Ana H. Januário - Universidade de Franca
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Ana H. Januário - Universidade de Franca
UNIVERSIDADE DE FRANCA DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE EGONOL E HOMOEGONOL NOS EXTRATOS DE Styrax (STYRACACEAE) POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ANA CAROLINA GONZALES MORAES FRANCA 2012 UNIVERSIDADE DE FRANCA DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE EGONOL E HOMOEGONOL NOS EXTRATOS DE Styrax (STYRACACEAE) POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ANA CAROLINA GONZALES MORAES Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientadora: Profa. Dra. Patrícia Mendonça Pauletti. FRANCA 2012 Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca M818d Moraes, Ana Carolina Gonzales Desenvolvimento e validação de método analítico para a quantificação de egonol e homoegonol nos extratos de Styrax (Styracaceae) por cromatografia líquida de alta eficiência / Ana Carolina Gonzales Moraes ; orientador: Patrícia Mendonça Pauletti. – 2012 76 f. : 30 cm. Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu – Mestre em Ciências 1. Styrax camporum. 2. Controle de qualidade. 3. Validação. 4. CLAEDAD. 5. Nor-neolignanas. I. Universidade de Franca. II. Título. CDU – 54:615.32 Dedico Aos meus pais, Moacyr e Regina, por todo amor e dedicação. Por me ensinarem os verdadeiros valores da vida. Aos meus irmãos, Leonardo e Ana Luísa, e ao meu namorado, Ubirajara, por estarem presentes na minha vida, dando apoio e me incentivando. À minha avó por todas as orações e acolhimento. AGRADECIMENTOS À Deus, pela vida, esperança, por todas oportunidades incríveis e conforto nos momentos difíceis. Aos meus pais, pelo amor e compreensão. A vocês toda a minha gratidão, vocês são um exemplo para mim. Aos meus irmãos, pelo carinho, incentivo e companheirismo. Ao Ubirajara, amor da minha vida, pela sua paciência, respeito e compreensão. Sem você nada disso seria possível. A toda minha família, inclusive, Ângela, Bira, Carol, minha avó Zélia, por estarem do meu lado, dando-me apoio e força e por me acolherem sempre. À Profa. Dra. Patrícia Mendonça Pauletti, que com sua imensa sabedoria, colaborou para meu crescimento profissional, por toda sua dedicação, confiança e amizade. Estou imensamente grata. A todos os companheiros de laboratório que contribuíram para a execução deste trabalho. Em especial, pelos grandes amigos, Murilo, Thaís, Carol, Camila, Karen e Eveline. Aos professores do grupo de pesquisa da Universidade de Franca por colaborarem para o meu crescimento profissional durante as disciplinas cursadas. À CAPES pelo suporte financeiro. E a todos que contribuíram direta ou indiretamente para execução deste trabalho. Meus sinceros agradecimentos. “Começa a aceitar suas derrotas com a cabeça erguida e olhos radiantes, com a graça de um adulto – e não com a tristeza de uma criança. E aprende a construir todas as suas estradas no hoje, pois o terreno do amanhã é incerto demais para os planos” William Shakespeare SUMÁRIO ABREVIAÇÕES E SÍMBOLO.................................................................................................. I LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. III LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. IV LISTA DE FLUXOGRAMA .................................................................................................... V RESUMO ................................................................................................................................. VI ABSTRACT ............................................................................................................................VII 1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 2 1.1 USO DE PLANTAS COM FINS TERAPÊUTICOS .................................................. 2 1.2 CONTROLE DE QUALIDADE DAS PLANTAS MEDICINAIS ............................. 4 1.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ..................................................................................... 6 1.4 FAMÍLIA STYRACACEAE ..................................................................................... 10 1.5 LIGNÓIDES ............................................................................................................... 12 2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 17 3 PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................................ 19 3.1 EQUIPAMENTOS ..................................................................................................... 19 3.2 MATERIAIS .............................................................................................................. 19 3.3 MATERIAL VEGETAL ............................................................................................ 20 3.4 OBTENÇÃO DOS PADRÕES .................................................................................. 20 3.5 PREPARO DOS PADRÕES E AMOSTRA .............................................................. 22 3.5.1 Preparo da solução estoque de egonol e homoegonol ................................................ 22 3.5.2 Preparo do extrato padrão dos caules de S. camporum .............................................. 23 3.5.3 Preparo das amostras .................................................................................................. 23 3.6 CONDIÇÕES DE ANÁLISE EM CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADO A DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-DAD) ... 23 3.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO............................................................. 24 3.7.1 Curva analítica por padronização externa .................................................................. 24 3.7.2 Curva de adição de padrão ......................................................................................... 24 3.7.3 Seletividade ................................................................................................................ 25 3.7.4 Recuperação ............................................................................................................... 25 3.7.5 Precisão (inter e intra-dia) .......................................................................................... 26 3.7.6 Exatidão ...................................................................................................................... 26 3.7.7 Limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) ................................................ 26 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 29 4.1 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS DE Styrax ....................................................................................................................................29 4.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DO EGONOL E HOMOEGONOL NO GÊNERO Styrax ............................................................................... 34 4.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ................................................................................... 38 4.3.1 Seletividade e Especificidade ..................................................................................... 38 4.3.2 Linearidade ................................................................................................................. 39 4.3.3 Precisão ...................................................................................................................... 40 4.3.4 Exatidão ...................................................................................................................... 40 4.3.5 Recuperação ............................................................................................................... 41 4.3.6 Limite de Detecção (LOD) ......................................................................................... 41 4.3.7 Limite de Quantificação (LOQ) ................................................................................. 42 4.4 APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO PARA QUANTIFICAR O EGONOL E HOMOEGONOL EM S. camporum, S. ferrugineus e S. pohlii .......................... 42 5 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 45 6 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 47 7 ANEXO ...................................................................................................................... 55 I ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS ACN Acetonitrila ANVISA Agência de Vigilância Sanitária C 18 Sílica Octadecilsilano CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa CLAE (HPLC) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CV Coeficiente de variação DAD Detector de arranjo de diodos DPR Desvio padrão relativo EEJ Estação ecológica do Jataí EM (MS) Espectrometria de massas GPNUF Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais da UNIFRAN IC Inclinação da curva de calibração ICH International Conference on Harmonization INMETRO Instituto Nacional de Metrologia LC Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida) LOD Limite de detecção LOQ Limite de quantificação MeOH Metanol MS Ministério da Saúde OMS Organização Mundial de Saúde p. Página PVDF Fluoreto de polivinilideno r Coeficiente de correlação RDC Resolução da Diretoria Colegiada Fator de retenção Rf 1 RMN H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio s Slope II S Desvio padrão SUS Sistema Único de Saúde tR Tempo de Retenção USP United States Pharmacopeia UV-Vis Ultravioleta-Visível V inj Volume de injeção λ Comprimento de onda (MPP)-1 Matriz metaloproteinase III LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Styrax camporum Pohl. 10 Figura 2 – Estrutura química da unidade fenilpropanoídica, lignana, neolignana, nor-lignana e nor-neolignana. 13 Figura 3 – Lignanas isoladas de Styrax. 14 Figura 4 – Estruturas químicas de egonol (1) e homoegonol (2). 29 Figura 5 – Espectro de RMN 1H de 1 (CDCl 3 , 200 MHz). 32 Figura 6 – Espectro de RMN 1H de 2 (CDCl 3 , 200 MHz). 33 Figura 7 – Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S. camporum. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 5 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 60 min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, V inj = 20 μL, [ ] = 1,0 mg/mL. 36 Figura 8 – Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S. camporum. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 50 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 30 min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, V inj = 20 μL, [ ] = 1,0 mg/mL. 36 Figura 9 – Cromatogramas obtidos por CLAE do (a) extrato padrão do caule de S. camporum; (b) extrato das folhas de S. camporum; (c) extrato das partes aéreas de S. pohlii; e (d) extrato das partes aéreas de S. ferrugineus. Condições cromatográficas: metanol-água-ácido acético (73:26.9:0.1, v/v/v) e detecção em 311 nm. 37 Figura 10 – Curva de calibração padrão externo X linearidade padrão 1. 39 Figura 11 – Curva de calibração padrão externo X linearidade padrão 2. 40 Figura 12 – Espectro de UV-Vis dos padrões (a) egonol (1) e (b) homoegonol (2). 42 IV LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Dados de RMN 1H (200 MHz) das substâncias 1 e 2 e comparação com a literatura (CDCl 3 , 200 MHz). 31 Tabela 2 – Valores de seletividade para egonol (1) e homoegonol (2). 39 Tabela 3 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intra e inter-dia para o egonol (1) e homoegonol (2). 41 Tabela 4 – Recuperação para o egonol (1) e homoegonol (2). 41 Tabela 5 – Quantidade (μg/mL) de egonol (1) e homoegonol (2) em espécies de Styrax. 43 V LISTA DE FLUXOGRAMA Fluxograma 1 – Fracionamento da fração hexânica de S. pohlii. 22 VI RESUMO MORAES, Ana Carolina Gonzales. Desenvolvimento e validação de método analítico para a quantificação de egonol e homoegonol nos extratos de Styrax (Styracaceae) por cromatografia líquida de alta eficiência. 2012. 76f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade de Franca, Franca. A crescente utilização das plantas para fins terapêuticos têm-se destacado em todo o mundo nas últimas décadas. Em vários países, essa forma de terapia constitui o único recurso disponível para o tratamento primário da saúde. Portanto, há necessidade de se desenvolver e comprovar a qualidade das análises químicas desses produtos. Devido à ampla utilização na medicina popular de Styrax camporum em tratamentos de transtornos gastroduodenais, os objetivos deste trabalho foram desenvolver e validar uma metodologia analítica para a detecção e a quantificação dos marcadores químicos da espécie S. camporum por CLAEDAD, visando o controle de qualidade dessa espécie vegetal e de outras desse gênero. A cromatografia líquida de alta eficiência, no modo reverso de eluição, foi utilizada para obtenção de um cromatograma fringerprinting representativo do extrato padrão de S. camporum e para o desenvolvimento de uma condição isocrática para quantificar as norneolignanas presentes em espécies de Styrax. Os padrões egonol e homoegonol foram isolados de S. pohlii e usados no preparo das soluções padrão e controle de qualidade, as quais foram utilizadas para atender os requisitos: linearidade, seletividade, precisão e exatidão, limite de quantificação (LOQ) e detecção (LOD) e recuperação. Tendo em vista a comprovação da aplicabilidade do método desenvolvido, dois extratos brutos etanólicos de espécies Styrax, previamente preparados, S. pohliin e S. ferrugineus e o extrato das folhas secas de S. camporum foram utilizados para quantificar os padrões egonol (1) e homoegonol (2). A resposta do detector de UV a 311 nm foi linear de 0,36 - 42,00 µg/mL para 1 e 2 e as equações da reta encontradas foram y = 123.000 x – 2.743 e y = 93.490 x – 10.630 (r = 0.9999 e 0,9998, CV < 2 %), respectivamente. O método desenvolvido mostrou-se seletivo, específico, linear, preciso e exato para os dois marcadores propostos, sendo, portanto, passível de utilização no controle de qualidade de S. camporum e também de outras espécies deste gênero. Palavras-chave: Controle de qualidade, validação, CLAE-DAD, Styrax camporum, Styracaceae, nor-neolignanas. VII ABSTRACT MORAES, Ana Carolina Gonzales. Development and validation of an analytical method for the quantification of egonol and homegonol in extracts of Styrax (Styracaceae) by high performance liquid chromatography. 2012. 