebnisse unter Verwendung des Rapid Capture System
zur Assay-Behandlung wurden mit den Ergbnissen der manuellen Behandlung von Assays verglichen.
Es wurden zwei vergleichende Tests an separaten Aliquoten der gleichen behandelten Proben
durchgeführt.
Tabelle 20
Innerhalb der Proben SurePath Ergbnisübereinstimmung mit RCS
(RCS im Vergleich zu manuellem Assay)
Positive Übereinstimmung %
95% CI
(n/N)
Hoch positiv
Alle positiv
Untergruppe
(RLU/CO ≥ 2,5)
99,0
100
417/421
375/375
97,6, 99,7
99,0, 100
Negative Übereinstimmung %
95% CI
(n/N)
Niedrig Negativ
Alle negativ
Untergruppe
RLU/CO (<0,80)
97,7
98,7
1057/1079
1050/1064
96,9, 98,7
97,8, 99,28
43
GRENZEN DES VERFAHRENS
In-vitro-Diagnostikum
Weitere Grenzen des Verfahrens, die für Tests mit großen Probendurchsätzen typisch sind, sind
dem Benutzer-Anwendungshandbuch zum Rapid Capture System zu entnehmen.
•
Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test auf das humane Papillomavirus, Typen 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68 wird nicht zur Bewertung bei Verdacht auf sexuellen
Missbrauch empfohlen.
•
Die Prävalenz einer HPV-Infektion in einer Population kann sich auf die Leistung auswirken.
Positive Vorhersagewerte nehmen beim Testen von Populationen mit einer niedrigen
Prävalenz oder einzelnen Patientinnen mit keinem Infektionsrisiko ab.
•
Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit einer HPV-Infektion nicht aus, weil sehr
geringe Konzentrationen oder ein Probenentnahmefehler zu einem falsch-negativen Ergebnis
führen können. Dieser Test weist überdies nicht die HPV-DNA der Low-Risk-Typen (6, 11,
42, 43 und 44) nach.
•
Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test kann nur mit Zervixproben, die mit dem DNAPap oder
dem HC Cervical Sampler entnommen oder Biopsien, die in Specimen Transport Medium
gegeben wurden oder Zervixproben, die mit einer Entnahmevorrichtung des Besentyps oder
einer Bürsten-/Spatelkombination entnommen und in PreservCyt-Lösung oder SurePath
Preservative Fluid gegeben wurden, verwendet werden. Biopsieproben können nur bestimmt
werden, wenn sie sofort in Specimen Transport Medium gegeben und bis zur Bestimmung
bei -20 °C gelagert werden.
•
Der DNAPap und der HC Cervical Sampler sollten nicht zur Probenentnahme bei
schwangeren Frauen verwendet werden.
•
Eine Infektion mit HPV ist weder ein definitiver Indikator des Vorliegens einer High-GradeZervixerkrankung, noch impliziert sie in allen Fällen, dass sich eine High-Grade-Erkrankung
oder ein Karzinom entwickeln wird.
•
Eine geringfügige Kreuzhybridisierung zwischen HPV-Typen 6, 11, 40, 42, 53, 54, 55, 66,
MM4, MM7, MM8, und MM9, und der High Risk-HPV-Sonde ist zu beobachten. Patientinnen
mit Proben, die hohe Konzentrationen dieser HPV-Typen enthalten, könnten gegebenenfalls
38-39
.
unnötigerweise zur Kolposkopie überwiesen werden
•
Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test ist zum Nachweis von High-Risk-HPV-Typen,
einschließlich 39, 58, 59 und 68 ausgelegt. Von QIAGEN durchgeführte analytische Studien
unter Verwendung klonierter HPV-Plasmid-DNA weisen darauf hin, dass diese Typen bei
Konzentrationen im Bereich von 0,62 pg/ml bis 1,39 pg/ml mit diesem Assay nachgewiesen
werden können. Dies entspricht den Nachweischarakteristika der anderen HPV-Typen, auf
die der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test gerichtet war. QIAGEN konnte den Nachweis dieser
HPV-Typen nur an einer begrenzten Anzahl klinischer Proben validieren. Aufgrund der
geringen Prävalenz dieser Typen in der Allgemeinbevölkerung (wie aus Bosch et. al.35
hervorgeht) wurden die Leistungsmerkmale des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests zum
Nachweis der HPV-Typen 39, 58, 59 und 68 nicht statistisch bestätigt.
•
Wenn hohe Konzentrationen an antifungaler Creme, empfängnisverhütendem Gel oder
Duschbad zum Zeitpunkt der Probenentnahme zum HPV-Test vorhanden waren, ist die
Erzielung eines falsch-negativen Ergebnisses wahrscheinlich, wenn diese Proben HPV-DNAKonzentrationen enthalten, die RLU/Grenzwert Quotienten in der Nähe des AssayGrenzwertes ergeben.
