Mareike Bach

Personenkennziffer: 91588769
Name:
Mareike Gabriele Bach
E-Mail:
[email protected]
Abschlussbericht
über die Stipendienzeit
Von
Bis
In
06.07.15
25.09.15
Australien
Programm: RISE weltweit - Forschungspraktika für deutsche Studierende, 2015
Referat: Referat ST23
Im Einklang mit Ziffer 10 der „Allgemeinen Bedingungen für deutsche Stipendiatinnen und Stipendiaten
des DAAD“ kann dieser Bericht ohne Nennung meines Namens, meiner Anschrift, meiner
Telefonnummer und E-Mail-Adresse an künftige Stipendiaten des DAAD zur Information weitergegeben
werden.
 Ich bin auch mit der Weitergabe meines Namens und meiner E-Mail-Adresse an künftige
Stipendiaten des DAAD einverstanden, um eine eventuelle Kontaktaufnahme zu ermöglichen.
......................................
...............................................
Datum
Unterschrift
D 205/ Januar 2013
DAAD RISE weltweit 2015
-Abschlussbericht-
Mareike Bach (B.Sc. Biochemie)
Institution: La Trobe University, Melbourne, Australien
Betreuerin: Dr. Connie Darmanin
Inhalt:
1. Allgemeiner Teil
2. Fachlicher Teil
3. Fazit
September 2015
1.
Allgemeiner Teil
In diesem Teil des Berichtes sollen einige Erfahrungen zur Reisevorbereitung und zum
alltäglichen Leben in Australien Erwähnung finden.
Reisevorbereitung
Für die Einreise nach Australien sind keine besonderen Impfungen notwendig. Man kann die
Gelegenheit aber sehr gut nutzen um einen Blick in den Impfpass zu werfen und fehlende
generelle Impfungen aufzufrischen.
Wichtig ist es allerdings vor der Einreise ein Visum zu beantragen. Ich habe mich für das
eVisitor (Subclass 651) entschieden. Dies gilt zwar nur für 90 Tage (also für genau 12 Wochen
Praktikum) und man kann somit nicht nach dem Praktikum noch herumreisen, ist aber das
günstigste (nämlich kostenlos) und sehr einfach zu beantragen.
Als Alternativen gibt es sowohl das Working Holiday Visum als das Training and Research
Visum. Diese anderen Visa sind länger gültig, aber mit um die 400 AUD (ca. 250 €) auch sehr
teuer. Außerdem kann man das Working Holiday nur einmal im Leben beantragen, evtl.
zweimal mit Ausnahmegenehmigung. Falls man also keinen sehr viel längeren Aufenthalt in
Australien plant und vielleicht nocheinmal für längere Zeit wiederkommen möchte, ist das
eVisitor eine gute Lösung. Es kann aber durchaus sein, dass der Betreuer oder die Uni
fordern, dass man ein bestimmtes Visum beantragt.
Um ein Visum zu beantragen, braucht man einen gültigen Reisepass und muss online ein
Formular ausfüllen. Dann erhält man per e-Mail eine Bestätigung und meistens innerhalb
von 24 h eine postivie Rückmeldung, dass dem Antrag stattgegeben wurde. Ich habe mir
dann diese Bestätigung mit der wichtigen Nummer ausgedruckt, wurde aber bei der Einreise
und Inlandsflügen nicht danach gefragt, da das alles elektronisch abläuft.
Wonach die Beamten bei der Einreise aber fragen ist natürlich der gültige Reisepass und
einige fragen tatsächlich nach der Adresse der Unterkunft für die nächste Nacht. Die muss
a au h auf de gel e Zettel it de ‚ usto s de la atio a ge e . Ge e ell ka
a
aber sagen, dass die Einreise bei weitem nicht so unangenehm ist, wie z.B. in die USA oder
auch Canada.
Unterkunft
Über Kontakte meiner Betreuerin Connie konnte ich schon vor meiner Reise eine Unterkunft
für die Zeit meines Praktikums finden. Ich kam bei einem Bekannten in seinem nicht
genutzten Gästezimmer unter. Die Miete war mit 200 AUD pro Woche für die Lage in Lalor
(ca. 45 min mit der Bahn in den CBD) sehr teuer und Lalor ist doch auch noch ein gutes Stück
von der La Trobe University in Bundoora entfernt, allerdings war ich einfach froh schon im
Vorraus eine Unterkunft sicher zu haben, bei der ich auch davon ausgehen konnte, dass sie
geeignet ist. Generell sind die Preise für die Miete höher als ich es in Deutschland gewohnt
war. Falls man vorher nichts findet: Um eine Unterkunft ein Fahrrad oder ähnliches zu
finden, kann man sich auf der Seite www.gumtree.org.au umsehen. Dort gibt es gebrauchte
Dinge zu kaufen und auch Wohnungsangebote.
Fortbewegung/Verkehrsmittel
Da mein Vermieter sehr nett war und sich gerade am Anfang sehr um mich gekümmert hat,
konnte ich schon am zweiten Arbeitstag mit dem Fahrrad zur Uni fahren. Ich konnte sein
Fahrrad für die 12 Wochen Praktikum leihen und somit jeden Tag 40 min Hin- und 40 min
Rückfahrt genießen. Und ja: ich meine wirklich genießen, da mein Weg durch die Vororte,
durch kleine Parks und neben Flüssen entlangführte. Ich habe sogar Känguruhs entlang des
Weges gesehen, sowie Cuckabooras und andere interessante Stadtbewohner.
An den Wochenenden bin ich dann oft runter in die Innenstadt gefahren. Um öffentliche
Verkehrsmittel zu benutzen, braucht man hier eine Myki-Card, die man an allen größeren
Bahnhöfen und an den Automaten für 6 AUD erwerben kann. Diese kann man dann aufladen
und zahlt dann die Fahrten in dem man bei jeden Einsteigen und Aussteigen an den MykiGeräten das obligatorische „tou h o a d tou h off“ durchführt. Dabei ziehen die Geräte
automatisch den günstigsten Tarif ab.
Das Fahrrad darf man in Bus und Tram leider nicht mitnehmen, dafür aber in den Zügen. Das
ist von Vorteil, wenn man eine Radtour in die Stadt macht und am Abend nicht nochmal den
ganzen Weg zurück fahren möchte und auch, wenn das Ziel weit entfernt von der nächsten
Bahnstation liegt.
Zum und vom Flughafen weg kommt man übrigens nicht nur mit dem überteuerten Skybus,
es gibt auch Buslinien, die dann in die nördlicheren Stadtgebiete fahren und nur den
normalen Myki-Tarif nutzen. Der ptv-Journey-Planner (ptv=public transport victoria) gibt
einem (meistens) die gewünschten Informationen, sofern man denn das Richtige eingibt.
Tipps zum Reisen und Entdecken von Melbourne und Umgebung
Melbourne ist eine unwahrscheinlich große Stadt, erst recht für ein Landei wie mich, und sie
hat unheimlich viel zu bieten. Es gibt in Melbourne zwar nicht DIE 10 Sehenswürdigkeiten,
die man unbedingt gesehen haben muss, aber es gibt unwahrscheinlich viele kleine Dinge zu
entdecken und es ist für jeden Geschmack etwas dabei. Hier eine kleine auswahl von Dingen,
die mir besonders gefallen haben:
-
Pengiuns in St. Kilda:
Um Pinguine zu sehen, muss man nicht erst bis nach Phillip Island fahren. Es gibt eine
kleine Population von Pinguinen direkt am St. Kilda Pier. Die kleinen Stadtbewohner
lassen sich meisten in der Dämmerung blicken und man kann sie beobachten wie sie
es sich in ihren Steinhöhlen gemütlich machen.
-
Flying foxes im Yarra Bend Park:
Im Yarra Bend Park, ausgehend von der Picnic Area am Bell Bird Park, kann man
gigantische fliegende Säugetiere bestaunen. Eine Kolonie Flughunde (mehrere
Tausend Tiere) hat sich hier niedergelassen und die Bäume sind voll von diesen
Tieren! Man kommt sehr dicht an sie ran und kann sie in der Dämmerung wohl auch
fliegen sehen.
-
Kangaroos im Plenty Gorge Park (and everywhere else...)
Känguruhs gibt es in vielen der kleinen Parks in den Suburbs, der Plenty Gorge Park
ist eines der Reservate, in denen man in jedem Fall Känguruhs antrifft, falls man denn
überall sonst kein Glück hatte. Nachteil: Man kommt genauso wie in den Yarra Bend
Park am besten mit dem Fahrrad hin.
-
Free museums worth to visit:
Es gibt eine Reihe von Museen hier, die keinen oder nur ganz wenig Eintritt kosten.
Das Melbourne Museum hat eine wirklich tolle Ausstellung zu verschiedenen
Richtungen (Science, Aboriginis, Forest, ...). Ich habe in den 2 Stunden, die ich Zeit
hatte, nur einen Bruchteil gesehen und würde unbedingt wieder hin, wenn ich die
Zeit hätte. Einfach am Eingang den deutschen Studentenausweis vorzeigen und man
bekommt ein Ticket.
