universidade federal de minas gerais faculdade de farmácia

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
SHIRLEIDE SANTOS NUNES
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO POLIETILENOGLICOL NA CIRCULAÇÃO
E BIODISTRIBUIÇÃO DE LIPOSSOMAS PH-SENSÍVEIS,
RADIOMARCADOS COM TECNÉCIO-99m EM MODELOS EXPERIMENTAIS
BELO HORIZONTE
2016
SHIRLEIDE SANTOS NUNES
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO POLIETILENOGLICOL NA CIRCULAÇÃO
E BIODISTRIBUIÇÃO DE LIPOSSOMAS PH-SENSÍVEIS,
RADIOMARCADOS COM TECNÉCIO-99m EM MODELOS EXPERIMENTAIS
Dissertação
apresentada
ao
Programa
de
Pós-
Graduação Em Ciências Farmacêuticas da Faculdade
de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais,
como requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Valbert Nascimento Cardoso
Co-orientadores: Prof. Dr. André Luís Branco de Barros
Profa. Dra. Mônica Cristina de Oliveira
Belo Horizonte
2016
COLABORADORES
Profa. Dra. Elaine Amaral Leite – Laboratório de Farmacotécnica e Tecnologia
Farmacêutica – Departamento de Produtos Farmacêuticos – Faculdade de
Farmácia – UFMG;
Profa. Dra. Isabela da Costa Cesar – Laboratório de Pesquisa em
Farmacotécnica e Tecnologia Farmacêutica, Faculdade de Farmácia - UFMG;
Dr. Marcelo Alexandre de Farias - Laboratório Nacional de Nanotecnologia.
(LNNANO, Campinas);
Dr. Rodrigo Portugal - Laboratório Nacional de Nanotecnologia. (LNNANO,
Campinas).
Renata Salgado Fernandes – mestranda pelo programa de Ciências
Farmacêuticas - Faculdade de Farmácia – UFMG;
Carolina Henriques Cavalcante - Aluna de iniciação científica - Laboratório de
Radioisótopos - Faculdade de Farmácia – UFMG;
A todos que tornaram esse trabalho possível, eu pude conhecer o quão grande é a
disponibilidade para me auxiliar e o desejo do meu sucesso.
AGRADECIMENTOS
Eu tenho tanto e a tantos agradecer, meu tempo era curto, mas obtive tanta
ajuda, sem muitas vezes precisar pedir, e por tudo sou tão grata!
À Deus, por ser meu refúgio, amparo e fortaleza em cada passo dado, em
cada conquista alcançada.
Aos meus pais, Maria e Xisto, pelo apoio, exemplo, por serem a razão de eu
querer crescer e ser uma pessoa melhor. Pelas orações que sempre me
fortaceleram.
Ás minhas irmãs, Sheila, Shirlinha, Lana, pela paciência, pela companhia e por
sempre estarem prontas para o que eu precisasse.
Aos meus cunhados, primos e toda a minha família pelo apoio e carinho.
À Lu pela amizade, por contribuir para o meu crescimento e participar das
minhas conquistas.
Aos laços, por tornarem essa jornada mais leve e meus dias mais felizes. A
todos os meus amigos pela torcida e carinho que sempre me ampararam.
À Renata pelo companheirismo, pela cumplicidade, por ser minha “IC” e por
ajudar a tornar esse trabalho possível.
À Ju pela amizade, por estar disponível sempre que eu precisei. Carol e
Liziane por serem as melhores colegas de bancada do mundo.
Aos amigos do laboratório de farmacotécnica e do laboratório de radioisótopos
pela ajuda, carinho e pelo incentivo.
Aos IC’s Carol e Sued, pela grande ajuda e por contribuírem com este trabalho.
Ao professor Valbert, pelos ensinamentos e incentivo, por ser um exemplo de
pesquisador e de sucesso. Pela confiança e carinho a mim depositados.
À professora Mônica, agradeço a orientação, o acolhimento, a confiança, os
ensinamentos, a dedicação e por ser um exemplo de profissional e de caráter.
A Dra. Viviane por incentivar meu crescimento e ser um exemplo de dedicação.
A todos da medicina nuclear, pela paciência, companheirismo, carinho e por
segurarem as pontas sempre que precisei. Sem vocês eu não teria conseguido.
A professora Elaine, pelo carinho, pela paciência, pelo comprometimento e por
ser um exemplo de competência.
A professora Isabela pela disponibilidade e pela imensa contribuição
depositada a esse projeto.
Ao Dr. Rodrigo Portugal e ao Dr. Marcelo Alexandre de Farias, pela grande
ajuda e contribuição nos experimentos de microscopia no LNNANO.
Ao Vinicius, pela paciência e por estar sempre a disposição.
À veterinária Maria Adelaide e ao José Batista por estarem sempre disponíveis,
auxiliando nos cuidado com os animais.
Ao Vanderli, pelo apoio, parceria e disponibilidade.
A CNEN, CNPq e FAPEMIG pelo apoio financeiro.
E por fim, ao professor André Luís Branco de Barros, pela amizade, por
acreditar em mim, por torcer e contribuir para meu crescimento. Por trazer
alegria e esperança em momentos em que acreditei não ser possível. Por estar
onde e quando eu precisei. Pelo imenso aprendizado. Esse trabalho é tão seu
quanto meu.
“é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final... Eu prefiro na
chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco,
que em conformidade viver”.
(Martin Luther King).
RESUMO
Lipossomas são vesículas lipídicas amplamente estudadas em todo o mundo
como
carreadoras
de
diversas
substâncias.
O
polímero
hidrofílico
polietilenoglicol (PEG) é adicionado à superficie dos lipossomas para prolongar
o tempo de circulação sanguínea por reduzir a opsonização das vesículas, o
que diminui a captação da formulação pelo sistema fagocitário mononuclear
(SFM). Vários estudos afirmam que o peso molecular do PEG, bem como a
combinação de diferentes tipos de PEG com pesos moleculares diferentes
alteram a farmacocinética do lipossoma. Por essa razão, a proposta do
presente estudo consistiu em avaliar a influência do peso molecular e de
combinações de PEG com diferentes tamanhos de cadeia na farmacocinética e
biodistribuição de lipossomas pH-sensíveis contendo o complexo 99mTc-HYNICβAla-Bombesina(7-14) em modelos animais de tumor 4T1 e tumor de Ehrlich.
Foram preparadas oito formulações lipossomais, os resultados demonstraram
que os lipossomas apresentaram adequadas propriedades químicas e físicoquímicas como diâmetro médio inferior a 300nm, populações monodispersas,
potencial zeta próximo a neutralidade e teor de encapsulação da bombesina de
26,4 a 38,7%. As imagens obtidas por criomicroscopia eletrônica de
transmissão (cryo-MET) permitiram a visualização de vesículas unilamelares
com diâmetro médio 90 nm. Não foi encontrada diferença no tempo de meiavida (T1/2), dessa forma, para a composição de lipossomas avaliada, o PEG
não aumentou o tempo de circulação. Os estudos de biodistribuição e imagens
cintilográficas mostraram elevada captação pelos órgãos do SMF, fígado e
baço. A formulação de PEG2000 apresentou maiores concentrações no
sangue. Os lipossomas constituídos por DSPE, PEG2000 e PEG1000/5000
apresentaram maior captação no tumor em comparação ao músculo
contralateral, porém não houve diferença estatística entre as formulações na
relação tumor/músculo obtidas nos estudos de biodistribuição ou imagens
cintilográficas. Os resultados sugerem que para essa formulação a adição do
PEG não resultou em maior concentração do peptídeo radiomarcado no tecido
de interesse, sendo necessários estudos adicionais para confirmar essa
hipótese.
Palavras-chave:
Lipossomas,
polietilenoglicol,
tecnécio-99m,
bombesina,
tumor.
ABSTRACT
Liposomes are lipid vesicles widely studied throughout the world as
nanocarriers for different substances. The hydrophilic polymer polyethylene
glycol (PEG) might be added onto the surface of liposomes to prolong the
circulation time by reducing the opsonization of the vesicles, leading to a
reduced uptake by the mononuclear phagocyte system (MPS). Several studies
claim that the molecular weight of the PEG, as well as combination of different
types of PEG with different molecular weights may alter the pharmacokinetics of
the liposome. Therefore, the purpose of this study was to evaluate the influence
of molecular weight and PEG combinations with different chain sizes in the
pharmacokinetics and biodistribution of pH-sensitive liposomes containing
99mTc-HYNIC-βAla-Bombesin
complex (7-14 ) in tumor models (4T1 and
Ehrlich). Eight liposomal formulations were prepared, the results showed that
the liposomes exhibited adequate chemical and physical-chemical properties,
such as mean diameter less than 300nm, monodisperse populations, neutral
zeta potential, and encapsulation content of 26.4 to 38.7%. The images
obtained
by
transmission
electron
criomicroscopy
(cryo-TEM)
allowed
visualization of unilamellar vesicles with an average diameter of 90 nm. There
was no difference in blood half-life (T1/2), thereby for the composition of
liposomes used in this study, PEG did not increase blood circulation time.
Biodistribution studies and scintigraphic images showed high uptake by organs
of the SMF, liver and spleen. The PEG2000 formulation showed higher
concentration in blood. Liposomes with DSPE, PEG2000 or PEG1000 / 5000
showed higher uptake in the tumor compared to the contralateral muscle, but
there was no statistical difference between the formulations when tumor-tomuscle ratio, obtained in the biodistribution studies or scintigraphic images, was
analyzed. The results suggest that for this specific formulation, the addition of
PEG was not efficient for increasing the concentration of the radiolabeled
peptide in tumor tissue, however further studies to confirm this hypothesis is
required.
Keywords: liposomes, polyethylene glycol, technetium-99m, bombesin, tumor.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diferentes tipos de nanotransportadores.............................................
21
Figura 2. Representação esquemática do processo de formação de
lipossomas...........................................................................................................
23
Figura 3. Classificação de lipossomas de acordo com o diâmetro médio e
número de bicamadas..........................................................................................
24
Figura 4. Representação esquemática do efeito da modificação de superfície
de nanopartículas pela incorporação de PEG na adsorção de proteínas
plasmáticas e na biodistribuição..........................................................................
25
Figura 5. Estrutura do mPEG-DSPE...................................................................
26
Figura 6. Estruturas químicas do CHEMS (A) e DOPE (B).................................
27
Figura 7. Representação esquemática da organização estrutural de derivados
da PE na ausência e na presença de CHEMS....................................................
28
Figura 8. Comportamento de fases das membranas lipídicas............................
29
Figura 9. Imagem de criomicroscopia ilustrando lipossomas de DPPC/DSPEmPEG2000...........................................................................................
32
Figura 10. Estrutura química do lisofosfolípide da DOPE (1-oleil 2-hidroxi
fosfatidiletanolamina)..............................................................................................
35
Figura 11. Representação esquemática da interação fosfolípide-açúcar.............
36
Figura 12. Diferentes configurações apresentadas pelas moléculas de PEG......
38
Figura 13. Acúmulo espontâneo de nanopartículas na região tumoral pelo efeito
EPR..............................................................................................................
43
Figura 14. Seqüência de aminoácidos dos peptídos PLG18-27 (Peptídeo
liberador de gastrina), bombesina e NMB (Neuromedina B) ................................
44
Figura 15. Estrutura dos agentes quelantes para o tecnécio-99m........................
47
Figura 16. Extrusor de média pressão...................................................................
53
Figura 17. Curva da depuração sanguínea para o complexo
99m
Tc-HYNIC-βAla-
Bombesina(7-14) encapsulado nas formulações.......................................................
69
Figura 18. Fotomicrografias obtidas por cryo-MET para lipossomas de DSPE
em diferentes campos............................................................................................
71
Figura 19. Fotomicrografias obtidas por cryo-MET para lipossomas de
PEG2000 em diferentes campos............................................................................
71
Figura 20. Fotomicrografias obtidas por cryo-MET para lipossomas de
PEG1000-5000 em diferentes campos .................................................................
72
Figura 21. Perfil de liberação do complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14)
encapsulado em lipossomas em presença de plasma a 37ºC..............................
72
Figura 22. Biodistribuição do complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14),
após administração intravenosa, em animais BALB/c acometidos pelo tumor
4T1.........................................................................................................................
74
Figura 23. Biodistribuição do complexo
99m
Tc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14), após
administração intravenosa, em animais BALB/c acometidos pelo tumor
4T1........................................................................................................................
74
Figura 24. Relações tumor/músculo para o complexo 99mTc-HYNIC-βAlaBombesina (7-14) nos lipossomas de DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000 nos
tempos de 1 e 4h após a administração em camundongos BALB/c com tumor
4T1.......................................................................................................................... 76
Figura 25. Imagens cintilográficas após administração intravenosa do complexo
99m
Tc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14) em camundongos Balb/C acometidos pelo
tumor 4T1 nos tempos de 1 e 4 horas....................................................................
78
após administração intravenosa, em camundongos Swiss acometidos pelo
tumor de Ehrlich...................................................................................................... 79
após administração intravenosa, em camundongos Swiss acometidos pelo
tumor de Ehrlich...................................................................................................... 79
Figura 28. Relações tumor/músculo para o complexo 99mTc-HYNIC-βAlaBombesina(7-14) nos lipossomas de DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000 nos
tempos de 1 e 4h após a administração em camundongos Swiss com tumor de
81
Ehrlich ...............................................................................................................
Figura 29. 29 Imagens cintilográficas após administração intravenosa do
complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14) em camundongos Swiss, A,B =
DSPE 1,4 HORAS; C,D = PEG2000 1, 4 HORAS; E,F = PEG 1000-5000 1, 4
HORAS...........................................................................................................................
82
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Diâmetro médio e IP dos lipossomas após as etapas de
preparo.................................................................................................................. 61
Tabela 2. . Diâmetro médio, IP, potencial zeta e distribuição de diâmetro das
vesículas...............................................................................................................
64
Tabela 3. Teor de encapsulação do complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(714) para as diferentes formulações lipossomais....................................................
66
Tabela 4. Tempo de meia-vida das formulações lipossomais contendo o
complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14)......................................................
68
Tabela 5. Relação alvo/não-alvo para para o complexo 99mTc-HYNIC-βAlaBombesina (7-14) nos lipossomas de DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000 nos
tempos de 1 e 4h após a administração em camundongos BALB/c com tumor
4T1........................................................................................................................
78
Tabela 6. Relação alvo/não-alvo para o complexo
99m
Tc-HYNIC-βAla-
Bombesina(7-14) encapsulado nos lipossomas de DSPE, PEG2000 e PEG10005000 nos tempos de 1 e 4h após a administração em camundongos Swiss
com tumor de Ehrlich............................................................................................
82
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA
Analysis of Variance/Análise de variância
CEUA
Comissão de Ética no Uso de Animais
CHEMS
Cholesteryl hemisuccinate/Hemisuccinato de colesterila
CPM
Contagens por minuto
cryo-MET
microscopia eletrônica de transmissão após congelamento
Da
Dálton
DI
Dose injetada
DMEM
Meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DOPE
Dioleoylphosphatidylethanolamine/
Dioleilfosfatidiletanolamina
DOX
Doxorrubicina
DP
Desvio padrão
DSC
Differential calorimetry scanning/Calorimetria exploratória
diferencial
DLS
Dynamic Light Scattering /espalhamento dinâmico da luz
DSPE
Distearoylphosphoethanolamine/
Diestearoilfosfatildiletanolamina
DSPE-mPEG2000 Distearoylphosphoethanolamine-methoxypolyethyleneglycol
2000/Diestearoilfosfatildiletanolaminametoxipolietilenoglicol2000
DSPE-PEG
Distearoylphosphoethanolamine-polyethyleneglycol
/Diestearoilfosfatildiletanolamina-polietilenoglicol
DTPA
Ácido Dietileno Triamino Pentacético
EDDA
Ácido etilenodiaminodiacético
EPR
Enhanced Permeability and Retention/Permeabilidade e
retenção aumentados
FALT
Fixed aqueous layer thickness/espessura da camada
aquosa fixa
HII
Fase hexagonal II
HMPAO
Hexametilpropilenoaminoxima
HYNIC
Ácido hidrazinonicotínico
IP
Índice de polidispersão
LNLS
Laboratório Nacional de Luz Síncroton
LUV
Large unilamellar vesicles/Lipossomas unilamelares
grandes
MET
Microscopia Eletrônica de Transmissão
MLV
Multilamellar vesicles/Lipossomas multilamelares
PCS
Photo Correlation Spectroscopy/Espectroscopia de
correlação do fóton
PE
Fosfatidiletanolamina
PEG
Polietilenoglicol
PE-PEG
Fosfatidiletanolamina/ Polietilenoglicol
PLG
Peptídeo liberador de gastrina
ROI
Região de interesse
SFM
Sistema Fagocitário Mononuclear
SUV
Small Unilamellar Vesicles / Lipossomas unilamelares
pequenos
Tm
Temperatura de transição de fase
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 17
REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................... 19
1.
NANOTECNOLOGIA ....................................................................................... 20
2.
LIPOSSOMAS.................................................................................................. 22
2.1 CLASSIFICAÇÃO .......................................................................................... 23
2.2.
PROPRIEDADES FÍSICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DOS LIPOSSOMAS.... 28
2.3.