•
Kreuzreaktivität zwischen der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testsonde und dem Plasmid pBR322
ist möglich. Das Vorliegen homologer Sequenzen von pBR322 in Proben vom humanen
Genitale wurde berichtet, und bei Vorliegen hoher bakterieller Plasmidkonzentrationen
könnten falsch-positive Ergebnisse auftreten.
44
LITERATUR
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47
hc2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TEST LEITFADEN ZUR FEHLERSUCHE
Beobachtung
Mögliche Ursachen
Lösungen
Beobachtung eines
falschen oder keines
Farbumschlags
während der
Denaturierung.
Das Denaturierungsreagenz wurde nicht
vorschriftsmäßig vorbereitet
oder
Verifizieren, dass das Denaturierungsreagenz den Indikator-Farbstoff
enthält und eine dunkel-purpurrote Farbe aufweist.
das Denaturierungsreagenz wurde nicht
zugefügt
Verifizieren, dass das Denaturierungsreagenz der Probe mittels
Abmessen des Probenvolumens (erwartet werden 1,5 ml) zugefügt
wurde. Wenn anhand des Volumens ersichtlich ist, dass das
Denaturierungsreagenz nicht zugefügt wurde, den entsprechenden
Zusatz vornehmen, mischen und mit dem Assay fortfahren, wenn der
richtige Farbumschlag beobachtet wurde.
Proben enthalten Blut oder anderes Material,
das den Farbumschlag maskiert.
Mit diesen Probentypen wird der beschriebene genaue Farbumschlag
nicht erwartet; die hc2 HPV-DNA-Testergebnisse sollten nicht nachteilig
beeinflusst werden.
Der pH der Probe könnte ungewöhnlich sauer
sein.
Die
Qualitätskontrollen
ergeben falsche
Ergebnisse.
Beobachtung eines
falschen
Farbumschlags
während der
Hybridisierung.
Wahl des für den Test inkorrekten SoftwareProtokolls.
Wenn keine der anderen Ursachen zutreffen, könnten die Proben
gegebenenfalls ungewöhnlich sauer sein, und der erwartete Farbumschlag
tritt nicht auf. Vor Applikation von Essigsäure auf die Zervix eine neue
Probe entnehmen, da sich ein falscher pH der Proben nachteilig auf die
Testergebnisse auswirkt.
Wenn das Software-Protokoll für den durchzuführenden Test inkorrekt
ist, sollte die Platte innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe von
Nachweisreagenz 2 mit dem korrekten Protokoll erneut gemessen
werden.
Umgekehrte Platzierung von QC1-LR und
QC2-HR.
Proben erneut testen.
Umgekehrte Platzierung von HRC und QC2HR
Unzureichendes Mischen der
Sondenmischung mit denaturierter Kontrolle,
Kalibratoren und/oder Proben; oder die
Sondenmischung wurde nicht zugefügt, oder
ein falsches Reagenzvolumen wurde
zugefügt.
Proben erneut testen
Die Probe enthält Blut oder anderes Material,
das den Farbumschlag maskiert.
Die Probe enthielt <1000 µl STM.
Das Gestell mit der Mikrotiterplatte oder dem Mikroröhrchen zur
Hybridisierung weitere 2 Minuten schütteln. Wenn Röhrchen oder
Vertiefungen vorhanden sind, die weiterhin purpurrot bleiben, sollten
zusätzliche 25 µl der entsprechenden Sondenmischung zugefügt und gut
gemischt werden. Wenn nach Zugabe der Sondenmischung und
erneutem Mischen die vorschriftsmäßige Farbänderung nicht auftritt und
die Probe kein Blut oder andere Materialien enthielt, die Probe erneut
testen.
Mit diesen Probentypen wird der beschriebene genaue Farbumschlag
nicht erwartet; die hc2 HPV-DNA-Testergebnisse sollten nicht nachteilig
beeinflusst werden.
Das Volumen der Originalprobe prüfen. Das Volumen sollte 1425 µl ±20 µl
(nach Entfernung von 75 µl Aliquot zum Testen) betragen. Wenn das
Volumen <1425 µl liegt, enthielt die Originalprobe < 1000 µl STM. Eine
neue Probe entnehmen.
48
Beobachtung
Mögliche Ursachen
Lösungen
Der Assay entspricht
nicht den
Validationskriterien.
Es wurde kein Signal
in den positiven
Kalibratoren, in den
Qualitätskontrollen
oder in den Proben
beobachtet.
Dem Sondenverdünnungsmittel wurde keine
Sonde zugefügt.
Die Sondenmischung wie in der Packungsbeilage beschrieben
vorbereiten. Die Röhrchen sorgfältig beschriften.
Kontamination der Sonde mit RNase während
der Vorbereitung.
Beim Pipettieren der Sonde Filterspitzen verwenden und Handschuhe
tragen. Die Sonde in einem sterilen Behälter verdünnen. Nur saubere,
neue Einweg-Reagenzbehälter verwenden.