76f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade de Franca, Franca. The increasing use of plants for therapeutic purposes has been highlighted in worldwide in last decades. In several countries, this kind of therapy is the only available resource for primary care treatment. Thus, there is a requirement to develop and demonstrate the quality of chemical analysis of these products. Due to extensive use in folk medicine of Styrax camporum in the treatment of gastrointestinal disorders, the objectives of this study were to develop and validate an analytical methodology for detection and quantification of chemical markers of the species S. camporum by HPLC-PAD, aiming to control quality of this species and others from this genus. The high performance liquid chromatography reverse elution mode was used to obtain a fingerprinting chromatogram representative of the standard extract of S. camporum and to development an isocratic condition to quantify the norneolignans present in species of Styrax. The standards egonol and homoegonol were isolated from S. pohlii and used to meet the parameters: linearity, selectivity, precision and accuracy, limit of quantification (LOQ) and detection (LOD) and recovery. In order to prove the applicability of the developed method, two crude ethanolic extracts of Styrax species, previously prepared, S. pohlii and S. ferrugineus, and the extract form the leaves of S. camporum were used to quantify the standards egonol (1) and homoegonol (2). The response of the UV detector at 311 nm were linear from 0.36 to 42.00 μg/mL for 1 and 2. The regression equations found were y = 123,000 x – 2,743 and y = 93,490 x – 10,630 (r = 0.9999 and 0.9998, CV < 2%), respectively. The method developed proved to be selective, specific, linear, precise and accurate for both markers proposed, therefore, that can be used to control quality of S. camporum and also in other species of this genus. Keywords: Quality control, validation, HPLC-PAD, Styrax camporum, Styracaceae, norneolignans. Introdução 1 Introdução Introdução 2 1 INTRODUÇÃO 1.1 USO DE PLANTAS COM FINS TERAPÊUTICOS Pela observação e experimentação das plantas, os povos primitivos propagaram, de geração em geração, as propriedades terapêuticas de determinadas plantas, que se tornaram parte da cultura popular (Calixto, 2000; Turolla e Nascimento, 2006). Essas informações populares contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes terapêuticas dos vegetais e podem orientar pesquisas na área de produtos naturais, já que muitas espécies são usadas empiricamente, sem respaldo científico quanto à eficácia e segurança (Foglio et al., 2006). As plantas medicinais constituem uma alternativa medicamentosa bem aceita e acessível devido às vantagens em relação aos medicamentos obtidos por síntese química, como menores efeitos adversos comparadas com os fármacos sintéticos, preferência dos consumidores por tratamentos de origem natural e, principalmente, pelo custo mais baixo comparado com os medicamentos sintéticos (Cañigueral et al., 2003; Melo et al., 2007). A fitoterapia tem ressurgido como opção terapêutica e sua crescente utilização têm-se destacado em todo o mundo. Nos países em desenvolvimento, essa forma de terapia se constitui, muitas vezes, no único recurso disponível para o atendimento primário à saúde (Melo et al., 2007). A OMS (Organização Mundial de Saúde) vem, desde 1978, valorizando o uso da medicina tradicional em países em desenvolvimento. A OMS tem estimulado os países a identificar e explorar os aspectos da medicina tradicional que fornecem remédios ou práticas seguras e eficazes para a obtenção da saúde, os quais devem ser recomendados nos programas voltados para cuidados primários de saúde (Tomazzoni et al., 2006).O Brasil possui a maior biodiversidade do planeta, sendo estimada entre 15 e 20% de toda a biodiversidade mundial. Dados estatísticos indicam que existam 55 mil espécies de plantas (Barreiro e Bolzani, 2009). O uso de parte dessa biodiversidade com fins terapêuticos é uma prática antiga e, atualmente, Introdução 3 encontra-se em expansão. Dentro desse contexto, o Ministério da Saúde (MS) aprovou a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde (SUS), portaria nº 971 de 03/05/2006, com o intuito de valorizar a utilização de plantas medicinais no SUS. Entre as diretrizes dessa política, tem-se a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais e da Relação Nacional de Fitoterápicos, incentivo à pesquisa e desenvolvimento de plantas medicinais e fitoterápicos, priorizando a biodiversidade do país, e também, a garantia do monitoramento da qualidade dos fitoterápicos pelo Sistema Nacional de Vigilância Sanitária (Ministério da Saúde, Portaria nº 971, 2006). As pesquisas na área de produtos naturais contribuem também para o desenvolvimento de novos fármacos, sendo que, muitos dos medicamentos alopáticos, foram originalmente sintetizados para mimetizar ou otimizar a ação de seu precursor natural. O grande impacto recente de fármacos derivados de plantas foi, provavelmente, na área dos quimioterápicos com a introdução de vimblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), podofilotoxina e os análogos etoposídeo (VP-16-213; Vepeside®) e teniposídeo (VM-26; Vumon®), camptotecina e taxol (plaxitaxel; Taxol®) (Montanari e Bolzani, 2001). Cerca de 60 % dos medicamentos em ensaios clínicos, para diferentes tipos de câncer, são produtos naturais ou contém farmacóforos derivados de produtos naturais (Cragg et al., 1997; Cragg e Newman, 2000). No mercado mundial de medicamentos, estimado em cerca de 300 bilhões de dólares, aproximadamente 40 % destes são originados, direta ou indiretamente, de fontes naturais (sendo 75 % de origem vegetal e 25 % de origem animal e de micro-organismos). Estima-se que o mercado brasileiro de fitoterápicos movimente cerca de 22 bilhões de dólares por ano (Zuanazzi e Mayorga, 2010). Tendo em vista a crescente difusão e utilização das plantas medicinais, poucos estudos foram feitos a fim de se comprovar a garantia da eficácia, segurança e qualidade para a maioria desses produtos, dificultando a comercialização de fitoterápicos e a possibilidade de exportação destes (Pinto et al., 2002; Barnes, 2003). A falta de qualidade de um produto fitoterápico ou droga vegetal pode interferir na eficácia e segurança do produto. Portanto, é indispensável o desenvolvimento de métodos analíticos eficazes para o controle da qualidade destes produtos e também das análises químicas, pois, dados analíticos não confiáveis podem levar a decisões desastrosas e a prejuízos financeiros irrecuperáveis (Ribani et al., 2004). Introdução 4 1.2 CONTROLE DE QUALIDADE DAS PLANTAS MEDICINAIS As plantas possuem centenas de constituintes químicos e alguns deles estão presentes em baixas concentrações. Normalmente, tem mais de um composto ativo e, muitas vezes, o princípio ativo é desconhecido. Apesar dos procedimentos analíticos modernos, raramente, é possível uma investigação fitoquímica de sucesso, pelo isolamento e caracterização de todos os metabólitos secundários presentes no extrato vegetal (Calixto, 2000). Nesse contexto, a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massas (LC-MS) é uma técnica de grande valia no processo de identificação de substâncias conhecidas, pois permite comparar a amostra analisada com os principais bancos de dados de substâncias orgânicas (Bugni et al., 2008; Rodrigues et al., 2006). O acúmulo das substâncias presentes nas plantas é consideravelmente dependente de vários fatores que dificultam o controle de qualidade dos fitoterápicos. Fatores como o uso de plantas frescas, temperatura, luz, exposição à água, disponibilidade de nutrientes, variações sazonais, período da colheita, secagem, embalagem, armazenamento, transporte, parte da planta coletada, método de extração e preparação, etc., podem afetar significativamente a qualidade e, conseqüentemente, o efeito terapêutico. Todos esses fatores explicam a composição química variável da planta (Calixto, 2000; Li et al., 2008; Liang et al., 2004). Dessa forma, a normalização e o controle de qualidade de matérias-primas e preparações fitoterápicas devem ser permanentemente realizados. Os avanços que ocorreram nos processos de purificação e isolamento permitiram estabelecer estratégias apropriadas para a análise da qualidade e padronização das plantas medicinais, a fim de manter quanto possível à homogeneidade do extrato vegetal (Calixto, 2000). O emprego de técnicas cromatográficas hifenadas que possibilitam a separação, identificação e o isolamento de substâncias de um extrato vegetal mostra-se necessário, tanto para a determinação da composição química do princípio ativo e/ou de uma substância tóxica de uma planta, como também para a determinação de uma substância, ou grupo de substâncias, que sirva como marcadora daquela espécie, para controle qualitativo e Introdução 5 quantitativo, propiciando a padronização do material vegetal e produtos relacionados (SouzaMoreira, 2010; Calixto, 2000). Dentre as técnicas mais importantes, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) pode ser utilizada para a padronização e controle de qualidade da matéria-prima e fitoterápicos (Calixto, 2000). A CLAE é o método freqüentemente utilizado devido a sua versatilidade, facilidade de execução, alta resolução na separação, não é limitado pela volatilidade ou estabilidade do composto analisado, pode-se trabalhar em escala analítica e preparativa, é um método eficiente, rápido e reprodutível (Liang et al., 2004; McMaster, 2007). A CLAE combinada ao detector de arranjo de diodos (DAD) é uma técnica útil, pois pode fornecer numerosas informações sobre os metabólitos, antes mesmo do seu isolamento, permite otimizar a condição cromatográfica, diminuindo o tempo de análise, possui uma boa capacidade de separação cromatográfica, fornece o espectro de UltravioletaVisível (UV-Vis) (Espada et al., 2008; Liang et al., 2004). Essa técnica é amplamente utilizada na análise de produtos naturais que apresentem grupos cromóforos que propiciam a absorção de luz na região do UV-Vis. Este detector realiza uma varredura que se estende de 200-800 nm e permite a obtenção de espectros de UV-Vis das bandas cromatográficas. O baixo preço deste equipamento em relação aos outros detectores foi a principal causa para seu sucesso, contudo, a necessidade de maiores informações sobre as estruturas moleculares de cada substância na amostra analisada levou ao desenvolvimento de técnicas hifenadas mais modernas, como o acoplamento da CLAE com o espectrômetro de massa e com a ressonância magnética nuclear (Pinto et al., 2002; Rodrigues et al., 2006). Desse modo, a CLAE pode ser usada para análise quali e quantitativa de extratos de origem vegetal, pois sua alta resolução permite a separação de misturas complexas de substâncias, oferece uma caracterização completa da planta ou do produto analisado e permitir a distinção entre espécies vegetais próximas. Auxilia ainda na detecção de adulterantes e na identificação de drogas vegetais baseada no Fingerprint químico (impressão digital) da amostra analisada pela comparação com padrões e/ou marcadores (Liang et al., 2004; Liang et al., 2010; Souza-Moreira, 2010). A técnica de Fingerprint químico é amplamente utilizada no controle de qualidade de medicamentos fitoterápicos. A “impressão digital” química gerada nesses Introdução 6 experimentos fornece uma medida da semelhança e da abundância de componentes específicos entre as amostras, além de definir rapidamente a composição química do extrato vegetal e gerar pontuações de similaridade (Liang et al., 2004). Os extratos, nessa técnica, são analisados normalmente por CLAE acoplada a diferentes detectores que geram perfis químicos únicos, que são usados para comparar a qualidade e composição da amostra em relação a extratos padrões. Os dados são processados com o auxílio de algoritmos que permitem a comparação precisa e reprodutível de amostras analisadas em ocasiões diferentes. Então, é possível detectar a presença de marcadores químicos dentro de uma amostra e estes são, então, selecionados para a quantificação. (Sahoo et al., 2010; Li et al., 2008). 1.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO A validação analítica é um método dinâmico e imprescindível para demonstrar, através de evidências experimentais, que o método atende às exigências das aplicações analíticas, assegurando atingir os padrões adequados de exatidão, precisão e confiabilidade (Silva et al., 2006; Alencar et al., 2004). Deve ser demonstrado que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em laboratório de produtos farmacêuticos (Randau et al., 2005). Para tanto, alguns parâmetros devem ser analisados: especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequado à análise, demonstrando confiabilidade do método. Esses procedimentos estão descritos em vários guias de agências reguladoras (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003; ICH,1996; USP, 2005). Entretanto, nenhum desses guias especifica as regulamentações para fitoterápicos e matérias-primas vegetais. Desta forma, os parâmetros de qualidade estão fundamentados naqueles recomendados para medicamentos. I. Especificidade / Seletividade: capacidade de detectar, de forma inequívoca, a presença de uma substância na presença de componentes, tais como impurezas, produtos de Introdução 7 degradação e componentes da matriz, que podem interferir com a sua determinação em uma amostra complexa. A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse (USP,1999; Vessman et al., 2001; ANVISA, 2003). Diversos métodos podem ser empregados no estudo da seletividade. Através da comparação da matriz isenta da substância de interesse e a matriz adicionada com esta substância, sendo que, nenhum interferente deve sofrer eluição juntamente com a substância de interesse. Por meio de detectores modernos (DAD, arranjo de diodos) pode-se correlacionar a área de pico da substância de interesse com a pureza do mesmo. E também, pelo método de adição de padrão, a partir do qual se constrói uma curva analítica com adição da substância de interesse na amostra e compara-se com a curva analítica sem a presença da matriz, caso elas sejam paralelas, pode-se dizer que o método é seletivo (Ribani et al., 2004). II. Linearidade: refere-se à capacidade da metodologia analítica gerar resultados diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de uma faixa de confiança para qual o método é satisfatório (ANVISA, 2003; INMETRO, 2003). A fórmula matemática que relaciona a resposta do detector (y) e a concentração do analito (x) na amostra é a equação da reta: y = ax + b Onde: y: resposta medida (absorbância, altura ou área do pico) x: concentração do analito a: inclinação da reta (coeficiente angular) b: intersecção da curva no eixo y (coeficiente linear) Para estimar a qualidade da curva analítica obtida utiliza-se o coeficiente de correlação r. Quanto mais próximo de 1 for esse parâmetro, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados. O critério mínimo aceitável pela ANVISA deve ser igual a 0,99 e o INMETRO recomenda um valor acima de 0,90 (ANVISA, 2003; INMETRO, 2003). Introdução 8 III. Precisão: avalia a proximidade dos resultados obtidos entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra semelhantes ou padrões, em condições definidas, sendo usualmente expressa como desvio padrão (S) ou desvio padrão relativo (DPR), também conhecido como coeficiente de variação (CV %). Desvio padrão: S = Coeficiente de variação: CV % = Onde: : média aritmética de um pequeno número de determinações : valor individual de uma medição : número de medições : desvio padrão A precisão pode ser medida em três níveis (ANVISA, 2003; ICH, 1996): a) Repetibilidade: concordância dos resultados dentro de um pequeno espaço de tempo com as mesmas condições de operação (analista, equipamento, reagentes). Recomenda-se a análise de no mínimo nove determinações com três concentrações, baixa, média e alta ou seis determinações a 100% da concentração do teste. b) Reprodutibilidade: variação inter-laboratorial dos resultados obtidos. Exigida em casos de inclusão da padronização de procedimentos analíticos nos compêndios e farmacopéias. c) Precisão intermediária: concordância dos resultados obtidos no mesmo laboratório, porém com alguma variação, podendo ser diferentes dias ou diferentes analistas ou diferentes equipamentos ou uma combinação destes fatores. Segue as mesmas recomendações para o cálculo de repetitividade descrita acima. Introdução 9 IV. Exatidão: demonstra o grau de proximidade entre os resultados experimentais e um valor de referência aceito como verdadeiro, obedecendo a intervalos de segurança. São necessárias nove análises com três concentrações diferentes (baixa, média e alta) (ANVISA, 2003; ICH, 1996). Geralmente, os métodos utilizados para avaliar a exatidão são: uso de materiais de referência, participação em comparações inter-laboratoriais e execução de ensaios de recuperação (INMETRO, 2003; Thompson et al., 2002). A expressão matemática utilizada é a seguinte: Exatidão = V. Recuperação: utilizada para avaliar a quantidade de determinado analito recuperado no processo, em relação à quantidade real presente na amostra. Este parâmetro permite avaliar a perda da substância devido à baixa recuperação da extração, medidas volumétricas imprecisas ou interferentes na amostra. Através da comparação da resposta de uma amostra enriquecida com a não enriquecida, é possível determinar o percentual recuperado pelo processo. São desejáveis valores próximos de 100 %, porém se aceita uma variação de até 15 % sendo mais importante o enriquecimento ser preciso, exato e reprodutível (ANVISA, 2003; Chasin et al.,1998; Causon, 1997; Brito et al., 2003). Para cálculo da porcentagem faz-se uso da seguinte fórmula: % Recuperação = VI. Limite de Detecção (LOD): refere-se à menor quantidade da substância em análise que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, sob as condições experimentais estabelecidas, segundo a seguinte fórmula (ANVISA, 2003; Ribani et al., 2004). LOD = Introdução 10 VII. Limite de Quantificação (LOQ): é definido como a menor concentração do analito de interesse em uma amostra, que pode ser quantitativamente determinado com valores aceitáveis de precisão e exatidão (Cassiano et al., 2009). O LOQ pode ser calculado por meio do sinal/ruído, do desvio-padrão e por processos estatísticos. LOQ = 1.4 FAMÍLIA STYRACACEAE As Styracaceae são plantas arbustivas ou arbóreas, as quais possuem 160 espécies agrupadas em 11 gêneros (Dickison, 1993; Fritsch et al., 2001). O gênero Styrax L. possui 130 espécies, que compreende cerca de 80 % do total de espécies da família Styracaceae, as quais estão distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais, como no Sudeste da Ásia, Oeste da Malásia e Américas (Hutchinson, 1973; Nakajima e Monteiro, 1986; Dickison, 1993). No Brasil, são encontradas cerca de 25 espécies desse gênero, sendo que quatro estão presentes nos cerrados brasileiros: Styrax camporum Pohl., S. ferrugineus Nees et Mart., S. pohlii A. DC. e S. martii Seub. (Nakajima e Monteiro, 1986; Saraiva et al., 1988). Figura 1. Styrax camporum Pohl. Fonte: Lorenzi, 1982. Introdução 11 Styrax distingue-se dos outros gêneros de Styracaceae, devido à produção de material resinoso, vulgarmente chamado como resina de benjoim, normalmente secretada quando se fere a casca da árvore. Essa resina tem sido utilizada em várias partes do mundo em produtos de perfumaria, cosméticos e na medicina popular como expectorante (Costa, 1996), pois possui atividade fungicida, bacteriostática e é utilizada nas preparações inalatórias para bronquite, asma, e outras doenças respiratórias (Steiner e Leifer, 1949; Hjorth, 1961). Por outro lado, a alergia à tintura de benjoim tem sido reportada, embora não seja de forte sensibilização (Scardamaglia et al., 2003). As plantas desse gênero acumulam diversas classes de compostos como saponinas, triterpenos, lignanas e neolignanas (Pauletti et al., 2006). Estas substâncias apresentam diversas atividades biológicas, as saponinas, por exemplo, possuem atividade fungistática (Zehavi et al., 1986; Segal et al., 1966) e antiinflamatória (Min et al., 2004a). Dentre os efeitos farmacológicos dos triterpenos, destacam-se a atividade no sistema complemento, sendo um indicativo de atividade na terapia de doenças inflamatórias (Min et al., 2004a), citotóxica (Kim et al., 2004), efeitos inibitórios contra a matriz metaloproteinase (MPP)-1 (Moon et al., 2005; Kim et al., 2004) e antiinflamatória (Yun et al., 2007). Em especial as lignanas e neolignanas têm atraído a atenção de pesquisadores devido às diversas atividades biológicas apresentadas (Simões, 2004), dentre elas, destacamse se as atividades antibacteriana e antifúngica (Pauletti et al., 2000), antioxidante (Min et al., 2004b), antihipertensiva (Kakie et al., 1994) e antiinflamatória (Min et al., 2004a). A espécie Styrax camporum Pohl (Figura 1, p. 10), conhecida como "estoraque do campo", "cuia de brejo" e "benjoeiro'', amplamente utilizada em doenças gastroduodenais na medicina popular, teve seu potencial antiulcerativo e toxicidade avaliados. A administração oral a ratos, durante 30 dias, do extrato seco dos seus galhos (70 % etanol), diminuiu o tamanho da úlcera induzida por ácido acético e o volume da secreção ácida e aumentou o número de fibras colágenas. Esses estudos confirmaram a sua eficácia no combate de úlceras estomacais (Bacchi e Sertie, 1994; Bacchi et al., 1995). Outras espécies de Styrax, como S. pohlii e S. ferrugineus também são empregadas na medicina popular no tratamento de febres (Lorenzi, 1982; Rodrigues e Carvalho, 2008). Na indústria de perfumes e cosméticos, a resina balsâmica conhecida como benjoim, é a matéria-prima principal para a obtenção do ácido benzóico. Na medicina Introdução 12 tradicional é utilizado como adjuvante para inalação das vias respiratórias devido às suas propriedades expectorantes e é comercializada no Brasil (Pauletti et al., 2002). 1.5 LIGNÓIDES O termo lignóide é uma designação genérica, que caracteriza um grupo de metabólitos secundários, cujo esqueleto é formado exclusivamente pelo grupo fenilpropânico (C 6 -C 3 ) n (Figura 2, p. 13), sendo n restrito a poucas unidades (Ward, 1999). Dentre os lignóides, destacam-se as lignanas e neolignanas. As lignanas são dímeros, derivados da condensação por acoplamento oxidativo, de álcoois cinamílicos entre si ou destes com ácidos cinâmicos, cujo carbono γ ou 8 (C3) da cadeia lateral encontra-se oxidado (Ward, 1999). Assim, as lignanas são biossintetizadas através da dimerização, por acoplamento oxidativo, de unidades fenilpropanoídicas (C 6 C 3 ), através da ligação do C 8 -C 8’ formando uma variedade de subclasses estruturalmente bem distintas (Figura 2, p. 13). Já as neolignanas são dímeros, derivados da condensação por acoplamento oxidativo de alil e/ou propenil fenóis e, ao contrário das lignanas, são isentas de oxidação no carbono γ ou 8 (Figura 3, p. 14) (Gottlieb, 1978). Quando há perda de um ou mais átomos de carbono na estrutura química de uma lignana ou neolignana, é representado pelo prefixo nor (Moss, G.P., 2000). Introdução 13 6 5 9 8 7 4 1 2 3 Fenilpropanóide 9 2 3 5 8' 8 1 4 9' 7 6 2' 1' 7' 7' 1 9 4' 6' Lignana 7 8 3' 2' 2 9' 3 3' 6 5' 6 2 3 8 8' 2' 1 4 9' 7 5 2 1' 7' N or-lignana 2' 6' 6' 9 7' 3 4' 1' 8 4 3' 5' 7 1 5 9 6' 4 4' Neolignana 5 8' 1' 5' 3' 4' N or-neolignana 5' Figura 2. Estrutura química da unidade fenilpropanoídica, lignana , neolignana, nor-lignana e nor-neolignana. Os lignóides são amplamente distribuídas no reino vegetal e podem ser encontradas nas raízes, hastes, cascas, frutas e sementes de muitas espécies de plantas (Macrae e Towers, 1984; Gottlieb e Yoshida, 1989), possuindo diferentes níveis de oxidação, modo de substituição e estrutura química. No gênero Styrax, a classe de lignóides mais encontrados são as norneolignanas benzofurânicas: egonol (1), homoegonol (2) (Figura 3, p. 14) e seus derivados. Em 1915, foi isolado pela primeira vez o egonol a partir de sementes de S. japonicum (Okada, 1915) e Kawai e Sugiyama identificaram sua estrutura como sendo 5-(3´´-hidroxipropil)-2(3´,4´-metilenodioxifenil)-7-metoxibenzofurano (Kawai e Sugiyama, 1939). Foram identificadas outras substâncias como: o homoegonol, isolado de S. officinalis (Segal et al., 1967), desmetoxi egonol (1a) de S. obassia (Takanashi et al., 1974), glicosídeos benzofurânicos (1d-1e; 2a) de S. officinalis (Anil, 1980), e ésteres benzofurânicos (1b-1c) de S. obassia (Takanashi et al., 1988). Introdução 14 R3 R1 O O O R2 R1 R2 R3 (1) Egonol CH2OH OCH3 H (1a) Desmetoxi egonol CH2OH H H OCH3 H H H (1b) Egonol 2-metilbutanoato H2CO O (1c) Desmetoxi egonol 2-metilbutanoato H2CO O (1d) Egonol-β-gentiobiosídeo CH2O- Gentiobiosil OCH3 H (1e) Egonol-β-gentiotriosídeo CH2OH- Gentiotriosil OCH3 H CH2O-Glucose OCH3 H (1f ) Egonol-β-glicosídeo R2 OCH3 R1O OCH3 O R3 (2) Homoegol (2a) Homoegonol-β-gentiobiosídeo (2b) Homoegonol-β-glicosídeo R1 R2 R3 H H OCH3 Gentiobiosil H OCH3 Glucosil H OCH3 Figura 3. Lignanas isoladas de Styrax. O egonol, homoegonol e seus derivados juntamente com o egonol-β-glicosídeo (1f) e o homoegonol-β-glicosídeo (2b) apresentaram atividade antibacteriana e antifúngica contra Staphylococcus aureus e Candida albicans (Pauletti et al., 2000). A citotoxicidade do egonol e homoegonol foi avaliada frente a três linhagens celulares Hep-2, HeLa, e C6, sendo que apresentaram atividade moderada (Teles et al., 2005). Adicionalmente, o egonol inibiu a Introdução 15 atividade hemolítica do sistema complemento, este tipo de inibição é benéfico na terapia das doenças inflamatórias (Min et al., 2004a). Assim, devido a ampla ocorrência das norneolignanas benzofurânicas em espécies de Styrax estas podem ser consideradas os marcadores quimiossistemáticos do gênero (Pauletti et al, 2006). A necessidade de determinação e conhecimento dos principais constituintes químicos (padrões ou marcadores), bem como a padronização desses constituintes (responsáveis ou não pela atividade terapêutica) para se assegurar a qualidade, a repetibilidade e minimizar os efeitos adversos promovidos por extratos de plantas medicinais e fitoterápicos torna-se fundamental o desenvolvimento de métodos analíticos confiáveis (Hosttettman e Marston, 2002). Deste modo, devido à ampla utilização, na medicina popular, de espécies de Styrax faz-se necessário desenvolver e validar uma metodologia analítica para detecção e quantificação de egonol (1) e homoegonol (2), os principais compostos encontrados nas espécies de Styrax, S. camporum, S. ferrugineus e S. pohlii. Objetivos 16 Objetivos Objetivos 17 2 OBJETIVOS O presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e validação de um método analítico para o controle de qualidade de extratos vegetais de espécies de Styrax, principalmente, S. camporum. Para esse propósito, os objetivos específicos foram: • Extração e isolamento dos marcadores químicos, egonol e homoegonol, do extrato etanólico de S. pohlii; • Avaliação do perfil químico do extrato padrão de S. camporum por CLAE- • Identificação dos marcadores químicos por DAD; • Otimização da condição cromatográfica para detecção e quantificação dos DAD; compostos; • Preparo dos padrões para obtenção da curva analítica por padronização externa e por adição de padrão; • Validação da metodologia analítica desenvolvida de tal forma que sejam satisfeitos os requisitos: linearidade, seletividade, precisão e exatidão, limite de quantificação (LOQ) e detecção (LOD) e Recuperação. • Análise e quantificação dos extratos obtidos, caules e folhas de S. camporum, partes aéreas de S. ferrugineus e S. pohlii. • Aplicação da metodologia analítica desenvolvida. Parte Experimental 18 Parte Experimental Parte Experimental 19 3 PARTE EXPERIMENTAL 3.1 EQUIPAMENTOS • Evaporador rotativo (Büchi, Switzerland ) • Speed Vac (Thermo Electron Corporation, Waltham, EUA); • Banho ultrassônico (Unique, modelo USC-1400, Indaiatuba, Brasil); • Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear de 1H (Bruker, modelo Ac-200, Billerica, EUA) - IQ-USP - São Carlos; • Sistema Direct-Q-UV (Millipore, Billerica, USA); • Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência de sistema binário (LC-6AD), equipado com um injetor manual Rheodyne com alça de amostragem de 20 µL, desgaseificador DGU-20A5, e acoplado a um detetor PDA série SPDM-20A, com aquisição de dados através de um microcomputador, com software LCsolution (Shimadzu, São Paulo, Brasil); • Lâmpada UV (Spectroline, modelo ENF-240C, USA) • Balança analítica (UMark, 250A Bel Engineering, São Paulo, Brasil) 3.2 MATERIAIS • Solventes grau P.A. (Synth, São Paulo, Brasil); • Clorofórmio deuterado (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA); • Metanol grau HPLC (J.T. Baker); • Filtro de membrana de Nylon 66, 0,45 µm x 47 mm (Supelco); • Filtro de membrana de PVDF, 0,45 µm x 13 mm (Supelco); Parte Experimental 20 • Sílica gel 60, 230-400 mesh, (ASTM, Sigma-Aldrich, St Louis, USA), Sílica GF254 (Sigma-Aldrich) e G (Sigma-Aldrich); • Coluna ODS, 5 μm, 250 mm x 4,60 mm (Shimadzu Shim-pack) equipada com pré-coluna do mesmo material; • Solução de vanilina preparada da seguinte forma: pesou-se 0,3 g de vanilina dissolveu-se em 30 mL de uma solução de água (450 mL), ácido sulfúrico (400 mL) e metanol (450 mL). 