ESTABILIDADE FÍSICA E QUÍMICA DOS LIPOSSOMAS ........................ 33
2.4.
CRIOPROTEÇÃO ..................................................................................... 35
3.
POLIETILENOGLICOL..................................................................................... 36
4.
MEDICINA NUCLEAR ...................................................................................... 39
4.1. RADIOFÁRMACOS ...................................................................................... 40
4.2.
NANORRADIOFÁRMACOS ...................................................................... 41
4.3.
O ISÓTOPO TECNÉCIO-99m................................................................... 43
5.
BOMBESINA .................................................................................................... 44
6.
CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................. 48
OBJETIVOS ............................................................................................................... 49
OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 50
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 50
TRABALHO EXPERIMENTAL ................................................................................... 51
1.
MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 52
1.1.
MATERIAL ................................................................................................ 52
1.2.
MÉTODOS ................................................................................................ 52
1.2.1.
PREPARO DOS LIPOSSOMAS ......................................................... 52
1.2.2.
CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOSSOMAS ......................................... 53
1.2.3.
FORMAÇÃO DO COMPLEXO 99mTc- HYNIC-βALA-BOMBESINA..... 55
1.2.4.
DETERMINAÇÃO DA PUREZA RADIOQUÍMICA .............................. 56
1.2.5.
ENCAPSULAÇÃO (CONGELAMENTO/DESCONGELAMENTO ....... 56
1.2.6.
TEOR DE ENCAPSULAÇÃO ............................................................. 56
1.2.7.
PERFIL DE LIBERAÇÃO ................................................................... 56
1.2.8.
DEPURAÇÃO SANGUÍNEA EM ANIMAIS SADIOS .......................... 57
1.2.9.
DESENVOLVIMENTO DOS MODELOS TUMORAIS NOS
CAMUNDONGOS ............................................................................................ 57
2.
RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 60
2.1.
PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOSSOMAS ........................... 60
2.1.1.
PADRONIZAÇÃO DA METODOLOGIA ............................................. 61
2.1.2.
PREPARO DAS FORMULAÇÕES ..................................................... 63
2.1.3.
TEOR DE ENCAPSULAÇÃO ............................................................. 65
2.2.
PUREZA RADIOQUÍMICA ........................................................................ 67
2.3.
DEPURAÇÃO SANGUÍNEA EM ANIMAIS SADIOS.................................. 67
2.4.
CRIOMICROSCOPIA ................................................................................ 69
2.5.
PERFIL DE LIBERAÇÃO .......................................................................... 71
2.6.
ESTUDOS DE BIODISTRIBUIÇÃO E IMAGENS CINTILOGRÁFICAS EM
ANIMAIS COM TUMOR 4T1................................................................................ 73
2.7.
ESTUDOS DE BIODISTRIBUIÇÃO E IMAGENS CINTILOGRÁFICAS EM
ANIMAIS COM TUMOR DE EHRLICH ................................................................ 78
3.
CONCLUSÃO .................................................................................................. 82
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS……………………………………………………………………………84
ANEXO 1 .................................................................................................................. 104
APÊNDICE ............................................................................................................... 105
17
INTRODUÇÃO
A nanotecnologia é uma ciência capaz de manipular a matéria à escala atômica
e molecular, criando novos materiais e desenvolvendo novos produtos à escala
nanométrica (Scheu et al., 2006). Esta ciência aborda, sobretudo, a
caracterização, manipulação, fabricação e aplicação de estruturas biológicas e
não biológicas à escala referida. Materiais e produtos com tamanhos desta
ordem de grandeza geralmente exibem características funcionais únicas, não
encontradas em matérias similares à escala macro (Sahoo et al., 2007; Chau et
al., 2007). Atualmente, a nanotecnologia é um dos principais focos das
atividades de pesquisa em todo o mundo.
Na área de ciências farmacêuticas, e em particular na encapsulação de
fármacos, inúmeros estudos têm sido realizados com o objetivo de desenvolver
sistemas que permitam direcionar e controlar a liberação de fármacos, e dessa
forma obter alternativas terapêuticas com melhor eficácia e menos efeitos
adversos. A terapia convencional é, muitas vezes, limitada devido à baixa
solubilidade aquosa de muitos fármacos, além da impossibilidade de aumento
da dose administrada o que poderia potencializar os efeitos adversos. Neste
contexto, a encapsulação destes fármacos em nanossistemas, especialmente
lipossomas, surge como uma alternativa para superar essas limitações.
(BATISTA; CARVALHO; SANTOS-MAGALHÃES, 2007).
Os lipossomas são vesículas formadas por bicamadas concêntricas de
fosfolipídios, que apresentam capacidade de incorporar uma diversidade de
compostos, sejam eles hidrofílicos ou hidrofóbicos (ALLEN; HANSEN; LOPES
DE MENEZES, 1995; VOINEA; SIMIONESCU, 2002). Os lipossomas como
carreadores de fármacos, são utilizados para alcançar a acumulação seletiva
do fármaco no tecido ou células de interesse. Os lipossomas têm sido
carreadores aceitos clinicamente no diagnóstico e tratamento de diversos
processos
patológicos,
visto
que
eles
alteram
a
farmacocinética
biodistribuição dos fármacos encapsulados (MAMOT et al, 2003).
e
18
Porém quando moléculas coloidais como os lipossomas são administradas por
via intravenosa, podem sofrer adsorção de proteínas séricas como as
opsoninas, ocasionando sua captura pelas células do sistema fagocitário
mononuclear (SFM), sobretudo no fígado, baço e medula óssea (tecidos ricos
em macrófagos), sendo rapidamente eliminados, limitando o direcionamento
para outros tecidos (ALLEN e HANSEN, 1991; PATEL, 1992). Uma alternativa
a essa limitação é o recobrimento desses lipossomas por polímeros hidrofílicos
como o polietilenoglicol (PEG), que reduzem o reconhecimento pelo SFM e
com isso aumentam o seu tempo de circulação.
Várias pesquisas tem se concentrado no estudo do PEG, constatando-se que
diferentes propriedades desse polímero, como concentração e peso molecular,
alteram a sua interação com a nanopartícula e com o meio ao qual ele é
adicionado. Por essa razão, o objetivo desse estudo foi avaliar a influência do
peso molecular do PEG na farmacocinética e biodistribuição de lipossomas
radiomarcados. Para isso foram preparados oito tipos de formulações
lipossomais com diferentes pesos moleculares de PEG na forma isolada e com
combinações de pesos moleculares diferentes.
Em um primeiro momento no trabalho experimental é relatado o preparo e
caracterização das formulações.
A marcação do peptídeo HYNIC-βAla-
Bombesina(7-14) com átomos de tecnécio-99m que foi encapsulado nos
lipossomas. Em seguida, foi avaliado o tempo de meia-vida das formulações na
corrente sanguínea. Ao final, as formulações de escolha foram utilizadas em
estudos in vivo de biodistribuição e imagens cintilográficas em dois modelos
tumorais distintos (4T1 e Ehrlich).
19
REVISÃO DA LITERATURA
20
1. NANOTECNOLOGIA
A nanotecnologia é o ramo da ciência que estuda a compreensão,
desenvolvimento e controle de estruturas e materiais manipulados em escala
nanométrica. Um nanômetro (nm) corresponde à bilionésima parte do metro
(1x10-9 m) e as estruturas produzidas nesta escala, assumem novas
propriedades físicas, mecânicas, elétricas, químicas e biológicas (MELO et al.,
2004; SCHEU et al., 2006). Materiais e produtos com tamanhos desta ordem
de grandeza geralmente exibem características funcionais únicas, não
encontradas em matérias similares à escala micro ou macrométrica (SAHOO et
al., 2007; CHAU et al., 2007).
Um dos principais fatores que diferencia significativamente os nanomateriais de
outros materiais é o aumento expressivo na sua área superficial. Dessa forma,
o fato de inúmeras reações químicas poderem ocorrer na superfície das
partículas sugere que uma dada massa de material nanoparticulado será muito
mais reativa que a mesma massa de material feito com partículas grandes
(PISON et al., 2006).
O desenvolvimento da nanotecnologia tem demonstrado ser um campo
científico multidisciplinar, encontrando aplicações nas mais diversas áreas,
desde setores de energia e eletrônica até indústrias farmacêuticas (ROSSI –
BERGMANN, 2008). No campo das ciências farmacêuticas, podem-se
destacar: novos medicamentos baseados em nanoestruturas, sistemas de
difusão de medicamentos que atinjam pontos específicos no corpo humano;
materiais de substituição (próteses) biocompatíveis com órgãos e fluidos
humanos; kits de autodiagnostico; sensores laboratoriais construídos sobre
chips; materiais para a regeneração de ossos e tecidos; protetores solares;
produtos para recuperação da pele; produtos para maquiagem (ALVES, 2004,
2010; ROCO, 1999).
A aplicação da nanotecnologia para o desenvolvimento de medicamentos mais
seguros e eficazes veio alterar o panorama das indústrias farmacêuticas e de
biotecnologia. Com o uso de nanomateriais desenvolveram-se os sistemas de
liberação controlada de fármacos, frequentemente descritos como “Drug
21
Delivery Systems”, que oferecem inúmeras vantagens quando comparados aos
fármacos convencionais (PIMENTEL et al, 2007).
A vetorização de fármacos, baseada na teoria de Paul Ehrlich sobre a
capacidade de minúsculas partículas em carrear moléculas ativas aos sítios
específicos de ação, é uma das principais linhas da pesquisa biofarmacêutica
das últimas décadas, fazendo parte de uma grande área que rapidamente
emergiu no Brasil e no mundo. A utilização de sistemas coloidais
nanoestruturados constitui uma alternativa que visa alterar a biodistribuição de
fármacos após sua administração por diferentes vias (BANKER et al., 1996).
São vários os estudos realizados por diferentes grupos de investigação em
todo o mundo com o objetivo de desenvolver sistemas que permitam direcionar
e
controlar
a
liberação
de
fármacos,
assim
como
caracterizar
os
nanotransportadores obtidos. (ARULSUDAR et al., 2004, PETERSEN et al.,
2012).
Os nanotransportadores podem ser constituídos por diferentes materiais,
incluindo materiais orgânicos e inorgânicos.
Atualmente, existem diferentes
tipos de nanotransportadores como lipossomas, nanopartículas, complexos
lipídicos, dendrímeros e micelas poliméricas, entre outros (COUVREUR et al.,
1995;RAWAT, 2006; PARK, 2007;). Na Figura 1 apresentam-se os tipos mais
comuns de nanotransportadores disponíveis atualmente.
Figura 1: Diferentes tipos de nanotransportadores, adaptado de Rawat, 2006
22
De uma forma geral, os nanotransportadores são considerados como
excelentes veículos para o transporte e liberação de fármacos pelas inúmeras
vantagens que oferecem. Entre estas se destacam: a proteção do fármaco
frente a degradação no organismo, a manutenção de níveis plasmáticos por
tempo mais prolongado; o aumento da eficácia terapêutica; a liberação
progressiva e controlada do fármaco; a diminuição expressiva da toxicidade do
fármaco veiculado; a possibilidade de direcionamento a alvos específicos (sítioespecificidade); a possibilidade de incorporação tanto de substâncias
hidrofílicas quanto lipofílicas; a diminuição da dose terapêutica e do número de
administrações e o aumento da aceitação da terapia pelo paciente (RAWAT,
2006; PIMENTEL, et al., 2007)
Embora estas vantagens sejam significativas, alguns inconvenientes não
podem ser ignorados, como por exemplo; possível toxicidade relacionada aos
constituintes do próprio veículo, ausência de biocompatibilidade dos materiais
utilizados e o elevado custo de obtenção dos nanossistemas comparados com
as formulações farmacêuticas convencionais (RAMOS; PASA, 2008). Por
essas razões, diversas pesquisas buscam melhorar as características físicoquímicas e os processos de produção das nanopartículas com o intuito de
aumentar a eficiência desses sistemas como carreadores de fármacos e
possibilitar sua aplicação clínica.
2. LIPOSSOMAS
Descobertos nos anos 60 por Alec Bangham, os lipossomas vem sendo
investigados intensivamente, com vista à sua utilização como transportadores
de fármacos para diversas aplicações clínicas (GREGORIADIS, 1995;
TORCHILIN, 2005).
Lipossomas são sistemas lipídicos dispersos constituídos frequentemente por
fosfolípides, os quais em meio aquoso se organizam espontaneamente em
bicamadas formando vesículas esféricas. Essas bicamadas circundam uma
cavidade aquosa interna e se encontram envolvidas por um meio aquoso
(Figura 2). Considerando que os lipossomas são constituídos por moléculas
anfifílicas, os mesmos são capazes de encapsular substâncias hidrofílicas,
lipofílicas e anfifílicas. Moléculas hidrofílicas são encapsuladas na sua cavidade
interna, onde estão presentes os grupos polares dos fosfolípides. As
substâncias lipofílicas são acomodadas na região apolar da bicamada e as
23
anfifílicas ao longo de toda sua extensão, interagindo com a região apolar e
polar. Esses sistemas lipídicos foram descritos, na década de 60, por Bangham
e colaboradores (1965) como modelos de membranas biológicas. A utilização
dos lipossomas como sistemas de liberação de fármacos foi proposta na
década de 70. Entretanto, as primeiras formulações de lipossomas estudadas
não produziram os resultados esperados, devido à instabilidade das vesículas,
à baixa taxa de encapsulação dos fármacos e à escolha inadequada da via de
administração (LASIC, 1998).
Figura 2 - Representação esquemática do processo de formação de lipossomas:
auto-organização de moléculas individuais de fosfolípideos (a) a folhetos de
bicamada membranar (b), seguido da formação em lipossomas (c). A bicamada
lipídica é composta por moléculas lipídicas individuais dispostas
ordenadamente com as suas caudas hidrofóbicas voltadas para o interior da
bicamada e com os seus grupos polares voltados para o meio aquoso e para o
meio exterior ao lipossoma (d). Imagem adaptada de Jesorka, A. e Orwar, O.
(2008).
2.1 CLASSIFICAÇÃO
As propriedades químicas e físico-químicas dos lipossomas variam de acordo
com sua composição lipídica, diâmetro vesicular, lamelaridade, carga
superficial e método de preparação.
2.1.1. LIPOSSOMAS UNILAMELARES E MULTILAMELARES
24
Os lipossomas são classificados de acordo com o diâmetro e número de
bicamadas em (i) vesículas unilamelares pequenas (SUV), (ii) vesículas
unilamelares grandes (LUV) e (iii) vesículas multilamelares (MLV). As vesículas
unilamelares, formadas por uma bicamada única, são denominadas SUV
quando possuem diâmetro compreendido entre 25-100 nm e em LUV, quando
apresentam diâmetro entre 100 e 1000 nm (Figura 3). Os lipossomas
multilamelares são formados por bicamadas sucessivas, separadas por
compartimentos aquosos, com diâmetro > que 1 µm (NEW, 1990; SAHOO, 2003).
Figura 3- Classificação de lipossomas de acordo com o diâmetro médio e
número de bicamadas (LOPES et al., 2013b).
2.1.2 LIPOSSOMAS CONVENCIONAIS E DE CIRCULAÇÃO PROLONGADA
Os
lipossomas
convencionais
são
constituídos
essencialmente
por
fosfatidilcolinas e colesterol, e ainda um lipídeo com carga negativa ou positiva
para
evitar
a
agregação
das
vesículas,
esses
lipossomas
quando
administrados por via intravenosa, sofrem adsorção de proteínas séricas como
as opsoninas (imunoglobulinas, fibronectina), ocasionando sua captura pelas
células do sistema fagocitário mononuclear (SFM), sobretudo no fígado, baço e
medula óssea (tecidos ricos em macrófagos), sendo rapidamente eliminados,
limitando a utilização para outros tecidos (ALLEN e HANSEN, 1991; SENIOR e
ALVING, 1987; PATEL, 1992; SZEBENI,1998). Investigações iniciadas na
década de 90 foram realizadas com o objetivo de reduzir a captação dos
25
lipossomas convencionais pelas células do SFM e aumentar seu tempo de
permanência na circulação.
Os lipossomas de circulação prolongada, possuem um revestimento na
superfície, que pode ser constituído de componentes hidrofílicos naturais
(monossialogangliosíideo
e
fosfatidilinositol)
ou
sintéticos
como
os
polietilenoglicois (PEG). Foi observado que a incorporação, na membrana dos
lipossomas, de lipídeos acoplados ao PEG, altera sua interação com o
ambiente, sendo o efeito mais importante a redução da captura pelos
macrófagos, prolongando o tempo de circulação sanguínea. Esses lipossomas
(Figura 4) denominados lipossomas de circulação prolongada ou furtivos,
permitem uma distribuição do fármaco para outros órgãos além daqueles do
SFM (FONTES et al., 2005).
Figura 4. Representação esquemática do efeito da modificação de superfície de
nanopartículas pela incorporação de PEG na adsorção de proteínas plasmáticas
e na biodistribuição. Adaptado de AGARWAL et al., 2009.
O derivado de PEG, metoxiPEGdiestearilfosfatidiletanolamina(mPEG-DSPE) –
Figura 5, tem sido extensivamente utilizado no preparo de lipossomas de
circulação prolongada. A presença de volumosos grupos hidrofílicos na
superfície dos lipossomas parece constituir um obstáculo estérico às proteínas
plasmáticas que podem atuar como opsoninas. Consequentemente, os
lipossomas são menos reconhecidos e destruídos pelas células do SFM
(KLIBANOV et al., 1990; WOODLE e LASIC, 1992; STORM et al., 1995).
