Züchtung auf Virusresistenz in Wintergerste

Züchtung auf Virusresistenz in Wintergerste
Referent: Prof. Dr. Frank Ordon, Julius Kühn-Institut, Institut für Resistenzforschung und Stresstoleranz, Erwin-Baur-Str. 27, 06484 Quedlinburg
Tel.: 03946 / 47602, Fax.: 03946/ 47600, E-Mail: [email protected]
Einleitung
Die Wintergerste ist nach dem Winterweizen die in Deutschland bedeutendste Getreideart.
Neben Pilzkrankheiten führen Virosen zu erheblichen Ertragsverlusten im Wintergerstenanbau. In diesem Zusammenhang sind in Deutschland die durch verschiedene Stämme des
bodenbürtigen Barley yellow mosaic virus (BaYMV) und des Barley mild mosaic virus
(BaMMV) verursachte Gelbmosaikvirose der Gerste und die durch verschiedene Isolate des
blattlausübertragenen Barley yellow dwarf virus (BYDV) und Cereal yellow dwarf virus
(CYDV) verursachte Gelbverzwergung der Gerste zu nennen (vgl. Ordon et al. 2009). In einigen Regionen Deutschlands stellt des Weiteren das durch Zikaden übertragene Wheat
dwarf virus (WDV), welches ähnliche Symptome wie BYDV hervorruft, ein Problem im Gerstenanbau dar (Habekuß et al. 2009).
Aufgrund der vektoriellen Übertragung des BaYMV und BaMMV durch den bodenbürtigen
Plamodiophorid Polymyxa graminis, der infektiös bis in eine Bodentiefe von 70 cm nachgewiesen ist, können Ertragsverluste, welche beim Anbau anfälliger Sorten durchaus im Bereich von über 50% liegen können, mit chemischen Mitteln sowie pflanzenbaulichen Maßnahmen nicht verhindert werden. Bei insektenübertragenen Viren ist zwar eine Reduktion
von Ertragsverlusten durch eine Insektizidbehandlung möglich, jedoch verursacht diese zusätzliche Kosten und ist z.B. im Hinblick auf Zikaden nur unzureichend wirksam. Im Zuge
einer umwelt- und verbraucherfreundlichen Gerstenproduktion sollte diese daher vermieden
werden. Die Züchtung virusresistenter Sorten ist somit von erheblicher Bedeutung, da sie die
einzige Möglichkeit darstellt, den Wintergerstenanbau auf den mit bodenbürtigen Viren verseuchten Anbauflächen zu sichern und bei insektenübertragenen Viren eine umwelt- und
verbraucherfreundliche Gerstenproduktion gewährleistet.
Die Pflanzenzüchtung nimmt ihren Ausgangspunkt von der Erfassung der genetischen Variation im Genpool einer Kulturart gefolgt von deren Nutzung in langjährigen Selektionsverfahren, wie z.B. der Pedigree-Selektion bei Gerste, welche von der Kreuzung bis zur Sorte
durchaus 10-12 Jahre in Anspruch nehmen kann. Dieser Vorgang verlängert sich noch einmal deutlich (>20 Jahre), wenn die einzulagernden Eigenschaften, z.B. Virusresistenzen, aus
nicht angepassten genetischen Ressourcen stammen. Der Pflanzenzüchtung steht jedoch
heute eine Vielzahl biotechnologischer Verfahren zur Verfügung. So erlauben Zell- und Gewebekulturtechniken (Embryo Rescue, Protoplastenfusion) die Nutzung des sekundären und
tertiären Genpools, welche durch eine eingeschränkte bzw. nicht vorhandene Kreuzbarkeit
mit den Kulturarten limitiert ist. Des Weiteren stehen Haploid- (Antheren-, Mikrosporenkultur) und molekulare Markertechniken zur Verfügung, welche eine beschleunigte Nutzung
dieser Eigenschaften im Selektionsprozess ermöglichen. Die Möglichkeit der Regeneration
ganzer Pflanzen aus unreifen Pollenkörnern führt nach Verdopplung des Chromosomensatzes zu doppelhaploiden Pflanzen, die bereits reinerbig (homozygot) sind und eine Erfassung
auch komplexer Merkmale in frühen Generationen erlauben und damit zu einer deutlichen
Verkürzung des Zuchtganges beitragen. Diese Verfahren werden heute in der Gerstenzüch-
tung bereits routinemäßig eingesetzt, ebenso wie die Nutzung molekularer Marker, welche,
wenn sie hinreichend eng mit dem Zielgen gekoppelt sind, oder auf Sequenzunterschieden
im Gen selbst beruhen, eine sichere, umweltunabhängige Selektion auf DNA- bzw. RNAEbene für einfach vererbte Merkmale (Majorgene) bzw. komplex vererbte Merkmale (Quantitative Trait Loci, QTL) in frühen Entwicklungsstadien unabhängig von den Umweltbedingungen ermöglichen (Abb. 1, Friedt und Ordon 2006, Ordon et al. 2011)
Abb. 1: Überblick über Einsatzmöglichkeiten biotechnologischer Verfahren zur Nutzung genetischer Variation in der Pflanzenzüchtung (mod. Friedt und Ordon 2006)
Im Folgenden werden Arbeiten zur Züchtung virusresistenter Sorten unter Nutzung oben
genannter Techniken am Beispiel der Gelbmosaikvirose und der Gelbverzwergung der Gerste zusammenfassend dargestellt.
