Analytische Chemie

Analytische Chemie
für Biologie Pharmazie Bewegungswissenschaften und Sport
Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
FAME – Kombinierte Übung
HS 2008
Xiangyang Zhang
1
Zusammenfassung: GC, LC, EP
GC
LC
EP
MP
He, H2, N2
LM (elutionsmittel)
Pufferlösung
SP
Film-df/Polarität
NP, RP, IC, SEC, …
–––––
Säule (Kapillar)
ID, L, Kapizität
ID, L, df (kompakt)
ID, L
Parameters
Flussrate (u), T
Flussrate (u)
pH, Spannung (V)
Gradient-
T-
Elutions-, (T-)
pH-, V-
Prinzip
G/L Verteilung
L/L Verteilung
EP und EOF
Detektor
FID (ECD) / MS
UV, RI, ELSD / MS
UV, Fl / MS
Anwendungen
Klein, neutral,
thermostabil,
nicht-zu-polare
Alle (auch polare
bei RP, Polymere
bei SEC)
Ionische (auch
Neutrale bei
MEKC)
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Xiangyang Zhang
2
Gute Trennung
genuge Auflösung R
$ " #1' k2
N
t #t
R =&
*
= R 2 R1
)*
% " ( 1+ k2 4
(w 2 + w1 ) /2
Kurze Retentionszeit tR’
3
16RS2 H % # ( (1+ k 2 )
tR =
"'
*"
& # $1)
u
k 22
idealer Peakform (schmal wb und symmetrisch)
!
Analysenmethode:
!
•! System – Säule (stationäre Phase) und mobile Phase (Polarität)
•! Analyteneigenschaften
•! Operationsbedingungen (Fliessrate, Temperatur und LM-Gradientenelution)
Derivatisierung:
!! Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker für
selektive und empfindliche Detektion )
!! Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer
!! Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP
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3
Auswahl einer Chromatographiemethode
•! Geeignet für Sehr polare und
thermisch labile Substanzen
•! Geeignet für Ionische
Verbindungen, Biopolymere
und Polymere
GC
•! Analytische, Präparative und
Produktive
EP
NP
RP
•! Grosse Auswahl und Hohe
Trennleistung Selektivität
!! Polarität
Ausschluss
!! Löslichkeit
!! Ionenisch
!! Molekulare Masse
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LC
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FAME – Ein kombiniertes Beispiel
Entwerfen Sie eine Methode, um die Fettsäureverteilung in einem Fett oder
Öl quantitativ zu bestimmen. Nehmen Sie an, das Fett sei bereits aus dem
Lebensmittel isoliert.
1. Ist eine Aufarbeitung oder Derivatisierung notwendig?
2. Welches Trennverfahren eignet sich?
3. Wie detektieren Sie die Fettsäuren?
With the implementation of the Nutrition
Labeling and Education Act of 1990 by the U.S.
Food and Drug Administration (FDA), the total
fat and saturated fat contents of a food must be
listed on its label."