26
Figura 5 - estrutura do mPEG-DSPE2000. Fonte: www.avantilipis.com (2016)
Assim, lipossomas revestidos com PEG podem permanecer por mais tempo na
circulação, uma vez que são menos captados pelo SFM, devido a formação de
uma camada aquosa ao redor do lipossoma que dificulta o reconhecimento da
partícula, constituindo um poderoso instrumento para auxiliar o diagnóstico
e/ou tratamento de diversas doenças (CARMO et al., 2008b, SADZUKA et al.,
2002).
2.1.3 LIPOSSOMAS pH-SENSÍVEIS
Os lipossomas também podem ser classificados em polimórficos, estes se
tornam reativos devido à mudança em sua estrutura em consequência de uma
alteração de pH (pH-sensíveis), temperatura (termo-sensíveis) (BATISTA;
CARVALHO; MAGALHAES, 2007)
O uso de lipossomas pH-sensíveis como sistemas de liberação de fármacos foi
sugerido a partir da observação de que tecidos enfermos (tumores, inflamações
e infecções) apresentam um pH menor do que os tecidos normais (GULINO et
al., 1967), além do fato de que alguns tipos de vírus desenvolveram estratégias
para aproveitar-se da acidificação do meio do lúmen endossomal para infectar
células (SIMÕES et al., 2004). Esses lipossomas exibem transições de fases,
características dos seus constituintes fosfolipídicos, que são responsáveis pela
desestabilização das vesículas em meio ácido e são estáveis em pH fisiológico
(pH 7,4).
Os lipossomas pH-sensíveis são constituídos por fosfolípides derivados da
fosfatidiletanolamina (PE), como por exemplo, a dioleilfosfatidiletanolamina
(DOPE). Estes derivados organizam-se em meio aquoso, a temperatura
ambiente, sob a forma hexagonal, não sendo capazes de se apresentar na
forma de vesículas (SIEGEL, 1986).
27
A formação de lipossomas com estes fosfolípides requer a adição de agentes
estabilizantes, normalmente lipídeos carboxilados, como o hemisuccinato de
colesterila (CHEMS), que em pH fisiológico se encontram sob a forma ionizada
(Figura 6). Esses estabilizantes são capazes de se inserirem entre as
moléculas de fosfolípides, e o aparecimento de repulsões eletrostáticas entre
os grupamentos carboxila, presentes no estabilizante, e os grupos fosfato dos
fosfolípides favorecem a organização lamelar (Figura 7), possibilitando a
formação dos lipossomas. A exposição dos lipossomas pH-sensíveis a um
meio ácido resulta na protonação dos agentes estabilizantes, com consequente
desestabilização das vesículas e a liberação do material encapsulado
(OLIVEIRA et al., 2000).
Figura 6. Estruturas químicas do CHEMS (A) e DOPE (B). Fonte:
www.avantilipis.com (2016)
28
Figura 7. Representação esquemática da organização estrutural de derivados da
PE na ausência e na presença de CHEMS.
2.2.
PROPRIEDADES FÍSICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DOS
LIPOSSOMAS
As propriedades e aplicações dos lipossomas dependem das características
físicas e físico-químicas de suas membranas.
2.2.1. TRANSIÇÃO DE FASE DOS LÍPIDES
A fluidez da bicamada, quando constituída de um único tipo de lípide, depende
da temperatura de transição de fase (Tm) do estado gel (sólido) para o estado
líquido-cristalino (fluido) (Figura 8). Quando a temperatura do meio é igual à
Tm, as cadeias carbônicas dos lípides passam do estado ordenado (sólido)
para o estado fluido no qual estas cadeias encontram-se desordenadas e têm
grande liberdade de movimento. Portanto, de acordo com a Tm, as membranas
lipossomais de diferentes composições podem exibir diferentes níveis de
fluidez sob as mesmas condições de temperatura. A permeabilidade da
bicamada depende da fluidez da membrana e da natureza do soluto
29
encapsulado. A taxa de permeabilidade mais elevada ocorre na Tm e é menor
no estado “gel” em comparação com o estado fluido (FRÉZARD, 1999).
Figura 8. Comportamento de fases das membranas lipídicas (Adaptado de
FRÉZARD et al., 2005).
Um componente lipídico importante, muito utilizado na composição dos
lipossomas, é o colesterol. Este aumenta a rigidez das membranas no estado
“cristal-líquido” e reduz a rigidez e os defeitos estruturais das membranas no
estado “gel”.
2.2.2 DIÂMETRO DAS VESÍCULAS
A obtenção de lipossomas com diâmetro reduzido e distribuição homogênea
das vesículas é um importante fator para garantia da estabilidade dessa forma
farmacêutica. Muitos estudos utilizam lipossomas unilamelares homogêneos
com diâmetro compreendido entre 50 e 150 nm. Essa faixa é um meio termo
entre a eficiência de encapsulação (aumenta de acordo com o aumento do
diâmetro), a estabilidade do lipossoma (diminui com o aumento do diâmetro
acima da faixa ótima de 80-200 nm) e capacidade de extravasamento (diminui
com o aumento do diâmetro). Além disso, para preparações de uso
endovenoso o limite de 5 μm apresenta relevância fisiológica, por ser um
preventivo da oclusão da microvasculatura, uma vez que os capilares
sanguíneos possuem diâmetro interno entre 4 e 9 μm (LASIC, 1998).
São utilizadas diferentes técnicas para análise do diâmetro e distribuição dos
lipossomas. Dentre estas estão compreendidas técnicas de espalhamento da
luz (BERGER, N. et al., 2001; CASALS et al., 2003; YANG et al., 2006) e
microscopia, como microscopia de criofratura (BERGER et al., 2001) e
30
microscopia de força atômica (RUOZI et al., 2005; RAMACHANDRAN et al.,
2006). Neste trabalho foi empregada a técnica denominada espectroscopia de
correlação de fótons (PCS) ou espalhamento dinâmico da luz (Dynamic Light
Scattering) na análise do diâmetro das vesículas lipossomais.
A técnica de PCS consiste em atravessar determinada amostra com um feixe
de laser, de modo que as partículas presentes espalhem a luz. O
espalhamento da luz está relacionado ao movimento browniano das partículas
de modo que a intensidade da luz espalhada por estas forme um padrão de
movimento. Por meio da dispersão da luz, torna-se possível determinar o
diâmetro médio das partículas. Partículas menores são capazes de
movimentarem mais rapidamente e causam rápidas modificações no
espalhamento da luz. Por outro lado, partículas de maior diâmetro, as quais
possuem menores coeficientes de difusão, resultam em menores flutuações na
intensidade do espalhamento da luz (HASKELL et al., 1998). Esta técnica
permite a medida de partículas cujos diâmetros estejam compreendidos na
faixa de 1 a 5000 nm (MALVERN INSTRUMENTS, 1996a).
2.2.3. POTENCIAL ZETA
A medida do potencial zeta é uma ferramenta muito útil na detecção da
magnitude de interações repulsivas entre as partículas coloidais e é
comumente utilizada para avaliar a estabilidade dos colóides (CASALS et al.,
2003).
O potencial zeta pode ser definido como a carga existente na fronteira entre a
superfície de uma partícula individual e seus íons associados. A carga não
pode ser medida diretamente, mas pode-se determinar a grandeza da carga
elétrica pelas medidas da mobilidade eletroforética das partículas submetidas à
aplicação de um determinado campo elétrico (FLORENCE; ATTWOOD, 2003).
Para a determinação do potencial zeta dos lipossomas foi utilizado um método
que consiste na incidência de um feixe de luz e aplicação de um campo elétrico
de força conhecida através da amostra. Neste método, as partículas
carregadas se deslocam com velocidades distintas induzindo deslocamentos
da frequência do feixe de luz incidente, gerando um espectro de frequências.
31
As frequências são então utilizadas para os cálculos das velocidades, as quais
são convertidas para valores de mobilidades eletroforéticas e em seguida os
dados são transformados em valores de potencial zeta. (MALVERN
INSTRUMENTS, 1996b).
2.2.4. MORFOLOGIA DOS LIPOSSOMAS
A caracterização morfológica dos lipossomas é de fundamental importância
para garantir que as formulações desenvolvidas apresentem as propriedades
físicas desejadas que terão impacto na incorporação do agente antitumoral
nesses sistemas, no seu comportamento in vivo (biodistribuição e atividade
antitumoral), assim como na sua estabilidade de armazenamento. O emprego
da técnica de microscopia eletrônica de transmissão (MET) possibilita a análise
morfológica dos lipossomas e objetiva à caracterização desses nanossistemas
mediante a avaliação de parâmetros como lamelaridade e diâmetro, bem como
a observação de alterações relacionadas aos fenômenos de agregação e fusão
das partículas (NEW, 1990).
O princípio da técnica de MET consiste na emissão de um feixe de elétrons por
um filamento de tungstênio aquecido que promove a emissão termoiônica de
elétrons que são acelerados em um tubo sob vácuo em direção à amostra. O
feixe eletrônico transmitido incide sobre uma tela fluorescente, um filme
fotográfico ou uma câmera de vídeo, gerando a imagem da amostra (OREFICE
et al., 2006).
A principal vantagem relacionada ao emprego de MET é sua elevada resolução
que possibilita a análise de detalhes estruturais de lipossomas como a
lamelaridade (BIBI et al., 2011). Entretanto, na análise de lipossomas por MET,
o processo de desidratação durante o preparo da amostra pode causar o
encolhimento da partícula e distorção no diâmetro e o pré-tratamento da
amostra com corantes específicos pode gerar artefatos e causar alterações na
estrutura original vesicular. As manchas dos próprios corantes podem também
levar à formação de franjas claras e escuras que podem ser interpretadas
como estruturas lamelares na amostra a ser analisada. Além disso, o alto
vácuo e o bombardeamento de elétrons, característicos em MET, também
podem causar alterações na morfologia dos lipossomas. Neste contexto,
32
algumas variações relacionadas ao preparo de amostra podem otimizar a
análise e reduzir a ocorrência de artefatos, como por exemplo, a adoção do
processo de congelamento da amostra em gelo amorfo (criomicroscopia)
(SEDDON, 1990; BIBI et al., 2011).
Uma das técnicas de preparo para análise por MET mais comumente utilizadas
consiste na coloração negativa dos lipossomas. Como a possibilidade de
espalhamento elástico é diretamente relacionada ao número atômico e
considerando-se que as bicamadas de fosfolípides dos lipossomas são
constituídas basicamente por carbono e hidrogênio, pode-se prever que haverá
baixo espalhamento eletrônico por estas estruturas. Dessa forma, o contraste é
fornecido por sais de metais pesados como o acetato de uranila, por tetróxido
de ósmio ou por ácido fosfotúngstico, os quais espalham fortemente os
elétrons. A partir da coloração negativa, o fundo encontra-se corado e os
lipossomas não. Dessa forma, nas imagens por MET, a região exterior das
vesículas aparece em preto enquanto a área interna é visualizada na cor
branca (NEW, 1990; BIBI et al., 2011).
Figura 9 – Imagem de criomicroscopia ilustrando lipossomas de DPPC/DSPEmPEG2000. A fotomicrografia permite a visualização dos lipossomas pela
técnica de preparo por coloração negativa das vesículas após utilização de
acetato de uranila. Adaptado de HOLZER, 2009.
2.2.5.
EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO
33
A eficiência de encapsulação (EE) é a medida da razão do fármaco
encapsulado em relação ao fármaco livre (não encapsulado) (OHNISHIE,
2013). Este é um parâmetro importante que deve ser considerado na escolha
do método de preparação lipossomal. A EE pode ser otimizada dependendo do
método de encapsulação e da manipulação da composição lipídica da
membrana. É importante a obtenção de altas taxas de encapsulação,
particularmente quando o fármaco possui doses elevadas ou quando não é
possível o reaproveitamento do fármaco não encapsulado. A relação
fármaco/lípide também deverá ser maximizada, visto que determina a
quantidade de lípide a ser administrada ao paciente. Assim, quanto menor for a
quantidade de lípide veiculada, menores serão os riscos de efeitos adversos
associados aos mesmos (SWARBRICK;BOYLAN, 1994; FRÉZARD et al.,
2005).
Como anteriormente descrito, fármacos podem ser encapsulados no interior
dos lipossomas (hidrofílicos) ou na bicamada lipídica (hidrofóbicos). A
encapsulação desses fármacos durante o preparo dos lipossomas denominase encapsulação passiva, porém baixas taxas (5 a 15%) são alcançadas para
moléculas hidrofílicas (BATISTA; CARVALHO; MAGALHAES, 2007; SANTOS
e CASTANHO, 2002). Além disso, esse método gera lipossomas LUV não
homogêneos,
o
que
requer
posterior
sonicação
ou
extrusão
para
homogeinização das vesículas (BOZZUTO e MOLINARI, 2015; MUPPIDI et al.,
2012). Uma metodologia utilizada para maximizar a eficiência de encapsulação
de fármacos hidrofílicos é a técnica de congelamento/descongelamento em
nitrogênio líiquido – N2 (freeze-thaw-FT). Lipossomas SUVs pré-formados são
congelados com N2 (- 196°C), na presença do fármaco e de crioprotetor. Em
seguida, são descongelados a uma temperatura acima da transição de fase
(Tm) dos lipídios, o que culmina no rompimento da bicamada lipídica
permitindo a entrada do fármaco nos lipossomas e consequente encapsulação
do mesmo (COSTA; XU; BURGESS, 2014).
2.3.
ESTABILIDADE FÍSICA E QUÍMICA DOS LIPOSSOMAS
Para funcionar efetivamente como um vetor de fármacos, é importante que os
lipossomas se mantenham suficientemente estáveis por um período de tempo
34
razoável. Esses podem sofrer mudanças tanto físicas quanto químicas durante
a estocagem. As mudanças físicas podem ocorrer nas vesículas fosfolipídicas,
incluindo agregação e fusão. Já as mudanças químicas incluem hidrólise das
ligações éster dos fosfolípides em dispersões aquosas de lipossomas e
oxidação dos fosfolípides que contêm ácidos graxos insaturados, bem como a
oxidação do colesterol. Todas essas transformações podem causar a perda do
material encapsulado (CHOW et al., 1995).
Um dos aspectos mais importantes relacionados à estabilidade física dos
lipossomas é a mudança do tamanho das partículas e de sua distribuição. A
agregação e a fusão das vesículas são as principais fontes desta instabilidade.
Agregação de lipossomas neutros é causada por interações de Van der Waals,
e tende a ser mais pronunciada em vesículas grandes. Embora fatores como
resíduos de solventes e traços de elementos possam potencializar esse
processo, a formação de agregados de lipossomas é um fenômeno natural e
inevitável para membranas sem carga. A maneira mais simples de contornar
essa situação é utilizar lípides carregados na formulação (NEW, 1990).
CASALS e colaboradores (2003) afirmam que a presença de 25% de lípides
carregados confere uma suficiente estabilidade eletrostática que evita a
agregação e fusão de vesículas por um período de 3 meses, a 4ºC. Outra
forma de aumentar a estabilidade dos lipossomas é revesti-los com polímeros
hidrofílicos não-iônicos, como PEG, o que leva ao aparecimento da repulsão de
hidratação caracterizada pela presença de uma barreira estérica que impede a
aproximação das vesículas (ULRICH, 2002).
Muitas dispersões de fosfolípides contêm lípides insaturados (cadeias acila).
Os lípides insaturados sofrem degradação oxidativa ou peroxidação lipídica.
Essas reações podem ocorrer durante a preparação, o armazenamento ou no
momento do uso. A peroxidação é um processo complexo envolvendo reações
radicalares que resultam na formação de peróxidos cíclicos e hidroperóxidos.
Essa degradação oxidativa acontece rapidamente se os lípides insaturados não
forem protegidos durante a preparação e o armazenamento. Essa proteção é
realizada pela manutenção do sistema em atmosfera de gás inerte, como
nitrogênio ou argônio; pela remoção de metais pesados (adição de EDTA) e/ou
pela adição de antioxidantes, como alfa-tocoferol ou butilhidroxitolueno.
35
A hidrólise dos lípides leva a formação de lisofosfolípides (Figura 10) e ácidos
graxos livres. Os lisofosfolípides podem ser posteriormente hidrolisados em
glicerofosfocompostos e ácidos graxos. Esses produtos de reação podem
alterar a rigidez da bicamada lipossomal, a retenção do material encapsulado e
o diâmetro das vesículas e, portanto, devem ser mantidos em níveis mínimos
(VEMURI et al., 1995).
Figura 10. Estrutura química do lisofosfolípide da DOPE (1-oleil 2-hidroxi
fosfatidiletanolamina), fonte: www.avantilipiscom (2016).
2.4.