Unzureichendes Mischen von Sonde und
Sondenverdünnungsmittel.
Nachdem die Sonde dem Sondenverdünnungsmittel zugefügt wurde,
5 Sekunden durch Vortexen bei hoher Geschwindigkeit sehr gründlich
mischen. Es muss ein sichtbarer Wirbel gebildet werden.
Unzureichendes Mischen von verdünnter
Sonde und denaturierter Probe.
Nach Zufügen der Sondenmischung und der Probe zu jeder
Hybridisierungsmikrotiterplatten-Vertiefung oder jedem
Hybridisierungsmikroröhrchen auf dem Kreisschüttler I, eingestellt auf
3 ±2 Minuten bei 1100 ±100 U/min, schütteln. Prüfen, dass in jedem
Röhrchen ein Farbumschlag von purpurrot nach gelb auftritt.
Inkorrekte Zeit oder Temperatur während des
Hybridisierungsschrittes.
60 ±5 Minuten bei 65 ±2 °C hybridisieren. Die Temperatur des
Mikrotiterplatteninkubators I oder des Wasserbades prüfen. Darauf
achten, dass der Mikrotiterplatteninkubator I zum Erhitzen der Proben auf
die korrekte Temperatur eingestellt ist und vor Gebrauch 60 Minuten
vorgewärmt wurde. Sicherstellen, dass der Wasserspiegel zum Erhitzen
der Proben auf die korrekte Temperatur ausreichend ist. Die
Wasserbäder sollten periodisch kalibriert werden.
Unzureichendes Mischen während des
Capture-Schrittes.
Auf dem Kreisschüttler I 60 ±5 Minuten bei 20 - 25 °C wie in der
Packungsbeilage beschrieben schütteln. Die Geschwindigkeit des
Kreisschüttlers I mittels Kalibration verifizieren.
Die korrekte Menge des Nachweisreagenzes 1 wurde nicht zugefügt, oder es
wurde nicht für die vorgeschriebene Zeit
inkubiert.
75 µl Nachweisreagenz 1 mit einem 8-Kanal-Dispenser in jede Vertiefung
pipettieren. 30 - 45 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren.
Die richtige Menge des Nachweisreagenzes
2 wurde nicht zugefügt, oder es wurde nicht
für die vorgeschriebene Zeit inkubiert.
75 µl Nachweisreagenz 2 mit einem 8-Kanal-Dispenser in jede Vertiefung
pipettieren. 15 bis 30 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren.
Funktionsstörung des Luminometers oder
inkorrektes Programmieren.
Weitere Informationen zum DML 2000-Instrument und der Software,
Version 2, sind in der Gebrauchsanweisung (Abschnitt Wartung und
Fehlersuche), im interaktiven Bedienerhandbuch für die Digene Hybrid
Capture System, Version 2 (DHCS V.2) Software oder in der
Gebrauchsanweisung für die Digene Qualitative Software einzusehen;
oder setzen Sie sich mit Ihrem lokalen QIAGEN-Vertreter in Verbindung.
49
Beobachtung
Mögliche Ursachen
Lösungen
Erhöhte RLU-Werte
in den Kalibratoren,
Qualitätskontrollen
und/oder in den
Proben (≥200 RLU in
vielen oder allen
Vertiefungen). Der
Assay entspricht
nicht den
Validationskriterien.
Es wurde kein Denaturierungsreagenz
zugefügt; oder es wurde das inkorrekte
Reagenzvolumen zugefügt; oder das
Denaturierungsreagenz wurde unzureichend
mit den Proben und Kalibratoren gemischt.
Vor Zufügen des Denaturierungsreagenzes verifizieren, dass der
Direktverdrängungssystem-Dispenser genaue Mengen abgibt. Kalibrierte
Dispenser sind unerlässlich. Jedem Röhrchen die Hälfte des
Denaturierungsreagenzvolumens zufügen und gut mischen. Zur
Vermeidung falsch-positiver Ergebnisse darauf achten, dass die
Flüssigkeit die gesamte Innenfläche des Röhrchens benetzt.
Kalibratoren, Kontrollen und Proben sollten nach Zufügen des
Denaturierungsreagenzes nach purpurrot umschlagen.
Lichtaustritt in dem Luminometer.
Tür nicht abgedichtet.
Die Abdichtung um die Tür ist zerbrochen.
Die Hintergrundablesung des Luminometers durch Ablesen einer leeren
Mikrotiterplatte prüfen. Eine höhere Ablesung als 50 RLU deutet darauf
hin, dass eine leichte Leckstelle vorliegt. Für weitere Anweisungen die
Gebrauchsanweisung für das DML 2000-Instrument und die Software,
Version 2, das interaktive Bedienerhandbuch für die Digene Hybrid
Capture System Version 2 (DHCS V.") Software oder die
Gebrauchsanweisung für die Digene Qualitative Software (Abschnitt
Wartung und Fehlersuche) einsehen; oder setzen Sie sich mit Ihrem
lokalen QIAGEN-Vertreter in Verbindung.