Gelbmosaikvirose der Gerste
Die Gelbmosaikvirose der Gerste wurde erstmals in Europa im Jahre 1978 in Deutschland
(Huth und Lesemann 1978) nachgewiesen und hat sich seit dieser Zeit aufgrund einer ständigen Ausweitung der Befallsflächen, erheblicher Ertragsverluste (s.o.) sowie dem Auftreten
neuer, resistenzbrechender Virusstämme (Habekuß et al. 2008), zu einer der bedeutendsten
Krankheiten der Wintergerste entwickelt. Resistente Sorten konnten bereits kurze Zeit nach
der Entdeckung der Gelbmosaikvirose in Deutschland im Sortiment zugelassener Sorten
identifiziert werden. Genetische Analysen zeigten jedoch, dass die Resistenz dieser Sorten
auf ein einziges rezessives Gen (rym4) auf Chromosom 3HL der Gerste zurückzuführen ist.
Zu dieser Zeit (1980er) hatten die resistenten Sorten im Vergleich zu den anfälligen Sorten
noch eine deutlich geringere Ertragsleistung (Tabelle 1). Inzwischen ist es der Züchtung jedoch gelungen BaMMV/BaYMV-Resistenz mit einer hohen Ertragsleistung zu kombinieren,
so dass heute der überwiegende Teil der zugelassenen Sorten resistent ist und die anfälligen Sorten in der Ertragsleistung übertrifft (Tabelle. 1).
Tabelle 1: Kombination von Gelbmosaikvirusresistenz und Ertragsleistung in der Wintergerste von 1986 – 2012 (Anonymus 1986, 1995, 2012)
Anzahl Sorten
Ertrag
Jahr
resistent
anfällig
resistent
anfällig
1986
6
37
4,3*
5,6
1995
24
41
6,5
6,3
2012
63**
12
7,2
6,3
*1=minimum, 9=maximum, **3 Sorten mit Resistenz auch gegen BaYMV-2.
Aufgrund der sehr engen genetischen Basis der Resistenz (rym4) wurden umfangreiche
Screening-Programme zur Identifikation von Resistenzen im primären und sekundären Genpool der Gerste durchgeführt. In diesen Arbeiten konnte zunächst gezeigt werden, dass gegenüber den verschiedenen Erregern der Gelbmosaikvirose (BaMMV, BaMMV-Teik BaYMV,
BaYMV-2) genotypisch differenzierte Reaktionen vorliegen und weitergehende klassisch
genetische Analysen ergaben, dass im primären Genpool verschiedene rezessive Resistenzgene vorhanden sind (Götz & Friedt 1993, Ordon & Friedt 1993). Darüberhinaus wurden
zwei dominante Resistenzgene in Hordeum bulbosum identifiziert (Ruge et al. 2003, RugeWehling et al. 2006) und jüngst konnte auch in der Kulturgerste (Hordeum vulgare) ein erstes
dominantes Resistenzgen nachgewiesen werden (Kai et al. 2012). Mit der Entwicklung molekularer Markertechniken in den 1990er Jahren wurden diese Gene sukzessive im Genom
der Gerste lokalisiert (Abbildung 2, Friedt & Ordon 2007).