Como
CRIOPROTEÇÃO
descrito
anteriormente,
o
método
de
encapsulação
por
congelamento/descongelamento é utilizado para aumentar a EE. Porém, tanto
o congelamento quanto o descongelamento podem induzir a danos nas
membranas dos lipossomas, resultando no aparecimento de fenômenos
relacionados à agregação e/ou fusão das vesículas. Os lipossomas podem ter
seu diâmetro alterado se estabilizantes apropriados não forem empregados
(MOHAMMED et al., 2006; CHEN et al, 2010). Assim sendo, para promover
estabilidade física durante o processo de encapsulação, agentes crioprotetores
como açúcares (por exemplo, sacarose, trealose e glicose) e seus derivados
podem ser utilizados. Aminoácidos também têm sido estudados quanto a sua
capacidade crioprotetora (MOHAMMED et al., 2007).
Os açúcares inserem-se entre as porções polares do fosfolípide, levando à
formação de ligações de hidrogênio (Figura 11). Essas interações entre os
açúcares e os fosfolípides permitem a manutenção do estado físico das
membranas durante o congelamento de forma similar à existente no estado
hidratado. (van WINDEN et al., 1997). Além disso, a manutenção da
integridade da membrana lipídica na presença de açúcares está associada com
a formação de uma matriz vítrea dos açúcares à temperatura ambiente. Esta é
amorfa, termodinamicamente instável e caracterizada por alta viscosidade e
36
baixa mobilidade molecular. A formação dessa matriz vítrea evita a fusão da
membrana lipídica, sendo importante para a manutenção do diâmetro das
vesículas e a retenção do conteúdo encapsulado (CACELA; HINCHA, 2006;
RICKER et al., 2003; van WINDEN et al., 1997).
Figura 11. Representação esquemática da interação fosfolípide-açúcar.
3.
POLIETILENOGLICOL
Em geral, quando um fármaco é encapsulado dentro de um lipossoma, a
eliminação a partir do plasma diminui, enquanto o tempo de meia-vida
plasmática (t1/2) e a área sob a curva aumentam (Cattel, L. et al., 2003;
Gabizon, A. et al., 2002). A farmacocinética e a biodistribuição das formulações
lipossomais
encapsulando
fármacos
são
influenciadas
pelo
tamanho,
composição lipídica, dose de fármaco, estabilidade e via de administração
(ALLEN e CULLIS, 2004). Consequentemente, a adição de PEG à superfície
lipossomal também interfere na farmacocinética dessas formulações. Como
anteriormente relatado, esse polímero é utilizado para aumentar o tempo de
circulação da partícula na qual ele foi incorporado, no entanto, vários fatores
devem ser avaliados para que ele mantenha as propriedades pelas quais foi
adicionado.
A concentração de PEG que pode ser acrescentada a formulação é de suma
importância para a estabilidade e aumento de circulação (BRADLEY et al.,
1998; TORCHILIN, 2007). Vários estudos avaliaram qual a concentração de
PEG provocaria um maior aumento na circulação sem reduzir a estabilidade da
nanopartícula.
Acredita-se que apenas uma pequena quantidade de PEG pode ser
acrescentada
a
superfície
lipossomal.
Concentrações
de
5-10%
de
37
fosfatidiletanolamina acoplado a PEG (PE-PEG) de massa molecular 10002000Da conferem excelente estabilidade às formulações (ULRICH, 2002;
GARBUZENKO et al., 2005;
TORCHILIN, 2007; VARGA et al., 2013).
BRADLEY e colaboradores sugerem que 4-6 % de PEG (1500 Da) confere
estabilidade a lipossomas, já que concentrações maiores de PEG favorecem o
processo de micelização, isso porque, quando a quantidade de PEG aumenta,
o mesmo acontece com grupo hidrofílico da cabeça do fosfolipíde, bem como a
tendência para formar micelas em vez de bicamadas lipídicas (BEDU-ADDO et
al., 1996; BRADLEY et al., 1998; SHIMADA et al., 2000)
Além da concentração ideal do PEG na membrana lipossomal para
manutenção da estabilidade e do aumento da circulação, outros fatores
relacionados ao PEG alteram a farmacocinética da nanopartícula. Sugyiama e
colaboradores estudaram amplamente a utilização do PEG e sua influência na
circulação. Em termos das suas propriedades físico-químicas, os autores
examinaram a interação entre o tempo de circulação prolongada dos
lipossomas e as condições da molécula de PEG na superficie lipossomal (KUHI
et al., 1994; TORCHILIN et al., 1995; JANZEN et al., 1996).
Após a funcionalização com PEG, uma camada aquosa fixa é formada em
torno dos lipossomas através da interação entre o polímeros de PEG e
molécula de água (SHIMADA et al., 1995), que impede a aproximação de
opsoninas, isso porque, as proteínas do soro não conseguem reconhecer a
nanopartícula devido a água recolhida na superfície dos lipossomas. Como
resultado, os lipossomas PEG-funcionalizados conseguem evadir das células
do SFM, e consequentemente apresentam um tempo de circulação prolongado
(WU et al, 1993; SCHMITZ et al, 1992;. Papafadjopoulos et al, 1991). A
espessura da camada aquosa fixa (fixed aqueous layer thickness-FALT) em
torno do lipossoma foi medida usando eletroquímica interfacial e foi constatado
que a FALT de lipossomas PEG-funcionalizados aumentou em comparação
com lipossomas sem a presença da molécula de PEG (SHIMADA et al.,1995;
ZEISIG et al., 1996).
A partir disso foram avaliadas várias cadeias de PEG com pesos moleculares
diferentes, e verificou-se que a FALT em torno de lipossomas foi aumentada
38
com o aumento do peso molecular de PEG. Modelagem molecular das cadeias
de PEG presentes na superfície de lipossomas mostrou que, pelo menos, duas
conformações podem ser identificadas, "cogumelos" (enxertos isolados) e
"escovas" (conformação de cadeia estendida determinada pela interação entre
cadeias vizinhas) (NEEDHAM et al. , 1997).
Como ja relatado que o peso molecular do PEG interfere na farmacocinetica,
SUGIYAMA e SADSUKA (2007), avaliaram se a combinação de PEG com
comprimentos de cadeia diferentes provocaria algum beneficio na FALT e/ou
no tempo de circulação. Verificou-se que a inserção de cadeias de PEG com
baixo peso molecular junto a estruturas contendo moléculas de PEG com alto
peso molecular conduziu a mudança da conformação de cogumelo para
escova, e consequentemente, levou a um aumento na camada de solvatação e
no tempo de circulação das partículas (Figura 12).
Figura 12. Diferentes configurações apresentadas pelas moléculas de PEG. (a)
PEG de cadeia curta gerando menor espessura da camada protetora (La); (b)
PEG de cadeia longa com espessura intermediária (Lb); (c) Mistura de PEGs
(cadeias longa e curta) produzindo maior espessura da camada protetora
(Lc).(Sugiyama et al., 2007).
Outro estudo avaliou o efeito na atividade antitumoral da doxorrubicina (DOX)
em lipossomas após a utilização de misturas de PEG comparados a mesma
39
formulação com a adição do PEG na forma isolada. Além do aumento da FALT
provocado pela combinação de PEG de diferentes pesos moleculares (cadeias
de polietilenoglicol curtas e longas), houve um ganho na biodistribuição e na
atividade antitumoral da DOX, se comparado à mesma formulação com apenas
um tipo de PEG (SADZUKA et al., 2002; SADZUKA et al., 2003)
Esses achados confirmam a expectativa de que a FALT e um longo tempo de
circulação dos lipossomas têm uma conexão direta (MATSUO et al., 2000;
SADZUKA et al., 2005). Quando a concentração de PEG em torno do
lipossoma é maior que 4,7 mol%, as cadeias de PEG se encontram na forma
em 'escova' (TORCHILIN et al., 1994; KENWORTHY et al., 1995; NIKOLOVA
et al., 1998), esta condição induz a um maior tempo circulação no sangue,
evitando o aprisionamento por células do SFM (TORCHILIN et al., 1994). No
entanto, não há um aumento expressivo na FALT quando apenas um tipo de
PEG é acrescentado ao lipossoma, ainda que aumente o peso molecular das
cadeias de polietilenoglicol, o que justifica a utilização de dois tipos de PEG
com pesos moleculares diferentes (SADZUKA et al., 2002; SUGIYAMA et al.,
2011).
Uma vez confirmadas as alterações na farmacocinética das formulações
lipossomais provocadas pela adição do PEG, torna-se relevante estudar a
influência do peso molecular do PEG na biodistribuição e avaliar quais as
alterações provocadas pela adição de diferentes tamanhos de cadeia desse
polímero. Nesse contexto, a medicina nuclear é uma importante ferramenta
para acompanhar a farmacocinética de diversas substâncias, incluindo
nanoestruturas, pois uma vez radiomarcadas, é possível determinar a
biodistribuição das mesmas através da atividade radioativa emitida por elas
utilizando um contador de radiação (BOERMAN et al., 2000).
4.
MEDICINA NUCLEAR
A medicina nuclear é uma especialidade médica que utiliza métodos seguros e
não invasivos através de radionuclídeos para diagnóstico e tratamento de
doenças. Seu surgimento iniciou-se após a descoberta dos Raios-X em 1895,
por Wilhelm Conrad Roentgen (THRALL; ZIESSMAN, 2003).
40
Os materiais radioativos são administrados, normalmente, por via endovenosa,
oral, inalatória ou subcutânea, e apresentam distribuição para órgãos ou
células específicas, não havendo risco de reações alérgicas. A distribuição
depende das características do radionuclídeo quando aplicado na forma
isolada, ou este pode estar ligado a um grupo químico de alguma molécula,
formando um radiofármaco, e dessa forma a distribuição depende da molécula
radiomarcada. O diagnóstico é baseado em alterações bioquímicas e
fisiológicas do órgão em exame, sem a necessidade de alterações anatômicas,
fornecendo o diagnóstico da doença de forma não invasiva e em um estágio
inicial (CONTI et al., 1996; THRALL; ZIESSMAN, 2003).
4.1. RADIOFÁRMACOS
Os radiofármacos são moléculas ligadas a elementos radioativos (radioisótopos
ou radionuclídeos) emissores de radiação, utilizados na medicina para terapia e
para exames de diagnóstico por imagem. Os radiofármacos são compostos por
dois componentes: carreador (moléculas) e radionuclídeo, sendo sua aplicação
(diagnóstico ou terapia) diretamente relacionada ao radioisótopo utilizado (LIU,
2004). Os radiofármacos são alvo de grande interesse de pesquisadores em
todo o mundo que buscam tecnologias inovadoras e melhores resultados para
exames de imagem para diversas doenças, principalmente o câncer
(BANERJEE et al., 2001, OLIVEIRA et al.,2006).
Diversos radiofármacos, vem sendo utilizados tanto para o diagnóstico como
terapia. No Brasil, há, aproximadamente 40 desses compostos sendo utilizados
em Medicina Nuclear, gerando um volume de exames em torno de 3 milhões
procedimentos/ano (SANTOS-OLIVEIRA, 2010).
As características do radionuclídeo escolhido serão responsáveis pela
aplicação e indicação do radiofármaco. Como exemplo, para aplicações em
diagnóstico em Medicina Nuclear utilizam-se radiofármacos que apresentam na
sua constituição radioisótopos emissores de radiação gama (γ) ou emissores
de pósitrons (β+) (OLIVEIRA et al., 2006).
41
Assim, após a administração, o radiofármaco se distribui e atinge diferentes
tecidos dependendo das características do carreador e por meio de
equipamentos de detecção e imagem pode-se realizar a medida da radiação.
Este procedimento permite avaliar a biodistribuição do radiofármaco e localizar
os focos onde o mesmo foi mais captado (BOERMAN et al., 2000).
4.2.
NANORRADIOFÁRMACOS
Com o intuito de melhorar o desempenho dos radiofármacos, em especial
quanto à sua penetrabilidade e direcionamento específico, pesquisas em
nanotecnologia
propiciaram
o
advento
de
radiofármacos
em
escala
nanométrica, chamados nanorradiofármacos, que promoveram um novo
paradigma tanto para a Medicina Nuclear quanto para a Radioproteção e
Dosimetria e desponta como alternativa viável ao tratamento e diagnóstico de
tumores (GARNETT & KALLINTERI, 2006, TING et al., 2010).
No campo da oncologia diversos estudos têm sido realizados para a
incorporação de agentes anticâncer em sistemas nanoestruturados devido à
melhora no perfil de distribuição do fármaco nos tecidos e células. Isso se
baseia no fato de que esses sistemas promovem uma liberação controlada do
fármaco associada a uma distribuição mais seletiva (alvo-específica) de modo
a superar as limitações encontradas nos tratamentos convencionais (CHO et
al., 2008). Além disso, o uso da nanotecnologia permite a proteção dos
radiofármacos de condições desfavoráveis, do microambiente tumoral (pH,
oxidação, entre outros) e da ação de enzimas, mantendo-os íntegros e
impedindo
sua
degradação
prematura,
além
de
aumentar
sua
biodisponibilidade, seu tempo de retenção e sua captação celular (CHO et al.,
2008).
Segundo KIM e colaboradores (2009), as estratégias de sistemas de
direcionamento a um alvo podem ser classificadas em duas categorias: 1)
sinalização passiva, que age em consonância com o efeito de permeabilidade e
retenção aumentadas (EPR - Enhanced Permeability and Retention) e 2)
sinalização ativa, que emprega vetores ou ligantes direcionais.
42
O direcionamento passivo é conseguido por meio da incorporação do agente
terapêutico em uma macromolécula ou nanopartículas que atinge o órgão alvo
de forma passiva. Fármacos encapsulados em nanopartículas ou acoplados a
macromoléculas podem passivamente chegar aos tumores devido ao efeito
EPR (BLAU et al., 2006, SINGH & LILLARD, 2009).
Os nanocarreadores, de maneira geral, não conseguem extravasar pela
vasculatura de tecidos saudáveis, cujas fenestrações do endotélio são de
aproximadamente 2 a 4 nm. Em contrapartida, os tecidos tumorais demonstram
um aumento de permeabilidade (fenestrações entre 300-800 nm), regulado,
parcialmente, pela secreção anormal de i) fator de crescimento do endotélio
vascular;
ii)
bradicinina;
iii)
óxido
nítrico;
iv)
prostaglandinas;
v)
metaloproteinases. Associado a isso ocorre uma deficiência nos vasos
linfáticos nesta região, dificultando a drenagem dos fluidos intersticiais. Estes
dois fatores são os responsáveis pelo chamado efeito EPR (KOO et al., 2005,
ALEXIS et al., 2008, CHO et al., 2008, DAVIS et al., 2008).
Como
resultado
do
aumento
da
permeabilidade
vascular,
partículas
poliméricas, micelas ou lipossomas com tamanhos característicos na faixa de
10 a 500 nm e carregados com fármacos antitumorais podem favorecer a maior
acumulação desses agentes no tecido tumoral (CHO et al., 2008). Em alguns
casos, esse efeito pode aumentar a concentração do fármaco encapsulado nos
tumores sólidos em 70 vezes (LIECHTY & PEPPAS, 2012). A eficiência desses
sistemas é tão maior quanto maior for a capacidade da partícula de prolongar
os períodos de circulação sanguínea (CHO et al., 2008).
De modo resumido, nanopartículas com tamanho na ordem de 200 nm
conseguem atravessar as fenestrações mais largas dos neovasos dos tumores
sólidos, mas não conseguem transpor aquelas dos endotélios dos tecidos
normais. O resultado disso é maior acúmulo das nanopartículas com fármaco
no tumor com pouca ou nenhuma nanopartícula nos tecidos normais
(OLIVEIRA et al., 2012).
43
Figura 13. Acúmulo espontâneo de nanopartículas na região tumoral pelo efeito
EPR (CHO et al., 2008)
4.3.
O ISÓTOPO TECNÉCIO-99m
O tecnécio-99m (99mTc) é o radionuclídeo mais usado em medicina nuclear, por
apresentar propriedades físicas e químicas ideais para um radiofármaco, tais
como: meia-vida física de 6,01 horas, emissão gama de baixa energia (140
keV), alta disponibilidade do radioisótopo a partir de um sistema gerador de
Molibdênio-99/Tecnécio-99m (99Mo/99mTc), além de apresentar um custo
relativamente baixo (JURISSON, 1993; JONES, 1995; MARQUES et al., 2001;
YANG et al., 2003).
O
99mTc
é um metal de transição da família VII B e tem número atômico 43,
podendo existir em oito estados de oxidação (-1 a +7). A estabilidade desses
estados de transição depende do tipo de ligação e do ambiente químico. Os
estados +7 e +4 são mais estáveis e são representados em óxidos, sulfetos,
haletos e pertecnetatos (DEWANJEE, 1990; SAHA, 1998).
O íon pertecnetato (99mTcO4-) tem estado de oxidação +7 para o
99mTc,
isso o
torna uma espécie não reativa e incapaz de ligar a algum composto, sendo
necessária a redução do
99mTc,
do estado +7 para um estado de oxidação
menor. O cloreto de estanho II (SnCl2 . 2H2O) é o agente redutor mais comum
44
usado na preparação de compostos ligados ao
99mTc
(NOWOTNIK, 1990;
SAHA, 1998).
99mTc
O
reduzido é uma espécie quimicamente reativa e combina com uma
grande variedade de agentes quelantes. O agente quelante geralmente é
doador de elétrons e forma uma ligação covalente coordenada com o
99mTc
reduzido. (SAHA, 1998).