Kontamination des Nachweisreagenzes 2 oder
der Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen
durch Nachweisreagenz 1 oder exogene
alkalische Phosphatase.
Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche.
Kontaminierter Waschpuffer.
Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche.
Kontaminierter automatischer Plattenspüler I.
Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche.
Unzureichendes Spülen der CaptureMikrovertiefungen nach der Inkubation mit
dem Nachweisreagenz 1.
Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen 6 Mal gründlich mit Waschpuffer spülen,
indem die Vertiefungen jedes Mal bis zum Überfließen gefüllt werden.
Siehe die Bedienungs- und Wartungsanweisungen für den automatischen
Plattenspülapparat I für Anleitungen zum Testen auf Kontamination oder
Funktionsstörungen.
Kontamination der MikrotiterplattenVertiefungen mit Nachweisreagenz 1.
Darauf achten, dass alle Arbeitsflächen sauber und trocken sind. Bei der
Verwendung von Nachweisreagenz 1 vorsichtig sein. Aerosole sind zu
vermeiden.
50
Beobachtung
Niedrige PK/NCQuotienten oder eine
hohe Anzahl an
gering positiven
Proben mit
Quotienten <2,0
(>20 %). Der Assay
entspricht nicht den
Validationskriterien .
Mögliche Ursachen
Lösungen
Abtropfen der Hybridisierungslösung auf
der gleichen Stelle der KimtowelsWischtücher oder entsprechenden
fusselfreien Papiertüchern.
Nicht zwei Mal an derselben Stelle des Kimtowels-Wischtuches
oder des entsprechenden fusselfreien Papiertuches abtupfen.
Verwendung falscher Saugtücher.
Unzureichende Probenvorbereitung.
Unzureichendes Mischen der Sondemischung
oder den Assays wurde ungenügend
Sondemischung zugefügt.
Jedem Hybridisierungsmikroröhrchen wurde
ein unzureichendes Volumen verdünnter
Sonde zugefügt.
Zum Abtupfen Kimtowels-Wischtücher oder geeignete
fusselfreie Papiertücher verwenden
Das entsprechende Denaturierungsreagenz-Volumen zufügen und
mittels Vortexen gründlich mischen. Zum Vermeiden falsch-positiver
Ergebnisse darauf achten, dass die Flüssigkeit sowohl mit dem
manuellen als auch dem MST-Vortexer I-Verfahren (für das manuelle
Vortexverfahren das Röhrchen einmal invertieren) die gesamte
Innenfläche des Röhrchens benetzt. Es sollte ein distinkter
Farbumschlag von klar nach purpurrot auftreten. 45 ±5 Minuten bei
65 ±2 °C inkubieren.
Die Sondenmischungen, wie beschrieben, vorbereiten. Durch Vortexen
gründlich mischen, darauf achten, dass ein sichtbarer Wirbel produziert
wird. Die Sondenmischung ist den Röhrchen zur Gewährleistung einer
genauen Abgabe mit einem Direktverdrängungssystem-Dispenser
zuzufügen.
Vor dem Zufügen der Sondenmischung zur
Hybridisierungsmikrotiterplatte oder zu den
Hybridisierungsmikroröhrchen verifizieren, dass der 8-Kanal-Dispenser
die genauen Mengen abgibt. Jeder Mikrotiterplatten-Vertiefung bzw.
jedem Mikroröhrchen mit denaturiertem Kalibrator, Qualitätskontrollen
und klinischen Proben 25 µl zufügen. Vor Zufügen der Sondenmischung
zu den Hybridisierungs-Mikrotiterplatten-Vertiefungen verifizieren, dass
der 8-Kanal-Dispenser die genaue Menge abgibt. Nach dem Zufügen
und gründlichen Mischen der Sondenmischung sollte ein Farbumschlag
von dunkel-purpurrot nach gelb auftreten. Proben in PreservCyt-Lösung
sollten anstelle von gelb nach rosa umschlagen.
Nachweisreagenz 1 bei 2 - 8 °C lagern. Vor dem auf dem Etikett auf dem
äußeren Behältnis des Kits angegebenen Verfallsdatum verwenden.
Verlust der Aktivität des
Nachweisreagenzes 1.
Unzureichendes Capture.
Der Capture-Schritt sollte unter Verwendung eines bei 1100 ±100 U/min
eingestellten Kreisschüttlers I durchgeführt werden. Die
Schüttlergeschwindigkeit durch Kalibration validieren.
Unzureichendes Spülen.
Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen 6 Mal gründlich mit Waschpuffer spülen,
die Vertiefungen jedes Mal bis zum Überfließen füllen oder den
automatischen Plattenspüler I verwenden.
Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche.
Reihe positiver
Proben mit
annähernd den
gleichen RLUWerten.
Kontaminierter Waschpuffer.
Kontamination von Capture-MikrotiterplattenVertiefungen während der AssayManipulation.
Kontamination des Nachweisreagenzes 2.
Die Capture-Mikrotiterplatte während aller Inkubationen abdecken.
Während der Durchführung des Assays dürfen die Röhrchen keinem
Aerosol ausgesetzt werden. Während der Manipulationen ungepuderte
Handschuhe tragen.
Darauf achten, dass die Stammlösung beim Pipettieren des
Nachweisreagenzes 2 in die Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen nicht
kontaminiert wird. Eine Kontamination des Nachweisreagenzes 2 durch
Aerosole aus dem Nachweisreagenz 1 oder aus dem Laboratoriumsstaub
Funktionsstörung des automatischen
Plattenspülers I.
usw. ist zu vermeiden.
Anleitungen zum Testen auf Kontamination oder Funktionsstörungen sind
dem Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche oder der
Bedienungs- und Wartungsanweisung für den automatischen
Plattenspülapparat I zu entnehmen.
51
Beobachtung
Mögliche Ursachen
Lösungen
Breiter VK(%)
zwischen den
Wiederholungsbestimmungen.
Ungenaues Pipettieren.
Den Dispenser überprüfen, um zu gewährleisten, dass reproduzierbare
Volumina abgegeben werden. Die Dispenser routinemäßig kalibrieren.
Unzureichendes Mischen.
Bei allen Schritten gründlich mischen. Vor und nach der
Denaturierungsinkubation und nach Zugabe der Sondenmischung
vortexen. Darauf achten, dass ein sichtbarer Wirbel gebildet wird.
Unvollständige Überführung von Flüssigkeit
aus den Hybridisierungsmikroröhrchen in die
Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen.
Während des Überführungsschrittes aus der
Hybridisierungsmikrotiterplatte oder den Hybridisierungsmikroröhrchen in
die Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen vorsichtig vorgehen, um zu
gewährleisten, dass reproduzierbare Volumina überführt werden.
Unzureichende Spülbedingungen.
Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit Waschpuffer 6 Mal gründlich spülen,
jedes Mal bis zum Überfließen füllen oder den automatischen
Plattenspülapparat I und die relevanten Protokolle für den automatischen
Plattenspülapparat I befolgen.
Kontamination der MikrotiterplattenVertiefungen mit Nachweisreagenz 1.
Sicherstellen, dass alle Arbeitsflächen sauber und trocken sind. Bei der
Verwendung des Nachweisreagenzes 1 vorsichtig vorgehen. Aerosole
vermeiden.
Zur Verhinderung einer Kreuzkontamination der Proben beim
Aliquotieren des Nachweisreagenzes 2 zwischen den Proben mit
Vorsicht vorgehen. Wird nur ein Teil eines Kits verwendet, ist das für
diesen Assay benötigte Volumen vor Befüllen des Dispensers in einen
sauberen Einweg-Reagenzbehälter zu aliquotieren.
Falsch-positive
Ergebnisse aus
bekannten negativen
Proben.
Erhöhte
NegativkalibratorRLU-Werte
(>200 RLU). Die
Leistung des
übrigen Assays ist
wie erwartet.
Kontamination von Nachweisreagenz 2.
Kontamination der MikrotiterplattenVertiefungen mit Nachweisreagenz 1.
Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit Waschpuffer 6 Mal gründlich
spülen, jedes Mal bis zum Überfließen füllen oder den automatischen
Plattenspüler I verwenden. Nach dem Spülen sollte in den
Mikrotiterplatten-Vertiefungen keine restliche rosa Flüssigkeit
zurückbleiben.
Abtupfen im gleichen Bereich der KimtowelsWischtücher oder entsprechenden fusselfreien
Papiertücher über mehrere Reihen.
Nicht auf einem Bereich abtupfen, der bereits zuvor verwendet wurde.
Unzureichende Probenvorbereitung.
Das entsprechende Volumen des Denaturierungsreagenzes zufügen und
mittels Vortexen gründlich mischen. Zur Verhinderung falsch-positiver
Ergebnisse darauf achten, dass Flüssigkeit die gesamte Innenfläche des
Röhrchens mit entweder dem manuellen Verfahren oder dem MST
Vortexer I-Verfahren (für das manuelle Vortexverfahren das Röhrchen
einmal invertieren) benetzt. Für Proben in PreservCyt Lösung ist auf
vorschriftsmäßiges Mischen zu achten sowie darauf, dass die
Resuspension des Zellpellets vor der Denaturierungsinkubation
abgeschlossen ist. Protokolldetails gehen aus der Packungsbeilage für
das hc2-Probenkonversionskit hervor. Es sollte ein distinkter
Farbumschlag nach dunkel-purpurrot auftreten. 45 ±5 Minuten bei
65 ±2° C inkubieren. SurePath-Proben müssen 90±5 Minuten bei 65 ±2°C
inkubiert werden
Unzureichende Spülbedingungen.
Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit Waschpuffer 6 Mal gründlich spülen,
indem die Mikrovertiefungen jedes Mal bis zum Überfließen gefüllt werden
oder der automatische Plattenspülapparat I verwendet und die
vorschriftsmäßigen Protokolle für den automatischen Plattenspülapparat I
befolgt werden.
Kontamination der Pipettenspitze mit nichtdenaturiertem Material während des Transfers
der denaturierten Probe in die Vertiefung der
Mikrotiterplatte, die zur HPVSondenhybridisierung benutzt wird.
Das Nachweisreagenz 2 wurde bei einer
höheren Temperatur als 20 - 25 °C inkubiert.
Der Denaturierungsschritt im Verfahren zur Probenbehandlung muss wie
in dieser Anleitung beschrieben durchgeführt werden. Unsachgemäßes
Vortexen der Proben oder Umdrehen und Schütteln der Röhrchen kann
zur unvollständigen Denaturierung unspezifischer RNA/DNA-Hybride in
den Zervixproben führen. Besonders bei der Verwendung von PreservCyt
Solution- oder SurePath Preservative Fluid-Proben ist das Vorkommen
dieser Hybride an den Innenwänden des Probenkonversionsröhrchens
wahrscheinlich. Um einen eventuellen Transfer dieses nicht-denaturierten
Zellmaterials zu vermeiden, darf die Pipettenspitze während des Transfers
der denaturierten Probe in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte zur HPVSondenhybridisierung die Wände nicht berühren.
Den Test wiederholen, und darauf achten, dass die Capture- und
Nachweisschritte bei 20 - 25 °C inkubiert werden.
Das Nachweisreagenz 2 wurde länger als
30 Minuten inkubiert.
Die Platten nach 15-minütiger Inkubation (und nicht später als
30 Minuten nach der Inkubation) bei 20 - 25 °C messen.
Das Nachweisreagenz 2 oder der
Waschpuffer wurde mit alkalischer
Phosphatase oder Nachweisreagenz 1
kontaminiert.
Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche
52
Beobachtung
Mögliche Ursachen
Lösungen
Der Assay entspricht
nicht den
Validationskriterien.
Erhöhter PC/NCQuotient.
Umgekehrte Platzierung von HRC und QC2HR
Proben erneut testen. Die Etiketten des Kalibrators und der
Qualitätskontrollsproben aufmerksam lesen, um zu vermeiden, dass diese
Reagenzien umgekehrt platziert werden.
KONTAMINATIONSTEST
Getestetes
Kontaminationstest-Verfahren
Interpretation der Ergebnisse
Reagenz
Hinweis: Beim Pipettieren von Nachweisreagenz 2 vorsichtig vorgehen, um Kontaminationen zu vermeiden. Handschuhe
tragen und Berührungen der Arbeitsoberfläche mit den Pipettenspitzen vermeiden.
Nachweis• Der Kontrollwert des
• 75 µl von Nachweisreagenz 2 aus dem angebrochenen
reagenz 2
Nachweisreagenz 2 muss unter 50
oder dem Originalfläschchen in eine leere Vertiefung
RLU liegen.
einer Capture-Mikrotiterplatte geben.
• Wenn die Werte des
• 15 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Direkte
Nachweisreagenz 2 unter 50 RLU
Sonneneinstrahlung vermeiden.
liegen, kann das Nachweisreagenz 2
• Die Mikrotiterplatte in das Luminometer einlesen.
benutzt werden, um den Test zu
wiederholen.
Hinweis: Der Test von Nachweisreagenz 2 in Replikaten
• Falls eine Kontamination vorliegt
von 3 erlaubt eine optimale Leistungsüberprüfung.
(oberhalb 50 RLU), einen neuen Kit
benutzen und den Test wiederholen.
Waschpuffersystem und/oder
Wasseranschluss
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Automatischer
Plattenspüler
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
75 µl des Nachweisreagenz 2 in 4 leere Vertiefungen
einer Capture-Mikrotiterplatte geben.
Die Vertiefungen mit 1-4 bezeichnen.
Vertiefung 1 dient als Kontrolle für das
Nachweisreagenz 2.
Aus dem Behälter für Waschflüssigkeit 10 µl des
Waschpuffers in Vertiefung 2 geben.
Waschpuffer durch die Schläuche der
Wascheinrichtung laufen lassen.
Aus den Schläuchen 10 µl des Waschpuffers in
Vertiefung 3 pipettieren.
Etwas von dem Wasser nehmen, das zur Herstellung
des Waschpuffers benutzt wird. Von dem Wasser 10 µl
in Vertiefung 4 pipettieren.