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5
Wichtige Fettsäuren in Milch, Fleisch, Fish und Gemüse"
1 C4:0 (Butryic) "
2 C6:0 (Caproic) "
3 C8:0 (Caprylic) "
4 C10:0 (Capric) "
5 C11:0 (Undecanoic) "
6 C12:0 (Lauric) "
7 C13:0 (Tridecanoic) "
8 C14:0 (Myristic)"
9 C14:1 (Myristoleic) "
10 C15:0 (Pentadecanoic) "
11 C15:1 (cis-10-Pentadecenoic) "
12 C16:0 (Palmitic) "
13 C16:1 (Palmitoleic) "
14 C17:0 (Heptadecanoic) "
15 C17:1 (cis-10-Heptadecenoic) "
16 C18:0 (Stearic) "
17 C18:1n9c (Oleic) "
18 C18:1n9t (Elaidic) "
19 C18:2n6c (Linoleic) "
20 C18:2n6t (Linolelaidic) "
21 C18:3n6 (!-Linolenic)"
22 C18:3n3 ("-Linolenic) "
23 C20:0 (Arachidic) "
24 C20:1n9 (cis-11-Eicosenoic) "
25 C20:2 (cis-11,14-Eicosadienoic) "
26 C20:3n6 (cis-8,11,14-Eicosatrienoic) "
27 C20:3n3 (cis-11,14,17-Eicosatrienoic) "
28 C20:4n6 (Arachidonic) "
29 C20:5n3 (cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic) "
30 C21:0 (Henicosanoic) "
31 C22:0 (Behenic) "
32 C22:1n9 (Erucic) "
33 C22:2 (cis-13,16-Docosadienoic) "
34 C22:6n3 (cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic)"
35 C23:0 (Tricosanoic) "
36 C24:0 (Lignoceric) "
37 C24:1n9 (Nervonic) "
Je 2 C14-C17/C24; je 7 C18/C20, 4 C22 Isomere
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Der erste Schritt
Wichtige Punkte:
•! Viele Komponenten, davon es ähnliche Isomere zu entstehen sind
•! Triglyceriden mit sehr höhen Siedpunkt
•! Carboxylic Gruppe: nicht empfindlich bei UV; wenn Elutionsgradient
nötig, RI-Detektion ist auch nicht geeignet.
•! Ist der Triglyceride möglich zu derivatisieren?
Unfortunately for the food analyst, determining the fatty acid composition is
difficult because a food can contain many different fatty acids of various
carbon chain lengths. "
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DB-5ht Säule für Butter Triglyceriden
(5%-Phenyl)-methylpolysiloxane, unpolar
30 m x 0.32 mm I.D., 0.1 µm
Carrier: Hydrogen at 55 cm/sec, measured at 250°C
Oven: 35-250°C at 70°/min, 250-400°C at 5°/min
400°C for 20 min
Injector: Cool On-column
1 µL of 9 µg/µL in toluene (approx. 1% w/w solution)
Detector: FID, 400°C
T= Total number of Carbons
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DB-XLB für Butter Triglycerides
Exceptionally Low Bleed (XLB)
Low polarity
Extended temperature limit of
340/360°C
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Column: DB-XLB
15 m x 0.25 mm I.D., 0.1 µm
Carrier: Hydrogen at 50 cm/sec
Oven: 255-365°C at 5°/min
365°C for 10 min
Injector: Split 1:50, 365°C
1 µL of 10 µg/µL
Detector: FID, 365°C
Nitrogen makeup gas at 30 mL/min
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9
Eine polarere Säule
DB-17ht: (50%-Phenyl)-methylpolysiloxane
!"#-polarity; Extended upper temperature limit of 365°C
Excellent peak shape and faster elution times for high boilers
Improved resolution for triglycerides
Ideal for confirmational analyses
30 m x 0.32 mm I.D., 0.15 µm
Carrier: Hydrogen at 40 cm/sec
Oven: 250-365°C at 5°/min; 365°C for 1 min
Injector: Cool On-column
1 µL of 9 µg/µL in toluene (approx. 1% w/w solution)
Detector: FID, 400°C, Nitrogen makeup gas at 30 mL/min
Baseline Corrected
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DB-17ht für Butterfett
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DB-17ht für Kokosfett
(50%-Phenyl)methylpolysiloxane
30 m x 0.25 mm I.D., 0.15 µm
Carrier: Hydrogen at 50 cm/sec
Oven: 255-365°C at 5°/min
365°C for 10 min
Injector: Split 1:50, 365°C
1 µL of 10 µg/µL
Detector: FID, 365°C
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HPLC: Olivenöl
UV bei 225 nm
Säule: Hypersil BDS C18,
5 !m, 250 mm x 4.6 mm
Mobile Phase: CH3CN : EtOH
ELSD Detektor
Gradient: 80:20 bis 0:100
während 60 min
Flussrate: 1.5 ml/min
Detektor: UV bei 225 nm und
ELSD
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13
Triglycerides in 100% Olive Oil
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
LLO
LLP
OOL
POL
PPL
OOO
OOP
PPO
OOS
•!
Alltima™ C18, 3!m, 150 x 4.6mm
•!
Mobile Phase:
–!
–!
•!
A: Dichloromethane
B: Acetonitrile
Gradient:
–!
Time (min): 0 10 18 20
%B: 70 55 70
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70
•!
Flowrate: 1.5mL/min
•!
Detector:ELSD 2000
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Derivatisierung
O
O
O
C
O
(CH2)n1CH3
O
C
O
(CH2)n2CH3
O
C
(CH2)n3CH3
3 NaOH
HCl
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HO
C
O
(CH2)n1CH3
HO
C
O
(CH2)n2CH3
HO
C
(CH2)n3CH3
OH
+
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OH
OH
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Ionenchromatographie
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Oxalsäure "
Weinsäure "
Citronensäure "
Malonsäure "
Ameisensäure "
Milchsäure "
Bernsteinsäure "
Essigsäure "
Fumarsäure!
Säule: Jordi Organic Acid
Column, 500 mm x
10 mm, 5 !m
Mobile Phase: 0.01 M
Phosphorsäure, pH 3
mit NaOH
Flussrate: 1.5 ml/min
Detektor:
UV bei 210 nm
RI
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GC-FID: DB-FFAP
High polarity, Nitroterephthalic acid
modified polyethylene glycol
T: 100° für 5 min, 100°–250°
bei 10°/min, dann stationär
Injektor: 250°, "split" 1:50
Detektor: FID, 300°
Säule: 30 m x 0.25 mm, 0.25 !m Filmdicke
Flussrate: 40 cm/s Helium
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1 Aceton "
2 Ameisensäure "
3 Essigsäure "
4 Propionsäure "
5 Isobuttersäure "
6 Buttersäure "
7 Isovaleriansäure "
8 Valeriansäure "
9 Isocapronsäure "
10 Capronsäure "
11 Heptansäure "
12 Caprylsäure "
13 Caprinsäure "
14 Laurinsäure "
15 Myristinsäure "
16 Palmitinsäure "
17 Stearinsäure "
18 Arachidinsäure "
17
HPLC: Alltima C-18
1
2
3
4
Linolensäure (C18:3)
Linolsäure (C18:2)
Ölsäure (C18:1)
Stearinsäure (C18:0)
Säule: Alltima C18, 5 µm, 150 x 4.6 mm "
Mobile Phase: Tetrahydrofuran :
Acetonitril : 0.1 % Phosphorsäure "
(24:58:18) "
Flussrate: 1.5 ml/min "
Detektor: UV bei 220 nm!
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CZE für Carbonsäuren
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Derivatisierung – FAME
O
O
O
C
O
(CH2)n1CH3
O
C
O
(CH2)n2CH3
O
C
(CH2)n3CH3
3 NaOCH3
H3CO
C
O
(CH2)n1CH3
H3CO
C
O
(CH2)n2CH3
H3CO
C
(CH2)n3CH3
ONa
+
ONa
ONa
Die beste Lösung des Problems liegt in der Umesterung der Triglyceride mit
Natriummethanolat. Die entstehenden Fettsäure-methylester (fatty acid methyl
esters, FAMEs) lassen sich leicht mittels Gaschromatographie trennen. Die
Detektion mit dem FID ist problemlos möglich. Der leichte Anstieg der Basislinie
infolge des Temperatur- programmes stört die Quantifizierung nicht. Die meisten
Peaks sind basisliniengetrennt.!
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DB-Wax Säule: 34 FAMEs
•!
Polyethylene glycol (PEG)
•!
Close equivalent to USP Phase G16
•!
High polarity
•!
Lower temperature limit of 20°C is lowest of any bonded PEG
phase; improves resolution of low boiling point analytes
•!
Column-to-column repeatability
•!
Bonded and cross-linked; solvent rinsable
•!
Exact replacement of HP-WAXcement of HP-WAX
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21
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22
(50%-Cyanopropylphenyldimethylpolysiloxane
H2, T-Gradient, FID, 13 min
17/18
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