Lipossomas radiomarcados para imagens tumorais vêm sendo pesquisados
desde a década de 1970. Os lipossomas são geralmente marcados pela
conjugação a moléculas-âncoras presentes tanto na cavidade aquosa (por
exemplo, deferoxamina DF) quanto na membrana lipídica (por exemplo,
Ácido Dietileno Triamino Pentacético - DTPA) (HAMOUDEH et al., 2008).
OYEN et al. (1996) avaliaram lipossomas de circulação prolongada
radiomarcados com
99mTc
na detecção de infecção e inflamação. De BARROS
et al. (2013) avaliaram lipossomas de longa circulação radiomarcados na
identificação de tumores. Nesse último trabalho foi utilizado um peptídeo
(bombesina) radiomarcado, encapsulado em lipossomas pH-sensiveis de longa
circulação como possível radiotraçador para diagnóstico de câncer de mama.
5.
BOMBESINA
Bombesina é um tetradecapeptídeo (Figura 14) isolado da pele do sapo
Bombina bombina e apresenta alta afinidade pelo receptor para o peptídeo
liberador de gastrina presente nos mamíferos. A bombesina pertence à família
de peptídeos que inclui o peptídeo liberador de gastrina, composto por 27
aminoácidos, e a neuromedina B, composta por 10 aminoácidos, que é
derivada de suínos (PATEL et al., 2006).
Figura 14. Seqüência de aminoácidos dos peptídos PLG18-27 (Peptídeo liberador
de gastrina), bombesina e NMB (Neuromedina B) - (Adaptado de PATEL et al.,
2006).
45
As atividades farmacológicas deste peptídeo incluem estimulação da liberação
de hormônios como gastrina e somatostatina, além de estimular a contração do
músculo liso do estômago e intestino. Além disso, os receptores para PLG e
bombesina apresentam efeitos mitogênicos e estimulam a proliferação tumoral
(LANGER; BECK-SICKINGER, 2001).
Existem quatro subtipos de receptores para a família de peptídeos liberadores
de gastrina que são conhecidos como BB1-R, BB2-R, BB3-R e BB4-R, sendo
todos receptores acoplados a proteína G. Uma grande variedade de tumores
apresenta expressão acentuada destes receptores como os tumores de
pulmão, mama, pâncreas, cólon e próstata (MARKWALDER; REUBI, 1999,
ZHANG et al., 2006, ZHANG et al., 2007).
BREEMAN et al. (1999) relataram estudos com análogos de bombesina
radiomarcados com
111In
e encontraram que agonistas foram internalizados
pelas células com receptores para este peptídeo enquanto que antagonistas
não apresentaram esta característica, mostrando que para utilização como
agentes de radiodiagnóstico os agonistas são mais adequados. Os análogos
marcados com tecnécio-99m foram primeiramente testados em 1998 por
BAIDOO et al. e também apresentaram boa afinidade pelos receptores para
PLG.
Vários estudos têm sido realizados utilizando análogos de bombesina
acoplados a um agente quelante para o radionuclídeo desejado, geralmente,
índio-111 ou tecnécio-99m e estes compostos foram utilizados com o intuito de
identificar de tumores (BREEMAN et al., 2002; HOFFMAN et al., 2003,
SCOPINARO et al., 2003, VARVARIGOU et al., 2004, DURKAN et al., 2007;
SANTOS-CUEVAS et al., 2009; JACKSON et al., 2012, de BARROS et al.,
2013). Alguns destes radiofármacos apresentaram elevada seletividade pelos
receptores nas células tumorais, utilizando a sequência completa do peptídeo
ou uma sequência truncada contendo apenas sete aminoácidos (Bombesina (714)NH2).
Isto demonstrou que a porção C-terminal da sequência de
aminoácidos é necessária para a manutenção da afinidade pelo sítio de ligação
no receptor, desta forma a região oposta (N-terminal), normalmente é utilizada
para a radiomarcação (FAINTUCH et al., 2009).
46
Gugger e Reubi (1999) demonstraram que 62% dos carcinomas de mama e
100% das metástases destes cânceres apresentaram maior expressão dos
receptores para bombesina, confirmando a possibilidade da utilização de
análogos destes peptídeos para fins de diagnóstico e terapia.
Peptídeos radiomarcados com tecnécio-99m (99mTc) são bons candidatos para
fornecer imagens de boa qualidade, pois, geralmente, peptídeos apresentam
rápida
depuração
sanguínea
e
facilitada
perfusão
pelos
tecidos,
proporcionando uma boa relação alvo/não alvo para o tecido em análise. A
radiomarcação de peptídeos pode ser realizada de três maneiras distintas:
marcação direta, o radionuclídeo se liga diretamente ao peptídeo que se deseja
estudar. É uma técnica simples e de fácil realização, porém é um processo
limitado a peptídeos que apresentem ligações dissulfeto (S-S), como, por
exemplo, a somatostatina. As outras duas formas de marcação de peptídeos
utilizam agentes quelantes que são capazes de complexar com o radionuclídeo
desejado. O agente quelante pode ser acoplado ao peptídeo antes ou após sua
radiomarcação. Sendo o primeiro método mais utilizado, pois após a formação
e purificação do composto final (peptídeo + agente quelante), este é, então,
radiomarcado com o isótopo desejado em uma etapa rápida, sem múltiplos
passos de preparação e purificação (LANGER; BECK-SICKINGER, 2001; de
BARROS et al., 2013).
Os agentes quelantes para o
99mTc
exibem baixa taxa de dissociação e o
átomo de tecnécio no estado de oxidação desejado. Uma variedade de
quelantes tem sido desenvolvida para a marcação com
encontram-se
os
triaminotiois
(N3S),
os
99mTc,
diaminoditiois
dentre eles
(N2S2),
o
hexametilpropilenoaminoxima (HMPAO) e o ácido hidrazinonicotínico (HYNIC),
mostrados na Figura 15 - (LANGER; BECK-SICKINGER, 2001, BLOK et al.,
2004).
47
Figura 15- Estrutura dos agentes quelantes para o tecnécio-99m (JURISSON,
1993)
O HYNIC complexa-se com tecnécio-99m de maneira rápida e com bons
rendimentos e pode ser acoplado a moléculas como proteínas, polipeptídeos e
glicoproteínas (LAVERMAN et al., 1999, WELLING et al., 2004, BANERJEE et
al., 2005; KING et al., 2007; de BARROS et al., 2010). Devido ao seu caráter
monodentado a complexação com átomos de tecnécio- 99m é realizada em
presença de co-ligantes, como tricina e ácido etilenodiaminodiacético (EDDA),
que estabilizam o metal formando uma ligação estável (GANDOMKAR et al.,
2007, MIRANDA-OLVERA et al., 2007).
A encapsulação do peptídeo bombesina radiomarcada no lipossoma permite
acompanhar a biodistribuição da formulação lipossomal e com isso identificar
as possíveis alterações provocadas devido a modificações na composição do
lipossoma.
48
6.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os Lipossomas constituem a classe de nanocarreadores mais estudada e
utilizada em todo o mundo, sendo o aumento do tempo de circulação do
fármaco encapsulado um grande desafio e um dos principais objetivos na
otimização da formulação lipossomal. Como anteriormente relatado, o PEG é
amplamente utilizado para aumentar o tempo de circulação das formulações às
quais ele é adicionado devido a uma redução da captação da formulação pelo
SFM. Uma vez constatado que o peso molecular do PEG assim como a
combinação de diferentes tipos de PEG com pesos moleculares diferentes
alteram drasticamente a circulação do lipossoma, torna-se pungente estudar a
influência do tamanho da cadeia de PEG sobre a farmacocinética da
nanopartícula, por meio da radiomarcação da nanoparticula, já que esse
método possibilita acompanhar o comportamento da mesma “in vivo”.
Este estudo se torna relevante, pois permite avaliar os parâmetros
farmacocinéticos das nanopartículas, além de fornecer dados quantitativos de
captação no tumor, permitindo avaliar a capacidade do nanossistema em
acessar a região tumoral.
49
OBJETIVOS
50
OBJETIVO GERAL
Avaliar a influência do PEG na circulação e biodistribuição de lipossomas pHsensíveis, contendo o complexo
99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina
(7-14)
em modelos
experimentais.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Preparar, caracterizar físico-quimicamente e morfologicamente os
lipossomas com cadeias de polietilenoglicois de diferentes tamanhos.
•
Realizar a radiomarcação do peptídeo HYNIC-βAla-Bombesina(7-14) com
tecnécio-99m
•
Encapsular o complexo
99mTc-HYNC--βAla-Bombesina
(7-14)
nas diversas
formulações lipossomais preparadas.
•
Estudar a influência do uso de moléculas de PEG, de diferentes
tamanhos de cadeia (PEG1000, PEG2000, PEG5000) no comportamento in
vivo dos lipossomas, e avaliar o tempo de circulação sanguínea das
formulações.
•
Realizar estudos de biodistribuição ex vivo e por imagens cintilográficas
dos lipossomas PEGuilados, radiomarcados com o isótopo tecnécio-99m
em camundongos acometidos de tumores de mama, 4T1 e Ehrlich.
51
TRABALHO EXPERIMENTAL
52
1. MATERIAL E MÉTODOS
1.1.
MATERIAL
O peptídeo HYNIC-βAla-Bombesina(7-14) foi adquirido da GL BioChem
(Shangai/China).
O tecnécio-99m foi obtido de um gerador de molibdênio-99/tecnécio-99m
(IPEN/Brasil).
Dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), diesteraoilfosfatidiletanolamina (DSPE),
Aminopoli(etilenoglicol)5000-diesteraoilfosfatidiletanolamina
DSPE)
foram adquiridos da Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemanha).
DSPE)
(mPEG5000-
e
(mPEG2000-
(mPEG1000-DSPE) foram comprados da Avanti Polar Lipids (Alabaster, EUA).
O Hemisuccinato de colesterila (CHEMS) foi comprado da Sigma-Aldrich
(Steinheim, Alemanha). Os demais reagentes foram adquiridos da SigmaAldrich Chemical Company (EUA).
Os camundongos BALB/c foram adquiridos do Biotério Central da UFMG e
mantidos sem restrição de água e ração, no biotério do laboratório de
Farmacotécnica da Faculdade de Farmácia da UFMG.
Os camundongos Swiss foram adquiridos do centro de bioterismo da
Faculdade de Farmácia da UFMG e mantidos, sem restrição de água e ração,
no biotério do laboratório de Farmacotécnica da Faculdade de Farmácia da
UFMG.
Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pela Comissão
de Ética no Uso de Animais (CEUA), sob o protocolo nº 301/2014 (ANEXO 1).
1.2.
MÉTODOS
1.2.1. PREPARO DOS LIPOSSOMAS
Os lipossomas preparados neste trabalho são constituídos por DOPE, CHEMS
e DSPE. As moléculas de PEG, nos diferentes tamanhos de cadeia, são
acoplados ao lípide DSPE (DSPE-PEG). Desta maneira, foram preparados oito
tipos de formulações lipossomais com concentração lipídica de 40 mM. Sendo
53
uma na ausência de PEG (DSPE não PEGuilado), três com apenas um tipo de
PEG (PEG1000, PEG2000, PEG5000) e quatro com combinações equimolares
dos diferentes tipos de PEG (PEG1000/2000, PEG1000/5000, PEG2000/5000
e PEG1000/2000/5000). Para o preparo dos lipossomas utilizou-se a
metodologia descrita por Bangham (1965).
Inicialmente, alíquotas das soluções de DOPE, CHEMS e DSPE (com ou sem
PEG) em clorofórmio (razão molar 5,8/3,7/0,5, respectivamente) foram
transferidas para um balão de fundo redondo para a formação do filme lipídico
pela evaporação do clorofórmio em evaporador rotatório sob pressão reduzida.
O filme lipídico foi hidratado com solução aquosa de NaOH 0,456 M (33 µL
para cada mL de lipossoma), para ionização do CHEMS. Em seguida solução
de NaCl 0,9% foi adicionada para completar o volume final da preparação. As
vesículas multilamelares resultantes foram submetidas à extrusão através de
membranas de policarbonato de 0,4, 0,2 e 0,1 µm utilizando um extrusor de
média pressão (Figura 16). A formulação foi submetida a 5 ciclos de extrusão
a fim de obter partículas com um maior grau de homogeneidade.
Figura 16. Representação esquemática ilustrando o método de preparo dos
lipossomas
1.2.2. CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOSSOMAS
1.2.2.1.
DIÂMETRO DAS VESÍCULAS E ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO
54
O diâmetro médio e a distribuição do tamanho das partículas foram
determinados por espectroscopia de autocorrelação de fótons, utilizando um
contador de partículas equipado com raio laser monocromático (Zetasizer Nano
ZS90 (Malvern, Inglaterra). A análise foi realizada em meio líquido e mediu o
raio hidrodinâmico das partículas atribuindo-se teoricamente a elas um formato
esférico.
Para
a
determinação
do
diâmetro
das
vesículas
foram
utilizados
aproximadamente 50μL de lipossomas diluídos em 1mL de solução de NaCl
0,9% até que se obtivesse a contagem adequada de partículas. Os resultados
são expressos como média de 10 medidas. O índice de polidispersão das
vesículas (IP) foi avaliado pela análise monomodal. Este índice avalia a
distribuição da população de partículas em torno de um diâmetro médio das
partículas. As medidas foram efetuadas em temperatura de 25ºC e em ângulo
de 90º e as medidas foram realizadas em triplicata.
1.2.2.2.
POTENCIAL ZETA
O potencial zeta foi determinado por espalhamento dinâmico da luz e análise
da mobilidade eletroforética das vesículas. As medidas foram feitas em
triplicata em alíquotas diluídas em solução de NaCl 0,9% (200 vezes),
empregando-se o equipamento Zetasizer Nano ZS90 (Malvern, Inglaterra), em
temperatura de 25 ºC e em ângulo de 90º.
1.2.2.3.
CARACTERIZAÇÃO
DOS
LIPOSSOMAS
POR
CRIOMICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
1.2.2.3.1. PREPARO DAS AMOSTRAS
Cryo-MET: As amostras foram preparadas em grades de cobre – Lacey Carbon
Type A 300 mesh copper grid (TedPella, USA), as quais foram submetidas ao
procedimento de Glow Discharge em um equipamento easiGlow (Pelco, USA),
com os seguintes parâmetros: corrente de 15 mA; carga negativa; 25 segundos de
descarga.
55
O congelamento em gelo amorfo (crio preparação) foi feito com a utilização de um
equipamento Vitrobot Mark IV (FEI, Holanda) em temperatura (22 °C) e umidade
(100%) controladas. O preparo das amostras seguiu os seguintes parâmetros: blot
time 2,5 segundos; blot force -5, blot wait 20 segundos com um único blot. Então,
3 μL das amostras foram aplicadas nas grades e imersas em etano líquido. Após a
imersão, a grade foi mantida em nitrogênio líquido até o momento da análise no
microscópio e mantida a -173 °C durante toda a análise no microscópio.
Esta etapa do estudo foi realizada em coloboração com o Dr Rodrigo Portugal, do
centro de microscopia do Laboratório Nacional de Luz Sincrotron (LNLS,
Campinas).
1.2.2.3.2. CONDIÇÕES DA ANÁLISE
a) Aquisição de dados: microscópio eletrônico de transmissão modelo JEM1400 PLUS (JEOL, Japão), filamento de LaB6, operando a 120kV; o
microscópio é equipado com uma câmera CCD Gatan MultiScan 794 (1k x 1k
pixels) para a aquisição digital de imagens.
b) Análise: a aquisição das imagens e medidas realizadas foram feitas com o
software Digital Micrograph (Gatan Inc., USA); as imagens obtidas não foram
submetidas a procedimentos de pós processamento.
1.2.3. FORMAÇÃO DO COMPLEXO 99mTc- HYNIC-βALA-BOMBESINA(714)
Em um frasco âmbar foram adicionados 5 mg de ácido etilenodiamino-N, N’diacético (EDDA) e 20 mg de tricina e, em seguida, foram solubilizados em 0,5
mL de solução de NaCl 0,9% (p/v). Foram adicionados ao frasco 10 µg do
peptídeo HYNIC-βAla-Bombesina(7-14) e 10 µL de uma solução de cloreto
estanoso em HCl 0,25 M (1mg/mL) e o pH foi ajustado para 7-8 com solução
de NaOH 0,1N. O frasco foi lacrado e realizou-se vácuo. Em seguida, 0,5 mL
de solução de NaCl 0,9% (p/v) contendo 37 MBq de pertecnetato de sódio
foram adicionados ao frasco. A mistura reagente foi mantida em banho-maria
fervente (100 ºC) por 15 minutos e resfriada em água corrente.
56
1.2.4. DETERMINAÇÃO DA PUREZA RADIOQUÍMICA
O rendimento de marcação foi determinado por cromatografia em camada
delgada (CCD) utilizando como fase móvel metiletilcetona para a determinação
do percentual de TcO4- e solução acetonitrila:água (1:1) para avaliar a
quantidade de TcO2. O rendimento de marcação foi considerado segundo a
fórmula abaixo:
% marcação = 100 - (% TcO4- + % TcO2)
1.2.5. ENCAPSULAÇÃO (CONGELAMENTO/DESCONGELAMENTO)
Em alíquotas de 1 ml de lipossomas brancos, recém preparados, foi adicionado
o crioprotetor (glicose) na razão crioprotetor:fosfolípide (m/m) de 2:1. Em
seguida, os tubos foram agitados em vortex por 1 minuto e então foi adicionado
0,5 ml do complexo
99mTc-HYNIC-βAlaBombesina
(7-14).