15 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Direkte
Sonneneinstrahlung vermeiden.
Die Mikrotiterplatte in das Luminometer einlesen.
•
75 µl des Nachweisreagenz 2 in 5 leere Vertiefungen
einer Capture-Mikrotiterplatte geben.
Die Vertiefungen mit 1-5 bezeichnen.
Vertiefung 1 dient als Kontrolle für das
Nachweisreagenz 2.
Aus dem mit Wash bezeichneten Behälter des
Plattenspülers 10 µl des Waschpuffers in Vertiefung 2
geben.
Aus dem mit Rinse bezeichneten Behälter des
Plattenspülers 10 µl Spülflüssigkeit in Vertiefung 3
geben.
Den Schalter „Prime“ auf der Tastatur des
Plattenspülers betätigen, damit Waschpuffer durch die
Leitungen fließen kann.
Aus dem Behälter 10 µl des Waschpuffers in Vertiefung
4 pipettieren.
Den Schalter „Rinse“ auf der Tastatur des
Plattenspülers betätigen, damit Spülflüssigkeit durch
die Leitungen fließen kann.
Aus dem Behälter 10 µl des Waschpuffers in Vertiefung
5 pipettieren.
Abdecken und 15 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren.
Direkte Sonneneinstrahlung vermeiden.
Die Mikrotiterplatte in das Luminometer einlesen.
•
53
•
•
•
•
•
Der Wert der Kontrolle des
Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1)
muss unter 50 RLU liegen.
Die RLU-Werte der Vertiefungen 2, 3
und 4 mit dem Wert der Kontrolle des
Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1)
vergleichen. Die RLU Werte der
Vertiefungen 2, 3 und 4 dürfen den
RLU Wert der Kontrolle des
Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1) um
nicht mehr als 50 RLU überschreiten.
Werte, die mehr als 50 RLU über dem
Wert der Kontrolle für das
Nachweisreagenz 2 liegen, sind ein
Zeichen für eine Kontamination.
Hinweise zur Reinigung und Pflege
des Plattenspülers finden sich im
Abschnitt „Vorbereitung und
Aufbewahrung der Reagenzien“.
Der Wert der Kontrolle des
Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1)
muss unter 50 RLU liegen.
Die RLU Werte der Vertiefungen 2, 3,
4 und 5 mit dem Wert der Kontrolle
des Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1)
vergleichen. Die RLU-Werte der
Vertiefungen 2, 3, 4 und 5 dürfen den
RLU Wert der Kontrolle des
Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1) um
nicht mehr als 50 RLU überschreiten.
Werte, die mehr als 50 RLU über dem
Wert der Kontrolle für das
Nachweisreagenz 2 liegen, sind ein
Zeichen für eine Kontamination des
Plattenspülers.
Siehe Bedienungsanleitung des
automatischen Plattenspülers, Kapitel
„Dekontamination“.
QIAGEN KONTAKTINFORMATIONEN
Benutzen Sie bitte das beigefügte Blatt mit Kontaktinformationen, um mit Ihrem zuständigen QIAGENVertreter in Verbindung zu treten.
Hybrid Capture, Digene und Rapid Capture sind eingetragene Warenzeichen der QIAGEN Gaithersburg, Inc.
DNAPap, Cervical Sampler, DML 2000, EXPAND-4, Female Swab Specimen Collection Kit, HC und Specimen
Transport Medium sind Warenzeichen der QIAGEN Gaithersburg, Inc.
Dieses Produkt und die zugehörigen Anwendungsverfahren sind von einem oder mehreren der folgenden Patente
abgedeckt:
U.S. HPV-Patente Nr.
4,849,331 ● 4,849,332 ● 4,849,334 ● 4,908,306 ● 5,411,857 ● 5,643,715 ● 5,712,092 ● 5,876,922 ● 5,952,487 ●
5,958,674 ● 5,981,173 ● 6,107,086
HPV-Patente (Ausland) Nr.
EP 294,659 ● JP 1047383 ● EP 0192001B1 ● EP 0591376B1 ● CA 1,339,729 ● EP 0370625B1 ● JP 3076578 ●
JP 02796332
US Hybrid Capture-Patente Nr.
4,732,847 ● 4,865,980 ● 6,228,578B1
Andere Patente
®
Das CDP-Star -Substrat durch ein oder mehrere der US-Patente Nr. 4,931,569 ● 4,978,614 ● 5,145,772 ●
5,326,882 ● 5,538,847 ● 5,582,980 ● 5,851,771 geschützt.
Anerkennungen eingetragener Warenzeichen:
CDP-Star: Tropix, Inc.
Kimtowels-Wischtücher: Kimberly-Clark Corporation
Eppendorf Repeater: Eppendorf-Netheler-Hinz
Parafilm: American Can Co.