3.3 MATERIAL VEGETAL As partes aéreas das espécies S. pohlii A. DC., S. camporum Pohl e S. ferrugineus Ness et Mart. foram coletadas na Estação Ecológica do Jataí (EEJ), no município de Luis Antônio (21°33’ a 21°37’ sul e 47°45’ a 47°57’ oeste, em outubro de 2008 e abril de 2009, respectivamente). As exsicatas (SPFR12168, SPFR12170, SPFR12169, respectivamente) foram identificadas pela Profa. Valéria Maria Melleiro Gimenez e pelo Prof. Milton Groppo e depositadas no Herbário do Departamento de Biologia, Laboratório de Sistemática Vegetal, da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil (SPFR). 3.4 OBTENÇÃO DOS PADRÕES Para reisolamento dos padrões egonol (1) e homoegonol (2) utilizou-se a espécie S. pohlii. Assim, após o processo de secagem (40° C) e trituração em moinho de facas, 2,4 kg das partes aéreas foram submetidas à extração ambiente, por maceração com etanol durante, aproximadamente, três dias, com três repetições. Em seguida, o extrato obtido foi filtrado em papel de filtro e o solvente foi removido sob pressão reduzida, o que resultou em 87 g de extrato bruto. Parte Experimental 21 O extrato etanólico (40 g) foi dissolvido em metanol-água (2:8, v/v) e submetido à partição líquido-líquido com n-hexano. Após evaporação do solvente, através de evaporador rotativo, a partição rendeu 2,8 g. Desta fração n-hexânica, 1,39 g foi submetido a cromatografia em coluna com 28,1 g de sílica gel 70-230 Mesh-ASTM (60 Å, Sigma-Aldrich) em coluna de 1,5 cm de diâmetro e 47 cm de altura. A fase móvel n-hexano-AcOEt foi utilizada em ordem crescente de polaridade: n-hexano (300 mL), n-hexano:AcOEt (9:1, 300 mL; 8:2, 400 mL; 7:3, 300 mL; 6:4, 200 mL; 5:5, 100 mL; 3:7, 200 mL; v/v) AcOEt (100 mL) e MeOH (100 mL). Deste procedimento, foram obtidas 111 subfrações, de 20 mL cada, que após análise por CCDC [n-hexano-AcOEt, 8:2 e 7:3 (v/v)] foram agrupadas em 31 subfrações (Fluxograma 1, p. 21). Nas subfrações 69-80 e 92-100 identificou-se a presença de duas substâncias diferentes sendo, assim, purificadas por CCDP com fase móvel DCM-MeOH (98:2, v/v), sendo que, da subfração 69-80, originou-se a substância 2 (m= 22 mg) que foi analisada por CLAE-UV e apresentou t R de 25,60 min, sendo identificada por RMN 1H. Na subfração 92100 foi identificada a presença de 1 (m= 27 mg) que ao ser analisada por CLAE-UV, gerou uma banda cromatográfica com t R de 22,02 min. Essa substância foi identificada por experimentos de RMN 1H. Parte Experimental 22 Fração n-hexano m=1,39g CC (n-hexano:AcOEt) 111 Subfrações Agrupamento em 31 Subfrações CCDC (n-hexano:AcOEt) Subfr. 92-100 Subfr. 69-80 CCDP(DCM:MeOH) Subfr. 1 m = 27 mg 1 Subfr. 1 m = 22 mg 2 Fluxograma 1. Fracionamento da fração hexânica de S. pohlii. 3.5 PREPARO DOS PADRÕES E AMOSTRA 3.5.1 Preparo da solução estoque de egonol e homoegonol Preparou-se uma solução dos padrões 1 e 2 (5,0 mg/mL cada) em metanol (1 mL). A partir desta solução, uma solução estoque (84 μg/mL) foi preparada em metanol-água (95:5, v/v) em balão volumétrico. A partir dessa solução, sete soluções padrão nas concentrações de 0,36, 1,47, 5,25, 10,50, 21,00, 33,60 e 42,00 μg/mL foram obtidas. Para o preparo das soluções controle de qualidade foram feitas soluções nas concentrações de 10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL a partir da solução estoque. Parte Experimental 23 3.5.2 Preparo do extrato padrão dos caules de S. camporum Pesou-se exatamente 1 g de pó seco dos caules de S. camporum e extraiu-se com 10 mL de diclorometano através de banho ultrasônico. Depois de 10 minutos, a solução foi filtrada em papel de filtro e concentrada em Speed Vac. Em seguida, o material foi ressuspendido em 3 mL de metanol-água (95:5, v/v). 3.5.3 Preparo das amostras O pó das folhas secas de S. camporum (1 g) foi extraído em 10 mL de diclorometano com o banho ultrasônico. Depois de 10 minutos, a solução foi filtrada em papel de filtro e concentrada usando Speed Vac. O material foi ressuspendido em 3 mL de metanolágua (95:5, v/v). Os extratos brutos etanólicos das partes aéreas de S. ferrugineus e S. pohlii (4,0 mg/mL de cada), anteriormente produzidos pelo nosso grupo de pesquisa, foram preparados em 1,0 mL de metanol-água (95:5, v/v). 3.6 CONDIÇÕES DE ANÁLISE EM CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADO A DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-DAD) Estudos preliminares foram feitos utilizando um gradiente exploratório contendo metanol-água (+ 0,1 % de ácido acético) de 5 % a 100 % de metanol em 50 minutos, 100 % de metanol durante 10 min. O tempo de análise total foi de 78 min, incluindo 3 min para retornar a condição inicial e 15 min de equilíbrio. A detecção feita em 311 nm com um fluxo de 1,0 mL/min. Na tentativa de melhorar as condições de análise, o seguinte gradiente foi empregado: metanol-água (+ 0,1 % de ácido acético) de 50 % a 100 % de metanol em 30 min, Parte Experimental 24 100 % de metanol durante 5 min, incluindo 3 min para retornar a condição inicial e 15 min de equilíbrio. A detecção feita em 311 nm com um fluxo de 1,0 mL/min. A fase móvel usada no desenvolvimento e validação do método para quantificação de 1 e 2 foi composta de metanol-água-ácido acético (73:26,9:0,1, v/v/v) e fluxo de 1,0 mL / min. Os espectros de UV foram registrados entre 200-400 nm e a detecção feita em 311 nm. 3.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO A validação do método analítico foi realizada de acordo com os requisitos do Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos publicados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, RE 899, 2003). 3.7.1 Curva analítica por padronização externa Para a construção da curva de calibração por padrão externo utilizou-se sete concentrações diferentes de cada padrão, obtidas através de diluições da solução estoque (84 μg/mL) em metanol-água (95:5, v/v). As soluções contendo 0,36, 1,47, 5,25, 10,5, 21,0, 33,6 e 42,0 μg/mL de 1 e 2, foram injetadas em triplicata para obter a curva de calibração e, assim, determinar a linearidade do método. A curva de calibração foi obtida plotando a área do pico versus a concentração em μg/mL do composto, com a ajuda do programa GraphPad Prism. A linearidade foi obtida a partir do valor do coeficiente de correlação (r). 3.7.2 Curva de adição de padrão Parte Experimental 25 Alíquotas de 300 µL das soluções-padrão nas concentrações de 10,5, 21,0, 33,6, 42,0, 50,4 e 67,2 μg/mL de 1 e 2 foram transferidas para tubo Falcon com o auxílio de uma micropipeta, concentradas utilizando um concentrador Speed Vac. Em seguida, foi adicionada uma quantidade constante de 50 µL do extrato padrão dos caules de S. camporum e 250 µL de metanol-água (95:5, v/v). As soluções foram injetadas em triplicata. A curva de calibração por adição de padrão foi construída pelo programa GraphPad Prism. A linearidade foi obtida através do valor do coeficiente de correlação (r). 3.7.3 Seletividade Para avaliar a seletividade do método, o detector de arranjo de fotodiodo (DAD) foi usado para identificar o egonol e o homoegonol e verificar a pureza desses padrões nos extratos a partir das áreas dos picos correspondentes. Os tempos de retenção dos padrões 1 e 2 foram empregados para a identificação dos mesmos no cromatograma obtido para os extratos. 3.7.4 Recuperação A eficiência da extração do egonol e homoegonol foi determinada a partir das três soluções de controle de qualidade, 10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL que foram adicionadas a amostras de 1 g de pó seco dos caules de S. camporum, extraídas com 10 mL de DCM em banho ultrassônico por 10 min. O solvente foi evaporado em Speed Vac e o material ressuspendido em 3 mL de metanol-água (95:5, v/v), para então serem analisadas em quintuplicata. O percentual de recuperação foi determinado comparando-se as áreas das bandas cromatográficas das amostras que foram tratadas com os resultados obtidos a partir da análise das amostras que não foram tratadas. % Recuperação = Parte Experimental 26 3.7.5 Precisão (inter e intra-dia) A precisão do método foi determinada avaliando-se em quintuplicata as três soluções controle de qualidade (10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL), em três dias não consecutivos. A precisão e repetibilidade foram confirmadas pelo valor do desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV %) dos ensaios intra e interdias. O DPR foi calculado pelo desvio padrão (s) sobre o valor médio medido multiplicado por 100 sendo admitidos valores de CV % menores ou iguais a 5 % (ANVISA, 2003). Coeficiente de variação: CV % = 3.7.6 Exatidão A exatidão do método foi verificada a partir da análise em quintuplicata das soluções controle de qualidade (10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL). A exatidão foi expressa pela relação entre o valor médio das concentrações encontradas e o valor da concentração teórica multiplicado por 100. Para a exatidão foram aceitos valores menores ou iguais a 20 % (ANVISA, 2003). Exatidão = 3.7.7 Limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) Parte Experimental 27 O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) foram determinados de acordo com a curva de calibração, como LOD = 3 x (s/IC) e LOQ = 10 x (s/IC), onde s é o desvio padrão do branco e IC é a inclinação da curva de calibração. LOD = LOD = Resultados e Discussão 28 Resultados e Discussão Resultados e Discussão 29 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS DE Styrax Os compostos egonol (1) e homoegonol (2) (Figura 4, p. 29) foram eleitos como marcadores químicos dos extratos de Styrax, pois, até o momento da realização deste trabalho não havia relatos na literatura sobre qual substância, em particular, poderia estar relacionada à propriedade antiulcerativa atribuída à espécie S. camporum (Moraes et al., 2011). Assim, devido à ampla ocorrência das nor-neolignanas benzofurânicas em espécies de Styrax estas foram escolhidas como padrão externo no desenvolvimento e validação de um método cromatográfico para análise de extratos de Styrax. Com base nos R f das cromatoplacas, nos tempos de retenção (t R1 12,07 min e t R2 20,92 min) dos cromatogramas preliminares obtidos por CLAE-DAD, nos espectros de UV-Vis e em comparação com padrões disponíveis no nosso laboratório, constatou-se que o egonol e homoegonol, compostos de média polaridade, eram acessíveis em maior quantidade e facilidade no extrato bruto etanólico de S. pohlii. Assim, este extrato foi submetido a processo de partição líquido-líquido e a fração hexânica rica nesses compostos foi purificada por coluna cromatográfica seguida de uma CCDP. Os compostos isolados foram identificados por análise de RMN 1H e suas estruturas foram confirmadas por comparação com dados espectrais disponíveis na literatura (Schreiber e Stevenson, 1976; Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000). 1" 3' HO 2' 4 9 3 2'' 5 6 7 8 O 2 OCH3 1 3'' O 1 6'' 4'' 5'' 1" 3' O HO 2' 4 9 3 2'' 5 6 7 O 8 2 6'' OCH3 3'' OCH3 1 4'' 5'' 2 Figura 4. Estruturas químicas de egonol (1) e homoegonol (2). OCH3 Resultados e Discussão 30 O espectro de RMN 1H de 1 (Figura 5, p. 32, Tabela 1, p. 31) apresentou sinais na região correspondente a hidrogênio de anel aromático. O sinal em δ 7,39 foi atribuído ao H-6′ (dd, J = 8,1 e 1,7, 1H) e os valores das constantes de acoplamento indicaram acoplamentos em posição orto e meta respectivamente com o H-5′ (δ 6,86, d, J = 8,1, 1H) e o H-2′ (δ 7,32, d, J = 1,7, 1H), revelando um anel aromático trissubstituído. Os sinais dos hidrogênios H-4 (δ 6,96, d, J = 1,4, 1H) e H-6 (δ 6,63, d, J = 1,4, 1H) indicaram a presença de um acoplamento meta e a presença de um anel aromático tetrassubstituído. Os sinais em δ 2,77 (t, J = 7,6, 2H), δ 1,95 (m, 2H) e δ 3,70 (t, J = 6,2, 2H) indicaram a presença de uma cadeia alifática. Os singletos em δ 6,78 (H-3) e em δ 6,00 (s, 2H) e δ 4,03 (s, 3H) indicaram a presença de anel benzofurânico, um grupamento metilenodioxi e uma metoxila ligados a anel aromático, respectivamente. Esses dados confirmaram a presença de uma nor-neolignana tipo benzofurânica comumente encontrada em espécies de Styrax, o egonol (1). O espectro de RMN 1H de 2 (Figura 6, p. 33, Tabela 1, p. 31), apresentou sinais semelhantes aos da substância 1. Sendo que o sinal em δ 7,45 foi atribuído ao H-6′ (dd, J= 8,5 e 2,0, 1H) e os valores das constantes de acoplamento indicaram o mesmo tipo de acoplamentos, isto é, em posição orto e meta com o H-5′ (δ 6,93, d, J= 8,5, 1H) e o H-2′ (δ 7,37, d, J=2,0, 1H) revelando um anel aromático trisubstituído. Adicionalmente, os sinais dos hidrogênios H-4 (δ 6,98,d, J= 1,5, 1H) e H-6 (δ 6,65, d, J=1,5, 1H) e os valores das constantes de acoplamento evidenciaram acoplamento em meta e indicaram a presença de outro anel aromático tetrasubstituído. O singleto em δ 6,83 (1H), foi atribuído ao hidrogênio do anel benzofurano. Os sinais em δ 3,71 (t, J=6,4, 2H), δ 2,79 (t, J=7,6, 2H) e δ 1,96 (m, 2H) indicaram uma cadeia alifática. Os singletos integrados para 3H em δ 4,03, δ 3,98 e δ 3,93 confirmaram a presença de três metoxilas. Esses dados quando analisados em conjunto com os valores disponíveis na literatura (Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000; Schreiber e Stevenson, 1976) permitiram identificar a estrutura do homoegonol, uma nor-neolignana de ampla ocorrência em espécies de Styrax. Resultados e Discussão 31 Tabela 1. Dados de RMN 1H (200 MHz) das substâncias 1 e 2 e comparação com a literatura (CDCl 3 , 200 MHz). 1 1* 2 2** δ, m, J (Hz) δ, m, J (Hz) δ, m, J (Hz) δ, m, J (Hz) 3 6,78 s 6,76 s 6,83 s 6,75s 4 6,96 d (1,4) 6,91 d (2,0) 6,98 d (1,5) 6,90 d (2,0) 6 6,63 d (1,4) 6,57 d (2,0) 6,65 d (1,5) 6,60 d (2,0) 2´ 7,32 d (1,7) 7,29 d (2,0) 7,37 d (2,0) 7,29 d (2,0) 5´ 6,86 d (8,1) 6,83 d (2,0) 6,93 d (8,5) 6,80 d (8,0) 6´ 7,39 dd (8,1 e 1,7) 7,39 dd (2,0; 8,0) 7,45 dd (8,5 e 2,0) 7,35 dd (2,0; 8,0) 1´´ 2,77 t (7,6) 2,82 t (8,0) 2,79 t (7,6) 2,79 t (8,0) 2´´ 1,95 m 2,02 m 1,96 m 1,97 m 3´´ 3,70 t (6,2) 3,78 t (7,8) 3,71 t (6,4) 3,78 t (7,8) 7-OCH 3 4,03 s 4,01 s 4,03 s 3,99 s OCH 2 O 6,00 s 5,94 s - - 3´-OCH 3 - - 3,98 s 3,97 s 4´-OCH 3 - - 3,93 s 3,85 s H * Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000 ** Schreiber e Stevenson, 1976; Pauletti et al., 2000 PPM 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 7.2 4.4 00 4.0 3.6 3.2 2.8 1.829 7.30 2.069 7.40 2.072 2.999 1.819 0.873 0.822 0.939 0.793 0.993 0.785 6.90 2.4 6.80 2.0 Figura 5. Espectro de RMN 1H de 1 (CDCl 3 , 200 MHz). 