As amostras foram
congeladas em nitrogênio líquido por 5 minutos, seguido do descongelamento
em
banho-maria
a
30ºC.
Foram
realizados
5
ciclos
de
congelamento/descongelamento. O diâmetro médio das vesículas e o índice de
polidispersão foram determinados conforme descrito no item 2.2.2.1.
1.2.6. TEOR DE ENCAPSULAÇÃO
Os
lipossomas
que
congelamento/descongelamento
passaram
foram
pelo
submetidos
processo
à
de
ultracentrifugação
(150000 x g, 90 minutos, 4°C). A porcentagem de encapsulação total
(adsorvido + interno) foi determinada pela quantificação da radiação presente
no sobrenadante e no pellet de lipossomas formado após a ultracentrifugação
segunda a fórmula abaixo:
% encapsulação total = (cpm pellet / cpm pellet + cpm sobrenadante) x 100
1.2.7. PERFIL DE LIBERAÇÃO
Alíquotas de 92 µL dos lipossomas purificados em ultracentrífuga foram
diluídas em 1000 µL plasma de camundongo e incubadas a 37ºC sob agitação
57
constante. Após os tempos de 10, 30, 60, 120, 240 e 360, 1440 minutos
alíquotas foram retiradas e adicionadas em filtros AMICON® (10 kDa). Os
filtros foram acoplados a eppendorfs e centrifugados (14.000 x g) por 30
minutos. Determinou-se a quantidade de radiação presente no líquido filtrado e
no filtro. A quantidade de radioatividade retida no filtro foi considerada como
sendo o complexo radiomarcado encapsulado e o percentual do complexo
liberado foi determinado segundo a equação abaixo:
% liberado = (cpm filtrado / cpm filtro + cpm filtrado) x 100
1.2.8. DEPURAÇÃO SANGUÍNEA EM ANIMAIS SADIOS
Foram utilizados 48 camundongos BALB/c fêmeas, pesando 20-25 g. Estes
animais foram divididos em oito grupos onde cada animal recebeu uma
alíquota de 0,1 ml dos lipossomas contendo o complexo
99mTc-HYNIC-βAla-
Bombesina(7-14). Foi realizada uma incisão na cauda dos animais e o sangue foi
coletado, em tubos previamente pesados, nos tempos de 1, 5, 10, 15, 30, 45,
60, 90, 120 e 240 minutos após a administração do radiofármaco. Os tubos
foram pesados e levados ao contador gama para determinação da
radioatividade. Os resultados foram expressos em percentual da dose injetada
por grama de sangue (%ID/g).
1.2.9. DESENVOLVIMENTO DOS MODELOS TUMORAIS NOS
CAMUNDONGOS
1.2.9.1.
MODELO ANIMAL EXPERIMENTAL DE CÂNCER DE MAMA
MURINO
As células de adenocarcinoma de mama murino (4T1) foram inoculadas em
camundongos BALB/c fêmeas com 6-8 semanas de vida. Os camundongos
foram mantidos em área com controle de luminosidade, com livre acesso a
água e ração. As células 4T1 foram cultivadas em meio DMEM suplementado
com soro fetal bovino a 10%, penicilina 100UI/mL, estreptomicina 100 µg/mL,
em câmara com 5% de CO2, 95% de umidade e 37ºC. Após 3-5 dias de cultivo,
para a inoculação do tumor, as células foram tripsinisadas, contadas e
ressuspendidas em meio DMEM na concentração de 2,5x107 células/mL.* Cem
microlitros dessa suspensão foram inoculados (SC) na coxa direita dos
animais.
58
1.2.9.2.
BIODISTRIBUIÇÃO
DOS
COMPLEXOS
EM
ANIMAIS
ACOMETIDOS PELO TUMOR
Foram utilizados 36 camundongos BALB/c, pesando 20-25g, com tumor da
linhagem 4T1 implantado na coxa direita, para cada complexo. Os animais
foram divididos em três grupos, nos quais cada animal recebeu, pela veia
caudal, 3,7 MBq da solução lipossomal contendo o complexo
99mTc-HYNIC-
βAla-Bombesina(7-14) . Após os tempos de 1 e 4 horas os animais foram
anestesiados com solução de Ketamina (80 mg/Kg) e Xylazina (15 mg/Kg) e,
em seguida, submetidos à eutanásia. Órgãos e tecidos como: fígado, baço,
rins, estômago, coração, pulmão, sangue, tumor, músculo, tireoide, foram
retirados, pesados e levados ao contador gama para determinação da
radioatividade, e os resultados foram expressos em percentual da dose
injetada por grama de tecido (%ID/g).
1.2.9.3.
IMAGENS
CINTILOGRÁFICAS
DOS
COMPLEXOS
EM
ANIMAIS ACOMETIDOS PELO TUMOR
Para esse estudo foram utilizados os mesmos animais do estudo de
biodistribuição.
Nos
animais
BALB/c
acometidos
pelo
administrados, por via endovenosa, 37 MBq da solução de
tumor,
foram
99mTc-HYNIC-βAla-
Bombesina(7-14). As imagens foram adquiridas nos tempos de 1 e 4 horas após
a administração dos complexos radiomarcados. Os camundongos foram
anestesiados e mantidos em posição de decúbito ventral sob a gama câmara
(Nuclide TM TH 22, Mediso, Hungria). Uma janela de 20% simétrica foi utilizada
para um pico de energia de 140 KeV. As imagens (300.000 contagens) foram
obtidas e armazenadas em uma matriz 256 x 256. As imagens foram
analisadas determinando-se a radioatividade nas regiões de interesse (ROI)
pelo delineamento ao redor da área alvo (tumor) e da área não-alvo (músculo
contralateral).
1.2.9.4.
IMPLANTE DO TUMOR LÍQUIDO (ASCITE) DE EHRLICH
As células, armazenadas em nitrogênio líquido, foram descongeladas a
temperatura ambiente. Em seguida, transferiram-se as células de Ehrlich com o
59
auxílio de uma pipeta automática para um tubo falcon estéril. Adicionou-se
solução de NaCl 0,9% (p/v) e o tubo foi levado à centrífuga (3000 x g, 5
minutos), retirou-se o sobrenadante e o pellet foi novamente lavado com
solução de NaCl 0,9% (p/v). Ao final da segunda lavagem, o pellet foi
ressuspendido com a mesma solução e o volume de 0,1 mL foi injetado, por via
intraperitoneal, em camundongos Swiss.
Os animais foram mantidos no biotério do laboratório de Farmacotécnica por
oito dias sem restrição de água e ração. Após este período, os camundongos
foram anestesiados com solução de Ketamina (80 mg/Kg) e Xylazina (15
mg/Kg) e o líquido ascítico foi retirado e colocado em um tubo falcon estéril.
Centrifugou-se o líquido ascítico a 3000 x g por 5 minutos, retirou-se o
sobrenadante e o sedimento foi ressuspendido com solução de NaCl 0,9%
(p/v). Esse processo foi repetido e, em seguida, uma alíquota das células foi
corada com solução de Tripan 0,4% e contada em microscópio, com aumento
de 400x, com o auxílio de uma câmara de Neubauer .
Após a contagem as células foram diluídas para uma concentração de 1x10 7
células/mL e estas foram aliquotadas em criotubos e armazenadas em
nitrogênio líquido.
1.2.9.5.
IMPLANTE
DE
TUMOR
SÓLIDO
DE
EHRLICH
EM
CAMUNDONGOS SWISS
Para o implante do tumor sólido de Ehrlich foram utilizadas células obtidas
após coleta e lavagem do líquido ascítico, conforme descrito no item anterior.
As células foram contadas, com auxílio de uma câmara de Neubauer, e o
volume de 0,1 mL, contendo 106 de células foi implantado, por via subcutânea,
na coxa direita de camundongos Swiss. Os animais foram mantidos no biotério
do laboratório de Farmacotécnica com ciclo de claro-escuro e sem restrição de
água e alimento. Foi permitido o crescimento do tumor a um diâmetro não
superior a 10 mm.
60
1.2.9.6.
BIODISTRIBUIÇÃO, EM ANIMAIS COM TUMOR DE EHRLICH,
DO
COMPLEXO
99mTC-HYNIC-βALABOMBESINA
(7-14),
ENCAPSULADO NOS LIPOSSOMAS.
Foram utilizados 36 camundongos Swiss, pesando 20-25 g, com tumor de
Ehrlich implantado na coxa posterior direita. Estes animais foram divididos em
3 grupos onde cada animal recebeu, pela veia caudal, 3,7 MBq da suspensão
dos lipossomas contendo o complexo
99mTc-
HYNIC-Ala-Bombesina(7-14).
Após os tempos de 1 e 4 horas os animais foram anestesiados com solução de
Ketamina (80 mg/Kg) e Xylazina (15 mg/Kg) e, em seguida, submetidos à
eutanásia. Órgãos e tecidos como: fígado, baço, rins, estômago, coração,
pulmão, sangue, tumor, músculo, tireóide foram retirados, pesados e levados
ao contador gama para determinação da radioatividade, e os resultados foram
expressos em percentual da dose injetada por grama de tecido (%ID/g) (de
BARROS et al., 2011).
1.2.9.7.
IMAGENS CINTILOGRÁFICAS, EM ANIMAIS COM TUMOR DE
EHRLICH, DO COMPLEXO
14),
99mTC-HYNIC-βALA-BOMBESINA
(7-
ENCAPSULADO EM LIPOSSOMAS
Para esse estudo foram utilizados os mesmos animais do estudo de
biodistribuição, foram administrados, por via intravenosa, 37 MBq da
suspensão dos lipossomas contendo
99mTc-HYNIC-Ala-Bombesina
(7-14).
As
imagens foram adquiridas nos tempos de 1 e 4 horas após a administração do
complexo radiomarcado, os camundongos foram anestesiados e mantidos em
posição de decúbito ventral sob a gama câmara (NuclideTM TH 22, Mediso,
Hungria). Uma janela de 20% simétrica foi utilizada para um pico de energia de
140 KeV. As imagens (300.000 contagens) foram obtidas e armazenadas em
uma matriz 256 x 256. As imagens foram analisadas determinando-se a
radioatividade nas regiões de interesse (ROIs) pelo delineamento ao redor da
área alvo (tumor) e da área não-alvo (músculo contralateral).
2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.1.
PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOSSOMAS
61
2.1.1. PADRONIZAÇÃO DA METODOLOGIA
No intuito de assegurar que todas as formulações lipossomais fossem
preparadas de maneira uniforme e com características semelhantes foram
realizados testes preliminares para determinar se alguma etapa no processo de
preparo poderia alterar os parâmetros físico-químicos das formulações. A
formulação contendo DOPE:CHEMS:DSPE-PEG2000 foi a de escolha para os
estudos preliminares de padronização da metodologia devido ao menor custo
do lípide DSPE-PEG2000.
Os valores de diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão (IP), da
formulação lipossomal de PEG2000, estão representados na tabela 1.
Tabela 1. Diâmetro médio e IP dos lipossomas após as etapas de preparo*
PEG2000
Diâmetro médio
(nm)
IP
Pós-hidratação
254 ± 34
0,43 ± 0,10
Pós-extrusão
131,7 ± 2,7
0,08 ± 0,02
645,8 ± 120,0
1
139,9 ± 7,6
0,10 ± 0,07
147,4 ± 6,9
0,13 ± 0,10
Pós-congelamento/descongelamento
(ausência de crioprotetor)
Pós-congelamento/descongelamento
(presença de crioprotetor)
Pós-ultracentrifugação
* Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (n = 3).
Ao término da hidratação dos lipossomas, estes apresentaram tamanho e IP
elevados, o que justificou a calibração dos mesmos através de extrusão em
membranas de policarbonato, após essa etapa houve uma redução de 1,93
vezes no tamanho dos lipossomas e uma redução drástica do IP 5,37 vezes, a
formulação apresentou diâmetro de aproximadamente 131,7nm e IP de 0,08.
Sabe-se que diâmetros na faixa de 50 a 200 nm são preferíveis. Uma vez que,
partículas menores que 10 nm são rapidamente filtradas pelos rins e partículas
maiores que 300 nm são facilmente reconhecidas pelo sistema imune,
opsonizadas e removidas da circulação pelas células do sistema fagocitário
mononuclear (LI et al., 2008; MAEDA et al. 2010; TORCHILIN, 2010) O IP
reflete a distribuição do tamanho das vesículas na dispersão coloidal e pode
variar de 0,0 (para sistemas totalmente monodispersos) a 1,0 (para sistemas
totalmente polidispersos). A formulação apresentou IP menor que 0,3, esse
62
valor é preconizado para considerar uma população de determinado sistema
como monodispersa, sendo compatível para administração endovenosa
(YOON et al., 2013).
Após a extrusão, procedeu-se o processo de congelamento/descongelamento
dos lipossomas necessário para a encapsulação do radiofármaco. Como
esperado, os lipossomas congelados na ausência de agentes crioprotetores
apresentaram um acentuado aumento no diâmetro médio (4,92 vezes maior
que o diâmetro apresentado pelos lipossomas antes do processo de
congelamento/descongelamento) e, além disso, a formulação se mostrou
totalmente heterodispersa (IP = 1).
De BARROS et al., (2011), trabalhando com a mesma formulação avaliaram a
influência da concentração e do tipo de crioprotetor na manutenção do
diâmetro médio, IP durante o congelamento/descongelamento. Os autores
relataram que o carboidrato glicose na razão açúcar: fosfolípide 2:1 (m/m) foi
adequado para manter as vesículas com diâmetro e IP adequados. Por esta
razão, optou-se neste trabalho pela utilização deste açúcar (na razão 2:1) como
crioprotetor.
Como mostrado na Tabela 1, quando os lipossomas foram colocados em
presença de glicose na proporção 2:1 (m/m), não foram observados aumentos
significativos no tamanho das vesículas e no IP durante o processo de
congelamento/descongelamento.
Esse
achado
corrobora
os
dados
apresentados por de BARROS et al., (2011) indicando que a glicose na
proporção 2:1 foi capaz de atuar, de maneira efetiva, na preservação do
tamanho das vesículas. Isto pode ser explicado pelo fato de que durante o
processo de congelamento/descongelamento os agentes crioprotetores, como
a glicose, se inserirem entre as porções polares do fosfolípide, levando à
formação de ligações de hidrogênio. São formadas múltiplas ligações de
hidrogênio entre os açucares e a porção polar dos fosfolípides na superfície da
bicamada podendo os açucares interagir com até 3 tipos diferentes de lipídeos,
simultaneamente. (CHEN et al., 2010). Essas interações entre os açúcares e
os fosfolípides permitem a manutenção do estado físico das membranas
63
durante o processo de congelamento de forma similar à existente no estado
hidratado (VAN WINDEN et al., 1997).
Também foi avaliado se o processo de ultracentrifugação alteraria as
propriedades da formulação. Não houve aumento considerável no tamanho ou
IP
das
vesículas
em
relação
à
etapa
anterior
(congelamento/descongelamento). Portanto, o processo de preparo dos
lipossomas produz vesículas de tamanho reduzido e com população
monodispersa e pode dessa forma, ser utilizada para administração
endovenosa. A aplicação de nanossistemas como carreadores de fármacos ou
agentes de diagnóstico para sítios tumorais requer a administração de
vesículas de pequeno diâmetro (normalmente inferiores a 200 nm), visto que os
lipossomas se utilizam das fenestrações existentes na neovasculatura dos
tumores para extravasar nessa região e, consequentemente, gerar uma maior
acumulação no sitio tumoral (FERRARI, 2005; CHO et al., 2008).
Além disso, sabe-se que o diâmetro médio das vesículas pode alterar a
biodistribuição das partículas, pois partículas maiores que 300 nm são
rapidamente retiradas da circulação acumulando em órgãos como fígado e
baço. Em contrapartida, partículas menores que 200 nm apresentam um tempo
de circulação mais prolongado (LITZINGER et al., 1994; PEREIRA et al., 2008).
2.1.2. PREPARO DAS FORMULAÇÕES
Uma vez padronizado o processo de preparação dos lipossomas, procedeu-se
a preparação das demais formulações propostas. Os valores de diâmetro
médio das partículas, índice de polidispersão (IP), potencial zeta e distribuição
do diâmetro das vesículas das 8 preparações lipossomais estão representados
na tabela 2.
Tabela 2. Diâmetro médio, IP, potencial zeta e distribuição de diâmetro das
vesículas para formulações com diferentes tipos e combinações de PEG.