Im Ian Potter Center der NGV (National Gallery of Victoria) gibt es eine tolle
Ausstellung zu Indigenous Art und andere bestaunenswerte Kunstgegenstände sowie
Ausstellungen zu wechselnden Themengebieten. Die Gallery bietet mehrfach am Tag
kostenlose Führungen an, der Besuch des Museums ist auch kostenlos.
-
Food:
Melbournes mutikulturelle Küche lässt sich am besten in den zahlreichen kleinen
Restaurants oder Cafes genießen. Es gibt eigentlich nichts, was es nicht gibt. Von
Dumplings über Samosas, günstigen Sushi-Rolls, Pizza und Pasta zu Eis, was in
Flüssigstickstoff hergestellt wird.
-
Great Ocean Road:
Definitiv eine Reise wert! Die GOR schlängelt sich mal mehr mal weniger am Wasser
Richtung Westen, der Start ist in Torquay. Entlang der Great Ocean Road gibt es tolle
Strände, eine Menge Surfer und atemberaubende Aussichten. Man kann auch das
australische Wildlife beobachten. Delfine im Meer, Koalas und Känguruhs an Land.
-
Clubs and Societies/Socialising and finding friends:
Nicht nur gut, um mit anderen Studenten von wo auch immer in Kontakt zu kommen,
sind die zahlreichen Angebote, die es am Campus gibt. Über den Surfing-Club bin ich
an die Great Ocean Road gekommen, die International Students Association bietet
kleine Trips im Winter in den Schnee oder nach Phillip Island an und die Uni selbst hat
ein Austauschprogramm um die regionalen Teile der Uni in Albury/Wodonga oder
Bendigo zu besuchen. Das ist meist kostengünstig und perfekt um andere Studenten
kennenzulernen und Freundschaften zu schließen.
Empfehlenswert ist auch erreichbar zu sein. Ich habe am Flughafen einen Goodie-Bag
mit einer SIM-Karte abgestaubt und war somit von Anfang an erreichbar. Im Zeitalter
von Facebook, Whatsapp und Wifi ist es ja sowieso sehr leicht in Kontakt mit anderen
zu bleiben. Aber: Die guten Möglichkeiten und die netten Leuten fallen nicht einfach
auf einen drauf. Man darf und sollte gerne von Anfang an auf die Menschen zu gehen
und selbst die Initiative ergreifen, sich informieren und einfach mal Leute
ansprechen, man hat ja auch nicht ewig Zeit und die drei Monate vergehen wie im
Flug. Ich habe mich zum Beispiel im Swimming Club angemeldet und habe später
durch Thorben (RISE Stipendiat an der RMIT) eine Gruppe von Leuten gefunden, die
jedes Wochenende wandern gehen. Ei e a de e Mögli hkeit u ‚Glei hgesi te fü
was auch immer zu finden ist die Couchsurfing-Webseite. Hier stellen nicht nur
Menschen von überall ihre Couch für Übernachtungen zur Verfügung, sondern es gibt
auch einige Events, bei denen man einfach teilnehmen und Leute kennenlernen
kann. Andere suchen über die Seite vielleicht auch nach Leuten, die sie auf ihrem
Wochenendtrip begleiten.
Good stuff to have
-
-
-
Australische SIM-Karte (siehe oben) oder Wifi-fähiges Handy mit deutscher SIM
Eine Kreditkarte ist für einige Dinge essentiell: Flüge buchen, Autos mieten, um einen
Schrank in der Schwimmhalle zu mieten, um nur einige (skurrile) Dinge zu nennen.
Generell ist eine Bankkarte, mit der man kostenlos Bargeld abheben kann, neben
einer Kreditkarte sinnvoll. Ich habe eine Sparkarte der Postbank, war damit bisher
zufrieden, es soll aber noch bessere Möglichkeiten geben.
Melbourne kann im Winter doch recht kalt werden, allerdings nicht im Vergleich zu
deutschen Wintern. Also Mütze und Schal habe ich schon gebraucht. Auf der anderen
Seite wird es, wenn dann man die Sonne scheint, auch recht warm. Man ist also gut
beraten von allem etwas einzupacken!