DuraSeal: Diversified Biotech, Inc
ThinPrep und PreservCyt: Cytyc Corporation
Windows: Microsoft Corporation
TriPath Imaging und SurePath: TriPath Imaging, Inc., Burlington, North Carolina, USA
Anerkennungen von Warenzeichen:
Prepstain: TriPath Imaging, Inc., Burlington, North Carolina, USA
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Zusammenfassung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests
Wichtig: Vor Gebrauch dieser Zusammenfassung ist es wichtig, dass der Anwender mit den einzelnen Verfahrensschritten gründlich vertraut ist.
Verfahren
Manuelles Vortexverfahren
Multi-Specimen Tube (MST) Vortexer I-Verfahren
Hybridisierungsmikroröhrchen beschriften.
Denaturierungsreagenz vorbereiten.
È
Denaturierungsreagenz (Volumen entspricht der Hälfte des
Probenvolumens) in die Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben
pipettieren.
Jede Probe, jeder Kalibrator und jede Qualitätskontrolle 5 Sekunden bei
hoher Geschwindigkeit einzeln vortexen (nähere Einzelheiten siehe
Packungsbeilage).
Prüfen, dass alle Röhrchen eine purpurrote Farbe aufweisen.
È
45 ±5 Minuten bei 65 ±2 °C inkubieren.
È
HPV-Sondenmischung vorbereiten.
È
È
È
Die Hybridisierungsplatte beschriften.
Das Denaturierungsreagenz vorbereiten.
È
Denaturierungsreagenz (Volumen entspricht der Hälfte des
Probenvolumens) in die Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben
pipettieren.
Prüfen, dass alle Röhrchen eine purpurrote Farbe aufweisen.
È
Das Gestell mit Folie oder einem Verschlussdeckel abdecken.
È
10 Sekunden vortexen.
È
45 ±5 Minuten bei 65 ±2 °C inkubieren.
È
HPV-Sondenmischung vorbereiten.
È
Wasserbadverfahren
Mikroplatteninkubator I-Verfahren
Die denaturierte Probe gut mischen und 75 µl in Röhrchen pipettieren.
Die denaturierte Probe gut mischen und
75 µl in die Mikrotiterplatten-Vertiefungen pipettieren.
È
10 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren.
↓
10 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren.
↓
25 µl High-Risk-HPV-Sondenmischung in Röhrchen pipettieren.
↓
↓
25 µl High-Risk-HPV-Sondenmischung in MikrotiterplattenVertiefungen pipettieren.
↓
Die Mikroröhrchen mit einer Plattenabdeckung abdecken und
3 ±2 Minuten bei 1100 ±100 U/min auf einem Kreisschüttler I
schütteln.
Prüfen, dass alle Röhrchen eine gelbe Farbe aufweisen.
↓
60 ±5 Minuten bei 65 ±2° C inkubieren. Die Capture-Mikrotiterplatte
vorbereiten.
↓
Die Mikroröhrchen mit einer Plattenabdeckung abdecken und
3 ±2 Minuten bei 1100 ±100 U/min auf einem Kreisschüttler I
schütteln.
Prüfen, dass alle Röhrchen eine gelbe Farbe aufweisen.
↓
60 ±5 Minuten bei 65 ± 2 °C inkubieren. Die Capture-Mikrotiterplatte
vorbereiten.
↓
↓
Den Inhalt von jeder Hybridisierungsplattenvertiefung oder dem Mikroröhrchen mit einem 8-Kanal-Dispenser
in die entsprechende Vertiefung in der Capture-Mikrotiterplatte pipettieren.
Mit einem Plattendeckel oder einer Plattenabdeckung abdecken.
60 ±5 Minuten bei 20 - 25 °C bei 1100 ±100 U/min schütteln. Den Waschpuffer vorbereiten.
È
Dekantieren und die Capture-Mikrotiterplatte abtupfen (nähere Einzelheiten gehen aus der Packungsbeilage hervor).
È
75 µl Nachweisreagenz 1 in jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte pipettieren.
Die Capture-Mikrotiterplatte mit einem Plattendeckel, Parafilm oder entsprechendem Material abdecken.
30 - 45 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Platte mit Hilfe des gewünschten Verfahrens spülen.
È
Manuelles Spülverfahren
Verfahren mit dem automatischen Plattenspülapparat I
Dekantieren und die Capture-Mikrotiterplatte abtupfen
Die Platte auf den Spülapparat geben und zum Beginnen „START/STOP“
(nähere Einzelheiten gehen aus der Packungsbeilage hervor)
drücken.
È
È
6 Mal spülen.
Auf den nächsten Schritt übergehen.
È
È
È
Auf fusselfreien Papiertüchern abtupfen
È
È
In jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte 75 µl Nachweisreagenz 2 pipettieren.
15 - 30 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren.
È
Die Capture-Mikrotiterplatte am Luminometer messen.
È
Validation des Assays und Interpretation der Probenergebnisse.
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