*
Formulação
Diâmetro
médio (nm)
IP
Potencial
zeta (mV)
DSPE
212,3±17,9a
0,20±0,09
-9,7±1,2
Distribuição do diâmetro das
vesículas %
˂200
200-500
>500
88,0±1,9
11,9±1,9
0,1±0,0
64
PEG1000
134,8±3,9b
0,11±0,01
-11,3±1,7
99,6±0,2
0,4±0,2
0,0 ± 0,0
PEG2000
137,0±2,1b
0,13±0,07
-4,1±0,6
99,6±0,1
0,4±0,1
0,0 ± 0,0
PEG5000
128,4±6,5b
0,11±0,04
-2,3±0,2
99,5±0,2
0,5±0,2
0,0 ± 0,0
PEG1000/2000
142,6±4,9b
0,14±0,04
-5,3±0,6
99,2±0,4
0,8±0,4
0,0 ± 0,0
PEG1000/5000
146,6±7,6b
0,11±0,03
-3,0±0,1
99,7±0,2
0,3±0,2
0,0 ± 0,0
PEG2000/5000
157,0±7,7b
0,17±0,03
-4,2±1,0
99,2±0,7
0,8±0,5
0,0 ± 0,0
PEG1000/2000/5000
142,3±6,0b
0,11±0,03
-4,8±0,9
99,6±0,1
0,4±0,2
0,0 ± 0,0
* Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (n =3). Letras diferentes
apresentam diferenças estatisticamentesignificativas (p<0,05).
Após o preparo e ultracentrifugação dos lipossomas foram determinados o
diâmetro médio e o índice de polidispersão (IP) das vesículas. Os resultados
demonstraram que sete das oito formulações avaliadas apresentaram tamanho
reduzido sem diferença significativa entre elas (variando de 121,9 a 165,4 nm).
Adicionalmente,
todas
as
formulações
testadas
apresentaram-se
monodispersas com o IP menor que 0,3 (Tabela 2).
A formulação de DSPE apresentou um aumento considerável após o
congelamento/descongelamento, que se manteve após a ultracentrifugação.
Esse aumento pode ser devido a ineficiência do crioprotetor em evitar a
agregação das partículas. (CHEN et al., 2010,. Como discutido anteriormente,
a glicose foi utilizada na razão 2:1 (m/m) em relação aos lípides estruturais. No
entanto, a massa molar do DSPE (811 g/mol) é muito menor que a massa do
DSPE-PEG2000 (2801 g/mol), utilizado como referencia para escolha do
crioprotetor. Isto resultou numa menor disponibilidade de glicose para exercer
uma crioproteção efetiva, portanto, para a formulação contendo DSPE foi
utilizada a razão glicose: fosfolípide 4:1 (m:m). Desta forma, foi possível
alcançar reduções nos valores de diâmetro médio e IP dos lipossomas de
DSPE, no entanto, estes valores (212,3± 17,9) ainda se mantiveram superiores
aos valores encontrados após a extrusão (123,9±5,4), ou seja, a interação
entre o grupo fosfato dos fosfolípides e o açúcar não foi suficientemente forte
para evitar a agregação das vesículas. Essa diferença provavelmente se deve
a ausência do PEG, este, por si só pode levar a um impedimento estérico o que
65
dificulta a agregação das vesículas, (PARR et al., 1994; HARASYM et al.,
1995).
Ao avaliar a distribuição das vesículas por número de partículas, constatou-se
que para as sete formulações com PEG quase 100% vesículas apresentaram
diâmetro inferior a 200nm. Enquanto que para a formulação de DSPE, cerca de
90% apresentaram diâmetro nessa faixa. Estudos realizados por Lasic (1998),
Yuan e colaboradores (1995) mostraram que nanopartículas com diâmetros
menores ou iguais a 500 nm podem extravasar-se e serem acumuladas em
regiões com aumento da permeabilidade vascular. Como a grande maioria das
partículas apresenta tamanho reduzido, menor que 200nm, o aumento de
tamanho encontrado para a formulação de DSPE não deve produzir uma
alteração drástica na farmacocinética das vesículas se comparado ás outras
formulações.
Os valores do potencial zeta dos lipossomas variaram de -2,1 a -5,7 mV para
os lipossomas de PEG2000, PEG5000, PEG1000-2000, PEG1000-5000,
PEG2000-5000, PEG1000-2000-5000 apresentaram valores de potencial zeta
próximos a neutralidade. Este fato pode ser justificado pela baixa mobilidade
eletroforética apresentada pelo grupo mPEG-DSPE, devido à grande
resistência hidrodinâmica conferida pelo polímero mPEG (WOODLE et al.,
1992). Os valores de potencial zeta para a formulação de DSPE e PEG1000
apresentaram-se
ligeiramente
mais
negativos
(-9,7±1,2
e
-11,3±1,7;
respectivamente), o primeiro provavelmente se deve a ausência do PEG e o
segundo pode ser explicado pela ineficiência do PEG1000 em recobrir a
superficie do lipossoma (HASHIZAKI et al., 2005; PASUT et al., 2015) na
concentração utilizada, com isso a carga de superficie predominante para
esses lipossomas deve-se ao grupo fosfato dos fosfolípides, que resulta na
diminuição do valor do potencial zeta.
2.1.3. TEOR DE ENCAPSULAÇÃO
Os valores de teor de encapsulação para as 8 formulações lipossomais estão
representados na tabela 3.
66
Tabela 3. Teor de encapsulação do complexo
diferentes formulações lipossomais. (n=3)
Formulação
(7-14)
para as
Encapsulação (%)*
DSPE
26,3±7,1
PEG1000
30,3±6,4
PEG2000
31,3±8,4
PEG5000
29,3±9,1
PEG1000/2000
28,6±4,1
PEG1000/5000
27,4±6,4
PEG2000/5000
33,9±1,9
PEG1000/2000/5000
31,0±2,4
*Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (n =3).
Segundo de BARROS e colaboradores (2011) a concentração lipídica dos
lipossomas com melhores resultados na encapsulação da bombesina
radiomarcada foi a de 40 mM, dessa forma essa concentração foi a de escolha
neste trabalho. Em estudo de nosso grupo também foi avaliado a quantidade
de bombesina adsorvida a membrana dos lipossomas, os valores encontrados
foram considerados baixos, (3,0 ± 0,5%), por isso não foi realizada essa
análise para as formulações lipossomais avaliadas no presente trabalho.
A encapsulação de moléculas hidrofílicas, como o peptídeo bombesina, em
lipossomas pode ser realizada durante o processo de hidratação do filme
lipídico ou a partir dos lipossomas previamente formados, utilizando técnicas
como congelamento/descongelamento ou liofilização. A adição da molécula a
ser encapsulada durante a hidratação do filme lipídico pode apresentar alguns
inconvenientes, visto que é um processo laborioso, podendo resultar em
eventuais perdas das moléculas a ser encapsulada (SANTOS e CASTANHO,
2002; BATISTA; CARVALHO; MAGALHAES,2007; BOZZUTO e MOLINARI,
2015). Especificamente para produtos radiomarcados, pode-se adicionar a
esse método o inconveniente de maior tempo de manipulação de material
radioativo, expondo por um tempo desnecessário o usuário.
Desta
maneira,
o
método
de
escolha
foi
o
método
de
congelamento/descongelamento, uma vez que essa técnica apresenta
67
rendimento similar a outras metodologias (SATTERFIELD, M. B.; WELCH, M.
J., 2005), além de ser rápido e de fácil realização.
Os
valores de teor de
encapsulação
encontrados pelo
método
de
congelamento/descongelamento foram semelhantes para as oito formulações
avaliadas, variando de 26,4 a 38,7%, (tabela 3). Estes valores estão
satisfatórios e condizentes com a literatura (SATTERFIELD, M. B.; WELCH, M.
J., 2005; DZIUBLA et al., 2005)
o que permitiu a condução dos estudos
subsequentes.
2.2.
PUREZA RADIOQUÍMICA
O complexo
(7-14)
foi avaliado por cromatografia
em camada delgada e apresentou pureza radioquímica igual a 96,2% ± 2,5
(n=6) no sistema de eluentes utilizado. Estes resultados foram altamente
reprodutíveis durante todo o período de experimentos.
Altos níveis de impurezas radioquímicas resultam na presença de radiação em
locais onde não é desejável (órgãos ou tecidos que tem afinidade pelo tecnécio
não complexado), reduzindo a quantidade presente nos locais de interesse, o
que prejudica os estudos de biodistribuição e gera imagens de baixa qualidade
devido à alta radiação de fundo ao redor dos tecidos e no sangue, além de
expor o paciente a uma dose desnecessária de radiação (THEOBALD, 1990).
Por isso, é preconizado na literatura que o rendimento de marcação de um
produto para estudos de biodistribuição seja superior a 90% (TRHALL &
ZIESSMAN, 2003; SAHA, 2010). Desta forma, o complexo
Bombesina(7-14)
apresentou
resultados
satisfatórios
99mTc-HYNIC-βAla-
para
os
estudos
subsequentes.
Não foram realizados estudos de estabilidade de marcação uma vez que o
mesmo foi realizado por de BARROS e colaboradores (2010) para o mesmo
complexo radiomarcado, e os resultados confirmaram a estabilidade do produto
formado, o que permite sua utilização por tempo prolongado.
2.3.
DEPURAÇÃO SANGUÍNEA EM ANIMAIS SADIOS
68
As curvas de depuração sanguínea, para os lipossomas contendo o complexo
(7-14),
estão representadas na figura 13. Os
parâmetros farmacocinéticos estão representados na tabela 4.
Tabela 4. Tempo de meia-vida das formulações lipossomais contendo o complexo
99mTc-
HYNIC-βAla-Bombesina(7-14). (n =6)
Formulação
T 1/2
DSPE
118,32a,b
PEG1000
88,96a
PEG2000
160,02b
PEG5000
118,09a,b
PEG1000/2000
101,69a,b
PEG1000/5000
125,25a,b
PEG2000/5000
161,77b
PEG1000/2000/5000
135,12a,b
T1/2 = tempo de meia vida das formulações; Letras diferentes apresentam diferenças
estatisticamentesignificativas (p<0,05).
Os lipossomas apresentaram rápida depuração sanguínea após administração
em animais sadios da linhagem BALB/c. O tempo de meia-vida (T1/2) foi
determinado para todas as oito formulações e não foi encontrada diferença
estatisticamente significativa para as formulações, com exceção da formulação
de PEG1000 que obteve menor tempo de circulação (88,96 minutos)
comparado às formulações de PEG2000 e PEG2000-5000.
É interessante
ressaltar que ao contrário do relatado em estudos anteriores (SADZUKA et al.,
2002, PHAN et al., 2005; SADZUKA et al., 2006; SUGIYAMA et al., 2007;
CHOW et al., 2009) as formulações contendo PEG não provocaram um
aumento considerável no tempo de circulação, independentemente do peso
molecular ou da presença de PEG de diferentes tamanhos de cadeia.
Sugerindo que, para essa composição de lipossomas, a presença de PEG não
foi capaz de aumentar o tempo de circulação dos nanossistemas.
Para o prosseguimento dos estudos foram escolhidas as formulações de
DSPE, de PEG2000 e a de PEG1000-5000. Os lipossomas com PEG2000
69
foram tomados como a formulação padrão. Com o intuito de averiguar o efeito
da presença de uma mistura de PEG, com diferentes tamanhos de cadeia, em
comparação com lipossomas na ausência de PEG na biodistribuição das
vesículas, foram selecionadas as formulações de DSPE e PEG1000-5000,
respectivamente.
Na Figura 17 estão representadas as curvas de depuração sanguínea para as
três formulações selecionadas, pode-se perceber que o padrão de eliminação
das formulações é muito semelhante, assim como foi observado pelos valores
de tempo de meia vida encontrados (Tabela 4).
Figura 17. Curva da depuração sanguínea para o complexo
(7-14)
encapsulado nas formulações de DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000. (n=6).
30
%ID/g
20
DSPE
PEG2000
PEG1000-5000
10
0
0
50
100
150
200
250
300
Minutos
2.4.
CRIOMICROSCOPIA
As imagens obtidas por criomicroscopia eletrônica de transmissão (cryo-MET)
para os lipossomas de DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000 (Figuras 18,19 e 20
respectivamente) permitiram a visualização de vesículas unilamelares de
diâmetros variados tendo sido observadas população majoritária de vesículas
com diâmetro médio em torno de 90 nm, mas lipossomas na faixa de 30-250
nm também foram observados, esses resultados podem ser corroborados
pelos estudos de MOHR et al., (2014). Não foram encontradas diferenças no
tamanho assim como na morfologia das três formulações. Poucas partículas
70
multilamelares foram observadas, os lipossomas analisados em sua ampla
maioria apresentaram bicamada única com aproximadamente 5 nm de
espessura para as formulações avaliadas, esses resultados estão de acordo
coma literatura, isso se deve principalmente ao método de calibração utilizado,
devido a extrusão, os lipossomas formados são em sua grande maioria
unilamelares (CHANGSAN et al., 2009; dos SANTOS et al., 2002; KAISER et
al., 2003; SEMPLE et al.,2005; ZHIGALTSEV et al., 2006).
Não foi visualizada nenhuma modificação na superficie lipossomal nas
formulações contendo PEG, nem aumento na espessura da bicamada devido a
adição do polímero. A adição do PEG à superfície de lipossomas não é
visualizada
nas
imagens
Cryo-MET,
devido
ao
baixo
contraste
do
polietilenoglicol. Em oposição, lipossomas revestidos com carga positiva (lisina)
e negativa (ácido glutâmico) pela tecnologia de camada por camada podem ser
claramente visualizado por Cryo-MET (CIOBANU et al ., 2007) .
A análise de tamanho das vesículas por criomicroscopia corrobora os
resultados encontrados por DLS. Ambas as técnicas encontraram tamanhos
semelhantes para as três formulações assim como foi possível visualizar
populações basicamente monodispersas.
Figura 18. Fotomicrografias obtidas por cryo-MET para lipossomas de DSPE em diferentes
campos
71
Figura 19. Fotomicrografias obtidas por cryo-MET para lipossomas de PEG2000 em diferentes
campos
Figura 20. Fotomicrografias obtidas por cryo-MET para lipossomas de PEG1000-5000 em
diferentes campos
2.5.
PERFIL DE LIBERAÇÃO
A Figura 21 apresenta o perfil de liberação do complexo
99mTc-HYNIC-Ala-
Bombesina(7-14) a partir das formulações lipossomais de DSPE, PEG2000,
PEG1000-5000 em presença de plasma a 37ºC.
72
Figura 21. Perfil de liberação do complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14) encapsulado em
lipossomas em presença de plasma a 37ºC. (n = 3)
100
DSPE
PEG2000
%Liberação
80
PEG10005000
60
40
*
20
0
0
500
1000
1500
tempo (min)
*indica diferenças estatisticamente significativas (p0,05).
Pode
ser
observada
uma
liberação
do
complexo
99mTc-HYNIC-
βAlaBombesina(7-14) igual a 4,2 % e 5,01% no tempo de 10 minutos para as
formulações de PEG2000 e PEG1000-5000, respectivamente. Durante o
intervalo de tempo investigado, não foi observada uma liberação adicional
estatisticamente significativa do complexo
(7-14)
a
partir dessas duas formulações até o tempo de 6 horas. Pode-se supor que
uma fração do complexo
(7-14)
liberada se deve à
presença do radiotraçador adsorvido na superfície das vesículas. Os valores da
liberação da bombesina após 24 horas foram de 17,05% e 18,55% para
PEG2000 e PEG1000-5000. Esses valores são considerados baixos (EVJEN et
al., 2011; FUGIT et al., 2015) indicando que as formulações possuem boa
estabilidade frente a exposição ao plasma sanguíneo.
Para a formulação de DSPE foram encontrados valores superiores a outras
formulações, no tempo inicial foi encontrada uma liberação de 8,9% e no tempo
de 24 horas um valor de 32,7%. Esse achados estão de acordo com dados
apresentados pela literatura que relatam que a presença do PEG confere maior
estabilidade as formulações frente a exposição a agentes biológicos
(SUDHAKAR et al., 2016; MÉRIAN et al., 2015), e desse forma possuem uma
maior capacidade de manter o fármaco encapsulado em seu interior.
73
2.6.
ESTUDOS
DE
BIODISTRIBUIÇÃO
E
IMAGENS
CINTILOGRÁFICAS EM ANIMAIS COM TUMOR 4T1
O perfil de biodistribuição de 1 e 4 horas após a administração do complexo
(7-14)
nas formulações de DSPE, PEG2000 E
1000-5000 estão representados nas figuras 22 e 23.
Figura 22. Biodistribuição do complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14), após administração
intravenosa, em animais BALB/c acometidos pelo tumor 4T1 (n=6). Todos os resultados foram
expressos como média da dose injetada de 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina por grama de
tecido, ± desvio padrão.
1 hora
15
DSPE
PEG2000
PEG1000-5000
%DI/g
10
5
*
0
e
o
o
gu gad baç
n
i
f
sa
or ulo
de
ao
ão
go
m
oi
c
aç ulm ma
u
e
r
t
us
o
ir
p
t
t
co
m
es
rim
intravenosa, em animais BALB/c acometidos pelo tumor 4T1 (n=6). Todos os resultados foram
expressos como média da dose injetada de 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14) por grama de
tecido, ± desvio padrão.
74
4 horas
15
DSPE
PEG 2000
10
%DI/g
PEG1000-5000
5
*
0
e
o
gu gad
n
fi
sa
ço
ba
rim
e
or ulo
ão ago
ão
id
ç
m
o
c
m
l
m ire
ra
tu
us
pu sto
t
co
m
e
Os estudos de biodistribuição mostraram que o complexo
99mTc-HYNIC-βAla-
Bombesina(7-14) encapsulado em lipossomas apresentou maior captação em
órgãos do sistema fagocitário mononuclear, como fígado e baço (Figura22 e
23). No tempo de 1 hora, a captação no fígado foi inferior àquela apresentada
pelo baço para todas as formulações. Já para o tempo de 4 horas, houve uma
redução na captação pelo baço igualando aos níveis de captação apresentados
pelo fígado. Esta redução pode ser devida à metabolização dos lipossomas
contendo o complexo
(7-14)
pelos macrófagos
presentes no baço. Dados da literatura mostram que mesmo lipossomas de
circulação prolongada apresentam captação relevante pelo fígado e baço
(PHILLIPS, 1999; AWASTHI et al., 2003; CARVALHO-JÚNIOR et al., 2007).