6.6334 6.6265 6.7857 6.8432 6.8845 6.9719 6.9686 6.9650 7.2589 7.3228 7.3144 7.3808 7.3722 7.4216 7.4130 6.70 1.6 0.0000 1.9799 1.9483 1.9405 1.9360 1.9038 2.8131 2.7771 2.7369 3.7386 3.7066 3.6747 4.0304 6.0011 7.4216 7.4130 7.3808 7.3722 7.3228 7.3144 7.2589 6.9719 6.9686 6.9650 6.8845 6.8432 6.7857 6.6334 6.6265 Resultados e Discussão 32 SpinWorks 2.5: PADRAO P/ PROTON 0.1% ET. BENZ. EM CDCL3 TMS 21/10/01 6.60 1.2 0.8 0.4 -0.0 PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.044 PM 2.161 2.141 3.319 3.240 2.927 0.976 0.974 1.027 0.960 0.998 0.936 2.4 2.0 Figura 6. Espectro de RMN 1H de 2 (CDCl 3 , 200 MHz). 1.6 1.2 0.976 0.960 1.027 0.974 0.936 0.998 6.6434 6.6363 6.8383 6.9051 6.9473 6.9880 6.9834 6.9810 7.2632 7.3723 7.3624 7.4807 7.4705 7.4387 7.4290 0.0014 1.2546 1.9929 1.9613 1.9533 1.9490 1.9167 2.8267 2.7907 2.7504 4.0410 3.9891 3.9314 3.7515 3.7196 3.6879 3.6672 7.4807 7.4705 7.4387 7.4290 7.3723 7.3624 7.2632 6.9880 6.9834 6.9810 6.9473 6.9051 6.8383 6.6434 6.6363 Resultados e Discussão 33 SpinWorks 2.5: PADRAO P/ PROTON 0.1% ET. BENZ. EM CDCL3 TMS 21/10/01 7.447.407.367.327.287.247.207.167.127.087.047.006.966.926.886.846.806.766.726.686.64 0.8 0.4 -0.0 Resultados e Discussão 34 4.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DO EGONOL E HOMOEGONOL NO GÊNERO Styrax A exigência cada vez maior da qualidade nos produtos de origem vegetal requer o emprego de técnicas seletivas e eficientes que garantam a segurança na identificação e quantificação de diferentes substâncias presentes na matriz. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tem sido muito utilizada para a padronização e o controle de qualidade de materiais vegetais (matéria-prima) e produtos fitoterápicos em processos acabados (He, 2000). As impressões digitais químicas (fringerprinting) obtidos por técnicas cromatográficas, especialmente pelas hifenadas, são recomendadas para o controle de qualidade de medicamentos fitoterápicos, uma vez que podem representar adequadamente a integridade do produto e, portanto, a autenticidade das plantas medicinais (Giri et al., 2010; Gong et al., 2003). Através da hifenação é possível combinar uma técnica de separação com outra técnica de determinação estrutural e identificação de compostos, permitindo uma análise completa da amostra. De acordo com Snyder e Dolan (1996), para desenvolvimento de um método cromatográfico empregando CLAE no modo reverso, é indicado iniciar utilizando uma eluição gradiente exploratória, a qual tem por objetivo determinar se uma condição gradiente ou isocrática é a mais apropriada para a análise de uma amostra em estudo. Nessa eluição, emprega-se uma mistura de H 2 O (solvente A) e um solvente orgânico (solvente B - MeOH ou ACN) como constituintes da fase móvel, sendo que ocorre a variação da concentração de % B em um tempo definido (1 hora), sob condições de vazão determinadas e constantes (2,0 mL/min). O modo isocrático é preferível quando se tem valores baixos de t R e uma boa resolução dos picos. Assim, a eluição gradiente exploratória indicará qual a porcentagem do solvente B a ser empregado na análise para se obter os valores de t R desejados (Snyder e Dolan, 1996). Resultados e Discussão 35 No caso do modo gradiente, a escolha se dará com base nos valores elevados de t R e na grande diversidade química ou ainda se não for possível uma boa separação cromatográfica. A eluição exploratória permite avaliar qual a melhor percentual do solvente B a ser empregada (concentração inicial e final), reduzindo assim, a faixa de gradiente empregado e o tempo de análise (Snyder e Dolan, 1996). A fim de se avaliar o perfil químico do extrato vegetal padrão dos caules de S. camporum e identificar a fase móvel mais eficiente para separação dos compostos da amostra, foi realizada uma análise em gradiente exploratório por CLAE-DAD. As condições de análise propotas por Snyder e Dolan (1996) foram adaptadas neste estudo, como a redução da vazão visando avaliar a melhor interação dos compostos da amostra com a fase estacionária. Utilizou-se uma coluna C 18 , inicialmente eluída com gradiente MeOH-H 2 O (0,1% de ácido acético) (Figura 7, p. 36) de 5 % a 100 % de MeOH em 50 min, e 100 % MeOH durante 10 min, sendo o total da análise 78 min, incluindo 3 min para retornar a condição inicial, e 15 min para condicionar a coluna, com vazão de 1,0 mL/min. O perfil cromatográfico inicial do extrato padrão de S. camporum mostrou vários picos menores e dois picos mais intensos em 311 nm relativos aos compostos 1 e 2. Foi possível notar nesse cromatograma a presença de poucas bandas cromatográficas no início da análise. Assim, com intuito de melhorar esses dados o gradiente anterior foi modificado para MeOH-H 2 O (0,1 % de ácido acético) (Figura 8, p. 36) de 50 % a 100 % de MeOH em 30 min, e 100 % MeOH durante 5 min, incluindo 3 min para retornar a condição inicial, e 15 min para condicionar a coluna, com vazão de 1,0 mL/min. Nesta nova condição as bandas cromatográficas relativas aos compostos 1 e 2 eluidas em t R menores, o que é importante em termos de análise, pois, nesta condição tem-se um tempo de corrida menor. Com base também nas eluições com gradiente foi possível confirmar que ambos os padrões possuíam média polaridade, e que seria possível quantificar os padrões egonol e homoegonol na matriz de forma mais rápida e eficiente, através da otimização das condições cromatográficas no modo de eluição isocrático. Assim, algumas condições isocráticas empregando MeOH-H 2 O e ácido acético foram testadas. A resolução adequada e pureza dos extratos, avaliada pelo detector DAD, foram obtidas com a fase móvel composta de metanol-água-ácido acético (73:26,9:0,1, v/v /v) (Figura 9, p. 37). Resultados e Discussão 36 125 mAU 1 100 2 75 50 25 0 0 10 20 30 40 50 min Figura 7. Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S. camporum. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 5 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 60 min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, V inj = 20 μL, [ ] = 1,0 mg/mL. mAU 1 250 200 2 150 100 50 0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min Figura 8. Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S. camporum. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 50 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 30 min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, V inj = 20 μL, [ ] = 1,0 mg/mL. Resultados e Discussão 37 mAU (a) 100 1 50 2 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min mAU (b) 150 100 50 1 2 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min mAU (c) 100 2 1 50 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min mAU (d) 200 150 1 100 50 2 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min Figura 9. Cromatogramas obtidos por CLAE do (a) extrato padrão do caule de S. camporum; (b) extrato das folhas de S. camporum; (c) extrato das partes aéreas de S. pohlii; e (d) extrato das partes aéreas de S. ferrugineus. Condições cromatográficas: metanol-água-ácido acético (73:26.9:0.1, v/v/v) e detecção em 311 nm. Resultados e Discussão 38 4.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO Os parâmetros de “performance” avaliados foram: seletividade, especificidade, linearidade, precisão, exatidão, recuperação, limite de detecção e limite de quantificação, seguindo como referência os limites aceitáveis propostos pelo Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos (ANVISA, 2003). 4.3.1 Seletividade e Especificidade A curva de calibração (Figura 10, p. 39) pelo método de adição de padrão foi realizada para avaliar a interferência da matriz. Esta curva de calibração foi estabelecida pela análise na faixa de 10,5 a 67,2 μg/mL para 1 e 2. As equaçes de regressão encontradas foram y = 138.900 x + 234.200 e y = 103200 x - 316.100, com um coeficiente de correlação (r) de 0,9986 e 0,9994, respectivamente, e com CV < 2 % para a análise em triplicata. Os resultados mostraram que não houve diferença significativa nos resultados obtidos pela curva de adição de padrão e os obtidos pela curva de calibração externa. O software LCsolution do CLAE-DAD indicou também que os picos referentes aos compostos 1 e 2 eram exclusivamente destes e que não havia coeluição de nenhum outro componente da matriz vegetal. Desse modo, com base na curva de calibração por adição de padrão e pelos dados gerados pelo DAD (Tabela 2, p. 39), concluiu-se que o método desenvolvido apresenta seletividade e especificidade adequadas para os padrões em cada um dos extratos analisados, com boa resolução. A pureza dos padrões isolados, 1 e 2, foi determinada pelas áreas dos picos detectados por CLAE-DAD como sendo 100% e 98,7%, respectivamente (Tabela 2, p. 39). Resultados e Discussão 39 Tabela 2. Valores de seletividade para egonol (1) e homoegonol (2). Pureza do padrão Similaridade 1 100 % 0.999 2 98,7 % 0.998 4.3.2 Linearidade O método de padronização foi com padrão externo, sendo que a resposta do detector DAD a 311 nm apresentou-se linear nas concentrações de 0,36 a 0,42 μg/mL para 1 e 2. As equações de regressão encontradas foram y = 123.000 x - 2.743 e y = 93.490 x - 10.630, com um coeficiente de correlação (r) de 0,9999 e 0,9998, respectivamente, e com um CV de < 2 % para a análise em triplicata (Figura 11, p. 40). Padrão 1 - Egonol 1.5×10 7 Linearidade Adição de Padrão Área 1.0×10 7 5.0×10 6 0 0 20 40 60 80 concentração [µg/mL] Figura 10. Curva de calibração padrão externo x linearidade padrão 1. Resultados e Discussão 40 Padrão 2 - Homoegonol 8.0×10 6 Linearidade Adição de Padrão Área 6.0×10 6 4.0×10 6 2.0×10 6 0 0 20 40 60 80 concentração [µg/mL] Figura 11. Curva de calibração padrão externo x linearidade padrão 2. 4.3.3 Precisão A precisão desenvolvida no método foi a de repetibilidade através da análise em quintuplicata de três soluções padrão com concentração baixa (10,5 μg/mL), média (33,6 μg/mL) e outra alta (67,2 μg/mL) em relação às concentrações da curva de calibração, em três dias não consecutivos. Os resultados para as replicatas das amostras apresentou CV % de 0,26 a 0,57 para o padrão 1 e de 0,27 a 0,73 para o padrão 2. As análises apresentaram dentro dos limites de aceitação estabelecidos para o método, não excedendo 5 % (Tabela 3, p. 41). 4.3.4 Exatidão A exatidão do método também foi avaliada através da análise em quintuplicata das concentrações baixa, média e alta. Os valores estão de acordo com os critérios de aceitação estabelecidos para o método, contemplando valores de 99,3 a 104,0 para o padrão 1 e de 105,9 a 110,0 para o padrão 2, ou seja, com variabilidade menores ou igual a 20 % (Tabela 3, p. 41). Resultados e Discussão 41 Tabela 3. Exatidão (%) e precisão (CV%) intra e inter-dia para o egonol (1) e homoegonol (2). Padrões 1 2 º Concentração 3º dia (n = 5) 2º dia (n = 5) 1 dia (n = 5) [µg/mL] CV (%) Exatidão CV (%) Exatidão CV (%) Exatidão 10,5 0,31 100,2 0,56 102,5 0,40 102,8 33,6 0,57 99,3 0,27 100,5 0,35 101,0 67,2 0,26 100,4 0,54 102,0 0,48 104,0 10,5 0,46 107,3 0,39 110,0 0,47 106,1 33,6 0,55 106,2 0,73 107,8 0,35 108,6 67,2 0,43 107,5 0,27 109,5 0,45 105,9 4.3.5 Recuperação A recuperação de egonol e homoegonol foi determinada através da análise das soluções padrão em três concentrações: 10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL, em quintuplicata. A média das áreas dos picos das amostras tratada foi comparada com as amostras não tratadas para obter a porcentagem de recuperação. Os resultados obtidos (Tabela 4, p. 41) ficaram entre 89,6 a 96,2 % e com CV < 2 %, demonstrando que o procedimento de extração empregado não interfere nas análises. Tabela 4. Recuperação para o egonol (1) e homoegonol (2). Concentração Padrões [µg/mL] 1 2 Media (%) s (%) Media (%) s (%) Recuperação (%) n=5 10,5 93,1 0,82 89,6 0,74 33,6 94,4 0,40 92,7 0,53 67,2 96,2 0,24 94,5 0,21 4.3.6 Limite de Detecção (LOD) Resultados e Discussão 42 O limite de detecção do método foi calculado mediante a equação abaixo e assim obteve-se o valor de 0,25 μg/mL para o padrão 1 e de 0,22 μg/mL para o padrão 2. LOD = 4.3.7 Limite de Quantificação (LOQ) O limite de detecção do método foi calculado mediante a fórmula abaixo, obtendo-se o valor de 0,83 μg/mL para o padrão 1 e de 0,73 μg/mL para o padrão 2. LOQ = 4.4 APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO PARA QUANTIFICAR O EGONOL E HOMOEGONOL EM S. camporum, S. ferrugineus e S. pohlii O método desenvolvido por CLAE-DAD mostrou-se, seletivo, específico, linear, preciso e exato para os dois marcadores propostos para o gênero Styrax. Portanto pode ser indicado para quantificar o egonol e homoegonol em amostras de S. camporum. Visando comprovar a aplicabilidade do método desenvolvido, dois extratos brutos etanólicos de espécies Styrax, previamente preparados (S. pohlii e S. ferrugineus) e o extrato das folhas secas de S. camporum (Figura 9b-9d, p. 37) foram utilizados para quantificar os padrões 1 e 2, os quais foram confirmados pelo tempo de retenção (t R1 12,07 min e t R2 20,92 min, aproximadamente) e espectros de UV-Vis (Figura 12, p. 43), sendo o λ máx em torno de 311 nm (Tabela 5, p. 43). Estes dados confirmaram a presença destes compostos em diferentes concentrações no gênero Styrax. Além disso, também indicam que o método poderia ser aplicado para quantificar o material fornecido in natura ou na forma Resultados e Discussão 43 processada. Além disso, esse método seletivo, específico e simples permite a identificação e quantificação de egonol e homoegonol em S. camporum e também nas espécies S. ferrugineus e S. pohlii, as quais acumulam estas nor-neolignanas. O presente trabalho gerou uma publicação na revista Biomedical Chromatography, sendo que o mesmo encontra-se em anexo (Anexo, p. 55). (a) (b) mAU mAU 150 316 311 215 100 50 216 150 100 50 0 0 200 250 300 350 nm 200 250 300 350 nm Figura 12. Espectro de UV-Vis dos padrões (a) egonol (1) e (b) homoegonol (2). Tabela 5. Quantidade (μg/mL) de egonol (1) e homoegonol (2) em espécies de Styrax. 