O QUE É O DNA? - Universidade do Porto

DNA, RNA e PROTEÍNAS
DNA
PROTEÍNA
Carla Costa
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Serviço e Laboratório de Biologia
Celular e Molecular
OBSERVAÇÃO
A descoberta do DNA foi crucial para o entendimento da
biologia ao nível molecular.
http://www.csiro.au/helix/dna/index.shtml
O QUE É O DNA?
DNA – Ácido desoxiribonucleíco – é a molécula que contém a
informação genética.
http://www.dnahelix.com/
DNA - MARCOS HISTÓRICOS
Friedrich Miescher
Descoberta do DNA
(1869)
Purinas
Phoebus Levene
Erwin Chargaff
Identificou os componentes
do DNA (1920s)
Nucleótido
T=A
G=C
Pirimidinas
Desoxiribose
http://www.ba-education.demon.co.uk/for/science/dna.html
MARCOS HISTÓRICOS
Rosalind Franklin
Difracção DNA por raios-X
(1952)
Francis Crick
James Watson
Modelo da dupla hélice
(1953)
ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL
DO DNA
Francis Crick mostra a James Watson o modelo do DNA em dupla hélice
http://www.ba-education.demon.co.uk/for/science/dna.html
DUPLA HÉLICE E ESTRUTURA
MOLECULAR DO DNA
DNA mede-se em número
de pares de bases (bp)
1000 bp = 1 kb
1.000.000 bp = 1 Mb
10 nucleótidos
em uma volta
da hélice
ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA
Purinas
Pirimidinas
DUPLA HÉLICE E ESTRUTURA
MOLECULAR DO DNA
Cadeias anti-paralelas
LOCALIZAÇÃO CELULAR
Núcleo: 5-8 µm de diâmetro
DNA: 2 m de comprimento
DNA+Histonas
Nucleossomas
Cromatina
Cromossomas
CROMOSSOMAS
NÚCLEO
CROMOSSOMAS
http://www.csiro.au/helix/dna/index.shtml
NÚMERO DE CROMOSSOMAS
# of
chromosomes
DNA
(Mb)
Escherichia coli (bacterium)
1
47
Saccharomyces cerevisae (yeast)
16
12
Caenorhabditis elegans (nematode)
6
97
Arabidopsis thaliana (Arabidopsis)
10
118
Drosophila melanogaster (fruit fly)
4
135
Mus musculus (mouse)
19 + X/Y
3,059
Homo sapiens sapiens (human)
22 + X/Y
3,286
Organism
mug shot
LOCALIZAÇÃO CELULAR
Núcleo: 5-8 µm de diâmetro
DNA: 2 m de comprimento
DNA+Histonas
Nucleossomas
Cromatina
Cromossomas
CROMATINA E NUCLEOSSOMA
NÚCLEO
CROMOSSOMAS
DNA + HISTONAS
CROMATINA
NUCLEOSSOMA
- Contém ~ 200 pb de DNA enrolado à volta de uma região central
composta por 8 histonas (H2A, H2B, H3, H4).
- Histona H1 junta a estrutura.
10 nm de
diâmetro
- O empacotamento do DNA em fibras de cromatina de
10 nm diminui em cerca de 6 vezes o seu comprimento!
-Os nucleossomas originam uma fibra
de cromatina de ~10 nm de diâmetro.
- A cromatina pode ser condensada em
fibras de 30 nm.
FIBRAS DE CROMATINA
EUCROMATINA E
HETEROCROMATINA
EUCROMATINA
HETEROCROMATINA
NÚCLEO EM INTERFASE – MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
GENES
Segmento de DNA que codifica
para a síntese proteínas
ESTRUTURA DO DNA
- Regiões reguladoras
- Regiões codificantes (Exões)
- Regiões não codificantes (Intrões)
Proteínas
http://www.wellcome.ac.uk/en/genome/thegenome/hg02b001.html
COMO É QUE UMA SEQUÊNCIA DE DNA
CODIFICA PARA UMA PROTEÍNA?
?