Adicionalmente, foi possível observar uma captação expressiva no rim, esse
fato pode ser explicado pela excreção do peptídeo bombesina em sua forma
livre. Os estudos de biodistribuição demostraram captação renal ligeiramente
elevada nos tempos de 1 hora (6,1±2,7%) e 4 horas (4,5±1,5%). Visto que a
bombesina livre apresenta meia vida plasmática de cerca de 15 minutos (de
BARROS, et al., 2011), estes dados sugerem que o peptídeo foi liberado dos
lipossomas após metabolização nos órgãos do SFM.
75
Os órgãos como coração, pulmão, estômago e tireoide não obtiveram captação
significativa. Cabe ressaltar que a baixa captação em estômago e tireoide é
indicativa de estabilidade entre o agente quelante e o tecnécio. É de suma
importância que a ligação entre o radioisótopo e o agente de interesse seja
estável ao longo do tempo. Caso contrário, pode haver erros de interpretação
dos dados farmacocinéticos e de biodistribuição, uma vez que a radiação
detectada não irá refletir o destino da nanopartícula. (de BARROS et al., 2012).
Ao avaliar-se a concentração no sangue das três formulações evidenciou-se
que aquela contendo PEG2000 apresentou maior captação em ambos os
tempos analisados (1 e 4 horas), sugerindo que essa nanoformulação
apresenta um maior tempo de circulação. Interessantemente, esse achado não
reproduz os dados encontrados nos estudos de depuração sanguínea, onde
todas as formulações apresentaram tempo de meia-vida semelhante. Ainda
mais interessante, quando foi utilizada uma mistura de PEG1000 e PEG5000 a
formulação não apresentou ganho na captação sanguínea, contrariando os
dados relatados na literatura para essa mistura de polímeros. Segundo
SHIMADA et al.,(2000), a utilização da combinação de PEG com diferentes
tamanhos de cadeia conduz a formação de uma maior camada aquosa ao
redor dos lipossomas, culminando em um menor reconhecimento pelo SMF, e
consequentemente maior tempo de circulação. No entanto, este conceito não
foi efetivo para o sistema utilizado neste trabalho.
Considerando a captação das formulações pelo tumor, não foi encontrada
diferença estatisticamente significativa em nenhuma formulação nos tempos
avaliados, além disso, também não houve diferença na relação tumor/musculo
(figura 24) em nenhum dos tempos. Estes dados corroboram os resultados
encontrados nos estudos de depuração sanguínea, onde nenhuma formulação
apresentou ganho no T1/2 e poderia resultar na maior captação pelo tecido
tumoral.
Figura 24. Relações tumor/músculo para o complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina (7-14) nos
lipossomas de DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000 nos tempos de 1 e 4h após a administração.
em camundongos Balb/c com tumor 4t1.
76
relação tumor/musculo
8
DSPE
PEG2000
6
PEG10005000
4
2
0
ra as
ho hor
1 4
ra as
ho hor
1 4
ra as
ho hor
1 4
Para as três formulações houve uma maior captação no tumor em relação ao
musculo contralateral em 1 e 4 horas, sendo que essa relação aumenta com o
tempo. Esse resultado demonstra a capacidade das formulações em alcançar o
sitio tumoral. As células 4T1 não apresentam em sua superfície receptores
para
o
peptídeo
bombesina,
portanto
a
maior
captação
no
tumor
provavelmente, se deve ao efeito EPR (YUAN et al., 1995; MAEDA et al., 2000;
CARMELIET & JAIN, 2000; GHOSH et al., 2008). Como já relatado, tumores
precisam da formação de novos vasos sanguíneos para a manutenção do
suprimento energético para seu crescimento. Estes vasos, no entanto,
apresentam poros suficientemente grandes que permitem o extravasamento
das vesículas (MAEDA, et al., 2000). Os lipossomas utilizados neste estudo
apresentaram tamanho reduzido, indicando que seriam capazes de extravasar
para o tecido adjacente e acumular na região tumoral (MAEDA et al., 2003;
KOBAYASHI et al., 2014, ELBIALY & MADI, 2015).
Apesar da formulação de PEG2000 ter apresentado maior captação no sangue
nos tempos avaliados, esse ganho não se refletiu em maior captação pelo
tumor. Esse resultado pode ser explicado pelo fato da presença de PEG pode
prejudicar a interação entre o lipossoma e as células tumorais reduzindo a
internalização pelo tumor (GAO et al.,2014). Esse achado sugere que, para
esse sistema em especial, a presença de PEG pode ser um limitador para a
captação tumoral, e consequentemente, para a entrega efetiva de fármacos à
77
estas células. Neste contexto, estudos posteriores de tratamento se fazem
necessários para validar essa hipótese.
As imagens cintiligráficas obtidas (Figura 25) apresentaram padrão de
captação nos órgãos e tecidos compatíveis com os valores encontrados na
biodistribuição. Também apresentaram maior captação pelo tumor quando
comparado ao músculo controle (pata contralateral). A análise quantitativa das
imagens possibilitou a obtenção da relação tumor/músculo e os valores obtidos
não
apresentaram
diferenças
estatisticamente
significativas
quando
comparados com aqueles apresentados para os estudos de biodistribuição
(Tabela 6).
Figura 25. Imagens cintilográficas após administração intravenosa do complexo 99mTc-HYNICβAla-Bombesina(7-14) em camundongos Balb/C acometidos pelo tumor 4T1. A,B = DSPE 1,4
HORAS; C,D = PEG2000 1, 4 HORAS; E,F = PEG 1000-5000 1, 4 HORAS
Tabela 5 - Relação alvo/não-alvo para para o complexo
(7-14)
nos
lipossomas de DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000 nos tempos de 1 e 4h após a administração
em camundongos BALB/c com tumor 4T1.
Formulação
Relação
Relação
alvo/não-alvo 1H
alvo/não-alvo 4H
78
2.7.
DSPE
2,89±1,55
5,65±1,22
PEG2000
3,09±1,78
4,01±0,78
PEG1000-5000
2,99±1,89
3,57±1,39
ESTUDOS
DE
BIODISTRIBUIÇÃO
E
IMAGENS
CINTILOGRÁFICAS EM ANIMAIS COM TUMOR DE EHRLICH
O perfil de biodistribuição de 1 e 4 horas após a administração, em
camundongos com tumor de Ehrlich implantado, do complexo
99mTc-HYNIC-
βAla-Bombesina(7-14) nas formulações de DSPE, PEG2000 E 1000-5000 estão
representados nas figuras 26 e 27.
intravenosa, em camundongos Swiss acometidos pelo tumor de Ehrlich (n=6). Todos os
resultados foram expressos como média % da dose injetada de
99mTc-HYNIC-βAla-
bombesina(7-14) por grama de tecido, ± desvio padrão.
1 hora
15
DSPE
PEG2000
PEG1000-5000
%DI/g
10
5
*
0
e
o
o
gu gad baç
n
i
f
sa
or ulo
de
ao
ão
go
m
oi
c
aç ulm ma
u
e
r
t
us
ir
o
p
t
t
co
m
es
rim
Figura 27. Biodistribuição do complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14) , após administração
intravenosa, em camundongos Swiss acometidos pelo tumor de Ehrlich (n=6). Todos os
resultados foram expressos como média da dose injetada de
14) por
(7-
grama de tecido, ± desvio padrão.
79
4 horas
8
DSPE
6
PEG2000
%DI/g
PEG1000-5000
4
2
*
0
ng
sa
ue
o
ad
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ço
ba
o
rim
c
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o
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or
m
u
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o
l
cu
us
m
Os resultados obtidos nos estudos de biodistribuição para o complexo
99mTc-
HYNIC-βAla-Bombesina(7-14), encapsulado nos lipossomas após administração
em camundongos Swiss com tumor de Ehrlich foram semelhantes aos estudos
com os animais contendo o tumor 4T1. Como esperado, os lipossomas
apresentaram importante captação por órgãos do sistema fagocitário
mononuclear como fígado e baço, além de elevada captação nos rins. Não
houve captação considerável em estômago e tireoide, confirmando a
estabilidade de marcação, conforme observado nas figuras 26 e 27.
Observou-se maior concentração no sangue nos tempos de 1 e 4 horas para a
formulação de contendo PEG2000 em comparação com as formulações de
DSPE e PEG1000-5000. Também foi encontrada considerável relação
tumor/musculo, em todos os tempos para as formulações, sendo que a relação
aumenta com o tempo, mas não há diferença estatisticamente significativa
entre elas (figura 28), o que corrobora os resultados encontrados para o tumor
4T1, em que a maior captação no sangue apresentada pela formulação de
PEG2000 não resultou em maior captação pelo tumor.
80
Outro fator importante que provavelmente favoreceu a maior captação pelo
tecido tumoral é o fato deste tecido apresentar pH inferior ao fisiológico
(STUBBS et al.,1999; PATRICK, 2005). Assim, os lipossomas pH-sensíveis são
desestabilizados em contato com este meio ligeiramente ácido e liberam o
peptídeo radiomarcado presente em seu interior (TACHIBANA et al., 1998;
OLIVEIRA et al., 2000). A maior concentração do peptídeo na região tumoral
favorece a internalização pelas células do tumor, gerando relações tumor/nãoalvo maiores
Figura 28. Relações tumor/músculo para o complexo
(7-14)
encapsulado nos lipossomas de DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000 nos tempos de 1 e 4h após
a administração em camundongos Swiss com tumor de Ehrlich implantado.
relação tumor/musculo
6
DSPE
PEG2000
4
PEG10005000
2
ho
ra
ho
ra
s
4
1
ho
ra
ho
ra
s
1
4
4
1
ho
ra
ho
ra
s
0
As imagens cintilográficas obtidas (Figura 29) também apresentaram maior
captação pelo tumor quando comparado ao músculo controle (pata
contralateral). A análise quantitativa das imagens possibilitou a obtenção da
relação tumor/músculo e os valores obtidos não apresentaram diferenças
estatisticamente significativas quando comparados com aqueles apresentados
para os estudos de biodistribuição (tabela 7).
Figura 29. Imagens cintilográficas após administração intravenosa do complexo 99mTc-HYNICβAla-Bombesina(7-14) em camundongos Swiss, nos tempos de 1e 4 horas. A,B = DSPE 1,4
HORAS; C,D = PEG2000 1, 4 HORAS; E,F = PEG 1000-5000 1, 4 HORAS.
81
Tabela 6 - Relação alvo/não-alvo para o complexo 99mTc-HYNIC-βAla-Bombesina(7-14)
encapsulado nos lipossomas de DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000 nos tempos de 1 e 4h após
a administração em camundongos Swiss com tumor de Ehrlich
Relação
Relação
alvo/não-alvo 1H
alvo/não-alvo 4H
DSPE
2,58±0,81
4,11±0,85
PEG2000
1,61±0,79
2,89±1,01
PEG1000-5000
1,79±1,01
2,95±0,59
Formulação
Diferentemente do tumor 4T1, o tumor de Ehrlich possui receptor para
bombesina, dessa forma há uma interação entre o peptídeo e as células
tumorais, o que facilitaria a sua internacionalização. No entanto, novamente,
apesar da formulação de PEG2000 ter maior captação no sangue, ela não foi
capaz de aumentar a concentração do peptídeo no sitio de interesse. Desta
forma, podemos inferir que a capacidade de acumulação no tecido tumoral
para este sistema não foi afetada pela presença de receptores para bombesina
na superfície das células tumorais, visto que o perfil de distribuição e
acumulação no tumor foi mantido para os dois modelos utilizados. Existem
82
relatos na literatura indicando a presença de PEG pode prejudicar o
reconhecimento celular dos lipossomas, (SONG et al., 2002; GAO et al., 2014).
A partir desses resultados pode-se concluir que a presença do polímero, no
caso da formulação de PEG2000, embora tenha aumentado a captação no
sangue não provocou maior acumulo no tumor. Neste contexto, cabe a
ressalva em relação a utilização de moléculas de PEG e suas diversas
concentrações e tamanhos de cadeia; a escolha da utilização ou não de PEG,
bem como do tipo ou concentração, devem ser feitas de maneira criteriosa e
individualizada, pois como observado nos resultados apresentados neste
trabalho respostas distintas podem ser alcançada em formulações diferentes.
Assim, a partir da avaliação pormenorizada, caso a caso, é possível otimizar a
utilização de cada nanossistema a fim de alcançar resultados satisfatórios.
3. CONCLUSÃO
Todas as formulações preparadas apresentaram diâmetro médio e IP
adequados para administração endovenosa. O potencial zeta se mostrou
próximo a neutralidade.
As imagens de microscopia eletrônica de transmissão por criomicroscopia
confirmaram o diâmetro médio das formulações realizadas por DLS, porém não
foram capazes de evidenciar diferenças na superfície dos lipossomas de
DSPE, PEG2000 e PEG1000-5000, devido ao baixo contraste apresentado
pelas cadeias de PEG.
A adição do PEG, independente do peso molecular ou da combinação de PEG
com diferentes tamanhos de cadeia, não conferiu aumento no tempo de
circulação dos lipossomas.
A formulação sem PEG possui uma menor estabilidade em plasma comparado
as outras formulações.
Os estudos de biodistribuição e imagens cintilográficas para complexo
99mTc-
HYNIC-βAla-Bombesina(7-14) demonstraram acúmulo hepático, esperado para
nanopartículas devido à captação pelo SFM, além de baixo acúmulo em
tireoide e estômago, indicando estabilidade do complexo radiomarcado.
83
Os estudos de biodistribuição e imagens cintilográficas em animais acometidos
pelos tumores de mama 4T1 e de Ehrlich demonstraram que a formulação
contendo PEG2000 apresentou maior circulação no sangue nos tempos
avaliados.
Os estudos de biodistribuição e de imagens cintilográficas em animais
acometidos pelos tumores de mama 4T1 e de Ehrlich mostraram diferença de
captação entre o tumor e o músculo contralateral para as três formulações
avaliadas, porem não houve diferença entre as relações tumor/musculo para as
formulações estudadas, consequentemente, a presença do PEG não conferiu
aumento de captação da bombesina pelo tumor.
A formulação de PEG 1000-5000 não promoveu aumento da concentração da
formulação no sangue, nem de captação da formulação pelo sitio tumoral,
esses resultados se mostraram contrários aos relatados na literatura, em que
afirmar-se que combinações de PEG de diferentes tamanhos de cadeia
modificam a conformação do polímero, culminando na formação de uma maior
camada aquosa em torno do lipossoma que dificulta o reconhecimento do SMF
provocando aumento na circulação da partícula.
A capacidade de acumulação no tecido tumoral para este sistema não foi
alterada pela presença do PEG, independentemente do modelo tumoral
utilizado. Dessa forma outros estudos, como de tratamento do tumor, precisam
ser avaliados, a fim de confirmar os benefícios da utilização do PEG e a
necessidade ou não de sua adição a essa nanopartícula.
PERSPECTIVAS
 Avaliação da ativação de macrófagos para as formulações de escolha;
 Calculo teórico da FALT;
 Teste em modelo tumoral para avaliar tratamento com formulações com
e sem PEG.
84
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICA
85
ALBENA N. NIKOLOVA A, MALCOLM N. Jones, Phospholipid free thin liquid
films with grafted poly(ethylene glycol)-2000 : formation, interaction forces and
phase states. Biochimica et Biophysica Acta, 1372, 237-243, 1998.
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104
ANEXO 1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
CEUA
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS
CERTIFICADO
Certificamos que o Protocolo nº. 301 / 2014, relativo ao projeto intitulado “Desenvolvimento e
estudo farmacocinético de lipossomas pH-sensíveis, com circulação prolongada,
radiomarcados com tecnécio-99m”, que tem como responsável André Luís Branco de Barros,
está de acordo com os Princípios Éticos da Experimentação Animal, adotados pela Comissão de
Ética no Uso de Animais (CEUA/UFMG), tendo sido aprovado na reunião de 02/12/2014. Este
certificado espira-se em 02/12/2019.
CERTIFICATE
We hereby certify that the Protocol nº. 301 / 2014, related to the Project entilted
“Development and pharmacokinetic studies of long-circulating and pH-sensitive liposomes
radiolabeled with technetium-99m”, under the supervision of André Luís Branco de Barros, is
in agreement with the Ethical Principles in Animal Experimentation, adopted by the Ethics
Committee in Animal Experimentation (CEUA/UFMG), and was approved in 02/12/2014. This
certificates expires in 02/12/2019.
Cleuza Maria de Faria Rezende
Coordenador(a) da CEUA/UFMG
Belo Horizonte, 02/12/2014.
Atenciosamente.
Sistema CEUA-UFMG
https://www.ufmg.br/bioetica/cetea/ceua/
105
APÊNDICE
106
107

universidade federal de minas gerais faculdade de farmácia

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