Apresentação do PowerPoint

Clonagem e expressão em alta escala de transportadores ABC humanos
em sistema Baculovírus/Célula de Inseto customizado para
cristalografia de raio X
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos/Fiocruz
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Transportadores ABC
Thesgc.org
Alberts et al. (2002)
Cassete Ligante de ATP (ATP-Binding Cassete):
proteínas integrais de membrana: alta complexidade estrutural
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Transportadores ABC
 Alto peso molecular (acima de 60kDa)
 Mais de 40 superfamílias de genes
 7 subfamílias de proteínas (ABCA – G)
 Utilizam energia derivada de hidrólise de ATP
 Transporte de substâncias pelas membranas biológicas
 Homeostase de colesterol
 Influxo/efluxo de neurotransmissores
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Transportadores ABC
Importância no sistema imune:
Expressão de sinalizadores da imunidade inata
Metabolismo em macrófagos
Apresentação de peptídeos via MHC-1: células T CD8+
Potencialização da resposta humoral: autoimunidade
Expressão de marcadores tumorais de superfície
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Ictiose Tipo Arlequim
(ABCA)
Gota
(ABCG)
Hipoglicemia infantil
(ABCC)
Merckmanual.com
Esquizofrenia
(ABCA)
Rheumatology.org
Livemedical.net
(ABCA)
soscuisine.com
missjheintz.edublogs.org
Trialx.com
Doença de Tangier
Fibrose Cística
(ABCC)
Sciencenewstoyou.blogspot.com
Transportadores ABC
Sideroblastose
(ABCB)
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Telegraph.co.uk
Transportadores ABC
Asma/DPOC
Hepatoma
Câncer de cólon
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Objetivos
Alvos estratégicos
Transportadores ABC
Clonar, expressar e purificar
Baculovírus/Célula de inseto - High-Throughput
Protocolo customizado para XRC
Consórcio de Genômica Estrutural
Universidade de Oxford, Reino Unido (SGC/Oxford)
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Tn 7L
Clonagem por High-Throughput
SV40 pA
FBAC-2
BamHI (6058)
Flag
10 His
f1 origin
BfuAI (5982)
Pst I (5979)
9 Alvos estratégicos
95 Construções truncadas de DNA
TEV
Amp R
3'LIC
BfuAI
KpnI (5561)
pFB-C T10HF-LIC
Sac B
6721 bp
pUC origin
Vetor customizado pFB-CT10HF-LIC
FastBac, Bac-To-Bac: Life Technologies
BfuAI
BfuAI (4052)
5'LIC
Tn7R
Bse RI (2962)
FBAC-1
PH promoter
Gm R
C-terminal TEV-His10-Flag
TEV
PH promoter
Lic 5’
Gene de interesse
Lic 3’
10 His
FLAG
Tn7L
Vetor pFastBac modificado por SGC Oxford
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
pFBCT10HF-LIC vector digested by BfuAI
1% Agarose E-gel from 95 constructs of an ABC transporter.
100%
92%
92%
90%
75%
75%
67%
69%
67%
1% agarose gel from a colony PCR using 95
different constructs from an ABC transporter
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
96 poços
Clonagem LIC
Transformação em E. coli DH10Bac
Bloco de 96 poços
Seleção colônias azuis/brancas
Miniprep Bacmid®
Placa de 24 poços
(96 h)
Bloco de 24 poços
(48-72 h)
Transfecção em céls.Sf9 cells (vírus P0)
Geração sequencial: vírus P1, P2
Expressão em pequena escala (Células P2)
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Teste de expressão em 3mL – Phynexus System
Bloco de 24 poços
Cultura céls. Inf. em placas de 24 poços
Sonicação em paralelo (automatizada)
Bloco de 96 poços
Transferência para blocos de 96 poços
Extração em detergente não-iônico
Centrifugação 300 x g (debris)
Ligação à Talon (IMAC Co2+)
Lavagem com HEPES/NaCl + deterg.
Eluição 300mM Imidazol
3mL Test Expression - 24 constructs (ABC transporter)
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Screening automatizado de detergentes
•
•
•
•
12 detergentes em paralelo
Concentração Micelar Crítica (CMC) - 2X
Aditivo lipídico: CHS
Teste de Monodispersidade: Dionex
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Screening automatizado de detergentes
*
*
*
*
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Expressão: 3-46 L céls. Sf9
Preparação: gradiente NaCl
Lise: 15.000PSI
Extração DDM + CHS
PD10 (remover imidazol)
Cromatog. Afinidade – Co2+
Cromatog. Exclusão Molecular
Clivagem His-tag - TEV protease
Purificação reversa
Concentração/Centricon
Cristalização automatizada
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
SDS-PAGE 4-12%
Análise qualitativa
160,00
140,00
120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
-20,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
Volume (ml)
Alvo confirmado!
Excisão e digestão tríptica LC-MS/MS
Alvo confirmado!
ESI-TOF/Q-TOF
(UniProt_SwissProt/SGC databases)
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Conclusões
• O sistema Baculovírus/Célula de Inseto se constitui de um excelente sistema
para expressão de transportadores ABC humanos;
• A possibilidade de inclusão de múltiplas construções truncadas de um mesmo
alvo tem se mostrado eficiente na seleção de proteínas mais estáveis;
• A clonagem e expressão em alta escala utilizando plamídeos customizados são
importantes ferramentas na obtenção de clones susceptíveis para
transportadores ABC humanos.
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Perspectivas
• Execução da modelagem 3D a partir das proteínas que gerarem cristais
difratados no Diamond (Sincrotron);
• Síntese de inibidores/ligantes quimioterápicos para os alvos utilizados neste
estudo pelas farmacêuticas investidoras no SGC;
• Ampliação do rol de transportadores ABC humanos e receptores de membrana
com foco em: rinite, asma e DPOC.
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos
Obrigado!
Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos