verificação da qualidade de dna genômico extraído de plasma

VERIFICAÇÃO
DA QUALIDADE DE DNA
GENÔMICO EXTRAÍDO
DE PLASMA BOVINO
PARA PCR*
ALEX SILVA DA CRUZ, DANILO CONRADO SILVA, EMILIA
OLIVEIRA A. COSTA, CLÁUDIO CARLOS DA SILVA,
APARECIDO DIVINO DA CRUZ
Resumo: com o surgimento e melhoramento constante de técnicas laboratoriais voltadas a identificação de sexo fetal, uma das técnicas amplamente
utilizada é a da reação em cadeia pela polimerase. Para que esta metodologia funcione corretamente é nessesarios metodologias de fornecimento de
DNA de boa qualidade. O objetivo do presente estudo foi avaliar a qualidade
de DNA bovino isolado de plasma Até o momento, não foi publicado teste
semelhante para bovinos.
estudos, Goiânia, . 339, n. 2, p. 245-251, abr./jun. 2012.
Palavras-chave: Qualidade. DNA Genômico. Plasma bovino.
P ara que as metodologias de determinação sexual por análise de DNA
funcionem corretamente é necessário uma padronização de técnicas,
que resultem na extração e quantificação de DNA fetal de boa qualidade do sangue materno (SAITO et al., 2000).
A biologia molecular tem criado ferramentas para pesquisa, tanto na medicina humana como na medicina veterinária. A reação em cadeia da polimerase (PCR) possibilita testes altamente sensíveis, cujas aplicações vão desde
o diagnóstico clínico até a programas de melhoramento animal. Contudo, tais
procedimentos dependem da habilidade de se extrair DNA em quantidade
suficiente e de boa qualidade. Há vários métodos de purificação do DNA genômico, no entanto, ainda persistem problemas como contaminação por DNA
estranho, inibidores de PCR e sensibilidade da molécula de DNA, que facilitam
sua quebra (COELHO et al., 2004).
As técnicas de extração e quantificação de DNA para utilização na reação em cadeia
pela polimerase (PCR) permitem a investigação em diferentes amostras biológicas,
mesmo quando o DNA esta presente em pequenas quantidades. Resquícios de saliva,
esfregaço bucal, sangue, bulbos capilares, tecidos incluídos em parafina, ossos, plasma
sanguíneo, gotas de esperma, entre outros, podem fornecer informações importantes,
desde que analisados de forma adequada (BAREA et al., 2004).
Implementação de uma metodologia simples e precisa para extração e quantificação
de DNA fetal em bovinos é importante para a otimização do manejo reprodutivo em
programas de seleção e melhoramento (CARVALHAIS et al., 2005).
Neste aspecto, o conhecimento prévio do sexo fetal, possibilita ao pecuarista planejar antecipadamente o manejo dos rebanhos e os cuidados no pós-parto, direcionando
a venda dos lotes animais e selecionando as fêmeas matrizes que farão parte dos lotes
de reposição, antecipadamente. Nessa situação, a padronização de uma técnica eficaz
de extração e quantificação de DNA permitiria à sexagem fetal, que se tornaria uma
ferramenta útil na seleção dos animais e, conseqüentemente, promover o melhoramento
e direcionar os caminhos da atividade (MARTINHAGO, 2006).
O objetivo do presente estudo foi avaliar a qualidade de DNA bovino isolado de
plasma mediante amplificação de DNA genômico por PCR. Adicionalmente, este estudo foi desenvolvido com o intuito de se aprimorar e difundir o método de extração e
isolamento de DNA circulante em plasma de bovinos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo foi realizado com um grupo de bovinos, composto de animais machos,
fêmeas não prenha e fêmeas, com idade gestacional de 8 meses. O grupo foi constituído de 1 touro e 6 fêmeas bovinas. Os animais não apresentavam à época da colheita das amostras sanguíneas sintomas de doenças e não estavam
em uso de medicamentos.
Colheita das Amostras e Separação do Plasma
As amostras de sangue periférico foram coletadas por punção venosa com seringas
descartáveis heparinizadas. Durante o transporte, as amostras foram colocadas em uma
caixa de isopor, contendo gelo, evitando se drásticas variações de temperatura.
O sangue do macho e da fêmea não prenha foram mantidos inteiros e encaminhados
à extração. Estas amostras extraídas foram destinadas para controle masculino e feminino
na reação de PCR. O restante dos materiais coletados (5 amostra de sangue periférico
de fêmeas com 8 meses de prenhez), foram centrifugados para separação do plasma.
A parte sólida do sangue foi precipitada mediante centrifugação por 10 minutos a
2000rpm. O plasma foi recolhido e processado imediatamente para a extração e purificação do DNA circulante.
estudos, Goiânia, . 39, n. 2, p. 245-251, abr./jun. 2012.