DNA
PROTEÍNA
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA
MOLECULAR
Núcleo
Citoplasma
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/centraldogma.html
REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO
E TRADUÇÃO
Núcleo
Citoplasma
http://www.postmodern.com/~jka/rnaworld/nfrna/nf-transcrip.html
REPLICAÇÃO DO DNA – DNA
MAKES DNA
- INICIAÇÃO
- REPLICAÇÃO
- TERMINAÇÃO
REPLICAÇÃO SEMI-CONSERVATIVA
DO DNA
DUPLA HÉLICE ORIGINAL
MOLÉCULAS DE DNA APÓS
A REPLICAÇÃO
http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDNAMOLGEN.html
REPLICAÇÃO - INICIAÇÃO
GARFO DE REPLICAÇÃO
- Origem de replicação (ori) – sequência particular de DNA onde a replicação é iniciada.
- Na ori ligam-se várias proteinas, as cadeias de DNA são abertas, formando a “replication bubble”.
- A replicação inicia-se no garfo de replicação.
- A replicação do DNA a partir dos garfos de replicação é bidireccional.
DNA POLIMERASE
DNA POLIMERASE - EUCARIOTAS
Activas em células em divisão - replicação.
REPLICAÇÃO
-Topoisomerases – desenrola a dupla hélice de DNA.
- Helicase – abre a molécula de DNA no topo do garfo de
replicação (quebra as ligações por pontes de hidrogénio
entre as bases).
- Single-Stranded DNA binding proteins (SSB) – ligam-se a
regiões do DNA em cadeia simples para prevenir a re-ligação em
cadeia dupla.
Síntese 5’-> 3’
- DNA Polimerase –inicia a síntese da nova cadeia de forma
contínua.
- Sintetizada descontinuamente sobre a forma de fragmentos
de Okasaki que são pequenas moléculas de DNA (1 a 3kb).
- RNA primase – liga-se ao local de iniciação no DNA.
- DNA Polimerase – sintetiza os fragmentos de Okazaki..
- DNA ligase – liga os fragmentos de Okazaki.
http://oak.cats.ohiou.edu/~ballardh/pbio475/Heredity/Heredity.htm
SÍNTESE DA CADEIAS LEADING E
LAGGING
http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/replication_overview.jpg
FRAGMENTOS DE OKAZAKI
Primase
DNA Polimerase
DNA Pol
SÍNTESE DA CADEIAS LEADING E
LAGGING
DNA Polimerase
Polimerase 5’->3’
Exonuclease 3’->5’
http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/replication_overview.jpg
PROOFREADING (capacidade de verificação)
1 base em 109-1010 bases incorporadas
é adicionada incorrectamente
REPLICAÇÃO - TERMINAÇÃO
- Ocorre quando os garfos de replicação se encontram.
- DNA Ligase.
- Topoisomerase enrola o DNA.
REPLICAÇÃO DO DNA - RESUMO
Replicação.MOV
MUTAÇÕES NO DNA
- ESPONTÂNEAS
- INDUZIDAS
- RADIAÇÕES
- QUÍMICOS
MUTAÇÕES ESPONTÂNEAS NO DNA
Para além dos erros de incorporação de bases que podem ocorrer durante a replicação.
Várias modificações químicas na molécula de DNA podem ocorrer espontâneamente.
(perda de purinas)
Resultando na quebra da ligação entre as bases
puricas e a desoxirribose deixando um local
apurinico no DNA.
MUTAÇÕES INDUZIDAS POR
RADIAÇÕES OU QUÍMICOS
A radiação UV induz a formação de dímeros
de pirimidina, em que duas timinas adjacentes
são unidas por um anel ciclobutano.
A formação destes dímeros distorce
a estrutura do DNA e bloqueia a transcrição
e replicação.
Benzo-apyrene reagem com as bases
adição de grupos alquilo (metil ou etil)
a várias posições nas bases de DNA
de DNA adicionando grandes grupos
químicos à molécula de DNA.