Abb. 2: Lokalisation von Resistenzgenen gegen BaMMV/BaYMV
Eng gekoppelte molekulare Marker stellen effiziente Werkzeuge in der Züchtung auf
BaMMV/BaYMV-Resistenz dar, da sie die Selektion resistenter Pflanzen ohne phänotypische Analyse ermöglichen, deren Erfolg insbesondere bei BaMYV/BaYMV-2 zu einem erheblichen Teil von den Witterungsbedingungen im Winter und Frühjahr abhängt. In der Pra-
xis können dank geeigneter molekularer Marker doppelhaploide (DH)-Populationen bereits in
der Petrischale (in vitro) untersucht werden, so dass nur Pflanzen mit dem resistenzbedingenden Allel anschließend ins Gewächshaus überführt werden müssen.
Darüber hinaus können Rückkreuzungsprogramme, die erforderlich sind, um neue Resistenzgene, die in der Regel aus ertragsarmem, exotischen genetischen Ressourcen stammen, in geeignete ertragreiche Gerstesorten zu inkorporieren, mit molekularen Markern erheblich verkürzt werden. Dies führt zu einer beschleunigten Nutzung von Virusresistenzen
aus genetischen Ressourcen (Übersicht siehe Palloix & Ordon 2011).
Entsprechende Marker erleichtern zudem insbesondere im Zusammenspiel mit der Nutzung
von Doppelhaploid-Techniken eine effiziente Pyramidisierung von Resistenzgenen, d. h. die
Kombination verschiedener Resistenzgene in einem Genotyp (Werner et al. 2005). Die Pyramidisierung könnte in Zukunft in der Züchtung auf Gelbmosaikvirusresistenz an Bedeutung
gewinnen, da viele der bekannten rezessiven Resistenzgene nicht gegen alle Stämme des
Gelbmosaikviruskomplexes wirksam sind. Durch diesen Ansatz kann die Nutzungsdauer von
Genen, die nur noch gegen einzelne Stämme des BaMMV/BaYMV wirksam sind, verlängert
werden.
Die entsprechenden Marker beruhen jedoch i.d.R. nicht auf Unterschieden im Resistenzgen
selbst, sondern im Bereich des interessierenden Locus, d. h. durch Rekombination kann es
zu Fehlern bei der Selektion kommen. Daher ist die Isolation derartiger Resistenzgene von
besonderem Interesse, einerseits um Informationen über die Struktur und Funktion von Virusresistenzgenen zu gewinnen, und andererseits eine zielgerichtete allelbasierte Selektion
zu ermöglichen. Bisher konnte der Rym4/Rym5-Locus auf Chromosom 3H, welcher für den
Translationsinitiationsfaktor 4e (Hv-eIF4E, Stein et al. 2005) codiert, mit Hilfe eines kartengestützten Klonierungsansatz (Pellio et al. 2005) isoliert werden. Die Kenntnis entsprechender Gene erlaubt einerseits eine allelbasierte Selektion sowie andererseits die Identifikation
neuer, u.U. wirkungsvollerer Allele, in großen Genbankkollektionen und eröffnet somit die
Möglichlichkeit einer zielgerichteten Erfassung der genetischen Diversität im Hinblick auf
Resistenz gegen BaMMV/BaYMV (Stracke et al. 2007, Hofinger et al. 2011) gefolgt von deren Nutzung im Züchtungsprozess.
Da der pflanzliche Translationskomplex neben Hv-eIF4E weitere Gene umfasst, für die z.T.
bereits eine Beteiligung an der Resistenz gegen Potyviren gezeigt werden konnte (LeGall et
al. 2011), stellen diese geeignete Kandidatengene für weitere in der Gerste bekannte Resistenzloci gegen den Gelbmosaikviruskomplex dar. Derzeit werden diese Kandidatengene kartiert, jedoch konnte bisher keines dieser Kandidatengen in der Nähe von BaMMV/BaYMVResistenz-Loci kartiert werden (Abb. 1).