2 [μg/mL] ± sa (%) Amostras 1 [μg/mL] ± sa (%) Extrato padrão do caule de S. camporum 12,68 ± 0,06 (0,004)b 2,40 ± 0,04 (0,001)b Extrato das folhas de S. camporum 2,17 ± 0,04 (0,001)b 1,92 ± 0,02 (0,001)b Extrato das partes aéreas de S. pohlii 13,77 ± 0,12 (0,34)c 21,96 ±0,09 (0,55)c Extrato das partes aéreas S. ferrugineus 16,72 ± 0,09 (0,42)c 7,65 ± 0,03 (0,19)c a n= 3 porcentagem em relação ao material vegetal seco c porcentagem em relação ao extrato bruto etanólico seco b Conclusões 44 Conclusões Conclusões 45 5 CONCLUSÕES Os padrões egonol e homoegonol, que possuem ampla distribuição em Styrax, foram extraídos, isolados e identificados de S. pohlii. O cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado ao detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD), equipado com coluna C 18 , no modo reverso de eluição permitiu, num primeiro momento, a obtenção de cromatogramas fingerprinting do extrato padrão de S. camporum, fundamentais para a obtenção do perfil químico do extrato, na escolha da fase móvel e também na identificação dos marcadores químicos propostos. Com base nas análises iniciais de LC uma condição analítica isocrática foi determinada para a quantificação dos padrões no extrato padrão de S. camporum. O método desenvolvido foi então validado e apresentou seletividade, especificidade, precisão e exatidão, parâmetros que interferem na qualidade e segurança do produto. Outros parâmetros foram avaliados, como a linearidade, limite de detecção e quantificação. O método desenvolvido permitiu a quantificação de 1 e 2 em outros extratos vegetais in natura ou na forma processada (S. pohlii e S. ferrugineus e nas folhas S. camporum. Referências 46 Referências Referências 47 6 REFERÊNCIAS ALENCAR, J.R.B.; RAMOS, S.V.V.; MACHADO, L.; OLIVEIRA, A.T.C.; MONTEIRO, D.B.; MEDEIROS, F.P.M.; ROLIM NETO, P.J. Validação de limpeza de zidovudina: estratégia aplicada ao processo de fabricação de medicamentos anti-retrovirais. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 40, p. 1-8, 2004. ANIL, H. Four benzofurans glycosides from Styrax officinalis. Phytochemistry, v. 19, p. 2784-2786, 1980. ANVISA. Agência de Vigilância Sanitária. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003. BACCHI, E.M.; SERTIÉ, J.A.A.; VILLA, N.; KATZ, H. Antiulcer action and toxicity of Styrax camporum and Caesalpinia ferrea. Planta Medica, v. 61, p. 204-207, 1995. BACCHI, E.M.; SERTIÉ, J.A.A. Antiulcer action of Styrax camporum and Caesalpinia ferrea in rats. Planta Medica, v. 60, p. 118-120, 1994. BARNES, J. Quality, efficacy and safety of complementary medicines: fashions, facts and the future. Part II. Efficacy and Safety. British Journal of Clinical Pharmacology, v. 55, p. 331340, 2003. BARREIRO, E.J.; BOLZANI, V.S. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de fármacos. Química Nova, v. 32, n. 3, p. 679-688, 2009. BUGNI, T.S.; RICHARDS, B.; BHOITE L.; CIMBORA, D.; HARPER, M.K.; IRELAND, C.M. Marine natural product libraries for high-throughput screening and rapid drug discovery. Journal of Natural Products, v. 71, p. 1095-1098, 2008. BRITO, N.M.; JUNIOR, O.P.A.; POLESE, L.; RIBEIRO, M.L. Validação de métodos analíticos: estratégia e discussão. Pesticidas: R. Ecotoxicol. e Meio Ambiente, v. 13, p. 129146, 2003. CALIXTO, J.B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal medicines (Phytotherapeutic agents). Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 33, p. 179-189, 2000. Referências 48 CAÑIGUERAL, S.; DELLACASSA, E.; BANDONI, A.L. Plantas Medicinales y Fitoterapia: ¿Indicadores de Dependencia o Factores de Desarrollo?. Acta Farmacéutica Bonaerense, v. 22, n. 3, p. 265-278, 2003. CASSIANO, N.M.; BARREIRO, J.C.; MARTINS, L.R.R.; OLIVEIRA, R.V.; CASS, Q.B. Validação em métodos cromatográficos para análises de pequenas moléculas em matrizes biológicas. Química Nova, v. 32, p. 1021-1030, 2009. CAUSON, R. Validation of chromatographic methods in biomedicals analysis: Viewpoint and discution. Journal of Chromatography B, v. 689, p. 175-180, 1997. CHASIN, A.A.M.; NASCIMENTO, E.S.; RIBEIRO-NETO, L.M.; SIQUEIRA, M.E.P.B.; ANDRAUS, M.H.; SALVADORI, M.C.; FERNÍCOLA, N.A.G; GORNI, R.; SALCEDO, S. Validação de métodos em análise toxicológicas: uma abordagem geral. Revista Brasileira de Toxicologia, v. 11, p. 1-6, 1998. COSTA, A.F. Farmacognosia. Lisboa: Calouste Gulbenkian, 1996. CRAGG, G.M.; NEWMAN, D.J. Antineoplastic agents from natural sources: achievements and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs, v. 9, p. 2783-2797, 2000. CRAGG, G.M.; NEWMAN, D.J., SNADER, K.M. Natural products in drug discovery and development. Journal of Natural Produdcts, v. 60, p. 52-60, 1997. DICKISON, W.C. Floral anatomy of the Styracaceae, including observations on intra-ovarian trichomes. Botanical Journal of the Linnean Society, v. 112, p. 223-255, 1993. ESPADA, A.; MARTIN, M.M.; DAGE, J.; KUO, M.S. Application of LC/MS and related teqniques to high-throuhput drug didcovery. Drug Discovery Today, v. 13, p. 417-423, 2008. FOGLIO, M.A.; QUEIROGA, C.L.; SOUSA, I.M.O; RODRIGUES, R.A.F. Plantas medicinais como fonte de recursos terapêuticos: um modelo multidisciplinar. MultiCiência: Construindo a história dos produtos naturais, 2006. Disponível em www.multiciencia.unicamp.br, acessado em Agosto/2010. FRITSCH, P.W.; MORTON, C.M.; CHEN, T.; MELDRUM, C. Phylogeny and biogeography of the Styracaceae. International Journal of Plant Sciences, v. 162, p. 95-116, 2001. GIRI, L.; ANDOLA, H.C.; PUROHIT, V.K.; RAWAT, M.S.M.; RAWAL, R.S.; BHRATT, I.D. Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines: an overview as modern tools. Research Journal of Phytochemistry, v. 4, p. 234-241, 2010. GONG, F.; LIANG, Y-Z; XIE, P-S; CHAU, F-T. Information theory applied to chromatographic fingerprint of herbal medicine for quality control. Journal of Chromatography A, v. 1002, p. 25-40, 2003. GOTTLIEB, O.R. Neolignans. Fortschritte Der Chemie Organischer Naturstoffe, v. 35, p. 1-72, 1978. Referências 49 GOTTLIEB, O.R.; YOSHIDA, M. Natural products of woods plants. Chemicals extraneous to the lignocellulosic cell wall. Spring-Verlag, Berlin. p. 439, 1989. HE, X.G. On-line identification of phytochemical constituents in botanical extracts by combined high-perfomance liquid chromatographic-diode-array detection-mass spectrometric techniques. Journal of Chromatography A, v. 880, p. 203-232, 2000. HJORTH, N.H. Eczematous allergy to balsams. Acta Dermato-Venereologica, v. 41, p. 121, 1961. HOPKINS, C.Y.; EWING, D.F.; CHISHOLM, M.J. Egonol. Spectrometric properties and derivatives. Canadian Journal of Chemistry, v. 45, p. 1425-1429, 1967. HOSTTETTMAN, K., MARSTON, A. Drugs from higher plants. Escola de Verão, São Carlos, SP, 2002. HUTCHINSON, J. The families of flowering plants. 3rd ed. Clarendon Press, Oxford, 1973. ICH. International Conference on Harmonization. Q2B: Validation of Analytical Procedures: Methodology, 1996. INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia. DOQ-CGCRE-008 – Revisão 1. Orientações sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos, 2003. KAKIE, T., HARASAWA, A., TAKASE, I. Isolation of (+)-pinoresinol from leaf of Styrax japonica Sieb. et Zucc. Japanese Kokai Tokkyo Koho, JP 9, 339, 833, 1994, Chemical Abstracts 122:27954. KAWAI, S.; SUGIYAMA, N. Synthesis of the two egonol degradation products, dihydroconiferyl alcohol and styraxinoaldehyde. Chemische Berichte, v. 72, p. 367-380, 1939. KIM, M.R; LEE, H.H.; HAHM, K.S; MOON, Y.H; WOO, E.R. Pentacyclic triterpenoids and their cytotoxicity from stem bark of Styrax japonica S. et Z. Archives of Pharmacal Research, v. 27, p. 283-286, 2004. LI, S.; HAN, Q.; QIAO, C.; SONG, J.; CHENG, C.L.; XU, H. Chemical markers for the quality control of herbal medicines: an overview. Chinese Medicine, v. 28, p. 3-7, 2008. LIANG, X.; ZHANG, L.; ZHANG, X.; DAI, W.; LI, H.; HU, L.; LIU, H.; SU, J.; ZHANG, W. Qualitative and quantitative analysis of traditional Chinese medicine Niu Huang Jie Du Pill using ultra performance liquid chromatography coupled with tunable UV detector and rapid resolution liquid chromatography coupled with time-of-flight tandem mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 51, p. 565-571, 2010. Referências 50 LIANG, Y.Z; XIE, P.; CHAN, K. Quality control of herbal medicines. Journal of Chromatography, v. 812, p. 53-70, 2004. LORENZI, H. Árvores Brasileiras – Manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. Instituto Plantarum de Estudos da Flora: Nova Odessa, v. 1, p. 332, 1982. MacRAE, W.D. e TOWERS, G.H.N. Biological activities of lignans. Phytochemistry, v. 23, p. 1207-1220, 1984. MCMASTER, M.C. HPLC: A Practical User’s Guide, Editora Wiley, Second Edition, EUA, 2007. MELO, J.G.; MARTINS, J.D.G.R; AMORIM, E.L.C.; ALBUQUERQUE, P. Qualidade de produtos a base de plantas medicinais comercializados no Brasil: castanha-da-índia (Aesculus ippocastanum L.), capim-santo (Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf ) e centela (Centella asiatica (L.) Urban). Acta Botanica Brasilica, v. 21, p. 27-36, 2007. MIN, B.S.; NA, M.K.; OH, S.R.; AHN, K.S.; JEONG, G.S.; LI, G.; LEE, S.K.; JOUNG, H.; LEE, H.K. New benzofuran and butyrolactone lignans with antioxidant activity from the stem bark of Styrax japonica. Journal of Natural Products, v. 67, p. 1980-1984, 2004a. MIN, B.S; OH, S.R; AHN, K.S; KIM, J.H; LEE, J; KIM, D.Y; KIM, E.H; LEE, H.K. Anticomplement activity of norlignans and terpenes from the stem bark of Styrax japonica. Planta Medica, v. 70, p. 1210-1215, 2004b. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde. Portaria nº 971, de 3 de maio de 2006. MONTANARI, C.A.; BOLZANI, V.S. Planejamento racional de fármacos baseado em produtos naturais. Química Nova, v. 24, p. 105-111, 2001. MOON, H.I; SEO, D.W.; KIM, K.H; CHO, K.H; EUN, H.C; CHUNG, J.H. Erythrodiol-3acetate, pentacyclic triterpenoid from Styrax japonica, expressions of matrix metalloproteinase-1,2 in cultured human skin fibroblasts. Journal of Ethnopharmacology, v. 97, p. 567-571, 2005. MORAES, A.C.G.; BERTANHA, C.S., GIMENEZ, V.M.M.; GROPPO, M.; SILVA, M.L.A; CUNHA, W.R.; JANUÁRIO, A.H.; PAULETTI, P.M. Development and validation of a highperfomance liquid chromatography method for quantification of egonol and homoegonol in Styrax species. Biomedical Chromatography, DOI: 10.1002/bmc.1744, 2011. MOSS, G.P. Nomenclature of lignans and neolignans. Pure Appl. Chem., v. 72, n. 8, p. 1493–1523, 2000. NAKAJIMA, J.N.; MONTEIRO, R. Estudos fitogeográficos com espécies de Styrax L. (Styracaceae) dos cerrados brasileiros. Eugeniana, v. 12, p. 3-10, 1986. Referências 51 OKADA, H. The fatty oil from the seed of Styrax japonica. Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, v. 400, p. 657, 1915. PAULETTI, P.M.; ARAÚJO, A.R.; YOUNG, M.C.; GIESBRECHT, A.M.; BOLZANI, V.D. Nor-Lignans from the leaves of Styrax ferrugineus (Styracaceae) with antibacterial and antifungal activity. Phytochemistry, v. 55, p. 597-601, 2000. PAULETTI, P.M.; ARAÚJO, A.R.; BOLZANI, V.S.; MARX, Y.M.C. Triterpenos de Styrax camporum (STYRACACEAE). Química Nova, v. 25, n. 3, p. 349-352, 2002. PAULETTI, P.M.; TELES, H.L.; SILVA, D.H.S.; ARAÚJO, A.R.; BOLZANI, V.S. The Styracaceae. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 16, p. 576-590, 2006. PINTO, A.C; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S.; LOPES, N.P.; EPIFÂNIO, R.A. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Química Nova, v. 25, p. 45-61, 2002. RANDAU, K.P.; MEIRA, J.L.; FARIAS BRAGA, J.M.; MONTEIRO, D.B.; ROLIM NETO, P.J. Desenvolvimento e validação analítica para anti-retroviralzidovudina (AZT) - MatériaPrima. Acta Farmaceutica Bonaerense, v. 24, p. 104-108, 2005. RIBANI, M.; BOTTOLI, C.B.G.; COLLINS, C.H.; JARDIM, I.C.S.F; MELO, L.F.C. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, v. 27, p. 771-780, 2004. RODRIGUES, M.V.N.; REHDER, V.L.G.; SARTORATTO, A.; BOAVENTURA JÚNIOR, S.; SANTOS, A.S. O emprego de técnicas hifenadas no estudo de plantas medicinais. MultiCiência: Construindo a história dos produtos naturais, 2006. Disponível em www.multiciencia.unicamp.br, acessado em Agosto/2010. RODRIGUES, V.E.G.; DE CARVALHO, D.A. Florística de plantas medicinais nativas de remanescentes de floresta estacional semidecidual na região do alto Rio Grande – Minas Gerais. Cerne, v. 14, p. 93-112, 2008. SAHOO, N.; MANCHIKANTI, P.; DEY, S. Herbal drugs: Standards and regulation. Fitoterapia, v. 81, p. 462-471, 2010. SARAIVA, L.C.; CESAR, O.; MONTEIRO, R. Biologia da polinização e sistema de reprodução de Styrax camporum Pohl. e S. ferrugineus Nees et Mart. (Styracaceae). Revista Brasileira de Botânica, v. 11, p. 71-80, 1988. SCARDAMAGLIA, L.; NIXON, R.; FEWINGS, J. Compound tincture of benzoin: A common contact allergen? Australasian Journal of Dermatology, v. 44, p. 180-184, 2003. SCHREIBER, F.G; STEVENSON, R. Synthesis of benzofuran Styrax extratives. Journal of The Chemical Society Perkin Transaction 1, p. 1514-1518, 1976. Referências 52 SEGAL, R.; MANSOUR, M.; ZAITSCHEK, D.V. Effect of ester groups on the haemolytic action of some saponins and sapogenins. Biochemical Pharmacology, v. 15, p. 1411-1416, 1966. SEGAL, R.; MILO-GOLDZWEIG, I.; SOKOLOFF, S.; ZITSCEK, D.V. A new benzofuran from the seeds of Styrax officinalis. Journal of the Chemical Society (C), p. 2402-2404, 1967. SILVA, R.M.F.; OLIVEIRA, F.H.C.; STTRATMENN, R.R.; PIMENTEL, M.F.; MEDEIROS, F.P.M.; ALBUQUERQUE, M.M.; ROLIM NETO, P.J. Desenvolvimento e validação da metodologia analítica para doseamento da matéria-prima e de cápsula de sulfato de indinavir por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Acta Farmaceutica Bonaerense, v. 25, p. 578-82, 2006. SIMÕES, C.MO.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5ª Edição. Porto Alegre Florianópolis: Editora da UFSC, p. 557-573, 2004. SNYDER, L.R.; DOLAN, J.W. Initial experiments in high-performance liquid chromatographic method development. I. Use of a starting gradient run. Journal of Chromatography A, v. 721, p. 3-14, 1996. SOUZA-MOREIRA, T.M.; SALGADO, H.R.N.; PIETRO, R.C.L.R. O Brasil no contexto de controle de qualidade de plantas medicinais. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 20, p. 435-440, 2010. STEINER, K.; LEIFER, W. Investigation of contact-type dermatitis due to compound tincture of benzoin. Journal of Investigative Dermatology, v. 13, p. 351-359, 1949. TAKANASHI, M.; TAKIZAWA, Y.; MITSUHASHI, T. 5-(3ʹʹ-Hydroxypropyl)-2-(3ʹ,4ʹmethylenedioxyphenyl)benzofuran. Chemistry Letters, p. 869-871, 1974. TAKANASHI, M.; TAKIZAWA, Y. New benzofurans related to egonol from immature seeds of Styrax obassia. Phytochemistry, v. 27, p. 1224-1226, 1988. TELES, H.L.; HEMERLY, J.P.; PAULETTI, P.M.; PANDOLFI, J.R.C.; ARAÚJO, A.R.; VALENTINI, S.R.; YOUNG, M.C.M.; BOLZANI, V.S.; SILVA, D.H.S. Cytotoxic lignans from the stems of Styrax camporum (Styracaceae). Natural Product Research, v. 19, p. 319323, 2005. TOMAZZONI, M.I; NEGRELLE, R.R.B.; CENTA, M.L. Fitoterapia popular: a busca instrumental enquanto prática terapêutica. Texto & Contexto Enfermagem, Florianópolis, v. 15, p. 115-21, 2006. THOMPSON, M.; ELLISON, S.L.R.; WOOD, R. Harmonized guidelines for singlelaboratory validation of methods of analysis (IUPAC technical report). Pure and Applied Chemistry, v. 74, p. 835-855, 2002. Referências 53 TUROLLA, M.S.R.; NASCIMENTO, E.S. Informações toxicológicas de alguns fitoterápicos utilizados no Brasil. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, p. 289-306, 2006. USP. The United States Pharmacopeia. NF 23, 28 ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, Rockville, 2005. USP. The United States Pharmacopeia. NF 24, Validation of Compendial Methods, Rockville, 1999. VESSMAN, J.; STEFAN, R.I.; STADEN, J.F.V.; DANZER, K.; LINDNER, W.; BURNS, D.T.; FAJGELJ, A.; MÜLLER, H. Selectivity in analytical chemistry. Pure and Applied Chemistry, v. 73, p. 1381–1386, 2001.WARD, R.S. Lignans, neolignans and related compounds. Natural Products Report, v. 16, p. 75-96, 1999. WARD, R.S. Lignans and neolignans and related compounds. Natural Products Report, v. 11, n. 2, p. 75-96, 1999. YUN, K.J; MIN, B.S; KIM, J.Y; LEE, K.T. Styraxoside A isolated from the stem bark of Styrax japonica inhibits lipopolysaccharide-induced expression of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in RAW 264.7 cells by suppressing nuclear factor-kappa B activation. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 30, p. 139-144, 2007. ZEHAVI, U.; LEVY, M.; SEGAL, R. Fungistatic activity of saponin A from Styrax officinalis L. on plant pathogens. Journal of Phytopathology, v. 116, p. 338-343, 1986. ZUANAZZI, J.A.S.; MAYORGA, P. Fitoprodutos e desenvolvimento econômico. Química Nova, v. 33, p. 1421-1428, 2010. Anexo 54 Anexo Anexo 55 7 ANEXO Artigo publicado: MORAES, A.C.G; BERTANHA, C.S., GIMENEZ, V.M.M.; GROPPO, M.; SILVA, M.L.A; CUNHA, W.R.; JANUÁRIO, A.H.; PAULETTI, P.M. Development and validation of a high-perfomance liquid chromatography method for quantification of egonol and homoegonol in Styrax species. Biomedical Chromatography, (wileyonlinelibrary.com) DOI 10.1002/bmc.1744, p. 2011. Research article Received: 4 August 2011, Accepted: 18 September 2011 Published online in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com) DOI 10.1002/bmc.1744 Development and validation of a high-performance liquid chromatography method for quantification of egonol and homoegonol in Styrax species Ana C. G. Moraesa, Camila S. Bertanhaa, Valéria M. M. Gimenezb, Milton Groppoc, Márcio L. A. Silvaa, Wilson R. Cunhaa, Ana H. Januárioa and Patrícia M. Paulettia* ABSTRACT: Styrax camporum Pohl, known in Brazil as ‘estoraque do campo’ or ‘cuia de brejo’, has been used in the treatment of gastrointestinal diseases. The therapeutic action of S. camporum has been attributed to the ethyl acetate fraction, although the chemical composition of this fraction has not yet been analyzed. In this study, a high-performance liquid chromatography photodiode array detection (HPLC-PAD) method for analysis of Brazilian Styrax species has been developed. The compounds egonol (1) and homoegonol (2) were found to be present in all the samples investigated by HPLC. These compounds were isolated by open column chromatography followed by preparative TLC, and were identified by 1H NMR. Compounds 1 and 2 were thus proposed as phytochemical markers for Styrax, owing to their biological properties and presence in other Styrax species. The developed method has been validated and successfully applied for quantification of 1 and 2 in S. camporum dried leaves and crude ethanolic extracts from S. ferrugineus and S. pohlii aerial parts. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Keywords: HPLC-PAD; quantitative determination; egonol; homoegonol; Styrax camporum Introduction Herbal medicines, or phytomedicines, are medicinal products existing in plant organs (roots, leaves, barks, seeds, berries or flowers) that can be used to promote health and treat diseases. Plants have long found medicinal applications and continue to be a source of efficacious medications (Li et al., 2008). The literature describing Brazilian traditional herbal medicine contains references to the use of plant species belonging to Styrax (Styracaceae), such as S. camporum Pohl, S. pohlii A. DC., and S. ferrugineus Ness et Mart., all of which have been mainly employed in the treatment of gastrointestinal diseases and fevers (Lorenzi, 1982; Rodrigues and de Carvalho, 2008). This genus is also well known for the production of a resinous material that is usually secreted when the barks and trunks of the plant are injured by sharp objects. This resin is utilized as a substitute for the benzoin resin, which is remarkable for its anti-inflammatory properties (Lorenzi, 1982). The reported use of S. camporum, known in Brazil as ‘estoraque do campo’ or ‘cuia do brejo’, for the treatment of gastrointestinal diseases has prompted studies on the antiulcer activity of the stem extract and fractions of this plant (Bacchi and Sertie, 1994; Bacchi et al., 1995). It has been established that the ethyl acetate fraction is responsible for the antiulcer activity, and that the crude extract does not display subchronic toxicity. These studies have supported utilization of the S. camporum hydroalcoholic extract as an antiulcer phytomedicine in folk medicine. Biomed. Chromatogr. 2011 Phytochemical investigations of Styrax species have revealed predominant occurrence of shikimate derivatives such as lignan derivatives of 3,7-dioxabicyclo [3.3.0] octane, butanolide and tetrahydrofuran; neolignan derivatives of dihydrobenzofuran; norneolignan derivatives of benzofuran, phenylpropanoids and phenolic acids; and pentacyclic saponins and triterpenes (Pauletti et al., 2006). From a theoretical viewpoint, the therapeutic effects of S. camporum have been attributed to the presence of tannins and saponins, since these classes of natural compounds have been identified in the crude extract. However, a detailed analysis of the chemical composition of the bioactive ethyl acetate fraction has not yet been accomplished. In addition, biological investigations have shown that the norneolignans from Styrax, particularly egonol (1) and homoegonol * Correspondence to: P. M. Pauletti, Universidade de Franca, Av. Dr Armando Salles de Oliveira, 201, 14404–600, Franca, São Paulo, Brazil. E-mail: [email protected] a Universidade de Franca, Av. Dr Armando Salles de Oliveira, 201, 14404-600, Franca, São Paulo, Brazil b Centro Universitário Claretiano, Rua Dom Bosco, 466, 14.300-000, Batatais, São Paulo, Brazil c Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras, Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes, 3900, 14040-901, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil Abbreviations used: PAD, photodiode array detection. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. A. C. G. Moraes et al. (2; Fig. 1) and their derivatives, display moderate antimicrobial and cytotoxic actions (Pauletti et al., 2000; Teles et al., 2005; Hirano et al., 1994; Öztürk et al., 2008). Moreover, egonol has been shown to inhibit the hemolytic activity of the complement system, which should be beneficial in the therapy of inflammatory diseases (Min et al., 2004). Quality control and standardization of phytomedicines are crucial to therapy efficacy (Kroll and Cordes, 2006; Li et al., 2008). Thus, it is very important to quantify and identify the active principles in the preparation. In cases where the active principles are unknown, appropriate phytochemical markers must be established for analytical purposes according to the requirements of the Brazilian National Agency of Sanitary Vigilance and other regulatory agencies (Anvisa, 2004; Li et al., 2008). In this sense, we now report a high-performance liquid chromatographic photodiode array detection (HPLC-PDA) method for the quantitative determination of the markers egonol (1) and homoegonol (2) in S. camporum, S. ferrugineus and S. pohlii for quality control. These compounds have been selected for application as external standards owing to their wide distribution in Styrax species and biological properties. Experimental Materials The methanol employed in the experiments was HPLC grade (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA) and was filtered through a 0.45 mm 47 mm Nylon 66 membrane filter prior to use. Ultrapure water was obtained by passing redistilled water through a Direct-Q UV3 system, Millipore (Billerica, MA, USA). Silica gel 60 (230–400 mesh, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) was used for column chromatography. Thin-layer chromatography (TLC) was accomplished using silica on TLC Alu foils with fluorescent indicator at 254 nm (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Preparative TLC was carried out on silica gel type G (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). (PDA) detector SPDM-20A series, a communication bus module CBM-20A, and a Reodyne manual injector with a 20 mL loop. HPLC data acquisition was accomplished with the aid of LCsolution software. Separation of the micromolecules was carried out on a Shimadzu Shim-pack Octadecyl silane (ODS) (particle diameter 5 mm, 250 4.60 mm) column equipped with a pre-column of the same material. For the preliminary studies, the elution condition was: methanol–water (+ 0.1% acetic acid) gradient from 5 to 100% methanol for 50 min, followed by elution with 100% methanol for 10 min. The total analysis time was 78 min, including 3 min for return to the initial condition and 15 min of equilibration. For further experiments, methanol–water (+ 0.1% acetic acid) gradient from 50 to 100% methanol was used for 30 min, followed by elution with 100% methanol for 5 min, including 3 min for return to the initial condition and 15 min of equilibration. The isocratic mobile phase used for development and validation of the method for quantification of 1 and 2 consisted of methanol–water–acetic acid (73:26.9:0.1, v/v/v). The flow-rates were set at 1.0 mL/min UV spectra were recorded between 200 and 400 nm, and the detection was accomplished at 311 nm. Isolation of egonol and homoegonol The air-dried, powdered aerial parts (2.4 kg) of S. pohlii were extracted with ethanol. After filtration, the solvent was removed under reduced pressure, to yield 87 g of the extract. The ethanolic extract (40 g) was then dissolved in methanol–water (2:8, v/v) and successively partitioned with n-hexane, ethyl acetate and n-butanol. After solvent evaporation using a rotary evaporator, 2.8, 8.9, 7.6 and 8.2 g of each phase were obtained, respectively. The n-hexane fraction (1.4 g) was chromatographed over silica eluted with a gradient of n-hexane-ethyl acetate, to afford 111 fractions. Compounds 1 (27 mg) and 2 (22 mg) were isolated from fractions 92–100 and 69–80, respectively, after a prep-TLC silica eluted with dichloromethane–methanol (98:2, v/v). The spectral data of 1 and 2 were in agreement with previously published data (Schreiber and Stevenson, 1976; Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000). The purity was determined by means of the HPLC-PAD peak area. Preparation of standards and samples Plant material Aerial parts of Styrax pohlii A. DC., Styrax camporum Pohl and Styrax ferrugineus Ness et Mart. were collected in the city of Luis Antonio (21 33’ to 21 37’ S and 47 45’ to 47 57’ W, in October 2008 and April 2009, respectively) and identified by Professor V. M. M. Gimenez and Professor M. Groppo. Voucher specimens (SPFR12168, SPFR12170 and SPFR12169, respectively) were deposited in the Herbarium of the Department of Biology, Laboratory of Plant Systematics, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil (Herbarium SPFR). HPLC-PAD analyses HPLC analyses were conducted on a Shimadzu LC-6 AD system (Kyoto, Japan) equipped with a degasser DGU-20A5, a Photo diode array HO O Preparation of the stock solution. A solution of egonol and homoegonol (5.0 mg/mL each) was prepared in methanol (1.0 mL). From this solution, a stock solution (84 mg/mL) was prepared in methanol–water (95:5, v/v). Preparation of the standard S. camporum stem extract. The airdried powdered stems of S. camporum (1 g) were accurately weighed and extracted in 10 mL dichloromethane using an ultrasonic bath. After 10 min, the solution was filtered and concentrated using SpeedVac concentrator (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA). The material was then resuspended in 3 mL methanol–water (95:5, v/v). Sample preparation. The air-dried powdered leaves of S. camporum (1 g) were accurately weighed and extracted in 10 mL dichloromethane using an ultrasonic bath. After 10 min, the solution was filtered and concentrated using a SpeedVac concentrator (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA). The material was then resuspended in 3 mL methanol–water (95:5, v/v). A solution of the crude ethanolic extracts of the aerial parts of S. pohlii and S. ferrugineus (4.0 mg/mL each) was prepared in 1.0 mL methanol–water (95:5, v/v). OR1 Method validation OCH3 OR2 -CH2CH3 CH3 Validation of the analytical method was performed according to the requirements of the Validation Guide for analytical and bioanalytical methods published by the Brazilian National Agency of Sanitary Vigilance (Anvisa, 2003). Figure 1. The structure of egonol (1) and homoegonol (2) isolated from S. pohlii. External standard curve. Dilutions of the stock egonol and homoegonol solution (84 mg/mL) were carried out using methanol–water R1 1 2 wileyonlinelibrary.com/journal/bmc R2 Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Biomed. Chromatogr. 