Grupo Amostral
Extração e Quantificação de DNA
O DNA do plasma materno sangue total de fêmea e do macho foi isolado e purificado
usando se dois kits comerciais, incluindo Ilustra Blood GenomicPrep Mini Spin® (GE
HEALTHCARE,UK), Easy-DNA® (Invitrogen Life Technologies, USA), conforme
instruções do fabricante. Foi realizado uma purificação com o extrator Easy-DNA® dobrando as quantidades de amostra e do produto mantendo apenas a adição final de água.
O DNA do sangue total de fêmea e do macho utilizados no controle da PCR
foi extraído utilizando o kit comercial Ilustra Blood GenomicPrep Mini Spin® (GE
HEALTHCARE,UK).
A quantificação das amostras extraídas foi realizada usando se o quantificador
fluorômetro de ácidos nucléicos, GeneQuant pro® (Amersham Biosciences, EUA),
conforme instrução do fabricante.
Amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase
Para a PCR, foram utilizados, conjuntos de primers (oligonucleotídeos iniciadores)
descritos por Resende e colaboradores (2008), contidos na tabela 1.
estudos, Goiânia, . 339, n. 2, p. 245-251, abr./jun. 2012.
Tabela 1: Descrição de primers autossômico bovino
Primers
Seqüência (5’  3’)
Localização
Amplicons (pb)
Gbr bov
AGG TCG CGA GAT TGG TCG
CTA GGT CAT GCA
Autossômica
280
Gbr bov
AAG ACC TCG AGA GAC CCT
CTT CAA CAC GT
Autossômica
280
Para a determinação do melhor DNA amplificável pela PCR, as amostras do material
extraído de plasma e do grupo de controle foram colocados em tubos de PCR , cujas
concentrações foram calculadas para um volume final de 25µL. As condições gerais de
termociclagem podem ser obtidas da Tabela 2.
Tabela 2: Condições de amplificação de DNA genômico bovino por PCR
PCR
Volume
H2O Miliq
7.5µl
Tampão Gold
5.0µl
MgCl
0.5µl
Primer A. 29 pb
0.5µl
Primer A. 30 pb
0.5µl
Taq Polimerase
1.0µl
DNA
10µl
Total
25µl
2
As amplificações das amostras foram feitas por um termociclador de forma descrita
na tabela 3.
Tabela 3: Condições de termociclagem para amplificação de DNA genômico isolado de plasma bovino
Ação
Desnaturação inicial
Desnaturação
Anelamento
Extensão
Extensão final
Armazenamento
Temperatura (oC)
94
94
58
72
72
4
Tempo (minutos)
5
1
0.30
1
7
∞
Quantidade de ciclos
1
40
40
40
1
-
Foi feita eletroforese da amostra em gel de agarose em uma concentração de 1,0%,
durante um período de 1:30 horas, sendo que a voltagem utilizada foi a de 10 volts por
centímetro de gel.
Análise Estatística
O pacote estatístico Excel® 2007 (Microsoft Corporation, EUA) foi usado para o
cálculo das médias, desvio padrão e freqüências percentuais de amplificação.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Resultados das Extrações e Quantificações de Dna
Os resultados observados durante a extração e quantificação das amostras de plasma das fêmeas pelos meios de purificação: Ilustra Blood GenomicPrep, Easy-DNA e
extração Easy-DNA 2X estão demonstrados na Tabela 4.
Animais
F1
F2
F3
F4
F5
Média (DP)
Illustra Blood
9.6ng/ µL
6.1ng/ µL
6.4ng/ µL
6.8ng/ µL
6.9ng/ µL
1.40 ng/ µL
Easy-DNA
17.9ng/ µL
21.9ng/ µL
3.4ng/ µL
18.8ng/ µL
38.2ng/ µL
12.95ng/ µL
Easy-DNA 2X
18.5ng/ µL
18.9ng/ µL
17.0ng/ µL
31.4ng/ µL
57,3ng/ µL
17.04ng/ µL
F1, F2, F3, F4, F5 Amostra de plasma de fêmeas. DP, desvio padrão.
A extração e isolamento de DNA genômico pelo Illustra Blood apresentaram a
menor concentração e o menor desvio padrão dentre os métodos avaliados. Entretanto,
o DNA isolado com Illustra Blood® produziu o melhor rendimento na PCR, com 100%
da amostras amplificadas (Figura 1). Porque o método utiliza Proteinase K (PK), os resultados da PCR podem ser atribuídos a esta etapa, visto que os contaminantes protéicos
contidos nos produtos isolados são a principal causa de inibição da DNA polimerase
estudos, Goiânia, . 39, n. 2, p. 245-251, abr./jun. 2012.
Tabela 4: Resultados da quantificação espectrofotométrica de DNA genômico total isolado de plasma
das vacas, utilizando-se kits comerciais
in vitro. Assim, o uso de uma protease de largo espectro como a PK contribuiu para a
obtenção de DNA de qualidade de plasma. Considerando-se que no plasma sanguíneo
a concentração de proteína é elevada, sugerimos que ao se isolar DNA de plasma deve
se incorporar um passo de digestão proteolítica com uma enzima de largo espectro.
A extração e isolamento de DNA usando o kit Easy-Dna®, embora considerado
robusto para obter DNA de sangue periférico e outros tecidos biológicos, no presente
estudo não foi capaz de produzir DNA de plasma bovino com qualidade satisfatório para
ser amplificado por PCR. Tanto a técnica sugerida pelo fabricante, quanto a modificação
inserida por estes autores não produziu os resultados esperados. Apenas 40% das amostras
foram amplificadas por PCR, sendo as amostra F1 e F2 para o Easy-DNA® e F1 e F3 para
o produto isolado com a técnica modificada. Porque o método de isolamento de DNA
Easy-DNA® não utiliza um protease inespecífica, parte do contaminante protéico isolado
concomitantemente com o DNA funcionam como um potente inibidor da reação de PCR.
Para funcionar como controles de amplificação por PCR, foi obtido DNA bovino
isolado de sangue total de um macho e de uma fêmea, cujos resultados foram representados na Tabela 5. Foi usado sangue periférico para a obtenção de DNA controle
devido à facilidade de se obter maior quantidade de DNA a partir das células sanguíneas nucleadas em circulação periférica. Para simular as condições do DNA isolado de
plasma, para a PCR os DNAs genômicos controles forma diluídos de 1:10, refletindo
a média de concentração de todos as amostra avaliadas.
Resultados da amplificação do material extraído
estudos, Goiânia, . 339, n. 2, p. 245-251, abr./jun. 2012.
Tabela 5. Resultados da quantificações espectofotométrica do DNA controle obtido de sangue total de bovinos.
Animais controles
Ilustra Blood
M
242.5 ng/ µL
F
229.0 ng/ µL
A Figura 1 ilustra os resultados da PCR feita a partir de DNA isolado de plasma
bovino. Os amplicons foram produzidos conforme o esperado (280pb) para todas as
amostras do Illustra Blood® e em apenas 40% para as amostras extraídas com EasyDNA®.
Figura 1: Amplicons de genoma bovino gerados por PCR a partir de DNA isolado de plasma
Legenda: MM = marcador de tamanho molecular em pares de base; F1 a F5 = fêmeas doadoras de plasma; C- = controle negativo;
C+f = controle positivo de fêmea; C+m= controle positivo de macho. Tamanho do amplicon esperado foi de 280pb.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos com a extração de DNA genômico de plasma bovino permitem
concluir que o kit comercial de purificação de DNA Illustra Blood® apresenta eficiência
de 100% resultando em DNA de boa qualidade comprovada pela amplificação pela PCR.
De fato as extrações que não utilizam uma protease inespecífica, resultaram em baixa
eficiência de amplificação (40%), devido a presença do contaminante protéico isolado
juntamente com o DNA funcionam como um inibidor da reação de PCR.
Finalmente é permitido concluir que a utilização de uma protease inespecífica é
fundamental para a purificação de DNA genômico de boa qualidade. Nesse sentido a
padronização de uma técnica de extração de DNA bovino e amplificação por PCR é um
fator muito importante para a execução da sexagem fetal em plasma de vacas prenhas.
Abstract: with the rise and continuous improvement of laboratory techniques aimed at
identifying fetal sex, a technique widely used is the polymerase chain reaction. For this
methodology is to work properly necessaries methods of providing good quality DNA.
The aim of this study was to evaluate the quality of DNA isolated from bovine plasma
So far, not been published similar test for cattle.
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estudos, Goiânia, . 39, n. 2, p. 245-251, abr./jun. 2012.
Referências
estudos, Goiânia, . 339, n. 2, p. 245-251, abr./jun. 2012.
* Recebido em:05.03.2012.
Aprovado em:17.03.3012.
ALEX SILVA DA CRUZ
Mestrando em Biologia Celular e Molecular na Universidade Federal de Goiás (UFG).Zootecnista pela
Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC Goiás).
DANILO CONRADO SILVA
Biólogo pela PUC Goiás.
EMILIA OLIVEIRA A. COSTA
Bióloga e Mestre em Genética pela PUC Goiás. Bolsista da Comissão Nacional de Energia Nuclear.
CLÁUDIO CARLOS DA SILVA
Doutor em Biologia Celular e Molecular pela UFG. Professor na PUC Goiás.
APARECIDO DIVINO DA CRUZ
Doutor em Biologia Molecular pela University of Victoria- BC, Canadá. Professor nos Departamentos
de Biologia e de Medicina da PUC Goiás. Biomédico Geneticista da Secretaria de Estado da Saúde de
Goiás. E-mail: [email protected]