Gerstengelbverzwergung
Weltweit ist die Gerstengelbverzwergung, die von verschiedenen blattlausübertragenen
Stämmen des Barley yellow dwarf virus (BYDV), und des Cereal yellow dwarf virus (CYDV)
verursacht wird, die bedeutendste Getreidevirose. Der Klimawandel wird bedingt durch mildere Herbst- und Wintermonate in Deutschland zu einer steigenden Bedeutung insektenübertragener Viren führen, wie dies bereits für das blattlausübertragene Barley yellow dwarf
virus (BYDV), welches erhebliche Ertragsverluste in Gerste verursachen kann, in SachsenAnhalt gezeigt werden konnte (Habekuß et al. 2009), so dass eine züchterische Verbesserung der Resistenz gegenüber BYD als Reaktion auf den Klimawandel erforderlich ist. In der
Gerste wurden neben dem aus H. bulbosum stammenden Resistenzgen Ryd4Hb, welches
aufgrund der Kopplung mit negativen Eigenschaften aus der Wildart in der Züchtung bisher
nicht genutzt werden kann (Scholz et al. 2009), mehrere toleranzbedingende Gene identifi-
ELISA Extinktion
ziert. Dies sind Ryd2 auf dem Chromosom 3H, Ryd3 auf dem Chromosom 6H und - neben
anderen - ein QTL auf dem langen Arm des Chromosoms 2H (Ordon et al. 2009). Eine Verbesserung der Toleranz gegenüber der Gelbverzwergung mit Hilfe der phänotypischen Selektion gestaltet sich schwierig, da eine verlässliche Selektion eine künstliche Inokulation mit
virustragenden Blattläusen erfordert, die zuvor massenhaft vermehrt werden müssen. Daher
ist die Entwicklung molekularer Marker für die obengenannten Gene von besonderer Bedeutung, um eine effiziente Selektion toleranter Genotypen zu ermöglichen. Entsprechende
Marker für diese Gene und QTL existieren bereits und erlauben – neben markergestützten
Selektionsverfahren – die Pyramidisierung dieser Gene. Basierend auf entsprechenden Markern und DH-Linien wurden Ryd2, Ryd3 und der QTL auf dem Chromosom 2H kombiniert,
und DH-Linien mit allen möglichen Allelkombinationen wurden nach künstlicher Inokulation
mit BYDV in Feldversuchen getestet. Diese Studien ergaben, dass eine Kombination von
Ryd2 und Ryd3 nicht nur zu einer verbesserten Toleranz gegenüber BYDV, sondern auch zu
einer Reduktion des Virustiter (Abb. 3), d. h. zu einer quantitativen Resistenz (Riedel et al.
2011) führt. Entsprechende Linien werden in der Gerstenzüchtung bereits zur Verbesserung
der BYDV-Resistenz genutzt.
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
G
F
D
C
E
CD
A
B
Ryd2 Ryd2 Ryd2 Ryd2 ryd2 ryd2 ryd2 ryd2 DH21Ryd3 Ryd3 ryd3 ryd3 Ryd3 Ryd3 ryd3 ryd3 136
QTL+ QTL- QTL+ QTL- QTL+ QTL- QTL+ QTL- (Ryd2
ryd3
Allel Kombination
QTL+)
RIL
K4-56
(ryd2
Ryd3
QTL-)
Rubina
(ryd2
ryd3
QTL-)
Abb. 2: Durchschnittliche ELISA-Extinktion (405 nm) und Standardabweichung in DH-Linien
einer DH-Population mit verschiedenen Allelkombinationen von Ryd2, Ryd3 und einem QTL
auf Chromosom 2H. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede.
Zum Vergleich sind Daten der Elternlinien und des anfälligen Standards gezeigt (Riedel et al.
2011)
Zusammenfassung und Ausblick
In der Züchtung auf Virusresistenz bei Gerste konnten in der Vergangenheit in Bezug auf
BaMMV/BaYMV bereits erhebliche Erfolge erzielt werden. Für die Züchtung virusresistenter
Sorten stehen bereits heute Werkzeuge wie molekulare Marker und Haploidtechniken zur
Verfügung, welche sie effizienter gestalten. Die zunehmende Sequenzinformation und neue
Hochdurchsatzmarkertechnologien werden zukünftig die beschleunigte Isolation von Resistenzgenen ermöglichen. Die Isolation von Genen, die an der Virusresistenz beteiligt sind,
wird die Virusresistenzzüchtung in zunehmendem Maße auf die Allelebene verlagern sowie
die Identifikation neuer Allele und deren gezielte Nutzung in molekularen Züchtungsstrategien ermöglichen. Die genannten biotechnologischen Fortschritte werden die Pflanzenzüch-
tung in die Lage versetzen schneller und gezielter auf die Herausforderungen, die durch das
Auftreten neuer Viruskrankheiten bzw. neuer Virusstämme entstehen, zu reagieren. Dies
trägt zu einer Reduktion der durch Virosen verursachten Ertragsverluste in der Gerste bei
und sichert langfristig einen ökonomisch tragfähigen Gerstenanbau.
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