Myki: Für den Öffentlichen Verkehr braucht man eine Myki Card, die an allen
größeren Bahnhöfen erhältlich ist. (siehe oben)
2. Fachlicher Teil
Introduction
G-Protein Coupled Receptors (GPCRs) are integral membrane proteins consisting of 7
transmembrane helices.1 The general function of the GPCR superfamily is to transfer an
arriving signal from the outside of the cell in terms of signal molecules, such as
neurotransmitters and hormones, into a signal cascade in the cytoplasm of the cell. 2
Figure 1: Schematic diagram of the 7 transmembrane helices receptor family
Figure taken from: Stryer Biochemistry1, page 407
The dopamine D2 receptor is part of the GPCR superfamily and is expressed in the dorsal
striatum of the human brain. It exists in two isoforms, known as D2 long and D2 short.3
Stimulating parts of the brain responsible for neurological processes such motor behavior,
motivation, and working memory, the D2L receptor is suspected to have a major impact on
diseases i ludi g S hizoph e ia, Pa ki so s disease, ps hosis, dep essio , a d d ug a d
alcohol addiction.4
As a strong target fortherapeutical applicatons, it is essential to solve the crystal structure of
the D2L-receptor to aid in structure-based design of drugs. As a focus of ongoing
crystallization trials in the group, the D2L-receptor needs to be available in large quantities.
Consequently this project is meant to deliver protein samples for further crystallization trials.
Aim of the project
The aim of this 12-weeks project was to express the D2L-receptor (Dopamine-receptor, long)
using the baculovirus expression system in insect cell culture.
The molecular cloning of the D2L gene with the virus DNA and the initial low titre virus for
this receptor was previous carried out in the Darmanin laboratory. Therefore the virus titer
of the small scale virus had to be determined via plaque assays and a high titer virus stock
produced. The cells had to be transfected with the D2L-clone using the baculovirus
expression system. Small scale expression was supposed to be carried out by the end of the
12 weeks.
Results
High titer virus production of D2L-receptors in insect cells
The virus titer of the D2L-virus P3 from 12th October 2012 (already on stock in Darmanin
Laboratory) had to be determined via plaque assays. The results of the plaque assay can be
found in Figure 2.
Figure 2: D2L-Plaque assay revealing a low titer of virus in the long-term stored D2L-virus stock
Virus used: D2L P3, 12/10/2012
The virus titer was estimated to be 1.3x107 pfu/ml. This virus titer was too low to do
expression in Sf21 cells. A titer of >108 pfu/ml is required for the D2L-virus stock in order to
carryout expression. Therefore this virus stock had to be amplified up to a P4 viral stock.
The desired MOI (multiplicity of infection) for amplification was set as 0.05 pfu/ml. The
inoculum of the virus stock required was calculated using the following formula:
�
��
��
=
�
��
��
=
�
. 5
���
���
. ∗
�
∗ ∗
���
∗
∗5
���
�
���
= 3.35
(1)
500 ml of Sf21 cells were incubated at 28 °C in a shaker with 3.35 ml inoculated D2L-virus for
7 days until >90% cell lysis appeared.
Figure 3: D2L-Plaque assay revealing a very titer of the P4 virus
Virus used: D2L P4, 27/08/2015
The results of the P4 virus plaque assay (Figure 3) showed a very high virus titer. The pfu/ml
could not be determined, as almost all cells were lysed and no plaques were visible in the
lower dilutions of the virus (100-10-3). Another plaque assay was carried out with higher
dilutions (10-3 to 10-8) of the D2L-P4-virus stock (figure 4). Two plaque assays were carried
out in parallel, one by myself and the other by a coworker in the lab, Sudeep.
Figure 4: D2L-Plaque assay revealing a very titer of the P4 virus
Virus used: D2L P4, 27/08/2015
Left side: Experiment carried out by Mareike Bach
Right side: Experiment carried out by: Sudeep
My results suggested a very high titer of approximately 10 10, while the plaque assay of
Sudeep was estimated to 4x109 pfu/ml. As a virus titer of higher than 109 is very unlikely,
Sudeep s pla ue assa was used fo fu the al ulatio s fo e pression trials.
Small scale expression of the D2L-receptor in Sf21 cells
First trial
The result of 4x109 pfu/ml was used to determine the required inoculum for small scale
expression (formula (1)).
Table 1: Set up for the first small scale expression trial
Bottle number Amount of cells
[ml]
1
200
2
200
3 (contam.)
200
4 (contam.)
200
5
200
6 (contam.)
200
7 (contam.)
200
8 (contam.)
200
9
200
10
200
11
200
12 (contam.)
200
Cell density
[cells/ml]
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
MOI
1
1
1
1
3
3
3
3
5
5
5
5
Added virus
[ml}
0,05
0,05
0,05
0,05
0,15
0,15
0,15
0,15
0,25
0,25
0,25
0,25
Harvesting time after
inoculation [h]
24
48
72
96
24
48
72
96
24
48
72
96
In the small scale expression trial three different MOI of 1, 3 and 5 and four different harvest
times (24, 48, 72, 96 h) were set up. An amount of 200 ml of cells at 1x10 6 cells/ml was
infected per MOI and harvest time. (Table 1) The cells were harvested and pelleted for 20
min at 8000 xg.