2011 HPLC method for quantification of egonol and homoegonol in Styrax (95:5, v/v), to obtain solutions containing 0.36, 1.47, 5.25, 10.50, 21.00, 33.60 and 42.00 mg/mL of 1 and 2, which were injected in triplicate. A seven-point calibration curve was constructed, to determine the linearity of the method. The calibration curve was obtained by plotting the peak area vs the compound concentration in micrograms per milliliter. Standard addition curve. Aliquots (300 mL) of the standard solutions with concentrations of 10.5, 21.0, 33.6, 42.0, 50.4 and 67.2 mg/mL of 1 and 2 were concentrated using a SpeedVac concentrator, and were added to a constant amount (50 mL) of S. camporum standard extract preparation and 250 mL methanol–water (95:5, v/v). Solutions were injectd in triplicate. The calibration curve was constructede by plotting the peak area vs the concentration of the added compound in micrograms per milliliter. Selectivity. The photo diode array detector was used for identification of egonol and homoegonol and also for verification of peak purity during the analytical run of the extracts. The retention times of the standards egonol and homoegonol were employed for identification at the analytical chromatogram profile. Recovery, accuracy and precision. The relative recovery was examined using three quality control solutions prepared in methanol–water (95:5, v/v), namely at concentrations of 10.5, 33.6 and 67.2 mg/mL. Five replicate analyses were performed. The peak area ratios at each concentration were compared with those of the three standard solutions, to obtain the percentage recovery. To measure the assay precision and repeatability, the intra- and interday tests were done by analyzing three different concentrations, which were then employed in the recovery experiment. The tests were carried out on three nonconsecutive days. Precision and repeatability were confirmed by the relative standard deviation (RSD) value of the intra- and interday assays. The RSD was calculated by standard deviation over the measured amount multiplied by 100. Accuracy was estimated on the basis of the standard solutions of the analytes using the three above-mentioned concentration levels and the percentage accuracy for each concentration. Limits of detection and quantification. The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) were determined according to the calibration curve, as LOD = 3 (SD/slope) and LOQ = 10 (SD/slope), where SD is the standard deviation of the response and slope is the slope of the calibration curve. Results and discussion In order to obtain a preliminary idea of the complexity of the extracts, a combined HPLC-PAD analysis was performed. The separation was carried out using an ODS column eluted with a methanol–water (+ 0.1% acetic acid) gradient from 5 to 100% methanol for 50 min, followed by elution with 100% methanol for 10 min. The total analysis time was 78 min, including 3 min for return to the initial condition and 15 min of equilibration. The initial HPLC profile of the standard extract of S. camporum (Fig. 2) displayed several minor peaks and two more intense peaks at 311 nm. To improve this profile, the gradient condition was modified to methanol–water (+ 0.1% acetic acid) from 50 to 100% methanol for 30 min, followed by elution with 100% methanol for 5 min, including 3 min for return to the initial condition, and 15 min of equilibration (Fig. 3). On the basis of these analyses, the S. pohlii ethanolic crude extract was submitted to the described isolation process, since both standards have medium polarity and are present in larger quantities in this crude extract. The isolated compounds 1 and 2 were identified by 1H NMR analysis, and results were compared with spectral data available in the literature. This procedure was necessary since 1 and 2 are not commercially available (Schreiber and Stevenson, 1976; Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000). Their structures are depicted in Fig. 1. After complete characterization, the compounds were used as external standards for the development mAU 125 1 100 2 75 50 25 0 0 10 20 30 40 50 min Figure 2. HPLC-PAD chromatogram of the standard extract from S. camporum stems. Chromatographic conditions: methanol–water (+ 0.1% acetic acid) linear gradient from 5 to 100% methanol for 50 min, and 100% methanol for 10 min. The total analysis time was 78 min, including 3 min for return to the initial condition and 15 min of equilibration and detection at 311 nm. The flow-rate was 1.0 mL/min. mAU 250 1 200 2 150 100 50 0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min Figure 3. HPLC-PAD chromatogram of the standard extract from S. camporum stems. Chromatographic conditions: methanol–water (+ 0.1% acetic acid) linear gradient from 50 to 100% methanol for 30 min, and 100% methanol for 5 min, including 3 min for return to the initial condition and 15 min of equilibration and detection at 311 nm. The flow-rate was 1.0 mL/min. Biomed. Chromatogr. 2011 Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. wileyonlinelibrary.com/journal/bmc A. C. G. Moraes et al. (a) mAU 100 1 50 2 0 0.0 (b) 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min mAU 150 100 50 1 2 0 0.0 (c) 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min mAU 100 2 1 50 0 0.0 (d) 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min mAU 200 150 100 1 50 2 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min Figure 4. HPLC-PAD chromatogram of (a) the standard extract from S. camporum stems; (b) S. camporum leaves extract; (c) S. pohlii aerial parts extract; and (d) S. ferrugineus aerial parts extract. Chromatographic conditions: methanol–water–acetic acid (73:26.9:0.1, v/v/v) and detection at 311 nm. The flow-rate was 1.0 mL/min. and validation of a chromatographic method for the qualitative and quantitative analysis of the analytes present in Styrax extracts. Purities were 100 and 98.7% for 1 and 2, respectively, as determined by means of the peak areas detected by HPLC-PAD. On the basis of the employed gradient elution conditions, an isocratic analysis for the quantification of egonol and homoegonol chromatographic bands was estimated and tested for a more rapid and efficient separation of 1 and 2 from the other matrix compounds. The appropriate resolution and purity of the peaks were obtained by using the mobile phase methanol– water–acetic acid (73:26.9:0.1, v/v/v; Fig. 4). The selectivity and specificity of the analytical method were confirmed using the PAD software for the standards and for each of the assayed extracts. The response of the UV detector at 311 nm was linear from 0.36 to 42.00 mg/mL for both 1 and 2. The obtained regression equations were y = 123,000x – 2,743 and y = 93,490x – 10,630, wileyonlinelibrary.com/journal/bmc with a correlation coefficient (r2) of 0.9999 and 0.9998, respectively, and an RSD of <2% for the triplicate analysis. The LOD and LOQ obtained for the standards 1 and 2 were 0.25 and 0.22, and 0.83 and 0.73 mg/mL, respectively. Calibration curves were constructed by means of the standard addition method, to evaluate matrix interference. These calibration curves were Table 1. Extraction recovery of egonol (1) and homoegonol (2) Recovery (%), n = 5 Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Concentration Standards (mg/mL) 10.5 33.6 67.2 1 (RSD%) 2 (RSD%) 93.1 (0.82) 89.6 (0.74) 94.4 (0.40) 92.7 (0.53) 96.2 (0.24) 94.5 (0.21) Biomed. Chromatogr. 2011 HPLC method for quantification of egonol and homoegonol in Styrax Table 2. Accuracy and intra- and inter-day precision of egonol (1) and homoegonol (2) Standards 1 2 Concentration (mg/mL) 10.5 33.6 67.2 10.5 33.6 67.2 Day 1 (n = 5) RSD (%) 0.31 0.57 0.26 0.46 0.55 0.43 Accuracy (%) 100.2 99.3 100.4 107.3 106.2 107.5 established by analysis of 1 and 2 in the 10.5 to 67.2 mg/mL range. The regression equations were y = 138,900x – 234,200 and y = 103,200x – 316,100, with a correlation coefficient (r2) of 0.9986 and 0.9994, respectively, and an RSD of <2% for the triplicate analysis. The results showed that there was no significant difference between the mean results determined by the external calibration curve and the standard addition curve. The recoveries of egonol and homoegonol were determined by analyzing the standard solutions at three concentrations: 10.5, 33.6 and 67.2 mg/mL. The peak/area ratios of five treated samples at each concentration were compared with those of five injections of untreated samples, to derive a percentage recovery. The recoveries are summarized in Table 1 and lie in the range 89.6–96.2%, with RSD < 2%. The intra- and inter-day precision and accuracy of the method were determined by analyzing five replicates of three standard solutions at concentrations of 1 and 2 equal to 10.5, 33.6 and 67.2 mg/mL on three nonconsecutive days. Precision is expressed as coefficient of variation (RSD, %); accuracy was evaluated by back-calculation and is expressed as the percentage deviation between the experimentally detected amount and the real amount for the three evaluated concentrations. Results are shown in Table 2 and reveal reasonable intra- and inter-assay precision, with RSD <2%, whereas accuracy varied from 99.3 to 110.0%. Typical chromatograms of the analysis obtained during the validation study are presented in Fig. 4(a). The validated method was employed for the quantitative analysis of egonol and homoegonol in crude ethanolic extracts of two Styrax species previously prepared in our laboratory Table 3. Amounts (mg/mL) of egonol (1) and homoegonol (2) in Styrax species 1 (mg/mL) RSDa (%) 2 (mg/mL) RSDa (%) S. camporum stem standard 12.68 0.06 extract (0.004)b S. camporum leaves 2.17 0.04 (0.001)b S. pohlii aerial parts 13.77 0.12 (0.34)c S. ferrugineus aerial parts 16.72 0.09 (0.42)c 2.40 0.04 (0.001)b 1.92 0.02 (0.001)b 21.96 0.09 (0.55)c 7.65 0.03 (0.19)c Samples a n = 3. Percentage relative to the dried plant material. c Percentage relative to the dried crude ethanolic extract. b Biomed. Chromatogr. 2011 Day 2 (n = 5) Day 3 (n = 5) RSD (%) Accuracy (%) RSD (%) Accuracy (%) 0.56 0.27 0.54 0.39 0.73 0.27 102.5 100.5 102.0 110.0 107.8 109.5 0.40 0.35 0.48 0.47 0.35 0.45 102.8 101.0 104.0 106.1 108.6 105.9 (S. pohlii and S. ferrugineus) and in S. camporum dried leaves (Fig. 4b–d). The presence of 1 and 2 was confirmed by the retention time and UV–vis spectra obtained from authentic samples, at lmax around 311 nm (Table 3). The data demonstrate that the investigated plant species accumulate compounds 1 and 2 in different concentrations. The results also indicate that the method developed herein could be applied for quantification of material supplied in natura or in process form. This selective, specific and simple method thus allows for identification and quantification of egonol and homoegonol in S. camporum and also in other Styrax species that accumulate these compounds. Conclusion The therapeutic effects of S. camporum have not been attributed to a specific compound; however, biological investigations have shown that egonol and homoegonol display antimicrobial and cytotoxic actions (Pauletti et al., 2000; Teles et al., 2005; Hirano et al., 1994; Öztürk et al., 2008). In addition, egonol has been shown to inhibit the hemolytic activity of the complement system, which should be beneficial in the therapy of inflammatory diseases (Min et al., 2004). The developed method can be successfully applied for quantification of 1 and 2 in S. camporum dried leaves and crude ethanolic extracts from S. ferrugineus and S. pohlii aerial parts. Thus, these neolignans could be used as phytochemical markers for the quality control of this traditional herbal medicine. Acknowledgment The authors are grateful to Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico for fellowships. FAPESP is also acknowledged for financial support (grant no. 2008/10.283-1). References Anvisa. 2003. Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Resolução RE no. 899. Diário Oficial da Republica Federativa do Brasil, Imprensa Nacional: Brasília. Available from: http://portal.anvisa.gov. br/wps/wcm/connect/71a7358043a1825a867eeed956f63ca1/RE_899_ 2003_Determina+a+publicação+do+Guia+para+validação+de+ métodos+analíticos+e+bioanal (accessed June 2011). Anvisa. 2004. Dispõe sobre o registro de medicamento fitoterápico. Resolução RDC no. 48. Diário Oficial da Republica Federativa do Brasil, Imprensa Nacional: Brasília. Available from: http://portal.saude.gov. br/portal/arquivos/pdf/rdc_48_16_03_04_registro_fitoterapicos%20. pdf (accessed June 2011). Bacchi EM and Sertie JAA. Anti-ulcer action of Styrax camporum and Caesalpinia ferrea in rats. Planta Medica 1994; 60: 118–120. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. wileyonlinelibrary.com/journal/bmc A. C. G. Moraes et al. Bacchi EM, Sertie JAA, Villa N and Katz H. Antiulcer action and toxicity of Styrax camporum and Caesalpinia ferrea. Planta Medica 1995; 61: 204–207. Hirano T, Gotoh M and Oka K. Natural flavonoids and lignans are potent cytostatic agents against human leukemic HL-60 cells. Life Science 1994; 55: 1061–1069. Hopkins CY, Ewing DF and Chisholm MJ. Egonol. Spectrometric properties and derivatives. Canadian Journal of Chemistry 1967; 45: 1425–1429. Kroll U and Cordes C. Pharmaceutical prerequisites for a multi-target therapy. Phytomedicine 2006; 13: 12–19. Li S, Han Q, Qiao C, Song J, Lung Cheng C and Xu H. Chemical markers for the quality control of herbal medicines: an overview. Chinese Medicine 2008; 28: 3–7. Lorenzi H. Árvores Brasileiras – Manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil, Vol. 1. Instituto Plantarum de Estudos da Flora: São Paulo, 1982; 332. Min BS, Oh SR, Ahn KS, Kim JH, Lee J, Kim DY, Kim EH and Lee HK. Anticomplement activity of norlignans and terpenes from the stem bark of Styrax japonica. Planta Medica 2004; 70: 1210–1215. wileyonlinelibrary.com/journal/bmc Öztürk SE, Akgül Y and Anil H. Synthesis and antibacterial activity of egonol derivatives. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2008; 16: 4431–4437. Pauletti PM, Araújo AR, Young MC, Giesbrecht AM and Bolzani VD. nor-Lignans from the leaves of Styrax ferrugineus (Styracaceae) with antibacterial and antifungal activity. Phytochemistry 2000; 55: 597–601. Pauletti PM, Teles HL, Silva DHS, Araújo AR and Bolzani VS. The Styracaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia 2006; 16: 576–590. Rodrigues VEG and de Carvalho DA. Florística de plantas medicinais nativas de remanescentes de floresta estacional semidecidual na região do alto Rio Grande – Minas Gerais. Cerne 2008; 14: 93–112. Schreiber FG and Stevenson R. Synthesis of benzofuran Styrax extratives. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1 1976; 1514–1518. DOI: 10.1039/P19760001514 Teles HL, Hemerly JP, Pauletti PM, Pandolfi JRC, Araújo AR, Valentini SR, Young MCM, Bolzani VS and Silva DHS. Cytotoxic lignans from the stems of Styrax camporum (Styracaceae). Natural Product Research 2005; 19: 319–323. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Biomed. Chromatogr. 2011