MECANISMOS DE REPARAÇÃO DO
DNA
RADIAÇÕES
REPARAÇÃO
QUÍMICOS
- DIRECTA
- EXCISÃO DE BASE
ESPONTÂNEA
- EXCISÃO DE NUCLEÓTIDO
- REPARAÇÃO MISMATCH
REPARAÇÃO DIRECTA DO DNA
O processo de reparação dos dímeros de timina designa-se fotoreactivação uma vez que energia
proveniente da luz visível é utilizada para quebrar a estrutura de ciclobutano.
As pirimidinas originais permanecem na molécula de DNA, agora no seu estado normal.
REPARAÇÃO POR EXCISÃO
- EXCISÃO DE UMA BASE
- EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS
- REPARAÇÃO POR MISMATCH
EXCISÃO DE UMA BASE
O uracilo pode ser erradamente incorporado no DNA em vez da timina durante
a replicação ou pode ser formado por desaminação da citosina.
A excisão do uracilo é catalizada pela DNA glicosilase, uma enzima que
cliva a ligação entre a base e a desoxirribose, formando-se um local
apirimidinico (apurinico se for outro tipo de base a ser removida).
O local AP é reparado por uma AP endonuclease que remove a desoxirribose.
O espaço vazio de um nucleotido é preenchido pela DNA polimerase e
estabelecidas as ligações pela ligase.
REPARAÇÃO POR EXCISÃO
- EXCISÃO DE UMA BASE
- EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS
- REPARAÇÃO POR MISMATCH
EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS
Mecanismo de reparação em todo o genoma
As bases modificadas são removidas como parte de um
oligonucleotido contendo a lesão
Reconhecimento da base alterada por um complexo contendo a
proteína XPC e a hHR23B.
A esta interacção segue-se a ligação das proteínas XPB, XPD (são
componentes do factor de transcrição TFIIH necessário para o inicio
da transcrição) e XPG ao DNA danificado.
Actuam como helicase desenrolando 30 pb de DNA à volta do
local danificado.
A proteína XPA confirma a mutação e recruta a XPF em heterodímero
com ERCC1 ao complexo de reparação. As XPF/ERCC1 e XPG são
endonucleases que clivam o DNA a 5’ e 3’ do local danificado.
O espaço vazio resultante é preenchido pela DNA polimerase
e unidos pela ligase.
EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS
Reparação por excisão de nucleótidos.swf
REPARAÇÃO POR EXCISÃO
- EXCISÃO DE UMA BASE
- EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS
- REPARAÇÃO POR MISMATCH
REPARAÇÃO POR MISMATCH
Reconhece bases não emparelhadas que são
incorporadas durante a replicação e escapam ao
controlo do mecanismo de Proofreading – faz
um scaning ao DNA replicado de novo.
6 homólogos de MutS e 5 homólogos de MutL,
designados por MSH e MLH, respectivamente. Os
factores melhor caracterizados em reparação MMR
são o MSH2, MSH3 e MSH6.
Reparação pós replicativa de erros e é essencial
para a manutenção da integridade do genoma.
http://www.funpecrp.com.br/gmr/year2003/vol1-2/sim0001_full_text.htm
REPARAÇÃO POR MISMATCH
- Incorporação mismatch durante a replicação.
- Reconhecimento.
- Excisão.
- Síntese.
DEFEITOS NOS SISTEMAS DE
REPARAÇÃO DO DNA
REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO
E TRADUÇÃO
Núcleo
Citoplasma
http://www.postmodern.com/~jka/rnaworld/nfrna/nf-transcrip.html
TRANSCRIÇÃO
- INICIAÇÃO
- ELONGAÇÃO
Citoplasma
- TERMINAÇÃO
- PROCESSAMENTO DO mRNA
TRANSCRIÇÃO - OVERVIEW
http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/transcription.html
RNA – ÁCIDO RIBONUCLEÍCO
Estruturalmente semelhante ao DNA
contudo:
- Ribose em vez de desoxiribose
- Uracilo em vez de timina
- Moléculas de RNA são mais pequenas
- RNA é em cadeia simples
TIPOS DE RNA
TRANSCRIÇÃO DE UMA ÚNICA
CADEIA DE DNA
3’
5’
Cadeia molde – Anti-sense
3’
RNA Polimerase
5’
3’
5’
RNA POLIMERASES EM EUCARIOTAS
INICIAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO:
REGIÃO PROMOTORA
REGIÃO PROMOTORA:
sequência no DNA onde a
RNA Polimerase II inicia
a transcrição
TRANSCRIÇÃO - INICIAÇÃO
Inúmeras proteínas envolvidas designadas por factores de transcrição.
- Formação de um complexo de transcrição da RNA polimerase II
envolve a ligação do factor TFIID (Transcription Factor II) à TATA
Box. O factor TFIID é composto por várias subunidades, incluindo
uma TBP (TATA binding protein) e aproximadamente 10 outros
polipeptideos designados TBP-associated factors (TAFs).
- A ligação do TFIID é seguida pelo recrutamento de um segundo
factor de transcrição, o TFIIB que serve como ponte para a RNA
polimerase II, que se liga ao complexo TBP-TFIIB em associação
com outro factor, o TFIIF.
- Ao complexo ligam-se mais dois factores, o TFIIE e TFIIH.
- A RNA Polimerase II separa a dupla cadeia de DNA e
inicia a transcrição do mRNA.
TRANSCRIÇÃO - ELONGAÇÃO
ELONGAÇÃO: O mRNA vai-se formando ligado ao DNA, na transcription bubble, através da adição de
bases (Ex: adenina a uracilo e guanina a citosina) na direcção 5' – 3’. Processo mediado pela RNA
Polimerase II.
http://www.synapses.co.uk/genetics/repflow.html
http://www.nicerweb.com/doc/class/bio1151/Locked/media/ch17/17_07bTranscripElongation_L.jpg
TRANSCRIÇÃO - TERMINAÇÃO
TERMINAÇÃO:
- Um sinal stop no DNA faz com que a
RNA Polimerase II seja removida.
- O mRNA sintetizado é libertado.
- A transcription bubble no DNA é fechada.
Pré-mRNA
http://www.synapses.co.uk/genetics/repflow.html
TRANSCRIÇÃO - RESUMO
Transcrição.MOV
TRANSCRIÇÃO: PROCESSAMENTO
DO mRNA
O pré-mRNA sofre 3 grandes modificações
antes de sair do núcleo e ser traduzido em proteína
2
3
1
- CAPPING
- POLIADENILAÇÃO
- SPLICING
http://nobelprize.org/medicine/educational/dna/a/splicing/index.html
PROCESSAMENTO DO mRNA
1) Capping – uma metilguanosina é adicionada à extremidade 5' do
mRNA.
Esta modificação é necessária para a estabilização do mRNA e para a
eficiente iniciação da síntese proteíca.
2) Poliadenilação – o mRNA é poliadenilado na extremidade 3’.
Adição de uma cadeia de 150-200 adeninas que aumenta a estabilidade
e o tempo de semi-vida de molécula de mRNA.
3) Splicing – remoção de intrões (sequências não codificantes)
do pré-mRNA para formar mRNA, contendo somente a estrutura
codificante, exões, para serem traduzidos em proteína. Este
processo ocorre no spliceossoma.
http://nobelprize.org/medicine/educational/dna/a/splicing/index.html
SPLICING
Splicing.swf
PROCESSAMENTO DO mRNA RESUMO
Processamento mRNA.MOV
DO NÚCLEO PARA O CITOPLASMA
mRNA
http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/translation/tleuk.html
ENVELOPE NUCLEAR
Heterocromatina
Eucromatina
Nucléolo
Complexo
Poro nuclear
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/cells/organelle.htm
TRANSPORTE DO mRNA DO NÚCLEO
PARA O CITOPLASMA
http://nobelprize.org/medicine/educational/dna/b/transport/index.html
TRANSPORTE DO mRNA DO NÚCLEO
PARA O CITOPLASMA
A molécula de mRNA é transportada através do poro nuclear.
Antes da translocação começar, algumas proteínas (Ex: componentes de splicing) são
dissociadas do mRNA.
Proteínas envolvidas na exportação ligam-se ao mRNA e posteriormente a receptores no
complexo poro nuclear.
O mRNA é translocado pelo poro nuclear, com a extremidade 5’ CAP na frente.
Quando o mRNA chega ao lado citoplasmático do poro nuclear, muitas proteínas se dissociam deste.
Como as proteínas de exportação que regressam ao núcleo.
A molécula de mRNA está pronta para o próximo passo - TRADUÇÃO
http://nobelprize.org/medicine/educational/dna/a/transport/
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA –
TRANSPORTE DO mRNA
mRNA transportado com a
extremidade 5’ na frente
mRNA associado
ao CPN.
mRNA torna-se alongado de modo a facilitar
o transporte através da abertura do CPN.
Núcleo
Citoplasma
Quando chegado ao lado citoplasmático
os ribossomas ligam-se ao mRNA e a
síntese proteíca é iniciada.
Microscopia electrónica – mRNA associado a proteínas durante o transporte através do complexo poro nulear
(CPN). Barra= 100 nm.
Cell 69: 605-613 1992
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA –
TRANSPORTE DO mRNA
Vista tangencial no lado citoplasmático do CPN.
As setas mostram a passagem de mRNA.
mRNA
Microscopia electrónica – Transporte do mRNA através do complexo poro nulear (CPN) – vista do lado
citoplasmático.
Journal of Molecular Biology, 260:289-477; Cell 69: 605-613 1992
TRANSCRIÇÃO
- DNA transfere informação para o mRNA sob
a forma de uma sequência de nucleótideos
TRADUÇÃO
- A molécula de mRNA é “lida” por sequências de 3
nucleótidos, CODÕES, de 5’->3’.
http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/genetoprot.html
CÓDIGO GENÉTICO
Sequência de tripletos de nucleótidos, codões, ao longo do mRNA e que
determinam a sequência de aa numa proteína.
20 aminoácidos (aa) usados na construção de proteínas,
e os codões que codificam para cada aa.
O código genético é degenerativo ou redundante – 2 ou mais codões codificam para o mesmo aa.
Codões degenerativos diferem no terceiro nucleótideo.
TRADUÇÃO
MOLÉCULAS ENVOLVIDAS NA
TRADUÇÃO
A tradução é catalizada por ribossomas que são
constituídos por proteínas e rRNA (RNA ribossomal),
responsável pela ligação entre os aminoácidos.
Maquinaria básica para o processo de tradução.
A tradução envolve moléculas de tRNA (RNA de
transferência) que liga anti-codões aos codões do mRNA.
Cada anti-codão está ligado a um aminoácido (aa) particular.
O ribossoma liga-se ao primeiro codão AUG (codão de iniciação) no mRNA.
Este codão codifica para o aa metionina (Met).
http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Theory/Translation/translation.htm
TRADUÇÃO: INICIAÇÃO
- A unidade pequena do ribossoma liga-se a um local
"upstream" na extremidade 5’do início do mRNA.
- Prosegue para dowstream (5’->3’) até encontrar o codão de
iniciação AUG.
- Liga-se o anti-codão complementar através do tRNA
iniciador.
- A unidade maior do ribossoma junta-se ao complexo.
- O tRNA iniciador codifica para o aa metionina (Met).
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/17x15.jpg
TRADUÇÃO: ELONGAÇÃO
Met
-O aa inicial, Met, é covalentemente ligado através de rRNA ao aa
seguinte, resultado da ligação do segundo anti-codão ao codão
complementar.
- O tRNA iniciador é libertado.
-O ribossoma move-se ao longo do mRNA fazendo a ligação de anticodões a codões, adicionando aa à cadeia polipeptídica.
http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/translation_initiation.jpg
TRADUÇÃO: ELONGAÇÃO
Quando o ribossoma atinge um codão stop no mRNA, o polipeptídeo e o mRNA
são libertados.
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/17x15.jpg
TRADUÇÃO - RESUMO
Tradução.MOV
TAKE HOME MESSAGE
PROCESSOS DE REPARAÇÃO DE DANOS
ESSENCIAL PARA A MANUTENÇÃO DA
INTEGRIDADE DO DNA
MUTAÇÕES NOS PROCESSOS DE REPARAÇÃO
ESTÃO ASSOCIADOS A DIVERSAS PATOLOGIAS