After 48 h contamination was detected in bottles 3, 4, 6, 7, 8, 12. The remaining flask 11 was
still harvested.
Second trial
The result of 4x109 pfu/ml was used to determine the required inoculum for small scale
expression (formula (1)).
Table 2: Set up for the second small scale expression trial
Bottle number Amount of cells
[ml]
1
5
2
5
3
5
4
5
5
5
6
5
7
5
8
5
9
5
10
5
11
5
12
5
Cell density
[cells/ml]
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
1x106
MOI
1
1
1
1
3
3
3
3
5
5
5
5
Added virus
[ml}
0,05
0,05
0,05
0,05
0,15
0,15
0,15
0,15
0,25
0,25
0,25
0,25
Harvesting time after
inoculation [h]
24
48
72
96
24
48
72
96
24
48
72
96
Discussion
Within the 12-weeks of the project a new high titer virus stock was obtained and a small
scale expression trials were carried out.
By the time the internship ended, small scale expression was started, but due to
contamination with fungi was not able to proceed to large scale expression. In the near
future the optimal MOI and harvest time to optimize expression has to be determined and
large scale expression has to be carried out. The optimal harvest time can be determined by
using a SDS-PAGE, Western Blots and ligand binding assays.
The experience during the project is that working with insect cell culture is a tough and
drown-out process. It takes a lot of experience to work with these kind of cells and produce
protein in the end.
Other projects I worked on
During the time of my internship I was able to gain insight into other projects in the group.
For example:
-
Reproducible crystallization of 4 µm sized Concanavalin A crystals
Purification of Histamin-Receptor (H1R) using IMAC (Immobilized metal ion affinity
chromatography)
Bibliography
1.
Berg, J. M., Tymoczko, J. L. & Stryer, L. Stryer Biochemie. (Springer Spektrum, 2013).
2.
Gudermann, T., Schöneberg, T. & Schultz, G. FUNCTIONAL AND STRUCTURAL COMPLEXITY OF
SIGNAL TRANSDUCTION VIA G-PROTEIN-COUPLED RECEPTORS. Annu. Rev. Neurosci. 20, 399–427
(1997).
3.
Lindgren, N. et al. Distinct roles of dopamine D2L and D2S receptor isoforms in the regulation
of protein phosphorylation at presynaptic and postsynaptic sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 4305–
4309 (2003).
4.
Liang, Y.-L., Conn, C. E., Drummond, C. J. & Darmanin, C. Uptake of the butyrate receptors,
GPR41 and GPR43, in lipidic bicontinuous cubic phases suitable for in meso crystallization. J. Colloid
Interface Sci. 441, 78–84 (2015).
3. Fazit
Ich habe die 12 Wochen meines Praktikums in Australien sehr genossen und kann sowohl
fachlich als auch persönlich eine Menge aus dem Aufenthalt mitnehmen.
Australien ist ein tolles Land und Melbourne eine großartige Stadt, die einiges zu bieten hat
und in der ich wahrscheinlich nach Jahren immer noch neue spannende Orte entdecken
könnte.
Ich konnte einige neue Techniken im Labor erlernen und habe gemerkt, dass mir die
Laborarbeit sehr viel Spaß macht. Ich habe gelernt selbstständig zu arbeiten und meine
Experimente zu planen und weiß nun auch aus Erfahrung, dass Forschung nicht immer so
schnell vorangeht, wie man es sich wünschen würde.
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich beim DAAD für die Organisation dieses tollen Programmes
bedanken. Für Bachelorstudenten ist dies eine großartige Möglichkeit das in der Uni gelernte
Wissen praktisch anzuwenden und zu vertiefen. Darüberhinaus gibt es einem die
Möglichkeit ein anderes Land und eine andere Kultur kennenzulernen. Ohne die finanzielle
Unterstützung wäre so ein Auslandsaufenthalt nicht möglich und dafür möchte ich mich
recht herzlich bedanken!
I would like to thank my supervisor Connie as well, for answering all of my questions and
explaining all the new techniques I had never heard of before. Thank you for having
confidence in me and letting me work so independently. I had a great time in your lab and I
enjoyed working with every single one of you guys!
Vielen Dank auch an meine Eltern, die mir sowohl mit finanzieller Unterstützung als auch mit
Rat und Tat zur Seite standen, bei allen Vorbereitungen vor und bei allen Skype-meetings
während der großen Reise.